JP2019507798A - 肝疾患の予防又は治療用薬学組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、肝疾患の予防又は治療用薬学組成物に関し、より詳細には、瓦松の発酵物を用いて肝疾患を予防又は治療できる薬学組成物及びこれを製造する方法に関する。

Description

本発明は、肝疾患の予防又は治療用薬学組成物に関し、より詳細には、瓦松の発酵物を用いて肝疾患を予防又は治療できる薬学組成物及びこれを製造する方法に関する。

肝は、外部から入ってきた毒性物質から全身を防御し、生体外物質の代謝を担当する重要な機能を行う臓器である。すなわち、肝は、摂取した各種栄養素を生体に必要な形態に転換させ、アルブミンなどの生命維持に必要な各種物質を合成し、生体異物（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）を体外に***しやすい状態に転換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）させたりするなど、非常に多様な機能を行う。一旦、生体内に入ってきた生体外物質は肝を通過するので、肝は、栄養素以外の多くの毒性物質に露出する危険性が高く、他の臓器に比べて損傷する可能性が高い。肝は、再生能力に優れた臓器であって、少しの損傷は十分に回復する。しかし、過度なストレス、喫煙、環境汚染による化学物質への露出、飲酒、ウイルス感染、胆汁分泌停止などによって持続的に損傷を受けると、機能が低下するだけでなく、肝組織の一部が完全に破壊され、損傷部分は正常に回復できないという結果をもたらす。結局、肝線維化を経て致命的な肝硬化を起し、肝硬化は肝癌に発展し得る。また、肝疾患は、初期段階では痛みや自覚症状が現れなく、末期に至って発見されるので適切な時期に治療が不可能であり、その結果、死亡率も高い疾患である。このように、肝疾患の深刻性にもかかわらず、未だに効果的な肝疾患治療剤が存在していない実情にある。

肝炎ウイルスによる肝疾患の場合は抗ウイルス薬物が使用されているが、その副作用が深刻であるという問題がある。近来、アルコール及び環境汚染によって増加している毒性物質による肝疾患の場合は、未だに効果的な治療方法がほとんどない。そこで、肝組織の構造及び機能を維持しながら肝損傷を治療及び予防できる薬物の開発が切実に必要な実情にある。

一方、瓦松（Ｏｒｏｓｔａｃｈｙｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）は、瓦蓮華とも呼ばれる双子葉植物、バラ目、ベンケイソウ科の多年生草本植物であって、漢方古書には坑癌効果、解熱、止熱、湿疹、火傷などに特効を有するものと記録されている。特に、瓦松は、***癌、膵臓癌、骨髓癌、食道癌、子宮癌、淋巴腺癌、胃癌、大膓癌、高血圧、低血圧、血液循環、糖尿病、中風、関節炎、手足のしびれ、便秘、嘔吐、各種成人病などに特効を有するものと知られている。

瓦松に存在する成分としては、フリーデリン（ｆｒｉｅｄｅｌｉｎ）、エピフリーデラノール（ｅｐｉｆｒｉｅｄｅｌａｎｏｌ）、グルチノン（ｇｌｕｔｉｎｏｎｅ）及びグルチノール（ｇｌｕｔｉｎｏｌ）などのトリテルペノイド類（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）、β−システロール（β−ｓｉｓｔｅｒｏｌ）及びカンペステロール（ｃａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ）などのステロール系列の物質、脂肪酸エステル類、ケンペロール（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）及びケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）などのフラボノイド類、４−ヒドロキシ安息香酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３，４−ジヒドロキシ安息香酸（３，４−ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）及び没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）などの芳香族酸などがあり、近来は、前記瓦松を用いた多様な疾患の治療に対する研究が活発に進められている。

瓦松には９０％〜９５％以上の水分が含有されており、既存に知られている効能を発揮するためには過量に服用しなければならない。しかし、実際に消化機能が非常に低下し、適正量の食事を取ることさえも難しい患者の場合は、事実上、瓦松を過量に服用することが不可能である。これによって、瓦松の有効成分を増大させ、服用の便利性を高められる方法に対する研究が必要であろう。

本発明は、前記のような従来技術の問題を解決するためになされたものであって、本発明の一目的は、瓦松の発酵物を用いて肝疾患を効果的に予防又は治療できる薬学組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、簡単且つ容易な工程で瓦松の有効成分を増大させ、服用の便利性を高めた肝疾患の予防又は治療用組成物を製造する方法を提供することにある。

本発明の一具現例は、瓦松の発酵物を有効成分として含む肝疾患の予防又は治療用薬学組成物に関する。

本発明において、前記瓦松の発酵物を製造する方法は次の通りである。

まず、瓦松を準備し、３０℃〜５０℃の温度下で２４時間〜７２時間にわたって乾燥させた後、必要に応じては粉砕することができる。

前記瓦松の乾燥粉砕物に溶媒を添加し、瓦松懸濁液を得ることができる。ここで、前記溶媒の種類は特に制限しないが、後で発酵工程を行うためには蒸留水を使用することが好ましい。また、前記溶媒の添加量も特に制限しないが、懸濁液内の瓦松の乾燥粉砕物が５ｗ／ｖ％〜２０ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％〜１５ｗ／ｖ％又は５ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％で含まれるように溶媒を添加することができる。

本発明において、前記瓦松懸濁液は酵素又は発酵菌株の培養液を用いて発酵できるが、発酵菌株培養液を用いて発酵させることが好ましく、この場合、瓦松の有効成分を増大させ、抗酸化又は抗炎症効果を極大化させることができる。また、１次的に酵素を用いて発酵させた後、２次的に発酵菌株培養液を用いて発酵させることがより好ましい。

本発明において、前記瓦松の発酵時に使用する酵素としては、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、ヘミセルラーゼ（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ）及びアミログルコシダーゼ（Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）からなる群から選ばれた１種以上を使用可能であり、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びアミログルコシダーゼが０．５〜１．５：０．５〜１．５：０．５〜１．５の重量比で混合された酵素を使用することが好ましい。

本発明において、前記セルラーゼは、１，４−（１，３：１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノ−ヒドロラーゼ（１，４−（１，３：１，４）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ４−ｇｌｕｃａｎｏ−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）であり、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社のセルクラスト（Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ）を使用することが好ましいが、これに制限されない。

また、本発明において、前記ヘミセルラーゼとしては、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社のＨＴｅｃ２を使用することが好ましいが、これに制限されない。

本発明では、前記瓦松の懸濁液に前記酵素を添加した後、１２時間〜４８時間、１２時間〜３６時間又は２４時間〜３６時間にわたって発酵させることによって１次発酵物を得ることができる。

本発明において、前記酵素の添加量は特に制限しないが、例えば、前記酵素は、瓦松の懸濁液の総体積に対して５体積％〜２０体積％、５体積％〜１５体積％又は５体積％〜１０体積％の量で添加することができる。

本発明において、前記のように１次発酵物が得られると、発酵菌株の培養液を用いて２次的に発酵させることによって２次発酵物を得ることができる。

本発明において、前記発酵菌株としては、ラクトバチルス・ヒルガルディー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選ばれた１種以上の菌株を使用可能であるが、リゥコノストック・メゼンテロイデス及びペディオコッカス・アシディラクティシのうち１種以上の菌株を使用することが好ましく、ペディオコッカス・アシディラクティシを使用するより好ましい。前記発酵菌株としてペディオコッカス・アシディラクティシを使用する場合、瓦松の有効成分を増大させ、肝疾患の治療効果を高めることができる。

また、本発明において、前記発酵菌株の培養液は、果汁培地又は野菜汁培地をさらに含むことによって発酵菌株の活性を向上させることができる。ここで、前記果汁培地の種類は特に制限しなく、例えば、ミカン、ブドウ、リンゴ、マンゴー、オレンジ、パイナップル、トックリイチゴ、イチゴ、桃、ブルーベリー又は石榴などの果物から得たものであり得るが、これらに限定されなく、果物のピューレであってもよい。また、前記野菜汁の種類は特に制限しなく、例えば、ニンジン、トマト、キャベツなどの汁液を挙げることができるが、これらに限定されなく、野菜のピューレであってもよい。

前記果汁及び野菜汁は、果物又は野菜をミキサーなどで研磨・粉砕し、必要に応じてさらに搾汁することによって得ることができる。このような果汁及び野菜汁は、適当に濃縮することも好ましく、濃縮液はそのままの状態で、蒸留水などで適当な濃度に希釈して使用することも好ましい。

上述した果汁及び野菜汁は、それぞれを単独で使用してもよく、目的に応じて組み合わせて使用してもよい。また、果物又は野菜のピューレは、超高圧下（例えば、１００ＭＰａ）で酵素処理することによって得ることができ、食物繊維を豊かに含んでいる。この酵素処理に使用される酵素は、果物又は野菜の種類に応じて適宜選択され得る。

また、本発明において、前記培養液は、発酵菌株を１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ又は１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの量で含むことができる。

本発明では、前記瓦松の懸濁液に発酵菌株の培養液を添加した後、３０℃〜４０℃で３日〜１０日間静置培養させることによって発酵物を得ることができる。

但し、前記培養液の添加量は特に制限しないが、懸濁液の総重量に対して０．０５重量％〜０．５重量％、０．０５重量％〜２重量％又は０．０５重量％〜０．１重量％の量で添加することが好ましい。

本発明において、前記のように２次発酵物が得られると、必要に応じては前記２次発酵物を凍結乾燥させることができる。ここで、前記凍結乾燥の遂行条件は特に制限しないが、例えば、凍結乾燥は、−６０℃〜３０℃で６時間〜５０時間にわたって行うことができ、−４０℃〜−２０℃で１時間〜３時間、−２０℃〜−１０℃で１時間〜３時間、−５℃〜０℃で３時間〜５時間、１０℃〜２０℃で１時間〜３時間、及び２０℃〜３０℃で１時間〜３時間にわたって行うことが好ましい。

本発明において、前記瓦松の発酵物の剤形は特に制限しなく、例えば、瓦松の液状発酵物或いは固体状発酵物であり得る。前記瓦松の発酵物の剤形は、組成物が投与される患者の嗜好或いは使用目的などに応じて多様に調節されて選択され得る。

本発明において、前記のように得られた瓦松の発酵物は、肝細胞の核内でＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の転写作用を抑制することによって、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２及びＴＮＦ−ａの生成及びその遺伝子発現を効果的に阻害し、抗酸化及び抗炎症反応によって肝損傷を予防又は治療することができる。

本発明において、予防又は治療の対象となる肝疾患は、自己免疫性肝疾患、薬物性肝疾患、アルコール性肝疾患、感染性肝疾患及び先天性代謝性肝疾患からなる群から選択可能であり、感染性肝疾患であることが好ましい。

一方、リポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）は炎症誘発物質の生成を刺激し、急性肝損傷を発生させるが、その結果、脂肪肝が生じ、体重に対する肝組織の重量比が増加するようになる。人体の肝で脂肪が占める比率は５％程度であるが、これより多くの脂肪が蓄積された状態を脂肪肝と言う。脂肪肝は、さらに深刻になると、肝炎、肝硬変に変わってから肝癌に至ることもある。

したがって、本発明の薬学組成物は、リポポリサッカライドによって媒介された急性肝損傷或いはそれから起因した脂肪肝の予防又は治療に使用することが最も好ましい。

本発明において、前記薬学組成物における前記瓦松の発酵物の含量は特に制限しないが、組成物の総重量に対して０．１重量％〜５０重量％の量で含まれることが好ましい。

本発明において、「予防」という用語は、本発明の薬学組成物を用いて肝疾患を遮断したり、肝疾患を抑制又は遅延させる行為であればいずれも制限なく含むことができる。

また、本発明において、「治療」という用語は、本発明の薬学組成物を用いて肝疾患が好転したり有利になる行為であればいずれも制限なく含むことができる。

本発明の前記薬学組成物は、通常の方法に係る適切な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。本発明の薬学組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油などを使用可能であるが、これに制限されない。

また、本発明に係る薬学組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤又は滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用可能である。より詳細には、製剤化する場合、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調剤され得る。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の薬学組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜることによって調剤され得る。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクなどの潤滑剤も使用可能である。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが含まれるが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどが使用可能である。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用可能である。

本発明に係る薬学組成物の投与経路は、これらに限定されないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸を含み、経口又は非経口投下であることが好ましい。本発明で使用された「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液のう内、胸骨内、硬膜内、病巣内及び頭蓋骨内注射又は注入技術を含む。また、本発明の薬学組成物は、直腸投与のための坐剤の形態で投与され得る。

本発明の薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合及び予防又は治療される特定疾患の重症を含む様々な要因によって多様に変わり得る。前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、１日０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ又は０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。また、前記薬学組成物は、１日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量は、いずれの面においても本発明の範囲を限定するものではない。本発明に係る薬学的組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化され得る。

本発明の他の具現例は、瓦松の発酵物を有効成分として含む肝疾患の予防又は改善用食品組成物に関する。

本発明の食品組成物における前記瓦松の発酵物に関するものは、矛盾しない限り、本発明の薬学組成物に関する開示事項を参照することができる。

本発明の食品組成物は、各種食品類、例えば、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、お菓子、餠、パンなどの形態に製造され得る。本発明の食品組成物は、毒性及び副作用がほとんどない植物抽出物で構成されたものであるので、予防の目的で長期間服用するときにも安心して使用することができる。

本発明の組成物が食品組成物に含まれるとき、その添加量は、全体重量の０．１％〜５０％の比率であり得る。

ここで、前記食品組成物が飲料の形態に製造される場合、指示された比率で前記食品組成物を含有すること以外に特別な制限点はなく、通常の飲料と同様に様々な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。すなわち、天然炭水化物としてブドウ糖などのモノサッカライド、果糖などのジサッカライド、スクロースなどのポリサッカライド、デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールなどを含むことができる。前記香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）などを挙げることができる。

その他の本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。

このような成分は、独立的に又は組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率は、本発明の組成物１００重量部当たり０．１重量部〜５０重量部の範囲から選択され得る。

本発明の瓦松発酵物は、肝細胞の核内でＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の転写作用を抑制することによって、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２及びＴＮＦ−ａの生成及びその遺伝子発現を効果的に阻害することができ、このような抗酸化及び抗炎症反応によって肝損傷を効果的に予防又は治療することができる。

図１は、評価例４で実施例１〜５の瓦松発酵物に対するＵＰＬＣ成分分析結果を示した図である。

図２は、評価例５でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理による体重の変化を示したグラフである。

図３は、評価例５でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理によるマウスの体重に対する肝組織の重量比の変化を示したグラフである。

図４は、評価例６でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理による血清内のＡＬＴ水準の変化を測定した結果を示したグラフである。

図５は、評価例６でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理による血清内のＡＳＴ水準の変化を測定した結果を示したグラフである。

図６の（ａ）及び（ｂ）は、評価例７でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理による血清及び肝組織内のＲＯＳ水準の変化を示したグラフである。

図７は、評価例８でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理によるＡＰ−１発現量の変化を示したグラフである。

図８は、評価例８でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理によるＮＦ−κＢ ｐ６５発現量の変化を示したグラフである。

図９は、評価例８でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理によるＣＯＸ−２発現量の変化を示したグラフである。

図１０は、評価例８でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理によるｉＮＯＳ発現量の変化を示したグラフである。

図１１は、評価例８でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理によるＴＮＦ−α発現量の変化を示したグラフである。

図１２の（ａ）〜（ｅ）は、評価例９でＬＰＳによる急性肝損傷マウスモデルにおける各処理後の肝組織を光学顕微鏡で観察した写真である。

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。しかし、本発明の実施形態は、様々な他の形態に変形可能であり、本発明の範囲が以下で説明する実施形態に限定されることはない。また、本発明の実施形態は、当該技術分野で平均的な知識を有する者に本発明をさらに完全に説明するために提供されるものである。

［準備例１］材料の準備

１．薬剤の準備

瓦松（Ｏｒｏｓｔａｃｈｙｄｉｓ Ｈｅｒｂａ）をバルン韓薬（ソウル、韓国）から購入した。

２．酵素の準備

１次発酵時に使用する酵素としては、韓国化学研究院融合化学研究チームで提供したセルクラスト（Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＨＴｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社、Ｄｅｎｍａｒｋ）、アミログルコシダーゼの１：１：１混合液を使用した。

３．発酵菌株培養液の準備

２次発酵時に使用する培養液としては、ラクトバチルス・ヒルガルディー、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ペディオコッカス・アシディラクティシ及びサッカロマイセス・セレビシエの合計４種の発酵菌株のそれぞれを液状発酵させた後、果汁培地を添加し、菌株の濃度が１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように菌株懸濁液を準備した。但し、微生物の培養に使用された試薬としては、いずれもＤｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）製品を使用した。菌株培養液に果汁培地を添加し、菌株の濃度を１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌにした。

４．その他の試薬及び材料の準備

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（血清型Ｏ５５：Ｂ５、Ｌ２８８０）由来のＬＰＳ、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ、ＤＰＰＨ）、２，２’−アジノビス−３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（２，２’−ａｚｉｎｏｂｉｓ−３−ｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＴＳ）は、Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ社（ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。ニトロセルロース膜は、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＧＥヘルスケア社（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）から購入し、フェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ）、核内因子カッパＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ Ｂ）（ＮＦ−κＢ ｐ６５）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ｉＮＯＳ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）（ＣＯＸ−２）、腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）（ＴＮＦ−α）、ヒストン、β−アクチン及び２次抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入し、アクチベータータンパク質−１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）（ＡＰ−１）はＣｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。プロテアーゼ抑制剤混合物、ＤＭＳＯ及びエチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＥＤＴＡ）は和光純薬工業株式会社（大阪、日本）から購入した。また、２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ、ＤＣＦＨ−ＤＡ）及びジヒドロローダミン１２３（Ｄｉｈｙｄｒｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）から購入し、ＥＣＬウエスタンブロット探知試薬はＧＥヘルスケア社から購入して使用した。タンパク質定量のためのＢＣＡタンパク質アッセイキットはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から購入した。

［実施例１〜５］瓦松の液状発酵物の製造

１．瓦松の乾燥及び粉砕

購入した瓦松を水洗した後、乾燥機（ＨＤＧ−２２２、Ｈｙｕｎｄａｉ Ｅｎｅｒｔｅｃ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、華城、韓国）を用いて４０℃で３日間低温乾燥させた後、超微粒子粉砕機（Ｊｅｔ Ｍｉｌｌ、Ｄｕｋｓａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、始興、韓国）を用いて微細粉末に細分化した。

２．１次発酵

乾燥瓦松粉末を５ｇずつ秤量して５個の容器に入れた後、４５ｍｌの滅菌蒸留水を添加し、固形分が１０ｗ／ｖ％になるように懸濁した。各懸濁液が含まれた容器に予め準備した複合酵素液を０．５ｍｌの量で添加し、これを一晩中発酵させた。

３．２次発酵

１次発酵物が含まれた各容器に下記の表１に示したように菌株培養液を０．５ｍｌずつ接種した後、３０℃に合わせられた恒温培養器（Ｊｅｉｏ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、大田、韓国）及び振盪培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ、Ｊｅｉｏ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、大田、韓国）で静置培養した。発酵させる間、サンプルを間欠的に振った。

［実施例６〜１０］瓦松の固体状発酵物の製造

前記実施例１〜５と同一の方法で５種の液状発酵物を製造した後、凍結乾燥器（ＬＹＯＰＨ−ＰＲＩＤＥ ２０Ｒ、Ｉｌｓｈｉｎ Ｂｉｏｂａｓｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、韓国）を用いて前記液状発酵物を−３０℃で１２０分、−１５℃で１２０分、０℃で２４０分、１５℃で１２０分、３０℃で１２０分の条件で凍結乾燥させた。

［評価例１］ｐＨ分析

前記実施例２〜５で発酵物の発酵がうまく進められたかどうかを評価するためにｐＨを測定し、その結果を下記の表２に示した。但し、ｐＨ測定は、Ｗａｔｅｒｐｒｏｏｆ社のｐＨシアータイプ（Ｓｈｅａｒ ｔｙｐｅ）を使用した。

前記表２に示したように、発酵時間の経過と共にｐＨが変化することを見ることができる。実施例２及び５の場合は、発酵時に使用した菌株が酸を生成する菌株であるので、時間が経過するほど発酵物のｐＨが減少することを見ることができ、その一方で、実施例３及び４の場合は、ｐＨが増加することを見ることができる。

［評価例２］ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）ラジカル消去能

前記実施例１〜５で得られた発酵物の抗酸化能力を評価するために、発酵物を１００倍希釈した後、ＤＰＰＨラジカル消去能（ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を分析した。具体的に、電子供与能（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ）はＤＰＰＨフリーラジカル消去法で測定した。ＤＰＰＨはフリーラジカルであって、溶液は紫色（ｄｅｅｐ ｖｉｏｌｅｔ）を帯びるが、試料中の抗酸化物質と結合して中和（還元）が行われると、溶液は透明に変わる。したがって、ＤＰＰＨは、試料中の抗酸化（ラジカル消去能）物質の量を測定するのに使用される。

前記実施例１〜５の発酵物試料１００μｌは、６０μｌ ＤＰＰＨ溶液をエタノールに溶解させた溶液１００μｌに入れて混合した後、室温で３０分間反応させた。この反応液を用いて５４０ｎｍでの吸光度で電子供与能を測定した後、電子供与能は式（ａ）によって算出した。その結果は下記の表３に示した。

［式（ａ）］

ラジカル消去能（％）＝｛（ＯＤ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}−ＯＤ_{ｓａｍｐｌｅ}）／ＯＤ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}｝Ｘ１００

ＯＤ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}：試料が入っていない場合（対照群）の吸光度

ＯＤ_{ｓａｍｐｌｅ}：試料が入っている場合の吸光度

前記表３に示したように、実施例１〜５は、いずれも高いＤＰＰＨラジカル消去能を示した。その中でも、特に実施例１及び３が非常に高いＤＰＰＨラジカル消去能を示し、実施例２がその次に高いＤＰＰＨラジカル消去能を示した。このように、本発明に係る瓦松の発酵物は、いずれも優れた抗酸化能力を有することが分かる。

［評価例３］ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス−３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ラジカル消去能

前記実施例１〜５で得られた発酵物の抗酸化能力を評価するために、発酵物を１００倍希釈した後、ＡＢＴＳラジカル消去能を分析した。具体的に、７ｍｍのＡＢＴＳ及び２．４５ｍｍの過硫酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）を蒸留水に溶かした後、１２時間にわたって遮光させて保管した。この反応液は、４１５ｎｍでエタノールを用いて吸光度を０．７０±０．０２に補正した。その後、ＡＢＴＳ ９５μｌに実施例１〜５の発酵物試料５μｌを添加して１５分間反応させた後、４１５ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度は、式（ｂ）によって算出し、その結果は下記の表４に示した。

［式（ｂ）］

ラジカル消去能（％）＝｛（ＯＤ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}−ＯＤ_{ｓａｍｐｌｅ}）／ＯＤ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}｝×１００

ＯＤ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}：試料が入っていない場合（対照群）の吸光度

ＯＤ_{ｓａｍｐｌｅ}：試料が入っている場合の吸光度

前記表４に示したように、実施例１〜５は、いずれも高いＡＢＴＳラジカル消去能を示した。その中でも、特に、実施例４が非常に高いＡＢＴＳラジカル消去能を示し、実施例１がその次に高いＡＢＴＳラジカル消去能を示した。このように、本発明に係る瓦松の発酵物は、いずれも優れた抗酸化能力を有することが分かる。

［評価例４］成分分析

実施例１〜５で得られた発酵物１ｍｌに含有された成分を分析するために、Ｗａｔｅｒｓ社のＥＳＩソースの質量分析器が結合されたＵＰＬＣを用いて分析した。成分を分離するためにＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×１５０．０ｍｍ、１．７μｍ）カラムを使用し、移動相は、下記の表５に示した条件で０．１％のギ酸が含有された水及びアセトニトリルを用いてグラジエント溶媒条件で流した。カラムは４０℃に維持し、流速は分当たり０．１８ｍｌ／ｍｉｎとし、注入量は３．０μｌとした。また、定量分析のために、ＡＣＱＵＩＴＹ ＴＱＤ ＭＳを用いて陽イオン及び陰イオンモードで検出した。ＭＳ検出のために、キャピラリー電圧（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ）（３．３ｋＶ）、引出電圧（ｅｘｔｒａｃｔ ｖｏｌｔａｇｅ）（３Ｖ）、インターフェース温度（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（１２０℃）、ＲＦレンズ（０．３Ｖ）、脱溶媒温度（ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（３００℃）、脱溶媒ガス（ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｇａｓ）（６００Ｌ／ｈ）、コーンガス（ｃｏｎｅ ｇａｓ）（５０Ｌ／ｈ）及び衝突ガス（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ）（０．１４ｍｌ／ｍｉｎ）などに対する条件を設定し、多重反応検知法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、ＭＲＭ）モードを適用して定量を実施した。実施例１〜５の発酵物１ｍｌに含有された成分を分析し、その結果を下記の表６及び図１に示した。発酵瓦松は、ケルセチン及びケンペロールの含量を分析して示し、ｔｒは、検出されるが、定量値が意味のないことを意味する。

前記表６及び図１に示したように、実施例１〜５で得られた瓦松の液状発酵物内のルチン、イソクェルシトリン、ケンペロール−３−Ｏ−ルチノシド、クェルシトリン、ケルセチン及びケンペロールの成分を分析した結果、実施例１の発酵物において、ケルセチンの含量が５．３８と示され、ケンペロールの含量が９．９４と示されたことを見ることができる。

［評価例５］ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）による急性肝損傷の改善効果

ＩＣＲマウス（６週齢、雄）に何ら処置もしていない正常群、ＬＰＳを処置した対照群、前記対照群に実施例１、３及び４で得られた発酵物の２００ｍｇ／ｋｇの用量を１日１回８日間経口投与した投与群を合計５つのグループに分類し、各群に６匹ずつ割り当てた。

８日間試料を各用量に合わせて経口投与し、実験９日目にＬＰＳ ２０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射し、２４時間絶食した後、エチルエーテルで吸入麻酔をし、心臓から血液を採取し、直ちに遠心分離機を用いて血清を分離した。その後、食塩水（０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を灌流して肝を採取し、臓器の重さを測定した後、分析前まで迅速に−８０℃で保管した。

適応期間を除いた食餌給与期間８日間にわたって体重の変化及び食餌効率を測定し、その結果を下記の表７及び図２に示した。また、マウスの体重に対する肝組織の重量比を測定し、その結果は図３に示した。

前記表７及び図２に示したように、時間の経過と共に、正常群、対照群及び実施例１、３及び４の発酵物を投与した投与群のいずれにおいても体重が一定に増加することを見ることができる。

また、図３に示したように、対照群の場合は、体重に対する肝組織の重量比が正常群に比べて有意に増加することを見ることができるが、実施例１、３及び４の発酵物を投与した投与群の場合は、体重に対する肝組織の重量比が対照群に比べて減少する傾向を見ることができる。特に、実施例４の発酵物を投与した場合は、体重に対する肝組織の重量比が対照群に比べて有意に減少したことを見ることができる。

したがって、本発明の薬学組成物は、ＬＰＳによる急性肝損傷から起因した脂肪肝の生成を抑制し、肝機能の回復を促進させることが分かる。

［評価例６］血清のＡＬＴ及びＡＳＴ測定

前記評価例５の正常群、対照群及び投与群のマウスの心臓から採取した血液を遠心分離機に４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって血清を得た。血清中のＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びＡＳＴ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性度は、ライトマン−フランケル（Ｒｅｉｔｍａｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ）法によって製造された試薬キットを用いて５０５ｎｍでＵＶ分光光度計で比色定量して測定し、血清リットル当たりの国際ユニット（ＩＵ／Ｌ）で測定し、その結果をそれぞれ図４及び図５に示した。

ＡＳＴ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（アスパラギン酸アミノ基転移要素））又はＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ））、及びＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（アラニンアミノ基転移要素））又はＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）は、肝機能関連酵素として肝細胞内のミトコンドリアに存在し、肝細胞の破壊によって血液内に流出する酵素に該当する。すなわち、ＡＳＴ及びＡＬＴは、肝細胞内に存在する酵素であって、主に肝細胞が損傷を受ける場合に血中に放出され、血中数値が増加するようになる。

図４に示したように、対照群の場合は、正常群に比べて肝細胞の破壊によってＡＬＴが有意に増加したが、実施例１、３及び４の発酵物を投与した投与群の場合は、対照群に比べてＡＬＴが減少したことを見ることができ、特に実施例３及び４の発酵物を投与した場合は、ＡＬＴが対照群より有意に減少したことを見ることができる。

図５に示したように、対照群の場合は、正常群に比べてＡＳＴが有意に増加したが、実施例１、３及び４の発酵物を投与した投与群の場合は、対照群に比べてＡＳＴが減少したことを見ることができ、特に実施例３及び４の発酵物を投与した場合は、ＡＳＴが対照群より有意に減少したことを見ることができる。

このように、本発明の薬学組成物は、ＬＰＳによって誘導された肝損傷を回復させることを見ることができるので、急性・慢性肝損傷、脂肪肝などの肝疾患に優れた効果を示すことを期待することができる。

［評価例７］活性酸素種（ＲＯＳ）の測定

前記評価例５の正常群、対照群及び投与群のマウスの心臓から採血した血液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって血清を獲得し、肝組織は、１ｍｍのＥＤＴＡ−５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）を用いて粉砕した。血清及び肝組織内のＲＯＳを測定するために２５ｍＭのＤＣＦＨ−ＤＡを混合した後、蛍光光度計を用いて０分から毎１０分ずつ５３０ｎｍの放出波長及び４８５ｎｍの励起波長を用いて３０分間測定した算出値を計算した。その結果は、それぞれ図６の（ａ）及び（ｂ）に示した。

図６の（ａ）及び（ｂ）に示したように、酸化的ストレスのバイオマーカーであるＲＯＳが正常群に比べて対照群で高く測定されたが、実施例１、３及び４の発酵物を投与した場合は、対照群より測定量が減少したことを見ることができる。特に肝組織で実施例１、３及び４の発酵物を投与した場合は、ＲＯＳが対照群に比べて有意に減少することを見ることができる。

酸化的ストレスは、ＬＰＳによって誘導された肝損傷に重要な役割をし、ＲＯＳの過度な生成は抗酸化システムの不均衡をもたらし、結局、細胞の損傷を引き起こす。したがって、ＲＯＳは、組織損傷の改善に主な要因として作用するが、本発明に係る薬学組成物を投与した場合は、血清及び肝組織でＲＯＳが全て減少し、特に肝組織ではＲＯＳが有意に減少することを見ることができるので、肝損傷の改善効果があることが分かる。

［評価例８］ウェスタンブロット

前記評価例５の正常群、対照群及び投与群のマウスの肝の細胞質タンパク質を得るために、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、１５ｍＭのＣａＣｌ_２、１．５Ｍのスクロース、０．１ＭのＤＴＴ及びプロテアーゼ抑制剤複合体（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を添加したバッファーＡを組織粉砕機で粉砕した後、１０％のＮＰ−４０溶液を添加した。これをアイス上で２０分間静置させた後、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、細胞質タンパク質を含んでいる上層液を分離した。

核タンパク質を得るために、１０％のＮＰ−４０が添加されたバッファーＡで濯ぎを２回行い、１００μｌのバッファーＣ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．３ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ及び１０％グリセロール）を添加して再浮遊させた後、１０分ごとにボルテックスを３回行った。４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、核タンパク質を含んでいる上層液を獲得し、これを−８０℃でそれぞれ冷凍保管した。

肝組織の細胞質タンパク質であるｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＴＮＦ−α、β−アクチン、及び核タンパク質であるＡＰ−１、ＮＦ−κＢ ｐ６５、ヒストンタンパク質の発現を測定するために、１０μｇのタンパク質を８％〜１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、アクリルアミドゲルをニトロセルロースメンブレンに移動させた。準備されたメンブレンにそれぞれの１次抗体を処理して４℃で一晩中反応させた後、ＰＢＳＴで６分ごとに５回洗浄し、それぞれ処理された１次抗体に使用される２次抗体（ＰＢＳＴで１：３０００に希釈して使用）を用いて常温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴで６分ごとに５回洗浄した。そして、光を発するＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）溶液をＧＥヘルスケア社（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）に露出させた後、Ｓｅｎｓｉ−Ｑ２０００ Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（Ｌｕｇｅｎ Ｓｃｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、ソウル、韓国）に感光させることによってタンパク質の発現を確認した後、該当のバンドをＡＴＴＯデンシトグラフソフトウェア（Ｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｐｈ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ＡＴＴＯ株式会社、東京、日本）プログラムを用いて定量した後、これを図７〜図１１に示した。

図７及び図８に示したように、炎症性媒介因子であるＡＰ−１及びＮＦ−κＢ ｐ６５の発現量を測定した結果、対照群の場合は、正常群に比べて発現量が有意に増加したが、実施例１、３及び４の発酵物を投与した場合は、対照群に比べて発現量が有意に減少したことを見ることができる。

また、図９〜図１１に示したように、ＣＯＸ−２、ｉＮＯＳ及びＴＮＦ−αの発現量を測定した結果、対照群の場合は、正常群に比べて発現量が有意に増加したが、実施例１、３及び４の発酵物を投与した場合は、対照群に比べて発現量が著しく減少したことを見ることができ、特にＣＯＸ−２の発現においては実施例３及び４の発酵物を投与した場合に、ｉＮＯＳの発現においては実施例１、３及び４の発酵物を投与した場合に、そして、ＴＮＦ−αの発現においては実施例４の発酵物を投与した場合に対照群に比べて発現量が有意に減少したことを見ることができる。

これを通じて、本発明の薬学組成物は、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の信号伝逹調節によって炎症前駆物質の形成を抑制することが分かる。

［評価例９］組織の分析

前記評価例５の正常群、対照群及び投与群のマウスの肝組織を摘出した後、１０％の中性ホルマリンに１８時間以上固定させた後、脱水を経てパラフィン包埋した後、４μｍの切片を製作した。その後、Ｈ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎ）染色を実施し、これを光学顕微鏡で観察した。その結果は、図１２の（ａ）〜（ｅ）に示した。

図１２の（ａ）〜（ｅ）に示したように、正常群（ａ）に比べて、対照群（ｂ）では血管周囲の炎症程度が増加し、核の形状が著しく減少した状態を観察することができる。しかし、実施例１の発酵物投与群（ｃ）、実施例３の発酵物投与群（ｄ）及び実施例４の発酵物投与群（ｅ）では、血管周囲の炎症程度が減少した状態、及び核の有無が明確に区分される状態を観察することができる。

本発明の前記実験において、全ての数値は平均±標準誤差（Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ）で表示し、ＳＰＳＳ（２２．０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ ｐｒｏｇｒａｍ）を用いてＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ−ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）で有意水準ｐ−値＜０．０５で検定した。

以上の結果によると、ＬＰＳによって誘発されたマウスの急性肝細胞損傷において、本発明の薬学組成物は、抗酸化及び抗炎症に有意味な効果を有することを確認することができる。１次発酵物（実施例１）に比べて、２次発酵まで進めた発酵物（実施例３及び４）がより優れた効果を有することを見ることができ、特に、２次発酵時、ペディオコッカス・アシディラクティシ菌株を用いた発酵物（実施例４）が最も優れた効果を有することを見ることができる。

Claims (25)

1. 瓦松の発酵物を有効成分として含む肝疾患の予防又は治療用薬学組成物。
2. 前記瓦松の発酵物は、瓦松を酵素及び発酵菌株の培養液のうち１種以上によって発酵させたものである、請求項１に記載の薬学組成物。
3. 前記瓦松の発酵物は、瓦松を酵素で１次的に発酵させた後、発酵菌株の培養液で２次的に発酵させたものである、請求項２に記載の薬学組成物。
4. 前記酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びアミログルコシダーゼからなる群から選ばれた１種以上である、請求項２に記載の薬学組成物。
5. 前記酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びアミログルコシダーゼが０．５〜１．５：０．５〜１．５：０．５〜１．５の重量比で混合されたものである、請求項４に記載の薬学組成物。
6. 前記発酵菌株は、ラクトバチルス・ヒルガルディー、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ペディオコッカス・アシディラクティシ及びサッカロマイセス・セレビシエからなる群から選ばれた１種以上の菌株を含む、請求項２に記載の薬学組成物。
7. 前記発酵菌株は、ペディオコッカス・アシディラクティシを含む、請求項６に記載の薬学組成物。
8. 前記発酵菌株の培養液は、発酵菌株を１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌの量で含む、請求項２に記載の薬学組成物。
9. 前記発酵物は凍結乾燥物である、請求項１に記載の薬学組成物。
10. 前記肝疾患は、自己免疫性肝疾患、薬物性肝疾患、アルコール性肝疾患、感染性肝疾患及び先天性代謝性肝疾患からなる群から選ばれる、請求項１に記載の薬学組成物。
11. 瓦松の発酵物を有効成分として含む肝疾患の予防又は改善用食品組成物。
12. 前記瓦松の発酵物は、瓦松を酵素及び発酵菌株の培養液のうち１種以上によって発酵させたものである、請求項１１に記載の食品組成物。
13. 瓦松を準備する段階；及び
    瓦松を発酵させる段階；を含む、肝疾患の予防又は改善用薬学組成物の製造方法。
14. 前記瓦松を発酵させる段階は、酵素及び発酵菌株の培養液のうち１種以上を用いて行われる、請求項１３に記載の薬学組成物の製造方法。
15. 前記瓦松を発酵させる段階は、瓦松を酵素で１次的に発酵させる段階；及び
    発酵菌株の培養液で２次的に発酵させる段階；を含む、請求項１４に記載の薬学組成物の製造方法。
16. 前記酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びアミログルコシダーゼからなる群から選ばれた１種以上である、請求項１４に記載の薬学組成物の製造方法。
17. 前記酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びアミログルコシダーゼが０．５〜１．５：０．５〜１．５：０．５〜１．５の重量比で混合されたものである、請求項１６に記載の薬学組成物の製造方法。
18. 前記発酵菌株は、ラクトバチルス・ヒルガルディー、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ペディオコッカス・アシディラクティシ及びサッカロマイセス・セレビシエからなる群から選ばれた１種以上の菌株を含む、請求項１４に記載の薬学組成物の製造方法。
19. 前記発酵菌株は、ペディオコッカス・アシディラクティシを含む、請求項１８に記載の薬学組成物の製造方法。
20. 前記発酵菌株の培養液は、発酵菌株を１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌの量で含む、請求項１４に記載の薬学組成物の製造方法。
21. 前記瓦松を準備する段階は、瓦松に溶媒を添加することによって瓦松懸濁液を準備する段階をさらに含む、請求項１４に記載の薬学組成物の製造方法。
22. 前記酵素は、瓦松懸濁液の総体積に対して５体積％〜２０体積％の量で添加される、請求項２１に記載の薬学組成物の製造方法。
23. 前記発酵菌株の培養液は、瓦松懸濁液の総重量に対して０．０５重量％〜０．５重量％の量で添加される、請求項２１に記載の薬学組成物の製造方法。
24. 前記瓦松を発酵させる段階後、凍結乾燥させる段階をさらに含む、請求項１４に記載の薬学組成物の製造方法。
25. 前記肝疾患は、自己免疫性肝疾患、薬物性肝疾患、アルコール性肝疾患、感染性肝疾患及び先天性代謝性肝疾患からなる群から選ばれる、請求項１３に記載の薬学組成物の製造方法。

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