JP2022519308A - その中の核酸分子を差次的にメチル化するように操作されたミニサークル産生細菌 - Google Patents
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Abstract
実施形態は、差次的メチル化能力を有する操作されたミニサークル産生細菌、ならびに前記細菌を含むキットおよび組成物を含む。差次的にメチル化されたミニサークルＤＮＡを産生するためおよび扱いにくい細菌における外因性ＤＮＡの形質転換効率を改善するために前記操作されたミニサークル産生細菌を使用する方法が、さらに記載される。本発明は、例えば、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む親プラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌を提供する。
Description
政府により支援された研究の下でなされた発明に対する権利の声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＤＥ０２７８５０の下での政府支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＤＥ０２７８５０の下での政府支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
配列表に関する声明
本出願と関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３７４３３２＿４０７ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、６７．３ＫＢであり、２０２０年２月５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本出願と関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３７４３３２＿４０７ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、６７．３ＫＢであり、２０２０年２月５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
背景
技術分野
本開示は、その中のＤＮＡを差次的にメチル化する操作されたミニサークル産生細菌、ならびにミニサークルＤＮＡを産生するためおよび細菌中に形質転換される場合に外因性ＤＮＡの形質転換効率を増加させるためにこれらの細菌を使用する方法、ならびにかかる方法における使用のためのキットに、一般に関する。
技術分野
本開示は、その中のＤＮＡを差次的にメチル化する操作されたミニサークル産生細菌、ならびにミニサークルＤＮＡを産生するためおよび細菌中に形質転換される場合に外因性ＤＮＡの形質転換効率を増加させるためにこれらの細菌を使用する方法、ならびにかかる方法における使用のためのキットに、一般に関する。
従来技術の記載
遺伝子操作は、細菌の能力を利用するためおよび細菌機能の基本的な態様を発見するための強力なアプローチである。近年、研究者が自由に使える遺伝的ツールキットは、大幅に拡大した。これらのツールの適用は、高い形質転換効率を有する細菌株に大幅に限定されている。しかし、公知の細菌種の豊富さおよび多様性と比較して、かかる高度に遺伝的に扱いやすい株は現在少数存在するのみである。遺伝子操作の間のそのゲノムの変更にも新たな遺伝情報の導入にも適さない株は、遺伝的に扱いにくいと称される。
遺伝子操作は、細菌の能力を利用するためおよび細菌機能の基本的な態様を発見するための強力なアプローチである。近年、研究者が自由に使える遺伝的ツールキットは、大幅に拡大した。これらのツールの適用は、高い形質転換効率を有する細菌株に大幅に限定されている。しかし、公知の細菌種の豊富さおよび多様性と比較して、かかる高度に遺伝的に扱いやすい株は現在少数存在するのみである。遺伝子操作の間のそのゲノムの変更にも新たな遺伝情報の導入にも適さない株は、遺伝的に扱いにくいと称される。
現時点で、遺伝的扱いにくさは、微生物学の全ての分野にわたって広汎でかつ蔓延する問題である；実験室で成長させることができるほとんどの細菌には、機能を解明するためまたはヒト使用のために操作するための遺伝学の力は依然として歯が立たない。遺伝的に扱いやすい種内でさえ、この扱いやすさは、少数の飼い慣らされた株（domesticated strain）に限定される場合が多いが、目的の、異なる表現型形質を有する種の新たな初代分離株は、扱いやすさが不十分であるか、または現在扱いにくいかのいずれかである。結果として、研究者は、各別個の野生株の分離株のためのさらなる骨の折れる改変をしばしば伴う、各別個の種のためのａｄ ｈｏｃな遺伝システムの費用のかかる生成に従事しなければならなかった。
それらの天然の環境では、細菌は、３つの別個の手段：接合、形質導入および形質転換、による遺伝子水平伝播（ＨＧＴ）を介して、新たな遺伝情報を獲得する。接合の間、ＤＮＡは、直接的な細胞対細胞接触によって、１つの生物から別の生物へと伝播される。形質導入の間、ＤＮＡは、ＤＮＡを宿主細菌細胞中に注入することによって侵入するウイルスであるバクテリオファージによって運搬される。これら２つの天然のプロセスには、複雑な仕組みを要求する多面的な相互作用が関与し、したがって、これらは、ＤＮＡが理想的には任意の所与の細菌株へと容易かつ迅速に伝播可能でなければならない現代の細菌遺伝学では、価値が限定的である。しかし、形質転換の間、裸のＤＮＡは、直接獲得され、相同な配列との組換えによって、またはプラスミドの場合には、新たなエピソーム（自律的に複製する染色体外ＤＮＡ）を樹立することによって、宿主ゲノム中に取り込まれ、細胞の遺伝的変更を生じる。遺伝的コンピテンスは、ＤＮＡ内部移行の一過的な「絶好の機会」である天然の形質転換を細菌が受けるのを可能にする細胞状態である。しかし、６，６００を超える検証済み培養型の細菌種の株、および純粋な培養下にあるおよそ３０，０００の公式に命名された種が存在するが、天然の形質転換およびコンピテンスは、ごく一握りのおよそ８０の細菌種でしか観察されていない。いくつかの場合において、単一の報告だけが形質転換を実証しており、天然の形質転換の分子的証拠が欠如しているので、これさえも過大評価であり得る。その代わり、目的の残りの培養細菌種（cultivated bacterial species）について、微生物学者は、しばしば株レベルで、「人工」形質転換および個別化された遺伝システム：遺伝的に扱いにくい表現型によって絶えず妨害されるプロセス、を開発しなければならない。
したがって、公知の方法は、細菌の広い多様性への容易かつ迅速な適用とは程遠い。扱いにくい細菌の遺伝子操作における障壁を克服するための改善された方法が、必要とされている。
概要
以下にさらに記載されるように、内因性メチルトランスフェラーゼが欠損し、それによって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有する操作されたミニサークル（ＭＣ）産生細菌が、本明細書で提供される。かかる細菌は、他の細菌、例えば、扱いにくい細菌中に次いで形質転換され得る差次的にメチル化された（例えば、メチル化なしの）ＭＣ ＤＮＡを産生する。
以下にさらに記載されるように、内因性メチルトランスフェラーゼが欠損し、それによって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有する操作されたミニサークル（ＭＣ）産生細菌が、本明細書で提供される。かかる細菌は、他の細菌、例えば、扱いにくい細菌中に次いで形質転換され得る差次的にメチル化された（例えば、メチル化なしの）ＭＣ ＤＮＡを産生する。
より具体的には、本開示は、その中のＤＮＡを差次的にメチル化する操作された（ＭＣ）産生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ならびにＭＣ ＤＮＡを産生するためおよび扱いにくい細菌を含む細菌中に形質転換される場合に外因性ＤＮＡの形質転換効率を増加させるためにこれらの細菌を使用する方法を特色とする。
したがって、本開示の態様は、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む親プラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌を含む。
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載される操作された細菌を含むキットを含む。別の態様では、本明細書に記載される操作された細菌またはキットから産生されたミニサークル（ＭＣ）プラスミドが、本明細書に記載される。
本開示のさらなる態様は、
本明細書に記載される操作された細菌である第１の細菌において、外因性ＤＮＡ配列を含むミニサークルを産生するステップ；および
ミニサークルを第２の細菌中に形質転換するステップであって、ミニサークルが、第２の細菌中に形質転換された場合に、分解に対して耐性である、ステップ
を含む方法を含む。
本明細書に記載される操作された細菌である第１の細菌において、外因性ＤＮＡ配列を含むミニサークルを産生するステップ；および
ミニサークルを第２の細菌中に形質転換するステップであって、ミニサークルが、第２の細菌中に形質転換された場合に、分解に対して耐性である、ステップ
を含む方法を含む。
さらに、本開示の態様は、外因性核酸配列を含むミニサークルプラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌を含む。
本開示は、宿主細胞であって、宿主細胞にとって外因性である核酸配列を含むプラスミドを含み、外因性核酸配列が、参照Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌ではメチル化される複数のメチル化部位（methylation cite）においてメチル化を欠如する、宿主細胞を、さらに記載する。
さらなる態様では、本開示は、親プラスミドを、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損した操作された細菌中に形質転換するステップであって、親プラスミドが、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む、ステップ；およびミニサークル核酸配列を含むミニサークルを産生するステップを含む方法を記載する。
図面中の要素のサイズおよび相対的位置は、必ずしも一定の縮尺で描かれるわけではない。例えば、種々の要素の形状、および角度は、一定の縮尺では描かれておらず、これらの要素の一部は、図面の読みやすさを改善するために、自由裁量によって拡大および配置される。さらに、描かれた要素の特定の形状は、その特定の要素の実際の形状に関していずれの情報も伝達する意図はなく、図面中での認識の容易さのためにのみ選択されたものである。
詳細な説明
ある特定の態様では、本開示は、産生されたＭＣが細菌制限修飾（ＲＭ）系によって分解されないように、その中のＤＮＡを差次的にメチル化する、操作されたミニサークル（ＭＣ）産生細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を提供する。関連の操作された構築物もまた記載される。さらに、ＭＣ ＤＮＡを産生するため、および標的細菌中への外因性ＤＮＡの形質転換効率を増加させるためにこれらの操作されたＥ．ｃｏｌｉを使用する方法、ならびにかかる方法における使用のためのキットが、本明細書に記載される。本明細書に記載される方法、合成構築物およびキットは、遺伝子操作の間の標的細菌のＲＭ系を克服するために使用され得る。有利なことには、本明細書に記載される方法、合成構築物およびキットは、以前には扱いにくかった細胞の形質転換を可能にする。
ある特定の態様では、本開示は、産生されたＭＣが細菌制限修飾（ＲＭ）系によって分解されないように、その中のＤＮＡを差次的にメチル化する、操作されたミニサークル（ＭＣ）産生細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を提供する。関連の操作された構築物もまた記載される。さらに、ＭＣ ＤＮＡを産生するため、および標的細菌中への外因性ＤＮＡの形質転換効率を増加させるためにこれらの操作されたＥ．ｃｏｌｉを使用する方法、ならびにかかる方法における使用のためのキットが、本明細書に記載される。本明細書に記載される方法、合成構築物およびキットは、遺伝子操作の間の標的細菌のＲＭ系を克服するために使用され得る。有利なことには、本明細書に記載される方法、合成構築物およびキットは、以前には扱いにくかった細胞の形質転換を可能にする。
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用されるある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。さらなる定義は、本開示を通じて示される。
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはそれらの組合せを指す。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成されるもの、およびライゲーション、開裂、エンドヌクレアーゼ作用またはエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成されるものを含む、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）。ある特定の実施形態では、本開示の核酸は、ＰＣＲによって産生される。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα－エナンチオマー形態）、またはそれら両方の組合せであるモノマーから構成され得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分またはピリミジンもしくはプリン塩基部分中に改変を有し得る、あるいは糖部分またはピリミジンもしくはプリン塩基部分の置き換えを有し得る。実施形態では、改変された核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。改変された核酸は、合成の、天然に存在するまたは天然に存在しない、参照の天然に存在する核酸と類似の結合特性を有し、参照核酸と類似の様式で代謝される、改変された骨格残基または連結を含み得る。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはかかる連結のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル連結のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート（例えば、キラルメチルホスホネート）、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド（2-0-methyl ribonucleotide）などが含まれる。種々の実施形態では、改変されたヌクレオチド間連結が使用される。改変されたヌクレオチド間連結は、当該分野で周知であり、これには、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏｎａｔｅ）、ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）およびリン酸エステル連結が含まれる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。さらに、核酸分子は、センスまたはアンチセンス鎖、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、天然に存在する分子、および全体的にまたは部分的に合成された核酸分子を指し得る。
用語「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、ヌクレオチドのヘテロポリマー中のヌクレオチドの順序を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。ペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、アミノ酸の最大数について制限はない。「ペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ペプチドのバリアント、改変されたペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が含まれる。ペプチドには、天然のペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組合せが含まれる。
「ペプチド配列」は、ペプチド中に存在するアミノ酸の順序を指す。
「バリアント」は、１つまたは複数の変更を含むヌクレオチドまたはペプチド配列である。言い換えると、バリアントは、参照配列とは、１つまたは複数の欠失、置換、付加または改変が異なる。かかる変更は、標準的な変異誘発技法、例えば、Adelman et al., 1983, DNA 2:183などに記載されるオリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発を使用して、容易に導入される。ヌクレオチドバリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは天然に存在しないバリアントであり得る。実施形態では、バリアント配列は、参照配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す。バリアントヌクレオチド配列の相補体は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
「変更」は、本明細書に記載されるものなどの、標準的な当該分野で公知の方法によって検出される核酸またはアミノ酸配列中の変化を意味する。変更（複数可）は、独立して、置換、欠失、付加または他の改変であり得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列中の変更は、保存的置換を含み、これには、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。他の実施形態では、核酸配列中の変更は、対応するアミノ酸配列において保存的置換を生じる。本明細書で使用される場合、変更には、参照配列と比較した、配列における５％の変化、１０％の変化、２５％の変化、４０％の変化または５０％の変化が含まれ得る。種々の実施形態では、変更には、配列の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％またはさらには１００％の変化が含まれる。実施形態では、変更には、ＲＭ標的配列の核酸配列における変化が含まれる。
「配列同一性」は、本明細書で使用される場合、配列をアラインさせ、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、参照配列中の残基と同一な、１つの配列中の核酸またはアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセンテージ配列同一性値は、デフォルト値に設定したパラメーターを用いた、Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs ", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402によって定義されるように、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２．０ソフトウェアを使用して生成され得る。「実質的に同一な」は、それぞれ参照アミノ酸配列または核酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すペプチドまたは核酸分子を指す。実施形態では、かかる配列は、アミノ酸または核酸レベルで、参照配列に対して少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一である。
標的配列に対して「実質的な同一性」を有する核酸分子は、典型的には、標的配列とハイブリダイズすることが可能である。
「参照」は、標準的な条件または対照条件を指す。
「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される規定された配列である。参照配列は、特定された配列のサブセットまたは全体；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列であり得る。種々の実施形態では、参照配列は、未変更のヌクレオチドまたはアミノ酸配列である。
用語「標的」、「標的配列」、「標的領域」および「標的核酸」は、本明細書で使用される場合、核酸の領域またはサブ配列（例えば、特定のメチルトランスフェラーゼによって認識および結合される核酸の領域）を指す。
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用される場合、核酸の第１鎖が塩基対合を介して核酸の第２鎖と結合する任意のプロセスを指す（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger, 1987, Methods Enzymol. 152:399；Kimmel, A. R., 1987, Methods Enzymol. 152:507を参照のこと）。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖間で、またはミスマッチのマイナーな領域を含む「実質的に相補的な」核酸鎖間で生じ得る。「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸塩基間の、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であり得る水素結合を指し得る。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対合する相補的な核酸塩基である。
一実施形態では、「ストリンジェントな条件」は、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液中での予洗；６５℃、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳでの一晩のハイブリダイゼーション；その後、６５℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での各々３０分間の２回の洗浄、および６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での各々３０分間の２回の洗浄を指す。
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、好ましくは、約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、より好ましくは、約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得られ得るが、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは、少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得られ得る。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約３０℃の、より好ましくは、少なくとも約３７℃の、最も好ましくは、少なくとも約４２℃の温度が含まれる。変動するさらなるパラメーター、例えば、ハイブリダイゼーション時間、洗剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの包含または除外は、当業者に周知である。種々のレベルのストリンジェンシーが、必要に応じてこれらの種々の条件を組み合わせることによって達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳ中で３０℃で行われる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中で３７℃で行われる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび２００１１ｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ中で４２℃で行われる。これらの条件に対する有用な変形形態は、当業者に容易に明らかである。
ほとんどの適用について、ハイブリダイゼーション後の洗浄ステップもまた、ストリンジェンシーを変える。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることによってまたは温度を増加させることによって、増加され得る。例えば、洗浄ステップのためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは、約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄ステップのためのストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約２５℃の、より好ましくは、少なくとも約４２℃の、さらにはより好ましくは、少なくとも約６８℃の温度が含まれる。好ましい実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中で２５℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中で６８℃で行われる。これらの条件についてのさらなる変形形態は、当業者に容易に明らかである。ハイブリダイゼーション技法は、当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977)；Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)；Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)；Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
他に示されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、および相補配列、ならびに明示的に示される配列もまた指し得る。具体的には、縮重コドン置換は、選択された１つもしくは複数の（または全ての）コドンの３番目の位置が適切な混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって、達成され得る（Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res, 19:081；Ohtsuka et al., 1985, 1 Biol. Chem., 260:2600-2608；Rossolini et al., 1994, Mol. Cell Probes, 8:91-98）。
「断片」は、ペプチドまたは核酸分子の一部分である。かかる部分は、参照ペプチドまたは核酸分子の全長の、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を含む。
用語「単離された」は、材料が、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合には、天然の環境）から取り出されていることを意味する。したがって、単離された生物学的材料は、一部のまたは全ての細胞成分、即ち、ネイティブ材料が天然に存在する細胞の成分（例えば、細胞質または膜成分）を含まないことができる。例えば、微生物中に存在する天然に存在する核酸は、単離されていないが、天然の系中で共存する材料の一部または全てから分離された同じ核酸は、単離されている。材料は、細胞抽出物または上清中に存在する場合、単離されたとみなすものとする。核酸分子の場合、単離された核酸には、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは制限断片が含まれる。
本明細書で使用される場合、「単離された核酸」は、天然に存在する生物の他の成分、例えば、細胞環境中の核酸および／または他の核酸と関連して一般に見出される細胞構造成分のうち少なくとも一部から分離されているまたはそれを実質的に含まない核酸を指す。したがって、核酸の単離は、周知の技法、例えば、細胞溶解、その後のフェノール＋クロロホルム抽出、その後の核酸のエタノール沈殿によって達成され得る。
「単離された核酸分子」は、遺伝子を含まない核酸（例えば、ＤＮＡ分子）であって、その核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノム中でその遺伝子に隣接する前記核酸（例えば、ＤＮＡ分子）もまた指す。実施形態では、単離された核酸は、染色体から切り出される。一部の実施形態では、単離された核酸は、染色体中に見出される場合に単離された核酸分子によって含まれる遺伝子の上流または下流に位置する他の遺伝子にもはや接続されておらず、近位でもない。さらなる実施形態では、単離された核酸は、非コード領域にもはや接続されておらず、近位でもないが、そのネイティブ調節領域またはその部分には接続されていてもよい。さらに別の実施形態では、単離された核酸は、１つまたは複数のイントロンを欠如する。単離された核酸には、例えば、ベクター中に；自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス中に；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれる；あるいは他の配列から独立した別々の分子（例えば、ｃＤＮＡ、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡが含まれる。さらに、単離された核酸分子には、ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子、ならびにさらなるペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡ分子が含まれる。単離された核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体など中に挿入された配列もまた含まれる。
核酸は、核酸を単離するための当該分野で周知の方法に従って、細胞から単離され得る。あるいは、本発明の核酸は、核酸を合成するための文献中に十分に記載された標準的なプロトコールに従って合成され得る。本発明の核酸に対する改変もまた、その核酸によってコードされるペプチドの本質的な構造および機能が維持されることを条件として、企図される。
「単離されたペプチド」は、ペプチドであって、それに天然に付随する成分から分離されたペプチドである。典型的には、ペプチドは、それが天然に関連する他のペプチドおよび天然に存在する有機分子を、少なくとも６０重量％含まない場合、「単離された」とみなされる。実施形態では、調製物は、少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％または少なくとも９９重量％の本発明のペプチドである。本発明の単離されたペプチドは、例えば、天然の供給源からの抽出によって、かかるペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；またはペプチドを化学的に合成することによって、得られ得る。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によって測定され得る。
用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、材料であって、無関係の材料、即ち、その材料が得られるネイティブ材料を含む夾雑物の存在を低減または排除する条件下で単離された材料を指す。例えば、精製されたＤＮＡは、組織培養成分、夾雑物などを含む細胞または培養成分を好ましくは実質的に含まない。本明細書で使用される場合、用語「実質的に含まない」は、材料の分析試験の観点から、運用上使用される。実施形態では、精製された材料は、少なくとも５０％純粋、少なくとも７５％純粋、少なくとも９０％純粋または少なくとも９９％純粋である場合、夾雑物を実質的に含まない。純度は、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー）、ゲル電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および当該分野で公知の他の方法によって評価され得る。実施形態では、「精製された」核酸またはペプチドは、電気泳動ゲルにおいて、本質的に１つのバンドを生じる。改変、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供され得るペプチドについて、異なる改変は、別々に精製され得る異なる単離されたペプチドを生じ得る。
特定の核酸およびペプチドを単離および精製するための技法は、当業者に周知である。本開示によれば、当業者の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技法が使用され得る。かかる技法は、文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を参照のこと。
「検出する」は、検出される分析物の存在、非存在または量を同定することを指す。
本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ」は、コンピューター上でまたはコンピューターシミュレーションを介して実施される作用を記載するために使用される形容詞である。例えば、「ヒトゲノムのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析」は、コンピューターを用いて実施されるヒトゲノム分析である。
用語「内因性」は、細菌において先天的にまたは天然に見出される材料（例えば、核酸、アミノ酸など）を指す。例えば、「内因性」酵素は、ゲノム中に天然にコードされ、標的細菌において発現される。
用語「外因性」は、標的細菌において先天的にも天然にも見出されない材料を指す。例えば、「外因性」核酸材料は、標的細菌の外側に由来し、標的細菌中に導入されている。
「同質遺伝子的（syngenic）」核酸は、内因性参照配列と比較して改変または変更を含む外因性核酸分子を指し、ここで、改変または変更は、目的の細菌細胞中に導入された場合に核酸分子が分解されないことを確実にするのに十分である。同質遺伝子的核酸分子は、人工形質転換の際に特定の細菌宿主内で内因性核酸分子としてそれが機能すること、および細菌ＲＭ防御によってそれが受容されることを可能にするのに十分な配列および後成的適合性を有する、操作された合成核酸分子を指し得る。
「発現ベクター」は、宿主細胞における特定の遺伝子の転写を可能にする一連の特定された核酸エレメントを保有する、組換えまたは合成により生成された核酸構築物である。典型的には、遺伝子発現は、構成的または誘導性プロモーター、組織優先的調節エレメント、およびエンハンサーを含む、ある特定の調節エレメントの制御下に置かれる。
「作動可能に連結した」は、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が第２の核酸分子に結合される場合に、第１の核酸分子が、第１の核酸分子の転写を指示する第２の核酸分子に隣接して配置されることを意味する。
「プロモーター」は、転写を開始するために使用される核酸配列を指す。本明細書で使用される場合、プロモーターは、プロモーターが動作可能に連結される核酸分子の少なくとも一部分の転写を指示する核酸配列を指す。実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始に十分な核酸配列を含む。さらに、プロモーターは、転写開始をモジュレートする配列、例えば、トランス作用性因子に対して応答性であり得るシス作用性エレメントを含み得る。例示的なプロモーターは、翻訳開始部位の上流（例えば、すぐ上流）にある約１００、２５０、３００、４００、５００、７５０、９００、１０００、１２５０および１５００ヌクレオチドの核酸配列を含む。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡから分離され、独立して複製することができる環状核酸分子である。プラスミドは、プラスミドを細胞中に導入することを意図した形質転換または他の手順の成功を示すために、選択可能なマーカーを含み得る。さらに、プラスミドは、核酸配列の挿入を可能にする複数の制限酵素コンセンサス部位を含むマルチクローニング部位を含み得る。プラスミドベクターは、目的の配列のクローニングを楽にし、それを増幅するために使用される、「クローニングベクター」または「ドナーベクター」であり得る。「発現ベクター」または「アクセプターベクター」と称される他のプラスミドベクターは、規定された標的細胞における目的の遺伝子の発現のために使用される。発現ベクターは、一般に、プロモーター、導入遺伝子およびターミネーター配列を含むまたはそれらからなる発現カセットを含む。実施形態では、発現ベクターは、異なる宿主細胞におけるそれらの増殖および選択を可能にするエレメントを含むシャトルプラスミドであり得る。
「ミニサークル」（ＭＣ）は、抗生物質耐性マーカーも細菌複製起点ももはや含まない、ＰＰ由来の小さい切り出された環状ＤＮＡ断片である。これらは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで使用され得、標準的なプラスミド中の細菌骨格によって引き起こされ得る免疫原性応答のリスクなしに１つまたは複数の導入遺伝子の長期の一過的な発現を提供する、小さい非ウイルス性のエピソーム性の発現ベクターである。ＭＣは、部位特異的組換え反応を介して、ＰＰから切り出される。ＭＣは、宿主細胞と共に複製せず、発現は、***細胞では１４日間またはそれよりも長く持続し得、非***細胞では数ヶ月間にわたって継続し得る。
本明細書で使用される場合、用語「ミニサークル産生」細菌は、親プラスミド（ＰＰ）の増殖およびＰＰからのミニサークル（ＭＣ）の産生の両方を可能にする細菌を指す。ＰＰは、挿入物の両方の末端において２つのリコンビナーゼ標的配列に挟まれている導入遺伝子挿入物を含む細菌プラスミドである。２つのリコンビナーゼ標的配列は、リコンビナーゼが細菌において誘導された場合の、挿入物のリコンビナーゼ媒介性切り出しを促進する。ＰＰは、その細菌複製起点およびさらに抗生物質耐性マーカーを有する、自己複製性のエピソーム性プラスミドである。ＰＰは、細菌において誘導性である特異的制限酵素のいくつかの制限部位もまた含むが、導入遺伝子挿入物は、特異的制限酵素のいずれの制限部位も含まない。リコンビナーゼおよび特異的制限酵素がＭＣ産生細菌において誘導される場合、導入遺伝子挿入物は、組換えによってＭＣとして切り出され、残存するＰＰは、誘導された特異的制限酵素によって分解される。これは、ＭＣが宿主ＰＰ ＤＮＡのいずれの夾雑も有さないことを確実にする。
「宿主細胞」は、クローニングベクターまたは発現ベクターを含む任意の原核生物または真核生物細胞であり得る。この用語は、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローニングされた遺伝子（複数可）を含むように遺伝子操作された原核生物または真核生物細胞もまた含む。
「メチルトランスフェラーゼ（Methytransferase）」は、その基質をメチル化する、即ち、基質にメチル基（－ＣＨ３）を付加する酵素を指す。実施形態では、メチルトランスフェラーゼは、認識配列内のアデニンまたはシトシン塩基にメチル基（－ＣＨ３）を付加する酵素であり、認識配列中にメチル基が存在しない場合にのみ切断するある特定のエンドヌクレアーゼから、認識配列を保護する。認識配列の例は、ＣＣＷＧＧ（式中、ＷはＡまたはＴである）、ＧＡＴＣおよびＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ（配列番号１）であり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、下線付きの塩基は、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。
デオキシアデノシンメチルトランスフェラーゼの略称であるＤＡＭメチルトランスフェラーゼは、ｄａｍ遺伝子、遺伝子ＩＤ ９４７８９３によってコードされる酵素である。ＤＡＭは、新たに合成されたＤＮＡ中の配列５’－ＧＡＴＣ－３’のアデニンにメチル基を付加する。ＤＡＭ（ＥＣ：２．１．１．７２）は、配列ＧＡＴＣ中のアデニン残基のＮ６位に、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からメチル基を転移させる。ＵｎｉＰｒｏｔ上のＤＡＭのタンパク質ＩＤは、ＰＯＡＥＥ８またはＤＭＡ ＥＣＯＬＩである。
デオキシシトシンメチルトランスフェラーゼの略称であるＤｃｍメチルトランスフェラーゼは、Ｍｅｃメチルトランスフェラーゼとしても公知であり、Ｄｃｍ遺伝子、遺伝子ＩＤ ９４６４７９によってコードされる酵素である。Ｄｃｍは、Ｃ５位において配列５’－ＣＣＡＧＧ－３’および５’－ＣＣＴＧＧ－３’［５’－ＣＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧ－３１中の内部（２番目の）シトシン残基にメチル基を付加する酵素（ＥＣ：２．１．１．３７）である。ＵｎｉＰｒｏｔ上のＤｃｍのタンパク質ＩＤは、ＰＯＡＥＤ９またはＤｃｍ ＥＣＯＬＩである。
ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼは、細菌におけるＩ型ＲＭ系の一部であるＤＮＡ－メチルトランスフェラーゼサブユニットＭであり、この酵素は、配列５’－ＡＡＣＮＮＮＮＮＮＧＴＧＣ－３’（配列番号１）中の２番目のアデニンにメチル基を付加する。ＨｓｄＭについての遺伝子ＩＤは、６２７６０２６である。ＵｎｉＰｒｏｔ上のＨｓｄＭのタンパク質ＩＤは、Ｂ１ＶＣＫ６またはＢ１ＶＣＫ６ ＥＣＯＬＸである。
細菌は、メチルトランスフェラーゼが実質的に存在しないまたは非機能的である場合、メチルトランスフェラーゼが「欠損」している。一部の実施形態では、メチルトランスフェラーゼの活性の少なくとも９０％が排除されている場合、メチルトランスフェラーゼは、実質的に存在しないまたは非機能的である。さらなる実施形態では、メチルトランスフェラーゼの活性の少なくとも９５％が排除されている場合、メチルトランスフェラーゼは、実質的に存在しないまたは非機能的である。具体的な実施形態では、細菌は、メチルトランスフェラーゼが存在しないまたは非機能的である場合、メチルトランスフェラーゼが欠損している。酵素の存在または活性を低減させるため、ならびに酵素をノックアウトするための種々の技法は、当業者に公知である。さらに、酵素の存在または活性を評価（例えば、定量）するための技法は、周知である。
本明細書で使用される場合、「非機能的」は、メチルトランスフェラーゼの観点から、触媒的に不活性な酵素を指す。言い換えると、酵素は、その酵素的触媒反応を実行することが不可能である、即ち、その基質にメチル基（－ＣＨ３）を付加しない。
用語「リコンビニアリング」は、例えば、記載される操作された細菌のｄａｍ、ＤｃｍまたはＨｓｄＭ遺伝子編集における、ｉｎ ｖｉｖｏ相同組換え媒介性遺伝子操作を指す。「ＣＲＩＳＰＲ媒介性リコンビニアリング」では、相同組換えは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連切断酵素系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される。ＣＲＩＳＰＲ系は、ゲノム中の規定された部位においてＤＮＡ二本鎖切断を促進する。次いで、これは、細胞中に導入された相同修復鋳型の存在下で細胞の先天的ＤＮＡ修復機構を活性化する。二本鎖切断は、所望のゲノム改変を含む改変された鋳型との相同組換えによって修復される。この方法で、ＤＮＡ挿入、欠失、点変異体、インフレーム導入遺伝子融合または任意の他の改変が、ゲノム中に操作され得る。
統計分析のある特定のツール（例えば、両側１標本ｔ検定、両側フィッシャー正確確率検定）が、本明細書で言及される。ある特定の実施形態では、本明細書で詳細に記載される改変された統計ツールが言及される。
明確に他が示されない限り、本明細書で使用される場合、用語「または」は、包括的であると理解される。特記されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、単数形または複数形であると理解される。
明確に他が示されない限り、本明細書で使用される場合、用語「約」は、当該分野の通常の許容差の範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内と理解される。用語「約」は、述べられた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内と理解され得る。文脈から明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに帰せられている意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る；「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は同様に、米国特許法において帰せられている意味を有し、この用語はオープンエンドであり、列挙されるものの基本的または新規の特徴が、列挙されるものよりも多くのものの存在によって変更されない限り、列挙されるものよりも多くのものの存在を許容するが、先行技術の実施形態は除外する。言い換えると、用語「～から本質的になる」は、請求項の範囲を、特定された材料もしくはステップに、または特許請求された発明の基本的特徴に実質的に影響を与えない材料もしくはステップに、限定する。例えば、ペプチドドメイン、領域もしくはモジュール（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、リンカーモジュール）またはペプチド（これは、１つまたは複数のドメイン、領域またはモジュールを有し得る）は、ドメイン、領域、モジュールまたはペプチドのアミノ酸配列が、組み合わせて、ドメイン、領域、モジュールまたはペプチドの長さの多くても２０％（例えば、多くても１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、ドメイン（複数可）、領域（複数可）、モジュール（複数可）またはペプチドの活性（例えば、結合ペプチドの標的結合親和性）に実質的に影響を与えない（即ち、５０％よりも大きくは活性を低減させない、例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％以下低減させる）伸長、欠失、変異、またはそれらの組合せ（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシ末端における、またはドメイン間のアミノ酸）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。
本明細書の変数の任意の定義における化学基の一覧表の列挙は、任意の単一の基または列挙された基の組合せとしての、その変数の定義を含む。本明細書の変数または態様についての実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその部分と組み合わせて、その実施形態を含む。
本明細書で提供される任意の組成物または方法は、本明細書で提供される他の組成物および方法のいずれかのうち１つまたは複数と組み合わされ得る。
本記載では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、他に示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合には、その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解される。また、任意の物理的特色、例えば、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さに関する、本明細書で列挙される任意の数範囲は、他に示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解される。本明細書で使用される場合、用語「約」は、他に示されない限り、示された範囲、値または構造の±２０％を意味する。用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書で使用される場合、数え上げられた成分のうち「１つまたは複数」を指すと理解すべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちいずれか１つ、両方、またはそれらの任意の組合せを意味すると理解すべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義語として使用され、これらの用語およびその異形は、非限定的と解釈されることが意図される。
さらに、本明細書に記載される構造および置換基の種々の組合せに由来する個々の化合物または化合物の群は、各化合物または化合物の群が個々に示されたのと同じ程度まで、本出願によって開示されると理解すべきである。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲内である。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、引き続いて記載される事象または状況が存在してもしなくてもよいこと、ならびにその記載が、この事象または状況が存在する場合および存在しない場合を含むことを意味する。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術範囲内に十分に入る、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を使用する。かかる技法は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)； "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)； "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)； "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)； "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)； "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)； "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)； "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)などの文献中で完全に説明されている。これらの技法は、本発明の核酸分子およびペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明を作製および実施する際に考慮され得る。特定の実施形態のために特に有用な技法は、以下のセクションで議論される。
操作された細菌およびその中で産生されるミニサークル
広い範囲の細菌種における使用に適切な、制限修飾（ＲＭ）系障壁を克服するための多用途の戦略が、本明細書に記載される。実施形態では、解決すべき問題は、存在するＲＭ系の数および認識される標的配列が、超可変であり、高度に種特異的であり、しばしば、さらには株特異的であるということである。したがって、その中のＤＮＡが差次的にメチル化される（例えば、メチル化なしの）ように少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが欠損した操作されたＭＣ産生細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ならびにＭＣ ＤＮＡを産生するためおよび標的細菌中に形質転換される場合に外因性ＤＮＡの形質転換効率を増加させるためにこれらの細菌を使用する方法が、本明細書に記載される。かかる方法における使用のためのキットもまた記載される。
広い範囲の細菌種における使用に適切な、制限修飾（ＲＭ）系障壁を克服するための多用途の戦略が、本明細書に記載される。実施形態では、解決すべき問題は、存在するＲＭ系の数および認識される標的配列が、超可変であり、高度に種特異的であり、しばしば、さらには株特異的であるということである。したがって、その中のＤＮＡが差次的にメチル化される（例えば、メチル化なしの）ように少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが欠損した操作されたＭＣ産生細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ならびにＭＣ ＤＮＡを産生するためおよび標的細菌中に形質転換される場合に外因性ＤＮＡの形質転換効率を増加させるためにこれらの細菌を使用する方法が、本明細書に記載される。かかる方法における使用のためのキットもまた記載される。
内容について述べると、遺伝的扱いにくさは、いくつかのモデル生物を超えて、基礎、合成および翻訳微生物学の研究および開発における障壁である。制限修飾（ＲＭ）系は、細菌種における遺伝的扱いにくさの最も一般的な、根底にある原因である。ＲＭ系は、細菌および他の原核生物において見出され、バクテリオファージが保有するものなどの外来ＤＮＡに対する防御を提供する。ＲＭ系により、細菌は、内因性（即ち、「自己」）を外因性（即ち、「非自己」）ＤＮＡから識別することが可能になる。ＲＭ系は、異なるアーキテクチャー（収束性または発散性）で組織化され、この緊密な調節を確実にする異なる特色、例えば、結合協同性、二量体化の解離定数、および翻訳率によって特徴付けられる。ＲＭ系は、細菌の大部分において遺伝的アプローチの使用を妨害し、株レベルのバリエーションを示す。
ＲＭ系は、一般に、２つの酵素：制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチルトランスフェラーゼを介して機能する。制限エンドヌクレアーゼは、特定の地点で二本鎖ＤＮＡを断片へと切断し、これらの断片は、次いで、他のエンドヌクレアーゼによってさらに分解される。これは、感染性因子（例えば、バクテリオファージ）によって導入された外来ＤＮＡを効率的に破壊することによって、感染を防止する。制限酵素によって認識される配列は非常に短いので、細菌自身が、そのゲノム内にいくつかをほぼ確実に含む。制限酵素によるそれ自身のＤＮＡの破壊を防止するために、メチル基が付加される。これらの修飾は、ＤＮＡ塩基対合を妨害すべきではなく、したがって、通常は、いくつかの特定の塩基のみが、各鎖上で修飾される。制限エンドヌクレアーゼは、高度に特異的なＤＮＡ標的配列においてＤＮＡのメチル化状態を認識し、外因性と同定されるメチル化されていないまたは不適切にメチル化された標的を分解する。制限エンドヌクレアーゼは、通常は４～６塩基対長でありしばしば回帰性であるＤＮＡ中の特異的配列を認識して初めて、内部ホスホジエステル結合を切断する。制限エンドヌクレアーゼ酵素は、標的配列認識において高度に特異的である。ＲＭ標的モチーフは、配列および長さが４～１８塩基対（ｂｐ）の範囲で大きく変動し、今日までに、４５０個よりも多くの異なるモチーフが同定されている。コグネートメチルトランスフェラーゼは、各部位を内因性としてマークするメチル基の付加を介して、宿主のゲノムにわたって同じ標的配列を保護する。
ＲＭ系は、それらの認識された標的モチーフ、サブユニット組成、切断位置、補因子要件および基質特異性に基づいて、４つの型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型）へと区別される酵素の極めて多様な群である。ＲＭ系の４つのカテゴリーは、制限酵素活性およびメチルトランスフェラーゼ活性を全てが有するＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ならびに制限酵素活性のみを有する（メチルトランスフェラーゼ活性を有さない）ＩＶ型、である。
Ｉ型系は、最も複雑であり、３つのペプチド：Ｒ（制限）、Ｍ（修飾）およびＳ（特異性）からなる。得られた複合体は、ＤＮＡを切断しかつメチル化することができる。両方の反応がＡＴＰを要求し、切断は、認識部位からかなりの距離で生じる場合が多い。Ｓサブユニットは、制限およびメチル化の両方の特異性を決定する。切断は、認識配列から可変の距離において生じ、したがって、別個のバンドは、ゲル電気泳動によって容易には可視化されない。
ＩＩ型系は、最も単純かつ最も普及している。複合体として作用するのではなく、メチルトランスフェラーゼおよびエンドヌクレアーゼは、２つの別々のペプチドとしてコードされ、独立して作用する（特異性ペプチドは存在しない）。両方のペプチドが同じ認識部位を認識し、したがって、活性について競合する。メチルトランスフェラーゼは、一度に二重鎖の１つの鎖をメチル化するモノマーとして作用する。エンドヌクレアーゼは、両方の鎖の切断を促進するホモダイマーとして作用する。切断は、認識配列の近くまたは認識配列内の規定された位置において生じ、したがって、ゲル電気泳動の間に別個の断片を生じる。この理由のために、ＩＩ型系は、ＤＮＡ分析および遺伝子クローニングのために、実験室において使用される。
ＩＩＩ型系は、修飾および切断の複合体を形成するＲ（制限）およびＭ（修飾）ペプチドを有する。しかし、Ｍペプチドは、単独でメチル化を行うことができる。また、メチル化は、ほとんどの他の公知の機構とは異なり、ＤＮＡの一方の鎖上でのみ生じる。ＲペプチドおよびＭペプチドによって形成されるヘテロダイマーは、同じ反応を修飾および制限することによって、それ自身と競合する。これは、不完全な消化を生じる。
ＩＶ型系は、制限酵素のみを含み、メチルトランスフェラーゼを含まないので、真のＲＭ系ではない。他の型とは異なり、ＩＶ型制限酵素は、修飾されたＤＮＡ、最も一般的には、メチル化されたＤＮＡのみを認識し、カットする。したがって、ＩＶ型制限酵素は、修飾依存的酵素である。
遺伝子操作の間のＲＭ系を克服するための現在利用可能なアプローチの、全てではないがほとんどは、バクテリオファージ抗制限機構によって触発される。宿主のＲＭ活性を覆すためのファージゲノムのメチル修飾が関与するバクテリオファージ機構は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作アプローチへとすでに転換されている。これらは全て、メチル化による模倣として言及され得るが、それは、これらが、所望の宿主にマッチし、分子模倣を達成するために、遺伝的ツールのメチル化パターンを改変することを本質的に求めているからである。２つの一般的なメチル化による模倣アプローチが存在する。（Ａ）４５０個よりも多くの公知の標的のうち３７個のみに対して現在市販されている組換えメチルトランスフェラーゼ酵素によるｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化を使用することによって、ツール上の標的部位をメチル化する。（Ｂ）あるいは、制限酵素欠損である関連の株、またはプラスミド人工修飾（ＰＡＭ）と呼ばれる目的の株のメチル化プロファイルと一致するように広範に操作された代理株を介してプラスミドを継代することによって、ｉｎ ｖｉｖｏメチル化を達成する。これらは、一部の場合には有効であるが、それらの根底にある設計の労働集約的かつ硬直的な性質のせいで、ＲＭ系の多様性に起因して他の株に容易には適応可能でない。
有利なことに、本発明者らは、外因性ＤＮＡが、宿主のＲＭ系に高度に特異的な標的認識モチーフを欠如する場合、それは、これらの系から見えなくなり、人工形質転換の間分解されないことを発見した。ＲＭ防御は、高度に特異的な標的モチーフのメチル化状態のおかげで、遺伝的ツールを異種ＤＮＡと認識するので（Vasu K, et al., (2012) Promiscuous restriction is a cellular defense strategy that confers fitness advantage to bacteria. Proc Natl Acad Sci USA 109(20):E1287-1293）、遺伝的ツールのヌクレオチド配列からのかかる標的モチーフの体系的同定および排除は、形質転換の際にＲＭ－サイレントである人工同系ＤＮＡ分子の操作による作製を促進する。したがって、細菌の先天的遺伝的防御によって特異的に認識されるある特定の配列モチーフ中のアデノシンおよびシトシン残基におけるメチル化を排除することによって、扱いにくい細菌のＩＶ型ＲＭ系においてであっても、扱いにくい細菌における外因性ＤＮＡの分解を防止することが可能である。これは、次に、扱いにくい細菌における外因性ＤＮＡの形質転換効率を改善し、扱いにくい細菌の遺伝子操作を促進する。
したがって、内因性メチルトランスフェラーゼが欠損し、それによって、（例えば、野生型と比較して）低減されたＤＮＡメチル化能力を有する操作されたＭＣ産生細菌が、本明細書で提供される。かかる細菌は、他の細菌、例えば、扱いにくい細菌中に次いで形質転換され得る差次的にメチル化された（例えば、メチル化なしの）ＭＣ ＤＮＡを産生する。
本明細書に記載される細菌株は、ＩＶ型ＲＭ系を含むＲＭ系を避けるのに有用である。ＩＶ型ＲＭ系の制限エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ認識配列においてメチル修飾された核酸を分解することに特化している。内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している新たな細菌株において核酸を増殖させることによって、核酸は、細菌のネイティブメチル化パターンを有さず、したがって、本質的に、ＩＶ型ＲＭ系からは見えない。
実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している。一部の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基をメチル化し、式中、ＷはＡまたはＴである。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、配列ＧＡＴＣ、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ（配列番号１）、またはそれら両方のアデノシン残基をメチル化する。さらなる実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、シトシン残基およびアデノシン残基をメチル化する。
一部の実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、少なくとも１つの内因性Ｄａｍ、ＤｃｍまたはＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが欠損している。これらのメチルトランスフェラーゼは、特異的ＤＮＡモチーフ配列中のアデノシンおよびシトシン残基にメチル基を付加する。具体的には、Ｄａｍは、新たに合成されたＤＮＡ中の配列５’－ＧＡＴＣ－３’のアデニンにメチル基を付加し、Ｄｃｍは、Ｃ５位において配列５’－ＣＣＡＧＧ－３’および５’－ＣＣＴＧＧ－３’［５’－ＣＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧ－３’］中の内部（２番目の）シトシン残基にメチル基を付加し、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼは、配列５’－ＡＡＣＮＮＮＮＮＮＧＴＧＣ－３’（配列番号１）中の２番目のアデニンにメチル基を付加する。種々の実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄａｍが欠損している。さらなる実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄｃｍが欠損している。さらなる実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、ＨｓｄＭが欠損している。具体的な実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄａｍ－／Ｄｃｍ＋／ＨｓｄＭ＋である。さらなる実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄａｍ＋／Ｄｃｍ－／ＨｓｄＭ＋である。他の実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄａｍ＋／Ｄｃｍ＋／ＨｓｄＭ－である。なおさらなる実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄａｍ－／Ｄｃｍ－／ＨｓｄＭ＋である。さらなる実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄａｍ－／Ｄｃｍ＋／ＨｓｄＭ－である。特定の実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄａｍ＋／Ｄｃｍ－／ＨｓｄＭ－である。なおさらなる実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄａｍ－／Ｄｃｍ－／ＨｓｄＭ－である。本明細書で使用される場合、負の記号は、細菌が、それぞれのメチルトランスフェラーゼが欠損していることを示し、正の記号は、細菌が、それぞれのメチルトランスフェラーゼが欠損していないことを示す。
実施形態では、１つまたは複数の内因性メチルトランスフェラーゼは、操作されたＭＣ産生細菌には存在しない。一部の実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、Ｄａｍ、ＤｃｍおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼのうち１つまたは複数を発現しない。即ち、これらのメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、発現されない。種々の実施形態では、ｄａｍ、Ｄｃｍおよび／またはＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、例えば、挿入、欠失、点変異体などによって、細菌ゲノムにおいて改変（例えば、変異）される。一部の実施形態では、改変は、アミノ酸配列が遺伝子から転写および翻訳されないような改変である。他の実施形態では、１つまたは複数の内因性メチルトランスフェラーゼは、操作されたＭＣ産生細菌において機能的ではない。実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、非機能的であるＤａｍ、ＤｃｍおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼのうち１つまたは複数を発現する、例えば、メチルトランスフェラーゼは、トランケート型である。
メチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｍ、Ｄｃｍ、ＨｓｄＭ）またはそれらの機能のために要求される関連遺伝子（例えば、配列モチーフ標的をコードする、Ｈｓｄ系の特異性サブユニットであるＨｓｄＳ）は、メチルトランスフェラーゼオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列中にインデルまたは新たな遺伝子を導入する線状／環状ＤＮＡカセットとの相同組換えを使用する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ操作、リコンビニアリング、自殺ベクターまたは中断を含むいくつかの遺伝子操作技法を使用して、欠失または遺伝子不活性化のために標的化され得る。これらの方法は、当該分野で公知である。例として、ＷＯ２０１４０４３６３７、ＷＯ２０１４１４３３８１、米国特許出願公開第２０１１００２７３１３号、米国特許第６８７２５４７号および米国特許出願公開第２００３０１２１０６８号を参照のこと。これらの公報の内容、特に関連する開示は、それらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
操作されたＭＣ産生細菌の一部の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子または関連遺伝子は、遺伝子編集によって、例えば、リコンビニアリングによって変異される。一実施形態では、リコンビニアリングは、当該分野で公知のＣＲＩＳＰＲ技術、例えば、Ｃａｓ９誘発性相同組換えによって媒介される。ＷＯ２０１４１４３３８１、ＷＯ２０１４０９３６９４、ＷＯ２０１５０１７８６６、ＷＯ２０１５０６５９６４および米国特許出願公開第２０１５００３１１３４号を参照のこと。これらの内容、特に関連する開示は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、無傷のやり方でメチルトランスフェラーゼＯＲＦを欠失させるためのλ－Ｒｅｄリコンビニアリングと、その後の、メチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ標的化を使用した首尾よい変異体についての選択（メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むクローンにとっては毒性であるが、首尾よくリコンビニアリングされたメチルトランスフェラーゼ欠損クローンは成長させる）との組合せが使用される。有利なことには、かかる組合せは、継続的な抗生物質選択を必要とせずに、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の操作されたＭＣ産生株の創出を可能にする。
さらに、上述のように、本開示の細菌は、ミニサークル（ＭＣ）を産生する。ＭＣは、全ての原核生物ベクター部分を含まない（have are free from）小さい（約４ｋｂ）環状プラスミド誘導体である。言い換えると、この環状ＤＮＡエレメントは、もはや、抗生物質耐性マーカーも細菌複製起点も含まない。これらの小さいベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで使用され得、標準的なプラスミド中の細菌骨格によって引き起こされ得る免疫原性応答のリスクなしに１つまたは複数の導入遺伝子の長期の一過的な発現を提供する。
ＭＣは、親プラスミド（ＰＰ）、ならびにＰＰの増殖およびＭＣの産生の両方を可能にする操作された細菌株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株）を使用して産生される。したがって、外因性核酸配列を含むＭＣ核酸配列を含むＰＰを含む操作された細菌であって、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌が、本明細書に記載される。実施形態は、外因性核酸配列を含むＭＣ核酸配列を含むＰＰを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌を含む。
種々の実施形態では、ＭＣの調製は、以下の通りである：（１）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、真核生物挿入物（例えば、扱いにくい細菌中に導入される外因性ＤＮＡ分子）を有する細菌プラスミドであるＰＰの産生および増殖；（２）Ｅ．ｃｏｌｉ内での部位特異的リコンビナーゼの誘導；（３）ＰＰ中の挿入物の末端におけるリコンビナーゼ標的配列を介した原核生物ベクター部分の切り出し；ならびに（４）キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）による、得られたＭＣの回収。
一部の実施形態では、ＭＣは、分子内（シス－）組換えを介した誘導性ΦＣ３１インテグラーゼの発現によって生成される。完全サイズのＭＣ－ＤＮＡ構築物を、ΦＣ３１インテグラーゼおよびＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを同時に発現するアラビノース誘導性の系を保有する宿主細菌株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株）において成長させる。ΦＣ３１インテグラーゼは、アラビノース誘導の際に、完全サイズのＰＰ－ＤＮＡからＭＣ－ＤＮＡ分子を産生する。ＰＰ－ＤＮＡは、ＰＰ－ＤＮＡのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ消化および最終的な破壊に供されるいくつかの操作されたＩ－ＳｃｅＩ制限部位を含む。ＭＣ－ＤＮＡは、インタクトなままであるように、Ｉ－ＳｃｅＩ制限部位を欠如する。ＰＰ－ＤＮＡ中にいくつかのＩ－ＳｃｅＩ部位を含むことによって、ＰＰ－ＤＮＡ夾雑なしに非常にきれいなＭＣ－ＤＮＡの産生が可能になる。実施形態では、操作された細菌株は、慣用的なプラスミドＤＮＡ調製のものと類似の時間枠および量で、精製されたＭＣ－ＤＮＡを産生する。ＭＣを作製する方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第２００６０２１１１１７号、米国特許出願公開第２００７００３１３７８号、米国特許第８９４５８８５号および米国特許出願公開第２０１５００３１１３４号。これらの全内容、特に関連する開示は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、操作されたＭＣ産生細菌は、その中のＰＰを増殖させることが可能であり、誘導の際にＰＰ由来の外因性ＤＮＡ配列を含むＭＣの産生を支持することが可能であるように、扱いにくい細菌中に導入される外因性ＤＮＡ分子を含むＰＰを含む。一部の実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼを含む。特定の実施形態では、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼは、アラビノースによって誘導される。誘導された発現されたΦＣ３１インテグラーゼは、ＰＰ由来の外因性ＤＮＡ配列を含むＭＣを切り出す。一部の実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼを含む。かかる実施形態では、誘導されたＩ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼは、ＭＣが切り出された後にＰＰ ＤＮＡを分解し、ＭＣに細菌ＤＮＡが夾雑しないようにする。具体的な実施形態では、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼは、アラビノースによって誘導される。一部の実施形態では、ＰＰ中の外因性ＤＮＡ配列は、Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼ認識配列を含まない。これは、産生されたＭＣが、ＰＰの残りと共に分解されないことを確実にする。一部の実施形態では、ＰＰ中の外因性ＤＮＡ配列は、Ｉ型ＲＭ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含まない。例えば、５’－ＣＣＡＹＮ６ＴＧＴ－３’（配列番号２）または５’－ＧＧＴＲＮ６ＡＣＡ－３’（配列番号３）（式中、Ｙ＝ＣまたはＴ、およびＲ＝ＡまたはＧである）。
さらなる実施形態は、外因性核酸配列を含むＭＣプラスミドを含む操作された細菌であって、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌を含む。実施形態は、外因性核酸配列を含むＭＣプラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌もまた含む。
さらに、本明細書に記載される操作されたＭＣ産生細菌または本明細書に記載される操作されたＭＣ産生細菌を含むキットから産生されたＭＣが、本明細書で提供される。
実施形態は、宿主細胞であって、宿主細胞にとって外因性である核酸配列を含むプラスミドを含み、外因性核酸配列が、参照Ｅ．ｃｏｌｉ細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、宿主細胞をさらに含む。
操作された細菌を使用する方法
本明細書に記載される操作された細菌を使用する種々の方法もまた、本明細書で提供される。例えば、
親プラスミドを、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損した操作された細菌中に形質転換するステップであって、親プラスミドが、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む、ステップ；および
ミニサークル核酸配列を含むミニサークルを産生するステップ
を含む方法が、提供される。
本明細書に記載される操作された細菌を使用する種々の方法もまた、本明細書で提供される。例えば、
親プラスミドを、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損した操作された細菌中に形質転換するステップであって、親プラスミドが、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む、ステップ；および
ミニサークル核酸配列を含むミニサークルを産生するステップ
を含む方法が、提供される。
本明細書に記載されるさらなる方法は、
本明細書に記載される操作された細菌において、外因性核酸配列を含むＭＣを産生するステップ；および
ＭＣを第２の細菌中に形質転換するステップであって、ＭＣが、第２の細菌中に形質転換された場合に、分解に対して耐性である、ステップ
を含む。
本明細書に記載される操作された細菌において、外因性核酸配列を含むＭＣを産生するステップ；および
ＭＣを第２の細菌中に形質転換するステップであって、ＭＣが、第２の細菌中に形質転換された場合に、分解に対して耐性である、ステップ
を含む。
目的の細菌中に形質転換された場合に分解に対して耐性である外因性ＤＮＡ分子を生成するための方法であって、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが欠損し、それによって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有する操作されたＭＣ産生細菌を提供するステップ、および本明細書に記載される操作されたＭＣ産生細菌から、外因性ＤＮＡをＭＣとして産生するステップであって、ＭＣが外因性ＤＮＡを含む、ステップを含む方法が、さらに記載される。一実施形態では、目的の細菌は、扱いにくい細菌である。一実施形態では、分解に対する耐性は、扱いにくい細菌のＩＶ型制限修飾（ＲＭ）系によって特異的に認識されるある特定のＤＮＡモチーフ中のアデノシンおよびシトシン残基におけるメチルなしのまたは差次的メチル化状態によって付与される。例えば、配列５’－ＣＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧ－３’（式中、Ｗ＝ＡまたはＴである）中の２番目のシトシン、および配列５’－ＧＡＴＣ－３’または５’－ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ－３’（配列番号１）中のアデノシンは、メチル化されない。一実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが欠損した操作されたＭＣ産生細菌は、外因性ＤＮＡ挿入物を含む親プラスミド（ＰＰ）を含む。一実施形態では、ＰＰ中の外因性ＤＮＡ挿入物は、挿入物の両方の末端において２つのリコンビナーゼ標的配列に挟まれている。一実施形態では、リコンビナーゼは、操作されたＭＣ産生細菌において誘導性のΦＣ３１インテグラーゼである。一実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌中のＰＰは、ＰＰ－ＤＮＡのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ消化および最終的な破壊に供されるいくつかの操作されたＩ－ＳｃｅＩ制限部位を含む。一実施形態では、ＰＰ中の外因性ＤＮＡ挿入物は、その発現が誘導される場合にＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼの存在下でインタクトなままであるように、Ｉ－ＳｃｅＩ制限部位を欠如する。一実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼを含む。一実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを含む。
別の態様では、本発明は、目的の細菌中に形質転換された場合に分解に対して耐性である外因性ＤＮＡを生成するための方法であって、（ａ）本明細書に記載される、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが欠損し、それによって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有する操作されたＭＣ産生細菌を提供するステップであって、細菌が、挿入物の両方の末端において２つのリコンビナーゼ標的配列に挟まれる外因性ＤＮＡ挿入物を含むＰＰを含む、ステップ；（ｂ）細菌においてリコンビナーゼの発現を誘導するステップ；および（ｂ）本明細書に記載される操作されたＭＣ産生細菌から、外因性ＤＮＡをＭＣとして産生するステップであって、ＭＣが、外因性ＤＮＡを含む、ステップを含む方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ＭＣを産生する組換え反応の後に残存するＰＰ ＤＮＡを分解するように、エンドヌクレアーゼの発現を誘導するステップをさらに含む。
別の態様では、目的の細菌中に形質転換される場合に外因性ＤＮＡの形質転換効率を改善する方法であって、この方法は、本明細書に記載される操作されたＭＣ産生細菌から、外因性ＤＮＡをＭＣとして産生するステップであって、ＭＣが外因性ＤＮＡを含む、ステップ、およびＭＣを目的の細菌中に形質転換するステップを含む。一実施形態では、目的の細菌は、扱いにくい細菌である。理論に束縛されることは望まないが、改善された形質転換効率は、レシピエント細菌のＩＶ型ＲＭ系による低減された分解に起因する。レシピエントのＩＶ型ＲＭ系は、特異的認識配列におけるメチル化を要求する。かかるメチル化が存在しない場合、レシピエント細菌は、形質転換された外因性ＤＮＡを外来ＤＮＡとして認識することができず、したがって、外因性ＤＮＡを分解しない。一実施形態では、レシピエント細菌中のＩＶ型ＲＭ系について、分解できないことまたは保護は、扱いにくい細菌のＩＶ型制限修飾（ＲＭ）系によって特異的に認識されるある特定のＤＮＡモチーフ中のアデノシンおよびシトシン残基におけるメチルなしのまたは差次的メチル化状態によって付与される。例えば、配列５’－ＣＣ（Ａ／Ｔ）ＷＧＧ－３’（式中、Ｗ＝ＡまたはＴである）中の２番目のシトシン、および配列５’－ＧＡＴＣ－３’または５’－ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ－３’（配列番号１）中のアデノシンは、メチル化されない。一実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが欠損した操作されたＭＣ産生細菌は、外因性ＤＮＡ挿入物を含むＰＰを含む。一実施形態では、ＰＰ中の外因性ＤＮＡ挿入物は、挿入物の両方の末端において２つのリコンビナーゼ標的配列に挟まれている。一実施形態では、リコンビナーゼは、操作されたＭＣ産生細菌において誘導性のΦＣ３１インテグラーゼである。一実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌中のＰＰは、ＰＰ－ＤＮＡのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ消化および最終的な破壊に供されるいくつかの操作されたＩ－ＳｃｅＩ制限部位を含む。一実施形態では、ＰＰ中の外因性ＤＮＡ挿入物は、その発現が誘導される場合にＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼの存在下でインタクトなままであるように、Ｉ－ＳｃｅＩ制限部位を欠如する。一実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼを含む。一実施形態では、操作されたＭＣ産生細菌は、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを含む。
種々の実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損するように、操作されたＭＣ産生細菌を、操作により作製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、操作するステップは、ＣＲＩＳＰＲ媒介性リコンビニアリングによって、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を編集するステップを含む。
細菌株において制限修飾（ＲＭ）系標的モチーフを同定する方法
特定の細菌株においてＲＭ系標的モチーフを同定する方法もまた、本明細書に記載される。細菌におけるメチルトランスフェラーゼによるＤＮＡの複製後修飾は、３つの型の後成的マーカー：Ｎ６－メチルアデニン（ｍ６Ａ）、Ｎ４－メチルシトシン（ｍ４Ｃ）および５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）を生じる（Johnston CD, et al., (2017) Restriction-modification mediated barriers to exogenous DNA uptake and incorporation employed by Prevotella intermedia. PLoS One 12(9):e0185234）。細菌ゲノムにわたるメチル化の完全なセットは、メチロームと称される。メチローム分析は、単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴｓｅｑ；ＰＡＣＢＩＯ（登録商標））を使用することによって達成され得る（Davis BM, et al., (2013) Entering the era of bacterial epigenomics with single molecule real time DNA sequencing. Current opinion in microbiology 16(2):192-198）。ＳＭＲＴｓｅｑの間、ポリメラーゼは、蛍光標識された塩基をＤＮＡ鋳型に付加し、一方で、配列決定機器は、付加された塩基の配列および連続的付加間の動態学的情報（ミリ秒）の両方を記録し、配列決定トレースを形成する。メチル化された塩基を含むＤＮＡ鋳型は、これらの部位においてポリメラーゼを行き詰らせ、配列トレースにおける遅延をもたらす。この動態学的情報は、それらの特徴的トレースに基づいてゲノムＤＮＡ中のメチル化（ｍ６Ａ、ｍ４Ｃまたはｍ５Ｃ）の特異的部位を同定するために使用される（Davis BM, et al., (2013) Entering the era of bacterial epigenomics with single molecule real time DNA sequencing. Current opinion in microbiology 16(2):192-198）。ＳＭＲＴｓｅｑ分析ソフトウェアは、メチル化されたモチーフの正確な配列、ゲノム上に存在するモチーフの数、およびメチル化されたモチーフのパーセンテージを要約する。
特定の細菌株においてＲＭ系標的モチーフを同定する方法もまた、本明細書に記載される。細菌におけるメチルトランスフェラーゼによるＤＮＡの複製後修飾は、３つの型の後成的マーカー：Ｎ６－メチルアデニン（ｍ６Ａ）、Ｎ４－メチルシトシン（ｍ４Ｃ）および５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）を生じる（Johnston CD, et al., (2017) Restriction-modification mediated barriers to exogenous DNA uptake and incorporation employed by Prevotella intermedia. PLoS One 12(9):e0185234）。細菌ゲノムにわたるメチル化の完全なセットは、メチロームと称される。メチローム分析は、単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴｓｅｑ；ＰＡＣＢＩＯ（登録商標））を使用することによって達成され得る（Davis BM, et al., (2013) Entering the era of bacterial epigenomics with single molecule real time DNA sequencing. Current opinion in microbiology 16(2):192-198）。ＳＭＲＴｓｅｑの間、ポリメラーゼは、蛍光標識された塩基をＤＮＡ鋳型に付加し、一方で、配列決定機器は、付加された塩基の配列および連続的付加間の動態学的情報（ミリ秒）の両方を記録し、配列決定トレースを形成する。メチル化された塩基を含むＤＮＡ鋳型は、これらの部位においてポリメラーゼを行き詰らせ、配列トレースにおける遅延をもたらす。この動態学的情報は、それらの特徴的トレースに基づいてゲノムＤＮＡ中のメチル化（ｍ６Ａ、ｍ４Ｃまたはｍ５Ｃ）の特異的部位を同定するために使用される（Davis BM, et al., (2013) Entering the era of bacterial epigenomics with single molecule real time DNA sequencing. Current opinion in microbiology 16(2):192-198）。ＳＭＲＴｓｅｑ分析ソフトウェアは、メチル化されたモチーフの正確な配列、ゲノム上に存在するモチーフの数、およびメチル化されたモチーフのパーセンテージを要約する。
したがって、種々の実施形態では、ＳＭＲＴｓｅｑ生成されたメチロームデータは、活性なＲＭ系を同定し、各系の制限エンドヌクレアーゼによって認識される特異的標的を推論するために使用される。細菌ゲノムでは、メチル化されたモチーフは、そのコグネート制限エンドヌクレアーゼから部位を保護するためにメチルトランスフェラーゼによってメチル化されたＲＭ系の標的認識配列、またはコグネート制限エンドヌクレアーゼを欠如し、調節活性に関与し得るオーファンメチルトランスフェラーゼによって導入された修飾のいずれかを示す（Murphy J, et al., (2013) Bacteriophage orphan DNA methyl transferases: insights from their bacterial origin, function, and occurrence. Applied and environmental microbiology 79(24):7547-7555）。これら２つの可能性の間を区別するために、定量的ＳＭＲＴｓｅｑメチロームデータが評価される。活性なＲＭ系は、ゲノム中のその標的モチーフのおよそ１００％をメチル化するが、それは、メチル化されていないモチーフが、染色体切断を導入して細菌細胞死を生じるコグネート制限エンドヌクレアーゼの基質だからである（Takahashi N, et al., (2002) Journal of bacteriology 184(22):6100-6108；Kobayashi I (1998) Trends Genet 14(9):368-374）。ＤＮＡ単離の間に活発に***している細胞における不完全な複製後メチル化の小さいマージンを許容することで、配列は、一部の実施形態では、モチーフの少なくとも９５％がメチル化される場合、活性なＲＭ系のための標的認識配列とみなされ得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、モチーフの少なくとも９５％がメチル化される場合に、メチル化されたモチーフが活性なＲＭ系のための標的認識配列であることを決定するステップを含む（図２Ａ）。さらなる実施形態では、メチル化されたモチーフは、モチーフの少なくとも９７％がメチル化される場合に、活性なＲＭ系のための標的認識配列であると決定される。なおさらなる実施形態では、メチル化されたモチーフは、モチーフの少なくとも９９％がメチル化される場合に、活性なＲＭ系のための標的認識配列であると決定される。
以下にさらに記載されるＲＥＢＡＳＥ分析は、疑わしいオーファンメチルトランスフェラーゼを確認するために使用される（Roberts RJ, et al., (2015) REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res 43(Database issue):D298-299）。したがって、一部の実施形態では、本開示の方法は、メチルトランスフェラーゼがオーファンであることを確認するステップをさらに含む。実施形態では、メチルトランスフェラーゼがオーファンであることを確認するステップは、同じ標的部位を有する制限エンドヌクレアーゼ遺伝子ホモログが、ゲノム座標に基づいて、メチルトランスフェラーゼから少なくとも１０遺伝子以上離れて検出されることを決定するステップを含む（Johnston CD, et al., (2017) PLoS One 12(9):e0185234；Seshasayee ASN, et al., (2012) Nucleic acids research 40(15):7066-7073）。したがって、株の活性なＲＭ系の標的配列の簡潔なリストが、選択された遺伝的ツールのＤＮＡ配列から排除される必要があるｉｎ ｓｉｌｉｃｏ標的で生成される。
目的の細菌株のメチロームを決定するためのさらなる方法、および改変された核酸分子を調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ＷＯ２０１８／０７１８４１を参照のこと。その全内容、特に関連する開示は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態では、本開示の方法は、細菌中に形質転換される外因性核酸分子を含む遺伝的ツールのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ配列適応をさらに含む。ＲＭ標的が遺伝的ツールのＤＮＡ配列中に存在する頻度は、標的モチーフの長さおよび塩基組成（ＧＣ対ＡＴ含量）に依存する。上で議論したように、標的モチーフは、配列および長さが４～１８塩基対（ｂｐ）の範囲で大きく変動し、今日までに、＞４５０個の異なるモチーフが同定されている（Roberts RJ, et al., (2015) Nucleic Acids Res 43(Database issue):D298-299）。ＲＭ系は、認識されるそれらの標的モチーフ、ならびにまた、それらのサブユニット組成、切断位置、補因子要件および基質特異性に基づいて、４つの型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型）に分類される（Vasu K, et al., (2013) Microbiol Mol Biol Rev 77(1):53-72）。Ｉ～ＩＩＩ型系は、例外を除き、標的配列が適切なメチル基を欠如する場合に、それを認識し、カットする。特徴的に、Ｉ型系は、６～８ｂｐの非特異的スペーサーギャップによって分離された２つの特異的半配列を含む不連続な二分割ＤＮＡモチーフ（bipartite DNA motif）を標的とする。最も特徴付けられた例の１つは、ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ（式中、Ｎは任意の塩基である）（配列番号１）を認識するＥｃｏＫＩ系である（Murray NE (2000) Microbiol Mol Biol Rev 64(2):412-434）。ＩＩ型系は、４ｂｐ（例えば、Ａｌｕｌ系のＡＧＣＴ（Zhang B, et al., (1993) Nucleic acids research 21(4):905-911)）から１５ｂｐ（例えば、ＸｃｍＩ系のＣＣＡＮ９ＴＧＧ（Gormley NA, et al., (2000) Journal of Biological Chemistry 275(10):6928-6936)）の範囲の連続したモチーフおよび非連続なモチーフの両方を標的とする多くの異なるサブシステムの集合体である。ＩＩＩ型系は、４ｂｐ（例えば、ＴｍｅＢＩＶ系のＣＧＣＣ（Roberts RJ, et al., (2015) Nucleic Acids Res 43(Database issue):D298-299)）から７ｂｐ（例えば、Ｂｐｅ１３７１系のＡＧＣＣＧＣＣ（Roberts RJ, et al., (2015) Nucleic Acids Res 43(Database issue):D298-299)）までの範囲の短い連続した非対称な標的を認識する。非コード領域内に存在するＩ～ＩＩＩ型ＲＭ系の標的は、一塩基多型（ＳＮＰ）を使用して容易に排除され得るが、コード領域中に存在するものは、同義コドンスイッチを要求する（図２Ｂ）。
多くの遺伝的ツールは、複数の細菌種（通常、Ｅ．ｃｏｌｉおよび別の所望の宿主種の実験室株）においてそれらが動作するのを可能にする２つの異なる機能的レプリコン（複製起点およびアクセサリー遺伝子）から構成される二重宿主範囲プラスミド（即ち、シャトルベクター）である。２つのレプリコンの活性は、通常、細菌宿主株に依存して分配される。Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて遺伝的ツールを増殖させる場合に活性であるが、他のレプリコンは、所望の宿主株に伝播されるまで不活性なままであり、そのとき、Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンは、次いで不活性になる。
特に、細菌は、同等でない頻度で同義コドンを使用し、一部は、コドンバイアスとして公知の、翻訳の効率および精度についての自然選択によって、他よりも好まれる（Ermolaeva MD (2001) Curr Issues Mol Biol 3(4):91-97）。したがって、遺伝的ツール内のＲＭ標的をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで排除する場合の稀なまたは好ましくないコドンの導入を回避するために、実施形態では、本開示の方法は、各標的モチーフが存在するレプリコンを識別するステップ、およびその特定の宿主のコドンバイアスに対応する同義置換を導入するステップをさらに含む。コドンバイアスは、ＳＭＲＴｓｅｑによって生成された宿主のゲノムのアノテーションおよび分析によって決定され得る。
例えば、ｐＥＰＳＡ５プラスミド（Forsyth RA, et al. (2002) Mol Microbiol 43(6):1387-1400）は、２．５ｋｂのＥ．ｃｏｌｉレプリコン（アンピシリン耐性遺伝子および低コピー数ｐｌ５ａ自律複製起点）および４．３ｋｂのＳ．ａｕｒｅｕｓレプリコン（クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐＣ１９４由来起点およびキシロースリプレッサータンパク質遺伝子ｘｙｌＲ）を含むＥ．ｃｏｌｉ－Ｓ．ａｕｒｅｕｓシャトルベクターである（図９Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓレプリコンは、ｐＥＰＳＡ５が維持され、Ｅ．ｃｏｌｉ内で増殖される場合には非機能的であり、逆もまた同様である。したがって、ｐＥＰＳＡ５ Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンのコード領域内に存在するＲＭ標的は、当該分野で公知であり本明細書に記載されるＥ．ｃｏｌｉコドンバイアスに忠実な同義置換で改変される。さらに、ＲＭ標的モチーフが市販のメチルトランスフェラーゼ酵素に対応する場合、ヌクレオチド置換を介したかかる標的の排除ではなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化（ｄｅ ｎｏｖｏ合成の下流）が、使用され得る。これは、必要な置換の総数を減少させ、好ましくない変更を導入する可能性を低減させる。しかし、今日までに同定されたモチーフのうち、これらの標的のうち３７個のみが、入手可能なメチルトランスフェラーゼ酵素によって表される。さらに、市販のもののうち１６個のみが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡメチル化に有用な単離されたメチルトランスフェラーゼ酵素である（表６）。残り２１個の酵素は、それぞれ酵素的修飾および制限活性について競合するメチルトランスフェラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼサブユニットと共に、ＲＭ複合体として存在する（Roberts RJ, et al., (2015) REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res 43(Database issue):D298-299）。それにもかかわらず、メチルトランスフェラーゼが入手可能な場合、全ての他のＲＭ標的は、遺伝的ツールを生成するためにｉｎ ｓｉｌｉｃｏで排除され得、その後、形質転換前にｉｎ ｖｉｔｒｏでメチル化され得る。
上で詳述したＩ～ＩＩＩ型系とは対照的に、ＩＶ型制限系は、メチルトランスフェラーゼを欠如し、その代わり、それらの短い標的モチーフ内にメチル化された塩基、ヒドロキシメチル化された塩基またはグルコシル－ヒドロキシメチル化された塩基を有するＤＮＡ配列のみを切断するメチル依存的制限エンドヌクレアーゼ酵素から構成される。これらの系は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ系ＳａｕＵＳＩ（Xu SY, et al. (2011) Nucleic Acids Res 39(13):5597-5610）（図２Ａ）；Ｓ５ｍＣＮＧＳ（ｍ５Ｃまたは５ｈｍＣのいずれか）（式中、ＳはＣまたはＧである）を標的とする修飾されたシトシン制限系、によって例示される。細菌宿主におけるかかる系の存在は、形質転換効率に対するそれらの抑制的効果に起因して、遺伝子操作にとって重要な意味を有する（図２Ｄ）。ＲＥＢＡＳＥにおいて推定ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼとのホモログについてスクリーニングすることによって、ゲノム中のＩＶ型系の存在を検出することは、比較的単純である（Roberts RJ, et al., (2015) Nucleic Acids Res 43(Database issue):D298-299）。しかし、ＩＶ型系標的モチーフの同定は、宿主ゲノムＤＮＡ上の標示的な後成的修飾の非存在のせいで、ＳＭＲＴｓｅｑおよびメチローム分析を介してそれらの標的モチーフを決定することができないので、Ｉ～ＩＩＩ型系についてよりも、本質的に困難である（Johnston CD, et al. (2017) PLoS One 12(9):e0185234）。それにもかかわらず、ＩＶ型系の意図しない活性化は、ＤＮＡをメチル化しない中間Ｅ．ｃｏｌｉ宿主（Ｄａｍ－、Ｄｃｍ－、ＨｓｄＲＭＳ－）（Anton BP, et al. (2015) PLoS One 10(5):e0127446）におけるＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡベースのツールの増殖によって回避され得、そうして、存在する任意のＩＶ型系による認識および分解を回避する。このように、細菌宿主内に存在する特異的ＲＭ障壁の体系的同定は、遺伝子操作の間のこれらの障壁を回避するように調整された戦略の開発を促進する。いったん開発されると、この戦略は、次いで、同じ宿主株のためのさらなるＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡベースの遺伝的ツールを創出するために再適用され得る。
キット
本開示は、差次的にメチル化された（例えば、メチル化なしの）ＭＣを産生するために使用され得るキットをさらに提供する。かかるキットは、本明細書に記載される操作されたＭＣ産生細菌を含む。実施形態では、キットは、差次的にメチル化されたＭＣを産生するために操作されたＭＣ産生細菌を使用することに関する、指示書（written instruction）をさらに含む。種々の実施形態では、指示書は、キット内に提供される印刷された指示（instruction）の形態であり得、または指示書は、キットを収容する容器の一部分上に印刷され得る。指示書は、シート、パンフレット、冊子、ＣＤ－Ｒｏｍもしくはコンピューター可読デバイスの形態であり得、またはウェブサイトなどの遠隔位置に指示を配置するための指示（direction）を提供し得る。指示書は、英語および／または各国語もしくは地方言語であり得る。
本開示は、差次的にメチル化された（例えば、メチル化なしの）ＭＣを産生するために使用され得るキットをさらに提供する。かかるキットは、本明細書に記載される操作されたＭＣ産生細菌を含む。実施形態では、キットは、差次的にメチル化されたＭＣを産生するために操作されたＭＣ産生細菌を使用することに関する、指示書（written instruction）をさらに含む。種々の実施形態では、指示書は、キット内に提供される印刷された指示（instruction）の形態であり得、または指示書は、キットを収容する容器の一部分上に印刷され得る。指示書は、シート、パンフレット、冊子、ＣＤ－Ｒｏｍもしくはコンピューター可読デバイスの形態であり得、またはウェブサイトなどの遠隔位置に指示を配置するための指示（direction）を提供し得る。指示書は、英語および／または各国語もしくは地方言語であり得る。
かかるキットは、１つもしくは複数のさらなる試薬、アッセイ対照、またはＭＣを産生するために必要な他の供給品、例えば、アンプル、バイアル、管、管類（tubing）、ピペット、フェイスマスク、針なし流体移行デバイス、スポンジ、無菌接着ストリップ、Ｃｈｌｏｒａｐｒｅｐ、手袋などをさらに含み得る。本明細書に記載されるキットのいずれかの内容物における変形形態が実現され得る。種々の実施形態では、キットの内容物は、コンパクトな容器中に提供される。
実施形態：
本開示の種々の実施形態が、本明細書に記載される。各実施形態において特定された特色は、本開示のさらなる実施形態を提供するために、他の特定された特色と組み合わされ得ることが認識される。
１．外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む親プラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌。
２．外因性核酸配列を含むミニサークルプラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌。
３．外因性核酸配列が、操作された細菌と同じ種の参照細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、実施形態１または２に記載の操作された細菌。
４．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の操作された細菌。
５．少なくとも内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変が、トランケート型メチルトランスフェラーゼを産生する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の操作された細菌。
６．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基をメチル化し、式中、ＷがＡまたはＴである、実施形態１～５のいずれか１つに記載の操作された細菌。
７．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＧＡＴＣ、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ、またはそれら両方のアデノシン残基をメチル化する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の操作された細菌。
８．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、シトシン残基およびアデノシン残基をメチル化する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の操作された細菌。
９．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの組合せを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１０．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９に記載の操作された細菌。
１１．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９または１０のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１２．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１１のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１３．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＤｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１２のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１４．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１３のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１５．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１４のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１６．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１５のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１７．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態９～１６のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１８．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態９～１６のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１９．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態９～１８のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２０．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態９～１８のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２１．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態９～２０のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２２．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態９～２０のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２３．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２４．親プラスミドが、ミニサークル核酸配列の外側に複数の制限部位を含む、実施形態１または３～２３のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２５．誘導性ΦＣ３１インテグラーゼをさらに含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２６．誘導性ΦＣ３１インテグラーゼが、アラビノースによって誘導される、実施形態２５に記載の操作された細菌。
２７．誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２８．誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼが、アラビノースによって誘導される、実施形態２７に記載の操作された細菌。
２９．実施形態１～２８のいずれか１つに記載の操作された細菌を含むキット。
３０．実施形態１～２８のいずれか１つに記載の操作された細菌または実施形態２９に記載のキットから産生されたミニサークル（ＭＣ）プラスミド。
３１．実施形態１～２８のいずれか１つに記載の操作された細菌である第１の細菌において、外因性ＤＮＡ配列を含むミニサークルを産生するステップ；および
ミニサークルを第２の細菌中に形質転換するステップであって、ミニサークルが、第２の細菌中に形質転換された場合に、分解に対して耐性である、ステップ
を含む方法。
３２．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損するように、第１の細菌を操作するステップをさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
３３．操作するステップが、ＣＲＩＳＰＲ媒介性リコンビニアリングによって、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を編集するステップを含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．親プラスミドを、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損した操作された細菌中に形質転換するステップであって、親プラスミドが、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む、ステップ；および
ミニサークル核酸配列を含むミニサークルを産生するステップ
を含む方法。
３５．外因性核酸配列が、操作された細菌と同じ種の参照細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、実施形態３４に記載の方法。
３６．操作された細菌が、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変を含む、実施形態３４または３５に記載の方法。
３７．少なくとも内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変が、トランケート型メチルトランスフェラーゼを産生する、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基をメチル化し、式中、ＷがＡまたはＴである、実施形態３４～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＧＡＴＣ、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ、またはそれら両方のアデノシン残基をメチル化する、実施形態３４～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、シトシン残基およびアデノシン残基をメチル化する、実施形態３４～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの組合せを含む、実施形態３４～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１に記載の方法。
４３．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１または４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＤｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態３８～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態３８～４８のいずれか１つに記載の方法。
５１．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態３８～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態３８～５０のいずれか１つに記載の方法。
５３．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態３８～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態３８～５２のいずれか１つに記載の方法。
５５．操作された細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、実施形態３４～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．親プラスミドが、ミニサークル核酸配列の外側に複数の制限部位を含む、実施形態３４～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．操作された細菌が、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼをさらに含む、実施形態３４～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．誘導性ΦＣ３１インテグラーゼが、アラビノースによって誘導される、実施形態５７に記載の方法。
５９．操作された細菌が、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態３４～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼが、アラビノースによって誘導される、実施形態５９に記載の方法。
６１．宿主細胞であって、宿主細胞にとって外因性である核酸配列を含むプラスミドを含み、外因性核酸配列が、参照Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、宿主細胞。
６２．プラスミドが、細菌複製起点を欠如する、実施形態６１に記載の宿主細胞。
６３．プラスミドが、抗生物質耐性マーカーを欠如する、実施形態６１に記載の宿主細胞。
６４．プラスミドがミニサークルである、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の宿主細胞。
６５．プラスミドが親プラスミドである、実施形態６１に記載の宿主細胞。
６６．親プラスミドが、細菌複製起点、抗生物質耐性マーカー、またはそれら両方を含む、実施形態６５に記載の宿主細胞。
６７．少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが欠損し、それによって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有する、操作されたミニサークル産生細菌。
６８．少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍ、ＤｃｍおよびＨｓｄＭからなる群から選択される、実施形態６７に記載の操作された細菌。
６９．ＤＮＡ中の配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基においてメチル化せず、式中、ＷがＡまたはＴである、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７０．ＤＮＡ中の配列ＧＡＴＣもしくは配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣのアデノシン残基、またはそれら両方の配列のアデノシン残基においてメチル化しない、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７１．ＤＮＡ中のシトシン残基およびアデノシン残基の両方においてメチル化しない、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７２．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを欠いている、または非機能的Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを有する、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７３．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを欠いている、または非機能的Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを有する、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７４．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを欠いている、または非機能的ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを有する、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７５．ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＤｃｍメチルトランスフェラーゼを欠いている、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７６．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを欠いている、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７７．少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲ媒介性リコンビニアリングによって編集される、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７８．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７９．実施形態１～７８に記載の操作された細菌を含む、メチル化なしのミニサークルプラスミドを産生するためのキット。
８０．実施形態６７～７８に記載の操作された細菌または実施形態７９に記載のキットから産生されたミニサークル（ＭＣ）プラスミド。
８１．目的の細菌中に形質転換された場合に分解に対して耐性である外因性ＤＮＡを生成するための方法であって、
実施形態６７～７８のいずれか１つに記載の操作された細菌からミニサークルプラスミドを産生するステップであって、ミニサークルプラスミドが、外因性ＤＮＡを含む、ステップ；および
ミニサークルプラスミドを目的の細菌中に形質転換するステップ
を含む方法。
本開示の種々の実施形態が、本明細書に記載される。各実施形態において特定された特色は、本開示のさらなる実施形態を提供するために、他の特定された特色と組み合わされ得ることが認識される。
１．外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む親プラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌。
２．外因性核酸配列を含むミニサークルプラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌。
３．外因性核酸配列が、操作された細菌と同じ種の参照細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、実施形態１または２に記載の操作された細菌。
４．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の操作された細菌。
５．少なくとも内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変が、トランケート型メチルトランスフェラーゼを産生する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の操作された細菌。
６．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基をメチル化し、式中、ＷがＡまたはＴである、実施形態１～５のいずれか１つに記載の操作された細菌。
７．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＧＡＴＣ、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ、またはそれら両方のアデノシン残基をメチル化する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の操作された細菌。
８．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、シトシン残基およびアデノシン残基をメチル化する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の操作された細菌。
９．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの組合せを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１０．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９に記載の操作された細菌。
１１．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９または１０のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１２．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１１のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１３．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＤｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１２のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１４．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１３のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１５．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１４のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１６．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態９～１５のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１７．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態９～１６のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１８．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態９～１６のいずれか１つに記載の操作された細菌。
１９．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態９～１８のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２０．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態９～１８のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２１．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態９～２０のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２２．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態９～２０のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２３．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２４．親プラスミドが、ミニサークル核酸配列の外側に複数の制限部位を含む、実施形態１または３～２３のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２５．誘導性ΦＣ３１インテグラーゼをさらに含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２６．誘導性ΦＣ３１インテグラーゼが、アラビノースによって誘導される、実施形態２５に記載の操作された細菌。
２７．誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の操作された細菌。
２８．誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼが、アラビノースによって誘導される、実施形態２７に記載の操作された細菌。
２９．実施形態１～２８のいずれか１つに記載の操作された細菌を含むキット。
３０．実施形態１～２８のいずれか１つに記載の操作された細菌または実施形態２９に記載のキットから産生されたミニサークル（ＭＣ）プラスミド。
３１．実施形態１～２８のいずれか１つに記載の操作された細菌である第１の細菌において、外因性ＤＮＡ配列を含むミニサークルを産生するステップ；および
ミニサークルを第２の細菌中に形質転換するステップであって、ミニサークルが、第２の細菌中に形質転換された場合に、分解に対して耐性である、ステップ
を含む方法。
３２．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損するように、第１の細菌を操作するステップをさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
３３．操作するステップが、ＣＲＩＳＰＲ媒介性リコンビニアリングによって、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を編集するステップを含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．親プラスミドを、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損した操作された細菌中に形質転換するステップであって、親プラスミドが、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む、ステップ；および
ミニサークル核酸配列を含むミニサークルを産生するステップ
を含む方法。
３５．外因性核酸配列が、操作された細菌と同じ種の参照細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、実施形態３４に記載の方法。
３６．操作された細菌が、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変を含む、実施形態３４または３５に記載の方法。
３７．少なくとも内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変が、トランケート型メチルトランスフェラーゼを産生する、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基をメチル化し、式中、ＷがＡまたはＴである、実施形態３４～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＧＡＴＣ、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ、またはそれら両方のアデノシン残基をメチル化する、実施形態３４～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、シトシン残基およびアデノシン残基をメチル化する、実施形態３４～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの組合せを含む、実施形態３４～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１に記載の方法。
４３．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１または４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＤｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態４１～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態３８～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態３８～４８のいずれか１つに記載の方法。
５１．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態３８～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態３８～５０のいずれか１つに記載の方法。
５３．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが存在しない、実施形態３８～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが非機能的である、実施形態３８～５２のいずれか１つに記載の方法。
５５．操作された細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、実施形態３４～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．親プラスミドが、ミニサークル核酸配列の外側に複数の制限部位を含む、実施形態３４～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．操作された細菌が、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼをさらに含む、実施形態３４～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．誘導性ΦＣ３１インテグラーゼが、アラビノースによって誘導される、実施形態５７に記載の方法。
５９．操作された細菌が、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態３４～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼが、アラビノースによって誘導される、実施形態５９に記載の方法。
６１．宿主細胞であって、宿主細胞にとって外因性である核酸配列を含むプラスミドを含み、外因性核酸配列が、参照Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、宿主細胞。
６２．プラスミドが、細菌複製起点を欠如する、実施形態６１に記載の宿主細胞。
６３．プラスミドが、抗生物質耐性マーカーを欠如する、実施形態６１に記載の宿主細胞。
６４．プラスミドがミニサークルである、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の宿主細胞。
６５．プラスミドが親プラスミドである、実施形態６１に記載の宿主細胞。
６６．親プラスミドが、細菌複製起点、抗生物質耐性マーカー、またはそれら両方を含む、実施形態６５に記載の宿主細胞。
６７．少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが欠損し、それによって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有する、操作されたミニサークル産生細菌。
６８．少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍ、ＤｃｍおよびＨｓｄＭからなる群から選択される、実施形態６７に記載の操作された細菌。
６９．ＤＮＡ中の配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基においてメチル化せず、式中、ＷがＡまたはＴである、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７０．ＤＮＡ中の配列ＧＡＴＣもしくは配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣのアデノシン残基、またはそれら両方の配列のアデノシン残基においてメチル化しない、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７１．ＤＮＡ中のシトシン残基およびアデノシン残基の両方においてメチル化しない、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７２．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを欠いている、または非機能的Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを有する、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７３．Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを欠いている、または非機能的Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを有する、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７４．ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを欠いている、または非機能的ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを有する、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７５．ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＤｃｍメチルトランスフェラーゼを欠いている、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７６．Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを欠いている、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７７．少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲ媒介性リコンビニアリングによって編集される、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７８．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、実施形態６７に記載の操作された細菌。
７９．実施形態１～７８に記載の操作された細菌を含む、メチル化なしのミニサークルプラスミドを産生するためのキット。
８０．実施形態６７～７８に記載の操作された細菌または実施形態７９に記載のキットから産生されたミニサークル（ＭＣ）プラスミド。
８１．目的の細菌中に形質転換された場合に分解に対して耐性である外因性ＤＮＡを生成するための方法であって、
実施形態６７～７８のいずれか１つに記載の操作された細菌からミニサークルプラスミドを産生するステップであって、ミニサークルプラスミドが、外因性ＤＮＡを含む、ステップ；および
ミニサークルプラスミドを目的の細菌中に形質転換するステップ
を含む方法。
本発明の実施形態は、以下の実施例によってさらに例示される。
本開示の実施形態は、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む親プラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌を含む。
本開示は、外因性核酸配列を含むミニサークルプラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌の実施形態をさらに含む。
実施形態では、外因性核酸配列は、操作された細菌と同じ種の参照細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する。
実施形態では、操作された細菌は、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変を含む。一部の実施形態では、少なくとも内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変は、トランケート型メチルトランスフェラーゼを産生する。
さらなる実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基をメチル化し、式中、ＷはＡまたはＴである。種々の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、配列ＧＡＴＣ、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ、またはそれら両方のアデノシン残基をメチル化する。一部の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、シトシン残基およびアデノシン残基をメチル化する。
さらなる実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの組合せを含む。種々の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＤｃｍメチルトランスフェラーゼを含む。種々の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む。種々の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼは、存在しない。他の実施形態では、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼは、非機能的である。さらなる実施形態では、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼは、存在しない。他の実施形態では、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼは、非機能的である。なおさらなる実施形態では、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼは、存在しない。代替的な実施形態では、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼは、非機能的である。
実施形態では、操作された細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。一部の実施形態では、親プラスミドは、ミニサークル核酸配列の外側に複数の制限部位を含む。特定の実施形態では、操作された細菌は、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼをさらに含む。具体的な実施形態では、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼは、アラビノースによって誘導される。さらなる実施形態では、操作された細菌は、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼをさらに含む。特定の実施形態では、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼは、アラビノースによって誘導される。
本開示のさらなる実施形態は、本明細書に記載される操作された細菌を含むキットを含む。本明細書に記載される操作された細菌またはキットから産生されたミニサークル（ＭＣ）プラスミドもまた、本明細書に記載される。
本開示の実施形態は、宿主細胞であって、宿主細胞にとって外因性である核酸配列を含むプラスミドを含み、外因性核酸配列が、参照Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、宿主細胞をさらに含む。
一部の実施形態では、プラスミドは、細菌複製起点を欠如する。一部の実施形態では、プラスミドは、抗生物質耐性マーカーを欠如する。特定の実施形態では、プラスミドは、ミニサークルである。他の実施形態では、プラスミドは、親プラスミドである。一部の実施形態では、親プラスミドは、細菌複製起点、抗生物質耐性マーカー、またはそれら両方を含む。
本明細書に記載される操作された細菌である第１の細菌において、外因性ＤＮＡ配列を含むミニサークルを産生するステップ；および
ミニサークルを第２の細菌中に形質転換するステップであって、ミニサークルが、第２の細菌中に形質転換された場合に、分解に対して耐性である、ステップ
を含む方法が、本明細書にさらに記載される。
ミニサークルを第２の細菌中に形質転換するステップであって、ミニサークルが、第２の細菌中に形質転換された場合に、分解に対して耐性である、ステップ
を含む方法が、本明細書にさらに記載される。
種々の実施形態では、この方法は、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損するように、第１の細菌を操作するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、操作するステップは、ＣＲＩＳＰＲ媒介性リコンビニアリングによって、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を編集するステップを含む。
本開示は、親プラスミドを、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損した操作された細菌中に形質転換するステップであって、親プラスミドが、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む、ステップ；およびミニサークル核酸配列を含むミニサークルを産生するステップを含む方法をさらに記載する。
種々の実施形態では、外因性核酸配列は、操作された細菌と同じ種の参照細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する。
一部の実施形態では、操作された細菌は、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変を含む。一部の実施形態では、少なくとも内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変は、トランケート型メチルトランスフェラーゼを産生する。
特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基をメチル化し、式中、ＷはＡまたはＴである。具体的な実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、配列ＧＡＴＣ、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ、またはそれら両方のアデノシン残基をメチル化する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、シトシン残基およびアデノシン残基をメチル化する。
種々の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＤｃｍメチルトランスフェラーゼを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、ＤａｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼは、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、ＤｃｍメチルトランスフェラーゼおよびＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む。
種々の実施形態では、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼは、存在しない。他の実施形態では、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼは、非機能的である。種々の実施形態では、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼは、存在しない。他の実施形態では、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼは、非機能的である。種々の実施形態では、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼは、存在しない。他の実施形態では、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼは、非機能的である。
さらなる実施形態では、操作された細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。種々の実施形態では、親プラスミドは、ミニサークル核酸配列の外側に複数の制限部位を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼをさらに含む。特定の実施形態では、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼは、アラビノースによって誘導される。一部の実施形態では、操作された細菌は、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼをさらに含む。ある特定の実施形態では、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼは、アラビノースによって誘導される。
遺伝子操作は、細菌生理学、代謝および病理発生の基本的な態様を発見するため、ならびにヒト使用のために細菌の能力を利用するための、強力なアプローチである。しかし、遺伝子操作の力の全てを適用できるのは、いくつかのモデル生物に対してだけである。制限修飾系における生物学的多様性および株レベルでのバリエーションは、ほとんどの細菌を遺伝学の完全な潜在力の域を越えたものにしている、決定的な障壁である。本開示は、任意の培養細菌（cultivated bacterium）に広く適用することができる、制限修飾系を効率的に回避するための体系的アプローチを提供する。本明細書の結果は、先天的防御機構によって制限されない微生物の遺伝システム設計を可能にする、この、操作によるステルスアプローチの単純さおよび有効性を実証する。
本開示は、微生物遺伝子操作の間の遺伝的扱いにくさの最も一般的な原因であるＲＭ障壁を避けるためのアプローチを提供する。現行のメチル化による模倣アプローチとは対照的に、本開示には、操作によるステルスが関与する（図１１）。以下の実施例にさらに記載されるように、扱いやすさが不十分である（または扱いにくい）細菌株内のＲＭ系の正確な標的を同定し、一塩基多型（ＳＮＰ）または同義ヌクレオチド改変を介して、遺伝的ツールのＤＮＡ配列鋳型からｉｎ ｓｉｌｉｃｏで排除した。したがって、特定の宿主に関して、ＲＭ－サイレントであるテーラーメイドバージョンの遺伝的ツールを合成した。このステルスベースのＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡアプローチは、活性なＲＭ防御を有する細菌において効率的に動作する遺伝的ツールを提供する。
さらに、ミニサークル技術を使用して、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡミニサークルプラスミド（ＳｙＭＰＬ）ツールを生成したが、これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増殖のために要求されるが標的宿主においては過剰である成分を含まない。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの臨床的に関連するＵＳＡ３００株を使用して、形質転換効率における著明な改善が、本明細書に記載されるこれらのＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡおよびＳｙＭＰＬアプローチを使用するＲＭ系の体系的回避によって達成された。
以下の材料および方法を実施例１～４において使用する。
微生物株および試薬
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢアルファコンピテント細胞は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入し、中間クローニング宿主として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７９６は、Ｒｉｃｈ Ｒｏｂｅｒｔｓ（ＮＥＢ）の実験室によって提供され、メチル化なしのプラスミドＤＮＡを産生するために使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ（ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ；元のミニサークル産生株）は、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ）から購入した。抗生物質および化学物質は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、イソプロピル－Ｄチオガラクトピラノシド；ＩＰＴＧ）またはＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（アンヒドロテトラサイクリン）から購入した。成長培地は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）またはＯｘｏｉｄ（Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ）から購入した。ＤＮＡ単離キットは、Ｌｕｃｉｇｅｎ（Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ Ｇｒａｍ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｋｉｔ）およびＱｉａｇｅｎ（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）から購入した。クローニング試薬およびＤＮＡ酵素は、ＮＥＢ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｑ５ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ＥｐｉＭａｒｋ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ）またはＴａｋａｒａ（バイサルファイト処置されたＤＮＡのためのＥｐｉＴａｑ ＨＳ）から購入した。プラスミドは、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ）（親プラスミド；ｐＭＣベクター）、Ｅｌｉｔｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ｐＥＰＳＡ５）、Ａｄｄｇｅｎｅ（ｐＣａｓ；プラスミド番号４２８７６、ｐＴａｒｇｅｔＦ；番号６２２２６）から購入した、またはＧｅｏｒｇｅ Ｃｈｕｒｃｈ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ｐＣＫＴＲＢＳ（Juarez JF, et al., (2017) bioRxiv:193029））もしくはＲｉｃｈ Ｒｏｂｅｒｔｓ、ＮＥＢ（ｐＲＲＳ）の実験室から得た。オリゴヌクレオチドは、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。電気穿孔キュベット（１ｍｍギャップ）は、ＢｉｏＲａｄから購入し、形質転換をＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ機器で実施した。ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成サービスおよび核酸分子断片は、Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＮＪ）から購入した。プラスミドＤＮＡ配列決定サービスは、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＳＡ）またはＤＮＡ ｃｏｒｅ ａｔ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢアルファコンピテント細胞は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入し、中間クローニング宿主として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７９６は、Ｒｉｃｈ Ｒｏｂｅｒｔｓ（ＮＥＢ）の実験室によって提供され、メチル化なしのプラスミドＤＮＡを産生するために使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ（ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ；元のミニサークル産生株）は、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ）から購入した。抗生物質および化学物質は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、イソプロピル－Ｄチオガラクトピラノシド；ＩＰＴＧ）またはＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（アンヒドロテトラサイクリン）から購入した。成長培地は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）またはＯｘｏｉｄ（Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ）から購入した。ＤＮＡ単離キットは、Ｌｕｃｉｇｅｎ（Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ Ｇｒａｍ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｋｉｔ）およびＱｉａｇｅｎ（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）から購入した。クローニング試薬およびＤＮＡ酵素は、ＮＥＢ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｑ５ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ＥｐｉＭａｒｋ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ）またはＴａｋａｒａ（バイサルファイト処置されたＤＮＡのためのＥｐｉＴａｑ ＨＳ）から購入した。プラスミドは、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ）（親プラスミド；ｐＭＣベクター）、Ｅｌｉｔｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ｐＥＰＳＡ５）、Ａｄｄｇｅｎｅ（ｐＣａｓ；プラスミド番号４２８７６、ｐＴａｒｇｅｔＦ；番号６２２２６）から購入した、またはＧｅｏｒｇｅ Ｃｈｕｒｃｈ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ｐＣＫＴＲＢＳ（Juarez JF, et al., (2017) bioRxiv:193029））もしくはＲｉｃｈ Ｒｏｂｅｒｔｓ、ＮＥＢ（ｐＲＲＳ）の実験室から得た。オリゴヌクレオチドは、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。電気穿孔キュベット（１ｍｍギャップ）は、ＢｉｏＲａｄから購入し、形質転換をＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ機器で実施した。ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成サービスおよび核酸分子断片は、Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＮＪ）から購入した。プラスミドＤＮＡ配列決定サービスは、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＳＡ）またはＤＮＡ ｃｏｒｅ ａｔ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。
単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴｓｅｑ）および制限修飾（ＲＭ）系同定
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２のＳＭＲＴｓｅｑを、塩基修飾検出のための標準的なＳＭＲＴｂｅｌｌ鋳型調製プロトコールおよびＳＭＲＴＡｎａｌｙｓｉｓ ｖ２．３．０パッチ５（ＰＡＣＢＩＯ（登録商標））に従って、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｃｏｒｅ ＦａｃｉｌｉｔｙにおいてＰ６／Ｃ４化学を用いてＰａｃＢｉｏＲＳＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実施した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２のＳＭＲＴｓｅｑを、塩基修飾検出のための標準的なＳＭＲＴｂｅｌｌ鋳型調製プロトコールおよびＳＭＲＴＡｎａｌｙｓｉｓ ｖ２．３．０パッチ５（ＰＡＣＢＩＯ（登録商標））に従って、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｃｏｒｅ ＦａｃｉｌｉｔｙにおいてＰ６／Ｃ４化学を用いてＰａｃＢｉｏＲＳＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実施した。
単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴｓｅｑ）および関連の塩基修飾検出の原理は、以前に詳述されている（Flusberg BA, et al. (2010) Nat Methods 7(6):461-465）。ＳＭＲＴｓｅｑを、塩基修飾検出のための標準的なＳＭＲＴｂｅｌｌ鋳型調製プロトコール（ＰＡＣＢＩＯ（登録商標））に従って、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｃｏｒｅ ＦａｃｉｌｉｔｙにおいてＰ６／Ｃ４化学を用いてＰａｃＢｉｏＲＳＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実施した。ゲノムＤＮＡ試料を、Ｇ管（Ｃｏｖａｒｉｓ；Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を介して２０ｋｂｐの平均サイズになるように剪断し、末端修復し、配列決定前にヘアピンアダプターにライゲーションした。シーケンシングリードを処理し、標準的なマッピングプロトコールを使用してＢＬＡＳＲマッパー（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴＡｎａｌｙｓｉｓパイプラインを使用して、それぞれの参照配列にマッピングした。パルス間の持続時間を測定し、参照配列中の各位置にアラインされた全てのパルスについて処理した。修飾された位置を同定するために、修飾された塩基位置のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ動態学的参照およびｔ検定ベースの動態学的スコア検出を使用するＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴＡｎａｌｙｓｉｓ ｖ２．３．０パッチ５を使用した。ＳＭＲＴｓｅｑデータを使用して、ＲＭ系同定を、精選された制限酵素データベース（ＲＥＢＡＳＥ）（Roberts RJ, et al., (2015) Nucleic Acids Res 43(Database issue):D298-299）と組み合わせて、ＳＥＱＷＡＲＥコンピューターリソース、ＢＬＡＳＴベースのソフトウェアモジュールを使用して、本質的には以前に記載された通りに実施した（Murray IA, et al. (2012) Nucleic Acids Res 40(22):11450-11462）。予測は、ＲＥＢＡＳＥ内の実験により特徴付けられたＲＭ系遺伝子の公知のゲノム状況および特徴に加えて、配列類似性、存在、および予測的な機能的モチーフの順序によって支持され、それらのＲＭ型に基づいた、各特異性への候補メチルトランスフェラーゼ遺伝子の信頼性のある割当てを可能にした。
バイオインフォマティクスおよびｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ適応
ＤＮＡ配列分析および操作を、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＳｅｑｂｕｉｌｄｅｒおよびＳｅｑｍａｎプログラムを使用して実施した。コドン使用頻度分析および同義置換を、ＣｏｄｏｎＷおよびＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｋａｚｕｓａ）の組合せを使用して決定し、Ｓｅｑｂｕｉｌｄｅｒ内に導入して、Ｅ．ｃｏｌｉ内のコード領域のアミノ酸完全性を維持した。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（ＥＭＢＬウェブサイト）を使用して、元のＯＲＦおよびＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡバリアント由来のＤＮＡおよびアミノ酸配列をアラインした。重量（ｍ）から容量モル濃度（ｐｍｏｌ）へのプラスミドＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）変換を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｉｏＭａｔｈ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））を用いて実施した。
ＤＮＡ配列分析および操作を、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＳｅｑｂｕｉｌｄｅｒおよびＳｅｑｍａｎプログラムを使用して実施した。コドン使用頻度分析および同義置換を、ＣｏｄｏｎＷおよびＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｋａｚｕｓａ）の組合せを使用して決定し、Ｓｅｑｂｕｉｌｄｅｒ内に導入して、Ｅ．ｃｏｌｉ内のコード領域のアミノ酸完全性を維持した。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（ＥＭＢＬウェブサイト）を使用して、元のＯＲＦおよびＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡバリアント由来のＤＮＡおよびアミノ酸配列をアラインした。重量（ｍ）から容量モル濃度（ｐｍｏｌ）へのプラスミドＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）変換を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｉｏＭａｔｈ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））を用いて実施した。
ＤＮＡ合成およびＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡプラスミドのアセンブリー
ｐＥＰＳＡ５プラスミドのＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ－バリアント（ｐＥＰＳＡ５Ｓｙｎ）を、３つのＪＥ２ ＲＭ標的部位を包含する元のプラスミドの３．０５ｋｂ断片を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２に関してＲＭ－サイレントであったｄｅ ｎｏｖｏ合成されたＤＮＡ断片で置き換えることによってアセンブルした（図２、９および１０）。使用したプライマーは、表５に列挙される。元のｐＥＰＳＡ５プラスミドを、未改変の骨格のための増幅鋳型として使用し、一方、プラスミドｐＫａｎ－Ｆｒａｇ（Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、改変されたＲＭ－サイレント断片を増幅した。ＰＣＲアンプリコンをＤｐｎＩで処置して非増幅鋳型ＤＮＡを消化し、ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２プラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎクローニングを使用してアセンブルした。プラスミドヌクレオチド完全性を、再配列決定によって確認した。ｐＥＰＳＡ５およびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢアルファ（Ｄａｍ＋／Ｄｃｍ＋／ＨｓｄＭ＋）内で増殖させて、メチル化されたプラスミドＤＮＡを産生し、またはＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７９６（Ｄａｍ－、Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ－）内で増殖させて、ＩＶ型ＲＭ系の回避のためのメチル化なしのプラスミドＤＮＡを産生した。プラスミドＤＮＡのメチル化状態を、それによりメチル化されたプラスミドのみが消化に供される、ＤｐｎＩ処置およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。
ｐＥＰＳＡ５プラスミドのＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ－バリアント（ｐＥＰＳＡ５Ｓｙｎ）を、３つのＪＥ２ ＲＭ標的部位を包含する元のプラスミドの３．０５ｋｂ断片を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２に関してＲＭ－サイレントであったｄｅ ｎｏｖｏ合成されたＤＮＡ断片で置き換えることによってアセンブルした（図２、９および１０）。使用したプライマーは、表５に列挙される。元のｐＥＰＳＡ５プラスミドを、未改変の骨格のための増幅鋳型として使用し、一方、プラスミドｐＫａｎ－Ｆｒａｇ（Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、改変されたＲＭ－サイレント断片を増幅した。ＰＣＲアンプリコンをＤｐｎＩで処置して非増幅鋳型ＤＮＡを消化し、ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２プラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎクローニングを使用してアセンブルした。プラスミドヌクレオチド完全性を、再配列決定によって確認した。ｐＥＰＳＡ５およびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢアルファ（Ｄａｍ＋／Ｄｃｍ＋／ＨｓｄＭ＋）内で増殖させて、メチル化されたプラスミドＤＮＡを産生し、またはＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７９６（Ｄａｍ－、Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ－）内で増殖させて、ＩＶ型ＲＭ系の回避のためのメチル化なしのプラスミドＤＮＡを産生した。プラスミドＤＮＡのメチル化状態を、それによりメチル化されたプラスミドのみが消化に供される、ＤｐｎＩ処置およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ産生体株のゲノム編集
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／λ－Ｒｅｄ多重遺伝子編集戦略を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ株（ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ）において、無傷のメチルトランスフェラーゼ遺伝子欠失を導入した。この戦略は、２プラスミド系、ｐＣａｓおよびｐＴａｒｇｅｔを使用する（図６Ａ）、（Jiang Y, et al. (2015) Appl Environ Microbiol 81(7):2506-2514を参照のこと。その関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる。改変されたアンヒドロテトラサイクリン誘導性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／λ－Ｒｅｄ遺伝子編集系の構築のために、元の系において、ｐＣａｓプラスミドは、共に温度感受性レプリコン（ｒｅｐＡ１０１Ｔｓ）上に存在する、構成的に発現されるｃａｓ９遺伝子、およびλ－Ｒｅｄ系（Ｇａｍ、Ｂｅｔａ、Ｅｘｏ）を制御するアラビノース誘導性調節プロモーター／リプレッサーモジュール（ａｒａＣ－Ｐｂａｄ）を維持する。適合性ｐＴａｒｇｅｔプラスミドは、構成的プロモーター（Ｊ２３１１９）およびｐＭＢ１複製起点の制御下に、所望のＣａｓ９標的のためのｓｇＲＮＡ足場を有する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／λ－Ｒｅｄ多重遺伝子編集戦略を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ株（ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ）において、無傷のメチルトランスフェラーゼ遺伝子欠失を導入した。この戦略は、２プラスミド系、ｐＣａｓおよびｐＴａｒｇｅｔを使用する（図６Ａ）、（Jiang Y, et al. (2015) Appl Environ Microbiol 81(7):2506-2514を参照のこと。その関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる。改変されたアンヒドロテトラサイクリン誘導性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／λ－Ｒｅｄ遺伝子編集系の構築のために、元の系において、ｐＣａｓプラスミドは、共に温度感受性レプリコン（ｒｅｐＡ１０１Ｔｓ）上に存在する、構成的に発現されるｃａｓ９遺伝子、およびλ－Ｒｅｄ系（Ｇａｍ、Ｂｅｔａ、Ｅｘｏ）を制御するアラビノース誘導性調節プロモーター／リプレッサーモジュール（ａｒａＣ－Ｐｂａｄ）を維持する。適合性ｐＴａｒｇｅｔプラスミドは、構成的プロモーター（Ｊ２３１１９）およびｐＭＢ１複製起点の制御下に、所望のＣａｓ９標的のためのｓｇＲＮＡ足場を有する。
しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ株内でのＭＣ形成もまた、染色体上に組み込まれたａｒａＣ－Ｐｂａｄモジュールによって調節されるので、元の系を使用するλ－Ｒｅｄ組換えのアラビノース誘導は、遺伝子編集の間のＭＣアセンブリー酵素（ΦＣ３１インテグラーゼおよびＩ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼ）の意図しない誘導を引き起こす。これを回避するために、λ－Ｒｅｄ系のアラビノース誘導性モジュールを、代替的テトラサイクリン誘導性モジュールで置き換えた。利用したプライマーは、表５に列挙される。ａｒａＣ－Ｐｂａｄモジュールを含む、λ－Ｒｅｄ ｇａｍ遺伝子の上流のｐＣａｓの１３１８ｂｐ領域を、８１８ｂｐのテトラサイクリン誘導性調節プロモーター／リプレッサー単位（ＴｅｔＲ／Ｐｔｅｔ０）で置き換えた（図６Ｂ）。プラスミドｐＣＫＴＲＢＳは、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーを使用してｐＣａｓＴｅｔ－λを形成するための、ｐＣａｓの１１．３ｋｂアンプリコン（アラビノースモジュールを欠如する）にスプライシングされたＴｅｔＲ／ＰｔｅｔＯモジュールの増幅のための鋳型ＤＮＡとして機能する。元のｐＴａｒｇｅｔと組み合わせた改変されたｐＣａｓＴｅｔ－λプラスミドは、誘導因子分子としてのアラビノースの代わりに、抗生物質活性を示さないテトラサイクリンの誘導体であるアンヒドロテトラサイクリンを使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／λ－Ｒｅｄリコンビニアリングを可能にした。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ株の引き続くゲノム編集のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ株は、それぞれＤｃｍ、ＨｓｄＭＳおよびＤａｍ遺伝子によってコードされる３つの活性なメチルトランスフェラーゼを含む（Ｄｃｍ＋、Ｈｓｄ＋、Ｄａｍ＋）。異なるメチル化シグネチャーを有するＭＣを産生することが各々可能な一連のＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ株を創出するために、これらのメチルトランスフェラーゼ遺伝子を、改変されたアンヒドロテトラサイクリン誘導性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／λ－Ｒｅｄリコンビニアリング戦略を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣゲノムから（３ラウンドで）連続して欠失させた（図６～８）。この戦略では、ＤＮＡ編集鋳型とのλ－Ｒｅｄ媒介性組換えは、染色体からメチルトランスフェラーゼ遺伝子を排除し、その後、未編集の細胞において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を媒介してメチルトランスフェラーゼ遺伝子を標的とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって導入される二本鎖ＤＮＡ切断は、細菌において毒性であり、したがって、標的配列が編集された細胞のみが生存でき、組換え事象の陽性選択を可能にする。メチルトランスフェラーゼ欠失鋳型プラスミドを、各メチルトランスフェラーゼの５’側および３’側の領域のＰＣＲアンプリコン（所望の欠失事象を反映する）をｐＲＲＳプラスミド骨格上にアセンブルすることによって構築した（図６Ｃ）。次いで、これらのｐＲＲＳベースの鋳型プラスミドを使用して、λ－Ｒｅｄリコンビニアリングのための線状編集鋳型をＰＣＲ増幅した。電気形質転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の間の鋳型プラスミドキャリーオーバーを除去するために、編集鋳型アンプリコンをＤｐｎＩ処置し、使用前にＰＣＲ精製した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣコンピテント細胞（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、ｐＣａｓＴｅｔ－λで最初に形質転換して、Ｃａｓ９タンパク質を構成的に発現するがｇＲＮＡ標的を欠如するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭＣを形成した（図７）。ＪＭＣエレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（ｐＣａｓＴｅｔ－λを保有する）を、以前に記載された通りに生成した（Thomason LC, et al., (2007) Current protocols in molecularbiology:1.16. 11-11.16. 39）。ＪＭＣ細胞のλ－Ｒｅｄ誘導のために、アンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍｌ；約０．５μＭ）を、アラビノースベースの系について記載されたように（Thomason LC, et al., (2007) Current protocols in molecularbiology:1.16. 11-11.16. 39）、細胞をコンピテントにする３０分前に、成長している（３０℃）培養物に添加した。
ゲノム編集の第１ラウンドでは、エレクトロコンピテントなＪＭＣ細胞を、Ｄｃｍ欠失編集鋳型およびｐＴ－Ｄｃｍ（Ｊ２３１１９構成的プロモーターの制御下にＤｃｍ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを有するｐＴａｒｇｅｔ）で形質転換した。電気穿孔のために、５０μｌの細胞を、１００ｎｇ ｐＴ－Ｄｃｍプラスミドおよび２００ｎｇ Ｄｃｍ欠失編集鋳型ＤＮＡの組合せ５μｌと混合した；電気穿孔を、２ｍｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で２．５ｋＶで実施した。細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上で３０℃での選択的プレーティングの前に、３０℃で１時間回復させた。形質転換体を、コロニーＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって同定した。プライマーは、表５に列挙される。Ｄｃｍ欠失の確認後、ｐＣａｓＴｅｔ－ＸおよびｐＴ－Ｄｃｍの両方を保有する編集されたコロニーから、本質的には以前に記載された通りに（Jiang Y, et al. (2015) Appl Environ Microbiol 81(7):2506-2514）、ＩＰＴＧ誘導（０．５ｍＭ）によって後者のプラスミドをキュアリングした。簡潔に述べると、ＩＰＴＧは、構成的に発現されるＣａｓ９タンパク質との相互作用後にｐＴ－Ｄｃｍの複製起点を標的とするｇＲＮＡの産生を誘導する。このｇＲＮＡは、ＬａｃＯ／ＬａｃＩ（ＩＰＴＧ誘導性）系の転写制御下で、ｐＣａｓＴｅｔ－λプラスミド上にコードされる。得られたＥ．ｃｏｌｉ株（ＤｃｍΔ／ｐＣａｓＴｅｔ－λ＋）を、次のラウンドの編集のためにもう一度コンピテントにし、または４回の連続した接種について３７℃でのインキュベーションによってｐＣａｓＴｅｔ－λプラスミドをそこからキュアリングして、プラスミドなしのミニサークル産生株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭＣ１（Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ＋、Ｄａｍ＋）を形成した。
ゲノム編集の第２ラウンドでは、Ｈｓｄメチルトランスフェラーゼ系を標的にしてプロセス全体を繰り返した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｃｍΔ／ｐＣａｓＴｅｔ－λ＋を、Ｈｓｄ欠失編集鋳型およびｐＴ－Ｈｓｄプラスミド（ＨｓｄＭ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを有するｐＴａｒｇｅｔ）で形質転換した。得られたＥ．ｃｏｌｉ株（ＤｃｍΔ、ＨｓｄＭΔ、ｐＣａｓＴｅｔ－λ＋）から、ｐＣａｓＴｅｔ－λプラスミドをキュアリングして、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭＣ２株（Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ＋、Ｄａｍ＋）を形成した。
第３ラウンドでは、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ系を標的にしてプロセス全体を繰り返した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ－、ｐＣａｓＴｅｔ－λ＋を、Ｄａｍ欠失編集鋳型およびｐＴ－Ｄａｍプラスミド（Ｄａｍ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを有するｐＴａｒｇｅｔ）で形質転換した。得られたＥ．ｃｏｌｉ株（Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ－、Ｄａｍ－）から、両方のプラスミドをキュアリングして、完全にメチルなしのＥ．ｃｏｌｉ ＪＭＣ３株（Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ－、Ｄａｍ－）を形成した。
ゲノム編集の各ラウンドの後に、Ｄｃｍ、ＨｓｄＭおよびＤａｍ遺伝子欠失の表現型効果を、それぞれ、バイサルファイト配列決定、ＳＭＲＴｓｅｑおよびメチル依存的制限酵素分析を使用して確認した（図８）。ｇＤＮＡの部位特異的バイサルファイト配列決定およびＤｐｎＩメチル依存的制限分析を、本質的には以前に記載された通りに実施した（Johnston CD, et al., (2017) PLoS One 12(9):e0185234）。
ＳｙＭＰＬツールの産生
両方のｐＥＰＳＡ５プラスミド（ｐＥＰＳＡ５およびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２）の４．３ｋｂｐのＳ．ａｕｒｅｕｓレプリコンを、ＰＣＲ増幅し、ＭＣ親プラスミド（ｐＭＣ；Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にスプライシングして、ｐＥＰＳＡ５ＰおよびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２Ｐ（Ｐは親を示す）を形成した。表５に列挙されるプライマー。Ｄｃｍがメチル化したシトシン残基を標的とするＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２のＩＶ型制限系を回避するために、Ｄｃｍ欠損ＭＣ産生Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭＣ１（Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ＋、Ｄａｍ＋）を使用した。以前に記載された通りに調製したコンピテントなプラスミドなしのＥ．ｃｏｌｉ ＪＭＣ１細胞を、ｐＥＰＳＡ５ＰおよびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＰで形質転換した。ミニサークルの誘導および単離を、製造業者の推奨に従って、元のＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ株（ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ）について実施した。得られたＳｙＭＰＬツールｐＥＰＳＡ５ＭＣおよびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＭＣを、高純度Ｈ２Ｏ中に溶出し、形質転換前に２５０ｎｇ／μｌに規格化した。プラスミドヌクレオチド完全性を、再配列決定によって確認した。
両方のｐＥＰＳＡ５プラスミド（ｐＥＰＳＡ５およびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２）の４．３ｋｂｐのＳ．ａｕｒｅｕｓレプリコンを、ＰＣＲ増幅し、ＭＣ親プラスミド（ｐＭＣ；Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にスプライシングして、ｐＥＰＳＡ５ＰおよびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２Ｐ（Ｐは親を示す）を形成した。表５に列挙されるプライマー。Ｄｃｍがメチル化したシトシン残基を標的とするＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２のＩＶ型制限系を回避するために、Ｄｃｍ欠損ＭＣ産生Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭＣ１（Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ＋、Ｄａｍ＋）を使用した。以前に記載された通りに調製したコンピテントなプラスミドなしのＥ．ｃｏｌｉ ＪＭＣ１細胞を、ｐＥＰＳＡ５ＰおよびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＰで形質転換した。ミニサークルの誘導および単離を、製造業者の推奨に従って、元のＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ株（ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ）について実施した。得られたＳｙＭＰＬツールｐＥＰＳＡ５ＭＣおよびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＭＣを、高純度Ｈ２Ｏ中に溶出し、形質転換前に２５０ｎｇ／μｌに規格化した。プラスミドヌクレオチド完全性を、再配列決定によって確認した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ形質転換
エレクトロコンピテントなＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２細胞を、Loefblom et al. ((2007) Optimization of electroporation-mediated transformation: Staphylococcus carnosus as model organism. J Appl Microbioll 02(3):736-747）によって使用されたものの改変されたバージョンを使用して調製した。簡潔に述べると、ベジタブルペプトンブロス（ＶＰＢ）中のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２の一晩培養物（ＯＤ６００ｎｍ＝約１．８）を、新鮮な事前に温めたＶＰＢ中に、０．２５のＯＤ６００ｎｍになるように希釈した。ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ方法の有効性を試験するための最初の実験では、培養物を、ＯＤ６００ｎｍが０．８～０．９５の間に達するまで（約３時間）、振盪（１００ｒｐｍ）しながら３７℃で成長させた。しかし、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ実験およびＳｙＭＰＬ方法実験の間に、増加したＪＥ２細胞コンピテンシーが、培養物が１．５～１．７の間のＯＤ６００ｎｍになるまで（約６時間）成長させた時点で達成された。したがって、全てのＳｙＭＰＬ実験を、このより高い光学密度で収穫した細胞を用いて実施した。両方の場合において、培養管が所望のＯＤに達した時点で、培養フラスコを、濡れた氷上で１５分間冷却した。細胞を、５０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって収穫し、等しい体積の氷冷無菌水中で１回洗浄し、４℃でペレット化した。次いで、細胞を、１／１０体積の氷冷無菌１０％グリセロール中で洗浄し、１／２５体積の氷冷無菌１０％グリセロールで反復し、１／１００体積の氷冷無菌１０％グリセロールで反復し、１／１６０体積の氷冷無菌１０％グリセロール中に再懸濁し、次いで、１．５ｍｌ管中に等分した（２５０μｌ）。エレクトロコンピテントな細胞アリコートを、使用まで－８０℃で凍結した。
エレクトロコンピテントなＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２細胞を、Loefblom et al. ((2007) Optimization of electroporation-mediated transformation: Staphylococcus carnosus as model organism. J Appl Microbioll 02(3):736-747）によって使用されたものの改変されたバージョンを使用して調製した。簡潔に述べると、ベジタブルペプトンブロス（ＶＰＢ）中のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２の一晩培養物（ＯＤ６００ｎｍ＝約１．８）を、新鮮な事前に温めたＶＰＢ中に、０．２５のＯＤ６００ｎｍになるように希釈した。ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ方法の有効性を試験するための最初の実験では、培養物を、ＯＤ６００ｎｍが０．８～０．９５の間に達するまで（約３時間）、振盪（１００ｒｐｍ）しながら３７℃で成長させた。しかし、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ実験およびＳｙＭＰＬ方法実験の間に、増加したＪＥ２細胞コンピテンシーが、培養物が１．５～１．７の間のＯＤ６００ｎｍになるまで（約６時間）成長させた時点で達成された。したがって、全てのＳｙＭＰＬ実験を、このより高い光学密度で収穫した細胞を用いて実施した。両方の場合において、培養管が所望のＯＤに達した時点で、培養フラスコを、濡れた氷上で１５分間冷却した。細胞を、５０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって収穫し、等しい体積の氷冷無菌水中で１回洗浄し、４℃でペレット化した。次いで、細胞を、１／１０体積の氷冷無菌１０％グリセロール中で洗浄し、１／２５体積の氷冷無菌１０％グリセロールで反復し、１／１００体積の氷冷無菌１０％グリセロールで反復し、１／１６０体積の氷冷無菌１０％グリセロール中に再懸濁し、次いで、１．５ｍｌ管中に等分した（２５０μｌ）。エレクトロコンピテントな細胞アリコートを、使用まで－８０℃で凍結した。
電気穿孔のために、単一のアリコートを、プラスミド間での形質転換効率の正確な比較のために各個々の実験に利用した。アリコートを、氷上で５分間解凍し、５分間かけて室温に移行させ、５０００×ｇで１分間遠心分離し、２５０μｌ無菌電気穿孔緩衝液（１０％グリセロール、５００ｍＭスクロース）中に再懸濁した。５０μｌ体積のコンピテント細胞を、１μｇプラスミドＤＮＡ（無菌水中２５０ｎｇ／μｌ）と混合し、無菌１ｍｍギャップ電気穿孔キュベットに添加した。細胞を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（設定：２．３ミリ秒の時定数で、２５μＦ、１００Ω、２．１ｋＶ）を使用して１回パルスし、５００ｍＭスクロースを含むトリプシン（trypic）ソイブロス１ｍｌ中で３７℃で１時間成長させ、１５１μｇ／ｍｌ Ｃｍでトリプシンソイ寒天プレート上に広げるために希釈し、３７℃で一晩インキュベートした。
科学的厳密さおよび実験設計
形質転換効率（図２Ｄおよび２Ｂに示される）を、９つの独立した実験に基づいて決定した。エレクトロコンピテントなＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞の３つの独立したバッチを調製した（生物学的反復１、２および３；表２）。エレクトロコンピテント細胞の各バッチからの３つのアリコートを使用して、典型的には連日、３つの独立した形質転換実験を実施した（技術的反復Ａ、ＢおよびＣ；表２）。単一のプラスミド調製物（各ｐＥＰＳＡ５バリアントについて）を、バッチ内の全ての技術的反復のために使用した。新鮮なプラスミド調製物（全てのｐＥＰＳＡ５バリアントについて）を、細胞の各々の新たなバッチのために使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ株からのプラスミド増殖／単離に関連するバリエーションおよびプラスミドＤＮＡに対する凍結－解凍の影響を明らかにした。独立した実験において、技術的反復内のデータが、４つのプラスミドにわたって、対になった、または「クラスター化した」ものとして処理され得、プラスミド形質転換効率が、正当かつ効率的に比較され得るように、エレクトロコンピテントなＳ．ａｕｒｅｕｓの単一の２５０μｌアリコートを、９つの実験の各々内の全てのプラスミド（５０μｌ／プラスミド）のために使用した。最低３つの反復寒天プレートからのＣＦＵ計数の平均を、実験内の個々のプラスミドについての形質転換効率を決定するときに使用した。
形質転換効率（図２Ｄおよび２Ｂに示される）を、９つの独立した実験に基づいて決定した。エレクトロコンピテントなＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞の３つの独立したバッチを調製した（生物学的反復１、２および３；表２）。エレクトロコンピテント細胞の各バッチからの３つのアリコートを使用して、典型的には連日、３つの独立した形質転換実験を実施した（技術的反復Ａ、ＢおよびＣ；表２）。単一のプラスミド調製物（各ｐＥＰＳＡ５バリアントについて）を、バッチ内の全ての技術的反復のために使用した。新鮮なプラスミド調製物（全てのｐＥＰＳＡ５バリアントについて）を、細胞の各々の新たなバッチのために使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ株からのプラスミド増殖／単離に関連するバリエーションおよびプラスミドＤＮＡに対する凍結－解凍の影響を明らかにした。独立した実験において、技術的反復内のデータが、４つのプラスミドにわたって、対になった、または「クラスター化した」ものとして処理され得、プラスミド形質転換効率が、正当かつ効率的に比較され得るように、エレクトロコンピテントなＳ．ａｕｒｅｕｓの単一の２５０μｌアリコートを、９つの実験の各々内の全てのプラスミド（５０μｌ／プラスミド）のために使用した。最低３つの反復寒天プレートからのＣＦＵ計数の平均を、実験内の個々のプラスミドについての形質転換効率を決定するときに使用した。
統計分析
統計分析を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン７．０４；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＳｔａｔａバージョン１２．１（ＳｔａｔａＣｏｒｐ．２０１１．Ｓｔａｔａ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｒｅｌｅａｓｅ １２．Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ：ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＰ）を使用して実施した。標準誤差（ＳＥＭ）を伴う平均が、各グラフ中に示される。計数データのために適切な場合、プラスミドにわたる形質転換効率を、負の二項回帰モデルを両側アルファ＝０．０５でフィットさせることによって比較した（表３および４）。一般化推定方程式（ＧＥＥ）フレームワークおよびロバストな標準誤差を使用して、コンピテント細胞の技術的反復内のクラスタリングを明らかにした。２×２要因計画として設計した各実験について、主効果および乗法相互作用項（multiplicative interaction term）（実験設計を参照のこと）をフィットさせた。これは、１つの条件（例えば、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡプラスミド対未改変のプラスミド）の効果が、別の条件の存在下または非存在下（例えば、Ｄｃｍ＋またはＤｃｍ－Ｅ．ｃｏｌｉ宿主において増殖された）でどのように異なるかを定量する差分の差分法分析であると考えられ得る。
統計分析を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン７．０４；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＳｔａｔａバージョン１２．１（ＳｔａｔａＣｏｒｐ．２０１１．Ｓｔａｔａ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｒｅｌｅａｓｅ １２．Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ：ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＰ）を使用して実施した。標準誤差（ＳＥＭ）を伴う平均が、各グラフ中に示される。計数データのために適切な場合、プラスミドにわたる形質転換効率を、負の二項回帰モデルを両側アルファ＝０．０５でフィットさせることによって比較した（表３および４）。一般化推定方程式（ＧＥＥ）フレームワークおよびロバストな標準誤差を使用して、コンピテント細胞の技術的反復内のクラスタリングを明らかにした。２×２要因計画として設計した各実験について、主効果および乗法相互作用項（multiplicative interaction term）（実験設計を参照のこと）をフィットさせた。これは、１つの条件（例えば、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡプラスミド対未改変のプラスミド）の効果が、別の条件の存在下または非存在下（例えば、Ｄｃｍ＋またはＤｃｍ－Ｅ．ｃｏｌｉ宿主において増殖された）でどのように異なるかを定量する差分の差分法分析であると考えられ得る。
データの有効性
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＪＥ２＿ＦｏｒｓｙｔｈおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ＿Ｆｏｒｓｙｔｈの完全なゲノム配列および関連するメチロームアノテーションは、それぞれ、生物番号２１７４２および２１７４１の下で、一般公開のためにＲＥＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／）に提出されている。この研究で使用した各プラスミドのヌクレオチド配列は、表７に含まれる。関連する分析についてのデータと合わせた、形質転換効率の決定のための生ＣＦＵコロニー計数データは、表２～４に示される。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＪＥ２＿ＦｏｒｓｙｔｈおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ＿Ｆｏｒｓｙｔｈの完全なゲノム配列および関連するメチロームアノテーションは、それぞれ、生物番号２１７４２および２１７４１の下で、一般公開のためにＲＥＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／）に提出されている。この研究で使用した各プラスミドのヌクレオチド配列は、表７に含まれる。関連する分析についてのデータと合わせた、形質転換効率の決定のための生ＣＦＵコロニー計数データは、表２～４に示される。
（実施例１）
ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡベースの遺伝的ツールの体系的生成
ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡベースの遺伝的ツールを産生するための４つの基本的なステップが存在する（図１Ａ～１Ｃ）：１）標的同定、２）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールアセンブリー、３）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ配列適応、ならびに４）ＤＮＡ合成およびアセンブリー。標的同定は、細菌ゲノム全体（即ち、メチローム）にわたる、単一塩基分解能での各メチル化された部位を明らかにすることを要求し、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ゲノムおよびメチローム配列決定で始まる（Johnston CD, et al., (2017) PLoS One 12(9):e0185234）。メチロームデータを使用して、宿主のＲＭ系のメチルトランスフェラーゼによって保護された認識モチーフの各々を明らかにし、それらのコグネート制限エンドヌクレアーゼによって認識および分解される標的を、本明細書に記載されるように推論した。これは、選択された遺伝的ツールのＤＮＡ配列から排除される宿主微生物のＲＭ標的の簡潔なリストをもたらす。
ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡベースの遺伝的ツールの体系的生成
ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡベースの遺伝的ツールを産生するための４つの基本的なステップが存在する（図１Ａ～１Ｃ）：１）標的同定、２）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールアセンブリー、３）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ配列適応、ならびに４）ＤＮＡ合成およびアセンブリー。標的同定は、細菌ゲノム全体（即ち、メチローム）にわたる、単一塩基分解能での各メチル化された部位を明らかにすることを要求し、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ゲノムおよびメチローム配列決定で始まる（Johnston CD, et al., (2017) PLoS One 12(9):e0185234）。メチロームデータを使用して、宿主のＲＭ系のメチルトランスフェラーゼによって保護された認識モチーフの各々を明らかにし、それらのコグネート制限エンドヌクレアーゼによって認識および分解される標的を、本明細書に記載されるように推論した。これは、選択された遺伝的ツールのＤＮＡ配列から排除される宿主微生物のＲＭ標的の簡潔なリストをもたらす。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールアセンブリーは、引き続く適応ステップの間のこれらの構造に対する有害な変化を回避するために、プラスミドシャシー（plasmid chassis）、複製起点、抗生物質耐性カセット、プロモーター、リプレッサー、ターミネーターおよび機能的ドメインに関して、遺伝的ツールの配列の完全なアノテーションを要求する。理想的には、遺伝的に扱いやすい株における以前の実証可能な機能性を有する完全かつ最小限度の遺伝的ツールを、最初の実験に使用して、首尾よい形質転換が達成された後に機能性を増加させるＤＮＡ部分の引き続く付加を可能にする。
遺伝的ツールのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ配列適応は、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡアプローチの最も重要なステップであり、ここで、全てのＲＭ系中に存在する高い標的配列特異性の固有の進化の弱点が利用される。したがって、このステップでは、遺伝的ツールの完全なヌクレオチド配列を、ＳＭＲＴｓｅｑによって同定されたＲＭ標的の存在についてスクリーニングする。次いで、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの各ＲＭ標的のヌクレオチドを、配列の機能性を保ちつつ標的を排除するように再コード化する。非コード領域において、単一ヌクレオチドを変化させて（ＳＮＰを創出して）標的を除去する。コード領域において、標的の配列を、同義コドン置換を使用して除去する。一塩基変更は、一般に、ＲＭ標的を除去するのに十分であるが、複数の変更もまた使用され得る。所望の宿主の優先的コドンバイアスを使用して、同義スイッチの間の稀なまたは好ましくないコドンの導入を回避する。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの全てのＲＭ標的の完全な除去の際に、再コード化されたＤＮＡ配列は、宿主に関してＲＭ－サイレントにされ、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡと呼ばれ、いつでもｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成する状態になっている。
ＲＭ－サイレント遺伝的ツールの合成およびアセンブリーを、市販のｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成および標準的なアセンブリーアプローチを使用して実施して、いずれの実験室でもＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡツールを構築できることを確実にする。商業的ＤＮＡ合成の間、核酸配列は、典型的には、大量の合成ＤＮＡを得るために増殖されるＥ．ｃｏｌｉプラスミドレプリコン上にクローニングされる。このＥ．ｃｏｌｉレプリコンは、簡便であるが、宿主種中への形質転換後の環状ツール全体の分解をもたらし得るＲＭ標的を含み得る。この潜在的な問題に対する２つの解法が開発された。１つの解法は、各特定の微生物宿主株のためにＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド骨格を生成することである（図１Ｂ）。しかし、慣用的な適用では、これは、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ合成のコストを増加させ、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉレプリコン自体は、典型的には、形質転換後に他の細菌種において非機能的であるので、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増殖後に余剰になる。したがって、代替的解法は、Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンを再コード化するのではなく、ミニサークルＤＮＡ技術を全面的に使用してそれを除去することである。同じＥ．ｃｏｌｉレプリコンを使用して、複数の異なる微生物株のためのツールを生成することができるので、このアプローチはまた、柔軟性を増加させる。
（実施例２）
ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡミニサークル（ＭＣ）プラスミド（ＳｙＭＰＬ）ツール
ミニサークル（ＭＣ）は、プラスミド骨格を欠く最小限度の環状発現カセットである（Kay MA, et al. (2010) Nat Biotechnol 28(12):1287-1289）。これらは、真核生物宿主において導入遺伝子の安定な発現を駆動するために、遺伝子治療適用において主に使用される。ＭＣは、親プラスミド（ＰＰ）を導入遺伝子カセットに結合させること；高い細胞密度まで成長させたＥ．ｃｏｌｉ宿主においてこの構築物を培養すること；構築物組換えを誘導して、ＭＣ上の単離された導入遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉレプリコンを含む別個の自動的に分解されるＰＰを形成すること；ならびに最後に、標準的なプラスミド方法を使用することによって、単離されたＭＣを精製すること、によって産生される（Kay MA, et al. (2010) Nat Biotechnol 28(12):1287-1289）（図４Ａ）。任意のＤＮＡ配列が導入遺伝子の代わりになり得るので、ＭＣ技術を転用して、微生物プラスミド全体を運搬させ、シャトルベクターからの過剰なＥ．ｃｏｌｉレプリコンの除去を促進した。ＰＰ中へのＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ配列の取り込みは、ｓｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡミニサークル（ＭＣ）プラスミド（ＳｙＭＰＬ）ツールの創出を可能にした（図４Ｂ）。ＳｙＭＰＬツールは、特定の非Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における動作（operation）のための複製、選択および機能的ドメインを含むが、ＭＣ産生Ｅ．ｃｏｌｉ株から高濃度で単離されるにもかかわらず、Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンを欠如している。ＳｙＭＰＬ戦略では、合成された（およびアセンブルされた）ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡツールは、非ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＰに結合され、この構築物が、ＭＣ産生Ｅ．ｃｏｌｉ株において増殖される。ＰＰを排除する特異的エンドヌクレアーゼの同時誘導を伴う、組換えを介したＭＣの誘導は、所望の宿主株中への形質転換をいつでもできる最小限度のＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡベースの遺伝的ツールの容易な単離を可能にする（図４Ｃ）。
ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡミニサークル（ＭＣ）プラスミド（ＳｙＭＰＬ）ツール
ミニサークル（ＭＣ）は、プラスミド骨格を欠く最小限度の環状発現カセットである（Kay MA, et al. (2010) Nat Biotechnol 28(12):1287-1289）。これらは、真核生物宿主において導入遺伝子の安定な発現を駆動するために、遺伝子治療適用において主に使用される。ＭＣは、親プラスミド（ＰＰ）を導入遺伝子カセットに結合させること；高い細胞密度まで成長させたＥ．ｃｏｌｉ宿主においてこの構築物を培養すること；構築物組換えを誘導して、ＭＣ上の単離された導入遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉレプリコンを含む別個の自動的に分解されるＰＰを形成すること；ならびに最後に、標準的なプラスミド方法を使用することによって、単離されたＭＣを精製すること、によって産生される（Kay MA, et al. (2010) Nat Biotechnol 28(12):1287-1289）（図４Ａ）。任意のＤＮＡ配列が導入遺伝子の代わりになり得るので、ＭＣ技術を転用して、微生物プラスミド全体を運搬させ、シャトルベクターからの過剰なＥ．ｃｏｌｉレプリコンの除去を促進した。ＰＰ中へのＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ配列の取り込みは、ｓｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡミニサークル（ＭＣ）プラスミド（ＳｙＭＰＬ）ツールの創出を可能にした（図４Ｂ）。ＳｙＭＰＬツールは、特定の非Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における動作（operation）のための複製、選択および機能的ドメインを含むが、ＭＣ産生Ｅ．ｃｏｌｉ株から高濃度で単離されるにもかかわらず、Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンを欠如している。ＳｙＭＰＬ戦略では、合成された（およびアセンブルされた）ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡツールは、非ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＰに結合され、この構築物が、ＭＣ産生Ｅ．ｃｏｌｉ株において増殖される。ＰＰを排除する特異的エンドヌクレアーゼの同時誘導を伴う、組換えを介したＭＣの誘導は、所望の宿主株中への形質転換をいつでもできる最小限度のＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡベースの遺伝的ツールの容易な単離を可能にする（図４Ｃ）。
この実施例で使用したＭＣ産生Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を含む実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株の大部分は、宿主ゲノム上の特異的標的部位にメチル化修飾を導入する３つの活性なメチルトランスフェラーゼ（Ｄａｍ、ＤｃｍおよびＨｓｄＭ）を含む（図５Ａ～５Ｃ）。Ｄａｍメチルトランスフェラーゼは、配列ＧＡＴＣ内のアデニン残基を修飾し（ｍ６Ａ）、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼは、配列ＣＣＷＧＧ（式中、ＷはＡまたはＴである）の内部シトシン残基を修飾し（ｍ５Ｃ）、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼは、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ（配列番号１）の内部アデニン残基を修飾する（ｍ６Ａ）。したがって、ミニサークル（ＭＣ）産生株（ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ）を含むかかるＥ．ｃｏｌｉ株内で増殖されたプラスミドツールは、これらの標的配列において修飾される。
ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡベースのツール上のメチル化された部位の存在は、人工形質転換の際にＩＶ型ＲＭ系を活性化し得る。一般に、メチル標的化ＩＶ型系の意図しない活性化は、メチル欠損Ｅ．ｃｏｌｉ株、例えば、ＪＭ１１０（Ｄａｍ－、Ｄｃｍ－、ＨｓｄＲＭＳ＋）またはＥＲ２７９６（Ｄａｍ－、Ｄｃｍ－、ＨｓｄＲＭＳ－）内でのプラスミドの増殖によって回避され、そうして、これらの系を介した認識および分解を防止する。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ産生株の構築（Kay MA, et al. (2010) Nat Biotechnol 28(12):1287-1289）は、誘導性ミニサークルアセンブリー酵素のセット（それぞれＭＣ形成の誘導およびＰＰレプリコンの分解のためのφＣ３１インテグラーゼおよびＩ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼ）を安定に発現させるための複雑な操作を要求したので、かかるメチルなしのＥ．ｃｏｌｉ株は、ＭＣを産生することができない。
したがって、ＭＣ技術を細菌適用のために転用した場合、種々の形態のメチル化なしのＭＣを生成するＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ産生体株を操作により作製することも必要であった（図６Ａ～Ｃ、７、８Ａ～８Ｆ）。完全にメチル化なしのＭＣ産生体は、アデニンおよびシトシンの両方がメチル化されたＤＮＡを標的とするＩＶ型系に対して作用する場合に要求され得るが、細菌ＲＭ系、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＤｐｎ系（Lacks SA, et al. (1984) J Bacteriol 157(3):934-936）またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａのＰｉｎ２５６１１ＦＩＩ系（Johnston CD, et al., (2017) PLoS One 12(9):e0185234.）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄａｍメチルトランスフェラーゼモチーフ（ＧＡＴＣ）と特異的にマッチする標的と共に存在する。これらの系は、完全にメチルなしの株内で増殖された遺伝的ツール上のメチル化されていないＤａｍ部位を消化し、したがって、Ｄａｍメチル化は、これらの場合において保護的である。したがって、別個の型のメチルなしのＭＣ ＤＮＡを産生することが可能な一連のＥ．ｃｏｌｉ株を創出して、細菌におけるＲＭ系の固有のバリエーションを明らかにし、ＳｙＭＰＬアプローチの適用可能性を最大化した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を反復して適用して、元のＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ産生体株（Ｄａｍ＋、Ｄｃｍ＋、ＨｓｄＭ＋）からメチルトランスフェラーゼ遺伝子を連続して欠失させた（図７）。これらの新たな株は、メチルシトシンなしのＭＣ ＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭＣ１；Ｄａｍ＋、Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ＋）、Ｄａｍメチル化を除いてメチルシトシンおよびメチルアデニンなしのＭＣ ＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭＣ２；Ｄａｍ＋、Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ－－）、ならびに完全にメチルなしのＭＣ ＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭＣ３；Ｄａｍ－、Ｄｃｍ－、ＨｓｄＭ－）を産生する。所望の細菌宿主内で同定されたＩＶ型ＲＭ系に依存して、これらの株の１つが、ＳｙＭＰＬツールの産生のために選択および利用され得る。
（実施例３）
細菌病原体へのＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡおよびＳｙＭＰＬアプローチの適用
ＲＭ系は、米国における年間１０，０００を超える死亡の原因である、公衆衛生に対する有意な関連性を有する病原体であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのほとんどの株において、遺伝子操作に対する公知の決定的な障壁である（Lee BY, et al. (2013) Clin Microbiol Infect 19(6):528-536；Sadykov M (2016) Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 1373:9）。より臨床的に関連する株へと扱いやすさを拡大しようと求める多数のメチル化による模倣アプローチが試みられてきた（Monk IR, et al. (2012) Front Cell Infect Microbiol 2:49、Jones MJ, et al. (2015) PLoS One10(3):e0119487）。その公衆衛生上の重要性に基づいて、流行性ＵＳＡ３００市中関連メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）ＬＡＣ株の誘導体であるＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２（Fey PD, et al. (2013) MBio 4(1):e00537-00512）を、本明細書に記載される操作によるステルスアプローチの有効性を実証するために選択した。第１のステップとして、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２のメチロームを、ＳＭＲＴ配列決定を使用して決定し、この株のＲＭ標的を同定した。ＪＥ２のＳＭＲＴｓｅｑおよびＲＥＢＡＳＥ分析は、二分割標的配列ＡＧＧＮ５ＧＡＴ（配列番号４）およびＣＣＡＹＮ６ＴＧＴ（配列番号２）（表１；各モチーフ内の修飾された塩基は、太字で示され、Ｎ＝任意の塩基である）を認識する２つのＩ型ＲＭ系、ならびに配列ＳＣＮＧＳ（式中、Ｓ＝ＣまたはＧである）内のシトシンメチル化を標的とすることが以前に示されたＩＶ型系（Sadykov M (2016) Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 1373:9）の存在を確認した。
細菌病原体へのＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡおよびＳｙＭＰＬアプローチの適用
ＲＭ系は、米国における年間１０，０００を超える死亡の原因である、公衆衛生に対する有意な関連性を有する病原体であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのほとんどの株において、遺伝子操作に対する公知の決定的な障壁である（Lee BY, et al. (2013) Clin Microbiol Infect 19(6):528-536；Sadykov M (2016) Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 1373:9）。より臨床的に関連する株へと扱いやすさを拡大しようと求める多数のメチル化による模倣アプローチが試みられてきた（Monk IR, et al. (2012) Front Cell Infect Microbiol 2:49、Jones MJ, et al. (2015) PLoS One10(3):e0119487）。その公衆衛生上の重要性に基づいて、流行性ＵＳＡ３００市中関連メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）ＬＡＣ株の誘導体であるＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２（Fey PD, et al. (2013) MBio 4(1):e00537-00512）を、本明細書に記載される操作によるステルスアプローチの有効性を実証するために選択した。第１のステップとして、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２のメチロームを、ＳＭＲＴ配列決定を使用して決定し、この株のＲＭ標的を同定した。ＪＥ２のＳＭＲＴｓｅｑおよびＲＥＢＡＳＥ分析は、二分割標的配列ＡＧＧＮ５ＧＡＴ（配列番号４）およびＣＣＡＹＮ６ＴＧＴ（配列番号２）（表１；各モチーフ内の修飾された塩基は、太字で示され、Ｎ＝任意の塩基である）を認識する２つのＩ型ＲＭ系、ならびに配列ＳＣＮＧＳ（式中、Ｓ＝ＣまたはＧである）内のシトシンメチル化を標的とすることが以前に示されたＩＶ型系（Sadykov M (2016) Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 1373:9）の存在を確認した。
次いで、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡアプローチを、Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓ．ａｕｒｅｕｓシャトルベクターｐＥＰＳＡ５に適用した（図２Ａ～２Ｂ）。ｐＥＰＳＡ５プラスミド（Forsyth RA, et al. (2002) Mol Microbiol 43(6):1387-1400）は、２．５ｋｂのＥ．ｃｏｌｉレプリコン（低コピー数ｐｌ５ａ自律複製起点と共に、アンピシリン耐性遺伝子）および４．３ｋｂのＳ．ａｕｒｅｕｓレプリコン（クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐＣ１９４由来起点およびキシロースリプレッサータンパク質遺伝子ｘｙｌＲ）を含む（図９Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓレプリコンは、ｐＥＰＳＡ５が維持され、Ｅ．ｃｏｌｉ内で増殖される場合には非機能的であり、逆もまた同様である。したがって、ｐＥＰＳＡ５ Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンのコード領域内に存在するＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２ ＲＭ標的を、Ｅ．ｃｏｌｉコドンバイアスに忠実な同義置換で改変した。６ヌクレオチドのみが異なる（ヌクレオチドレベルで９９．９１％同一）ｐＥＰＳＡ５のバリアントであるｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２（図２Ｃ）を合成し、アセンブルし（図９Ｂ）、増殖して、元の配列中に存在する３つのＲＭ標的モチーフを排除した。形質転換効率（ＣＦＵ／μｇ ＤＮＡ）における約７０，０００倍（ｐ＝７．７６×１０－３０６）の増加が、元のｐＥＰＳＡ５プラスミド（Ｄｃｍ＋Ｅ．ｃｏｌｉにおいて増殖された）と比較して、完全にＲＭ－サイレントなｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２Ｄｃｍ－（Ｄｃｍ－Ｅ．ｃｏｌｉにおいて増殖された）を使用して実証された（図２Ｄ）。
引き続いて、形質転換効率におけるさらなる増加がＳｙＭＰＬ（ミニサークル）アプローチを使用して達成できるかどうかを調査した。Ｄｃｍ－株Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７９６およびＥ．ｃｏｌｉ ＪＭＣ１を使用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２におけるＩＶ型系から独立してミニサークル（ＭＣ）実験を実施した。ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡ ｐＥＰＳＡ５ミニサークルを、ＪＥ２（ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２ＭＣ）について生成した；これは、ｐＥＰＳＡ５よりも３８％小さく、元のＥ．ｃｏｌｉレプリコンを含まない（図３Ａおよび１０）。
ｐＥＰＳＡ５上に存在するＳ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２ ＲＭ系標的の大多数は、Ｅ．ｃｏｌｉレプリコン中にあり（Ｉ型：ｎ＝２およびＩＶ型：ｎ＝８）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓレプリコン中は単一のＩ型系標的のみが存在する（図９Ａ）、したがって、ＭＣアプローチは、３つのＩ型標的のうち２つを排除する。ここでの焦点は、以下を調査することにあった：１）ＳｙＭＰＬアプローチが、ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡアプローチと等しい、またはおそらくはＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡアプローチよりもさらに高い効率を達成するかどうか、および２）全てのＩ型標的の除去が、（残りの単一のＩ型標的を有する、部分的ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡのプラスミドと比較して）形質転換効率における感知できる上昇を達成するために要求されるかどうか。元のプラスミドｐＥＰＳＡ５（Ｄｃｍ＋）は、効率の正確な最終比較のための対照として実験に含め、一次比較とは見なさなかった。ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２ＭＣバリアントは、約２×１０７形質転換体／μｇ ＤＮＡ、ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２を超える、形質転換効率におけるさらなる３．５倍の増加（ｐ＝１．７８×１０－９）、および元の未改変のｐＥＰＳＡ５プラスミド（Ｄｃｍ＋Ｅ．ｃｏｌｉにおいて増殖された）と比較した＞１００，０００倍の増加（ｐ＝１．９７×１０－２８４）を達成した（図３Ｂ、表２～３）。
ＳｙＭＰＬ実験では、ＭＣプラスミドの全体的サイズを低減させることによって、形質転換に使用したＤＮＡのμｇ内に存在するＳ．ａｕｒｅｕｓレプリコンの数もまた、全長プラスミドについて使用したμｇと比較して増加した。機能的レプリコン／μｇ ＤＮＡの収量を増加させることは、ＭＣアプローチのさらなる利点であり得る。したがって、ＭＣプラスミドと全長プラスミドとの間で形質転換効率をより正確に比較するために、ＣＦＵ／μｇ ＤＮＡからＣＦＵ／ｐｍｏｌ ＤＮＡまでの形質転換効率を調整した二次分析を実施した（図３Ｃ、表４）。
ＣＦＵ／ｐｍｏｌ ＤＮＡ基準で、ＭＣバリアントｐＥＰＳＡ５ＭＣＤｃｍ－は、元のプラスミドｐＥＰＳＡ５Ｄｃｍ－を超えて、形質転換効率における４３６倍の増加を達成した（ｐ≦１．０×１０－３０６）。この増加は、ＭＣバリアントにおける、Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンと共に、２つのＩ型標的モチーフが排除されたこと（図１０Ａ、Ｂ）、もしくはより小さいＭＣが、電気穿孔の間にＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞表層において形成される可逆的孔をより容易に通過すること、またはそれら両方の組合せに起因し得る。プラスミドｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２を超えて、ＭＣバリアントｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２ＭＣ（これらは共に、ＪＥ２において完全にＲＭ－サイレントである）によって達成される、形質転換効率における比較的小さい２．３倍（ｐ＝１．２９×１０４）の増加は、第１の可能性を好む。対照的に、ｐＥＰＳＡ５ＭＣおよびｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２ＭＣは、それぞれ、単一のＩ型標的の存在または非存在のみが異なる（図３Ａ）。この単一の標的配列を排除することで、形質転換効率における中程度の１．５倍（ｐ＝１．０１－１４）の増加が生じた。
（実施例４）
単一の株における異なるＲＭ系の相対的寄与
定義により、完全にＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡのプラスミドは、宿主株内の全ての（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型）ＲＭ系に関してサイレントであり、形質転換効率を最大化するように設計される。さらに、部分的ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡのプラスミドの相補的なセットの生成は、宿主株内の異なるＲＭ系の相対的寄与を決定するために使用され得る。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２は、メチル化されたＳ５ｍＣＮＧＳモチーフ（ｍ５Ｃまたは５ｈｍＣのいずれか）（式中、ＳはＣまたはＧである）を標的とするＩＶ型制限系、ＳａｕＵＳＩ（Xu SY, et al., (2011) Nucleic Acids Res39(13):5597-5610）に加えて、メチル化されていない二分割配列モチーフを標的とする２つの活性なＩ型ＲＭ系を含む（図２Ａ）。Ｄｃｍオーファンメチルトランスフェラーゼを含むＥ．ｃｏｌｉ株において増殖されたプラスミドツールは、Ｃ５ｍＣＷＧＧモチーフにおいてメチル化され、このモチーフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓへの形質転換の際にこの制限系による分解に対する脆弱性を生じるＳａｕＵＳＩ標的モチーフ（ＳＣＮＧＳ）と重複する。したがって、完全にＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡのプラスミド（ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２Ｄｃｍ－）に加えて、部分的ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡのプラスミド、つまり、一方は、Ｉ型系に対してＲＭ－サイレントであるが、ＩＶ型系に対してはＲＭ－サイレントでなく（ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２Ｄｃｍ＋）、もう一方はその逆である（ｐＥＰＳＡ５Ｄｃｍ－）プラスミドを生成して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２における遺伝的障壁への、Ｉ型またはＩＶ型系の相対的寄与を決定した。この型の実験的アプローチは、Ｉ型系のサイレンシングおよびＩＶ型系のサイレンシングを交差させる２×２要因計画とみなすことができる。
単一の株における異なるＲＭ系の相対的寄与
定義により、完全にＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡのプラスミドは、宿主株内の全ての（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型）ＲＭ系に関してサイレントであり、形質転換効率を最大化するように設計される。さらに、部分的ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡのプラスミドの相補的なセットの生成は、宿主株内の異なるＲＭ系の相対的寄与を決定するために使用され得る。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２は、メチル化されたＳ５ｍＣＮＧＳモチーフ（ｍ５Ｃまたは５ｈｍＣのいずれか）（式中、ＳはＣまたはＧである）を標的とするＩＶ型制限系、ＳａｕＵＳＩ（Xu SY, et al., (2011) Nucleic Acids Res39(13):5597-5610）に加えて、メチル化されていない二分割配列モチーフを標的とする２つの活性なＩ型ＲＭ系を含む（図２Ａ）。Ｄｃｍオーファンメチルトランスフェラーゼを含むＥ．ｃｏｌｉ株において増殖されたプラスミドツールは、Ｃ５ｍＣＷＧＧモチーフにおいてメチル化され、このモチーフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓへの形質転換の際にこの制限系による分解に対する脆弱性を生じるＳａｕＵＳＩ標的モチーフ（ＳＣＮＧＳ）と重複する。したがって、完全にＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡのプラスミド（ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２Ｄｃｍ－）に加えて、部分的ＳｙｎｇｅｎｉｃＤＮＡのプラスミド、つまり、一方は、Ｉ型系に対してＲＭ－サイレントであるが、ＩＶ型系に対してはＲＭ－サイレントでなく（ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２Ｄｃｍ＋）、もう一方はその逆である（ｐＥＰＳＡ５Ｄｃｍ－）プラスミドを生成して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＥ２における遺伝的障壁への、Ｉ型またはＩＶ型系の相対的寄与を決定した。この型の実験的アプローチは、Ｉ型系のサイレンシングおよびＩＶ型系のサイレンシングを交差させる２×２要因計画とみなすことができる。
標準的なＤｃｍ＋実験室株であるＥ．ｃｏｌｉＮＥＢアルファにおいて増殖された元のｐＥＰＳＡ５プラスミドは、一貫して不十分な形質転換効率（約１０ＣＦＵ／μｇ ＤＮＡ）を達成した。このプラスミドは、１１個の個々のＲＭ標的モチーフを含む（Ｉ型；ｎ＝３およびＩＶ型；ｎ＝８）（図９Ａ）。両方の系型が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおける外来ＤＮＡからの防御に能動的に関与することが公知である（Monk IR, et al. (2012) Front Cell Infect Microbiol 2:49；Jones MJ, et al. (2015) PLoS One10(3):e0119487；Monk IR, et al. (2015) MBio 6(3):e00308-00315；Monk IR, et al., (2012) MBio 3(2)）。プラスミド（ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２Ｄｃｍ＋）からのＩ型標的モチーフのみの排除は、形質転換効率における１３倍の増加（ｐ＝２．７５×１０－１３）を達成した。対照的に、Ｄｃｍ欠損株Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７９６（ｐＥＰＳＡ５Ｄｃｍ－）を介してｐＥＰＳＡ５を継代することによる、ＩＶ型系標的のみの排除は、効率における＞１３９倍の増加（ｐ＝２．４８×１０－６９）を達成した。しかし、Ｉ型標的およびＩＶ型標的の両方を排除した場合（ｐＥＰＳＡ５ＳｙｎＪＥ２Ｄｃｍ－）、形質転換効率に対する超乗法（supra-multiplicative）効果（相加効果ではなく）が観察され、元のｐＥＰＳＡ５Ｄｃｍ＋プラスミド（相互作用についてのｐ＝６．９８×１０－２７）と比較して、約７０，０００倍（ｐ＝７．７６×１０－３０６）の増加である。
上記種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。２０１９年２月６日出願の米国特許出願第６２／８０２，０１６号を含む、本明細書で言及されるおよび／または出願データシート中に列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの実施形態の態様は、なおさらなる実施形態を提供するために、種々の特許、出願および刊行物の概念を必要に応じて使用するために、改変され得る。
これらおよび他の変化が、上の詳細な説明に照らして、実施形態に対してなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に限定すると解釈すべきではなく、かかる特許請求の範囲が権利付与される均等物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
Claims (66)
- 外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む親プラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌。
- 外因性核酸配列を含むミニサークルプラスミドを含む操作された細菌であって、低減されたＤＮＡメチル化能力を有するように、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損している、操作された細菌。
- 前記外因性核酸配列が、前記操作された細菌と同じ種の参照細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、請求項１または２に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも内因性メチルトランスフェラーゼの前記それぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする前記遺伝子における前記改変が、トランケート型メチルトランスフェラーゼを産生する、請求項１から４のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基をメチル化し、式中、前記ＷがＡまたはＴである、請求項１から５のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＧＡＴＣ、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ、またはそれら両方のアデノシン残基をメチル化する、請求項１から６のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、シトシン残基およびアデノシン残基をメチル化する、請求項１から７のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの組合せを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを含む、請求項９に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、請求項９または１０のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼおよび前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼおよび前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼおよび前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、請求項９から１４のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼおよび前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、請求項９から１５のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、請求項９から１６のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、請求項９から１６のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、請求項９から１８のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、請求項９から１８のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが存在しない、請求項９から２０のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが非機能的である、請求項９から２０のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記親プラスミドが、前記ミニサークル核酸配列の外側に複数の制限部位を含む、請求項１または３から２３のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 誘導性ΦＣ３１インテグラーゼをさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記誘導性ΦＣ３１インテグラーゼが、アラビノースによって誘導される、請求項２５に記載の操作された細菌。
- 誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の操作された細菌。
- 前記誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼが、アラビノースによって誘導される、請求項２７に記載の操作された細菌。
- 請求項１から２８のいずれか一項に記載の操作された細菌を含むキット。
- 請求項１から２８のいずれか一項に記載の操作された細菌または請求項２９に記載のキットから産生されたミニサークル（ＭＣ）プラスミド。
- 請求項１から２８のいずれか一項に記載の操作された細菌である第１の細菌において、外因性ＤＮＡ配列を含むミニサークルを産生するステップ；および
前記ミニサークルを第２の細菌中に形質転換するステップであって、前記ミニサークルが、前記第２の細菌中に形質転換された場合に、分解に対して耐性である、ステップ
を含む方法。 - 少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損するように、前記第１の細菌を操作するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
- 前記操作するステップが、ＣＲＩＳＰＲ媒介性リコンビニアリングによって、前記少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を編集するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
- 親プラスミドを、少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが欠損した操作された細菌中に形質転換するステップであって、前記親プラスミドが、外因性核酸配列を含むミニサークル核酸配列を含む、ステップ；および
前記ミニサークル核酸配列を含むミニサークルを産生するステップ
を含む方法。 - 前記外因性核酸配列が、前記操作された細菌と同じ種の参照細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、請求項３４に記載の方法。
- 前記操作された細菌が、前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼのそれぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子における改変を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
- 前記少なくとも内因性メチルトランスフェラーゼの前記それぞれの内因性メチルトランスフェラーゼをコードする前記遺伝子における前記改変が、トランケート型メチルトランスフェラーゼを産生する、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＣＣＷＧＧのシトシン残基をメチル化し、式中、前記ＷがＡまたはＴである、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、配列ＧＡＴＣ、配列ＡＡＣＮ６ＧＴＧＣ、またはそれら両方のアデノシン残基をメチル化する、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、シトシン残基およびアデノシン残基をメチル化する、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ、ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの組合せを含む、請求項３４から４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼを含む、請求項４１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、請求項４１または４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼおよび前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼを含む、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼおよび前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、請求項４１から４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼおよび前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、請求項４１から４６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの内因性メチルトランスフェラーゼが、前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼおよび前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼを含む、請求項４１から４７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、請求項３８から４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｄａｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、請求項３８から４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが存在しない、請求項３８から５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｄｃｍメチルトランスフェラーゼが非機能的である、請求項３８から５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが存在しない、請求項３８から５２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨｓｄＭメチルトランスフェラーゼが非機能的である、請求項３８から５２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項３４から５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親プラスミドが、前記ミニサークル核酸配列の外側に複数の制限部位を含む、請求項３４から５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細菌が、誘導性ΦＣ３１インテグラーゼをさらに含む、請求項３４から５６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記誘導性ΦＣ３１インテグラーゼが、アラビノースによって誘導される、請求項５７に記載の方法。
- 前記操作された細菌が、誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項３４から５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記誘導性Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼが、アラビノースによって誘導される、請求項５９に記載の方法。
- 宿主細胞であって、前記宿主細胞にとって外因性である核酸配列を含むプラスミドを含み、前記外因性核酸配列が、参照Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌ではメチル化される複数のメチル化部位においてメチル化を欠如する、宿主細胞。
- 前記プラスミドが、細菌複製起点を欠如する、請求項６１に記載の宿主細胞。
- 前記プラスミドが、抗生物質耐性マーカーを欠如する、請求項６１に記載の宿主細胞。
- 前記プラスミドがミニサークルである、請求項６１から６３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記プラスミドが親プラスミドである、請求項６１に記載の宿主細胞。
- 前記親プラスミドが、細菌複製起点、抗生物質耐性マーカー、またはそれら両方を含む、請求項６５に記載の宿主細胞。
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