JP2019524791A - Ｅ−セレクチンの阻害剤もしくはｃｘｃｒ４の阻害剤との、またはｅ−セレクチンおよびｃｘｃｒ４両方のヘテロ二機能性阻害剤とのｔ細胞チェックポイント阻害剤の組み合わせ - Google Patents

Abstract

Ｔ細胞チェックポイント阻害剤を、Ｅ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および／または少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤と組み合わせて投与することを含む、増加した制御性Ｔリンパ球細胞（Ｔｒｅｇ細胞）機能に関連した疾患、障害、および／または状態の処置のための組成物および方法が開示される。一局面では、上記疾患、障害、または状態は、細菌感染症、ウイルス感染症、少なくとも１つの細菌感染に関係する状態、および少なくとも１つのウイルス感染に関係する状態から選択される。

Description

この出願は、２０１６年８月８日に出願された米国仮出願第６２／３７２，１１６号、２０１６年１１月７日に出願された同第６２／４１８，７２２号および２０１６年１１月３日に出願された同第６２／４１７，０４５号（これらの開示は、参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。

Ｔ細胞チェックポイント阻害剤を、Ｅ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および／または、少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤と組み合わせて投与することを含む、増加した制御性Ｔリンパ球細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）機能に関連した疾患、障害、および／または状態の処置のための組成物および方法が開示される。１つのそのような疾患、障害、および／または状態はがんである。

がん腫瘍は、悪性細胞のみからなる塊ではなく、むしろいくつかの悪性細胞およびいくつかの動員された正常細胞型を含むことが現在では理解されている。Ｌｉｕら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ」、ＦＥＢＳ Ｊ． ２８３巻：２７３１〜４８頁の２７３１頁（２０１６年）。悪性細胞と正常細胞の両方が、腫瘍成長および転移を促進することにおいて役割を果たす。同上。腫瘍微小環境においてがん進行を支援する正常細胞の１つは、Ｔ_ｒｅｇ細胞である。

Ｔ_ｒｅｇ細胞は、他の免疫細胞を下方制御し、それにより例えば、自己免疫を防止することにおいて重要な役割を果たす。腫瘍微小環境において、悪性細胞は、Ｔ_ｒｅｇ細胞を引きつけ、他の免疫細胞を下方制御するＴ_ｒｅｇ細胞により発現するサイトカインの局部的濃度を増加させることができる。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、ＰＤ−１などの免疫調節性受容体により誘導および維持される。Ｔ_ｒｅｇ細胞はまた、内皮細胞表面タンパク質、Ｅ−セレクチン、およびＣＸＣＲ４リガンド、ＳＤＦ−１を含む炎症性腫瘍微小環境内でホーミングシグナルに応答する。これらの経路を使用して、がん細胞は、Ｔ_ｒｅｇ細胞を使用して、他の免疫細胞ががんを攻撃するのを防止する。このように、免疫系は、悪性疾患に対して応答を生じることができる場合が多いが、少なくとも一部、Ｔ_ｒｅｇ細胞の影響により、この応答は、腫瘍を排除するのに不十分である場合が多い。

この認識により、Ｔ細胞上のチェックポイントタンパク質と呼ばれる免疫調節性受容体をブロックすることに関心が持たれる。Ｔ細胞上のチェックポイントタンパク質をブロックすることにより、Ｔ細胞はもはや、免疫応答の残りを下方制御することはできず、免疫細胞は、悪性がん細胞を攻撃することができる。これらの免疫チェックポイント阻害剤のうちの２つ、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））およびイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））に対してＦＤＡによる承認がすでに与えられている。ニボルマブは、Ｔ細胞上のＰＤ−１と呼ばれるタンパク質受容体の活性を阻害し、イピリムマブは、ＣＴＬＡ−４と呼ばれるＴ細胞の表面上のチェックポイントタンパク質と結合する。これらのＴ細胞チェックポイント阻害薬は、放射線療法および化学療法などの標準がん処置と組み合わせて使用され得る。

Ｔ細胞チェックポイント阻害剤は、がんを処置するのに有用であり得るが、処置の過程は通常長く、いくつかの副作用がある。さらに、Ｔ細胞チェックポイント阻害剤による処置は、がん細胞による免疫系の徴用の１つの局面、すなわち、Ｔ_ｒｅｇ細胞の誘導および維持を標的とするのみであり、それは、Ｅ−セレクチンおよび／またはＳＤＦ−１による腫瘍微小環境へのＴ細胞の動員に対処していない。

Ｌｉｕら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ」、ＦＥＢＳ Ｊ．（２０１６）２８３巻：２７３１〜４８頁

したがって、がんの処置のためにＴ_ｒｅｇ細胞機能を抑制するためのさらなる組成物および処置、特に、Ｅ−セレクチンおよび／またはＳＤＦ−１関連経路に対処する組成物および処置に対する満たされていないニーズがある。敗血症、敗血症性状態、およびＨＩＶ感染症を含む細菌およびウイルス感染症などの、過剰に活性なまたは多数のＴ_ｒｅｇ細胞に関連した他の疾患、障害、および／または状態の処置のためにＴ_ｒｅｇ細胞機能を抑制するためのさらなる組成物および処置に対する満たされないニーズもある。

一部の実施形態では、少なくとも１つの疾患、障害、または状態の処置および／または防止のための方法であって、それを必要とする被験体に、（１）有効量の少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤、ならびに（２）Ｅ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤から選択される有効量の少なくとも１つの他の阻害剤を投与するステップを含む、方法が開示される。

以下に記載された図面が、例示のみを目的とすることを当業者は理解しているであろう。図面は、本教示の範囲を限定することを決して意図するものではない。

図１は、実験マウスの１２個の群（対照群も含まれる）におけるｍｍ^３での平均腫瘍量として標準誤差付きで示された平均腫瘍成長のグラフである。

図２は、実験マウスの１２個の群（対照群も含まれる）におけるｍｍ^３での腫瘍量中央値として標準誤差付きで示された腫瘍成長中央値のグラフである。

図３Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群１（食塩水対照群、図３Ａ）；群２（ＧＭＩ−１３５９処置、図３Ｂ）；群３（アイソタイプ対照抗体ＬＴＦ−２、図３Ｃ）；および群４（抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図３Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。 図３Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群１（食塩水対照群、図３Ａ）；群２（ＧＭＩ−１３５９処置、図３Ｂ）；群３（アイソタイプ対照抗体ＬＴＦ−２、図３Ｃ）；および群４（抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図３Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。 図３Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群１（食塩水対照群、図３Ａ）；群２（ＧＭＩ−１３５９処置、図３Ｂ）；群３（アイソタイプ対照抗体ＬＴＦ−２、図３Ｃ）；および群４（抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図３Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。 図３Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群１（食塩水対照群、図３Ａ）；群２（ＧＭＩ−１３５９処置、図３Ｂ）；群３（アイソタイプ対照抗体ＬＴＦ−２、図３Ｃ）；および群４（抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図３Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。

図４Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群５（ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体、図４Ａ）；群６（ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図４Ｂ）；群７（食塩水対照、図４Ｃ）；および群８（ＧＭＩ−１３５９処置、図４Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。 図４Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群５（ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体、図４Ａ）；群６（ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図４Ｂ）；群７（食塩水対照、図４Ｃ）；および群８（ＧＭＩ−１３５９処置、図４Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。 図４Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群５（ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体、図４Ａ）；群６（ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図４Ｂ）；群７（食塩水対照、図４Ｃ）；および群８（ＧＭＩ−１３５９処置、図４Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。 図４Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群５（ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体、図４Ａ）；群６（ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図４Ｂ）；群７（食塩水対照、図４Ｃ）；および群８（ＧＭＩ−１３５９処置、図４Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。

図５Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群９（ＬＴＦ−２抗体、図５Ａ）；群１０（抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図５Ｂ）；群１１（ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体、図５Ｃ）；および群１２（ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図５Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。 図５Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群９（ＬＴＦ−２抗体、図５Ａ）；群１０（抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図５Ｂ）；群１１（ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体、図５Ｃ）；および群１２（ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図５Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。 図５Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群９（ＬＴＦ−２抗体、図５Ａ）；群１０（抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図５Ｂ）；群１１（ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体、図５Ｃ）；および群１２（ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図５Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。 図５Ａ〜Ｄは、ｍｍ^３での腫瘍量として示され、対照中央値および群中央値を含む、群９（ＬＴＦ−２抗体、図５Ａ）；群１０（抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図５Ｂ）；群１１（ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体、図５Ｃ）；および群１２（ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置、図５Ｄ）の個々のマウスの腫瘍成長のグラフである。

図６は、１２個の実験群（なお、対照群も含まれる）についての平均体重変化％の標準誤差付きのグラフである。

図７は、実験群７〜１２における個体についての腫瘍におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率のグラフである。

図８は、実験群７〜１２における個体についての腫瘍におけるＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率のグラフである。

図９は、実験群７〜１２における個体についての腫瘍におけるＣＤ１１ｂ^＋／ＧＲ１^＋細胞の百分率のグラフである。

図１０は、実験群７〜１２における個体についての腫瘍におけるＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）の百分率のグラフである。

図１１は、実験群７〜１２における個体についての脾臓におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率のグラフである。

図１２は、実験群７〜１２における個体についての脾臓におけるＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率のグラフである。

図１３は、実験群７〜１２における個体についての脾臓におけるＣＤ１１ｂ^＋／ＧＲ１^＋細胞の百分率のグラフである。

図１４は、実験群７〜１２における個体についての脾臓におけるＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）の百分率のグラフである。

図１５Ａ〜Ｃは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス５、群１０）（図１５Ａ）；ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体で処置された個体（マウス５、群１１）（図１５Ｂ）；ならびにＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス５、群１２）（図１５Ｃ）の腫瘍におけるＴ_ｒｅｇ細胞を示す代表的な散布図である。 図１５Ａ〜Ｃは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス５、群１０）（図１５Ａ）；ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体で処置された個体（マウス５、群１１）（図１５Ｂ）；ならびにＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス５、群１２）（図１５Ｃ）の腫瘍におけるＴ_ｒｅｇ細胞を示す代表的な散布図である。 図１５Ａ〜Ｃは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス５、群１０）（図１５Ａ）；ＧＭＩ−１３５９およびＬＴＦ−２抗体で処置された個体（マウス５、群１１）（図１５Ｂ）；ならびにＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス５、群１２）（図１５Ｃ）の腫瘍におけるＴ_ｒｅｇ細胞を示す代表的な散布図である。

図１６Ａ〜Ｂは、ＧＭＩ−１３５９で処置された個体（マウス４、群８）（図１６Ａ）；ならびにＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス１、群１２）（図１６Ｂ）の脾臓におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞を示す代表的な散布図である。 図１６Ａ〜Ｂは、ＧＭＩ−１３５９で処置された個体（マウス４、群８）（図１６Ａ）；ならびにＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス１、群１２）（図１６Ｂ）の脾臓におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞を示す代表的な散布図である。

図１７Ａ〜Ｂは、食塩水で処置された個体（マウス４、群７）（図１７Ａ）；および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス３、群１０）（図１７Ｂ）の脾臓におけるＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞を示す代表的な散布図である。 図１７Ａ〜Ｂは、食塩水で処置された個体（マウス４、群７）（図１７Ａ）；および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（マウス３、群１０）（図１７Ｂ）の脾臓におけるＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞を示す代表的な散布図である。

図１８Ａ〜Ｃは、ＬＴＦ−２抗体処置で処置された個体（マウス３、群９）（図１８Ａ）；ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体で処置され、安定病態状態を呈する個体（マウス３、群１２）（図１８Ｂ）；ならびにＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置され、進行性疾患状態を呈する個体（マウス４、群１２）（図１５Ｃ）の腫瘍におけるＣＤ１１ｂ^＋／ＧＲ１^＋細胞を示す代表的な散布図である。 図１８Ａ〜Ｃは、ＬＴＦ−２抗体処置で処置された個体（マウス３、群９）（図１８Ａ）；ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体で処置され、安定病態状態を呈する個体（マウス３、群１２）（図１８Ｂ）；ならびにＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置され、進行性疾患状態を呈する個体（マウス４、群１２）（図１５Ｃ）の腫瘍におけるＣＤ１１ｂ^＋／ＧＲ１^＋細胞を示す代表的な散布図である。 図１８Ａ〜Ｃは、ＬＴＦ−２抗体処置で処置された個体（マウス３、群９）（図１８Ａ）；ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体で処置され、安定病態状態を呈する個体（マウス３、群１２）（図１８Ｂ）；ならびにＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置され、進行性疾患状態を呈する個体（マウス４、群１２）（図１５Ｃ）の腫瘍におけるＣＤ１１ｂ^＋／ＧＲ１^＋細胞を示す代表的な散布図である。

図１９は、１２個の処置群についての毒性および効力データの表である。

図２０は、群７（抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置単独）および群１２（組み合わされたＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置）についての、完全奏効（ＣＲ）率および完全奏効までの処置後の日数中央値の比較である。

図２１は、Ｅ−セレクチンおよびＣＸＣＲ４に対するＧＭＩ−１３５９の競合結合活性（ＩＣ５０）を示す表である。

図２２は、各処置群における、研究１５日目、ｉｎ ｖｉｖｏでの、脾臓および腫瘍組織試料における、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、および制御性Ｔ細胞の百分率のグラフを示す。

図２３は、各処置群における、研究５日目、ｉｎ ｖｉｖｏでの、脾臓および腫瘍組織試料におけるＣＤ８／制御性Ｔ細胞の比率を示す表である。

図２４Ａは、平均腫瘍量の群比較および応答集計の表を示す。

図２４Ｂは、ｘ軸に腫瘍植え込み後の日数、およびｙ軸に各処置群における平均腫瘍量（ｍｍ^３）を示すグラフである。

下記で定義される用語は、概して、本明細書を参照することにより、より完全に定義される。本明細書に使用される用語は、当業者によりよく理解されていると考えられるが、この文書に含まれる定義は、現在開示された主題の説明を容易にするために示される。

長年の特許法慣習に従って、特許請求の範囲を含むこの出願に使用される場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、「１つまたは複数」を指す。したがって、例えば、「１個の細胞」への言及は、１個の細胞または複数の細胞を含むなどである。

この開示を通して、様々な実施形態が範囲の形式で提示され得る。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。範囲の形式での記載は、単に、便利さと簡潔さのためであり、本開示の範囲への融通の利かない制限として解釈されるべきではないことは理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分的範囲、加えて、その範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１から６までなどの範囲の記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの部分的範囲、加えて、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３．８、４、５．１、５．３、および６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関わらず適用される。

Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）は、活性化内皮細胞上に発現している細胞接着分子であり、傷害部位への白血球の動員において重要な役割を果たす。用語「Ｅ−セレクチン阻害剤」または「Ｅ−セレクチンアンタゴニスト」などは、交換可能に使用され、Ｅ−セレクチンの活性を阻害し、またはＥ−セレクチンの１つもしくは複数のＥ−セレクチンリガンドとの結合を阻害する（それは、次に、Ｅ−セレクチンの生物学的活性を阻害し得る）作用物質を意味する。用語「Ｅ−セレクチン阻害剤」は、Ｅ−セレクチンのみの阻害剤、加えて、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンまたはＬ−セレクチンのいずれかの阻害剤、ならびにＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、およびＬ−セレクチンの阻害剤を含む。

用語「非糖模倣部分（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）」は、炭水化物分子を模倣することを意図されない構造を有する部分を含む。非糖模倣部分は、Ｅ−セレクチンアンタゴニストとして活性ではない場合がある（典型的には、活性ではない）。代わりとして、非糖模倣部分は、一般的に、糖模倣体（ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃ）の溶解度、生物学的利用能、親油性、および／または他の薬物様特徴などの少なくとも１つの特徴を変化させることを目的として、糖模倣部分に付加される部分である。

「Ｔ_ｒｅｇ細胞」は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を防止するＴ細胞の亜集団である。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、免疫抑制性であり、一般的に、他のＴ細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御する。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、バイオマーカーＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３を発現する（すなわち、ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋である）。

Ｔ細胞チェックポイントは、免疫応答を開始するために活性化または不活性化される必要がある分子である。「Ｔ細胞チェックポイント阻害剤」、「チェックポイント阻害剤」、または「免疫調節性受容体ブロック」は、正常なＴ細胞チェックポイント作動を防止または阻害し、免疫応答を防止する作用物質である。例えば、ＰＤ−１（細胞死タンパク質１）は、自己認識において重要であるＴ細胞上のチェックポイントタンパク質である。ＰＤ−１は、通常、Ｔ細胞が正常な体細胞を攻撃するのを防ぐ。なぜなら、正常な体細胞はＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１と結合するリガンド）を提示しているからである。ＰＤ−１チェックポイントタンパク質が細胞のＰＤ−Ｌ１タンパク質に付着する場合、そのＴ細胞は、その細胞を攻撃しない。上記で言及されているように、ＰＤ−Ｌ１は、正常細胞上に存在するが、いくつかのがん細胞は、大量のＰＤ−Ｌ１を有し、そのことが、それらが免疫攻撃を逃れるのを助ける。Ｔ細胞チェックポイント阻害剤は、がん細胞上に提示されたＰＤ−Ｌ１タンパク質をブロックして（またはそれは、Ｔ細胞のＰＤ−１をブロックする場合がある）、Ｔ細胞のＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１と結合するのを防止し得る。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合がブロックされた場合には、Ｔ細胞は、その細胞を「自己」として認識せず、その細胞を攻撃し得る。したがって、Ｔ細胞チェックポイント阻害剤は、免疫系が、ＰＤ−Ｌ１タンパク質を提示するがん細胞を攻撃することを援助し得る。Ｔ細胞チェックポイント阻害剤の例は、当技術分野において公知であり、それには、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ４抗体が挙げられる。

用語「患者」、「被験体」、「個体」などは、本明細書において交換可能に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏかｉｎ ｓｉｔｕかに関わらず、本明細書に記載された方法に適切な任意の動物またはその細胞を指す。ある特定の非限定的実施形態では、患者、被験体、または個体はヒトである。

用語「治療」は、疾患を阻害すること（それの発生を遅くし、または阻止すること）、疾患の症状または副作用からの解放を提供すること（対症療法を含む）、および疾患を軽減すること（疾患の退縮を引き起こすこと）を含む、疾患または状態を「処置すること」または疾患または状態の「処置」を指す。「治療」はまた、予防的処置を指し得、それは、疾患に対する素因を有し得るが、疾患の症状をまだ経験も呈示もしていない被験体において、疾患または状態の発生が起きるのを防止し、または遅延させることを含む。

本明細書で使用される場合、「一緒に」は、複数の作用物質が同時に投与されることを意味するように使用される。これらの作用物質は、同じ組成物において、または別々の組成物において投与することができる。「一緒に」とは対照的に、「逐次的に」は、１つの作用物質の投与と他の作用物質の投与との間の隔たりが顕著である、すなわち、最初に投与された作用物質が、第２の作用物質および／または第３の作用物質が投与されるときに血流にもはや治療量では存在し得ないことを意味するように本明細書で使用される。複数の化合物は、逐次的に投与される場合、任意の順序で投与され得る（例えば、Ｔ細胞チェックポイント阻害剤が最初に投与され、その後、Ｅ−セレクチン阻害剤が投与される、またはＥ−セレクチン阻害剤が最初に投与され、その後、Ｅ−セレクチン阻害剤が投与されるなど）。

用語「処置」は、疾患の進行の減速、妨害、阻止、逆転、または停止を意味し、それは、必ずしも、疾患の全ての徴候および症状の完全な排除を必要とするわけではない。さらに、処置が、処置された患者の１００％において有効性を示すことは必要ではなく、むしろ、用語「処置」は、患者の統計的に有意な割合が、症状および臨床徴候が少なくともある改善を示すように、有効に処置され得ることを意味するよう意図される。当業者は、様々な統計的方法（例えば、信頼区間、ｐ値の決定、スチューデントｔ検定、マンホイットニー検定など）を使用して、その割合が統計的に有意であるかどうかを容易に確立することができる。信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の信頼度を有する。ｐ値は０．１、０．０５、０．０１、０．００５、または０．０００１である。

一部の実施形態では、（１）少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および（２）少なくとも１つの他の阻害剤のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの医薬組成物の形である。一部の実施形態では、少なくとも１つの医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される成分をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤が第１の医薬組成物の形であり、少なくとも１つの他の阻害剤が第２の医薬組成物の形である。

一部の実施形態では、少なくとも１つの、細菌感染症、ウイルス感染症、または少なくとも１つの細菌もしくはウイルス感染に関係する状態の処置および／または防止のための方法であって、それを必要とする被験体に、（１）有効量の少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤、ならびにＥ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤から選択される有効量の少なくとも１つの他の阻害剤、ならびに／または（２）少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤と、Ｅ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤から選択される少なくとも１つの他の阻害剤とを含む有効量の少なくとも１つの医薬組成物を投与するステップを含む、方法が開示される。一部の実施形態では、感染症はＨＩＶ感染症である。一部の実施形態では、細菌またはウイルス感染に関係する状態は、敗血症または敗血症性状態である。

一部の実施形態では、少なくとも１つのがんの処置および／または防止のための方法であって、それを必要とする被験体に、（１）有効量の少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤、ならびにＥ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤から選択される有効量の少なくとも１つの他の阻害剤、ならびに／または（２）少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤と、Ｅ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤から選択される少なくとも１つの他の阻害剤とを含む有効量の少なくとも１つの医薬組成物を投与するステップを含む、方法が開示される。

一部の実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞の抑制が望まれる少なくとも１つの疾患、障害、または状態の処置および／または防止のための方法であって、それを必要とする被験体に、（１）有効量の少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤、ならびにＥ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤から選択される有効量の少なくとも１つの他の阻害剤、ならびに／または（２）少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤と、Ｅ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤から選択される少なくとも１つの他の阻害剤とを含む有効量の少なくとも１つの医薬組成物を投与するステップを含む、方法が開示される。

一部の実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞の抑制が望まれる少なくとも１つの疾患、障害、または状態の処置および／または防止のための方法であって、それを必要とする被験体に、（１）有効量の少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および有効量の少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤、ならびに／または（２）少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含む有効量の少なくとも１つの医薬組成物を投与するステップを含む、方法が開示される。

一部の実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞の抑制が望まれる少なくとも１つの疾患、障害、または状態の処置および／または防止のための方法であって、それを必要とする被験体に、（１）有効量の少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および有効量の少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤、ならびに／または（２）少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤を含む有効量の少なくとも１つの医薬組成物を投与するステップを含む、方法が開示される。

一部の実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞の抑制が望まれる少なくとも１つの疾患、障害、または状態の処置および／または防止のための方法であって、それを必要とする被験体に、（１）有効量の少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含む有効量の少なくとも１つのヘテロ二機能性阻害剤、ならびに／または（２）少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤と、少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含む少なくとも１つのヘテロ二機能性阻害剤とを含む有効量の少なくとも１つの医薬組成物を投与するステップを含む、方法が開示される。

任意のＴ細胞チェックポイント阻害剤が、本明細書に開示された組成物および方法に使用することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤は、Ｔ_ｒｅｇ細胞上のＰＤ−１受容体および／またはＣＴＬＡ−４タンパク質を標的にする。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤は、抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤は、ニボルマブおよびイピリムマブから選択される。

本明細書における少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含む、Ｅ−セレクチン阻害剤は、糖模倣体から選択され得る。一部の実施形態では、Ｅ−セレクチン阻害剤は、シアリルルイス^Ｘ（ｓＬｅ^Ｘ）およびｓＬｅ^Ｘ模倣体から選択される。一部の実施形態では、Ｅ−セレクチン阻害剤は、Ｅ−セレクチンの小分子糖模倣性アンタゴニスト、Ｅ−セレクチンを対象とする抗体、Ｅ−セレクチンに対するアプタマー、Ｅ−セレクチンを対象とするペプチド、およびＥ−セレクチンを対象とするペプチド模倣体から選択される。

一部の実施形態では、Ｅ−セレクチン阻害剤は、式（Ｉ）：
の化合物、式（Ｉ）の異性体、式（Ｉ）の互変異性体、および前記のいずれかの薬学的に許容される塩から選択され、式中、
Ｒ^１は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され；
Ｒ^２は、Ｈ、−Ｍ、および−Ｌ−Ｍから選択され；
Ｒ^３は、−ＯＨ基、−ＮＨ_２基、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｙ^１基、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｙ^１基、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＹ^１基から選択され、Ｙ^１が、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、Ｃ_２〜８ハロアルキニル基、Ｃ_６〜１８アリール基、およびＣ_１〜１３ヘテロアリール基から選択され；
Ｒ^４は、−ＯＨ基および−ＮＺ^１Ｚ^２基から選択され、Ｚ^１およびＺ^２が、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され、Ｚ^１およびＺ^２が一緒になって環を形成してもよく；
Ｒ^５は、Ｃ_３〜Ｃ_８シクロアルキル基から選択され；
Ｒ^６は、−ＯＨ基、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され；
Ｒ^７は、−ＣＨ_２ＯＨ基、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され；
Ｒ^８は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され；
Ｌはリンカー基から選択され；
Ｍは、ポリエチレングリコール、チアゾリル、クロメニル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_１〜４ＮＨ_２、Ｃ_１〜８アルキル、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＹから選択される非糖模倣部分であり、Ｙが、Ｃ_１〜４アルキル基、Ｃ_２〜４アルケニル基、およびＣ_２〜４アルキニル基から選択される。

当業者により認識されているように、句「式（Ｉ）の異性体、式（Ｉ）の互変異性体、および前記のいずれかの薬学的に許容される塩」は、水和物および溶媒和物を含む。

一部の実施形態では、Ｅ−セレクチン阻害剤は、式（Ｉ）の化合物（式中、非糖模倣部分がポリエチレングリコールを含む）から選択される。

本明細書で使用される場合、「ＣＸＣＲ４受容体阻害剤」、「ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体阻害剤」、「ＳＤＦ−１阻害剤」、または「ＳＤＦ−１アンタゴニスト」などは、交換可能に使用され、ケモカインＳＤＦ−１のＳＤＦ−１リガンドとの結合を阻害する（例えば、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４との結合を防止する）作用物質を意味する。そのような阻害剤は、典型的には、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）のＣＸＣＲ４受容体との結合を防止する。ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体阻害剤の例は、ＡＭＤ−３１００（Ｈｅｎｄｒｉｘら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４４巻：１６６７〜１６７３頁、２０００年）；ＡＬＸ４０−４Ｃ（Ｄｏｒａｎｚら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １７巻：４７５〜４８６頁、２００１頁）；およびＴ１３４（Ａｒａｋａｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３巻：１７１９〜１７２３頁、１９９９年）である。これらの例は、有機小分子、およびＴ２２ペプチドなどのアミノ酸に基づいた分子を含む。

一部の実施形態では、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤は、ペプチド（ｐｅｔｐｉｄｅｓ）、ジケトピペラジン模倣体、ビシクラム（ｂｉｃｙｃｌａｍ）、テトラヒドロキノリン、チアゾリルイソチオ尿素誘導体、およびベンゾジアゼピンから選択される。一部の実施形態では、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤は、ＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ１３４、およびＴ２２ペプチドから選択される。

一部の実施形態では、ヘテロ二機能性阻害剤は、式（ＩＩ）：
の化合物、式（ＩＩ）の異性体、式（ＩＩ）の互変異性体、および前記のいずれかの薬学的に許容される塩から選択され、式中、
Ｒ^１は、Ｈ、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜８ハロアルキニル基から選択され；
Ｒ^２は、−ＯＨ基、−ＮＨ_２基、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｙ^１基、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｙ^１基、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＹ^１基から選択され、Ｙ^１がＣ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、Ｃ_２〜８ハロアルキニル基、Ｃ_６〜１８アリール基、およびＣ_１〜１３ヘテロアリール基から選択され；
Ｒ^３は、−ＣＮ基、−ＣＨ_２ＣＮ基、および−Ｃ（＝Ｏ）Ｙ^２基から選択され、Ｙ^２が、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、−ＯＺ^１基、−ＮＨＯＨ基、−ＮＨＯＣＨ_３基、−ＮＨＣＮ基、および−ＮＺ^１Ｚ^２基から選択され、Ｚ^１およびＺ^２が、同一でも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜８ハロアルキニル基から独立して選択され、Ｚ^１およびＺ^２が一緒になって環を形成してもよく；
Ｒ^４は、Ｃ_３〜８シクロアルキル基から選択され；
Ｒ^５は、Ｈ、ハロ基、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜８ハロアルキニル基から独立して選択され；
ｎは、１から４までの範囲の整数から選択され；
Ｌは、リンカー基から選択される。

当業者により認識されているように、句「式（ＩＩ）の異性体、式（ＩＩ）の互変異性体、および前記のいずれかの薬学的に許容される塩」は、水和物および溶媒和物を含む。

一部の実施形態では、ヘテロ二機能性阻害剤は、式（ＩＩａ）：
の化合物から選択される。

一部の実施形態では、式Ｉおよび／または式ＩＩのリンカー基は、例えば、−（ＣＨ２）_ｐ−および−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐ−（式中、ｐは、１から３０までの範囲の整数から選択される）のようなスペーサー基などのスペーサー基を含む群から独立して選択される。一部の実施形態では、ｐは、１から２０までの範囲の整数から選択される。スペーサー基の他の非限定的例には、カルボニル基、およびカルボニル含有基、例えば、アミド基が挙げられる。スペーサー基の非限定的例は、
である。

一部の実施形態では、リンカー基は、
から独立して選択される。

他のリンカー基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（式中、ｐは、１から３０までの範囲の整数から選択され、またはｐは、１から２０までの範囲の整数から選択される）は、当業者および／または本開示を把握している者にはよく知られているであろう。

一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカー基は
である。

一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカー基は
である。

一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカー基は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＮＨ−、−ＣＨ_２ＮＨＣＨ_２−、および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ_２−から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカー基は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＮＨ−である。

一部の実施形態では、少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤は、式（Ｉａ）：
の化合物から選択され、

式中、ｎは、１から１００までの範囲の整数から選択される。一部の実施形態では、ｎは、４、８、１２、１６、２０、２４、および２８から選択される。

一部の実施形態では、Ｅ−セレクチン阻害剤は、参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第９，１０９，００２号に開示されたＥ−セレクチン阻害剤から選択される。一部の実施形態では、Ｅ−セレクチン阻害剤は、ＧＭＩ−１２７１である。例えば、Ｐｒｉｃｅら、「Ｄｏｒｍａｎｔ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｒｅｓｉｄｅ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｎｉｃｈｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｔｒａｎｓｉｔ ｔｏ ａｎｄ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８巻（３４０号）、２０１６年５月２５日、［ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｄ４０５９］；Ｄｕｔｔａら、「Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｍｉｔｉｇａｔｅｓ Ｓｐｌｅｎｉｃ ＨＳＣ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｙｅｌｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ Ｍｉｃｅ Ｗｉｔｈ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ［ＤＯＩ： １０．１１６１／ＡＴＶＢＡＨＡ．１１６．３０７５１９］を参照。

一部の実施形態では、ヘテロ二機能性阻害剤は、以下の式
の化合物から選択される。

一部の実施形態では、ヘテロ二機能性阻害剤は、以下の式
の化合物から選択される。

一部の実施形態では、ヘテロ二機能性阻害剤は、参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第８，４１０，０６６号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６３１９１に開示されたヘテロ二機能性阻害剤から選択される。一部の実施形態では、ヘテロ二機能性阻害剤は、ＧＭＩ−１３５９である。例えば、Ｓｔｅｅｌｅ， Ｍａｒｉａ Ｍ．ら、「Ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ ａｎｄ ＣＸＣＲ４ （ＧＭＩ−１３５９） ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １０６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１５年４月１８〜２２日、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ； Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （ＰＡ）： ＡＡＣＲ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５年、７５巻（１５号補遺）：抄録番号４２５、ｄｏｉ：１０．１１５８／１５３８−７４４５．ＡＭ２０１５−４２５；Ｇｒａｖｉｎａ， Ｇｉｏｖａｎｎｉ Ｌ．ら、「Ｄｕａｌ Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ ａｎｄ ＣＸＣＲ４ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １０６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１５年４月１８〜２２日、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ； Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （ＰＡ）： ＡＡＣＲ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５年、７５巻（１５号補遺）：抄録番号４２８、ｄｏｉ：１０．１１５８／１５３８−７４４５．ＡＭ２０１５−４２８（これらは全て参照により組み入れられている）を参照。

一部の実施形態では、少なくとも１つの疾患、障害、または状態は、がんから選択される。一部の実施形態では、がんは、液性がん（例えば、ＭＭ、ＡＬＬ、およびＡＭＬ）および固形がん（例えば、前立腺がん）から選択される。一部の実施形態では、がんは液性がんから選択される。一部の実施形態では、がんは固形がんから選択される。一部の実施形態では、被験体は、固形がんの腫瘍において局部的に処置される。

一部の実施形態では、がん性細胞の増加（例えば、腫瘍成長またはがん細胞増殖）の速度が、低下または停止する。一部の実施形態では、がん細胞の数が減少する。一部の実施形態では、がん細胞が排除される。一部の実施形態では、がん細胞の転移が低下する。一部の実施形態では、がん細胞の転移が停止する。一部の実施形態では、がんの骨髄への浸潤が低下または停止する。

一部の実施形態では、被験体はがんを有し、化学療法および／または放射線療法を受けたことがある、または受ける予定である。一部の実施形態では、化学療法は、白金、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、アザチオプリン、メルカプトプリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、メトトレキセート、ゲムシタビン、タキサン、ロイコボリン、マイトマイシンＣ、テガフール−ウラシル、イダルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、イホスファミド、およびドキソルビシンから選択される治療有効量の少なくとも１つの化合物を投与することを含む。

一部の実施形態では、化学療法は、ボルテゾミブの投与を含む。一部の実施形態では、化学療法は、ゲムシタビンの投与を含む。

一部の実施形態では、少なくとも１つの疾患、障害、または状態は、細菌感染症、ウイルス感染症、および細菌またはウイルス感染に関係する状態から選択される。一部の実施形態では、ウイルス感染症は、ＨＩＶ感染症であり、および／または患者が、ＡＩＤＳまたはＨＩＶ関係の病気と診断されている。一部の実施形態では、細菌感染症は敗血症であり、および／または被験体が敗血症性状態と診断されている。

一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および少なくとも１つの他の阻害剤の被験体への投与は、１つの作用物質の治療効果（すなわち、患者への測定可能な利益が観察される、使用後の期間）が、少なくともある時点において、第２の作用物質の治療効果の期間と一致するように、適切に重複する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および少なくとも１つの他の阻害剤は同時に投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および少なくとも１つの他の阻害剤は異なる時点で投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および少なくとも１つの他の阻害剤は逐次的に投与される。

一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および少なくとも１つの他の阻害剤は、単一の医薬組成物で投与される。

一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および少なくとも１つの他の阻害剤は別々の医薬組成物で投与される。

一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの追加の薬学的に許容される成分をさらに含む。

薬学的剤形において、本開示の化合物の任意の１つまたは複数は、塩などの薬学的に許容される誘導体の形で投与され得、ならびに／またはそれ／それらはまた、単独で、および／もしくは他の薬学的活性化合物と、適切に会合して、もしくは組み合わせて、使用され得る。

「有効量」または「治療有効量」は、被験体に、単回用量として、または一連の用量の一部として投与される場合、少なくとも１つの治療効果を生じるのに有効である、本開示の化合物または少なくとも１つのそのような化合物を含む組成物の量を指す。例えば、がんの場合、治療効果は、がん細胞を死滅させること、がん細胞においてアポトーシスを誘導すること、がん細胞の成長速度を低下させること、転移の発生率もしくは数を低減すること、腫瘍サイズを低減すること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給を低減すること、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を防止もしくは阻害すること、またはがんを有する被験体の寿命を増加させることであり得る。

最適な用量は、一般的に、実験モデルおよび／または臨床試験を使用して決定され得る。本明細書に記載された治療薬のそれぞれについての前臨床および臨床研究（予防的利益のために投与される場合を含む）の設計および遂行は、十分、関連分野の当業者の能力の範囲内である。治療薬の最適な用量は、被験体のボディマス、重量、および／または血液量に依存し得る。有効な治療を提供するのに十分である最小用量は、一部の実施形態において使用され得る。被験体は、一般的に、処置または防止されることになっている疾患または状態に適したアッセイを使用して、治療的有効性についてモニターされ得、そのアッセイは、当業者に周知であろうし、本明細書に記載されている。被験体に投与される化合物のレベルは、生物学的流体、例えば、血液、血液画分（例えば、血清）、および／もしくは尿、ならびに／または被験体由来の他の生物学的試料において、化合物（またはその化合物の代謝産物）のレベルを決定することによりモニターされ得る。化合物またはその代謝産物を検出するために当技術分野において実施される任意の方法が、治療レジメンの経過中に化合物のレベルを測定するために使用され得る。

本明細書に記載された化合物の用量は、被験体の状態、すなわち、疾患の病期、疾患に引き起こされる症状の重症度、全般的な健康状態、ならびに、年齢、性別、および体重、ならびに医療分野の当業者に明らかな他の因子に依存し得る。同様に、疾患または障害を処置するための治療薬の用量は、医療分野の当業者により理解されたパラメータに従って決定され得る。

医薬組成物は、医療分野の当業者により決定されるように、処置されるべき疾患または障害に適切な任意の様式で投与され得る。適切な用量ならびに投与の適した期間および頻度は、患者の状態、患者の疾患の型および重症度、活性成分の特定の形態、および投与方法を含む、本明細書で論じられているような因子により決定される。一般的に、適切な用量（または有効用量）および処置レジメンは、治療的および／または予防的利益（例えば、より頻繁な完全もしくは部分的寛解、またはより長い無病生存および／もしくは全生存、または症状重症度の減少、または上記で詳細に記載されているような他の利益などの臨床転帰の向上）を提供するのに十分な量で、本明細書に記載されているような医薬組成物を提供する。

本明細書に記載された医薬組成物は、それを必要とする被験体に、有効量のその化合物を有効に送達するいくつかの経路のいずれか１つにより投与され得る。非限定的な適切な投与経路（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ ｒｏｕｔｅ）には、局所的、経口、経鼻、髄腔内、経腸、頬側、舌下、経皮、直腸、膣、眼内、結膜下、舌下、ならびに、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿体内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ）、管内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、および尿道内（ｉｎｔｒａｕｒｅｔｈｒａｌ）の注射および／または注入を含む非経口投与が挙げられる。

本明細書に記載された医薬組成物は、無菌水性もしくは無菌非水性溶液、懸濁物、またはエマルジョンであり得、追加として、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤（すなわち、活性成分の活性に干渉しない無毒性材料）を含み得る。そのような組成物は、固体、液体、または気体（エアロゾル）の形態であり得る。あるいは、本明細書に記載された組成物は、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅ）として製剤化され得、または本明細書に記載された化合物が、当技術分野において公知のテクノロジーを使用して、リポソーム内にカプセル化され得る。医薬組成物はさらに、生物学的に活性または不活性であり得る、少なくとも１つの追加の薬学的に許容される成分を含み得る。そのような成分の非限定的例には、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡおよびグルタチオン）、安定剤、染料、矯味矯臭剤、懸濁化剤、および保存剤が挙げられる。

医薬組成物に使用される、当業者に公知の任意の適切な賦形剤または担体は、本明細書に記載された組成物に用いられ得る。治療用の賦形剤は、周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ（２００５年））に記載されている。一般的に、賦形剤の型は、投与形式、および、活性成分の化学組成に基づいて選択される。医薬組成物は、特定の投与形式のために製剤化され得る。非経口投与について、医薬組成物は、水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、および緩衝液をさらに含み得る。経口投与について、医薬組成物は、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなどの前述の賦形剤、固体賦形剤および担体のいずれかから選択される少なくとも１つの成分をさらに含み得る。

医薬組成物（例えば、経口投与用、または注射による送達用）は、液体の形態であり得る。液体医薬組成物は、例えば、以下：注射用水などの無菌希釈剤、食塩溶液、生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒もしくは懸濁媒体として働き得る固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；抗細菌剤；抗酸化剤；キレート剤；塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調整のための緩衝液および作用物質の少なくとも１つを含み得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックでできた、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアルに封入され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、生理食塩水を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、注射用医薬組成物であり、一部の実施形態では、注射用医薬組成物は無菌である。

経口製剤について、本開示の化合物のうちの少なくとも１つは、単独で、または錠剤、散剤、顆粒剤、および／もしくはカプセル剤を作製するのに適切な少なくとも１つの添加物、例えば、通常の添加物、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着色剤、および矯味矯臭剤から選択されるものと組み合わせて使用することができる。医薬組成物は、活性成分の、胃の環境の低ｐＨからの保護および／または腸溶コーティングを提供し得る、少なくとも１つの緩衝剤を含むように製剤化され得る。医薬組成物は、少なくとも１つの矯味矯臭剤と共に、例えば、液体、固体、もしくは半固体製剤において、および／または腸溶コーティングを有して、経口送達のために製剤化され得る。

経口製剤は、ゼラチンカプセル剤として提供され得、それは、活性化合物または生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を粉末担体と共に含有し得る。同様の担体および希釈剤は、圧縮錠を作製するために使用され得る。錠剤およびカプセル剤は、持続放出性産物として製造されて、ある期間にわたる活性成分の持続的放出を提供することができる。圧縮錠は、糖でコーティングされてもしくはフィルムでコーティングされて、いかなる不快な味覚もマスクし、大気から錠剤を保護することができ、または胃腸管における選択的崩壊のために腸溶コーティングされることができる。

医薬組成物は、持続放出または緩徐放出のために製剤化され得る。そのような組成物は、一般的に、周知のテクノロジーを使用して調製され、例えば、口腔、直腸、もしくは皮下の植え込みにより、または所望の標的部位における植え込みにより、投与され得る。持続放出製剤は、担体マトリクス中に分散した、および／または速度制御性膜により囲まれたリザーバ内に含有された活性治療薬を含有し得る。そのような製剤内に使用される賦形剤は、生体適合性であり、また生分解性であり得る；その製剤はまた、活性コンポーネント放出の相対的に一定のレベルを提供し得る。持続放出製剤内に含有される活性治療薬の量は、植え込みの部位、放出の速度および予想される放出時間、ならびに処置または防止されるべき状態の性質に依存する。

本明細書に記載された医薬組成物は、乳化基剤または水溶性基剤などの様々な基剤と混合することにより坐剤として製剤化することができる。医薬組成物は、吸入を介して投与され得るエアロゾル製剤として調製され得る。組成物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧体中へ製剤化され得る。

本開示の化合物およびこれらの化合物を含む医薬組成物は、局所的に（例えば、経皮投与により）投与され得る。局所製剤は、経皮パッチ、軟膏、ペースト、ローション、クリーム、ゲルなどの形態であり得る。局所製剤は、浸透剤または浸透エンハンサー（透過エンハンサーとも呼ぶ）、増粘剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ ａｉｄ）、または結合剤の１つまたは複数を含み得る。物理的な浸透エンハンサーには、例えば、イオン導入などの電気泳動技術、超音波（または「フォノフォレシス」）の使用などが挙げられる。化学的な浸透エンハンサーは、治療薬の投与の前、同時、または直後のいずれかで投与される作用物質であり、薬物の皮膚を通っての浸透の増強を提供するために、皮膚、特に角質層の透過性を増加させる。追加の化学的および物理的浸透エンハンサーは、例えば、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ、Ａ． Ｆ． Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ（編）１９８７年 ＣＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ、Ｓｍｉｔｈら編（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年）；Ｌｅｎｎｅｒａｓら、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５４巻：４９９〜５０８頁（２００２年）；Ｋａｒａｎｄｅら、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １９巻：６５５〜６０頁（２００２年）；Ｖａｄｄｉら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． ９１巻：１６３９〜５１頁（２００２年）；Ｖｅｎｔｕｒａら、Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ９巻：３７９〜９３頁（２００１年）；Ｓｈｏｋｒｉら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． ２２８巻（１〜２号）：９９〜１０７頁（２００１年）；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２４巻：６９８〜７００頁（２００１年）；Ａｌｂｅｒｔｉら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ７１巻：３１９〜２７頁（２００１年）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ５７巻：３０１〜５頁（２００１年）；Ｋｉｉｊａｖａｉｎｅｎら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． １０巻：９７〜１０２頁（２０００年）；およびＴｅｎｊａｒｌａら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． １９２巻：１４７〜５８頁（１９９９年）に記載されている。

投与経路には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内、および皮下の経路が挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、化合物または組成物は、局部的に（すなわち、がん腫瘍の近くに）投与される。一部の実施形態では、化合物または組成物の１つまたは複数は、異なる投与経路を使用して投与される。

化合物または医薬組成物は、１つまたは複数の用量および処置レジメンで投与することができ、その用量および処置レジメンは、同じか、または異なり得る。一実施形態では、化合物または医薬組成物のそれぞれは、１日１回、約１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの範囲の量で投与される。他の実施形態では、投薬量は、任意の投薬量であり得、約１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇが挙げられるが、それらに限定されない。

一部の実施形態では、化合物または医薬組成物は、これらの量および範囲のいずれかで、１日１回、１日に１回より多く、１日おきに、２日ごとになど、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤、ならびに少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および／または、Ｅ−セレクチン阻害剤がＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結されているヘテロ二機能性阻害剤は、同時に、および／または１日あたり同じ数の処置において、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤、ならびに少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および／または、Ｅ−セレクチン阻害剤がＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結されているヘテロ二機能性阻害剤は、異なるスケジュールで投与される。１つまたは複数の処置サイクルが繰り返され得、任意の数のサイクルが企図される。１日あたりの処置の数および各化合物または医薬組成物についての用量あたりの量は、各サイクル中、変化してもよい。

例えば経口用量または注射可能な用量における、本開示の少なくとも１つの化合物または医薬組成物の単位用量を含むキットが提供される。そのようなキットは、単位用量、目的の病理学的状態を処置することにおける治療薬の使用および付随する利益を記載する情報添付文書、ならびに／または任意選択で、少なくとも１つの化合物および／もしくはそれを含む医薬組成物の送達のための器具またはデバイスを含む容器を含み得る。

概要
本研究の主要な目標は、Ｔ細胞チェックポイント阻害剤のＥ−セレクチン阻害剤および／またはＣＸＣＲ４受容体阻害剤との投与を含む処置の抗がん活性を決定することであった。使用されたＴ細胞チェックポイント阻害剤は、抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体であった。Ｅ−セレクチンとＣＸＣＲ４受容体の両方の阻害剤である、ヘテロ二機能性阻害剤ＧＭＩ−１３５９を使用した。

抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体（１０Ｆ．９Ｇ２）およびＧＭＩ−１３５９の抗がん活性を、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、未定皮下ＣＴ２６．ＷＴ癌異種移植片に対するラットアイソタイプ対照抗体と比較した。各マウスの免疫プロファイルを、腫瘍および脾臓をサンプリングし、活性免疫応答のいくつかのマーカーについて染色し、これらのマーカーのレベルをフローサイトメトリーにより検出することにより決定した。フローサイトメトリーマーカーは、Ｔ細胞（ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋）、制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）（ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋）、ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ^＋／Ｇｒ１^＋）、ならびに既存のＣＤ４／ＣＤ８パネルに加えられたＣＣＲ７^＋およびＣＤ６２^＋の同時発現を含んだ。

材料および方法
化学物質：ＧＭＩ−１３５９（分子量＝１１１５ｇ／ｍｏｌ、ロット＃５０．２７９）を、あらかじめ秤量された結晶粉末として入手した。受け取ったら、それを、遮光して−２０℃で保存した。ＧＭＩ−１３５９を無菌食塩水中に製剤化した。ビヒクル（無菌食塩水）を、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に達するように、そのあらかじめ秤量された化合物に加えた。その後、その製剤を２０℃で一晩、撹拌した。最終投与溶液は、９．９９のｐＨを有して、透明無色であった。その投与製剤を、毎週、新鮮に調製し、使用中ではない時は、遮光して、２０℃で保存した。ＧＭＩ−１３５９の用量レベルは、バルクの原薬として示された。

ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２（５．８ｍｇ／ｍｌ、ロット＃５５３５−３−６−７／０５１５）を、透明無色のストック溶液として入手した。受け取ったら、遮光して、４℃で保存した。そのストック溶液をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈することにより投与溶液を調製した。最終投与溶液は、７．２９のｐＨを有して、透明無色であった。投与製剤を、週１回、調製し、使用中ではない時は、遮光して、４℃で保存した。各投与日において、投与製剤を、投与前および投与中、氷上で保存した。

抗ｍＰＤ−Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２、６．３９ｍｇ／ｍｌ、ロット＃５５９２−４−６／０６１５）を、無色透明のストック溶液として入手した。受け取ったら、遮光して、４℃で保存した。そのストック溶液をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈することにより投与溶液を調製した。最終投与溶液は、６．９６のｐＨを有して、透明無色であった。その製剤を、週１回、調製し、使用中ではない時は、遮光して、４℃で保存した。各投与日において、投与製剤を、投与前および投与中、氷上で保存した。

動物および管理（ｈｕｓｂａｎｄｒｙ）：雌Ｈａｒｌａｎ Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄ）をこの研究に使用した。それらは、実験の１日目において週齢６〜７週間であった。その動物に、照射されたＨａｒｌａｎ ２９１８．１５齧歯類食餌および水を随意に給餌した。動物は、１時間あたり１００回の完全な換気でＨ．Ｅ．Ｐ．Ａ濾過された空気をバブル環境（ｂｕｂｂｌｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）へ供給するＢｉｏｂｕｂｂｌｅ（登録商標）クリーンルームの内部にＢｅｄ−Ｏ’Ｃｏｂｓ（商標）敷き藁を有する固定ケージに収容した。全ての処置、体重決定、および腫瘍測定を、バブル環境において行った。その環境は、７０°±２°Ｆの温度範囲、および３０〜７０％の湿度範囲に管理された。これらの実験において行われた全ての手順は、ＡＡＡＬＡＣ公認施設においてＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）の全ての法規、規則、およびガイドラインに従って実施された。

細胞調製：ＣＴ２６．ＷＴ細胞を、１ｍＭピルビン酸Ｎａ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５ｇ／Ｌグルコースで改変され、１０％非加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％１００×ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（ＰＳＧ）を補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。成長環境を、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気でのインキュベーター内で維持した。

拡大増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）が完了したら、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用してトリプシン処理した。細胞脱離後、トリプシンを、完全成長培地での希釈により不活性化し、細胞のいかなる凝集塊もピペッティングにより分離させた。細胞を、４℃で８分間、２００ｒｃｆで遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを、ピペッティングにより、冷Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中に再懸濁した。均一な細胞懸濁物のアリコートを、トリパンブルー溶液中に希釈し、Ｌｕｎａ自動細胞カウンターを使用してカウントした。植え込み前細胞生存率は９２％であった。細胞懸濁物を、４℃で８分間、２００ｒｃｆで遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを冷たい無血清培地中に再懸濁して、トリパン排除細胞２．５０Ｅ＋０６個／ｍｌの最終濃度が得られた。細胞懸濁物を、植え込み中、湿った氷上で維持した。植え込み後、残りの細胞のアリコートを、トリパンブルー溶液で希釈し、カウントして、植え込み後細胞生存率（９１％）を決定した。

試験動物に、０日目、０．２ｍｌの無血清培地中５．００Ｅ＋０５個の細胞を腋窩の上部（前肢の真下）の皮下へ２７ゲージの針およびシリンジを使用して、植え込んだ。

以下の実験において以下の分類を使用した。全てのＣＤ８^＋細胞のうち、Ｔ_ナイーブ集団はＣＤ６２ｈｉ ＣＤ４４⁻であり；Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ}集団はＣＤ６２ｈｉ ＣＤ４４^＋であり；ＴＥＭ集団はＣＤ４４^＋ＣＤ６２⁻集団であった。ＴＣＭ／ＳＣＭマウス細胞集団の増加が観察された（図１〜６参照）。

実験研究群：全てのマウスを、各群における平均体重が全体平均の１０％以内であるように体重に基づいて研究群へ分類した。処置を３日目に始めた。

群１および群７：ビヒクル対照（食塩水）を、群１および群７についてそれぞれ２０日間（３〜２２日目）毎日および１２日間（３〜１４日目）毎日、腹腔内に投与した。

群２および群８：ＧＭＩ−１３５９を、群２および群８についてそれぞれ２０日間（３〜２２日目）毎日および１２日間（３〜１４日目）毎日、４０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。

群３および群９：抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２を、群３については３日ごとの処置を２回、３日間の休みを入れて２．５週間（３日目、６日目、１０日目、１３日目および１７日目）１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。群９は、３日ごとの処置を２回、３日間の休みを入れて２週間（３日目、６日目、１０日目および１３日目）１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。

群４および群１０：抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２を、群４については３日ごとの処置を２回、３日間の休みを入れて２．５週間（３日目、６日目、１０日目、１３日目および１７日目）１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。

群１０は、３日ごとの処置を２回、３日間の休みを入れて２週間（３日目、６日目、１０日目および１３日目）１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。

群５および群１１：ＧＭＩ−１３５９を抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦと組み合わせて、それぞれ４０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。群５においては、ＧＭＩ−１３５９は１日１回２０日間（３〜２２日目）投与し、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂは３日ごとの処置を２回、３日間の休みを入れて２．５週間（３日目、６日目、１０日目、１３日目および１７日目）与えた。群１１においては、ＧＭＩ−１３５９は１日１回１２日間（３〜１４日目）投与し、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂは３日ごとの処置を２回、３日間の休みを入れて２週間（３日目、６日目、１０日目および１３日目）投与した。両方の化合物を投与する日は、ＧＭＩ−１３５９を最初に与えた後、数分以内に抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦを与えた。

群６および群１２：ＧＭＩ−１３５９および抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２を併用レジメンにおいてそれぞれ４０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。群６においては、ＧＭＩ−１３５９は１日１回２０日間（３〜２２日目）投与し、抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２は３日ごとの処置を２回、３日間の休みを入れて２．５週間（３日目、６日目、１０日目、１３日目、および１７日目）与えた。

群１２においては、ＧＭＩ−１３５９は１日１回１２日間（３〜１４日目）投与し、抗ｍＰＤ−Ｌ１は３日ごとの処置を２回、３日間の休みを入れて２週間（３日目、６日目、１０日目および１３日目）投与した。両方の化合物を与える日は、ＧＭＩ−１３５９を最初に与え、それから数分以内に抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２を投与した。

全てのマウスは、処置の当日における個々の体重に従って投与した（０．２ｍｌ／２０ｇ）。

様々な処置群についての毒性および効力データを図１９に示す。

サンプリング：ＧＭＩ−１３５９の最終用量後の２４時間目（１５日目）において、群７〜１２からの全マウスを、腫瘍および脾臓収集のために安楽死させた。全マウスを、二酸化炭素への過剰曝露により安楽死させた。腫瘍および脾臓を切除し、冷ＰＢＳで満たされ、氷上に置かれたラベル付き５ｍＬサンプリングチューブに入れた。腫瘍および脾臓を、フローサイトメトリー分析のためにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇのｉｎ ｖｉｔｒｏグループへ提供した。

測定およびエンドポイント：この実験における試験は、一般的に、Ｓｃｈａｂｅｌ、Ｓｋｉｐｐｅｒ、Ｇｒｉｓｗｏｌｄ、Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｌｅｏｐｏｌｄ、Ｒｏｓｓ、およびＮＣＩのグループにより確立された一般原則を順守して行われた（１〜７）。腫瘍測定値を週３回、記録した。腫瘍量（ｍｍ^３）を、以下のように、単位密度を仮定する長楕円の体積についての式によりカリパー測定値から推定した：腫瘍量（ｍｍ^３）＝（Ｌ×Ｗ^２）／２、式中、ＬおよびＷは、それぞれの直交する腫瘍の長さおよび幅の測定値（ｍｍ）である。試験群のそれぞれの平均腫瘍量を図１に示す。試験群のそれぞれの腫瘍量中央値を図２に示す。群１〜４における個体についての腫瘍量および群１〜４のそれぞれについての群中央値は、それぞれ図３Ａ〜Ｄにプロットされている；群５〜８における個体についての腫瘍量および群５〜８のそれぞれについての群中央値は、それぞれ図４Ａ〜Ｄにプロットされている；群９〜１２における個体についての腫瘍量および群９〜１２のそれぞれについての群中央値は、それぞれ図５Ａ〜Ｄにおいてプロットされている。対照群についての腫瘍量中央値（すなわち、群１（食塩水）についての中央値）もまた、参照のために、図３Ａ〜Ｄ、４Ａ〜Ｄ、および５Ａ〜Ｄのそれぞれにおいてプロットされている。

２０００ｍｍ^３を超える腫瘍を有する動物は、明らかに窮迫しているか、または瀕死の状態にあることが見出されるため、安楽死させられた。処置は、腫瘍退縮の分析を事実上妨げる測定可能な腫瘍がない３日目に開始した。検査された治療の性質は、目標とする免疫に基づいた治療効果が１０日目より前にはほとんど、または全くない可能性が高いことを示唆した。この理由、およびマウスの全てが明らかな腫瘍を有するという理由のため、応答特性が決定される腫瘍体積ベンチマークとして９日目が選択された。

効力を評価するために使用される主要なエンドポイントは、腫瘍成長遅延（「Ｔ−Ｃ」）、研究の終わりにおける腫瘍なし生存動物の数、および進行性疾患、安定病態、および退縮性疾患の発生率であった。１２個の実験群についてのｍｍ^３での平均腫瘍量として示された各群についての平均腫瘍成長は図１に示されている。１２個の実験群についてのｍｍ^３での平均腫瘍量として示された各群についての腫瘍成長中央値は図２に示されている。

腫瘍成長遅延（Ｔ−Ｃ）は、処置された群と対照群の、規定された評価サイズに達するのにかかる時間中央値の間の差である。これは、群における各動物についての評価サイズまでの時間中央値から計算され、中央値成長曲線の内挿からではない。この研究についての統計的に有意な遅延を示す腫瘍成長遅延結果は、表１に提供されている。

この研究において、治療応答は、およそ１〜２週間かかる、免疫応答の活性化を必要とすることが予想された。最初の処置の時点において、腫瘍量は明らかではなかった。これらの理由のため、ベンチマーク日（９日目）が、応答が、理論上、生じ始め得る最初の日として選択された。成長および／または進行の遅延は、投与の最初の日から計算された。無増悪生存および腫瘍倍加時間などの他のパラメータは、ベンチマーク日から測定された。

腫瘍量が、ベンチマーク日（９日目）におけるそれの２倍以上へ増加した場合には、動物は進行性疾患を有する動物として符号化された。

９日目から進行までの時間は、「無増悪生存」を推定するために使用された。腫瘍量が、少なくとも２つの対照群倍加時間の間、進行（上記で定義）せず、また９日目の腫瘍量の５０％未満まで退縮しなかった場合には、マウスは、安定病態を有すると言明された。

腫瘍量が、９日目におけるそれの５０％未満に減少した場合には、マウスは退縮性疾患を有すると符号化された。

腫瘍倍加時間は、９日目に開始した測定可能な腫瘍を有する全てのマウスについて計算された。

副作用の評価：全ての動物を、少なくとも１日１回、臨床徴候について観察した。動物を、処置のそれぞれの日において、秤量した。個々の体重を、週３回、記録した。２０％を超える処置関連体重減少は、容認できない毒性とみなされた。この報告において、処置関連体重減少（処置中および処置後２週間）が２０％未満であり、致死的となり得る腫瘍量の非存在下でのこの期間中の死亡率が１０％以下である場合には、投薬量レベルは耐容性があると記載される。図６は、１２個の実験群についての平均体重変化％のグラフを提供する。図６（および全被験体が体重増加したことを示す、図１９における最大の処置関連体重減少の列）に示されているように、処置は、全て、耐容性が良好であり、体重減少は観察されなかった。

死亡または安楽死の時点で、全ての動物は、剖検され、死亡の潜在的原因、および、ことによると、毒性についての標的器官の一般的な評価を提供した。転移の存在または非存在もまた注目された。臨床徴候の顕著な観察および剖検所見が、個体および群の毒性所見に加えて、表にされた。

統計学：データを、シャピロ・ウィルクの方法による事後分析と共に、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の適用により分析した。データが、正規性も等分散（ｅｑｕａｌ ｖａｒｉａｎｃｅ）のいずれの検定にも合格しない場合、クラスカル・ウォリスの順位によるＡＮＯＶＡを、ダンの方法による事後分析と共に実施した。統計的比較を、評価サイズ（７５０ｍｍ^３）までの時間に関して実施した。

フローサイトメトリー方法：腫瘍解離について、腫瘍を秤量し、赤血球溶解に進む前に、１ｇ未満の組織を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ腫瘍解離プロトコール２．２．１、軟部腫瘍の解離に従って処理した。

脾臓解離について、３ｍＬシリンジにおけるプランジャーを使用して、１０ｍＬ ＤＰＢＳ中、脾臓を、臓器が十分、破壊され、ＤＰＢＳが細胞で濁るまで、押しつぶした。その後、細胞懸濁物を、５０ｍＬチューブ上の７０μｍストレーナーで濾過し、２０ｍＬ ＤＰＢＳで洗浄した。その後、懸濁物を、３００ｒｃｆで７分間、遠心分離し、上清を捨て、その後、赤血球溶解を進めた。

赤血球溶解について、腫瘍および脾臓試料のそれぞれを、３ｍＬ ＡＣＫ溶解緩衝液中に再懸濁し、その後、室温で５分間、インキュベートした。懸濁物を、１０ｍＬ ＤＰＢＳを加えることにより希釈し、その後、細胞を、３００ｒｃｆで５分間の遠心分離により収集した。細胞を、再び、３０ｍＬ ＤＰＢＳ中に再懸濁し、カウントした。懸濁物を、再び、遠心分離し、上清を捨て、その後、Ｆｃブロックへ進んだ。

Ｆｃブロックについて、腫瘍および脾臓試料のそれぞれを細胞１Ｅ＋０６個あたり１μＬ Ｆｃブロックを含むフローサイトメトリー染色緩衝液中、１００μＬあたり１Ｅ＋０６個の細胞で再懸濁した。懸濁物を、室温で５分間、インキュベートし、その後、３００ｒｃｆで５分間、遠心分離し、上清を除去し、その後、表面染色に進んだ。

表面染色について、フローサイトメトリー染色緩衝液中、１反応あたり５０μＬの以下の抗体希釈物を調製した（ＦｏｘＰ３を除く）：

Ｔ細胞−腫瘍：ＣＤ４ １：１０００＋ＣＤ８ａ １：１０００＋５μＬ ＣＤ１９７＋５μＬ ＣＤ６２Ｌ

Ｔ細胞−脾臓：ＣＤ４ １：２０００＋ＣＤ８ａ １：２０００＋５μＬ ＣＤ１９７＋５μＬ ＣＤ６２Ｌ

ＣＤ１１ｂ＆ＧＲ１−腫瘍：ＣＤ１１ｂ １：５００＋ＧＲ１ １：１０００

ＣＤ１１ｂ＆ＧＲ１−脾臓：ＣＤ１１ｂ １：５００＋ＧＲ１ １：１０００

ＰＤ−１−腫瘍：１：１０００

ＰＤ−１−脾臓：１：１０００

ＰＤ−Ｌ１−腫瘍：１：２５０

ＰＤ−Ｌ１−脾臓：１：５００

ＣＴＬＡ−４−腫瘍：１：５００

ＣＴＬＡ−４−脾臓：１：５００

ＣＤ８ａ＆Ｋｉ６７−腫瘍：ＣＤ８ａ １：１０００＋Ｋｉ６７ １：１０００

ＣＤ８ａ＆Ｋｉ６７−脾臓：ＣＤ８ａ １：２０００＋Ｋｉ６７ １：１０００

ＣＤ４、ＣＤ２５、＆ＦｏｘＰ３−腫瘍：ＣＤ４ １：１０００＋ＣＤ２５ １：５００；ＦｏｘＰ３：透過処理緩衝液中１：５００

ＣＤ４、ＣＤ２５、＆ＦｏｘＰ３−脾臓：ＣＤ４ １：２０００＋ＣＤ２５ １：５００；１．ＦｏｘＰ３：透過処理緩衝液中１：５００

表面染色について、腫瘍および脾臓細胞を、５０μＬあたり１Ｅ＋０６個の細胞で再懸濁した。１Ｅ＋０６個の細胞を含有する５０μＬ細胞懸濁物のそれぞれを、丸底９６ウェルプレートにおける、染色緩衝液中に希釈された５０μＬの抗体に加えた。そのプレートを、２．５に設定する、オービタルシェーカーにおいて、暗所中室温で３０分間、インキュベートした。試料を、２００μＬのフローサイトメトリー染色緩衝液を加えることにより希釈し、その後、３００ｒｃｆで５分間、遠心分離した。上清を吸引し、細胞を、２５０μＬフローサイトメトリー染色緩衝液中に再懸濁し、回転させることにより洗浄した。洗浄後、細胞内マーカーについて染色する場合には、その後、試料を、下記の細胞内染色手順に従って調製した。その後、試料を、２５０μＬフローサイトメトリー染色緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリー分析の準備が整った。

洗浄ステップ後、細胞内マーカーについて染色する場合、細胞を、２００μＬ ＦｏｘＰ３固定化／透過処理作業溶液中に再懸濁し、暗所中、室温で３０分間、インキュベートした。その後、試料を、室温で５分間、４００ｒｃｆで遠心分離し、その後、上清を捨てた。２００μＬ １×透過処理緩衝液を各ウェルに加えた。試料を、室温で５分間、４００ｒｃｆで遠心分離し、その後、上清を捨てた。２度目として、２００μＬ １×透過処理緩衝液を各ウェルに加えた。試料を、再び、室温で５分間、４００ｒｃｆで遠心分離し、その後、上清を再び、捨てた。その後、細胞を、５０μＬ透過処理緩衝液中に再懸濁し、抗ＦｏｘＰ３またはＫｉ６７を含む５０μＬ １×透過処理緩衝液を加えた。懸濁物を、暗所中、４℃で６０分間、インキュベートした。試料を、２００μＬ １×透過処理緩衝液を加えることにより希釈し、その後、４００ｒｃｆで５分間、遠心分離した。上清を除去し、細胞を、ウェルあたり２５０μＬフローサイトメトリー染色緩衝液で洗浄し、続いて、４００ｒｃｆで５分間、遠心分離した。洗浄を１回、繰り返した（上清を再び、除去し、細胞を、ウェルあたり２５０μＬフローサイトメトリー染色緩衝液で洗浄し、続いて、４００ｒｃｆで５分間、遠心分離した）。細胞を、ウェルあたり２５０μＬフローサイトメトリー染色緩衝液中に再懸濁し、試料は、フローサイトメトリー分析の準備が整う。

フローサイトメトリー分析について、いったん試料が調製されたならば、９６ウェルプレートを、Ａｔｔｕｎｅオートサンプラーへ装填する。いくつかの試料（データが生じなかった）は、機器の設定を定義することが求められた。これらの設定は、電圧最適化およびゲーティングのための非標識細胞、および、ゲートを確証するためのＦＭＯ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｍｉｎｕｓ−ｏｎｅ）対照を含む。作業空間をカスタマイズし、側方散乱（ＳＳＣ）対前方散乱（ＦＳＣ）ドットプロットから始め、関連する「娘」プロットを加えて、蛍光データをディスプレイした。この最初のプロットを使用して、生きている細胞、生きている腫瘍細胞、または生きているリンパ球をゲーティングし、選択された集団のみに関してさらなる分析を実施した。いったん作業空間が設定されたならば、オートサンプラーはデータを獲得した。

補償マトリクスを作成するために、ＡｂＣマウス／ラットビーズを使用した。これらのビーズは以下の２つのコンポーネントを含有する：それらの指定された種において生じた任意の抗体の重鎖と結合する捕獲ビーズ、および抗体結合能をもたない陰性ビーズ。ビーズは、非常に強い陽性および陰性シグナルを提供し、それらは、使用されているフルオロフォアからのチャネル間の放出こぼれ信号（ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｉｌｌｏｖｅｒ）を計算するために使用することができる。

開始するために、ＡｂＣ捕獲ビーズおよび陰性ビーズを、使用前にボルテックスすることにより再懸濁した。使用される各フルオロフォアコンジュゲート化抗体について、試料チューブを、適切な種特異的捕獲ビーズの１滴、および決定された作業希釈度における５０μＬ抗体を用いて調製した。試料チューブにおける溶液をよく混合し、暗所中、室温で１５分間、インキュベートした。３ｍＬフローサイトメトリー染色緩衝液を試料チューブに加えて、抗体を希釈し、その後、２００ｒｃｆで５分間、遠心分離した。上清を除去し、ビーズペレットを、５００μＬフローサイトメトリー染色緩衝液中に再懸濁した。陰性ビーズの１滴を、各チューブに加え、よく混合した。その後、試料をフローサイトメトリーにより分析した。

図７〜１４は、群７〜１２において試験された様々なマーカーについてのフローサイトメトリー分析の結果のグラフを提供する。そのグラフはまた、進行性疾患を有する動物、安定病態を有する動物、または腫瘍なし生存動物として、群における個体のそれぞれをカテゴリー化する。図７は、腫瘍におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率をグラフで示す；図８は、腫瘍におけるＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率をグラフで示す；図９は、腫瘍におけるＣＤ１１ｂ^＋／ＧＲ１^＋細胞の百分率をグラフで示す；図１０は、腫瘍におけるＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）の百分率をグラフで示す；図１１は、脾臓におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率をグラフで示す；図１２は、脾臓におけるＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率をグラフで示す；図１３は、脾臓におけるＣＤ１１ｂ^＋／ＧＲ１^＋細胞の百分率をグラフで示す；および、図１４は、脾臓におけるＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）の百分率をグラフで示す。

実験用語解説：０日目 − 腫瘍が動物へ植え込まれる日（常に、０日目に対して示される、処置の最初の日と混同されるべきではない）。

評価サイズ − 腫瘍成長遅延の計算のために選択された腫瘍量（ｍｍ^３）。評価サイズは、測定値の誤差が最小である傾向がある対照腫瘍成長曲線の指数関数的部分（通常、５００ｍｍ^３から１０００ｍｍ^３の間）から選択される。

進行性疾患（ＰＤ） − 実験の時間枠内において、ベンチマーク日と比較して、腫瘍サイズの２倍より大きい増加がある場合、動物は、進行性疾患を有すると認められた。図１９のＰＤ列は、進行性疾患を呈する、各群内における被験体の百分率を開示する。

安定病態（ＳＤ） − 実験の時間枠内において、腫瘍が、ベンチマーク日に観察されたサイズの２倍より大きいサイズには決して達しておらず、またはベンチマーク日に対してそのサイズの５０％未満には決して達していない期間がある場合、動物は、安定病態を有すると認められた。図１９のＳＤ列は、安定病態を呈する、各群内における被験体の百分率を開示する。

腫瘍なし生存動物（ＴＦＳ） − 実験の最後の日において疾患の測定可能な証拠をもたない任意の動物。この値はＣＲを除く。図１９のＴＦＳ列は、腫瘍なしとして呈する、各群内における被験体の百分率を開示する。

Ｒｘ関連死 − 動物は、対照群における最小の致死的腫瘍の腫瘍量の半分未満の腫瘍量を有して、最後の処置から２週間以内に、死んでいるのを見出され、または瀕死の状態で安楽死させられ、剖検において、感染、機械投与による外傷、または病的状態の他の明らかな原因の証拠を何も示さない場合には、処置関連死を経験したと推定される。これは、個体の毒性パラメータである。図１９のＲｘ関連死の列に示されているように、死亡した、またはいかなる処置の結果としても安楽死させられた個体はなかったため、処置の全ては耐容性が良好だった。

腫瘍倍加時間 − 体積倍加時間（日）として表された腫瘍の成長速度。腫瘍成長曲線の指数関数的部分の対数線形最小二乗回帰から計算される。これらの値は、腫瘍細胞死滅、部分的効果、および生存率推定を算出するために使用される。それらはまた、歴史的値に対してこの実験における腫瘍の生物学の適切さを評価するために使用される。

治療指数 − 本発明者らは、治療指数を、単純に、実質的抗がん活性を生じる耐容される投薬量レベルの範囲と定義する。この目的のための実質的活性は、処置の期間以上であり、また、Ｐ≦０．０５レベルで対照とは統計的に異なる、腫瘍成長遅延として定義される。

評価サイズまでの時間 − 腫瘍が、特定された評価サイズに達するのにかかる時間（日）。最終（処置後）の腫瘍成長曲線の指数関数的部分について時間に対する腫瘍量の対数線形最小二乗適合度から計算される。この値は、実験におけるあらゆる動物について計算される。その後、群中央値を使用して、腫瘍成長遅延を計算する。これは、個体の効力パラメータである。

最後のＲｘにおける腫瘍量 − 処置の最後の日における腫瘍量。この値は、最終（処置後）の腫瘍成長曲線の指数関数的部分について時間に対する腫瘍量の対数線形最小二乗適合度から計算される。（Ｔ／Ｃ比較を容易にするために提示される。）

（実施例１）
少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤および／または少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤と組み合わせての少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果、ならびに、したがって、潜在的ながん処置を評価するために研究を企てた。特に、この研究は、少なくとも１つの抗ｍＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤抗体およびＧＭＩ−１３５９を投与すること、ならびに、ＧＭＩ−１３５９を単独で投与することの抗腫瘍効果を調べた。さらに、免疫細胞エンドポイントにおける潜在的変化の予備検査を企てた。

全マウスを、腫瘍が確立する前の植え込みの時点において処置群へ分配した。全動物は、治療の開始時点で体重が１６．６ｇ以上であった。最初の処置時点における全動物についての平均群体重は、よく整合した（範囲１７．４〜１８．３ｇ）。７５０ｍｍ^３の腫瘍量が、腫瘍成長遅延による効力の評価のために選択された。

群１、ビヒクル（食塩水）、０．２ｍＬ／２０ｇ、ＱＤ×２０；Ｄ３／群７、ビヒクル（食塩水）、０．２ｍＬ／２０ｇ、ＱＤ×１２；Ｄ３

２１〜３０日目の間、全ての群１対照動物を、２０００ｍｍ^３を超える腫瘍量のために、ＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検を実施し、所見は、脾腫（９／１０）、および右心室に位置する白色横紋組織（１／１０）であった。１匹のマウスは、目立った剖検所見はなかった。

評価サイズまでの時間中央値は、投与の開始（３日目）から１５．９日であり、群１についての９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は３．１日であった。対照群において自発性退縮はなく、生着率は１００％であった。対照群における全マウスは、進行性疾患と同定された。無増悪期間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）中央値は１１．６日目であり、無増悪生存期間は、２．６日間であった。

１５日目において、全ての群７対照動物を、腫瘍および脾臓収集のために用量から２４時間後、ＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検を実施し、以下の所見が注目された：脾腫（３／５マウス）、肥大子宮角（１／５）、右心室に位置する白色横紋組織（２／５）。１匹のマウスは、いかなる目立った剖検所見もなかった。

評価サイズまでの時間中央値は、１２．６日であり、群７についての９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は２．１日であった。対照群において自発性退縮はなく、生着率は１００％であった。その群における全マウスは、進行性疾患と同定された。これらの所見は、群１と群７が、腫瘍成長特性について極めて一致したことを示している。

フローサイトメトリーにより群７腫瘍において検出されたＴ細胞の平均百分率は、７．５２％ＣＤ４^＋細胞および２３．８３％ＣＤ８^＋細胞であった。腫瘍において、平均４．１４％骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および平均３．３７％制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）があった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、２８．０７％、２９．５７％、および３６．５１％であった。ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻の集団もＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻の集団も、腫瘍試料において検出されなかった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は２８．７５％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は２５．５４％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は２６．４７％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ８^＋Ｔ細胞の百分率は２３．８２％であった。

群７マウスの脾臓において、細胞の平均１２．６２％がＣＤ４^＋であり、８．０４％がＣＤ８^＋であった。ＭＤＳＣの平均百分率は２．９５％であり、Ｔ_ｒｅｇは８．２９％であった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、４．１７％、８２．７４％、および７．１１％であった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は３．６９％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は３３．５７％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は８．０６％であった。

ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は２．１０％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しない細胞の平均百分率は２９．４９％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は６．０４％であった。

群２、ＧＭＩ−１３５９、４０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×２０；Ｄ３／群８、ＧＭＩ−１３５９、４０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×１２；Ｄ３

群２において、ＧＭＩ−１３５９での処置は耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、１６．８％の平均体重増加を経験した。１８〜４９日目の間、全ての群２動物を、２０００ｍｍ^３を超える腫瘍量のためにＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検所見は、ビヒクル処置されたマウス（群１および群７）における所見と類似していた。

群８において、ＧＭＩ−１３５９での処置は耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、７．０％の平均体重増加を経験した。１５日目において、全ての群８動物を、腫瘍および脾臓収集のために用量から２４時間後、ＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検は目立ったことはなかった。これらの所見は、ＧＭＩ−１３５９での処置が、耐容性が良好であること、ならびに群２および群８が、処置に対する耐容性について極めて一致したことを示している。

群３、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２、１０ｍｇ／ｋｇ、（Ｑ３Ｄ×２；３オフ（ｏｆｆ））×２．５；Ｄ３／群９、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２、１０ｍｇ／ｋｇ、（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２；Ｄ３

群３において、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置は耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、９．７％の平均体重増加を経験した。１８〜３７日目の間、全ての群３動物を、２０００ｍｍ^３を超える腫瘍量のためにＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検を実施し、以下の所見が注目された：脾腫（１０／１０）、および右心室に位置する白色横紋組織（１／１０）。１匹のマウスは、非滲出性潰瘍化腫瘍を有した。

群９において、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置はまた耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、９．３％の平均体重増加を経験した。１５日目において、全ての群９動物を、腫瘍および脾臓収集のために用量から２４時間後、ＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検は目立ったことはなかった。

これらの所見は、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置が、耐容性が良好であること、ならびに群３および群９が、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置に対する耐容性についてよく一致したことを示している。

群４、抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２、１０ｍｇ／ｋｇ、（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２．５；Ｄ３／群１０、抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２、１０ｍｇ／ｋｇ、（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２；Ｄ３

群４において、抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２での処置は耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、１０．１％の平均体重増加を経験した。２３〜３７日目の間、マウス１、２、３、４、５、および９を、２０００ｍｍ^３を超える腫瘍量のためにＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検を実施し、以下の所見：脾腫（６／１０）、肥大子宮角（３／１０）が注目され、１匹のマウスは、非滲出性潰瘍化腫瘍を有した。

マウス６、７、８、および１０に、最初の植え込み後、４４日目において、皮下（左、上部腋窩）に再植え込みした。８１日目において、マウス６、７、８、および１０を、クライアント要求により、ＣＯ２吸入により安楽死させた。マウス８および１０は、剖検において子宮角を肥大していた。マウス６および７の剖検は目立ったことはなかった。

群１０において、抗ｍＰＤ−Ｌ２、１０Ｆ．９Ｇ２での処置はまた耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、１．６％の平均体重増加を経験した。１５日目において、全ての群１０動物を、腫瘍および脾臓収集のために用量から２４時間後、ＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検を実施し、以下の所見：肥大子宮角（３／５）が注目され、１／５匹のマウスは、右心室に位置する白色横紋組織を有することが注目された。これらの所見は、抗ｍＰＤ−Ｌ２、１０Ｆ．９Ｇ２での処置が、耐容性が良好であること、ならびに群４および群１０が、処置レジメンの耐容性に関してよく一致したことを示している。

群５、ＧＭＩ−１３５９＋抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２、４０＋１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×２０＋（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２．５；Ｄ３／群１１、ＧＭＩ−１３５９＋抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２、４０＋１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×１２＋（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２；Ｄ３

群５において、ＧＭＩ−１３５９＋抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置は耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、１６．７％の平均体重増加を経験した。１６〜２８日目の間、全ての群５動物を、２０００ｍｍ^３を超える腫瘍量のためにＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検を実施し、以下の所見：脾腫（１０／１０）；右心室に位置する白色横紋組織（１／１０）；肥大子宮角（３／１０）が注目され、２／１０匹のマウスは、わずかに変色した「黒色」腸を有することが注目された。

群１１において、ＧＭＩ−１３５９＋抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置はまた耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、３．５％の平均体重増加を経験した。１５日目において、全ての群１０動物を、腫瘍および脾臓収集のために用量から２４時間後、ＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検を実施し、以下の所見：脾腫（１／５）；肥大子宮角（２／５）；右心室に位置する白色横紋組織（１／５）が注目され、２／５匹のマウスは、顕著な所見を有しないことが認められた。

これらの所見は、ＧＭＩ−１３５９＋抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置が、耐容性が良好であること、ならびに群５および群１１が、処置レジメンの耐容性に関してよく一致したことを示している。

群６、ＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２、４０＋１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×２０＋（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２．５；Ｄ３／群１２、ＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２、４０＋１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×１２＋（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２；Ｄ３

群６において、ＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２での処置は耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、９．５％の平均体重増加を経験した。１８〜３７日目の間、マウス１、２、３、５、７、および１０を、２０００ｍｍ^３を超える腫瘍量のためにＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検を実施し、以下の所見：脾腫（６／１０）、鼻／鼻づらにおける脱毛症（２／１０）、非滲出性潰瘍化腫瘍（２／１０）が注目され、４匹のマウスは、顕著な所見はなかった。マウス４、６、８、および９に、最初の植え込み後、４４日目において、皮下（左、上部腋窩）に再植え込みした。８１日目において、マウス４、６、８、および９を、クライアント要求により、ＣＯ２吸入により安楽死させた。マウス４、６、８、および９は、目立った剖検はなかった。

群１２において、ＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２での処置は耐容性が良好であり、処置関連死亡を生じなかった。処置に関連する体重減少はなかった。処置された動物は、処置レジメン中、２．５％の平均体重増加を経験した。１５日目において、全ての群１０動物を、腫瘍および脾臓収集のために用量から２４時間後、ＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検は、目立ったことはなかった。

所見は、ＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２での併用治療が、耐容性が良好であること、ならびに群６および群１２が、処置レジメンの耐容性に関してよく一致したことを示している。

効力
群２、ＧＭＩ−１３５９、４０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ＱＤ×２０；Ｄ３／群８、ＧＭＩ−１３５９、４０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ＱＤ×１２；Ｄ３

群２において、評価サイズ（７５０ｍｍ^３）までの時間中央値は、投与の開始から１８．４日であり、２．５日の腫瘍成長遅延を生じ、群２についての９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は３．３日であり、対照腫瘍倍加時間と本質的に同一であった。ＧＭＩ−１３５９での処置は、退縮も腫瘍なし生存動物も生じなかった。全てのマウスは、進行性疾患と同定された（１００％）。ＧＭＩ−１３５９での処置は、退縮も腫瘍なし生存動物も生じなかった。全てのマウスは、進行性疾患と同定された（１００％）。群８について、評価サイズまでの時間中央値は１４．３日であり、９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は１．８日であった。無増悪期間中央値は、１４．５日目においてであり、無増悪生存期間は５．５日であった。

フローサイトメトリーにより群８腫瘍において検出されたＴ細胞の平均百分率は、７．０２％ＣＤ４^＋細胞および１５．６１％ＣＤ８^＋細胞であった。腫瘍において、平均２．６６％骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および平均２．９３％制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）があった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、２３．３９％、３４．４４％、および４２．８０％であった。ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団もＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団も腫瘍試料において検出されなかった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、２５．３２％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は３１．４３％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は２５．８４％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ８^＋Ｔ細胞の百分率は２５．６５％であった。

群８マウスの脾臓において、細胞の平均１３．４３％はＣＤ４^＋であり、８．７７％はＣＤ８^＋であった。ＭＤＳＣの平均百分率は３．７０％であり、Ｔ_ｒｅｇは１０．００％であった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、５．５３％、８１．５０％、および１２．３１％であった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、２．０５％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は３３．３６％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は５．４２％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は１．００％であり、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻を発現する細胞の平均百分率は２７．９５％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は２．９４％であった。

群３、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２、１０ｍｇ／ｋｇ、（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２．５；Ｄ３／群９、抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２、１０ｍｇ／ｋｇ、（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２；Ｄ３

群３において、評価サイズ（７５０ｍｍ^３）までの時間中央値は、投与の開始から１９．１日であり、３．２日の腫瘍成長遅延を生じ、群３についての９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は３．２日であった。抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置は、退縮も腫瘍なし生存動物も生じなかった。全てのマウスは、進行性疾患と同定された（１００％）。無増悪期間中央値は、１２．４日目においてであり、無増悪生存期間は３．４日であった。群９における結果は類似した。しかしながら、１匹のマウスは、腫瘍を決して発生しなかった。生着なしは、処置に対する応答とは区別できた。

フローサイトメトリーにより群９腫瘍において検出されたＴ細胞の平均百分率は、７．１８％ＣＤ４^＋細胞および１９．９９％ＣＤ８^＋細胞であった。腫瘍において、平均３．１４％骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および平均６．８１％制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）があった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、２６．５７％、２８．６３％、および３８．６８％であった。ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団もＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団も腫瘍試料において検出されなかった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、２８．０９％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は３１．６２％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は２３．５０％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ８^＋Ｔ細胞の百分率は２６．９５％であった。

群９マウスの脾臓において、細胞の平均１５．００％はＣＤ４^＋であり、１０．９１％はＣＤ８^＋であった。ＭＤＳＣの平均百分率は２．２８％であり、Ｔ_ｒｅｇは１０．８８％であった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、４．８０％、８４．７８％、および８．４６％であった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、１．９１％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は３７．２３％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は３．５２％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は０．７７％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しない細胞の平均百分率は３１．５９％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は１．４８％であった。

群４、抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２、１０ｍｇ／ｋｇ、（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２．５；Ｄ３／群１０、抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２、１０ｍｇ／ｋｇ、（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２；Ｄ３

抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２での処置は耐容性が良好であった。群４について、評価サイズ（７５０ｍｍ^３）までの時間中央値は、投与の開始から２８日より長く、１１．７日の腫瘍成長遅延を生じ、９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は４．２日であった。処置は、進行性疾患の６０％発生率（マウス１、２、３、４、５、および９において）、および退縮性疾患の４０％発生率（マウス６、７、８、および１０）を生じ、その退縮性疾患は、全て、結果として、腫瘍なし生存動物を生じた。後で、これらのマウスに再負荷し、一次移植片も再負荷された移植片のいずれも、少しの再成長も生じなかった。無増悪期間中央値は、１２．８日目においてであり、無増悪生存期間は３．８日であった。

群１０において、応答状況は、レスポンダーについて実質的に増加した腫瘍倍加時間に基づいて割り当てられた。サンプリングのための安楽死は、潜在的腫瘍退縮の評価の妨げとなった。抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２での処置は、進行性疾患の２０％発生率および安定病態の８０％発生率を生じた。サンプリング群が分析するには減少していたため、評価サイズまでの時間中央値は決定されなかった。群１０についての９日目後の腫瘍体積倍加時間は、８．１日であった。

フローサイトメトリーにより群１０腫瘍において検出されたＴ細胞の平均百分率は、７．４２％ＣＤ４^＋細胞および１５．５２％ＣＤ８^＋細胞であった。腫瘍において、平均２．６９％骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および平均１．６９％制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）があった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、２６．４６％、５３．４９％、および４３．７６％であった。ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団もＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団も腫瘍試料において検出されなかった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、２１．３０％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は３４．２１％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は２１．９８％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ８^＋Ｔ細胞の百分率は２６．２６％であった。

群１０マウスの脾臓において、細胞の平均１２．８０％はＣＤ４^＋であり、６．１６％はＣＤ８^＋であった。ＭＤＳＣの平均百分率は１．６２％であり、Ｔ_ｒｅｇは１１．２４％であった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、６．４２％、３７．３２％、および１７．１５％であった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、１３．００％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は２５．４７％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は２４．１７％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は６．６９％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しない細胞の平均百分率は２７．９０％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は１９．２１％であった。

群５、ＧＭＩ−１３５９＋抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２、４０＋１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×２０＋（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２．５；Ｄ３／群１１、ＧＭＩ−１３５９＋抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２、４０＋１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×１２＋（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×２；Ｄ３

群５において、ＧＭＩ−１３５９＋抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置は耐容性が良好であった。評価サイズ（７５０ｍｍ^３）までの時間中央値は、投与の開始から１５．８日であり、−０．１日の腫瘍成長遅延を生じ、群５についての９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は２．８日であった。ＧＭＩ−１３５９＋抗ＫＬＨ；ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２での処置は、退縮も腫瘍なし生存動物も生じなかった。全てのマウスは、進行性疾患と同定された（１００％）。無増悪期間中央値は、１１．２日目においてであり、無増悪生存期間は２．２日であった。

群１１における所見は類似していた。退縮も腫瘍なし生存動物もなかった。全てのマウスは、進行性疾患と同定された（１００％）。サンプリング群が分析するには減少していたため、評価サイズまでの時間中央値は決定されなかった。群１１についての９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は、２．２日であった。

フローサイトメトリーにより群１１腫瘍において検出されたＴ細胞の平均百分率は、５．２５％ＣＤ４^＋細胞および８．２２％ＣＤ８^＋細胞であった。腫瘍において、平均３．２９％骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および平均１．７９％制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）があった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、２５．８５％、５５．５２％、および５３．５４％であった。ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団もＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団も腫瘍試料において検出されなかった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、２４．１４％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は３１．１６％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は１７．５１％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ８^＋Ｔ細胞の百分率は２３．２７％であった。

群１１マウスの脾臓において、細胞の平均１３．３３％はＣＤ４^＋であり、９．０６％はＣＤ８^＋であった。ＭＤＳＣの平均百分率は３．０９％であり、Ｔ_ｒｅｇは１１．１４％であった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、８．１８％、８４．００％、および１８．４４％であった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、１１．１９％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は３１．４５％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は１７．３３％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は５．６８％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しない細胞の平均百分率は３５．８５％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は１１．１８％であった。

群６および１２、ＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２、４０＋１０ｍｇ／ｋｇ

群６について、評価サイズ（７５０ｍｍ^３）までの時間中央値は、投与の開始から２９日より長く、１３．５日の腫瘍成長遅延を生じ、群６についての９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は５．９日であった。ＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１、１０Ｆ．９Ｇ２での処置は、進行性疾患の６０％発生率、および退縮性疾患の３０％発生率を生じた。マウス４、６、８、および９は、腫瘍なし生存動物として同定された。マウス９は、腫瘍が決して存在することがなかったため、ＰＤとしてもＳＤとしてもＲＤとしても同定することができず、完全奏効動物としてみなされ得、または生着なしのまれな発生であり得た。対照群における生着なしの発生率は、７つの以前の研究にわたって２％であった。

群１２における応答特性は類似していた。サンプリング群が分析するには減少していたため、評価サイズまでの時間中央値は決定されなかった。群１２についての９日目後の腫瘍体積倍加時間中央値は、３．７日であった。無増悪期間中央値は、１２．６日目においてであり、無増悪生存期間は３．６日であった。

フローサイトメトリーにより群１２腫瘍において検出されたＴ細胞の平均百分率は、８．２５％ＣＤ４^＋細胞および１６．９８％ＣＤ８^＋細胞であった。腫瘍において、平均４．３８％骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および平均０．９１％制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）があった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、２３．７６％、５０．２４％、および４５．７１％であった。ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団もＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団も腫瘍試料において検出されなかった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、２１．７０％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は２５．８４％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は２０．２４％であり、一方、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ８^＋Ｔ細胞の百分率は２３．３２％であった。

群１２マウスの脾臓において、細胞の平均１２．３３％はＣＤ４^＋であり、８．０１％はＣＤ８^＋であった。ＭＤＳＣの平均百分率は２．２２％であり、Ｔ_ｒｅｇは１１．６６％であった。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４を発現する細胞の平均百分率は、それぞれ、９．２３％、４７．９１％、および１７．９３％であった。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの両方を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は、７．１５％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は３２．５４％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しないＣＤ４^＋Ｔ細胞の平均百分率は１２．５２％であった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内において、ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は２．７７％であり、ＣＣＲ７を発現するが、ＣＤ６２Ｌを発現しない細胞の平均百分率は３５．６５％であり、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＣＲ７を発現しない細胞の平均百分率は６．３６％であった。

図１９の腫瘍成長遅延の列は、各処置が腫瘍成長を遅延させた、日数での結果を提供する。ＧＭＩ−１３５９単独での処置は、統計的に有意な抗腫瘍効果を生じず（ｐ＞０．０５）、全ての動物は、進行性疾患と同定され、２．５日の最小の腫瘍成長遅延を有した。単剤としての抗ｍＰＤ−Ｌ１での処置は、統計的に有意な抗腫瘍効果を生じ（ｐ＜０．０５）、マウスの３０％が退縮性疾患を有すると同定され、４０％が腫瘍なし生存動物と同定され、１１．７日の腫瘍成長遅延中央値を有した。

抗ｍＰＤ−Ｌ１と組み合わせてのＧＭＩ−１３５９での処置もまた、全群に対して統計的に有意な抗腫瘍効果を生じ（ｐ＜０．０５）、マウスの３０％が退縮性疾患を有すると同定され、４０％が腫瘍なし生存動物として同定され、１３．５日の腫瘍成長遅延中央値を有した。

群４（抗ｍＰＤ−Ｌ１単独）および群６（ＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１）において、４匹のマウスそれぞれに、４４日目において皮下（左、上部腋窩）に再植え込みした。全ての再負荷されたマウスを８１日目まで保持させ、そこで、再成長は起きなかったため、それらをクライアント要求により安楽死させた。すなわち、図２０に示されているように、完全奏効を達成したマウス、さらに、ＧＭＩ−１３５９と抗ｍＰＤ−Ｌ１の両方を組み合わせる処置により、より迅速な完全奏効を有するマウスは、その後のＣＴ−２６の負荷を拒絶した。

効力アーム内において、抗ｍＰＤ−Ｌ１単剤療法アームとＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１併用アームとの間に差があった。全体的な奏効率は同じであったが、併用群におけるマウスは、より早期の応答を示した。さらに、群１（食塩水対照）および群２（単剤ＧＭＩ−１３５９を用いる）におけるマウスは、全て、進行性疾患と同定された（図１９参照）。対照的に、図１９および図２０に示されているように、抗ｍＰＤ−Ｌ１の単独で（群４）、またはＧＭＩ−１３５９と組み合わせて（群６）の処置は、４０％の完全奏効（ＣＲ）率または腫瘍なし生存動物（ＴＦＳ）率を生じた。

ＣＲまでの時間中央値は、抗ｍＰＤ−Ｌ１単独（群４）と比較して、抗ｍＰＤ−Ｌ１をＧＭＩ−１３５９と組み合わされた場合（群６）、より短かった。図２０に示されているように、ＧＭＩ−１３５９と組み合わされた抗ｍＰＤ−Ｌ１で処置された処置群６についてのＣＲまでの時間中央値、対、抗ｍＰＤ−Ｌ１単独で処置された群４についての２３日（ｐ＜０．０４７１）。腫瘍浸潤性細胞の評価は、ＧＭＩ−１３５９と抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体での併用療法（群１２）が、食塩水（群７）、単一処置としてのＧＭＩ−１３５９（群８）または抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体（群１０）と比較して、Ｔ_ｒｅｇの百分率を低下させたことを示した（それぞれ、３．３％、２．９％、および１．９％に対して０．９％（図１０参照））。いずれの他のＴ細胞サブセットも影響されなかった（例えば、図１０（Ｔ_ｒｅｇ細胞）と比較しての、図７および図８（他のＴ細胞）を参照）。脾臓において、Ｔ_ｒｅｇの百分率中央値は、処置のいずれによっても影響されず（例えば、図１４参照）、抗ＰＤ−Ｌ１およびヘテロ二機能性のＥ−セレクチンとＣＸＣＲ４受容体の阻害剤ＧＭＩ−１３５９での組み合わされた処置による腫瘍内Ｔ_ｒｅｇにおける低下が、腫瘍微小環境における維持およびホーミングシグナルに対する減弱された応答であったことを示唆している。

ＣＤ４陽性Ｔ細胞集団およびＣＤ８陽性Ｔ細胞集団内において、２つのリンパ節ホーミング分子である、ＣＣＲ７およびＣＤ６Ｌの発現を調べた。ＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの同時発現は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）上に見出される。腫瘍リンパ球は、腫瘍内において、ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団もＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ⁻集団も見出すことができないが、脾臓内において、これらの集団がかなり豊富にあるという点において、脾臓リンパ球とは異なることが見出された。

さらに、ＧＭＩ−１３５９処置と抗ｍＰＤ−Ｌ１処置の組み合わせは、最低レベルの制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）、およびそのデータにおける最小量の群内変動を生じた。

脾臓と腫瘍の両方において、ＣＴＬＡ−４^＋集団は、抗ｍＰＤＬ１抗体での処置後、増加した。ＴＩＬ ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋は、抗ｍＰＤ−Ｌ１処置またはＧＭＩ−１３５９と抗ｍＰＤ−Ｌ１処置で減少するように思われる。ＴＩＬ ＰＤ−Ｌ１レベルは、ビヒクル、ＧＭＩ−１３５９単独、またはアイソタイプ対照単独の、それぞれと比較して、抗ｍＰＤ−Ｌ１単独処置、ＧＭＩ−１３５９＋アイソタイプ対照処置、およびＧＭＩ−１３５９＋抗ｍＰＤ−Ｌ１処置で増加する。図７は、実験群７〜１２における個体について腫瘍におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋の百分率のグラフを提供し、図１１は、実験群７〜１２における個体の脾臓におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋の百分率のグラフを提供する。

腫瘍において、マウスが、抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、図１５Ａの群１０についての例示的な散布図参照）、またはＧＭＩ−１３５９＋アイソタイプ対照抗体（例えば、図１５Ｂの群１１についての例示的な散布図参照）で処置された場合、Ｔ_ｒｅｇ細胞の平均百分率は同じままであった。しかしながら、マウスが、ＧＭＩ−１３５９と抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせで処置された場合（例えば、図１５Ｃの群１２についての例示的な散布図参照）、Ｔ_ｒｅｇ細胞の平均百分率は減少した。

腫瘍と比較して、脾臓において、処置群間でマーカーの差がより多いことが観察された。抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体（群１０）、ＧＭＩ−１３５９＋アイソタイプ対照抗体（群１１）、またはＧＭＩ−１３５９と抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせ（群１２）での処置は、ビヒクル（群１）、ＧＭＩ−１３５９（群２）、またはアイソタイプ対照抗体（群３）での処置の、それぞれと比較して、ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率を有意に増加させた。

上記で言及されているように、図１６Ａは、ＧＭＩ−１３５９で処置された個体（群８のマウス４）の脾臓におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞を示す代表的な散布図である。図１６Ｂは、ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置で処置された個体（群１２のマウス１）の脾臓におけるＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞を示す代表的な散布図である。これらのグラフは、アイソタイプ対照抗体と組み合わせたＧＭＩ−１３５９が、ＣＤ４^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率に影響するが、単剤としてのＧＭＩ−１３５９は影響しないことを示している。

ＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋である細胞の百分率における群間の差もまた、脾臓において検出された。図１２は、実験群７〜１２において脾臓におけるＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の百分率のグラフを提供する。マウスが、抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体（群１０）またはアイソタイプ対照抗体と共にＧＭＩ−１３５９（群１１）で処置された場合、ＣＤ８^＋／ＣＣＲ７^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋細胞の平均百分率は、ビヒクル対照（群７）と比較して増加した。図１７Ａは、群７におけるマウス４からのデータの代表的な散布図であり、図１７Ｂは、群１０におけるマウス３からのデータの代表的な散布図を示す。マウスが、疾患の状態に従ってグループ分けされ、その百分率が縦列でドットプロットされた場合、群１２における安定病態を有するマウスは、進行性疾患を有するマウスより、ＭＤＳＣの統計的に有意なより低い百分率を有した（図１３：群７〜１２における、脾臓のＣＤ１１ｂ^＋／ＧＲ１^＋（ＭＤＳＣ）の百分率のグラフを提供する）。これらの差を示す代表的な散布図は図１８Ａ〜Ｃに示されている。群９由来のマウス３（図１８Ａ）は、群９由来のマウスの全部を代表し、群１２由来のマウス３（図１８Ｂ）は、安定病態を有する群１２由来のマウスを代表し、群１２由来のマウス４（図１８Ｃ）は、進行性疾患を有する群１２由来のマウスを代表する。

（実施例２）
図２１は、Ｅ−セレクチンおよびＣＸＣＲ４に対するＧＭＩ−１３５９の競合結合活性（ＩＣ５０）を決定するために行われた実験に関する。ＧＭＩ−１３５９を、シアリルＬｅ^Ｘの固定化Ｅ−セレクチンとの結合の阻害、およびα−ＣＸＣＲ４抗体のＲａｊｉ細胞との結合の阻害について評価した。

Ｅ−セレクチンのアンタゴニストとしてＧＭＩ−１３５９をスクリーニングするための阻害アッセイは、競合結合アッセイであり、それは、ＩＣ_５０値の決定を可能にする。ヒトＥ−セレクチン／Ｉｇキメラを、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて３７℃で２時間のインキュベーションにより固定化した。非特異的結合を低減するために、ＢＳＡを各ウェルに加え、室温で２時間、インキュベートした。Ｅ−セレクチン／Ｉｇキメラとのインキュベーション後、プレートを洗浄し、試験化合物の段階希釈物を、ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼとのビオチン化ｓＬｅ^ａ−ポリアクリルアミドのコンジュゲートの存在下でウェルに加え、室温で２時間、インキュベートした。洗浄後、固定化Ｅ−セレクチンと結合したｓＬｅ^ａの量を決定するために、ペルオキシダーゼ基質、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加えた。３分後、酵素反応を、Ｈ_３ＰＯ_４の添加により停止し、４５０ｎｍの波長における光吸収度を決定した。光吸収度読み取りを、漸増濃度のＧＭＩ−１３５９の関数として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してプロットし、結合を５０％阻害するために必要とされるＧＭＩ−１３５９化合物の濃度を決定し、ＧＭＩ−１３５９についてのＩＣ_５０として報告した。

ＣＸＣＲ４のアンタゴニストとしてＧＭＩ−１３５９をスクリーニングするための阻害アッセイは、フローに基づいた競合結合アッセイであり、それは、ＩＣ_５０値の決定を可能にする。Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）を、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回、洗浄した。２回目の洗浄後、その細胞を、１ｍＬあたり約２．５×１０^６個の細胞へ再懸濁し、８０μｌの細胞（およそ２×１０^５個の細胞）を、ＢＤ ２０６３チューブに加えた。次に、１０μｌのＧＭＩ−１３５９かＨＢＳＳ／ＢＳＡ（陰性対照として）のいずれかをその細胞に加え、チューブを１０分間、室温に置いた。その後、１０μｌのフィコエリトリンコンジュゲート化抗ＣＸＣＲ４抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１７０Ｐ）、または陰性対照としての、１０μｌのアイソタイプ対照抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＣ００３Ｐ）を、ＨＢＳＳ／ＢＳＡと共に細胞に加えた。それらの抗体を、４℃で１時間、細胞と結合させた。次に、２ｍＬの冷ＨＢＳＳ／ＢＳＡを、全てのチューブに加え、細胞を、２５０×ｇでの１０分間の遠心分離によりペレット化した。上清を捨て、細胞ペレットを、１ｍＬのＨＢＳＳ／ＢＳＡ中に再懸濁した。前と同様に、細胞を再び、ペレット化し、１５０μｌのＨＢＳＳ／ＢＳＡ中に懸濁し、１５０μｌの２％ホルムアルデヒドの添加により固定した。抗ＣＸＣＲ４−ＰＥ抗体の細胞との結合を、フローサイトメトリーにより評価し、蛍光強度中央値を決定した。蛍光強度中央値を、漸増濃度のＧＭＩ−１３５９の関数として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してプロットし、ＩＣ５０（フィコエリトリンコンジュゲート化抗ＣＸＣＲ４抗体の５０％阻害を生じる、ＧＭＩ−１３５９の濃度として定義される）を決定した。図２１に示されているように、結果は、小分子糖模倣体、ＧＭＩ−１３５９が、リガンドのＥ−セレクチンおよびＣＸＣＲ４との結合のどちらも阻害することを示した。

（実施例３）
図２２は、各処置群からの、研究１５日目、ｉｎ ｖｉｖｏでの、脾臓および腫瘍組織試料におけるＣＤ４＋、ＣＤ８＋、および制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋、およびＣＤ２５＋）の百分率を決定するために行われた実験に関する。群のそれぞれについての実験処置の詳細は、実施例１に関する上記で提供されている。

ＧＭＩ−１３５９の最終用量から２４時間後、各処置群からの５匹のマウスを安楽死させ、脾臓および腫瘍をフローサイトメトリーのために処理した。腫瘍を、軟部腫瘍についてのＭｉｌｔｅｎｙｉ解離プロトコールに従って解離させた。脾臓由来の単一細胞懸濁物を、浸軟により得た。

以下の細胞決定因子を、フローサイトメトリーのための蛍光コンジュゲート化試薬を使用して評価した：ラット抗ＣＤ４ ＦＩＴＣコンジュゲート、クローンＧＫ１．５、ラット抗ＣＤ８ａ ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７５０コンジュゲート、ラット抗ＣＤ１１ｂ ＰＥコンジュゲート、クローンＭ１／７０．１５、ラット抗ＣＤ２５ ＰＥコンジュゲート、クローンＰＣ６１ ５．３、マウス抗ＦｏｘＰ３ ＡＰＣコンジュゲート、クローン３Ｇ３、ラット抗ＧＲ１（ＬＹ６Ｃ／Ｇ）ＡＰＣコンジュゲート、クローン１Ａ８、ラット抗ＣＤ６２Ｌ ＰＥコンジュゲート、クローンＭＥＬ １２−Ｈ２．１００、ハムスター抗ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）ＰＥコンジュゲート、クローンＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、ラット抗ＣＤ２７９（ＰＤ−１）ＦＩＴＣコンジュゲート、クローンＲＭＰＩ−３０、およびラット抗ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１）ＡＰＣコンジュゲート、クローン１０Ｆ．９Ｇ２。

いったん試料を調製したら、９６ウェルプレートをＡｔｔｕｎｅオートサンプラーへ装填した。いくつかの試料（データが生じなかった）は、機器の設定を定義することが求められた。これらの設定は、電圧最適化およびゲーティングのための非標識細胞、ならびに、ゲートを確証するためのＦＭＯ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｍｉｎｕｓ−ｏｎｅ）対照を含む。作業空間をカスタマイズし、側方散乱（ＳＳＣ）対前方散乱（ＦＳＣ）から始めた。この最初のプロットを使用して、生きている細胞、生きている腫瘍細胞、または生きているリンパ球をゲーティングし、選択された細胞決定因子のみに関してさらなる分析を実施した。データは、２５０，０００個の事象かまたは１８０μＬのいずれかの閾値の最初に達した方から獲得された。

図２２は、全ＣＤ４＋リンパ球、全ＣＤ８＋リンパ球、および全制御性Ｔ細胞の百分率についての結果を示す。

（実施例４）
図２３は、１５日目、ｉｎ ｖｉｖｏでの、脾臓および腫瘍組織試料におけるＣＤ８／制御性Ｔ細胞の比率を決定するために行われた実験に関する。群のそれぞれについての実験処置の詳細は、実施例１に関する上記で提供されている。

ＧＭＩ−１３５９の最終用量から２４時間後、各処置群からの５匹のマウスを安楽死させ、脾臓および腫瘍をフローサイトメトリーのために処理した。腫瘍を、軟部腫瘍についてのＭｉｌｔｅｎｙｉ解離プロトコールに従って解離させた。脾臓由来の単一細胞懸濁物を、浸軟により得た。

以下の細胞決定因子を、フローサイトメトリーのための蛍光コンジュゲート化試薬を使用して評価した：ラット抗ＣＤ４ ＦＩＴＣコンジュゲート、クローンＧＫ１．５、ラット抗ＣＤ８ａ ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７５０コンジュゲート、ラット抗ＣＤ２５ ＰＥコンジュゲート、クローンＰＣ６１ ５．３、およびマウス抗ＦｏｘＰ３ ＡＰＣコンジュゲート、クローン３Ｇ３。

いったん試料を調製したら、９６ウェルプレートをＡｔｔｕｎｅオートサンプラーへ装填した。いくつかの試料（データが生じなかった）は、機器の設定を定義することが求められた。これらの設定は、電圧最適化およびゲーティングのための非標識細胞、加えて、ゲートを確証するためのＦＭＯ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｍｉｎｕｓ−ｏｎｅ）対照を含む。作業空間をカスタマイズし、側方散乱（ＳＳＣ）対前方散乱（ＦＳＣ）から始めた。この最初のプロットを使用して、生きている細胞、生きている腫瘍細胞、または生きているリンパ球をゲーティングし、選択された細胞決定因子のみに関してさらなる分析を実施した。データは、２５０，０００個の事象かまたは１８０μＬのいずれかの閾値の最初に達した方から獲得された。

結果は、ＧＭＩ−１３５９および抗ＰＤ−Ｌ１抗体での併用療法が、単一処置としての食塩水、ＧＭＩ−１３５９、または抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体での処置と比較して、腫瘍内Ｔ_ｒｅｇの百分率を低下させたことを示した（それぞれ、３．３％、２．９％、および１．９％に対して、０．９％）。いずれの他のＴ細胞サブセットも影響されなかった。図２３に示されているように、腫瘍内Ｔ_ｒｅｇ細胞の低下は、結果として、全Ｔ_ｒｅｇ細胞に対する全ＣＤ８Ｔ細胞の比率のより都合良い増加を生じた。脾臓において、Ｔ_ｒｅｇ細胞の百分率中央値は、処置のいずれによっても影響されず、抗ＰＤ−Ｌ１およびＧＭＩ−１３５９での組み合わされた処置による腫瘍内Ｔ_ｒｅｇ細胞における低下が、腫瘍微小環境における維持およびホーミングシグナルに対する減弱された応答であったことを示唆している。

（実施例５）
図２４Ａおよび２４Ｂは、各群における、平均腫瘍量、および処置に対する応答性を比較するために行われた実験に関する。群のそれぞれについての実験処置の詳細は、実施例１に関する上記で提供されている。

腫瘍体積は、処置の開始時点から始まって、週３回、記録されたカリパー測定値から推定された。腫瘍量（ｍｍ^３）を、以下のように、単位密度を仮定する長楕円の体積についての式により計算された：腫瘍量（ｍｍ^３）＝（Ｌ×Ｗ^２）／２、式中、ＬおよびＷは、それぞれの直交する腫瘍の長さおよび幅の測定値（ｍｍ）である。２０００ｍｍ^３を超える腫瘍を有する動物を安楽死させた。

図２４Ａは、効力を評価するために使用される主要エンドポイントを示す：腫瘍成長遅延；研究の終了時点における腫瘍なし生存動物の数；進行性疾患、安定病態、および退縮性疾患の発生率；ならびに応答。追加として、図２４Ｂは、ｘ軸に腫瘍植え込み後の日数、およびｙ軸に各処置群における平均腫瘍量（ｍｍ^３）を示す。

図２４Ａおよび２４Ｂに示されているように、腫瘍を有するマウスの全ての処置は耐容性が良好であり、処置関連死亡は生じなかった。同様に、図２４Ａに示されているように、抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせたＧＭＩ−１３５９での処置、または抗ＰＤ−Ｌ１単独での処置は、それぞれ、１３．５日および１１．７日の腫瘍成長遅延、ならびに４０％完全奏効率を伴った。

上記の様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。この明細書に参照され、および／または出願データシートに列挙された、全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、非米国特許、非米国特許出願、および非特許刊行物は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を用いるために改変して、なおさらなる実施形態を提供することができる。

上記で詳述された説明を鑑みれば、本実施形態に、これらを始めとする変更を施すことができる。一般的に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を与えられている等価物の完全な範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。

Claims (28)

1. 少なくとも１つの疾患、障害、または状態を処置および／または防止するための方法であって、それを必要とする被験体に、
   （１）有効量の少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤、ならびに
   （２）Ｅ−セレクチン阻害剤、ＣＸＣＲ４受容体阻害剤、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤から選択される有効量の少なくとも１つの他の阻害剤
   を投与するステップを含む、方法。
2. （１）前記少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤および（２）前記少なくとも１つの他の阻害剤のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの医薬組成物の形である、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤が第１の医薬組成物の形であり、前記少なくとも１つの他の阻害剤が第２の医薬組成物の形である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記少なくとも１つの医薬組成物が少なくとも１つの薬学的に許容される成分をさらに含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つの他の阻害剤がＥ−セレクチン阻害剤から選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記少なくとも１つの他の阻害剤がＣＸＣＲ４受容体阻害剤から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 前記少なくとも１つの他の阻害剤が、少なくとも１つのＣＸＣＲ４受容体阻害剤に連結された少なくとも１つのＥ−セレクチン阻害剤を含むヘテロ二機能性阻害剤から選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤が、Ｔ_ｒｅｇ細胞上のＰＤ−１受容体および／またはＣＴＬＡ−４タンパク質を標的にする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記少なくとも１つのＴ細胞チェックポイント阻害剤が、ニボルマブおよびイピリムマブから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記Ｅ−セレクチン阻害剤が、シアリルルイス^Ｘ（ｓＬｅ^Ｘ）およびｓＬｅ^Ｘ模倣体から選択される、請求項１に記載の方法。
11. 前記Ｅ−セレクチン阻害剤が、Ｅ−セレクチンの小分子糖模倣性アンタゴニスト、Ｅ−セレクチンを対象とする抗体、Ｅ−セレクチンに対するアプタマー、Ｅ−セレクチンを対象とするペプチド、およびＥ−セレクチンを対象とするペプチド模倣体から選択される、請求項１に記載の方法。
12. 前記Ｅ−セレクチン阻害剤が、式（Ｉ）：
    の化合物、式（Ｉ）の異性体、式（Ｉ）の互変異性体、および前記のいずれかの薬学的に許容される塩から選択され、式中、
    Ｒ^１が、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され；
    Ｒ^２が、Ｈ、−Ｍ、および−Ｌ−Ｍから選択され；
    Ｒ^３が、−ＯＨ基、−ＮＨ_２基、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｙ^１基、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｙ^１基、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＹ^１基から選択され、Ｙ^１が、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、Ｃ_２〜８ハロアルキニル基、Ｃ_６〜１８アリール基、およびＣ_１〜１３ヘテロアリール基から選択され；
    Ｒ^４が、−ＯＨ基および−ＮＺ^１Ｚ^２基から選択され、Ｚ^１およびＺ^２が、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され、Ｚ^１およびＺ^２が一緒になって環を形成してもよく；
    Ｒ^５が、Ｃ_３〜Ｃ_８シクロアルキル基から選択され；
    Ｒ^６が、−ＯＨ基、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され；
    Ｒ^７が、−ＣＨ_２ＯＨ基、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され；
    Ｒ^８が、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜Ｃ_８ハロアルキニル基から選択され；
    Ｌがリンカー基から選択され；
    Ｍが、ポリエチレングリコール、チアゾリル、クロメニル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_１〜４ＮＨ_２、Ｃ_１〜８アルキル、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＹから選択される非糖模倣部分であり、Ｙが、Ｃ_１〜４アルキル基、Ｃ_２〜４アルケニル基、およびＣ_２〜４アルキニル基から選択される、
    請求項１０に記載の方法。
13. 前記Ｅ−セレクチン阻害剤が、式（Ｉａ）：
    の化合物から選択され、式中、ｎが、１から１００までの範囲の整数から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＣＸＣＲ４受容体阻害剤が、ペプチド、ジケトピペラジン模倣体、ビシクラム、テトラヒドロキノリン、チアゾリルイソチオ尿素誘導体、およびベンゾジアゼピンから選択される、請求項１に記載の方法。
15. 前記ＣＸＣＲ４受容体阻害剤が、ＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ１３４、およびＴ２２ペプチドから選択される、請求項１に記載の方法。
16. 前記ヘテロ二機能性阻害剤が、式（ＩＩ）：
    の化合物、式（ＩＩ）の異性体、式（ＩＩ）の互変異性体、および前記のいずれかの薬学的に許容される塩から選択され、式中、
    Ｒ^１が、Ｈ、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜８ハロアルキニル基から選択され；
    Ｒ^２が、−ＯＨ基、−ＮＨ_２基、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｙ^１基、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｙ^１基、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＹ^１基から選択され、Ｙ^１がＣ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、Ｃ_２〜８ハロアルキニル基、Ｃ_６〜１８アリール基、およびＣ_１〜１３ヘテロアリール基から選択され；
    Ｒ^３が、−ＣＮ基、−ＣＨ_２ＣＮ基、および−Ｃ（＝Ｏ）Ｙ^２基から選択され、Ｙ^２が、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、−ＯＺ^１基、−ＮＨＯＨ基、−ＮＨＯＣＨ_３基、−ＮＨＣＮ基、および−ＮＺ^１Ｚ^２基から選択され、Ｚ^１およびＺ^２が、同一でも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜８ハロアルキニル基から独立して選択され、Ｚ^１およびＺ^２が一緒になって環を形成してもよく；
    Ｒ^４が、Ｃ_３〜８シクロアルキル基から選択され；
    Ｒ^５が、Ｈ、ハロ基、Ｃ_１〜８アルキル基、Ｃ_２〜８アルケニル基、Ｃ_２〜８アルキニル基、Ｃ_１〜８ハロアルキル基、Ｃ_２〜８ハロアルケニル基、およびＣ_２〜８ハロアルキニル基から独立して選択され；
    ｎが、１から４までの範囲の整数から選択され；
    Ｌが、リンカー基から選択される、
    請求項１に記載の方法。
17. 前記ヘテロ二機能性阻害剤が、式（ＩＩａ）：
    の化合物から選択される、請求項１に記載の方法。
18. 前記Ｅ−セレクチン阻害剤がＧＭＩ−１２７１である、請求項１に記載の方法。
19. 前記ヘテロ二機能性阻害剤がＧＭＩ−１３５９である、請求項１に記載の方法。
20. 前記少なくとも１つの疾患、障害、または状態が、がんから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記がんが液性がんである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記がんが固形がんである、請求項２０に記載の方法。
23. 前記被験体が、前記固形がんの腫瘍において局部的に処置される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記被験体が、がんを有し、化学療法および／または放射線療法を受けたことがある、または受ける予定である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記化学療法が、有効量のボルテゾミブおよび／またはゲムシタビンを投与することを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記少なくとも１つの疾患、障害、または状態が、細菌感染症、ウイルス感染症、少なくとも１つの細菌感染に関係する状態、および少なくとも１つのウイルス感染に関係する状態から選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記少なくとも１つの疾患、障害、または状態がＨＩＶ感染症である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記少なくとも１つの疾患、障害、または状態が敗血症である、請求項２６に記載の方法。