CN109715659A - 用于诊断骨关节炎的comp肽和抗体 - Google Patents
用于诊断骨关节炎的comp肽和抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109715659A CN109715659A CN201780037707.1A CN201780037707A CN109715659A CN 109715659 A CN109715659 A CN 109715659A CN 201780037707 A CN201780037707 A CN 201780037707A CN 109715659 A CN109715659 A CN 109715659A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- peptide
- antibody according
- sample
- diagnosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/105—Osteoarthritis, e.g. cartilage alteration, hypertrophy of bone
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
- G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
提供了包含氨基酸序列N‑末端‑SGPTH的肽和针对该肽的抗体。该肽可用于人和动物,特别是马的诊断。特别地,该抗体可用于诊断如骨关节炎或动脉粥样硬化的全身性低级别慢性炎性疾病,或神经变性疾病或神经炎性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及肽和针对该肽的抗体,及其在诊断,特别是全身性炎性疾病,特别是骨关节炎和心血管疾病的诊断中的用途。
背景技术
动脉粥样硬化与全身性低级别慢性炎症和随后血管中炎性斑块的形成有关,并且是西方世界的主要死亡原因之一。动脉粥样硬化从较不危险的无症状阶段缓慢进展到斑块发展至斑块可能引起血栓形成的阶段,血栓形成可能阻塞毛细血管,从而导致心脏病发作或中风。
在晚期阶段,动脉粥样硬化经常进展到颈动脉狭窄,颈动脉狭窄是由斑块引起的颈动脉内表面变窄。在这个阶段,血栓形成和栓塞释放引起中风的风险非常高。
今天不可能监测动脉粥样硬化如何进展到危险阶段。
颈动脉狭窄通常通过使用具有中等敏感性和特异性的超声来诊断。因此,需要监测动脉粥样硬化进展为颈动脉狭窄的方法。
骨关节炎(OA)是一种低级别慢性全身性炎症,由关节软骨和下方骨质的破坏引起。该疾病从早期阶段开始,其通常以炎症为特征并且在受影响的关节中开始基质蛋白的解体,到更严重的阶段,对下面的骨骼造成损害。主要症状是关节疼痛。骨关节炎是一个主要的临床问题,因为它影响了约3.8%的人口。据估计,50%的NSAID止痛药处方与OA有关。
虽然关节疼痛经常导致医生怀疑是OA,特别是如果患者是老年人,现在很难诊断OA的早期阶段。今天诊断通常基于使用放射学识别OA晚期典型的不可逆结构损伤。然而,X射线或MRI不能用于诊断早期OA,因为结构损伤尚不可见。此外,X射线和MRI检查需要昂贵的设备,并与放射科医生预约。
对于马主来说,马的骨关节炎是一个很大的问题。拥有一匹马的主要原因是能够使用它,并经常用它参加比赛。OA是不能使用马的最常见原因,并且是马业中最大的单一经济损失。
马的早期OA经常表现为跛足,即异常的步态或姿势。跛足通常很微妙,能有一种改进的监测跛足的方法将是有用的。这将使马主能够知道何时由于跛足而停止训练和比赛,让马匹休息。
马和人类的OA是由类似的机制引起的。在人和马中,OA从早期阶段进展,其特征在于炎症持续数月和数年至具有广泛组织损伤的后期(Goldring,M.B.and Otero M.CurrentOpinion in Rheumatology(2011)23(5):471)。人和马的OA疾病机制在分子水平上也非常相似(Stenberg J,RüetschiU,Lindahl A.ProteomeSci.(2013)Oct 4;11(1):43)(Stenberg J,Rüetschi U,E,J,Lindahl A.Proteome Sci.(2013)Oct 4;11(1):43)(SGala E,M,Sihlbom C,Rüetschi U,Lindahl A,Ekman S,E.Connect Tissue Res.(2015);56(4):315-25)。
缺乏OA的早期标志物阻碍了可用于在疾病表现为不可逆的组织损伤之前控制疾病的药物的开发。如果有更方便的诊断和分期OA的方法将是有用的。
本发明解决了这些和其他问题。
发明内容
在本发明的第一方面,提供了特异性结合包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽的抗体。该抗体可用于诊断。因此,在第二方面,提供了特异性结合包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽的抗体在诊断中的用途。
该诊断可以是与全身性炎症相关的疾病的诊断,特别是全身性低级别慢性炎症,例如骨关节炎,特别是早期骨关节炎或动脉粥样硬化,特别是颈动脉狭窄。诊断也可以是动脉硬化的诊断。诊断还可以是神经退行性疾病,例如阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、或神经炎性疾病、例如多发性硬化症、帕金森病、格林-巴利综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、自身免疫性脑炎或发作性睡病的诊断。
该抗体可用于检测来自受试对象的样品中包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽的量。在优选的实施方案中,所述样品是滑液、血液、血清或血浆的样品。
本发明提供了用于全身性低级别慢性炎性疾病如动脉粥样硬化和OA的生物学标记物。因此,可以以比以前更方便的方式监测这些疾病。
通过使用本发明的抗体测试滑液样品,可以在早期发现OA。这有几个优点。这将有助于发现和监测OA,并可能促进OA的药物开发。
通过使用本发明的抗体测试血液样品可以检测晚期动脉粥样硬化。
在优选的实施方案中,受试对象是人,疾病是动脉粥样硬化,并且样品是血液样品。
在优选的实施方案中,受试对象是马,疾病是OA,特别是早期OA或急性跛行,并且该样品是滑液样品。
在第三方面,提供了根据本发明第一方面的抗体用于诊断。
在本发明的第四方面,提供了一种诊断方法,包括从受试对象中分离样品并分析样品中包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽在样品中的存在或量。
在本发明的第五方面,提供了一种诊断试剂盒,其包含如上所述的抗体。
在本发明的第六方面,提供了包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽。
在本发明的第七方面,提供了包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽用于产生抗体的用途。
附图说明
图1使用连续稀释的对照肽(SEQ ID NO 4)或SGPTHEGVC肽(SEQ ID NO 3)测试抗-N-SGPTH抗体的特异性。
图2是显示来自马的滑液样品中包含序列N-末端SGPTH的肽的浓度的图(*=p<0.050,****=p<0.0001)。
图3是显示来自人血清中包含序列N-末端-SGPTH的肽的浓度的图(***=p<0.001)。
图4和5是来自马的关节软骨样品的图像,用针对N-SGPTH肽的抗体染色。免疫组织化学-染色的切片是来自健康马(健康软骨-图4)和具有关节软骨浅表纤维性颤动的马(早期OA-图5)的关节软骨。针对该肽的抗体在健康软骨中染色为阴性。然而,在早期OA中,所述抗体在原纤化区域中染色为阳性(由箭头指示)。
图6显示来自人患者的动脉粥样硬化斑块样品的组织切片,用针对N-SGPTH肽的抗体染色。
具体实施方式
本发明涉及包含序列N-末端-SGPTH(SEQ ID NO 1)的肽,针对该肽的抗体以及这种抗体在诊断中的用途。
所述肽的长度可以为5至100,优选5至30,更优选5至20个氨基酸,更优选5至9个氨基酸,只要N-末端具有序列SGPTH即可。因此,该肽的此序列的丝氨酸残基具有肽的NH2基团。
在一个实施方案中,肽的长度使得其可用于免疫。那么肽的长度优选至少为9个残基。
所述肽可以是分离的肽。所述肽可以从例如滑液、血液、血浆或血清中分离。还可以使用本领域已知的方法合成肽,例如R.B.Merrifield(1963)."Solid Phase PeptideSynthesis.I.The Synthesis ofa Tetrapeptide".J.Am.Chem.Soc.85(14):2149–2154和Schnolzer,M.A.,P.;Jones,A.;Alewood,D.;Kent,S.B.H.(2007)."In SituNeutralization in Boc-chemistry Solid Phase Peptide Synthesis".Int.J.PeptideRes.Therap.13(1–2):31–44。肽可以是分离的肽。
所述肽可用于生产和分离抗体。该抗体特异性结合包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽,特别是由至少9个氨基酸残基组成的肽。术语“抗体”还包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和单链抗体。产生针对肽的抗体的方法是众所周知的。该肽可用于筛选与所述肽结合的抗体,也可用于纯化所述抗体。
优选地,所述抗体对所述肽具有高亲和力。亲和力可以使用解离常数或Kd表示。优选的结合亲和力包括解离常数(Kd)小于10-6M,更优选5×10-7M,更优选10-7M,更优选5×10- 8M,10-8M,更优选5×10-9M,更优选10-9M,更优选5×10-10M,更优选10-10M,更优选5×10-11M,更优选10-11M,更优选5×10-12M,更优选10-12M,甚至更优选5×10-13M,或最优选10-13M。优选地,所述抗体是分离的抗体。所述抗体可以是纯化的抗体。
优选地,所述抗体与包含序列N-末端-SGPTH(SEQ ID NO 1)的肽特异性结合。为了产生抗体,用比SGPTH长的肽免疫可能是适合的,例如免疫肽SGPTHGGGC(SEQ ID NO 2)。然而,随后的筛选步骤可以鉴定与表位N-末端-SGPTH特异性结合的抗体,并且其中用于免疫的肽的其他残基不参与抗体结合。在免疫肽SGPTHGGGC(SEQ ID NO 2)中,C-末端半胱氨酸可用于偶联肽,例如偶联至用于抗体纯化的基质。
抗体可以是衍生自哺乳动物,例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马等的任何抗体,其中优选小鼠或鸡。抗体的同种型可以是IgG、IgM、IgE、IgA、IgY等中的任何一种。
如本领域已知的,所述抗体可以是通过免疫动物(例如兔)产生的多克隆抗体。但优选地,所述抗体是单克隆抗体。优选地,所述单克隆抗体是小鼠或兔单克隆抗体。可以使用众所周知的杂交瘤技术(Kohler and Milstein,Nature,256,495-497,1975)产生针对所述肽的单克隆抗体。可以通过有限稀释分析、软琼脂测定、使用荧光激活细胞分选仪的方法等分离单个克隆。在有限稀释分析中,例如,在培养前将杂交瘤的菌落在培养基中连续稀释至约1个细胞/孔,以分离产生所需抗体的杂交瘤。抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。
还可以使用其他方法产生抗体克隆,例如噬菌体展示。
当抗体是鼠IgG时,可以使用蛋白A偶联的载体或抗小鼠免疫球蛋白偶联的载体用亲和层析纯化抗体。
存在众所周知的用于产生、纯化和分离抗体并确定其结合能力的方法。有关详细信息,请参阅Current Protocols in Immunology and Current Protocols in MolecularBiology。
抗体可以不同方式用于诊断。抗体可用于测量来自受试对象(可以是人或动物)的样品中肽的存在、量或浓度。样品可以是任何类型的生物样品,例如滑液、血浆、血清、脊髓液(液体)或尿液、腹水或组织切片。优选地,所述样品是液体样品。在优选的实施方案中,样品是血清样品、血液样品、血浆样品或滑液样品。在一个甚至更优选的实施方案中,样品是滑液样品。
用抗体测量样品中肽浓度的便利方式是ELISA。ELISA(酶联免疫吸附测定)的设计和使用在诊断领域中是众所周知的。抗体也可用于例如免疫组织化学。例如,可以使用病理学领域中已知的抗体对组织的薄切片,例如冷冻、石蜡处理或固定的组织进行染色。该抗体也可用于蛋白质印迹。
可以以各种方式检测抗体。常用的方法是使用与例如酶(例如HRP)、荧光团或放射性标记的可检测的物质(标记物或标记)偶联的第二抗体。例如,如果第一抗体是小鼠抗体,则第二抗体可以是山羊抗小鼠抗体。可以用本领域已知的方法检测标记物的存在:可以用产生颜色或光的试剂检测酶,可以用闪烁体或照相胶片检测放射性标记,并且可以用荧光检测仪检测或在荧光显微镜里观察荧光团。
或者,第一抗体(抗-SGPTH-抗体)可以直接与标记物/标记偶联。
当抗体用于各种方法如ELISA或免疫组织化学时,抗体的合适工作浓度取决于抗体的亲和力,并且可以通过测试不同浓度的抗体来确定,以便找到产生良好信噪比的浓度。例如,浓度为1mg/ml的抗体原液可以1/100、1/200、1/1000和1/5000稀释,以测试合适的工作浓度。在这些方法中抗体的工作浓度通常在μg/ml的范围内,例如1-10μg/ml。抗体适合在PBS中稀释,可以使用另外的蛋白质如BSA和防腐剂如叠氮化钠。
该抗体可用于诊断受试对象,特别是人或马的疾病。例如,可以使用标准方法,例如ELISA,测定样品中肽的浓度。可以将如此确定的浓度与标准值进行比较。与标准值的偏差可以指示特定疾病或疾病的阶段。
诊断可以是与全身性炎症相关的疾病,特别是全身性低级别慢性炎症的诊断。因此,诊断可以是例如阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、肌萎缩侧索硬化症(ALS)的神经退行性疾病,或例如多发性硬化症、帕金森氏病、格林-巴利综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、自身免疫性脑炎或发作性睡病的神经炎性疾病的诊断。
在一个优选的实施方案中,被诊断的疾病可以是选自下组的一种疾病:动脉粥样硬化和颈动脉狭窄,特别是在人体内。特别是该疾病可以是颈动脉狭窄。那么该样品优选是血液样品、血浆样品或血清样品。
该抗体可用于监测人类动脉粥样硬化的进展,特别是从斑块疾病到颈动脉狭窄。该抗体可用于区分仅患有斑块的患者和颈动脉狭窄的患者。基于目前使用兔多克隆抗血清的校准物,血清中肽浓度高于100ng/ml,更优选高于600ng/ml,更优选高于800ng/ml,更优选1000ng/ml,更优选1200ng/ml,并且最优选高于2000ng/ml可以指示人的颈动脉狭窄。可以使用标准实验和适当的对照建立适当的截止值。
该抗体可用于诊断人或马中的OA。在优选的实施方案中,滑液中高浓度的肽可以指示早期OA。低浓度的肽可能表明没有OA或OA的晚期。该抗体可用于监测从急性跛行/早期OA进行到慢性跛行/慢性OA的过程,特别是在马中。在马中,该抗体可用于诊断选自下组的一种病症:急性跛行/早期OA和慢性跛行/慢性OA。
在马中,基于目前使用兔多克隆抗血清的校准物,滑液浓度中的肽浓度高于1μg/ml,更优选超过20μg/ml,更优选30μg/ml,更优选高于40μg/ml,更优选超过200μg/ml可以指示早期跛足并因此指示早期OA。可以使用标准实验和适当的对照建立马的截止水平。
抗体和必需的试剂可以包括在用于检测样品中的肽的试剂盒中。该试剂盒可以基于ELISA,例如竞争性ELISA。该试剂盒可包括固定相(例如具有孔的板)、第二抗体、缓冲液和用于检测标记物的试剂。
实施例1
多克隆抗体
针对免疫肽N-末端SGPTHGGGC-C-末端,SEQ ID NO 2)产生兔多克隆抗体。肽n-末端SGPTH被鉴定为马的滑液中COMP蛋白(血小板反应蛋白5)的切割片段。人蛋白质具有相同的序列。免疫原性肽用于从兔血清中纯化抗体。所述多克隆抗体用于实施例2-6中。
实施例2
抑制ELISA,检测马和人的所述肽。
通过使用来自实施例1的抗体,对具有序列SGPTHEGVC(SEQ ID NO 3)的肽开发抑制ELISA。如实施例3(马)和实施例4(人)进行ELISA。抗体与该肽的结合证实所述多克隆抗体对N-SGPT是特异的。此外,抗体不与具有序列PPGYSGPTHEGVGMC(SEQ ID NO 4)的未切割的对照肽结合,显示N-末端是该抗体的表位的一部分,因为该肽(SEQ ID NO 4)包含SGPTH而不是N-SGPTH的N-末端(图1)。如所预期的,在抑制ELISA中,SGPTHEGVC(SEQ ID NO 3)肽随着肽浓度的增加而产生降低的吸光度信号。ELISA在来自人和马的血清和滑液(SF)中得到验证。因此,确定所述抗体检测来自人和马的血液和滑液中存在的肽。
对于马测定,组内测定(intra assay)验证变异系数(CV)(%)为10.9,组间测定(inter assay)验证CV(%)为10.7(定量的最低限度为0.156μg/ml)。人血清样品的CV与马数据相似。还测试了血清和滑膜样品在冷冻(-80℃)、解冻和添加蛋白酶抑制剂以及EDTA后的稳定性。
实施例3
检测来自具有骨关节炎的马的滑液中的所述肽
从生物样本库(biobank)中收集滑液(SF)样品。使用的材料包括来自马的中部腕关节和系关节(fetlock joint)的滑液。
本样品的纳入标准为A)超过100μl的可用液体,并且具有以下条件之一:B)早期OA/急性跛行病史(<4周持续时间),C)慢性OA/慢性跛行的病史(>4周持续时间),D)无跛行病史和具有正常形态的关节(健康对照),或E)存在晚期OA的关节。
生物样本库I包括28匹年轻的标准育种(STB)快步马(13匹小雌马和15匹小雄马),由同一个园区的同一名培训师培训。这些马在平均年龄为19.5个月开始训练,在平均年龄为40个月结束。所有的马都是临床健康的,并且在六个时机(访问1,2,3,4,5和6)进行检查。在SF取样时,进行了包括放射线照相和腕关节闪烁扫描在内的屈曲试验的临床跛行检查。
生物样本库II由STB的左腕关节和瑞典温血马(SWHs)组成,这些马在一个屠宰场被实施安乐死。来自左侧腕骨间关节的SF在死后立即取样。关节软骨的特征在于第三腕骨的近端关节表面正常或具有结构性OA损伤。
生物样本库III由来自临床跛足马的SF组成。在包括屈曲试验和关节内麻醉的常规跛行检查期间检查马。该检查还包括用于评估麻醉前后跛足的跛行***测试。根据临床跛行评估,从不同关节收集SF。该样本库由来自通过关节内麻醉和跛行***确定在特定关节中具有跛足的关节的SF组成。
图2中使用的材料是中部腕关节和系关节的SF,它们来自:关节软骨目视正常的马作为健康对照(n=8,生物样本库II);关节软骨的轻度至中度结构性OA变化的晚期OA的马(n=8,生物样本库II);早期OA/急性跛行<4周的马(n=9,生物样本库III);和慢性OA/慢性跛行>4个月的马(n=9,生物样本库III);以及来自年轻健康的训练中的赛马作为健康对照(n=7,生物样本库I)。
开发抑制ELISA以定量SF中肽的浓度。用在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中稀释的4.0μg/mL肽(序列SGPTHEGVC,SEQ ID NO 3)包被NUNC板,并在4℃温育过夜。使用含有0.6%BSA和0.8%SDS的10mM PBS中的5.0μg/mL肽(序列SGPTHEGVGMA(SEQ ID NO 5))的连续稀释物作为校准曲线(范围=5~0.078μg/mL)。在含有0.84%SDS的PBS中1:20稀释SF样品。将一式几份标准品和SF在96孔Sterilin板中于25℃温育过夜。第二天,将第一抗-SGPTH抗体(在含有1%BSA和4%Triton-X-100的PBS中1:2000稀释)加入Sterilin板中,将板在25℃温育1小时20分钟。在25℃洗涤NUNC板并用含有1%BSA和0.1%吐温的PBS封闭1小时。在25℃,将总共100μL从Sterilin板转移至NUNC板,并在25℃温育1小时。温育后,洗涤NUNC板,并且加入在含有1%BSA和0.1%吐温的PBS中1:20000稀释的第二抗体(山羊抗-兔IgG H&L)[HRP])。将板在25℃温育1小时,然后洗涤6次并与底物(Substrate Reagent Pack DY999,R&D System,UK)一起在25℃温育约8分钟。加入终止溶液(1M H2SO4),并在450nm测量吸光度(SpectraMaxPlus 384,MDS Analytical Technologies Ltd,UK)。
与健康对照关节和具有慢性骨关节炎/慢性跛行和/或具有晚期骨关节炎的马的关节相比,具有早期骨关节炎/急性跛行的马的滑液中的肽浓度在统计学上增加(图2)。
数据表示为平均值±SD,并且使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc,San Diego,CA,USA)通过单向ANOVA评估平均值之间的差异。为了进行组间比较,进行了Turkey的多重比较测试。显著性水平设定为p<0.05。
实施例4
检测动脉粥样硬化患者血清中的肽。患者材料如Nordanstig A,Bentzel T,K,GM,Risk of early recurrent stroke insymptomatic carotid stenosis,Eur J Vasc Endovasc Surg(2015);49:137-44。
开发抑制ELISA以定量血清中肽的浓度。用在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中稀释的4.0μg/mL肽(序列SGPTHEGVC(SEQ ID NO 3))包被NUNC板,并在4℃温育过夜。使用在含有0.6%BSA和0.8%SDS的10mM PBS中的1000ng/ml至15.6ng/ml的肽(序列SGPTHQGVGLA(SEQID NO 6))的连续稀释物作为校准曲线。在含有0.84%SDS的PBS中1:4稀释血清样品。将一式多份的标准品和血清在96孔Sterilin板中于25℃温育过夜。第二天,将第一抗-SGPTH抗体(在含有1%BSA和4%Triton-X-100的PBS中1:6000稀释)加入Sterilin板中,将所述板在25℃温育1小时20分钟。洗涤NUNC板并用含有1%BSA和0.1%吐温的PBS在25℃封闭1小时。将总共100μL从Sterilin板转移到NUNC板并在25℃温育1小时。温育后,洗涤NUNC板,并加入在含有1%BSA和0.1%吐温的PBS中1:20000稀释的第二抗体(山羊抗-兔IgG H&L-HRP)。将所述板在25℃温育1小时,然后洗涤六次,并与底物(Substrate Reagent Pack DY999,R&DSystem,UK)在25℃温育约21分钟。加入终止溶液(1M H2SO4),并在450nm测量吸光度(SpectraMaxPlus 384,MDS Analytical Technologies Ltd,UK)。
与颈动脉狭窄患者相比,颈动脉斑块患者血清中的肽浓度有统计学上的增加(图3)。
统计如实施例3中所述。
实施例5
来自马的关节软骨的免疫组织化学
对***固定的健康和早期OA关节软骨块进行针对肽的免疫染色(兔多克隆抗体)。多克隆抗体分别以1:800和1:1000的稀释度使用。简而言之,将标本切片并固定在载玻片上,脱石蜡,复水并在磷酸盐缓冲盐水(PBS;0.01M,pH 7.4)中洗涤。内源性过氧化物酶活性用PBS中的3%过氧化氢淬灭。通过将所述切片在2%正常山羊血清(DAKO,X0907,兔抗体)中温育来将非特异性结合封闭,然后干燥,并与所述抗体在室温(RT)温育60分钟。在PBS中漂洗后,所述切片与辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的第二抗体(Dako Real EnVisionTMDetection System,k5007,即用型试剂盒)在室温温育30分钟。使用显色剂3,3-二氨基联苯胺(DAB+Cromogen Dako EnVision)进行可视化,并用苏氨酸复染。作为阴性对照,用与第一抗体相同稀释度的非免疫-兔-血清(兔免疫球蛋白级分X0936,DAKO)代替第一抗体。
使用Nikon Eclipse E600显微镜和NIS Elements Basic Research软件版本3.22.11(Nikon Instruments Inc,Melville,NY,USA)主观评价切片。
来自健康马(健康软骨,图4)和关节软骨的表面原纤化(软骨表面的损伤)(早期OA)的马的关节软骨的免疫组织化学载玻片显示出不同的染色模式(图5)。针对肽的抗体在健康软骨中仅微弱染色或阴性染色。然而,在早期OA中,所述抗体在原纤化区域中染色为阳性。
实施例6
来自Fagerberg B,Ryndel M,Kjelldahl J,et al.J Vasc Res(2010);47:221-30描述的材料的来自人的动脉粥样硬化斑块的免疫组织化学。
在进行动脉内膜切除术之前,用磁共振血管造影术检查来自患有颈动脉狭窄症状的患者的样本,以定位体内最大狭窄。最大狭窄的横向组织切片用于免疫组织化学,其如实施例5中进行。内膜壁中染色增加(用箭头指示),表明包含序列N-SGPTH的肽的存在(图6)。
该实施例6和实施例4显示该抗体可用于诊断动脉粥样硬化。此外,实施例3和实施例5显示该抗体可用于诊断骨关节炎。骨关节炎和动脉粥样硬化的共同特点是全身性炎症。我们得出结论,该抗体可用于诊断存在全身性炎症的疾病,例如骨关节炎、动脉粥样硬化和神经变性疾病如阿尔茨海默氏病和血管性痴呆和神经炎性疾病如多发性硬化。
序列表
<110> 伊娃·斯蔻德布兰德
安德斯·林达尔
斯蒂娜·艾克曼
<120> 用于诊断骨关节炎的COMP肽和抗体
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 马(Equus caballus)
<400> 1
Ser Gly Pro Thr His
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 用于免疫的肽
<400> 2
Ser Gly Pro Thr His Gly Gly Gly Cys
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 马(Equus caballus)
<400> 3
Ser Gly Pro Thr His Glu Gly Val Cys
1 5
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 马(Equus caballus)
<400> 4
Pro Pro Gly Tyr Ser Gly Pro Thr His Glu Gly Val Gly Met Cys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 马(Equus caballus)
<400> 5
Ser Gly Pro Thr His Glu Gly Val Gly Met Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
Ser Gly Pro Thr His Gln Gly Val Gly Leu Ala
1 5 10
Claims (15)
1.一种抗体,其特异性结合包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽。
2.根据权利要求1所述的抗体,其用于诊断。
3.根据权利要求2所述的抗体,其中所述诊断是受试对象的骨关节炎、动脉粥样硬化、神经变性疾病或神经炎性疾病的诊断。
4.根据权利要求3所述的抗体,其中所述诊断是骨关节病的诊断。
5.根据权利要求4所述的抗体,其中所述骨关节病是早期骨关节炎。
6.根据权利要求3所述的抗体,其中所述诊断是动脉粥样硬化的诊断。
7.根据权利要求6所述的抗体,其中所述动脉粥样硬化是颈动脉狭窄。
8.根据权利要求3所述的抗体,其中所述神经变性疾病选自下组:阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、肌萎缩侧索硬化症(ALS),或者其中所述神经炎性疾病选自下组:多发性硬化症、帕金森病、格林-巴利综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、自身免疫性脑炎和发作性睡病。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的抗体,其中所述抗体用于检测来自受试对象的样品中包含氨基酸序列N末端-SGPTH的肽的量。
10.根据权利要求9所述的抗体,其中所述样品是滑液、脊髓液(液体)、血清、血液或血浆的样品。
11.根据权利要求1所述的抗体在诊断中的用途。
12.一种诊断方法,包括从受试对象中分离样品并分析该样品中包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽的存在或量。
13.一种试剂盒,其包含根据权利要求1所述的抗体。
14.包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽。
15.包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽用于产生抗体的用途。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE1650855-8 | 2016-06-16 | ||
SE1650855 | 2016-06-16 | ||
PCT/EP2017/064667 WO2017216289A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-06-15 | Compeptide and antibodies thereto for diagnosing osteoarthritis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109715659A true CN109715659A (zh) | 2019-05-03 |
CN109715659B CN109715659B (zh) | 2023-02-28 |
Family
ID=59276692
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201780037707.1A Active CN109715659B (zh) | 2016-06-16 | 2017-06-15 | 用于诊断骨关节炎的comp肽和抗体 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190137514A1 (zh) |
EP (1) | EP3472199B1 (zh) |
JP (1) | JP7295642B2 (zh) |
CN (1) | CN109715659B (zh) |
AU (1) | AU2017286376B2 (zh) |
CA (1) | CA3027291A1 (zh) |
ES (1) | ES2967411T3 (zh) |
WO (1) | WO2017216289A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114371286A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-04-19 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种检测新冠病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE542968C2 (en) | 2018-10-26 | 2020-09-22 | Lindahl Anders | Treatment of osteoarthritis |
SE2150815A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-24 | SGPTH Life Science AB | Biglycan peptide and antibodies |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040214272A1 (en) * | 1999-05-06 | 2004-10-28 | La Rosa Thomas J | Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7236216B2 (ja) | 2015-04-23 | 2023-03-09 | ナントミクス,エルエルシー | がんのネオエピトープ |
-
2017
- 2017-06-15 US US16/309,708 patent/US20190137514A1/en active Pending
- 2017-06-15 AU AU2017286376A patent/AU2017286376B2/en active Active
- 2017-06-15 ES ES17735015T patent/ES2967411T3/es active Active
- 2017-06-15 WO PCT/EP2017/064667 patent/WO2017216289A1/en active Search and Examination
- 2017-06-15 CN CN201780037707.1A patent/CN109715659B/zh active Active
- 2017-06-15 JP JP2018563724A patent/JP7295642B2/ja active Active
- 2017-06-15 EP EP17735015.4A patent/EP3472199B1/en active Active
- 2017-06-15 CA CA3027291A patent/CA3027291A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040214272A1 (en) * | 1999-05-06 | 2004-10-28 | La Rosa Thomas J | Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DICKINSON S. C.等: "Cleavage of cartilage oligomeric matrix protein (thrombospondin-5) by matrix metalloproteinases and a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs", 《MATRIX BIOLOGY》 * |
PEFFERS M. J.等: "Characterization of neopeptides in equine articular cartilage degradation", 《JOURNAL OF ORTHOPAEDIC RESEARCH》 * |
ZHEN E.Y.等: "Characterization of Metalloprotease Cleavage Products of Human Articular Cartilage", 《ARTHRITIS & RHEUMATISM》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114371286A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-04-19 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种检测新冠病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017216289A8 (en) | 2019-01-24 |
AU2017286376A1 (en) | 2019-01-03 |
EP3472199A1 (en) | 2019-04-24 |
JP2019528239A (ja) | 2019-10-10 |
ES2967411T3 (es) | 2024-04-30 |
CN109715659B (zh) | 2023-02-28 |
WO2017216289A1 (en) | 2017-12-21 |
EP3472199B1 (en) | 2023-11-01 |
EP3472199C0 (en) | 2023-11-01 |
CA3027291A1 (en) | 2017-12-21 |
US20190137514A1 (en) | 2019-05-09 |
JP7295642B2 (ja) | 2023-06-21 |
AU2017286376B2 (en) | 2024-06-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Caforio et al. | Cardiac autoantibodies to myosin and other heart-specific autoantigens in myocarditis and dilated cardiomyopathy | |
Poole et al. | The assessment of cartilage degradation in vivo: development of an immunoassay for the measurement in body fluids of type II collagen cleaved by collagenases | |
KR101678703B1 (ko) | 갈렉틴-3 면역검정 | |
CN110249226A (zh) | 评估患者样品中gfap状态的改进方法 | |
CN109715659A (zh) | 用于诊断骨关节炎的comp肽和抗体 | |
KR20120064072A (ko) | 콜라겐 네오에피토프 항체 | |
Tsacheva et al. | Detection of autoantibodies against the globular domain of human C1q in the sera of systemic lupus erythematosus patients | |
CN104105710A (zh) | 抗-spla2-v抗体以及其用途 | |
CN101903775A (zh) | 抗edta的s100a12c复合物(erac) | |
DE68925923T2 (de) | Antigene der einzigen Spaltungsstelle von Fibrinogen durch Elastase | |
JP2009156615A (ja) | Pad4及び抗pad4抗体の測定方法並びに関節リウマチの検出方法 | |
CN108948153A (zh) | 一种瓜氨酸修饰肽抗原组合及其应用 | |
EA034364B1 (ru) | Иммуноанализ для обнаружения хромогранина а | |
CN108535490A (zh) | 生物制剂血药浓度检测方法及试剂 | |
Newkirk et al. | Rheumatoid factor avidity in patients with rheumatoid arthritis: Identification of pathogenic RFs which correlate with disease parameters and with the gal (O) glycoform of IgG | |
CN108948154A (zh) | 一种瓜氨酸修饰肽及其应用 | |
CN1997669A (zh) | 抗胃泌素激素单克隆抗体 | |
CN109313201B (zh) | 用于监测细胞凋亡的特异于γ-谷氨酰基-L-ε-赖氨酸(GGEL)的单克隆抗体 | |
CN108948174A (zh) | 一种瓜氨酸修饰肽及其应用 | |
CN100381820C (zh) | 评价受试物质的毛发生长促进活性的方法和试剂盒 | |
JPWO2012153773A1 (ja) | 可溶性lr11の免疫学的測定方法 | |
Kanani et al. | False-positive high sensitivity troponin I on Alinity i | |
US20210285969A1 (en) | Methods for diagnosing a cerebral amyloid angiopathy | |
CN105980857A (zh) | 用于心脏病症的生物标记物 | |
US20090081714A1 (en) | Assays |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |