CN111675770B - 一种狼爪瓦松多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

一种狼爪瓦松多糖的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种狼爪瓦松多糖的制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明公开的一种狼爪瓦松多糖的制备方法，以生物反应器培养的狼爪瓦松愈伤组织为主要原料，利用大孔吸附树脂对狼爪瓦松愈伤组织多糖粗提物进行多糖纯化，操作简单、效率高、成本低。本发明制备的狼爪瓦松多糖具有抑菌、抗炎和抗癌活性，能够制备成抑菌药物、抗炎药物和抗癌药物。

Description

一种狼爪瓦松多糖的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种狼爪瓦松多糖的制备方法及其应用。
背景技术
狼爪瓦松(Orostachys cartilaginous A.Bor)，又名辽瓦松、干滴落，是景天科瓦松属二年生或多年生草本植物。狼爪瓦松多生长于低山山地，在我国主要分布于内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江等地。狼爪瓦松具有很高的药用价值，如抑菌、抗癌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等，这与它植物体内含有丰富的多糖类、黄酮类、酚类等多种活性物质密切相关。目前，随着人们对狼爪瓦松需求的增加，过度采集现象严重，造成其野生资源逐年减少，加上人工栽培因成分不稳定等原因，使得狼爪瓦松的开发与应用受到限制。因此，利用生物反应器快速、大量培养狼爪瓦松愈伤组织是缓解狼爪瓦松资源问题的有效途径之一，它作为一种新植物材料源具有潜在的应用价值。
植物多糖作为一种从植物中提取的天然活性物质，大量研究证明其具有抑菌、抗癌、抗炎等生物活性。现已成天然药物学和保健食品学的研究热点，既是寻找天然无毒副作用药物的有效途径，也是保健食品功能因子研究项目之一。因其来源广泛，植物多糖在医药领域具有重要地位。但在应用植物多糖的过程中，由于植物体构造复杂，且具有生物活性化合物在植物体内种类繁多，不同化合物的功能不一，在进行使用时很难实现精准高效的应用，从而造成资源的浪费，因此，需要对不同功能的植物源生物活性物质进行分离与提纯。大孔吸附树脂由于其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，不受无机盐类及强离子、低分子化合物存在的影响，在水和有机溶剂中可吸附溶剂而膨胀，是20世纪60年代发展起来的新型有机高聚物吸附剂，目前已被广泛应用于天然资源生物活性化合物的纯化和分离，尤其是黄酮类、多酚类、以及多糖类化合物。
高效地提取天然产物被认为是在制药和生化工业中使用绿色技术的一个重要领域，从植物粗提物中纯化生物活性化合物，对天然产物的利用具有特殊的意义，然而含有大量化合物的提取物中纯化理想的化合物是一项极具挑战性的任务。目前已开发出多种化合物的纯化方法，包括超临界流体萃取法、高速逆流色谱法、双水相萃取法、高效液相色谱法等，但这些方法具有复杂、耗时、维护成本高、对环境有害、不适合工业化生产等缺点。
因此，提供一种操作简单、高效率、低成本的狼爪瓦松多糖的制备方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种狼爪瓦松多糖的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种狼爪瓦松多糖的制备方法，具体步骤如下：
(1)利用生物反应器培养狼爪瓦松愈伤组织，培养后收获，冲洗去除表面培养基，在45℃恒温箱中烘至恒重后收集愈伤组织干品；
(2)制备狼爪瓦松愈伤组织多糖粗提物
将步骤(1)中收集的愈伤组织干品浸泡在料液比为1:15的70％乙醇中，60℃下冷凝回流1h，抽滤，收集滤渣；滤渣再次进行冷凝回流，重复3次；合并滤渣，滤渣表面挥干乙醇后，用100℃热水提取1h，提取三次，每次抽滤的滤液进行合并；将滤液在45℃条件下，减压浓缩，加入乙醇沉淀离心，冷冻干燥，得狼爪瓦松愈伤组织多糖粗提物；
(3)大孔吸附树脂法纯化狼爪瓦松多糖
取预处理AB-8树脂上柱，按照进料浓度1.6mg·mL-1，进料体积3BV，进料流速1BV·h-1，洗脱剂浓度65％，洗脱体积3BV，洗脱流速2BV·h-1的纯化条件进行纯化，收集流出液；
(4)将步骤(3)收集的流出液进行减压浓缩，40℃条件下烘干，得纯化后狼爪瓦松多糖。
进一步，步骤(1)所述利用生物反应器培养狼爪瓦松愈伤组织的具体步骤如下：在5L气球型气升式生物反应器中加入4L培养基：MS+BA 3.5mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1，pH 5.8；接入15g·L-1的狼爪瓦松愈伤组织；反应器通气量调节为300mL·min-1，在温度25℃和每天光照30μmol·m-2·s-1条件下培养16h，25d后收获愈伤组织，用自来水充分冲洗去除表面培养基，在45℃恒温箱中烘至恒重后收集愈伤组织干品。
进一步，步骤(3)所述预处理AB-8树脂的具体步骤如下：将大孔吸附树脂AB-8用95％乙醇溶液浸泡24h后上柱，用95％乙醇流过树脂柱充分冲洗，用蒸馏水冲洗至无醇味后加入4％盐酸溶液浸泡树脂4h，之后用蒸馏水冲洗柱子，至流出液pH呈中性；加入4％的氢氧化钠溶液浸泡树脂4h，用蒸馏水冲洗柱子直至流出液pH呈中性。
进一步，所述狼爪瓦松多糖在制备抑菌药物中的应用。
进一步，所述狼爪瓦松多糖在制备抗炎药物中的应用。
进一步，所述狼爪瓦松多糖在制备抗癌药物中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种狼爪瓦松多糖的制备方法及其应用，本发明以生物反应器培养的狼爪瓦松愈伤组织为主要原料，利用大孔吸附树脂对狼爪瓦松愈伤组织多糖粗提物进行多糖纯化，操作简单、效率高、成本低；本发明制备的狼爪瓦松多糖具有抑菌、抗炎和抗癌活性，能够制备成抑菌药物、抗炎药物和抗癌药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明狼爪瓦松愈伤组织纯化后总多糖(OTP)的抑菌谱；
其中，Ec：大肠杆菌；Pa：铜绿假单胞菌；Sa：金黄色葡萄球菌；Bs：枯草芽孢杆菌；OTP：总多糖；Control：DMSO；
图2附图为本发明纯化后总多糖(OTP)对RAW 264.7细胞活性的影响；
其中，ns表示与对照比较无显著性差异；
图3附图为本发明纯化后总多糖(OTP)对一氧化氮生成的影响；
其中，#为只加LPS组与对照组的比较结果，在0.05水平上差异显著；*、**、***分别表示与只加LPS组比较在0.05、0.01、0.001水平上差异显著；加3.13μg·mL-1OTP组的试验数据与只加LPS组没有差异性；
图4附图为本发明愈伤组织纯化后总多糖(OTP)对AGS细胞活性的影响；
图5附图为本发明愈伤组织纯化后总多糖(OTP)对HCT116细胞活性的影响；
图6附图为本发明愈伤组织纯化后总多糖(OTP)对MC38细胞活性的影响；
图7附图为本发明愈伤组织纯化后总多糖(OTP)对HepG2细胞活性的影响；
图8附图为本发明愈伤组织纯化后总多糖(OTP)对Hela细胞活性的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种狼爪瓦松多糖的制备方法，以生物反应器培养的狼爪瓦松愈伤组织为主要原料，利用大孔吸附树脂对狼爪瓦松愈伤组织多糖粗提物进行多糖纯化，具体步骤如下：
(1)狼爪瓦松愈伤组织生物反应器培养
在5L气球型气升式生物反应器中加入4L培养基(MS+BA 3.5mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1，pH 5.8)，接入15g·L-1的狼爪瓦松愈伤组织；反应器通气量调节为300mL·min-1，在温度25℃和每天光照(30μmol·m-2·s-1)16h条件下培养，25d后收获愈伤组织，用自来水充分冲洗去除表面培养基，在恒温箱(45℃)中烘至恒重后收集愈伤组织干品。
(2)狼爪瓦松愈伤组织多糖粗提物的制备
将步骤(1)中收集的愈伤组织干品浸泡在70％的乙醇(料液比为1:15)中，60℃下冷凝回流1h后，抽滤，收集滤渣；滤渣再次进行冷凝回流，重复3次；合并滤渣，滤渣表面挥干乙醇后，用100℃热水提取1h，提取三次，每次抽滤的滤液进行合并；将滤液在45℃条件下，减压浓缩，加入乙醇沉淀离心，冷冻干燥，得狼爪瓦松愈伤组织多糖粗提物；
(3)大孔吸附树脂法纯化狼爪瓦松多糖
①大孔吸附树脂AB-8的预处理：大孔吸附树脂AB-8用95％乙醇溶液浸泡24h后上柱，用95％乙醇流过树脂柱充分冲洗，用蒸馏水冲洗至无醇味后加入4％盐酸溶液浸泡树脂4h，之后用蒸馏水冲洗柱子，至流出液pH呈中性；加入4％的氢氧化钠溶液浸泡树脂4h，用蒸馏水冲洗柱子直至流出液pH呈中性；
②取预处理AB-8树脂上柱，按照进料浓度1.6mg·mL-1，进料体积3BV，进料流速1BV·h-1，洗脱剂浓度65％，洗脱体积3BV，洗脱流速2BV·h-1的纯化条件进行纯化，收集流出液；
(4)将步骤(3)收集的流出液进行减压浓缩，40℃条件下烘干，得纯化后纯度为96.4％的狼爪瓦松多糖(OTP)。
实施例2狼爪瓦松多糖的抑菌活性
试验方法：选用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌作为受试菌株，通过测定抑菌圈直径及最低抑菌浓度(MIC)，探明纯化多糖的抑菌活性。
(1)抑菌圈：采用滤纸片法测定抑菌圈直径。
具体为：用二甲基亚砜(DMSO)溶解纯化后狼爪瓦松多糖，使纯化多糖最终浓度为128mg·mL-1。将直径为6mm的滤纸片(CT0998B；Oxoid,UK)分别浸泡在纯化多糖溶液和DMSO(对照)中，使滤纸片吸满溶液(约2h)。分别将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液稀释至107CFU·mL-1，取300μL菌液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g·L-1+蛋白胨10g·L-1+氯化钠10g·L-1+琼脂10～20g，pH为7.0～7.2)中(平板直径为9cm)，然后放浸泡的滤纸片。培养皿放置于37℃下，培养12h，结果见图1(两个OTP为两个重复)；用游标卡尺测定抑菌圈直径，结果见表1。
表1狼爪瓦松愈伤组织纯化后总多糖(OTP)的抑菌圈直径
Figure BDA0002585884520000061
注：数值为平均值±标准偏差(n＝3)；-表示未能测定。
从纯化多糖的抑菌谱中可以看出，OTP对大肠杆菌(图1A)无抑菌效果，但对铜绿假单胞菌(图1B)、金黄色葡萄球菌(图1C)和枯草芽孢杆菌(图1D)均具有较好的抑菌效果，抑菌直径分别为8.5mm、11.2mm和13mm(表1)。
(2)最低抑菌浓度：利用TTC法测定最低抑菌浓度。将100μL菌悬液(107CFU·mL-1)加入至96孔板中后再加入100μL的纯化多糖溶液，使样品终浓度调节至64、32、16、8、4、2、1mg·mL-1，DMSO为对照。在37℃恒温箱中培养24h后，加入20μL浓度为0.2％的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，37℃下避光培养4h后，观察反应液的颜色，以无色时的提取物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。
从图1和表1结果可知，纯化多糖对枯草芽孢杆菌的制效果最佳；因此，采用TTC法测定了纯化多糖对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度(MIC)。TTC是一种脂溶性光敏感复合物，其氧化态呈无色，与活细菌内的琥珀酸脱氢酶反应后，被还原生成红色不溶性的三苯基甲臢。因此，可以根据颜色的深浅程度来鉴定细菌的活力。本试验采用二倍稀释法，根据TTC显色原理进行测定，发现随着样品浓度提高，混合液的红色逐渐变浅，当纯化多糖溶液浓度为8mg·mL-1时，红色沉淀完全消失，结果见表2。因此，8mg·mL-1为纯化多糖对枯草芽孢杆菌的MIC。
表2纯化后总多糖(OTP)的最低抑菌浓度检测结果
Figure BDA0002585884520000071
注：+++：深红色；++：桃红色；+：粉色；-：无色。
实施例3狼爪瓦松多糖的抗炎活性
试验方法：将RAW 264.7细胞接种于DMEM中，待细胞生长到对数期时，用胰蛋白酶消化并收集细胞，按每孔5×103接种于96孔板中，培养12h，加入提取物后，通过MTT法测定细胞活性评价细胞毒性，筛选适宜浓度。为了测定一氧化氮(NO)的释放量，将RAW 264.7细胞按每孔2.5×105接种于48孔板中，纯化多糖处理后，用脂多糖(LPS，0.1μg·L-1)处理，收集上清液，测定NO的释放量。
(1)细胞毒性：将生长对数期的Raw 264.7细胞，按每孔5×103接种于96孔板(含0.1mL DMEM培养液)，37℃培养12h。加入纯化多糖提取物，使其终浓度分别为0、25、50、100、200μg·mL-1；未用提取物处理的为空白对照，对照组加入等量DMEM培养液。处理24h后，弃混合液，每孔加100μL的MTT(500ng·mL-1)，37℃下培养3h后，弃去MTT，加入150μL的DMSO，300r·min-1下振荡5min，于550nm处测定OD值，结果见图2。从图2可知，在浓度为0～200μg·mL-1范围时，RAW 264.7细胞活性无显著性下降，说明此浓度范围内的纯化多糖无细胞毒性，可以作为抗炎研究的试验浓度。
(2)NO含量：将生长对数期的Raw 264.7细胞，按每孔2.5×105接种于48孔板(含0.3mL DMEM培养液)，37℃下培养12h。加入纯化多糖提取物，使其终浓度分别为0、3.13、6.25、12.5、25μg·mL-1，未用提取物处理的为空白对照，对照组加入等量DMEM培养液，处理1h后，加入1％的LPS(0.1μg·mL-1)处理24h，收集上清液。利用Griess还原法，将上清液与Griess试剂按照1:1比例混合，于550nm处测定OD值，计算NO含量，结果见图3。从图3可知，经OTP处理后，由LPS刺激的细胞中NO释放量有所降低，OTP对NO释放有显著抑制效果的最低浓度为6.25μg·mL-1，说明OTP具有较好的抗炎作用。
实施例4狼爪瓦松多糖的抗癌活性
试验方法：本试验中所用细胞系均由华南理工大学慢性疾病实验室廉哲雄教授提供。将人胃癌细胞系(AGS)、人结肠癌细胞系(HCT116)、人肝癌细胞系(HepG2)、人***细胞系(Hela)、小鼠结肠癌细胞系(MC38)分别接种于含有10％(V·V-1)胎牛血清(FBS，ThermoScientific，USA)和1％(V·V-1)抗生素(青霉素和链霉素，100U·mL-1，ThermoScientific，USA)的DMEM(Gibco，USA)培养液中，37℃细胞培养箱中培养(相对湿度95％，CO2含量5％)，待细胞生长到对数期时，胰蛋白酶(Trypsin-EDTA，Thermo Scientific，USA)消化并收集细胞。将癌细胞以每孔5×103接种于96孔板(每孔0.1mL DMEM)中，培养12h后，用OTP处理癌细胞，MTT法测定癌细胞活性。
测定方法：将生长对数期的癌细胞，按每孔5×103细胞接种于96孔板(含0.1mLDMEM培养液)，37℃培养(相对湿度95％，CO2含量5％)12h。加入纯化多糖提取物，使其终浓度分别为0、10、20、40、80、160、320μg·mL-1，未用提取物处理的为空白对照，对照组加入等量DMEM培养液。分别处理24、48、72h后，弃去混合液，每孔加入100μL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，500ng·mL-1)，37℃培养3h后，弃去MTT，加入150μL的DMSO，300r·min-1下振荡5min，于550nm处测定OD值，计算细胞活性。
采用MTT法通过细胞活性的测定评价了纯化多糖对AGS、HCT116、MC38、HepG2和Hela细胞的抗癌活性，结果见图4-图8。从图4-8可知，纯化多糖对癌细胞株活性的影响比较明显，在浓度为10μg·mL-1时，对AGS、HCT116、MC38、HepG2和Hela细胞都具有一定的抑制作用，并且随着浓度和处理时间的增加，细胞活性降低。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.狼爪瓦松多糖在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述狼爪瓦松多糖的制备步骤如下：
(1)利用生物反应器培养狼爪瓦松愈伤组织，培养后收获，冲洗去除表面培养基，在45℃恒温箱中烘至恒重后收集愈伤组织干品；
(2)制备狼爪瓦松愈伤组织多糖粗提物
将步骤(1)中收集的愈伤组织干品浸泡在料液比为1:15的70％乙醇中，60℃下冷凝回流1h，抽滤，收集滤渣；滤渣再次进行冷凝回流，重复3次；合并滤渣，滤渣表面挥干乙醇后，用100℃热水提取1h，提取三次，每次抽滤的滤液进行合并；将滤液在45℃条件下，减压浓缩，加入乙醇沉淀离心，冷冻干燥，得狼爪瓦松愈伤组织多糖粗提物；
(3)大孔吸附树脂法纯化狼爪瓦松多糖
取预处理AB-8树脂上柱，按照进料浓度1.6mg·mL-1，进料体积3BV，进料流速1BV·h-1，洗脱剂浓度65％，洗脱体积3BV，洗脱流速2BV·h-1的纯化条件进行纯化，收集流出液；
(4)将步骤(3)收集的流出液进行减压浓缩，40℃条件下烘干，得纯化后狼爪瓦松多糖；
步骤(1)所述利用生物反应器培养狼爪瓦松愈伤组织的具体步骤如下：在5L气球型气升式生物反应器中加入4L培养基：MS+BA 3.5mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1，pH5.8；接入15g·L-1的狼爪瓦松愈伤组织；反应器通气量调节为300mL·min-1，在温度25℃和每天光照30μmol·m-2·s-1条件下培养16h，25d后收获愈伤组织，用自来水充分冲洗去除表面培养基，在45℃恒温箱中烘至恒重后收集愈伤组织干品；
步骤(3)所述预处理AB-8树脂的具体步骤如下：将大孔吸附树脂AB-8用95％乙醇溶液浸泡24h后上柱，用95％乙醇流过树脂柱充分冲洗，用蒸馏水冲洗至无醇味后加入4％盐酸溶液浸泡树脂4h，之后用蒸馏水冲洗柱子，至流出液pH呈中性；加入4％的氢氧化钠溶液浸泡树脂4h，用蒸馏水冲洗柱子直至流出液pH呈中性。
2.权利要求1所述的狼爪瓦松多糖在制备抗炎药物中的应用。
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