JP2018502604A - 組換えHBV cccDNA、その作製方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む組換えHBV cccDNA、その組換えHBV cccDNAの作製方法、本発明の組換えHBV cccDNAの使用によりB型肝炎ウイルスを持続的に複製するcccDNAベースのインビトロまたはインビボモデルを樹立するための方法、ならびに抗HBV薬の評価のための方法に関する。【選択図】図1
Description
本発明は、HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサート(site-hybrid insert)を含む組換えHBV cccDNA、その組換えHBV cccDNAの作製方法、本発明の組換えHBV cccDNAの使用によりB型肝炎ウイルスを持続的に複製するcccDNAベースのインビトロまたはインビボモデルを樹立するための方法、ならびに抗HBV薬の評価のための方法に関する。
B型肝炎ウイルス(HBV)は最も危険なヒト病原体のひとつである。安全かつ有効なワクチンが20年以上前に得られているが、世界中でおおよそ20億人がHBVに感染し、3億5000万人以上が慢性的に感染している(Liaw, et al., 2009, Lancet, 373: 582-92)。慢性B型肝炎(CHB)感染は、肝硬変および肝細胞癌を含めた重篤な肝疾患の素因となる。HBV感染症は世界中で最上位の優先健康事項にランクされ、2010 Global Burden of Disease study(Lozano, et al., 2012, Lancet, 380: 2095-128)によれば死亡の10番目の主因(年間786000人の死亡)であった。現在承認されている薬物はCHBの治療を実質的に前進させたが、治癒率は依然として10%未満である(Kwon, et al., 2011, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 8: 275-84)。
HBVは部分二本鎖DNAウイルスである。ヒト肝実質細胞(hepatocyte)に感染すると、共有結合閉環状DNA(covalently closed circular DNA)(cccDNA)が形成されて感染細胞核内に維持され、それはそこに安定エピソームとして存続し、全ウイルス遺伝子の転写のための鋳型として使われる(Levrero, et al., 2009, J Hepatol, 51: 581-92)。現在の療法の主な限界は、既存のcccDNAプールを排除できないことである。したがって、cccDNAを直接ターゲティングする新規療法薬の開発に対する差し迫ったニーズがある(Fletcher, et al., 2013, Semin Liver Dis, 33: 130-7)。
HBV cccDNAベースのインビトロおよびインビボモデルの樹立に関するこれまでの試みは、満足すべき結果を生じることができなかった。たとえば、PCR作製したモノマー線状HBVゲノムのトランスフェクションは肝実質細胞においてcccDNAを産生できた(Gunther, et al., 1995, J Virol, 69: 5437-44, Pollicino, et al., 2006, Gastroenterology, 130: 823-37)が、効率が低く、オリゴマーが形成される可能性がある。この方法を改善するために、PCR作製したモノマー線状HBVゲノムをトランスフェクション前に環化することができたが、複雑なプロセスおよび低い収率のため、DNA製造をインビボ試験用にスケールアップするのはきわめて困難である(Cavallone, et al., 2013, J Virol Methods, 189: 110-7, Qin, et al., 2011, J Clin Microbiol, 49: 1226-33)。
最近、部位特異的分子内組換え法に基づくミニサークル技術が十分に確立され、それは高収率で再現性のある高品質を備えたミニサークルDNA(minicircle DNA)を効率的に製造することができる(Kobelt, et al., 2013, Mol Biotechnol, 53: 80-9)。しかし、そのような技術を組換えHBV cccDNAの製造のために用いて成功したことがない。
したがって、cccDNAベースのインビトロまたはインビボモデルの樹立に使用するために機能できる効率的な組換えHBV cccDNA、および大量のその組換えHBV cccDNAを効率的に作製する方法に対するニーズがある。
さらに、抗HBV薬を見出すことは簡便で生理学的に妥当なインビトロおよびインビボモデルが無いことにより妨げられてきた。初代ヒト肝実質細胞(primary human hepatocyte)(PHH)、分化したHepaRG細胞およびHepG2細胞など、安定NTCPタンパク質発現を伴う幾つかのインビトロHBV自然感染系はあるが、抗HBV分子についてこれらの系を用いたハイスループットスクリーニング(high throughput screening)(HTS)を実施するのはきわめて困難である。たとえば、新鮮なPHHはHBV薬物を見出すために生理学的に最も妥当なインビトロモデルであるが、PHHは単離されるとHBV感染に対するそれの感受性を急速に失う(Yan, et al., 2012, Elife, 1: e00049)。さらに、制限された供給量、高い代謝レベルおよびドナー間バリエーションは、この系を著しく非効率的なものにしている。HepaRGはHBV感染を支持できた最初の細胞系であるが、分化およびアッセイの時間が長いことがHTSへのそれの利用を制限している(Gripon, et al., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 15655-60)。HBV侵入レセプター(HBV entry receptor)としてのNTCPの発見に伴って、NTCPを安定発現するように遺伝子工学操作したHepG2細胞系はHBV感染されやすく、直ちに、HBVを研究して薬物を見出すためのきわめて有用なツールとなった(Yan, et al., 2012, Elife, 1: e00049)。しかし、HepG2.2.15、HepAD38、HepDE19およびHepDES19のように、HepG2由来の細胞系はすべてインターフェロン(IFN)仲介による抗HBV応答に欠陥があり、それはIFN経路関連の免疫調節物質を同定および試験するのに適さない(Marozin, et al., 2008, Mol Ther, 16: 1789-97, Keskinen, et al., 1999, Virology, 263: 364-75)。
HBVは宿主範囲がきわめて狭く、ヒト、チンパンジーおよびツパイ(tree shrew)(コモンツパイ(Tupaia belangeri))のみが感受性である。遺伝学的および免疫学的に十分に特性解明されたHBV感染可能な実験動物が無く、これはHBV免疫病原性および持続性のメカニズムに関する研究だけでなく抗HBV薬の開発をも著しく制限している。この制限を克服するために、ヒト肝実質細胞を導入してヒト化肝臓をもつキメラマウスを作製するか、あるいはHBV DNAをマウス肝臓にトランスジェニック、トランスダクションまたはハイドロダイナミックインジェクション(hydrodynamic injection)(HDI)により導入することによって、幾つかのマウスモデルが樹立された(Dandri, et al., 2014, J Immunol Methods)。キメラマウスモデル、たとえばuPA−SCIDマウスおよびFRGマウスは、侵入、cccDNA形成および伝播を含めてHBVの全ライフサイクルを支持するが、それらは遺伝学的に免疫欠損性であり、獲得免疫応答を研究するのには適さない(Dandri, et al., 2001, Hepatology, 33: 981-8, Azuma, et al., 2007, Nat Biotechnol, 25: 903-10)。HBV DNAをマウスの肝臓に直接導入すれば侵入工程を迂回でき、免疫コンピテント(免疫適格)(immunocompetent)バックグラウンド下のマウス肝臓における持続的なHBV複製が可能になるであろう。しかし、これらのモデルの主な限界は、HBV複製がcccDNAによって推進されず、それらを生理学的関連性がより少ないものにすることである。最近、Qiらは革新的なHDIベースの組換えcccDNAマウスモデルを開発し、その場合、cccDNAがインビボでCre/loxP仲介DNA組換えにより産生された(Qi, et al., 2014, J Virol, 88: 8045-56)。しかし、ウイルス複製レベルが低く、インビボ持続時間が短かった(Qi, et al., 2014, J Virol, 88: 8045-56)。
まとめると、既存のHBV細胞培養モデルは重大な限界をもつ。たとえば、PHHは供給量およびドナー間バリエーションの問題をもち、HepaRGは分化およびアッセイ時間が長いという問題をもち、HepG2−NTCP細胞はインターフェロン(IFN)仲介による抗HBV応答に欠陥をもつ。既存のHBV動物モデルも重大な限界をもつ。たとえば、ヒト化肝臓キメラマウスモデルは機能性である獲得免疫をもたない。トランスダクションおよびHDIマウスモデルにおいては、HBV複製がcccDNAによって推進されず、それらを生理学的関連性がより少ないものにしている。抗HBV薬を見出してHBV cccDNA関連の生物学的問題に対処するためには、これらの限界を改善するためにcccDNAベースのモデル、特にcccDNA推進による持続的HBV複製を支持できる免疫コンピテントマウスモデルを開発する必要がある。
Liaw, et al., 2009, Lancet, 373: 582-92
2010 Global Burden of Disease study (Lozano, et al., 2012, Lancet, 380: 2095-128)
Kwon, et al., 2011, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 8: 275-84
Levrero, et al., 2009, J Hepatol, 51: 581-92
Fletcher, et al., 2013, Semin Liver Dis, 33: 130-7
Gunther, et al., 1995, J Virol, 69: 5437-44
Pollicino, et al., 2006, Gastroenterology, 130: 823-37
Cavallone, et al., 2013, J Virol Methods, 189: 110-7
Qin, et al., 2011, J Clin Microbiol, 49: 1226-33
Kobelt, et al., 2013, Mol Biotechnol, 53: 80-9
Yan, et al., 2012, Elife, 1: e00049
Gripon, et al., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 15655-60
Marozin, et al., 2008, Mol Ther, 16: 1789-97, Keskinen, et al., 1999, Virology, 263: 364-75
Dandri, et al., 2014, J Immunol Methods
Dandri, et al., 2001, Hepatology, 33: 981-8
Azuma, et al., 2007, Nat Biotechnol, 25: 903-10
Qi, et al., 2014, J Virol, 88: 8045-56
本発明は、組換えHBV cccDNA、および組換えHBV cccDNAを作製する方法を提供する。組換えHBV cccDNAは種々のヌクレオチド配列、たとえばいずれかの遺伝子型のHBVゲノム、またはそのフラグメントもしくはバリアントを含むことができる。さらに、この方法を用いて大量の組換えHBV cccDNAを作製することも本発明の目的のひとつである。
本発明の組換えHBV cccDNAを培養細胞にトランスフェクトすると、それは天然HBV cccDNAと同じ挙動をし、それはエピソーム形態で細胞核内に存在してHBV複製を支持することができる。この細胞培養モデルを用いると、侵入およびcccDNA形成などの制約工程を迂回して、簡単なトランスフェクションプロセスによりHBV cccDNAをあらゆる初代細胞および細胞系に簡便に導入することができる。
本発明の組換えHBV cccDNAをマウスに送達し、インジェクトされたマウスの肝実質細胞にトランスフェクトすると、それは天然HBV cccDNAと同じ挙動をし、それはエピソーム形態でマウスの肝実質細胞に少なくとも30日間、特に肝実質細胞に少なくとも37日間、44日間または51日間、存在することができ、ウイルス抗原、複製中間体、および成熟ビリオンの産生のためのHBV転写鋳型として使うことができ、インジェクトされたマウスの血流中にそれらが放出される。本発明の組換えHBV cccDNAは、慢性肝炎のメカニズムの評価および解明ならびに抗ウイルス薬を見出す研究のために使用できる。
さらに、本発明はまた、そのcccDNAを含む組成物、およびそのcccDNAを含むキットに関するものであり、それはcccDNAベースのインビトロまたはインビボHBVモデルを樹立するために有用である。
他の態様において、本発明はまた、cccDNAベースのインビトロまたはインビボHBVモデルを樹立するための、下記を含む方法に関する:
(i)ミニサークル技術を用いて組換えHBV cccDNAを作製し;そして
(ii)その組換えHBV cccDNAを、細胞系もしくは初代細胞、または動物、特にマウスに送達する。
(i)ミニサークル技術を用いて組換えHBV cccDNAを作製し;そして
(ii)その組換えHBV cccDNAを、細胞系もしくは初代細胞、または動物、特にマウスに送達する。
他の態様において、本発明はまた、cccDNAベースのインビトロまたはインビボHBVモデルを樹立するための、あるいはcccDNAベースのインビトロまたはインビボHBVモデルを樹立する方法に使用するキットまたは組成物の調製のための、本発明の組換えHBV cccDNAの使用に関する。
さらなる態様において、本発明はまた、本発明の組換えHBV cccDNAによる、抗HBV薬の評価またはB型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬の評価に関する。
さらなる態様において、本発明はまた、抗HBV薬の評価またはB型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬の評価のための方法に関する。
さらなる態様において、本発明はまた、抗HBV薬の評価またはB型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬の評価のための方法に関する。
具体的には、本発明は下記の項目に関する:
1. HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む、組換えHBV cccDNA。
1. HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む、組換えHBV cccDNA。
2. サイト−ハイブリッドインサートがattR部位である、項目1に記載の組換えHBV cccDNA。
3. attR部位が、preS1遺伝子の開始コドンの直前に、ポリメラーゼ遺伝子の末端タンパク質ドメインとスペーサーの間に位置する、項目1または2に記載の組換えHBV cccDNA。
3. attR部位が、preS1遺伝子の開始コドンの直前に、ポリメラーゼ遺伝子の末端タンパク質ドメインとスペーサーの間に位置する、項目1または2に記載の組換えHBV cccDNA。
4. attR部位が、SEQ ID NO:3の2847位と2848位の間に位置する、項目1〜3のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
5. HBVゲノムが完全長ゲノム(full length genome)、特に遺伝子型Bまたは遺伝子型Dのゲノム、より特別にはGeneBank JN664917.1、X02496、AY217370、AY220698、GQ205440またはHPBHBVAAに特定されたゲノム、最も特別にはSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:22またはSEQ ID NO:23により表わされるゲノムであり;あるいは遺伝子型Dの過剰長ゲノム(over length genome)、たとえば1.1単位または1.3単位のゲノム(たとえば、SEQ ID NO:9により表わされる1.3単位ゲノム)である、項目1〜4のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
5. HBVゲノムが完全長ゲノム(full length genome)、特に遺伝子型Bまたは遺伝子型Dのゲノム、より特別にはGeneBank JN664917.1、X02496、AY217370、AY220698、GQ205440またはHPBHBVAAに特定されたゲノム、最も特別にはSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:22またはSEQ ID NO:23により表わされるゲノムであり;あるいは遺伝子型Dの過剰長ゲノム(over length genome)、たとえば1.1単位または1.3単位のゲノム(たとえば、SEQ ID NO:9により表わされる1.3単位ゲノム)である、項目1〜4のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
6. 組換えHBV cccDNA中のHBVゲノムのフラグメントが、HBVのエンベロープタンパク質、コア/プレコアタンパク質、xタンパク質および/またはポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子を複製または発現することができる、項目1〜5のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
7. その配列がSEQ ID NO:2に挙げたものである、項目1に記載の組換えHBV cccDNA。
8. 細胞系または初代細胞にトランスフェクトするための、項目1〜6のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
8. 細胞系または初代細胞にトランスフェクトするための、項目1〜6のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
9. 細胞系が肝細胞に由来する細胞系、特に肝実質細胞に由来するもの、より特別にはHepG2またはHepaRGであり、あるいは初代細胞が初代肝細胞、特に初代肝実質細胞である、項目8に記載の組換えHBV cccDNA。
10. 抗HBV薬の評価のための、項目1〜9のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
11. 抗HBV薬がETV、HAP 12、HAP 2、PegasysまたはR848である、項目9に記載の組換えHBV cccDNA。
11. 抗HBV薬がETV、HAP 12、HAP 2、PegasysまたはR848である、項目9に記載の組換えHBV cccDNA。
12. 組換えHBV cccDNAを動物に送達することを含む、cccDNAベースのHBV動物モデルを樹立する方法に使用するための、項目1〜11のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
13. 樹立した動物モデルが、肝実質細胞において少なくとも30日間、特に肝実質細胞において少なくとも37日間、42日間、44日間、49日間、51日間、56日間、70日間、104日間、120日間または134日間、HBV抗原を発現する、項目1〜12のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
14. 動物が、機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである、項目1〜13のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
15. 動物がマウスである、特にマウスがC3H/HeNまたはCBA/Jマウスである、項目1〜14のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
15. 動物がマウスである、特にマウスがC3H/HeNまたはCBA/Jマウスである、項目1〜14のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
16. 組換えHBV cccDNAを動物にハイドロダイナミックインジェクションにより送達する、項目1〜15のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
17. 項目1〜16のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを含む組成物またはキット。
17. 項目1〜16のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを含む組成物またはキット。
18. 項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを製造するための、下記の工程を含む方法:
a) HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを、ミニサークルDNA製造用の親ベクターの組換え基質部位に挿入し、それらによりフランキングして、親HBVサークル構築体を形成し;
b)その親HBVサークル構築体をミニサークル産生体内へトランスフォームして、部位特異的組換えにより組換えHBV cccDNAを産生させる。
a) HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを、ミニサークルDNA製造用の親ベクターの組換え基質部位に挿入し、それらによりフランキングして、親HBVサークル構築体を形成し;
b)その親HBVサークル構築体をミニサークル産生体内へトランスフォームして、部位特異的組換えにより組換えHBV cccDNAを産生させる。
19. ミニサークル産生体が微生物、好ましくは細菌、より特別にはエシェリキア属菌種(Escherichia sp.)、最も特別には大腸菌(E.coli)である、項目18に記載の方法。
20. 大腸菌が株ZYCY10P3S2Tである、項目19に記載の方法。
20. 大腸菌が株ZYCY10P3S2Tである、項目19に記載の方法。
21. ミニサークルDNA製造用の親ベクターが、組換え基質部位、特にリコンビナーゼに対して特異的な、より特別にはインテグラーゼ、たとえばφC31、R4、TP901−1、φBT1、Bxb1、RV−1、AA118、U153、φFC1のインテグラーゼに対して特異的な、組換え基質部位を含む、項目18〜20のいずれか1項に記載の方法。
22. 組換え基質部位がattPおよびattBである、項目18〜21のいずれか1項に記載の方法。
23. ミニサークルDNA製造用の親ベクターがpMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターである、項目18〜22のいずれか1項に記載の方法。
23. ミニサークルDNA製造用の親ベクターがpMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターである、項目18〜22のいずれか1項に記載の方法。
24. 親HBVサークル構築体のDNA配列がSEQ ID NO:1に挙げたものである、項目18〜23のいずれか1項に記載の方法。
25. HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントが組換え基質部位間に位置する、項目18〜24のいずれか1項に記載の方法。
25. HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントが組換え基質部位間に位置する、項目18〜24のいずれか1項に記載の方法。
26. 項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを含み、所望によりさらに生体適合性かつ非免疫原性の溶液、たとえばリン酸緩衝液、生理食塩水を含むことができる、組成物またはキット。
27. 細胞系または初代細胞にトランスフェクトするための、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAまたは項目26に記載の組成物もしくはキットの使用。
28. 細胞系または初代細胞にトランスフェクトするための、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAまたは項目26に記載の組成物もしくはキット。
29. 細胞系または初代細胞にトランスフェクトするために使用するキットまたは組成物の調製における、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAの使用。
30. 組換えHBV cccDNAを細胞系または初代細胞に送達する工程、特にトランスフェクトする工程を含む、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAまたは項目26に記載の組成物もしくはキットを使用してHBVの抗原およびDNAをインビトロで発現させるための方法。
31. cccDNAベースのインビトロHBVモデルを樹立するための、下記を含む方法:
(i)項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを作製するか、あるいは項目18〜25のいずれか1項に記載の方法に従って組換えHBV cccDNAを製造し;
(ii)その組換えHBV cccDNAを細胞系または初代細胞に送達する。
(i)項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを作製するか、あるいは項目18〜25のいずれか1項に記載の方法に従って組換えHBV cccDNAを製造し;
(ii)その組換えHBV cccDNAを細胞系または初代細胞に送達する。
32. 細胞系が肝細胞に由来する細胞系、特に肝実質細胞に由来するもの、より特別にはHepG2またはHepaRGであり、あるいは初代細胞が初代肝細胞、特に初代肝実質細胞である、項目27もしくは29に記載の使用、または項目28に記載の組換えHBV cccDNA、または項目30もしくは31に記載の方法。
33. B型肝炎ウイルス感染症の処置のための医薬の評価における、または抗HBV薬の評価における、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAまたは項目26に記載の組成物もしくはキットの使用。
34. B型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬の評価のための、または抗HBV薬の評価のための、組成物またはキットの調製における、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAの使用。
35. B型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬の評価または抗HBV薬の評価に使用するための、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAまたは項目26に記載の組成物もしくはキット。
36. 医薬または薬物がヌクレオシドアナログ、HBVカプシド阻害薬、インターフェロンまたはTLR7/8アゴニスト、たとえば、ETV、HAP 12、HAP 2、PegasysまたはR848を含む(ただし、これらに限定されない)、項目33もしくは34に記載の使用、または項目26に記載の組換えHBV cccDNAもしくは組成物もしくはキット。
37. 組換えHBV cccDNAを動物に送達することを含むcccDNAベースのHBV動物モデルを樹立する方法に使用するための、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAまたは項目26に記載の組成物もしくはキット。
38. 組換えHBV cccDNAを動物に送達する工程を含む、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAまたは項目26に記載の組成物もしくはキットを用いてHBVの抗原およびDNAをインビボで発現させるための方法。
39. cccDNAベースのHBVモデルを樹立するための、下記を含む方法:
(i)項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを作製するか、あるいは項目18〜25のいずれか1項に記載の方法に従って組換えHBV cccDNAを製造し;
(ii)その組換えHBV cccDNAを動物に送達する。
(i)項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを作製するか、あるいは項目18〜25のいずれか1項に記載の方法に従って組換えHBV cccDNAを製造し;
(ii)その組換えHBV cccDNAを動物に送達する。
40. 組換えHBV cccDNAを動物に送達することを含むcccDNAベースのHBV動物モデルを樹立する方法に使用するキットまたは組成物の調製における、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAの使用。
41. 組換えHBV cccDNAを動物に送達することを含むcccDNAベースのHBV動物モデルを樹立する方法のための、項目1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAまたは項目26に記載の組成物もしくはキットの使用。
42. 樹立した動物モデルが、肝実質細胞において少なくとも30日間、特に肝実質細胞において少なくとも37日間、42日間、44日間、49日間、51日間、56日間、70日間、104日間、120日間または134日間、HBV抗原を発現する、組換えHBV cccDNA、または項目26に記載の組成物もしくはキット、または項目38もしくは39に記載の方法、または項目40もしくは41もしくは42に記載の使用。
43. 動物が、機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである、組換えHBV cccDNA、または項目26もしくは42に記載の組成物もしくはキット、または項目38もしくは39もしくは42に記載の方法、または項目40もしくは41もしくは42に記載の使用。
44. 動物がマウスである、特にマウスがC3H/HeNまたはCBA/Jマウスである、組換えHBV cccDNA、または項目26もしくは42もしくは43に記載の組成物もしくはキット、または項目38もしくは39もしくは42もしくは43に記載の方法、または項目40〜43のいずれか1項に記載の使用。
45. 組換えHBV cccDNAを動物にハイドロダイナミックインジェクションにより送達する、組換えHBV cccDNA、または項目26もしくは42もしくは43もしくは44に記載の組成物もしくはキット、または項目38もしくは39もしくは42もしくは43もしくは44に記載の方法、または項目40〜44のいずれか1項に記載の使用。
本発明を下記の態様の説明および例においてさらに説明する。ただし、下記のものが本発明の範囲を限定するとみなすべきではなく、本発明の精神および特許請求の範囲内にある改変を行なうのは当業者には容易であろうと思われる。
定義
別に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載するものと類似の方法および材料は本質的にいずれも本発明の実施または試験に使用できるが、代表的な方法および材料のみを記載する。本発明の目的について、下記の用語を以下に定義する。
別に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載するものと類似の方法および材料は本質的にいずれも本発明の実施または試験に使用できるが、代表的な方法および材料のみを記載する。本発明の目的について、下記の用語を以下に定義する。
本明細書中で用いる“B型肝炎ウイルス”または“HBV”は、おおよそ3,200塩基対の小分子二本鎖DNAゲノムおよび肝臓の細胞に対する指向性をもつヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)のメンバーを表わす。“HBV”には、いずれかの多様な哺乳動物(たとえば、ヒト、非ヒト霊長類など)および鳥類(アヒルなど)宿主に感染するB型肝炎ウイルスが含まれる。“HBV”には、いずれか既知のHBV遺伝子型、たとえば血清型A、B、C、D、E、F、およびG;いずれかのHBV血清型またはHBVサブタイプ;いずれかのHBV分離株;HBVバリアント、たとえばHBeAg陰性バリアント、薬物耐性HBVバリアント(たとえば、ラミブジン(lamivudine)耐性バリアント;アデホビル(adefovir)耐性変異体;テノホビル(tenofovir)耐性変異体;エンテカビル(entecavir)耐性変異体;など)などが含まれる。
本明細書中で用いる“HBVゲノム”は、完全長ゲノム(1単位ゲノム)だけでなく、完全長を超えるHBVゲノム(>1単位ゲノム、言い換えると、過剰長HBVゲノム)をも表わす。HBVゲノムはHBV複製を構築および維持するのに必要なすべての情報を含む。そのようなゲノム配列は、それぞれの遺伝子型について文献およびGeneBankにおいて入手できる。“完全長を超えるHBVゲノム”は、完全長ゲノム−プラス−そのゲノムの一部を含む配列を表わす。“完全長を超えるHBVゲノム”の配列は、希望するゲノム単位および個々のHBV株に基づいて異なる。さらに、完全長を超えるHBVゲノムを得る方法およびそのゲノムの配列を決定する方法は、先行技術文献、たとえばEuropean Patent EP1543168に記載されている。
本明細書中で用いる“HBVゲノムのフラグメント”または“HBVゲノムフラグメント”は互換性をもって使用でき、HBVゲノムの一部を表わす。そのフラグメントは、HBVゲノムの少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100または3200個の連続ヌクレオチドであってもよい。フラグメントはHBVゲノムに含まれる1以上の遺伝子を含む部分ゲノムであってもよい;たとえば、フラグメントはHBVのエンベロープタンパク質、コア/プレコアタンパク質、xタンパク質および/またはポリメラーゼタンパク質をコードする核酸であってもよい。さらに、フラグメントはHBVのエンベロープタンパク質、コア/プレコアタンパク質、xタンパク質および/またはポリメラーゼタンパク質の1以上の部分をコードする核酸であってもよい。
HBVゲノムの位置について述べる際に本明細書中で用いるヌクレオチドのナンバリングは、H. Norder et al. (Virology 1994, 198, 489-503 , 本明細書に援用する;この報文の図1は、遺伝子型C、EおよびFを表わす種々のHBVクローンのゲノムと3221ヌクレオチド長さのクローンpHBV−3200の配列とのアラインメントを提示している)に公開された全HBVゲノムDNA配列、またはGeneBankにアクセス番号JN664917.1で公開された遺伝子型D HBVのもの(本明細書に援用する)を参照している。種々のHBVのゲノムの長さは変更できる。すなわち、ヌクレオチドのナンバリングは例示態様にすぎないとみなすべきである。
本明細書中で用いる用語 “バリアント”または“変異体”は、互換性をもって使用でき、親ポリペプチド配列または親ポリヌクレオチドに対してある程度のアミノ酸/ヌクレオチド配列同一性をもつポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して用いられる。バリアントは親配列に類似するが、それらのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列中にそれらを親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドと異なる配列にする少なくとも1カ所または数カ所またはそれ以上の置換、欠失または挿入をもつ。場合により、バリアントはそれらのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列においてそれらを親と異なる配列にする少なくとも1カ所の置換、欠失または挿入を含むように操作および/または工学処理されている。さらに、バリアントは親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドの機能特性または活性を保持することができる;たとえば、親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドの生物活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%の生物活性を維持する。
本明細書中で用いる用語 “核酸構築体”は、自然界で一緒にみられることのない1以上の機能単位を含むように構築された核酸配列を表わす。例には、非天然核酸配列を含む
環状、線状、二本鎖状の、染色体外DNA分子(プラスミド)、コスミド(ラムダファージ由来のCOS配列を含むプラスミド)、ウイルスゲノムなどが含まれる。
環状、線状、二本鎖状の、染色体外DNA分子(プラスミド)、コスミド(ラムダファージ由来のCOS配列を含むプラスミド)、ウイルスゲノムなどが含まれる。
本明細書中で用いる用語“ベクター”は、核酸配列をターゲット細胞へ伝達できるビヒクルを表わす。たとえば、ベクターはターゲット細胞において発現できるコード配列を含むことができる。本発明の目的について、“ベクター構築体”は一般に、目的とする遺伝子の発現を指向させることができ、目的遺伝子をターゲット細胞に伝達するのに有用である、いずれかの核酸構築体を表わす。よって、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒクルならびに組込みベクター(integrating vector)を含む。
本明細書中で互換性をもって用いられる“ミニサークルベクター”または“ミニサークルDNA製造用の親ベクター”は、ベクターに導入すべき目的配列、すなわちポリペプチド、shRNA、アンチセンスRNA、siRNAなどをコードすることができる目的配列を、少なくとも実質的に発現カセット配列および方向に関係なく持続的に高レベル発現する小型の二本鎖環状DNA分子を表わす。目的配列は、ミニサークルベクター上に存在する調節配列、すなわち目的配列の発現を制御する調節配列に、作動可能な状態で連結している。そのようなミニサークルベクターは、たとえば公開されたU.S. Patent Application US20040214329に記載されており、それを具体的に本明細書に援用する。
対象となるミニサークルベクターの全長は後記の目的エレメントを収容するのに十分であり、ただし、たとえばターゲット細胞を含む宿主に対する全身投与により細胞と接触した際に、ベクターがその細胞に進入する能力を阻止するかまたは許容できないレベルにまで実質的に阻害するほど長くはない。よって、ミニサークルベクターは一般に少なくとも約0.3kbの長さ、しばしば少なくとも約1.0kbの長さであり、その際、ベクターは10kb以上の長さであってもよいが、ある態様においてはこの長さを超えない。
ミニサークルベクターは、複製起点を欠如し、かつ細菌プラスミドに一般的にみられる薬物選択マーカー、たとえばβ−ラクタマーゼ、tetなどを欠如するという点で、細菌プラスミドベクターと異なる。たとえばプラスミドバックボーン中に、たとえばそれからミニサークルベクターを切り取った親プラスミドバックボーン核酸配列中に、発現サイレンシング配列も存在しない。ミニサークルは、リコンビナーゼハイブリッド生成物配列および目的配列、すなわち転写配列、および発現のために必要な調節配列以外のベクター配列を実質的に含まなくてもよい。
ミニサークルベクターは、一方向部位特異的リコンビナーゼのサイト−ハイブリッド配列(site-hybrid sequence)(プロダクト−ハイブリッド配列(product hybrid sequence)としても知られる)を含む。本明細書中で用いる“サイト−ハイブリッド配列”または“サイト−ハイブリッドインサート”または“プロダクト−ハイブリッド配列”は互換性をもって使用でき、当技術分野で既知の2つの組換え基質部位、たとえばattBおよびattP基質配列の一方向部位特異的リコンビナーゼ仲介による組換えの結果であり(Smith et al., Nucleic Acid Research, 2004, 33:8:2607-2617)、attRまたはattLサイト−ハイブリッド配列のいずれかであってもよい。“サイト−ハイブリッド配列”は、用いるリコンビナーゼに従って当業者が決定できる。一般に、サイト−ハイブリッド配列は約10bpから約30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bpおよび500bpまでの長さの範囲である。本明細書中で用いる“リコンビナーゼ”は遺伝子組換え酵素であり、それは通常は細菌および真菌に由来し、各リコンビナーゼに特異的な短い(30〜40ヌクレオチド)ターゲット部位配列間の方向感受性(directionally sensitive)DNA交換反応を触媒する。リコンビナーゼの例にはインテグラーゼ、たとえば野生型ファージインテグラーゼまたはその変異体が含まれるが、これらに限定されず、着目される具体的な代表的インテグラーゼにはφC31、R4、TP901−1、φBT1、Bxb1、RV−1、AA118、U153、φFC1などのインテグラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で用いる用語“組換え”DNA分子は、複数の供給源に由来する遺伝子材料を一緒にして他の場合には生物中にみられない配列を作製するための実験室的な遺伝子組換え法(たとえば、分子クローニング)により形成されるDNA分子を表わす。組換えDNAが可能なのは、あらゆる生物に由来するDNA分子が同じ化学構造を共有するからである。それらは同一の全般的構造内のヌクレオチド配列のみが異なる。
本明細書中で用いる用語“部位特異的組換え”は、それぞれが少なくとも1つの認識部位を含む2つのヌクレオチド配列間の組換えを表わす。“部位特異的”は、特定のヌクレオチド配列におけるということを意味し、それは宿主細胞のゲノム内の特定位置であってもよい。そのヌクレオチド配列は、宿主ゲノム中のそれの自然位置またはゲノム中の他のある位置で宿主細胞に内在してもよく、あるいはそれは多様な既知方法のいずれかにより予め宿主細胞のゲノム内へ挿入されたヘテロロガスヌクレオチド配列であってもよい。
本明細書中で用いる“ミニサークル産生体”は、ミニサークルDNA製造用の親ベクターを増幅でき、かつリコンビナーゼの発現に際してミニサークルDNAを産生できる微生物を表わす。先行技術において既知のミニサークル産生体には、細菌、たとえばエシェリキア属菌種、たとえば大腸菌が含まれる。当技術分野におけるミニサークル産生体の具体例のひとつは、株ZYCY10P3S2Tである。
本明細書中で用いる“HBVサークル”または“組換えHBV cccDNA”は、HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含むミニサークルベクターを表わす。
組換えHBV cccDNAを細胞内へ送達する方法は当技術分野で既知である。たとえば、組換えcccDNAをトランスフェクションにより細胞内へ送達することができる。細胞にトランスフェクトする方法は当技術分野で周知である。“トランスフェクトした”とは、細胞において外来核酸、通常はDNAの取込みから生じる変化を意味する。用語“トランスフェクション”の使用は外来核酸の導入をいずれか特定の方法に限定することを意図したものではない。適切な方法には、ウイルス感染/トランスダクション、コンジュゲーション、ナノ粒子送達、エレクトロポレーション、パーティクルガン(particle gun)法、リン酸カルシウム沈殿、直接注入などが含まれる。方法の選択は一般に、トランスフェクトされる細胞のタイプおよびトランスフェクションが行なわれる状況(すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)に依存する。これらの方法の全般的考察は、Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995中にある。
組換えHBV cccDNAを動物内へ送達する方法は当技術分野で既知である。“送達する”とは、肝臓のプラスミド送達およびトランスフェクションの技術分野で周知であるいずれかの方法を意味するが、本発明の範囲を限定すると考えるべきではない。たとえば、既知の技術のひとつとしてハイドロダイナミックインジェクション(Zhang et al.により開発:Hum Gene Ther 1999,10 (10): 1735-1737)をプラスミド送達に使用できる。
本明細書中で用いる“HBVマーカー”は、HBVウイルス感染を表示できるいずれかのマーカーを表わす。当技術分野で一般に用いられる既知のHBVマーカーには“HBVのDNA”、または“HBVのタンパク質”、たとえばHBsAgおよびHBeAgなどが含まれるが、これらに限定されない。HBVマーカーのレベルを判定する方法は、たとえば、HBVタンパク質のレベルについてのELISA、またはHBV DNAのレベルについてのqRT−PCR分析のように、当技術分野で既知である。
発明の詳細な説明
本発明は、HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む組換えHBV cccDNA、ならびにその組換えHBV cccDNAを製造する方法を提供する。そのような組換えHBV cccDNAは、部位特異的組換え後のサイト−ハイブリッドインサート、およびHBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含む。特に、HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントはサイト−ハイブリッドインサートによりフランキングされている。
本発明は、HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む組換えHBV cccDNA、ならびにその組換えHBV cccDNAを製造する方法を提供する。そのような組換えHBV cccDNAは、部位特異的組換え後のサイト−ハイブリッドインサート、およびHBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含む。特に、HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントはサイト−ハイブリッドインサートによりフランキングされている。
1態様において、HBVゲノムはいずれかの遺伝子型の完全長ゲノム、またはいずれかの遺伝子型の過剰長ゲノムである。好ましい態様において、ゲノムの遺伝子型はDである。より好ましい態様において、遺伝子型Dの完全長ゲノムはGeneBank JN664917.1、X02496、AY217370、またはHPBHBVAAに明記されている。さらなる態様において、過剰長ゲノムは1.1単位ゲノムまたは1.3単位ゲノムである。特定の態様において、本発明に使用するHBVゲノムはSEQ ID NO:3(GeneBank JN664917.1)により表わされる配列をもつか、あるいはその配列からなる。
1態様において、HBVゲノムのフラグメントはHBVゲノムの一部である。好ましい態様において、フラグメントはいずれかの遺伝子型のHBVゲノム、特に遺伝子型DのHBVゲノム(たとえば、GeneBank JN664917.1、X02496、AY217370、またはHPBHBVAAに明記されるもの)、より特別にはSEQ ID NO:3により表わされる遺伝子型DのHBVゲノムのフラグメントである。特に、HBVゲノムのフラグメントは、HBVのエンベロープタンパク質、コア/プレコアタンパク質、xタンパク質および/またはポリメラーゼタンパク質をコードする1以上の遺伝子を複製または発現することができる。
1態様において、HBVゲノムのバリアントは、ヌクレオチド配列中にその親HBVゲノムまたはフラグメントと比較して少なくとも1カ所または数カ所の置換、欠失もしくは挿入をもつバリアントであってもよい。たとえば、本発明のHBVゲノムのバリアントは、HBVコアタンパク質をコードする遺伝子上にそのバリアントが複製できないかまたはそのタンパク質を発現できないものにする1カ所または数カ所の変異をもつものであってもよい;すなわち、HBVゲノムのバリアントは、HBVコアタンパク質(HBc)をコードする遺伝子を含まないHBVゲノムであってもよい。たとえば、変異はHBcのコード配列の開始コドン上にあってもよい。1態様において、HBVゲノムのバリアントはSEQ ID NO:14により表わすことができる。
さらなる態様において、“サイト−ハイブリッドインサート”は、組換え基質、たとえばattPおよびattB部位を収容したいずれか市販のミニサークルDNA製造用の親ベクターから作製できる。ある態様において、組換え基質はリコンビナーゼ、特にインテグラーゼ、たとえば野生型ファージインテグラーゼまたはその変異体(φC31、R4、TP901−1、φBT1、Bxb1、RV−1、AA118、U153、φFC1などのインテグラーゼが含まれるが、これらに限定されない)に対して特異的である。特に、“サイト−ハイブリッドインサート”はattR部位である。最も特別には、attR部位はSEQ ID NO:4により表わされる。さらなる態様において、組換えHBV cccDNAにおけるattR部位はpreS1遺伝子の開始コドンの直前に、ポリメラーゼ遺伝子の末端タンパク質ドメインとスペーサーの間に位置し、特にattR部位はSEQ ID NO:3の2847位と2848位の間に位置する。
さらなる態様において、本発明の組換えHBV cccDNAを製造する方法は下記を含む:
a) HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントをミニサークルDNA製造用の親ベクターの組換え基質部位に挿入し、それらによりフランキングして、親HBVサークル構築体を形成し;
b)その親HBVサークル構築体をミニサークル産生体内へトランスフォームして、部位特異的組換えにより組換えHBV cccDNAを産生させる。
a) HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントをミニサークルDNA製造用の親ベクターの組換え基質部位に挿入し、それらによりフランキングして、親HBVサークル構築体を形成し;
b)その親HBVサークル構築体をミニサークル産生体内へトランスフォームして、部位特異的組換えにより組換えHBV cccDNAを産生させる。
1態様において、ミニサークル産生体は、ミニサークルDNA製造用の親ベクターを増幅できかつリコンビナーゼが発現した際にミニサークルDNAを産生できる微生物であってもよい。特に、微生物は細菌、より特別にはエシェリキア属菌種、最も特別には大腸菌、たとえば株ZYCY10P3S2Tである。1態様において、ミニサークル産生体はリコンビナーゼを内在発現できる微生物である。あるいは、ミニサークル産生体は、リコンビナーゼまたはそのリコンビナーゼをコードする遺伝子が導入されてそこで発現している微生物であってもよい。
1態様において、本発明のミニサークルDNA製造用の親ベクターは当技術分野で既知のいずれか、たとえばSystem Biosciences Inc.から販売されているベクターであってもよい。特に、本発明に用いるミニサークルDNA製造用の親ベクターは、組換え基質、たとえばリコンビナーゼ、特にインテグラーゼ、たとえば野生型ファージインテグラーゼまたはその変異体(φC31、R4、TP901−1、φBT1、Bxb1、RV−1、AA118、U153、φFC1などのインテグラーゼが含まれるが、これらに限定されない)に対して特異的な組換え基質を含む。より特別には、本発明に用いるミニサークルDNA製造用の親ベクターはpMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターであり、それはSystem Biosciencesから購入できる(カタログ番号MN501A1)。
さらなる態様において、親HBVサークル構築体においてHBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントは組換え基質部位の間に位置する。ミニサークル産生体(たとえば、大腸菌)における部位特異的組換えの後、得られた組換えHBV cccDNA中のHBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントは、依然としてそれの複製または発現する能力を保持している。特に、組換え基質部位は特にattPまたはattBから選択されるリコンビナーゼまたはインテグラーゼ結合部位であり、より特別には、本発明に用いるattPはSEQ ID NO:5により表わされ、および/または本発明に用いるattBはSEQ ID NO:6により表わされる。
最も好ましい態様において、前記のHBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントは、pMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターのattPおよびattB部位に挿入され、それらによりフランキングされて、そのプラスミドに既に存在していたCMV−MCS−SV40polyAフラグメントを置換する。こうして構築された組換えプラスミドは親HBVサークルと表示され、そのDNA配列をSEQ ID NO:1として挙げる。
前記の親HBVサークルを用いて組換えHBV cccDNAを作製するためには、組換え親構築体を次いでミニサークル産生体である大腸菌株ZYCY10P3S2T(System bioscience Incから販売,カタログ番号MN900A−1)内へトランスフォームする。アラビノースの添加によりφC31インテグラーゼおよびI−SceIホーミングエンドヌクレアーゼが発現すると、φC31インテグラーゼはattBおよびattP部位間の組換えを触媒して、小さなattR部位を保有するHBVサークルおよびプラスミドバックボーンサークルを産生する。I−SceIホーミングエンドヌクレアーゼは、I−SceI認識部位を消化することにより、組換えられなかった親DNAおよびプラスミドバックボーンサークルの破壊を開始する。組換えHBV cccDNAを次いでミニサークル産生体である大腸菌から抽出する。こうして作製された組換えHBV cccDNAをHBVサークルと表示し、そのDNA配列をSEQ ID NO:2として挙げる。
1態様において、本発明は、本発明の組換えHBV cccDNAを細胞系(たとえば、肝細胞に由来する細胞系、特に肝実質細胞に由来するもの、より特別にはHepG2またはHepaRG)または初代細胞(たとえば、初代肝細胞、特に初代肝実質細胞)に送達することを含む、HBV抗原をインビトロで発現させるための方法、またはcccDNAベースのインビトロHBVモデルを樹立するための方法に関する。
前記で製造した組換えHBV cccDNAを用いてHBV抗原をインビトロで発現させるために、当技術分野で既知のいずれかの手段を用いて組換えHBV cccDNAを培養細胞内へ送達し、結果的に培養細胞にその組換えHBV cccDNAを導入する(たとえば、トランスフェクトする)ことができる。したがって、侵入およびcccDNA形成などの制約工程を迂回して、簡単なトランスフェクションプロセスによりHBV cccDNAをあらゆる初代細胞および細胞系に簡便に導入することができる。樹立した細胞培養モデルをcccDNA研究、および抗HBV薬、たとえばETV、HAP 12、PegasysまたはR848の評価に使用できる。
1態様において、本発明はまた、本発明の組換えHBV cccDNAを動物に送達することを含む、HBV抗原および/またはDNAをインビボで発現させる方法、あるいはcccDNAベースのHBV動物モデルを樹立するための方法に関する。
1態様において、cccDNAベースのHBV動物モデルを樹立する方法は、組換えHBV cccDNAを動物に送達してその動物の肝実質細胞にトランスフェクトする工程を含む。
前記の組換えHBV cccDNAを用いてHBV抗原をインビボで持続的に発現させるために、当技術分野で既知のいずれかの手段を用いて組換えHBV cccDNAを動物(たとえば、マウス)に送達することができ、結果的に、インジェクトされた動物(たとえば、マウス)の肝実質細胞にその組換えHBV cccDNAがトランスフェクトされる。
1態様において、動物は哺乳動物または鳥類、たとえばマウスであってもよく、特にマウスはC3H/HeNマウスである。より特別には、本発明に用いるマウスは機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである。
組換えHBV cccDNAの送達方法に関して、プラスミド送達および肝臓の細胞のトランスフェクションの技術分野で周知のいずれかの方法を本発明に適用できるが、その方法が本発明の範囲を限定するとみなすべきではない。本発明において、たとえばハイドロダイナミックインジェクションなど既知の手段がプラスミド送達のための方法のひとつであってもよい。より具体的には、本発明の例において、組換えプラスミドによるマウスの肝臓の細胞のトランスフェクションは、組換えプラスミドをマウスの尾静脈内へハイドロダイナミックインジェクションすることにより達成される。組換えプラスミドをマウスの尾静脈内へ容易にインジェクトできるようにするために、前記のプラスミドを生体適合性かつ非免疫原性の溶液、たとえばリン酸緩衝液中に調製するが、それが本発明の範囲を限定するとみなすべきではない。
さらなる態様において、本発明の組換えHBV cccDNAをマウスに送達し、インジェクトされたマウスの肝実質細胞にトランスフェクトすると、それは天然HBV cccDNAと同じ挙動をし、それはエピソーム形態でマウスの肝実質細胞中に少なくとも30日間、肝実質細胞中に特に少なくとも37日間、44日間または51日間、存在することができ、それはウイルス抗原、複製中間体、および成熟ビリオンの産生のためのHBV転写鋳型として使うことができ、それらはインジェクトされたマウスの血流中に放出される。さらなる態様において、HBV抗原の発現は、マウスの肝実質細胞中で少なくとも30日間、肝実質細胞中で特に少なくとも37日間、44日間または51日間、持続する。この組換え形HBV cccDNAと自然感染HBVのcccDNAの特性はきわめて類似するので、したがって本発明の組換えHBV cccDNAは(慢性)肝炎のメカニズムの評価および解明、ならびに抗ウイルス薬を見出す研究に使用できる。特に、本発明の動物モデルは、B型肝炎ウイルス感染症の処置のための医薬、特にETV、HAP 2およびR848の評価に際して有用である。
さらなる態様において、本発明の動物(たとえば、マウス)モデルは、機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである動物に基づくものであり、よって誘導された肝臓の組織学的および血清学的状態は健康なHBVキャリアのものと類似する。したがって、本発明の動物モデルは慢性肝炎機構の肝炎メカニズム研究および薬物評価のための理想的なモデルである。
さらに、本発明はまた、本発明の組換えHBV cccDNAを含むキットまたは組成物に関する。さらなる態様において、本発明の組換えHBV cccDNAを含む組成物またはキットはさらに、生体適合性かつ非免疫原性の溶液、たとえばリン酸緩衝液を含有することができる。
さらに、本発明はまた、細胞培養培地における抗HBV薬のインビトロ評価のための、またはB型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬のインビトロ評価のための、下記を含む方法に関する:
(1)本発明の組換えHBV cccDNAを細胞(たとえば、細胞系(たとえば、肝細胞由来の細胞系、特に肝実質細胞由来のもの、より特別にはHepG2またはHepaRG)または初代細胞(たとえば、初代肝細胞、特に初代肝実質細胞))に送達し、
(2)評価すべき薬物または医薬で細胞を1〜30日間、特に2〜10日間処理し、
(3)細胞におけるHBVマーカーのレベルを検出し、そして
(4)その薬物または医薬で処理した細胞におけるHBVマーカーの低減は、その薬物が有効な抗HBV薬であること、またはその医薬がB型肝炎ウイルス感染症の処置に有効であることの指標となる。
(1)本発明の組換えHBV cccDNAを細胞(たとえば、細胞系(たとえば、肝細胞由来の細胞系、特に肝実質細胞由来のもの、より特別にはHepG2またはHepaRG)または初代細胞(たとえば、初代肝細胞、特に初代肝実質細胞))に送達し、
(2)評価すべき薬物または医薬で細胞を1〜30日間、特に2〜10日間処理し、
(3)細胞におけるHBVマーカーのレベルを検出し、そして
(4)その薬物または医薬で処理した細胞におけるHBVマーカーの低減は、その薬物が有効な抗HBV薬であること、またはその医薬がB型肝炎ウイルス感染症の処置に有効であることの指標となる。
さらに、本発明はまた、抗HBV薬のインビボ評価のための、またはB型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬のインビボ評価のための、下記を含む方法に関する:
(1)本発明の組換えHBV cccDNAを動物(たとえば、マウス、特にC3H/HeNマウス)に送達し、
(2)評価すべき薬物または医薬を動物に投与し、
(3)動物の血液(たとえば、血清)中のHBVマーカーのレベルを検出し、そして
(4)その薬物または医薬を投与された動物の血液中のHBVマーカーのレベルの低減は、その薬物が有効な抗HBV薬であること、またはその医薬がB型肝炎ウイルス感染症の処置に有効であることの指標となる。
(1)本発明の組換えHBV cccDNAを動物(たとえば、マウス、特にC3H/HeNマウス)に送達し、
(2)評価すべき薬物または医薬を動物に投与し、
(3)動物の血液(たとえば、血清)中のHBVマーカーのレベルを検出し、そして
(4)その薬物または医薬を投与された動物の血液中のHBVマーカーのレベルの低減は、その薬物が有効な抗HBV薬であること、またはその医薬がB型肝炎ウイルス感染症の処置に有効であることの指標となる。
1態様において、B型肝炎ウイルス感染症は慢性B型肝炎ウイルス感染症である。
本発明を実施および使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために以下の実施例を提示する。実施例はまた、本発明の純粋な例示のためのものであり、したがって決して本発明を限定するとみなすべきではなく、前記に考察した本発明の側面および態様を記載および詳述する。実施例は、以下の実験が実施したすべておよび唯一の実験であることを示すためのものではない。
材料および方法
組換えDNA技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989の記載に従い、標準法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬を製造業者の指示に従って用いた。
組換えDNA技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989の記載に従い、標準法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬を製造業者の指示に従って用いた。
遺伝子合成
目的とする遺伝子セグメントを、化学合成により作製したオリゴヌクレオチドから調製した。特異な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位によりフランキングされた100〜600bp長さの遺伝子セグメントを、PCR増幅を含めたオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションにより組み立て、続いてpCR2.1−TOPO−TAクローニングベクター(Invitrogen Corp.から,米国)内へA−オーバーハング(A-overhang)によりクローニングした。これらのサブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列をDNAシーケンシングにより確認した。
目的とする遺伝子セグメントを、化学合成により作製したオリゴヌクレオチドから調製した。特異な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位によりフランキングされた100〜600bp長さの遺伝子セグメントを、PCR増幅を含めたオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションにより組み立て、続いてpCR2.1−TOPO−TAクローニングベクター(Invitrogen Corp.から,米国)内へA−オーバーハング(A-overhang)によりクローニングした。これらのサブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列をDNAシーケンシングにより確認した。
細胞系
ヒトヘパトーマ由来の細胞系HepG2(ATCCから購入,ATCC(登録商標) HB−8065)を、10%のウシ胎仔血清(Invitrogenから)、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補足したDMEM/F12(Invitrogenから)中、37℃で5% CO2を含有する加湿空気下に培養した。増殖性HepaRG細胞をBiopredic International(フランス、レンヌ)から購入した。HepaRG細胞を製造業者のプロトコルに従って増幅および分化させた。
ヒトヘパトーマ由来の細胞系HepG2(ATCCから購入,ATCC(登録商標) HB−8065)を、10%のウシ胎仔血清(Invitrogenから)、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補足したDMEM/F12(Invitrogenから)中、37℃で5% CO2を含有する加湿空気下に培養した。増殖性HepaRG細胞をBiopredic International(フランス、レンヌ)から購入した。HepaRG細胞を製造業者のプロトコルに従って増幅および分化させた。
動物試験
この試験のすべての操作は地域の動物保護法および適切なガイドラインに従って行なわれた。
この試験のすべての操作は地域の動物保護法および適切なガイドラインに従って行なわれた。
C3H/HeNマウス(雄,4〜6週齢)をVital River Laboratories Co.Ltd(中国北京)から入手した。CBA/Jマウス(雄,4〜6週齢)をHFK Bioscience Co.,Ltd.(中国北京)から入手した。コーンコブ(トウモロコシ穂軸)(corncob)床敷を備えたポリカーボネートケージに、制御した温度(21〜25oC)、湿度(40〜70%)、および12時間明/12時間暗サイクル(7:00 AM〜7:00 PM 点灯)下で、マウスを収容した。マウスに普通食(Rodent Diet #5001,PMI Nutrition International,LLC,米国インディアナ州)および無菌水を任意摂取できる状態で供給した。
動物を−1日目の体重に基づいてグループ分けした。0日目に、すべての動物に体重(g)の8%に等しい体積(mL)の生理食塩水中における2.5〜20μgのDNAを、5秒以内に尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした(Liu, et al., 1999, Gene Ther, 6: 1258-66, Zhang, et al., 1999, Hum Gene Ther, 10: 1735-7)。ハイドロダイナミックインジェクションの技術的失敗または1日目もしくは3日目の低いHBVマーカー発現のため動物を除外した後、残りのマウスを長期評価用に維持した。HDIインジェクション後の指示した時点で、血清調製用の血液試料を採集した。
化合物処理のために、HDI後20日目(化合物処理の−3日目)に、20日目の血清HBsAgレベルおよび体重に基づいてC3H/HeNマウスを4グループに分けた。処理当日にETVおよびR848を原液から生理食塩水中に希釈した。ビヒクルはRC591であった。すべての被験化合物を指示した用量および頻度で経口投与した。
一過性トランスフェクション
X−TREMEGENE HP DNAトランスフェクション試薬(Rocheから)をトランスフェクションに用いた。トランスフェクションの1日前に、細胞をトリプシン処理し、プレートに播種した。HepG2および増幅HepaRG細胞系については0.8×105/ウェルで24ウェルプレートに、分化したHepaRG細胞系については3×105/ウェルで24ウェルプレートに、細胞を播種した。
X−TREMEGENE HP DNAトランスフェクション試薬(Rocheから)をトランスフェクションに用いた。トランスフェクションの1日前に、細胞をトリプシン処理し、プレートに播種した。HepG2および増幅HepaRG細胞系については0.8×105/ウェルで24ウェルプレートに、分化したHepaRG細胞系については3×105/ウェルで24ウェルプレートに、細胞を播種した。
HBV抗原の検出
HBeAgまたはHBsAgを、HBeAgまたはHBsAg ELISAキット(Autobioから)を用いて製造業者の指示に従って測定した。
HBeAgまたはHBsAgを、HBeAgまたはHBsAg ELISAキット(Autobioから)を用いて製造業者の指示に従って測定した。
HBV DNAの検出
細胞培養上清またはマウス血清中のHBV DNAを、MagNA Pure 96 System MagNA Pure 96 System(Rocheから)を用いて抽出した。HBV DNAレベルをRT−PCRにより判定した。プライマーおよびプローブの配列を以下に示す:
フォワードプライマー: 5’−GCTGGATGTGTCTGCGGC−3’(372−389);
リバースプライマー: 5’−GAGGACAAACGGGCAACATAC−3’(459−479);
プローブ: 5’−CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTG−BHQ−2−3’(409−436)
適宜希釈したプラスミドpBR322−HBV1.3(SEQ ID NO:7)をRT−PCRのための標準品として用いた。
細胞培養上清またはマウス血清中のHBV DNAを、MagNA Pure 96 System MagNA Pure 96 System(Rocheから)を用いて抽出した。HBV DNAレベルをRT−PCRにより判定した。プライマーおよびプローブの配列を以下に示す:
フォワードプライマー: 5’−GCTGGATGTGTCTGCGGC−3’(372−389);
リバースプライマー: 5’−GAGGACAAACGGGCAACATAC−3’(459−479);
プローブ: 5’−CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTG−BHQ−2−3’(409−436)
適宜希釈したプラスミドpBR322−HBV1.3(SEQ ID NO:7)をRT−PCRのための標準品として用いた。
細胞生存率アッセイ
Albumin AlphaLISAキット(PerkinElimerから)を用いて、上清中に分泌されたアルブミンの量により細胞生存率を決定した。
Albumin AlphaLISAキット(PerkinElimerから)を用いて、上清中に分泌されたアルブミンの量により細胞生存率を決定した。
DNase消化
細胞溶解物を、DNase Iキット(Sigmaから)を用いて製造業者の指示に従って消化した。
細胞溶解物を、DNase Iキット(Sigmaから)を用いて製造業者の指示に従って消化した。
Hirt DNA抽出
Hirt DNAを、先の記載をわずかに改変したものに従って調製した(Cai, et al., 2013, Methods Mol Biol, 1030: 151-61)。簡単に述べると、HepG2細胞(1×106)またはホモジナイズした肝臓組織(50mg)を、10mMのEDTAを含む50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)500μlに懸濁した。次いで120μlの10% SDSを添加し、100μlの2.5M KClを添加し、穏やかに混合した。4℃で10分間の遠心の後、上清をフェノールおよびフェノール:クロロホルム:イソフミルアルコール(25:24:1)およびフェノールでそれぞれ抽出した。DNAをエタノールで沈殿させ、核酸をTE緩衝液(10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0)に溶解した。
Hirt DNAを、先の記載をわずかに改変したものに従って調製した(Cai, et al., 2013, Methods Mol Biol, 1030: 151-61)。簡単に述べると、HepG2細胞(1×106)またはホモジナイズした肝臓組織(50mg)を、10mMのEDTAを含む50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)500μlに懸濁した。次いで120μlの10% SDSを添加し、100μlの2.5M KClを添加し、穏やかに混合した。4℃で10分間の遠心の後、上清をフェノールおよびフェノール:クロロホルム:イソフミルアルコール(25:24:1)およびフェノールでそれぞれ抽出した。DNAをエタノールで沈殿させ、核酸をTE緩衝液(10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0)に溶解した。
cccDNAリアルタイムPCR
HBV cccDNA特異的プライマーおよびプローブのセットを用いてcccDNAを検出した:
cccDNA−F; 5’−CTCCCCGTCTGTGCCTTCT−3’(1545−1563);
cccDNA−R: 5’−GCCCCAAAGCCACCCAAG−3’(1883−1900);
cccDNA−プローブ: 5’−TARMA+CGTCGCATGGARACCACCGTGAACGCC+BHQ−2−3’(1602−1628)。
HBV cccDNA特異的プライマーおよびプローブのセットを用いてcccDNAを検出した:
cccDNA−F; 5’−CTCCCCGTCTGTGCCTTCT−3’(1545−1563);
cccDNA−R: 5’−GCCCCAAAGCCACCCAAG−3’(1883−1900);
cccDNA−プローブ: 5’−TARMA+CGTCGCATGGARACCACCGTGAACGCC+BHQ−2−3’(1602−1628)。
HBVヌクレオカプシドの検出
トランスフェクトしたHepG2細胞を、細胞溶解緩衝液(50mM Tris−HCl,pH8.0,100mM NaCl,1% CA−630,1×EDTAフリー プロテイナーゼ阻害薬)を用いて溶解した。4℃で1時間、撹拌しながらインキュベートした後、細胞質溶解物を遠心により澄明にした。溶解物を1.5%アガロースゲル中での電気泳動により分離し、次いでそれぞれカプシドタンパク質およびカプシド被包DNAの検出のために、PVDF膜(ウェスタンブロット法について)または正に荷電したナイロン膜(サザンブロット法について)上へ移した。
トランスフェクトしたHepG2細胞を、細胞溶解緩衝液(50mM Tris−HCl,pH8.0,100mM NaCl,1% CA−630,1×EDTAフリー プロテイナーゼ阻害薬)を用いて溶解した。4℃で1時間、撹拌しながらインキュベートした後、細胞質溶解物を遠心により澄明にした。溶解物を1.5%アガロースゲル中での電気泳動により分離し、次いでそれぞれカプシドタンパク質およびカプシド被包DNAの検出のために、PVDF膜(ウェスタンブロット法について)または正に荷電したナイロン膜(サザンブロット法について)上へ移した。
ウェスタンブロット
SDS−PAGEの後、iblotシステム(Invitrogenから)を用いてゲルをPVDF膜へ移した。ブロッキングの後、膜を一次抗体、ウサギ抗HBVコア抗原(Dakoから)およびマウスモノクローナル抗アクチン(Sigmaから)と共にインキュベートした。数回の洗浄の後、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)にカップリングした適宜な二次抗体(KangChenから)と共に膜をインキュベートした。洗浄の後、Western Pico Super ECL試薬(Pierceから)を用いて信号を視覚化した。
SDS−PAGEの後、iblotシステム(Invitrogenから)を用いてゲルをPVDF膜へ移した。ブロッキングの後、膜を一次抗体、ウサギ抗HBVコア抗原(Dakoから)およびマウスモノクローナル抗アクチン(Sigmaから)と共にインキュベートした。数回の洗浄の後、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)にカップリングした適宜な二次抗体(KangChenから)と共に膜をインキュベートした。洗浄の後、Western Pico Super ECL試薬(Pierceから)を用いて信号を視覚化した。
サザンハイブリダイゼーション
試料を1×TAE緩衝液中1.5%アガロースゲルに装填し、2〜3時間電気泳動した。変性および中和の後、DNAを20×SSC中でHybond−N+膜(GE Healthcareから)にブロットし、DIG標識HBV DNAプローブとハイブリダイズさせた。ブロットをアルカリホスファターゼ結合した抗DIG抗体と共にインキュベートした後、ハイブリダイゼーション信号を標準的な化学発光反応で検出した。
試料を1×TAE緩衝液中1.5%アガロースゲルに装填し、2〜3時間電気泳動した。変性および中和の後、DNAを20×SSC中でHybond−N+膜(GE Healthcareから)にブロットし、DIG標識HBV DNAプローブとハイブリダイズさせた。ブロットをアルカリホスファターゼ結合した抗DIG抗体と共にインキュベートした後、ハイブリダイゼーション信号を標準的な化学発光反応で検出した。
免疫蛍光
細胞をチャンバースライド(chamber slide)(Permanoxから)上で培養し、PBS中4%パラホルムアルデヒドで固定し、透過用緩衝液(5% BSA+0.5%トリトン,PBS中)で透過処理した。細胞をウサギ抗HBVコア抗原(Dakoから)およびマウスモノクローナル抗HBV表面抗原(Invitrogenから)で染色した。5%のFBSを含有するPBS中に抗体を希釈した。PBSで洗浄した後、結合した抗体を二次抗体、Alexa Fluor 594nmヤギ抗ラットおよびAlexa Fluor 488nmロバ抗ウサギ(Invitrogenから)で標識した。数回の追加洗浄の後、細胞をDAPI(Invitrogenから)で染色し、Nikon倒立IF顕微鏡下で観察した。
細胞をチャンバースライド(chamber slide)(Permanoxから)上で培養し、PBS中4%パラホルムアルデヒドで固定し、透過用緩衝液(5% BSA+0.5%トリトン,PBS中)で透過処理した。細胞をウサギ抗HBVコア抗原(Dakoから)およびマウスモノクローナル抗HBV表面抗原(Invitrogenから)で染色した。5%のFBSを含有するPBS中に抗体を希釈した。PBSで洗浄した後、結合した抗体を二次抗体、Alexa Fluor 594nmヤギ抗ラットおよびAlexa Fluor 488nmロバ抗ウサギ(Invitrogenから)で標識した。数回の追加洗浄の後、細胞をDAPI(Invitrogenから)で染色し、Nikon倒立IF顕微鏡下で観察した。
クロマチン免疫沈降
EpiTect Chip One−Day Kit(Qiagenから)を用い、製造業者が提示した方法をわずかに改変したものに従って、ChIPアッセイを実施した。細胞を1%ホルムアルデヒド中、37℃で10分間、固定した。固定を停止した後、細胞を800g、4℃で10分間ペレット化し、プロテイナーゼ阻害剤カクテルを補足した免疫沈降用細胞溶解緩衝液の添加により再懸濁した。500マイクロリットルの細胞溶解物を、カップホーン(cup horn)(Sonicator XL2020,Misonix)により、26Wで2秒間のオンおよび15秒間のオフ、合計時間につき16秒間(ラウンド当たり8回)、9ラウンドのセッティングで超音波処理した。この超音波処理条件は細胞DNAを500〜800bpのフラグメントに着実に破断することが示されている。予備澄明化(pre-clear)、免疫沈降およびDNA抽出については、EpiTect ChIP One−Day Kit(Qiagenから)に備えられた指示に厳密に従った。得られたDNAに、特異的cccDNAプライマーを用いたリアルタイムPCRによる定量分析を施した:
フォワード, 5’−CTGAATCCTGCGGACGACCC−3’ (1441−1460nt);
リバース, 5’−CCCAAGGCACAGCTTGGAGG−3’ (1889−1869nt)
免疫組織化学染色
切除した肝臓組織試料を直ちに4%ホルマリンに浸漬し、18〜24時間固定し、パラフィン包埋した。組織切片について抗HBcマルチクローナル抗体(Dakoから)を用いた免疫組織化学染色を実施してコア抗原発現を検出した。HBc陽性細胞の割合および染色強度を評価するために免疫反応スコア(Immunoreactive score)(IRS)半定量スコアリング方式を用いる。染色強度を0(陰性)、1(弱)、2(中)、および3(強)と等級付けした;陽性細胞のパーセントを0(陰性)、1(<25%)、2(25%〜50%)、3(50%〜75%)、4(>75%)と採点した。2つのスコアを掛け算してIRSを決定した。
EpiTect Chip One−Day Kit(Qiagenから)を用い、製造業者が提示した方法をわずかに改変したものに従って、ChIPアッセイを実施した。細胞を1%ホルムアルデヒド中、37℃で10分間、固定した。固定を停止した後、細胞を800g、4℃で10分間ペレット化し、プロテイナーゼ阻害剤カクテルを補足した免疫沈降用細胞溶解緩衝液の添加により再懸濁した。500マイクロリットルの細胞溶解物を、カップホーン(cup horn)(Sonicator XL2020,Misonix)により、26Wで2秒間のオンおよび15秒間のオフ、合計時間につき16秒間(ラウンド当たり8回)、9ラウンドのセッティングで超音波処理した。この超音波処理条件は細胞DNAを500〜800bpのフラグメントに着実に破断することが示されている。予備澄明化(pre-clear)、免疫沈降およびDNA抽出については、EpiTect ChIP One−Day Kit(Qiagenから)に備えられた指示に厳密に従った。得られたDNAに、特異的cccDNAプライマーを用いたリアルタイムPCRによる定量分析を施した:
フォワード, 5’−CTGAATCCTGCGGACGACCC−3’ (1441−1460nt);
リバース, 5’−CCCAAGGCACAGCTTGGAGG−3’ (1889−1869nt)
免疫組織化学染色
切除した肝臓組織試料を直ちに4%ホルマリンに浸漬し、18〜24時間固定し、パラフィン包埋した。組織切片について抗HBcマルチクローナル抗体(Dakoから)を用いた免疫組織化学染色を実施してコア抗原発現を検出した。HBc陽性細胞の割合および染色強度を評価するために免疫反応スコア(Immunoreactive score)(IRS)半定量スコアリング方式を用いる。染色強度を0(陰性)、1(弱)、2(中)、および3(強)と等級付けした;陽性細胞のパーセントを0(陰性)、1(<25%)、2(25%〜50%)、3(50%〜75%)、4(>75%)と採点した。2つのスコアを掛け算してIRSを決定した。
実施例1
HBVサークルのデザインおよび製造
1.3単位の過剰長遺伝子型D HBVゲノム(GeneBank JN664917.1)を収容したプラスミドpBR322−HBV1.3およびそのプラスミドの配列をSEQ ID NO:7として挙げる。親ミニサークルDNAベクタープラスミド、pMC.CMV−MCS−SV40polyAをSystem Biosciencesから購入した(カタログ番号MN501A1,配列をSEQ ID NO:13として挙げる)。
HBVサークルのデザインおよび製造
1.3単位の過剰長遺伝子型D HBVゲノム(GeneBank JN664917.1)を収容したプラスミドpBR322−HBV1.3およびそのプラスミドの配列をSEQ ID NO:7として挙げる。親ミニサークルDNAベクタープラスミド、pMC.CMV−MCS−SV40polyAをSystem Biosciencesから購入した(カタログ番号MN501A1,配列をSEQ ID NO:13として挙げる)。
親HBVサークル−CMV−HBV1.1構築体を得るために、遺伝子型D HBVゲノムのヌクレオチド1805−3182および1−1990から出発して1.1単位の過剰長HBVゲノムをpBR322−HBV1.3からPCRにより回収し、次いでSalIおよびNheI部位を利用してpMC.CMV−MCS−SV40polyAベクター内へクローニングした。この親HBVサークル−CMV−HBV1.1構築体の配列をSEQ ID NO:8として挙げる。
親HBVサークル−HBV1.3構築体を得るために、pMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターをSmaIおよびKpnI(New England Biolabs Ltdから購入)で消化した。1.3単位の過剰長HBVゲノムインサート(SEQ ID NO:9として挙げる)を作製するために、SmaI部位を含むフォワードプライマー
5’−TGGGCTCCCCGGGCGCGCAATCTAAGCAGGCTTTCACT−3’
およびKpnI部位を含むリバースプライマー
5’−ATGTGGTACCACATCATGATGCTGATTACCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGGATCTCGTACTGAAGGAAAGA−3’
を用い、pBR322−HBV1.3を鋳型として用いて、PCRにより4.2kbフラグメント(SEQ ID NO:10として挙げる)を作製した。このPCRフラグメントをSmaIおよびKpnIで制限処理し、同じ酵素により消化したpMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターとライゲートさせて、親プラスミドを得た。親HBVサークル−HBV1.3構築体の配列をSEQ ID NO:11として挙げる。
5’−TGGGCTCCCCGGGCGCGCAATCTAAGCAGGCTTTCACT−3’
およびKpnI部位を含むリバースプライマー
5’−ATGTGGTACCACATCATGATGCTGATTACCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGGATCTCGTACTGAAGGAAAGA−3’
を用い、pBR322−HBV1.3を鋳型として用いて、PCRにより4.2kbフラグメント(SEQ ID NO:10として挙げる)を作製した。このPCRフラグメントをSmaIおよびKpnIで制限処理し、同じ酵素により消化したpMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターとライゲートさせて、親プラスミドを得た。親HBVサークル−HBV1.3構築体の配列をSEQ ID NO:11として挙げる。
親HBVサークル構築体を得るために、pMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターをSmaIおよびKpnIで消化した。attBおよびattP部位ならびにSmaIおよびKpnI部位によりフランキングされた遺伝子型D HBVゲノムのヌクレオチド2848−3182および1−2847から出発した完全長HBVゲノムインサートを、直接に遺伝子合成し(配列をSEQ ID NO:12として挙げる)、消化し、同じ酵素により消化したpMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターとライゲートさせて、親プラスミドを得た。親HBVサークル構築体の配列をSEQ ID NO:1として挙げる。
MC−EasyミニサークルDNA製造キットを用い、製造業者の指示に従って(System Biosciences,MN925A−1)、ミニサークルDNAを製造した。HBVサークル、HBVサークル−CMV−HBV1.1およびHBVサークル−HBV1.3のDNAが、それぞれ前記に挙げたそれらの対応する親プラスミドから、ミニサークル産生体である大腸菌株ZYCY10P3S2TにおいてφC31インテグラーゼおよびI−SceI遺伝子発現が起動した際に産生された(図1A)。HBVサークルDNAについては、HBVサークル中の39ヌクレオチドのattR部位インサーション(SEQ ID NO:4)は、SEQ ID NO:3の2847位と2848位の間、preS1遺伝子の開始コドンの直前、ポリメラーゼ遺伝子のTP(terminal protein)(末端タンパク質)ドメインとスペーサーの間に位置する(図1B)。HBVサークルの全配列をSEQ ID NO:2として挙げる。HBVサークルDNAのサイズおよび配列を、それぞれアガロースゲル電気泳動およびサンガーシーケンシング(Sanger sequencing)により確認した(図1C)。
実施例2
インビトロでのHBVサークルトランスフェクション後のHBV複製の査定
HBVサークル、HBVサークル−CMV−HBV1.1およびHBVサークル−HBV1.3ならびにそれらの親プラスミドを、ウイルス複製試験のためにHepG2細胞に一過性トランスフェクトした。トランスフェクション後、72時間目に細胞培養上清を採集し、ELISAおよびqRT−PCR分析を行なった。HBeAg、HBsAgおよびHBV DNAが上清中に多量に存在し、これは健全なウイルス複製を示唆した(図2A、BおよびC)。細胞を溶解し、総DNAを抽出し、cccDNA特異的プライマーおよびプローブのセットによるリアルタイムPCRを用いてcccDNAを定量した(図2D)。従来の1.3単位HBVゲノム過剰長デザインをもつ親HBVサークル−HBV1.3プラスミドと比較して、HBVサークルは少なくともそれに匹敵するかまたはそれより高いHBVマーカー発現を示した。
インビトロでのHBVサークルトランスフェクション後のHBV複製の査定
HBVサークル、HBVサークル−CMV−HBV1.1およびHBVサークル−HBV1.3ならびにそれらの親プラスミドを、ウイルス複製試験のためにHepG2細胞に一過性トランスフェクトした。トランスフェクション後、72時間目に細胞培養上清を採集し、ELISAおよびqRT−PCR分析を行なった。HBeAg、HBsAgおよびHBV DNAが上清中に多量に存在し、これは健全なウイルス複製を示唆した(図2A、BおよびC)。細胞を溶解し、総DNAを抽出し、cccDNA特異的プライマーおよびプローブのセットによるリアルタイムPCRを用いてcccDNAを定量した(図2D)。従来の1.3単位HBVゲノム過剰長デザインをもつ親HBVサークル−HBV1.3プラスミドと比較して、HBVサークルは少なくともそれに匹敵するかまたはそれより高いHBVマーカー発現を示した。
さらに、HBsAgおよびHBVコア(HBc)タンパク質は、HBVサークルをトランスフェクトした細胞において、免疫蛍光染色で容易に検出できた(図2E)。HBc欠失がHBV複製に及ぼす影響を判定するために、HBcの開始コドンを変異させたHBc(−) HBVサークルをSEQ ID NO:15として構築した。これら2種類の構築体をHepG2細胞にトランスフェクトした場合、HBsAgおよびHBeAg発現は同様に発現した(図3−1Aおよび3−1B)。細胞内HBVカプシドおよびカプシド被包HBV DNAは野生型のみに検出されたが、HBc(−) HBVサークルをトランスフェクトした細胞には検出されなかった。HBcをトランスで補足した場合、これらの欠損の救済に成功した(図3−1C)。さらに他のHBV変異体も作製し、図3−2A、3−2Bおよび3−2Cに示すようにHBV複製マーカーを検査した。これらの変異体は下記のものを含む;HBVサークルPol(−)、すなわちHBVポリメラーゼ遺伝子の開始コドンが変異したもの(SEQ ID NO:16)は、そのウイルスをポリメラーゼ発現欠損にし、ウイルスRNAをパッケージできなかった(Nguyen et al., J Virol. 2008;82:6852-6861);HBVサークル Pol(Y63D)、すなわちHBVポリメラーゼにY63D変異があるもの(SEQ ID NO:17)は、そのウイルスをDNA合成欠損にしたが、RNAパッケージングにおいては完全に機能性であった(Lanford et al., J Virol. 1997;71:2996-3004);HBVサークルHBs(−)、すなわち2つの未成熟停止コドンをpreS2およびSコーディング領域に導入したもの(SEQ ID NO:18);HBVサークルHBe(−)、すなわち未成熟停止コドン変異G1896Aをプレコア遺伝子に導入したもの(SEQ ID NO:19)。
これらのデータは、肝細胞に導入されるとHBVサークルが高レベルHBV複製の支持について十分にコンピテントであることを明瞭に立証した。
実施例3
インビトロでのcccDNAマーカー査定
核内にcccDNAが存在するのはHBVのユニークな特徴のひとつである。HBVサークルが肝細胞の核内でcccDNAを形成できるかどうかを判定するために、サザンブロットおよびCHIP分析を実施した。サザンブロット分析のために、親HBVサークルまたはHBVサークルをまずHepG2細胞にトランスフェクトし、次いでHirt DNAを調製した(Cai, et al., 2013, Methods Mol Biol, 1030: 151-61)。HBVサークルをトランスフェクトした細胞においてのみスーパーコイルド耐熱性cccDNAバンドがサザンブロット上にみられたが、親HBVサークルをトランスフェクトした細胞にはみられなかった。EcoRI線状化すると、cccDNAバンドは消失した(図4A,RC:弛緩した環状(relaxed circle);DSL:二本鎖線状(double strand linear);CCC:cccDNA)。HBVサークルをトランスフェクトした細胞を用いてCHIP分析も実施した。先の刊行物と一致して、トリメチル化リジン9(H3K9me3)およびアセチル化リジン27(H3K27ac)を含むエピジェネティック修飾がcccDNAに付随していた(Liu, et al., 2013, PLoS Pathog, 9: e1003613)。一方で、類似レベルの総H3(Pan H3)がHBV cccDNAと宿主RL30遺伝子の間にみられた(それぞれ図4BおよびC)。合わせると、これらのデータはHBVサークルをトランスフェクトした細胞に基準cccDNAがミニ染色体として存在することを立証し、これはさらにHBVサークルを天然HBV cccDNA研究のための代替として使用できることを支持した。
実施例3
インビトロでのcccDNAマーカー査定
核内にcccDNAが存在するのはHBVのユニークな特徴のひとつである。HBVサークルが肝細胞の核内でcccDNAを形成できるかどうかを判定するために、サザンブロットおよびCHIP分析を実施した。サザンブロット分析のために、親HBVサークルまたはHBVサークルをまずHepG2細胞にトランスフェクトし、次いでHirt DNAを調製した(Cai, et al., 2013, Methods Mol Biol, 1030: 151-61)。HBVサークルをトランスフェクトした細胞においてのみスーパーコイルド耐熱性cccDNAバンドがサザンブロット上にみられたが、親HBVサークルをトランスフェクトした細胞にはみられなかった。EcoRI線状化すると、cccDNAバンドは消失した(図4A,RC:弛緩した環状(relaxed circle);DSL:二本鎖線状(double strand linear);CCC:cccDNA)。HBVサークルをトランスフェクトした細胞を用いてCHIP分析も実施した。先の刊行物と一致して、トリメチル化リジン9(H3K9me3)およびアセチル化リジン27(H3K27ac)を含むエピジェネティック修飾がcccDNAに付随していた(Liu, et al., 2013, PLoS Pathog, 9: e1003613)。一方で、類似レベルの総H3(Pan H3)がHBV cccDNAと宿主RL30遺伝子の間にみられた(それぞれ図4BおよびC)。合わせると、これらのデータはHBVサークルをトランスフェクトした細胞に基準cccDNAがミニ染色体として存在することを立証し、これはさらにHBVサークルを天然HBV cccDNA研究のための代替として使用できることを支持した。
実施例4
HBVサークルを用いたインビトロでの抗HBV薬の評価
次に、細胞培養モデルにおいてHBVサークル系を用いた抗HBV薬の評価の可能性を査定した。HepG2細胞または増殖性HepaRG細胞をHBVサークルで一過性トランスフェクトし、指示した濃度のETV、HAP 12(HBVカプシドアセンブリー阻害薬,これはヘテロアリールジヒドロピリミジン(heteroaryldihydropyrimidine)(HAP)化学物質シリーズに属し、Bourne et al., J Virol. Oct 2008; 82(20): 10262-10270に例12として公表された)またはPegasysで6日間処理した。上清を採集し、HBsAg、HBeAgおよびアルブミンELISAを実施した。細胞を溶解し、細胞溶解物にカプシド被包HBV DNA検出のためのサザンブロット分析、ならびに特異的抗体によるHBVカプシド、HBcおよびベータ−アクチン検出のためのウェスタンブロット分析をそれぞれ施した。
HBVサークルを用いたインビトロでの抗HBV薬の評価
次に、細胞培養モデルにおいてHBVサークル系を用いた抗HBV薬の評価の可能性を査定した。HepG2細胞または増殖性HepaRG細胞をHBVサークルで一過性トランスフェクトし、指示した濃度のETV、HAP 12(HBVカプシドアセンブリー阻害薬,これはヘテロアリールジヒドロピリミジン(heteroaryldihydropyrimidine)(HAP)化学物質シリーズに属し、Bourne et al., J Virol. Oct 2008; 82(20): 10262-10270に例12として公表された)またはPegasysで6日間処理した。上清を採集し、HBsAg、HBeAgおよびアルブミンELISAを実施した。細胞を溶解し、細胞溶解物にカプシド被包HBV DNA検出のためのサザンブロット分析、ならびに特異的抗体によるHBVカプシド、HBcおよびベータ−アクチン検出のためのウェスタンブロット分析をそれぞれ施した。
HBVサークルをトランスフェクトしたHepG2細胞において、Entecavir(ETV)、すなわちCHB処置用として承認されたヌクレオシドアナログは用量依存性でHBV DNA複製を効果的にブロックしたが、他のウイルスタンパク質発現には影響を及ぼさなかった(図5A,上左パネルおよび右パネル)。他方で、HAP 12はカプシド形成をブロックして、HBV DNA複製の抑止をもたらした(Bourne, et al., 2008, J Virol, 82: 10262-70)。本発明者らはHAP 12が用量依存性で特異的にHBeAg分泌を低減するが、HBsAgまたはアルブミンには影響を及ぼさないことも観察した(図4A,下左パネルおよび右パネル)。
Pegasys(peg化インターフェロンアルファ−2a)はCHB処置用として承認されたもうひとつの薬物であり、多数の宿主メカニズムを活性化してHBV複製を抑制することができる。HBVサークルをトランスフェクトしたHepaRG細胞をPegasysで処理すると、HBsAgとHBeAgの両方の産生が用量依存性で阻害された(図5B)。これらの結果は、種々のクラスの抗HBV薬をインビトロで細胞培養モデルにおいて評価するためにHBVサークルを使用できることを示唆する。
実施例5
HBVサークルを用いた持続的HDIマウスモデルの樹立
HBV複製および持続時間をインビボで試験するために、10μgのHBVサークル、すなわちHBVサークル−HBV1.3を、HBVサークル−HBV1.3の親プラスミドと共に、C3H/HeNマウス(雄,4〜6週齢)の尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。HDI後の指示した時点で、HBsAg、HBeAgおよびHBV DNAを含めたHBVマーカーを検査するために血液試料を採集した(図6)。図6の指示した時点での動物数を表1に示した。HBVサークルをインジェクトしたC3H/HeNマウスは、他のグループと比較してきわめて高いレベルの安定したHBVマーカー発現を示した。すべてのHBVマーカーが、インジェクション後、7週を超えて持続した。対照的に、pBR322−HBV1.3構築体のように古典的なHBV1.3デザインをもつ親HBVサークル−HBV1.3構築体はHBV持続性を支持することができなかった;HBsAgが急速に低減して14日を過ぎると検出できなくなったからである。その間に、全実験期間中、マウスの体重をモニターし、各系統のすべてのグループ間に有意差がなかった(図6D)。
HBVサークルを用いた持続的HDIマウスモデルの樹立
HBV複製および持続時間をインビボで試験するために、10μgのHBVサークル、すなわちHBVサークル−HBV1.3を、HBVサークル−HBV1.3の親プラスミドと共に、C3H/HeNマウス(雄,4〜6週齢)の尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。HDI後の指示した時点で、HBsAg、HBeAgおよびHBV DNAを含めたHBVマーカーを検査するために血液試料を採集した(図6)。図6の指示した時点での動物数を表1に示した。HBVサークルをインジェクトしたC3H/HeNマウスは、他のグループと比較してきわめて高いレベルの安定したHBVマーカー発現を示した。すべてのHBVマーカーが、インジェクション後、7週を超えて持続した。対照的に、pBR322−HBV1.3構築体のように古典的なHBV1.3デザインをもつ親HBVサークル−HBV1.3構築体はHBV持続性を支持することができなかった;HBsAgが急速に低減して14日を過ぎると検出できなくなったからである。その間に、全実験期間中、マウスの体重をモニターし、各系統のすべてのグループ間に有意差がなかった(図6D)。
HDIに際してのDNA量がHBV持続性に及ぼす影響を理解するために、4種類の異なる用量のHBVサークルを対照プラスミドpBR322−HBV1.3と共にC3H/HeNマウスにインジェクトした。血清中のHBVマーカーを51日間モニターした。図7の指示した時点における動物数を表2に示した。図7に示すように、2.5μg、5μgおよび10μgグループのすべてのマウスが高レベルのウイルス複製を少なくとも51日間持続して維持し、初期の用量依存性パターンのウイルスマーカー発現がみられたにもかかわらず、その後の30日を過ぎた時点では有意差がなかった。異なるプラスミドバックボーンおよび1.3過剰長HBVゲノムを保有するpBR322−HBV1.3グループは、良好に持続しなかった。
次に、マウス肝臓中のcccDNAを検出するために、3日目および30日目の各時点でHBVサークル10μgグループから2匹のマウスをと殺した。マウス肝臓を採取し、サザンブロット分析用のHirt DNAを調製した。図7Dに示すように、HDI後3日目に耐熱性cccDNAを明瞭に検出できた。そして30日目にはcccDNAレベルは低減したが、なお検出可能であった。EcoRI消化により線状化すると、速やかに移動するスーパーコイルドcccDNAバンドは予想どおり消失していた。これらの結果は、マウス肝臓において持続性表現型が基準cccDNAにより推進されたことを示唆する。
表3および図8に示すように、選択したマウスについてHDIインジェクション後120日目にHBcの免疫組織化学(Immunohistochemistry)(IHC)染色も実施した。結果は、これらのマウスにおいてHBV複製が少なくとも120日間持続し、HBcが主に、HBVを複製する肝実質細胞の核に存在することを立証した;これは、HBV慢性感染者において免疫寛容期にみられるものに類似する表現型である(Hsu, et al., 1987, J Hepatol.;5(1):45-50)。
(1)陽性染色パーセントスコア:0(陰性);1(陽性細胞<25%);2(陽性細胞25%〜〜50%);3(陽性細胞50%〜70%);4(陽性細胞>75%).
(2)染色強度,弱から強まで:0〜3.
(3)IRS:陽性染色パーセントスコア×染色強度スコア.
(4)累積IRS:5回の反復IRSの和.
(5)ND:判定しなかった.
(6)HBsAgについてのLLOQは10IU/mlである;HBeAgについてのLLOQは5NCU/mlである;HBV DNAについてのLLOQは4.30Log10(コピー/ml)である。
(2)染色強度,弱から強まで:0〜3.
(3)IRS:陽性染色パーセントスコア×染色強度スコア.
(4)累積IRS:5回の反復IRSの和.
(5)ND:判定しなかった.
(6)HBsAgについてのLLOQは10IU/mlである;HBeAgについてのLLOQは5NCU/mlである;HBV DNAについてのLLOQは4.30Log10(コピー/ml)である。
実施例6
HBVサークルを用いたインビボでの抗HBV薬の評価
免疫コンピテントマウスにおけるHBVサークルによる持続的な高レベルHBV複製の樹立は、異なる作用メカニズム(mechanism of action)(MoA)をもつ抗HBV薬を評価できる可能性もある。これを調べるために、まずC3H/HeNマウスに10μgのHBVサークルをインジェクトし、22日間待った後、抗ウイルス薬処理を開始した。23日目に、マウスを6〜7匹/グループの4グループに分け、ビヒクル、ETV(0.03mg/kg,QD)、ヘテロアリールジヒドロピリミジン(HAP)化合物系列に属するHAP 2(HBVカプシドアセンブリー阻害薬,WO2014/037480の例2に公表,10mg/kg,QD)、およびR848(レシキモド(Resiquimod),TLR7アゴニスト,その構造はHemmi et al., Nature Immunology 3, 196 - 200 (2002)に公表された,0.5mg/kg,QOD)を各グループのマウスに29日間、経口投与した。図9に示すように、ETV、HAP 2およびR848処理は血清中のHBV DNAを検出できないレベルにまで効果的に低減した。さらに、R848はHBsAgおよびHBeAgをも著しく低減し、44日目(処理の22日目)からは3種類すべてのHBV血清マーカーを検出できないレベルにまで低減した。この例の結果は、本発明の組換えHBV cccDNAにより樹立したモデルが薬物評価に用いる効果的方法であることを明瞭に示した。
HBVサークルを用いたインビボでの抗HBV薬の評価
免疫コンピテントマウスにおけるHBVサークルによる持続的な高レベルHBV複製の樹立は、異なる作用メカニズム(mechanism of action)(MoA)をもつ抗HBV薬を評価できる可能性もある。これを調べるために、まずC3H/HeNマウスに10μgのHBVサークルをインジェクトし、22日間待った後、抗ウイルス薬処理を開始した。23日目に、マウスを6〜7匹/グループの4グループに分け、ビヒクル、ETV(0.03mg/kg,QD)、ヘテロアリールジヒドロピリミジン(HAP)化合物系列に属するHAP 2(HBVカプシドアセンブリー阻害薬,WO2014/037480の例2に公表,10mg/kg,QD)、およびR848(レシキモド(Resiquimod),TLR7アゴニスト,その構造はHemmi et al., Nature Immunology 3, 196 - 200 (2002)に公表された,0.5mg/kg,QOD)を各グループのマウスに29日間、経口投与した。図9に示すように、ETV、HAP 2およびR848処理は血清中のHBV DNAを検出できないレベルにまで効果的に低減した。さらに、R848はHBsAgおよびHBeAgをも著しく低減し、44日目(処理の22日目)からは3種類すべてのHBV血清マーカーを検出できないレベルにまで低減した。この例の結果は、本発明の組換えHBV cccDNAにより樹立したモデルが薬物評価に用いる効果的方法であることを明瞭に示した。
実施例7
さらに他のマウス系統およびHBV遺伝子型を用いた持続的HDIマウスモデルの樹立
C3H/HeNマウスのほかに、他の免疫コンピテントマウス系統であるCBA/Jを、それらが持続的HBV複製を支持する能力について同様に評価した。図10に示す実験において、HBVサークルまたはpBR322−HBV1.3をCBA/Jマウス(雄,4〜6週齢)の尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。HDI後の指示した時点で、HBsAg、HBeAgおよびHBV DNAを含めたHBVマーカーを検査するための血液試料を採集した。HBV複製はHDIインジェクトしたマウスの60%において少なくとも56日間持続した。
さらに他のマウス系統およびHBV遺伝子型を用いた持続的HDIマウスモデルの樹立
C3H/HeNマウスのほかに、他の免疫コンピテントマウス系統であるCBA/Jを、それらが持続的HBV複製を支持する能力について同様に評価した。図10に示す実験において、HBVサークルまたはpBR322−HBV1.3をCBA/Jマウス(雄,4〜6週齢)の尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。HDI後の指示した時点で、HBsAg、HBeAgおよびHBV DNAを含めたHBVマーカーを検査するための血液試料を採集した。HBV複製はHDIインジェクトしたマウスの60%において少なくとも56日間持続した。
遺伝子型D HBV配列のほかに、遺伝子型B HBV配列をもつ2種類のHBVサークル構築体を同様に評価した。図11に示すように、HBVサークルGt B(SEQ ID No:22,GeneBank AY220698に由来)およびHBVサークルGt Bc(SEQ ID No:23,GeneBank GQ205440に由来)の両方が、C3H/HeNマウスにおいて元のHBVサークルに匹敵する持続性を示した。
実施例8
HBVサークルを用いたインビボでのHBV変異体の特性解明
一連のHBVサークル変異体を作製し、それの持続性をインビボで評価した。HBc欠失はウイルスを複製不能にし、したがって血清中のHBV DNAを検出不能にした。しかし、それはHBsAgおよびHBeAgの持続性には影響を及ぼさなかった。同様に、HBx欠失(開始コドン変異,SEQ ID No:20)またはR96E変異(DDB1結合の欠失,SEQ ID No:21)(Leupin, et al., J Virol. 2005 Apr; 79(7): 4238-4245)はいずれもHBVの持続性には影響を及ぼさなかった(図12)。野生型グループと比較した血清中のHBV DNAおよび抗原のレベル低減により指摘されるように、HBV複製レベルの低減がみられた(図12)。この所見と一致して、マウス肝臓IHC染色結果も肝実質細胞におけるHBcレベル低減を立証した(表4および図13)。
HBVサークルを用いたインビボでのHBV変異体の特性解明
一連のHBVサークル変異体を作製し、それの持続性をインビボで評価した。HBc欠失はウイルスを複製不能にし、したがって血清中のHBV DNAを検出不能にした。しかし、それはHBsAgおよびHBeAgの持続性には影響を及ぼさなかった。同様に、HBx欠失(開始コドン変異,SEQ ID No:20)またはR96E変異(DDB1結合の欠失,SEQ ID No:21)(Leupin, et al., J Virol. 2005 Apr; 79(7): 4238-4245)はいずれもHBVの持続性には影響を及ぼさなかった(図12)。野生型グループと比較した血清中のHBV DNAおよび抗原のレベル低減により指摘されるように、HBV複製レベルの低減がみられた(図12)。この所見と一致して、マウス肝臓IHC染色結果も肝実質細胞におけるHBcレベル低減を立証した(表4および図13)。
別の実験で、HBe(−)、HBs(−)、Pol(−)およびPol(Y63D)を含めたさらに他のHBV変異体を検査した。図14に示すように、HBe(−)変異体はHBsAgの持続性の低減を示した。
(1)陽性染色パーセントスコア:0(陰性);1(陽性細胞<25%);2(陽性細胞25%〜〜50%);3(陽性細胞50%〜70%);4(陽性細胞>75%).
(2)染色強度,弱から強まで:0〜3.
(3)IRS:陽性染色パーセントスコア×染色強度スコア.
(4)累積IRS:5回の反復IRSの和.
(5)HBsAgについてのLLOQは10IU/mlである;HBeAgについてのLLOQは5NCU/mlである;HBV DNAについてのLLOQは4.30Log10(コピー/ml)である。
(2)染色強度,弱から強まで:0〜3.
(3)IRS:陽性染色パーセントスコア×染色強度スコア.
(4)累積IRS:5回の反復IRSの和.
(5)HBsAgについてのLLOQは10IU/mlである;HBeAgについてのLLOQは5NCU/mlである;HBV DNAについてのLLOQは4.30Log10(コピー/ml)である。
Claims (24)
- HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む、組換えHBV cccDNA。
- サイト−ハイブリッドインサートがattR部位である、請求項1に記載の組換えHBV cccDNA。
- attR部位が、preS1遺伝子の開始コドンの直前に、ポリメラーゼ遺伝子の末端タンパク質ドメインとスペーサーの間に位置する、請求項1または2に記載の組換えHBV cccDNA。
- attR部位が、SEQ ID NO:3の2847位と2848位の間に位置する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- HBVゲノムが完全長ゲノム、特に遺伝子型Bまたは遺伝子型Dのゲノム、より特別にはGeneBank JN664917.1、X02496、AY217370、AY220698、GQ205440またはHPBHBVAAに特定されたゲノム、最も特別にはSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:22またはSEQ ID NO:23により表わされるゲノムであり;あるいは遺伝子型Dの過剰長ゲノム、特に1.1単位または1.3単位のゲノム、より特別にはSEQ ID NO:9により表わされる1.3単位ゲノムである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- 組換えHBV cccDNA中のHBVゲノムのフラグメントが、HBVのエンベロープタンパク質、コア/プレコアタンパク質、xタンパク質および/またはポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子を複製または発現することができる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- 請求項1に記載の組換えHBV cccDNAであって、その配列がSEQ ID NO:2に挙げたものである、組換えHBV cccDNA。
- 細胞系または初代細胞にトランスフェクトするための、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- 細胞系が肝細胞に由来する細胞系、特に肝実質細胞に由来するもの、より特別にはHepG2またはHepaRGであり、あるいは初代細胞が初代肝細胞、特に初代肝実質細胞である、請求項8に記載の組換えHBV cccDNA。
- 抗HBV薬の評価のための、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- 抗HBV薬がETV、HAP 12、HAP 2、PegasysまたはR848である、請求項9に記載の組換えHBV cccDNA。
- 組換えHBV cccDNAを動物に送達することを含むcccDNAベースのHBV動物モデルを樹立する方法に使用するための、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- 樹立した動物モデルが、肝実質細胞において少なくとも30日間、特に肝実質細胞において少なくとも37日間、42日間、44日間、49日間、51日間、56日間、70日間、104日間、120日間または134日間、HBV抗原を発現する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- 動物が、機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- 動物がマウスである、特にマウスがC3H/HeNまたはCBA/Jマウスである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- 組換えHBV cccDNAを動物にハイドロダイナミックインジェクションにより送達する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNA。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを含む組成物またはキット。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAを製造するための、下記の工程を含む方法:
a) HBVゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを、ミニサークルDNA製造用の親ベクターの組換え基質部位に挿入し、それらによりフランキングして、親HBVサークル構築体を形成し;
b)その親HBVサークル構築体をミニサークル産生体内へトランスフォームして、部位特異的組換えにより組換えHBV cccDNAを産生させる。 - ミニサークル産生体が微生物、好ましくは細菌、より特別にはエシェリキア属菌種(Escherichia sp.)、最も特別には大腸菌(E.coli)、特に株ZYCY10P3S2Tである、請求項18に記載の方法。
- ミニサークルDNA製造用の親ベクターが、組換え基質部位、特にリコンビナーゼに対して特異的な、より特別にはインテグラーゼ、最も特別にはφC31、R4、TP901−1、φBT1、Bxb1、RV−1、AA118、U153、φFC1のインテグラーゼに対して特異的な、組換え基質部位を含む、請求項18または19に記載の方法。
- 組換え基質部位がattPおよびattBである、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- ミニサークルDNA製造用の親ベクターがpMC.CMV−MCS−SV40polyAベクターである、請求項18〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 親HBVサークル構築体のDNA配列がSEQ ID NO:1に挙げたものである、請求項18〜22のいずれか1項に記載の方法。
- B型肝炎ウイルス感染症の処置のための医薬の評価における、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組換えHBV cccDNAまたは請求項17に記載の組成物もしくはキットの使用。
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JP2022519308A (ja) * | 2019-02-06 | 2022-03-22 | フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター | その中の核酸分子を差次的にメチル化するように操作されたミニサークル産生細菌 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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CN107208102A (zh) | 2017-09-26 |
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