JP2018048192A - ｃ−Ｍｅｔ抗体およびＶＥＧＦ結合断片が連結された融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】 ｃ−Ｍｅｔ抗体およびＶＥＧＦ結合断片が連結された融合タンパク質の提供。
【解決手段】 抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ結合断片が連結された融合タンパク質、前
記融合タンパク質を含む二重特異性抗体、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオ
チド、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体、前記二重特異性抗体を有効成分として含
む医薬組成物、および抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦ結合断片を連結するステップを含む
抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする二
重特異性抗体の製造方法。
【選択図】 図２Ａ

Description

本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ結合断片を含む融合タンパク質、前記融合タン
パク質を含む二重特異性抗体、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記
ポリヌクレオチドを含む形質転換体、前記二重特異性抗体を有効成分として含む医薬組成
物、および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程を含む抗がんおよび新生
血管抑制効能が改善されたｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする融合タンパク質およ
び二重特異性抗体の製造方法に関する。

ｃ−Ｍｅｔは、細胞の表面に存在する代表的な受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＲＴＫ）であり、そのリガンドである肝細胞成
長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）と結合して細胞
内シグナル伝達を促して細胞の成長を促すだけではなく、がん細胞に過剰発現されて発が
ん、がん転移、がん細胞移動、がん細胞浸潤、新生血管形成にも広範に関与する。ｃ−Ｍ
ｅｔは、種々のがんにおいて過剰発現されており、特に、ｃ−Ｍｅｔの過剰発現がある患
者はがんの治療予後が悪い場合がほとんどである。

血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）は正常細胞にも存在し、特に、がん細胞から分泌さ
れてその受容体であるＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して血管新生（
ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を引き起こし、がん細胞にはその新たな血管を介して成長に
必要な栄養分が供給される。

この理由から、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦは両方とも抗がん剤の開発に際して標的としての
重要性が高く、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする抗体およびこれらを用いるがん
治療技術の開発が求められる。

ＵＳ２０１０００７６１７８ ＵＳ２０１００２６０６６８

本発明の目的は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ結合断片を含む融合タンパク質を提供す
ることである。

本発明の他の目的は、前記融合タンパク質を有効成分として含むｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦ
を同時に標的とする二重特異性抗体を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供
することである。

本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体を提供することで
ある。

本発明のさらに他の目的は、前記二重特異性抗体を有効成分として含む医薬組成物を提
供することである。

本発明のさらに他の目的は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程を含
む、抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とす
る二重特異性抗体の製造方法を提供することである。

本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片およびＶＥＧＦ結合断片を含む、
融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合
可能な二重特異性を有することから、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的としてがん細胞
の成長と血管新生を効果的に阻害して、改善された抗がん効果および／または血管新生阻
害効果を得ることができる。

前記ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合可能な融合タンパク質は、ｃ−Ｍｅｔを標的と
することによりがん細胞の成長自体を阻害することができ、同時にＶＥＧＦを標的とする
ことにより新生血管の形成を遮断し且つがん細胞の成長に欠かせない栄養分の供給を防い
でがん細胞の成長をさらに阻害することにより、がん細胞成長の阻害および／または新生
血管の形成の阻害に際してより一層増進された相乗効果を期待することができる。

本発明の実施形態において、ＶＥＧＦ結合断片と、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原
結合断片、または前記抗体の変形体とが連結された融合タンパク質が提供される。本発明
の他の例において、前記融合タンパク質を含む、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合可能
な二重特異性抗体（二重標的抗体とも言う）が提供される。具体的に、ＶＥＧＦ結合断片
と、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体とを含む融合
タンパク質を含む、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦの二重特異性抗体が提供される。

本発明のさらに他の実施形態においては、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドおよび前記ポリヌクレオチドが取り込まれた形質転換体が提供される。前記形質転
換体は、前記融合タンパク質または二重特異性抗体の産生に使用可能である。

本発明のさらに他の実施形態においては、前記融合タンパク質または二重特異性抗体を
有効成分として含む医薬組成物が提供される。前医薬学組成物は、ｃ−Ｍｅｔおよび／ま
たはＶＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療効果を有するものであってもよく、例え
ば、抗がん剤または新生血管生成阻害剤であってもよい。

本発明のさらに他の実施形態において、前記二重特異性抗体の治療的な有効量を投与す
るステップを含むｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療
方法が提供される。

本発明のさらに他の実施形態においては、前記形質転換体を培養して融合タンパク質を
発現させたり、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片または前記抗体の変形体にＶ
ＥＧＦ結合部位を連結する工程を含む、抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたｃ−
ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする二重特異性抗体の製造方法が提供される。

本発明のさらに他の実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片、
または前記抗体の変形体にＶＥＧＦ結合断片を連結して抗がん効能および／または新生血
管形成抑制効能が増進されたｃ−Ｍｅｔ抗体を製造する方法が提供される。

本発明のさらに他の実施形態において、前記融合タンパク質を有効成分として含むｃ−
Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦの同時検出用組成物が提供される。

本発明のさらに他の実施形態において、前記融合タンパク質を有効成分として含むｃ−
Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病の診断用組成物が提供される。

前記血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）は正常細胞にも存在し、特に、がん細胞から分
泌されてその受容体であるＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して血管新
生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を引き起こし、がん細胞にはその新たな血管を介して成
長に必要な栄養分が供給される。ＶＥＧＦの過発現は様々な疾病の原因となり、特に、発
がんだけではなく、侵襲、転移などの悪い予後にも関与する。この理由から、ＶＥＧＦは
抗がん療法に際して重要な標的となる。

前記ＶＥＧＦは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類などをはじ
めとする哺乳類由来のものであってもよい。例えば、前記ＶＥＧＦタンパク質は、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１０２５３６６．２、ＮＭ＿００１０２５３６７．２、ＮＭ
＿００１０２５３６８．２、ＮＭ＿００１０２５３６９．２、ＮＭ＿００１０２５３７０
．２、ＮＭ＿００１０３３７５６．２、ＮＭ＿００１１７１６２２．１、ＮＭ＿００１１
７１６２３．１、ＮＭ＿００１１７１６２４．１、ＮＭ＿００１１７１６２５．１、ＮＭ
＿００１１７１６２６．１、ＮＭ＿００１１７１６２７．１、ＮＭ＿００１１７１６２８
．１、ＮＭ＿００１１７１６２９．１、ＮＭ＿００１１７１６３０．１、ＮＭ＿００１２
０４３８４．１、ＮＭ＿００１２０４３８５．１、ＮＭ＿００３３７６．５などに供され
たヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によってコードされたポリペプチドであってもよい。

前記「ｃ−Ｍｅｔタンパク質」とは、肝細胞成長因子と結合する受容体チロシンキナー
ゼを意味する。前記ｃ−Ｍｅｔタンパク質はあらゆる種に由来のものであってもよく、例
えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０００２３６）、サルｃ−Ｍｅｔ（例えば、アカ
ゲザル、ＮＰ＿００１１６２１００）などの霊長類由来のもの、またはマウスｃ−Ｍｅｔ
（例えば、ＮＰ＿０３２６１７．２）、ラットｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿１１３７０５
．１）などのげっ歯類由来のものなどであってもよい。前記タンパク質は、例えば、Ｇｅ
ｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００２４５に供されたヌクレオチド配列によってコードされ
たポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００２３６に供されたポリペプ
チド配列によってコードされたタンパク質、またはその細胞外ドメインを含む。受容体チ
ロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、発がん、がん転移、がん細胞移動、がん細胞浸潤
、新生血管生成過程などの種々の機序に関与する。

前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体はｃ−Ｍｅｔを特異的に認識するタンパク質であり、ｃ−Ｍｅｔ
のみを認識する単一標的抗体であってもよく、この詳細については、後述する。

前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗原結合断片は、後述する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の相補性決定領域
（ＣＤＲ）、ＣＤＲとＦｃ領域、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'またはＦ
（ａｂ'）_２などよりなる群から選ばれたものであってもよく、この詳細については、後
述する。

抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が用いられる場合、ＶＥＧＦ結合断片は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のＣ−末
端に好適なペプチドリンカーを介してまたは介さずに連結され得る。また、抗ｃ−Ｍｅｔ
抗体の抗原結合断片が用いられる場合、ＶＥＧＦ結合断片は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗原結
合断片のＮ−末端および／またはＣ−末端の両方に連結可能であり、好適なペプチドリン
カーを介してまたは介さずに連結され得る。

前記抗体の変形体は、自然系に存在するヒトおよび動物抗体のアイソタイプ、および／
またはヒンジを構成するアミノ酸が変形されたあらゆるヒトおよび動物抗体のＦｃを含む
ものなどであってもよく、この詳細については、後述する。本発明において、別途の断り
のない限り、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、上述した変形体を含むものであると理解される。

前記融合タンパク質のＶＥＧＦ結合断片は、ＶＥＧＦと結合する分子、例えば、ＶＥＧ
Ｆ受容体、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦ結合タンパク質、または前記ＶＥＧＦ結合タン
パク質のＶＥＧＦ結合部位を含む断片、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片またはＶ
ＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ結合部位であってもよい。例えば、前記抗ＶＥＧＦ抗体はベバシ
ズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）であってもよく、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片
は前記抗ＶＥＧＦ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）または可変領域、ＣＤＲとＦｃ領域の
組み合わせ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２などよりなる
群から選ばれたものであってもよい。前記ＶＥＧＦ受容体は、例えば、ヒトのＶＥＧＦ受
容体１（ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １；Ｐ１７９４８．２；配列番号１
０９）、ヒトのＶＥＧＦ受容体２（ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２；Ｐ３
５９６８．２）、ヒトのＶＥＧＦ受容体３（ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
３；Ｐ３５９１６．３）などであってもよい。なお、前記ＶＥＧＦ結合タンパク質のＶＥ
ＧＦ結合部位を含む断片は、第２Ｉｇ様ドメイン２（ＶＩＧ２）またはＶＥＧＦ受容体の
うちの前記ＶＩＧ２部位を含むポリペプチドであってもよい。例えば、ヒトのＶＥＧＦ受
容体１のＶＥＧＦ結合部位を含む断片は、第２Ｉｇ様ドメイン２（ＶＩＧ２；例えば、Ｐ
１７９４８．２のアミノ酸配列（配列番号１０９）の１２９番目から２２９番目までのア
ミノ酸配列（配列番号１１０））、または前記配列番号１０９のアミノ酸のうち前記ＶＩ
Ｇ２を含んで連続する１０２〜１３３８個のアミノ酸を含むポリペプチドなどであっても
よい。

このため、本発明の一態様において、前記ＶＥＧＦ結合断片は、ベバシズマブなどの抗
ＶＥＧＦ抗体、前記抗ＶＥＧＦ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲとＦｃ領域、ｓ
ｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'またはＦ（ａｂ'）_２などよりなる群から選ば
れた抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片、ＶＥＧＦ受容体（例えば、配列番号１０９）、また
は前記ＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ結合部位（例えば、配列番号１１０のＶＩＧ２、または
配列番号１０９のアミノ酸のうち配列番号１１０のＶＩＧ２を含んで連続する１０２〜１
３３８個のアミノ酸を含むポリペプチド）などであってもよい。

本発明の態様において、前記融合タンパク質または二重特異性抗体は、後述する抗−ｃ
−Ｍｅｔ抗体、その断片、または変形体のＦｃ部分にＶＥＧＦ結合断片、例えば、ＶＩＧ
２を連結したものであってもよい（図１参照）。

前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体と、ＶＥＧ
Ｆ結合断片はリンカーによって連結されたものであってもよい。前記リンカーは、１〜１
００個、好ましくは、２〜５０個、より好ましくは５〜３０個のアミノ酸長さのペプチド
リンカーであってもよく、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどからな
る群から選ばれる１種以上のアミノ酸を含むものであってもよいが、これらに制限されな
い。本発明の一実施形態において、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎで表わされるもので
あってもよく、前記ｎは、（ＧＧＧＧＳ）（配列番号１１６）単位体の繰り返し回数であ
り、二重特異性抗体の効能を考慮して１〜１０、好ましくは１〜５であってもよい。

本発明は、ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその断片にＶＥＧＦ結合断片（例えば、ＶＩＧ２）を
連結して二重特異性抗体として製作することにより、ｃ−Ｍｅｔ抗体の薬理学的な効果を
より一層増進することを特徴とする。

前記融合タンパク質または二重特異性抗体に用いられる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、あらゆる
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片であってもよい。特に、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
は、ｃ−Ｍｅｔの特定の部位、例えば、ＳＥＭＡドメイン内の特定の部位を連続する５以
上のアミノ酸からなるエピトープを特異的に認識し、結合し得る。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
は、ｃ−Ｍｅｔに作用して細胞内移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および分解（
ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘導するあらゆる抗体またはその抗原結合断片であってもよ
い。

肝細胞成長因子（ＨＧＦ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の受
容体であるｃ−Ｍｅｔは、細胞外部位、膜透過部位、細胞内部位の３つの部分に分けられ
る。細胞外部位の場合、ジスルフィド結合を通してα−サブユニットとβ−サブユニット
が連結された形であり、ＨＧＦ結合ドメインであるＳＥＭＡドメイン、ＰＳＩドメイン（
ｐｌｅｘｉｎ−ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍ
ａｉｎ）およびＩＰＴドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｆｏｌｄ
ｓｈａｒｅｄ ｂｙ ｐｌｅｘｉｎｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａ
ｃｔｏｒｓ ｄｏｍａｉｎ）からなる。ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメインは、配
列番号７９のアミノ酸配列を含むものであってもよく、ｃ−Ｍｅｔの細胞外部位に存在す
るドメインであり、ＨＧＦと結合する部位である。ＳＥＭＡドメインの特異的な領域、例
えば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）のアミノ酸配列の１０
６〜１２４番目のアミノ酸残基の範囲に相当する、配列番号７１のアミノ酸配列を含む領
域は、ＳＥＭＡドメインのエピトープを持つ２番目と３番目のプロペラ構造の間にあるル
ープ領域である。この領域は、本発明に係る特異的な抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のエピトープとし
て働く。

用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔ
ｅｒｍｉｎａｎｔ）であり、抗体によって認識される抗原の一部分を意味するものである
と解釈される。本発明の一実施形態によれば、前記エピトープは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質
のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の連続する５以上のアミノ酸を含む部位、例えば
、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の１０６番目から１２４
番目までに相当する配列番号７１内に位置する連続する５個〜１９個のアミノ酸を含むも
のであってもよい。例えば、前記エピトープは、配列番号７１のアミノ酸配列のうち配列
番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含んで連続する５〜１９個のアミノ酸からなるものであっても
よく、例えば、配列番号７１、配列番号７２または配列番号７３のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドであってもよい。

前記配列番号７２のアミノ酸配列を含むエピトープは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭ
Ａドメイン内の２番と３番のプロペラ構造のドメイン間のループ領域のうちの最外側に位
置する部位に相当し、前記配列番号７３のアミノ酸配列を含むエピトープは、本発明の一
実施形態による抗体が比較的に特異的に結合する部位である。

このため、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号配列番号７１のアミノ酸配列のうち配列番号
７３（ＥＥＰＳＱ）を含んで連続する５〜１９個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に
結合するものであってもよく、例えば、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７
３のアミノ酸配列を含むエピトープに特異的に結合する抗体であってもよい。

本発明の一態様によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号
２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸残基を含む連続する８〜１９個
のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列、
配列番号８５のアミノ酸配列または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目ま
でのアミノ酸残基を含む６〜１３個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ
−Ｈ３、からなる群から選択された１以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配
列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８の
アミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のア
ミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸残
基を含む配列番号８９の９〜１７個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ
−Ｌ３からなる群から選択された１以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記配列番号４〜９は、それぞれ下記の一般式Ｉ〜一般
式ＶＩで表わされるアミノ酸配列であるものであってもよい：
一般式Ｉ
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号４）、
一般式ＩＩ
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ_５−Ｔｈｒ（配列番号
５）、
一般式ＩＩＩ
Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ_６−Ｔｙｒ（配列番号６）、
一般式ＩＶ
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_７−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘａａ_８−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ_９−Ｘａａ_１０−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号７）
一般式Ｖ
Ｔｒｐ−Ｘａａ_１１−Ｓｅｒ−Ｘａａ_１２−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘａａ_１３（配列番号８
）
一般式ＶＩ
Ｘａａ_１４−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_１５−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１６−Ｔ
ｈｒ（配列番号９）
前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ_１は存在しないか、あるいは、ＰｒｏまたはＳｅｒであ
り、Ｘａａ_２はＧｌｕまたはＡｓｐであり、
前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ_３はＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_４はＡｌａま
たはＶａｌであり、Ｘａａ_５はＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ_６はＳｅｒまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ_７はＨｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘ
ａａ_８はＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ_９はＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ_１０
はＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ_１１はＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ_１２はＴｈｒ
またはＬｙｓであり、Ｘａａ_１３はＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ_１４はＧｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ_１
５はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_１６はＬｅｕ
、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。

本発明の一実施形態において、前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、配列番号２２、配列
番号２３および配列番号２４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであっても
よい。前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群
から選ばれるアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３
、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群から選ばれるアミノ酸配
列を含むものであってもよい。

前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配
列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群から選ばれるアミノ酸配列
を含むものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１、配列番号３４、配列番
号３５、および配列番号３６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであっても
よい。前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５
、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群から選ば
れるアミノ酸配列を含むものであってもよい。

本発明の一実施形態において、前記抗体は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３
および配列番号２４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−
Ｈ１）、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選ばれるアミノ
酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号３、配列番号２７、配列番
号２８、および配列番号８５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド（
ＣＤＲ−Ｈ３）を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配
列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群から選ばれ
るアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１１、配列番号３４、配
列番号３５、および配列番号３６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５
、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群から選ば
れるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ３）を含む軽鎖可変領域と、を含むも
のであってもよい。

所望の抗原を非免疫動物に免疫させて産生する動物由来の抗体は、一般に、治療目的で
ヒトに投与するときに免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制
するためにキメラ型抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ
型抗体は、遺伝工学的な方法を用いて抗アイソタイプ（ａｎｔｉ−ｉｓｏｔｙｐｅ）反応
の原因となる動物由来の抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キ
メラ型抗体は、動物由来の抗体に比べて抗アイソタイプ反応においてかなり改善されたが
、依然として動物由来のアミノ酸が可変領域に存在しているため潜在的な抗イディオタイ
プ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を抱えている。このような副作
用を改善するために開発されたものが、ヒト化抗体である。これは、キメラ型抗体の可変
領域のうち抗原の結合に重要な役割を果たす相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅ
ｎｔａｒｉｔｉｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格(フレ
ームワーク、ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植（挿入）して製作される。

ヒト化抗体を製作するためのＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術に最も重要なのは、
動物由来の抗体のＣＤＲ部位を最も上手に取り入れ得る最適化したヒト抗体を選定するこ
とであり、このために、抗体データベースの活用、結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ）の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかしながら、たとえ最適
化したヒト抗体骨格に動物由来の抗体のＣＤＲ部位を移植するとしても、動物由来の抗体
の骨格に位置して抗原結合に影響するアミノ酸が存在する場合があるため抗原結合力が保
存できない場合が多く存在するため、抗原結合力を復元するためのさらなる抗体工学技術
の適用は欠かせないものであるといえる。

本発明の一実施形態によれば、前記抗体は、マウス由来の抗体、マウス−ヒトキメラ抗
体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。

完全な抗体は、２つの全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２つの全長重鎖を有
する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合によって連結されている。抗
体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（
γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）タイプを有
し、サブカラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ
４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は
カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。

「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」の用語は、抗原に特異性を与えるために十分な可
変領域配列を含むアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶ_Ｈおよび３個の不変領域ドメイ
ンＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３とヒンジを含む全長重鎖およびこの断片をいずれも含む意
味であると解釈される。また、「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」の用語は、抗原に特
異性を与えるために十分な可変領域配列を含むアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶ_Ｌ
および不変領域ドメインＣ_Ｌを含む全長軽鎖およびこの断片をいずれも含む意味であると
解釈される。

「相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎ
ｇ ｒｅｇｉｏｎ）」の用語は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高度可変領域（ｈｙ
ｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は
それぞれ３個のＣＤＲを含んでいてもよい（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３および
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに
結合するに際して重要な接触残基（ｃｏｎｔａｃｔ ｒｅｓｉｄｕｅ）を提供することが
できる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当
業者にとって一般的に公知となっている意味と同じものであり、抗原および抗体が特異的
に相互作用して免疫学的な反応をすることを意味する。

前記抗原結合断片は、免疫グロブリンの全体構造に関するその断片であり、抗原が結合
可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ＣＤＲ、ＣＤＲとＦｃ領域、
ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'またはＦ（ａｂ'）_２であってもよいが、こ
れに限定されない。

前記抗原結合断片のうちのＦａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域およ
び重鎖の最初の不変領域（Ｃ_Ｈ１）を有する構造であり、１つの抗原結合部位を有する。

Ｆａｂ'は、重鎖Ｃ_Ｈ１ドメインのＣ末端に１以上のシステイン残基を含むヒンジ領域
を有するという点でＦａｂとは相違点がある。

Ｆ（ａｂ'）_２抗体は、Ｆａｂ'のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をな
しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の
抗体欠片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業者にとって周知である。

二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は非共有結合によって重鎖可変部位と軽鎖可
変部位が連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般に、
ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合によって連結され
るか、あるいは、Ｃ末端において直結されているため、二重鎖Ｆｖのようにダイマーと同
じ構造を有することができる。

前記抗原結合断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗
体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ
'）_２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を用いて製作することができる。

「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」の用語は、抗体の重鎖に含まれている領
域であり、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性を提供す
る機能をする領域を意味する。

動物由来の抗体がキメラ化（ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）過程を経ると、動物由来の
ＩｇＧ１ヒンジはヒトＩｇＧ１ヒンジで置換されるが、動物由来のＩｇＧ１ヒンジはヒト
ＩｇＧ１ヒンジに比べてその長さが短く、２つの重鎖間のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌ
ｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）が３個から２個に減少してヒンジの硬直性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が
互いに異なる効果を示す。このため、ヒンジ領域の修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は
、ヒト化抗体の抗原結合効率性を増大させることができる。前記ヒンジ領域のアミノ酸配
列を変形するためのアミノ酸の欠失、付加または置換方法は当業者にとって周知である。

このため、本発明の一実施形態において、抗原結合効率性を増進するために、前記抗ｃ
−Ｍｅｔ抗体または抗原結合断片は１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸が欠失、付加または置換されてアミノ酸配列が変
形されたヒンジ領域を含むものであってもよい。例えば、前記抗体は、配列番号１００（
Ｕ７−ＨＣ６）、配列番号１０１（Ｕ６−ＨＣ７）、配列番号１０２（Ｕ３−ＨＣ９）、
配列番号１０３（Ｕ６−ＨＣ８）、配列番号１０４（Ｕ８−ＨＣ５）、または配列番号１
０５（非修飾ヒトヒンジ領域）のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含むものであってもよ
い。

前記ＣＤＲ領域、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を除く重鎖不変領域および軽鎖不変
領域は、全ての免疫グロブリンのサブタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ
（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）の重鎖不変領域および軽鎖
不変領域であってもよい。

本発明の一実施形態によれば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合断片において、前記重
鎖可変領域は、配列番号１７、配列番号７４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９
１、配列番号９２、配列番号９３または配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可
変領域は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号７５、
配列番号８８、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９
９、または配列番号１０７のアミノ酸配列を含むものであってもよい。

本発明の一実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００
２２０であるハイブリドーマ細胞から産生される、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の細胞外部位（
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ）に特異的に結合するモノクローナルモノク
ローナル抗体であってもよい（大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号参照；前
記文献は本明細書に参照により取り込まれる）。

前記の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号に定義さ
れた抗体をいずれも含んでいてもよい。

本発明の一実施形態において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２（これらの中で
、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６
２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４（これらの中で、１番目
から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６４の１８
番目から４６１番目までのアミノ酸配列、および配列番号６６（これらの中で、１番目か
ら１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６６の１８番
目から４６０番目までのアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖と
、配列番号６８（これらの中で、１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプ
チドである）または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽
鎖からなる抗体、配列番号７０（これらの中で、１番目から１７番目までのアミノ酸配列
はシグナルペプチドである）または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ
酸配列または配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖と、からなる抗体であってもよい
。

例えば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目か
ら２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目か
ら２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目か
ら２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目か
ら２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６０番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目か
ら２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目か
ら２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、また
は
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体であっ
てもよい。

一方、前記配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号１３のＣＤＲ
−Ｌ３重鎖可変領域とヒトのカッパ不変領域を含む軽鎖であり、配列番号６８のアミノ酸
配列を含むポリペプチドは、前記配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおい
て３６番目（Ｋａｂａｔ番号付けによる、配列番号６８内の６２番目のアミノ酸位）のヒ
スチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）がチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）で置換された形のポリ
ペプチドである。前記置換によって、本発明の一実施形態による抗体の産生量が増大され
得る。また、前記配列番号１０８のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、前記配列番号６
８のアミノ酸配列のうち１番目から２０番目までのシグナルペプチドを除く２１番目から
２４０番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいてＫａｂａｔ番号付けによる２
７ｅ位置（Ｋａｂａｔ番号付けによる、配列番号１０８内の３２番目の位置；ＣＤＲ−Ｌ
１内部）のセリン（Ｓｅｒ）がトリプトファン（Ｔｒｐ）で置換されたものであり、前記
置換によって、本発明の一態様による抗体の活性（例えば、ｃ−Ｍｅｔへの結合親和度、
ｃ−Ｍｅｔ分解活性およびＡｋｔリン酸化抑制活性など）がさらに増進され得る。

本発明の一実施形態において、前記融合タンパク質または二重特異性抗体は、上述した
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のＦｃ部分または前記抗体の抗原結合断片のＮ末端またはＣ末端にＶＥ
ＧＦ結合断片（例えば、ＶＩＧ２）を上述したリンカーを介してまたは上述したリンカー
を介さずに連結したものであってもよい（図１参照）。

本発明の一態様において、前記融合タンパク質または二重特異性抗体は配列番号６２の
アミノ酸配列、配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６
４のアミノ酸配列、配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、配列番
号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配
列を含む重鎖、および配列番号６８、配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミ
ノ酸配列、配列番号７０、配列番号７０のアミノ酸配列２１番目から２４０番目までのア
ミノ酸配列、または配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであってもよい
前記ＶＥＧＦ結合断片（例えば、ＶＩＧ２またはこれを含むポリペプチドなど）は前記
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体以外の他の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と結合する場合にも抗体効能を増進させる
だけではなく、副作用（ａｇｏｎｉｓｍ）を顕著に減少させることが確認された（図５参
照）。

具体的に、上述したように、ＶＥＧＦ結合断片が結合することにより抗体効能および副
作用が改善され得るｃ−Ｍｅｔ抗体は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体以外のあらゆる抗ｃ−Ｍｅ
ｔ抗体であってもよく、例えば、配列番号１１２または配列番号１１４のアミノ酸配列を
含む重鎖および配列番号１１３または配列番号１１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むも
のであってもよく、より具体的に、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列
番号１１３のアミノ酸を有する軽鎖を含むものであってもよく、あるいは、配列番号１１
４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むもの
であってもよい。

前記ＶＥＧＦ結合断片と、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または前記抗体の抗原結合断片がリンカー
を介して、または介さずに連結された融合タンパク質は、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に
標的とする二重特異性抗体の製造のための前駆体として使用可能である。前記医薬組成物
は、前記二重特異性抗体の有効量と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または
賦形剤などを含むことができる。

前記医薬組成物に含まれる薬学的に許容可能な担体は、薬物の製剤化に汎用されるもの
であり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉
、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細
結晶性セルロース、ポリビニールピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロ
ース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステア
リン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群から選ばれた１種以上であってもよ
いが、これに限定されない。前記混合剤または薬学的組成物は、前記成分に加えて、医薬
組成物の製造に汎用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、
懸濁剤、保存剤などよりなる群から選ばれた１種以上をさらに含むことができる。

前記医薬組成物は、経口または非経口で投与可能である。非経口投与である場合には、
静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与
および直腸内投与などであってもよい。経口投与時に、タンパク質またはペプチドは消化
されることから、経口用組成物は活性薬剤をコーティング、または剤形化してもよい。な
お、前記組成物は、活性物質を標的細胞に輸送可能な任意の装置を使用して投与すること
ができる。

ここで用いられる薬学的な有効量の単語は、それぞれの活性成分が薬学的に最も影響を
及ぼすことができる量のことを指す。

前記医薬組成物の投与対象は、ヒト、サルなどの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯
類を含む哺乳類であってもよい。

１回投与のための前記医薬組成物内の有効成分である二重特異性抗体の有効量は、製剤
化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与間隔、投
与経路、***速度および反応感応性などの要因によって種々に処方可能である。例えば、
１回投与のための前記二重特異性抗体の有効量は、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは
１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。前記１回投与のための有効量は、単位服用量
の形態で一つの製剤に処方されてもよく、適切に分量して処方されてもよく、複数の投薬
用容器内に充填して製造されてもよい。

前記医薬組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液
の剤形に剤形化されてもよく、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、精製またはカプセル剤
などの剤形に剤形化されてもよく、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含んで
いてもよい。

特に、前記医薬組成物は二重特異性抗体を含むため、免疫リポソームに剤形化されても
よい。抗体を含むリポソームは当業者に広く知られている方法により製造されてもよい。
前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングリ
コール−誘導化ホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であってもよく、逆相
蒸発法によって製造可能である。例えば、抗体のＦａｂ''断片は、ジスルフィド交換反応
を通じてリポソームに接合可能である。ドキソルビシンなどの化学治療剤がさらにリポソ
ームに含まれ得る。

本発明において提案される医薬組成物は、ｃ−ＭｅｔおよびＶＥＧＦによって誘発され
る疾病、例えば、ｃ−Ｍｅｔの複製数の増加および／または発現量の増加および／または
ＶＥＧＦ過発現によって誘発される疾病、代表的に、がんまたはがん転移の予防および／
または治療に使用可能である。前記癌は、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを過発現するものであっ
てもよく、これに制限されないが、固形癌、例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小
細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直腸
癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿
道癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、膵臓癌、
膠芽腫、子宮頚部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腺腫、***癌、結腸癌、大腸癌、子
宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頚部癌、脳癌
、骨肉腫などよりなる群から選ばれた１種以上であってもよい。本発明の一態様において
、前記癌は、脳癌、胃腸癌、腎臓癌、または肺癌（例えば、扁平上皮癌、肺小細胞癌、非
小細胞性肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌など）であってもよい。前記癌は、原発性癌だけで
はなく、転移性癌も含む。さらに他の例において、前記ｃ−ＭｅｔおよびＶＥＧＦによっ
て誘発される疾病は、がん、妊娠糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑変性（例えば、湿性老人
性黄斑変性（ｗｅｔ ＡＭＤ）など）などであってもよい。

さらに他の例は、前記二重特異性抗体の治療的な有効量をｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶ
ＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療を必要とする患者に投与するステップを含むｃ
−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療方法と関連するもの
である。前記予防および／または治療方法は、前記投与ステップ前にｃ−Ｍｅｔおよび／
またはＶＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療を必要とする患者を確認するステップ
をさらに含んでいてもよい。前記予防および／または治療方法によって予防および／また
は治療可能なｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病は、上述した通りである。

また、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、代表的なＲＴＫ負調節因子であるＣｂｌに依存するこ
となく、Ｃｂｌによって媒介されるプロテアソーム経路ではないリソソーム経路を介して
ｃ−Ｍｅｔ分解活性を示すことができる。このように、Ｃｂｌの突然変異、Ｃｂｌの発現
量の減少、ｃ−ＭｅｔのＣｂｌ結合部位変異などの要因によってＣｂｌが正常に働かない
患者に投与するときにも、Ｃｂｌと独立して働く他の負調節因子であるＬＲＩＧ１を介し
てｃ−Ｍｅｔを抑制することができるため、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ拮抗剤の併用投
与はＣｂｌが正常に働かない患者に特に有効に適用され得る。

さらに、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはこの抗原結合断片およびＶＥＧＦ結合断片を含む融合
タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドを含む組換えベク
ターが提供される。また、前記ポリヌクレオチドまたは組換えベクターが取り込まれた組
換え細胞が提供される。前記ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞は、前記融合タ
ンパク質または二重特異性抗体の産生に使用可能である。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはこ
の抗原結合断片およびＶＥＧＦ結合断片は、上述した通りである。

「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」の用語は、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるた
めの手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオ
ファ-ジベクター、アデノウィルスベクター、レトロウィルスベクターおよびアデノ随伴
ウィルスベクターなどのウィルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用可能な
ベクターは、当業界において頻用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１
０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐ
ＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４
、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇ
ｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウィルス（例えば、Ｓ
Ｖ４０など）を操作して製作可能であるが、本発明はこれに制限されない。

前記組換えベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドはプロモータに作動可能に連結さ
れ得る。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは
、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモータ配列）と他のヌクレオチド配列との間
の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、「作動的に連結」されることにより、他の
ヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を調節することができる。

前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベ
クターとして構築可能である。前記発現用ベクターは、当業界において、植物、動物また
は微生物において外来性タンパク質を発現するのに用いられる通常のものを用いることが
できる。前記組換えベクターは、当業界において公知の種々の方法によって構築可能であ
る。

前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築可能である。例えば
、用いられるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を行
い得る強力なプロモータ（例えば、ｐＬλプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ｔｒｐプロモ
ータ、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、Ｔ７プロモータなど）、翻訳の開始のため
のリボゾーム結合位および転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿
主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞において作動する複製起点は、ｆ１複製
起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢ
ＢＶ複製起点などを含むが、これに限定されない。また、哺乳動物細胞のゲノム由来のプ
ロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）または哺乳動物ウィルス由来のプロモ
ータ（例えば、アデノウィルス後期プロモータ、ワクチニアウィルス７．５Ｋプロモータ
、ＳＶ４０プロモータ、サイトメガロウィルスプロモータおよびＨＳＶのｔｋプロモータ
）が使用可能であり、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に取り込むことにより得られ
たものであってもよい。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定的に且つ連続的にク
ローニングまたは発現させ得る細胞であり、当業界において公知のいかなる宿主細胞も用
いることができ、原核細胞として、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルス・サブティリス、バチルス
・チューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、そしてネズミチフス菌、セラチアマルセッ
センスおよび様々なシュードモナス種などの腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転
換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯＤＧ４
４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３
Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などが使用可能であるが、これに制限されない。

前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への導入（トラン
スフェクション）は、当業界に周知の導入方法を用いて行うことができる。前記導入方法
としては、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ_２方法またはエレクトロポ
レーション方法などが採用可能であり、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法
、リン酸カルシウム沈殿沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム媒介トランスフ
ェクション法および遺伝子ボンバードメント法などが採用可能であるが、これに限定され
ない。

前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現される表現型を
用いて、当業者に周知の方法に従って容易に行うことができる。例えば、前記選択標識が
特定の薬剤耐性遺伝子である場合には、前記薬剤が含有されている培地において形質転換
体を培養することにより形質転換体を容易に選別することができる。

本発明の他の側面において、本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片およ
びＶＥＧＦ結合断片を含む、融合タンパク質の製造方法を提供する。さらに、他の側面に
おいて、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体にＶＥＧ
Ｆ結合断片を連結する工程を含む、ｃ−Ｍｅｔ抑制（抗癌効能）および／または新生血管
形成抑制効能が増進されたｃ−Ｍｅｔ抗体の製造方法が提供される。前記連結は、前記抗
ｃ−Ｍｅｔ抗体またはこの抗原結合断片とＶＥＧＦ結合断片が（リンカーを介してまたは
介さずに）融合された融合タンパク質のアミノ酸配列またはこれをコードする核酸配列を
合成するなどの適切な方法によって行われ得る。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結
合断片にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程は、ｃ−Ｍｅｔ標的抗体またはその断片とＶＥ
ＧＦ結合断片とがリンカーを介して結合する連結するものであってもよい。前記リンカー
は、前述のように１〜１００個のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよい。

以下、本発明についてより詳細に説明する。

既存の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦに結合可能な部分（例えば、ヒトＶＥＧＦ受容体１
（例えば、配列番号１０９）のＩｇ様ドメイン２：ＶＩＧ２（例えば、配列番号１１０）
または配列番号１０９のアミノ酸のうち配列番号１１０を含んで連続する１０２〜１３３
８個のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を連結して二重特異性抗体として製作して両因
子を一括して標的としたとき、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦのそれぞれを標的とする効果はその
まま維持しながら、相乗効果を示すことを確認した。

したがって、本発明において提案される二重特異性抗体の製作技術は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗
体の抗がん効能をより改善する方法であり得る。

このようにして製作された二重特異性抗体は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に比べてがん細胞の成
長をより有効に阻害することができ、各種の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を用いて上述したような二
重特異性抗体を製作する場合にも、単一抗体と比較して卓越した効能が現れることを確認
して（実施例５参照）、本発明において提案される二重特異性抗体の製作方法が抗ｃ−Ｍ
ｅｔ抗体の抗がん効能を増進させるのに一般的に使用可能であることを確認した。

前記二重特異性抗体は、既存の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗がんおよび抗新生血管効能を含む
ｃ−Ｍｅｔ結合の相対的性質をそのまま維持することを確認した（実施例２参照）。また
、前記二重特異性抗体はＶＥＧＦ結合部位を含むことにより、ＶＥＧＦの生物学的な機能
を拮抗する効能を示すことを確認した（実施例３参照）。なお、前記二重特異性抗体の抗
がん効能を動物モデルにおいて試験して、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に比べて優れた抗がん効能を
示すことを確認した（実施例４参照）。

また、様々な形式の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（リンカーの違い、長さの違い、修飾されたＦｃ
部分、ＣＤＲの違いなど）の場合にもＶＩＧ２を連結して類似する効能を示すことを確認
した（図４Ａ参照）。

このため、ＶＥＧＦ結合部位を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に結合させる方法は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗
体の抗がんおよび抗新生血管効能を増進させるのに一般的に使用可能であることが期待さ
れる。

さらに、前記融合タンパク質および／または二重特異性抗体は、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦ
を同時に検出することができるため、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦの同時検出用組成物およびｃ
−ＭｅｔとＶＥＧＦ誘発疾病の診断用途にも用いて好適である。

本発明において提供される抗ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦ結合部位を連結する技術は、抗
ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗がん／新生血管抑制効能を増進することができるため、抗がん剤脳が
ん、肺がん、胃腸がんなどに適用可能な抗がん剤および新生血管生成機序による疾病の治
療剤の開発に用いて好適であり、加えて、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦシグナル伝達経路とＶＥＧ
Ｆ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与する他の疾病に対する治療剤の開発にも使用可能
である。このように二重特異性抗体を用いることにより、関連薬物の併用投与時と比較し
て服用し易いだけではなく、優れた効能が得られることが期待される。

二重特異性抗体の一例を模式的に示すものである。 本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のｃ−Ｍｅｔ分解活性を示すグラフである。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が処理されていない対照群（ｍｅｄｉａ）の値を１００％とし、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理後に得られる値は前記対照群に対する相対値として計算した。 本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＡｋｔリン酸化抑制の度合いを示すグラフである（対照群（５Ｄ５）の値を１００％として計算する）。 本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＭＫＮ４５細胞株の成長阻害の度合いを示すグラフである。 本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株の成長阻害の度合いを示すグラフである。 ＨＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ増殖抑制の度合いを示すグラフである。 ＶＥＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ増殖抑制の度合いを示すグラフである。 ＶＥＧＦおよびＨＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ増殖抑制の度合いを示すグラフである。 ＶＥＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ浸潤能阻害の度合いを示すグラフ（上）と写真（下）である。 ＶＥＧＦおよびＨＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ浸潤能阻害の度合いを示す結果であり、上の部分は各処理群の相対的な蛍光イメージ領域を示すグラフであり、下の部分は各処理群の蛍光イメージを示す写真である。 本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体の細胞移動阻害の度合いを示すグラフである。 本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＵ８７−ＭＧ脳がん細胞に対する生体内抗がん効果を示す結果であり、上の部分は経時的な腫瘍の大きさ（体積）を示すグラフであり、下の部分は試験終了後の腫瘍の重さを示すグラフである。 本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＮＣＩ−Ｈ４４１肺がん細胞に対する生体内抗がん効果を示す結果であり、上の部分は経時的な腫瘍の大きさ（体積）を示すグラフであり、下の部分は試験終了後の腫瘍の重さを示すグラフである。 本発明の一実施例に従いＶＩＧ２を融合した様々なｃ−Ｍｅｔ抗体のｃ−Ｍｅｔ分解活性をＶＩＧ２未融合のｃ−Ｍｅｔ抗体と比較して示すグラフである。

（参考例）１：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の製作
１．１．ｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体「ＡｂＦ４６」の産生
１．１．１．マウスの免疫化
ハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、５匹のマウス
に１匹当たりに１００μｇのヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ
社製）と同量の完全フロインドアジュバント （Ｆｒｅｕｎｄ'ｓａｄｊｕｖａｎｔ）を混
合して４−６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に注射した。２週後
に、上記の方法と同様にして、前記抗原として用いられたヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タ
ンパク質を先に注射した量の半分である５０μｇを同量の不完全フロインドアジュバント
と混合してマウスの腹腔内に注射した。一週間後に最後の追加免疫が行われ、３日後に前
記マウスの尻尾から採血して血清を得た後、１／１０００でＰＢＳに希釈してＥＬＩＳＡ
でｃ−Ｍｅｔを認知する抗体の力価（ｔｉｔｅｒ）が増大されることを確認した。上記の
結果をもって抗体の量が十分に得られるマウスを選別して下記の細胞融合過程を行った。

１．１．２．細胞融合およびハイブリドーマの製造
細胞融合実験３日前に５０μｇのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質混合
物をＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に注射し、免疫化されたマウスを麻
酔した後に身体の左側に位置する脾臓を摘出した。摘出した脾臓をメッシュで磨って細胞
を分離し、培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＧＩＢＣＯ、インビト
ロゲン社製）と混合して脾臓細胞懸濁液を作成した。前記懸濁液を遠心分離して細胞層を
回収した。前記得られた脾臓細胞１×１０^８個と骨髓腫細胞（Ｓｐ２／０）１×１０^８個
を混合した後、遠心分離して細胞を沈殿させた。前記遠心分離された沈殿物を徐々に懸濁
し、３７℃で１分間ＤＭＥＭ中の４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（１ｍＬ）で
処理した後、１ｍＬの培養培地（ＤＭＥＭ）に懸濁した。次いで、細胞を１０ｍＬのＤＭ
ＥＭに１０分間以上浸し、その後３７℃で５分間放置した。そして、ＤＭＥＭで５０ｍＬ
にし、再び遠心分離した。細胞沈殿物を分離培地（ＨＡＴ培地）に約１〜２×１０^５／ｍ
Ｌで再懸濁し、９６ウェルプレートに０．１ｍＬずつ分注した後、３７℃の二酸化炭素培
養器において培養してハイブリドーマ細胞群を製作した。

１．１．３．ｃ−Ｍｅｔタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞の選別
前記参考例１．１．２に従い製造されたハイブリドーマ細胞群から、ｃ−Ｍｅｔタンパ
ク質にのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／
Ｆｃ融合タンパク質とヒトのＦｃタンパク質を抗原としたＥＬＩＳＡ分析方法を用いてス
クリーニングした。

マイクロタイタープレートにヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質を１ウェル当たりに
それぞれ５０μＬ（２μｇ／ｍＬ）ずつ加えてプレートの表面に付着させ、未反応抗原は
洗い取った。ｃ−Ｍｅｔには結合しないがＦｃを認識するする抗体を選別して除去するた
めに、ヒトＦｃタンパク質を上記の方法と同様にしてプレート表面に付着させた。

前記参考例１．１．２において得られたハイブリドーマ細胞の培養液を前記準備された
マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに５０μＬずつ加えて１時間かけて反応さ
せた後、リン酸緩衝溶液−ツイーン２０（ＴＢＳＴ）溶液で十分に洗浄して未反応培養液
を除去した。ここにヤギ抗−マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｇｏａｔ ａ
ｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ）を加えて１時間かけて室温下で反応させた後、Ｔ
ＢＳＴ溶液で十分に洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼの基質溶液（オルトフェニレン
ジアミン；ＯＰＤ）を加えて反応させ、その反応の度合いはＥＬＩＳＡリーダーを用いて
４５０ｎｍにおける吸光度を測定して確認した。

上記の反応の度合いの確認によって、ヒトＦｃには結合せず、ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク
質にのみ特異的に高い結合力を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を繰り返し選
別した。繰り返し選別によって得られたハイブリドーマ細胞株を限界希釈（ｌｉｍｉｔｉ
ｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）してモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株１個
のクローンを最終的に得た。最終的に選別されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
を２００９年１０月９日付けでブダペスト条約下の国際寄託機関である大韓民国ソウル特
別市鍾路区蓮建洞に所在する韓国細胞株研究財団に寄託して受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−
００２２０を与えられた（大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号参照）。

１．１．４．モノクローナル抗体の産生および精製
前記参考例１．１．３において得られたハイブリドーマ細胞を無血清培地において培養
し、培養液からモノクローナル抗体を産生および精製した。

まず、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕ
ｍ）入り培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍＬにおいて培養された前記ハイブリドーマ細胞を遠
心分離して細胞沈殿物を２０ｍＬのＰＢＳで２回以上洗浄してＦＢＳが除去された状態で
、前記細胞沈殿物を培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍＬに再懸濁させた後、３日間３７℃の二
酸化炭素培養器において培養した。

次いで、遠心分離により抗体を産生する細胞を除去し、使用前まで４℃で保存し、また
は直ちに、抗体の分離および精製に用いた。親和性カラム（プロテインＧアガロースカラ
ム；米国ファルマシア社製）を装備したＡＫＴＡ精製機器（ＧＥヘルスケア社製）を用い
て前記準備された培養液５０ｍＬ〜３００ｍＬから抗体を精製した後、タンパク質凝集用
フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてＰＢＳで上澄み液を置換して精製された抗体を保管し
、以下の実施例に用いた。

１．２．ｃ−Ｍｅｔに対するキメラ型抗体ｃｈＡｂＦ４６の製作
一般に、マウス抗体は、治療目的でヒトに注入されたときに免疫拒絶反応を示す可能性
が高い。そのため、これを解決するために、前記実施例１に従い製作されたマウス抗体Ａ
ｂＦ４６から、抗原結合に関連する変異領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を除く
不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）をヒトＩｇＧ１抗体の配列で置換したキメ
ラ型抗体ｃｈＡｂＦ４６を製作した。

重鎖に相当するヌクレオチド配列は「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−
ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号３８）から、軽鎖に相当するヌク
レオチド配列は「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−Ｃ
Ｌ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号３９）から構成されるようにそれぞれデザインして遺
伝子を合成した。次いで、インビトロゲン社製のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ抗体発現キット（Ｃ
ａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯ Ｔ
Ａクローニングキットに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番
号３８）を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｃａｔ ｎｏ
．８３００−０１）に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番号
３９）をそれぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６
Ｓ）制限酵素を用いてクローニングすることにより、キメラ型抗体の発現のための重鎖を
含むベクターおよび軽鎖を含むベクターをそれぞれ構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ ｎｏ
．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ２９
３発現システム（インビトロゲン社製）を用いて行われた。用いられた細胞株は２９３−
Ｆ細胞であり、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ２９３発現培地を培地として浮遊培養方式で培
養された。一過性一過性発現の前日に細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にして準
備した後、２４時間が経過して細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになったときに一過
性一過性発現を行った。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ試薬（インビトロゲン社製）を
用いたリポソーマル試薬法により形質移入（トランスフェクション）を行い、１５ｍｌの
チューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合にてＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏ
^ＴＭ ＳＦＭ（インビトロゲン社製）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブに
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ試薬１００μＬとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ ２ｍｌを
混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）を混合して１５分間インキュベーションした後、前日
に準備した細胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、３７℃、８０％の
湿度、８％のＣＯ_２及び１３０ｒｐｍのインキュベータにおいて５日間培養した。

次いで、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地において３７℃、５％のＣＯ_２の条
件下で５時間培養した後、ＦＢＳ未添加のＤＭＥＭ培地において４８時間３７℃、５％の
ＣＯ_２の条件下で培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上澄み液をそれぞれ１００ｍｌずつ取り、ＡＫＴＡ
プライム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカ
ラム（ＧＥヘルスケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速
で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出
させた。得られた溶出物をＰＢＳバッファに交換して最終的にキメラ型抗体ＡｂＦ４６（
以下、ｃｈＡｂＦ４６と命名する）を精製した。

１．３．キメラ型抗体ｃｈＡｂＦ４６からのヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の製作
１．３．１．重鎖のヒト化（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｈｅａｖｙおよびＨ３−ｈｅａｖｙの２種のデザインのために、先ず、Ｉｇ Ｂ
ｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ
／）を介して前記参考例１．２において精製されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＶＨ遺伝子と
最も相同性が高いヒトの生殖細胞系遺伝子を分析した。その結果、ＶＨ３−７１がアミノ
酸レベルにおいて８３％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ
−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３をＫａｂａｔ番号付けで定義し、マウス抗体ＡｂＦ
４６のＣＤＲ部分がＶＨ３−７１の骨格（フレームワーク）に取り込まれるようにデザイ
ンした。このとき、３０番（Ｓ→Ｔ）、４８番（Ｖ→Ｌ）、７３番（Ｄ→Ｎ）、７８番（
Ｔ→Ｌ）のアミノ酸は、元のマウスＡｂＦ４６抗体のアミノ酸配列に復帰突然変異した。
次いで、Ｈ１はさらに８３番（Ｒ→Ｋ）と８４番（Ａ→Ｔ）のアミノ酸に突然変異を与え
て最終的にＨ１−ｈｅａｖｙ（配列番号４０）とＨ３−ｈｅａｖｙ（配列番号４１）を構
築した。

Ｈ４−ｈｅａｖｙのデザインのためにヒト抗体のフレームワーク配列を探ったところ、
ＡｂＦ４６抗体のマウスフレームワーク配列と配列が非常に類似しているとともに、既存
の最も安定的であると知られているＶＨ３サブタイプを用いてＫａｂａｔ番号付けで定義
されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を取り込んだ
。これにより、Ｈ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）を構築した。

１．３．２．軽鎖のヒト化（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｌｉｇｈｔ（配列番号４３）およびＨ２−ｌｉｇｈｔ（配列番号４４）の２種の
デザインのために、Ｉｇ Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を介して、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相
同性が高いヒト生殖細胞系遺伝子を分析した。その結果、ＶＫ４−１がアミノ酸レベルに
おいて７５％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、Ｃ
ＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をＫａｂａｔ番号付けで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤ
Ｒ部分がＶＫ４−１のフレームワークに取り込まれるようにデザインした。このとき、Ｈ
１−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のア
ミノ酸を復帰突然変異し、Ｈ２−ｌｉｇｈｔは、４９番のアミノ酸（Ｙ→Ｉ）１個のみを
復帰突然変異して構築した。

Ｈ３−ｌｉｇｈｔ（配列番号４５）のデザインのために、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を介してマウス抗体Ａ
ｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖細胞系遺伝子を分析したところ、前記
ＶＫ４−１に加えてＶＫ２−４０を選定した。マウス抗体ＡｂＦ４６ＶＬとＶＫ２−４０
はアミノ酸レベルにおいて６１％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６
のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をＫａｂａｔ番号付けで定義し、マウス抗
体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１のフレームワークに取り込まれるようにデザイン
した。このとき、Ｈ３−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（
Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を復帰突然変異して構築した。

Ｈ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）のデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配
列を探ったところ、既存の最も安定的であると知られているＶｋ１サブタイプを用いてＫ
ａｂａｔ番号付けで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、Ｃ
ＤＲ−Ｌ３を取り込んだ。このとき、Ｈ４−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（
Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸をさらに復帰突然変異して構築した。

次いで、インビトロゲン社製のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ抗体発現キット（Ｃａｔ ｎｏ．１
２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡクローニング
キットに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（Ｈ１−ｈｅａｖｙ；配
列番号４７、Ｈ３−ｈｅａｖｙ；配列番号４８、Ｈ４−ｈｅａｖｙ；配列番号４９）をｐ
ｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットに前記軽鎖に相当するヌクレオ
チド配列を含むＤＮＡ断片（Ｈ１−ｌｉｇｈｔ；配列番号５０、Ｈ２−ｌｉｇｈｔ；配列
番号５１、Ｈ３−ｌｉｇｈｔ；配列番号５２、Ｈ４−ｌｉｇｈｔ；配列番号５３）をそれ
ぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）の制限酵
素を用いて、クローニングすることにより、ヒト化抗体の発現のためのベクターを構築し
た。

前記構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ ｎｏ
．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ２９
３発現システム（インビトロゲン社製）を用いて行われた。用いられた細胞株は２９３−
Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ ２９３発現培地を培地として浮遊培養方式で培
養された。一過性発現の前日に細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にして準備した
後、２４時間が経過して細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになったときに一過性発現
を行った。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ試薬（インビトロゲン社製）を用いたリポソ
ーマル試薬法により形質移入（トランスフェクション）を行い、１５ｍｌのチューブに重
鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ（
インビトロゲン社製）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙ
ｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ試薬１００μＬとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ ２ｍｌを混合（Ｂ）し
た後、（Ａ）と（Ｂ）を混合して１５分間インキュベーションした後、前日に準備した細
胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、３７℃、８０％の湿度、８％の
ＣＯ_２、１３０ｒｐｍのインキュベータにおいて５日間培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上澄み液各１００ｍｌを取り、ＡＫＴＡプライム（
ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカラム（ＧＥ
ヘルスケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速で流した後
、ＩｇＧ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出した。これ
をＰＢＳバッファに交換して最終的にヒト化抗体ＡｂＦ４６（以下、ｈｕＡｂＦ４６と命
名する）を精製した。一方、以降の実施例において用いたヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の重
鎖、軽鎖の組み合わせはＨ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）およびＨ４−ｌｉｇｈｔ（配
列番号４６）である。

１．４．ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリーの製作
ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いてｈｕＡｂＦ４６抗体の
ｓｃＦｖを製作するための遺伝子をデザインした。それぞれの重鎖可変領域および軽鎖可
変領域を「ＶＨ−リンカー−ＶＬ」の形にし、前記リンカーは「ＧＬＧＧＬＧＧＧＧＳＧ
ＧＧＧＳＧＧＳＳＧＶＧＳ」（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するようにデザインし
た。このようにしてデザインされたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖをコードするポリヌク
レオチド（配列番号５５）をバイオニア社に依頼して合成し、これを発現させるためのベ
クターを配列番号５６に示す。

次いで、前記ベクターから発現された結果物を分析して、ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合力
を示すことを確認した。

１．５．親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のためのライブラリ
ー遺伝子の製作
１．５．１．標的ＣＤＲの選定およびプライマの製作
ｈｕＡｂＦ４６抗体の親和性成熟のために６個の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）を前記製作されたマウス抗体
ＡｂＦ４６から「Ｋａｂａｔ番号付け」によって定義し、それぞれのＣＤＲは下記の表１
に示す通りである。

抗体ＣＤＲのランダムな配列の取り込みのために下記のようにしてプライマーを製作し
た。既存のランダムな配列の取り込み方式では、突然変異を与えたい部位に同じ割合の塩
基（２５％Ａ、２５％Ｇ、２５％Ｃ、２５％Ｔ）が取り込まれるようにＮコドンを用いた
が、この実施例においては、ｈｕＡｂＦ４６抗体のＣＤＲにランダムに塩基を取り込むた
めに、各ＣＤＲのアミノ酸をコードする３個の野生型ヌクレオチドのうち最初と２番目の
ヌクレオチドの８５％はそのまま保存し、残りの３個の塩基をそれぞれ５％ずつ取り込む
ような方式を取った。なお、３番目のヌクレオチドは同様に（３３％Ｇ、３３％Ｃ、３３
％Ｔ）が取り込まれるようにプライマーをデザインした。

１．５．２．ｈｕＡｂＦ４６抗体のライブラリーの製作およびｃ−Ｍｅｔへの結合力の
確認
ＣＤＲのランダムな配列の取り込みを用いた抗体ライブラリー遺伝子の構築は、前記参
考例１．５．１などの方法により製作されたプライマーを用いて行った。鋳型としてｈｕ
ＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを含むポリヌクレオチドを用いて、図１に示す方法と同様にし
て２個のＰＣＲ断片を製作し、これをオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（ｏｖｅ
ｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）方法を用いて、所望のＣＤＲのみがそれぞれ突
然変異されたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリー遺伝子を確保して製作された６
個のＣＤＲをそれぞれ標的とするライブラリーを構築した。

このようにして製作されたライブラリーは、野生型と各ライブラリーのｃ−Ｍｅｔへの
結合力を確認し、それぞれのライブラリーは野生型に比べてｃ−Ｍｅｔへの結合力が総じ
て下がる傾向を示したが、ｃ−Ｍｅｔへの結合力が保たれる一部の突然変異を確認した。

１．６．製作されたライブラリーからの親和度が改善された抗体の選別
前記構築されたライブラリーからｃ−Ｍｅｔへのライブラリーの結合力を向上させた後
、それぞれの個別クローンからｓｃＦｖの遺伝子配列を分析した。確保された遺伝子配列
はそれぞれ下記の表２に示す通りであり、これをＩｇＧ形式に変換した。下記のクローン
のうちから、Ｌ３−１、Ｌ３−２、Ｌ３−３、Ｌ３−５から産生された４種の抗体を選別
して後続の実験を行った。

１．７．選別された抗体のＩｇＧへの変換
選別された４種の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎ
ａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ」（配列番号３８）から構成
され、重鎖の場合、親和性成熟後に抗体のアミノ酸が変更されなかったため、ｈｕＡｂＦ
４６抗体の重鎖をそのまま用いた。但し、ヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジではないＵ
６−ＨＣ７ヒンジ（配列番号５７）で置換した。軽鎖は「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ」から構成されるようにそれぞれデ
ザインして遺伝子を合成し、親和性成熟後に選別された前記４種の抗体の軽鎖可変領域を
含んでコードするポリヌクレオチド（配列番号５８〜配列番号６１）をバイオニア社に依
頼して合成した。次いで、インビトロゲン社製のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ抗体発現キット（Ｃ
ａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯ Ｔ
Ａクローニングキットに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番
号３８）を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｃａｔ ｎｏ
．８３００−０１）に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（Ｌ３−１
由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号５８、Ｌ３−２由来のＣＤＲ−Ｌ３を含
むＤＮＡ断片：配列番号５９、Ｌ３−３由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号
６０、Ｌ３−５由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号６１）をそれぞれＥｃｏ
ＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）の制限酵素を用いて
クローニングすることにより、親和性成熟された抗体の発現のためのベクターを構築した
。

前記構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ ｎｏ
．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ２９
３発現システム（インビトロゲン社製）を用いて行われた。用いられた細胞株は２９３−
Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ ２９３発現培地を培地として浮遊培養方式によ
り培養された。一過性発現の前日に細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にして準備
した後、２４時間が経過して細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになったときに一過性
発現を行った。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ試薬（インビトロゲン社製）を用いたリ
ポソーマル試薬法により形質移入（トランスフェクション）を行い、１５ｍｌのチューブ
に重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭＳＦＭ
（インビトロゲン社製）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔ
ｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ試薬１００μＬとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）し
た後、（Ａ）と（Ｂ）を混合して１５分間インキュベーションした後、前日に準備した細
胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、３７℃、８０％の湿度、８％の
ＣＯ_２、１３０ｒｐｍのインキュベータにおいて５日間培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上澄み液を各１００ｍｌ取り、ＡＫＴＡプライム（
ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカラム（ＧＥ
ヘルスケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速で流した後
、ＩｇＧ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出した。これ
をＰＢＳバッファに交換して最終的に親和性成熟された４種の抗体（以下、ｈｕＡｂＦ４
６−Ｈ４−Ａ１（Ｌ３−１由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２（Ｌ３−２由来）、ｈｕ
ＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３（Ｌ３−３由来）およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５（Ｌ３−５
由来）と命名する）を精製した。

１．８．不変領域および／またはヒンジ領域が置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１
の製造
前記参考例１．７において選別された４種の抗体のうち、ｃ−Ｍｅｔとの結合親和性が
最も高く、Ａｋｔリン酸化およびｃ−Ｍｅｔ分解の度合いが最も低く測定されたｈｕＡｂ
Ｆ４６−Ｈ４−Ａ１を対象として、ヒンジ領域または不変領域およびヒンジ領域が置換さ
れた抗体を製作した。

ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジおよびヒトのＩｇＧ
１不変領域からなる重鎖およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトの
カッパ（ｋａｐｐａ）不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１
（Ｕ６−ＨＣ７）と命名し、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ
２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなる重鎖およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１
の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６
−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ヒンジ）と命名し、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域
、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ２不変領域からなる重鎖およびｈｕＡｂＦ４
６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体を
ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ Ｆｃ）と命名した。なお、前記３種の抗体は、
産生量の増大のためにヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖の３６番のヒスチジンをいずれ
もチロシンで置換した。

前記３種の抗体を製作するために、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、Ｕ６
−ＨＣ７ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列番号６２）を
コードするポリヌクレオチド（配列番号６３）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変
領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列
番号６４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６５）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ
１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ２不変領域からなるポリペ
プチド（配列番号６６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６７）、３６番のヒス
チジンがチロシンで置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトの
カッパ不変領域からなるポリペプチド（配列番号６８）をコードするポリヌクレオチド（
配列番号６９）をバイオニア社に依頼して合成した。次いで、インビトロゲン社製のＯｐ
ｔｉＣＨＯ^ＴＭ抗体発現キット（Ｃａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐ
ＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットに前記重鎖に相当する塩基配列
を含むＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｃａ
ｔ ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当する塩基配列を含むＤＮＡ断片を挿入して
、前記抗体の発現のためのベクターを構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ ｎｏ
．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ２９３
発現システム（インビトロゲン社製）を用いて行われた。用いられた細胞株は２９３−Ｆ
細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ ２９３発現培地を培地として浮遊培養方式により
培養された。一過性発現の前日に細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にして準備し
た後、２４時間が経過して細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになったときに一過性発
現を行った。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ試薬（インビトロゲン社製）を用いたリポ
ソーマル試薬法により形質移入（トランスフェクション）を行い、１５ｍｌのチューブに
重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合にてＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦ
Ｍ（インビトロゲン社製）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓ
ｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ試薬１００μＬとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ ２ｍｌを混合（Ｂ
）した後、（Ａ）と（Ｂ）を混合して１５分間インキュベーションした後、前日に準備し
た細胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、３７℃、８０％の湿度、８
％のＣＯ_２、１３０ｒｐｍのインキュベータにおいて５日間培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上澄み液各１００ｍｌを取り、ＡＫＴＡプライム（
ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカラム（ＧＥ
ヘルスケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速で流した後
、Ｉｇ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出した。これを
ＰＢＳバッファに交換して最終的に３種の抗体（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−Ｈ
Ｃ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ヒンジ）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１
（ＩｇＧ２ Ｆｃ））を精製した。これらの中で、本発明による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の代表
例としてｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ Ｆｃ）を選択して下記の実施例に供し
、便宜上、前記抗体を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙと命名した。

実施例１：融合タンパク質の製造
前記参考例１において製作された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を基に重鎖Ｃ末端にリンカーが連結
されるように融合した。次いで、リンカーの末端にＶＥＧＦ受容体１を構成するアミノ酸
のうちＩｇ２ドメイン、すなわち、１２９番目から２２９番目までのアミノ酸を連続して
融合してｃＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合可能な抗体を製作した（図１参照）。

ＶＥＧＦ受容体１（Ｐ１７９４８．２；配列番号１０９）を構成する１３３８個のアミ
ノ酸のうち、ＶＥＧＦ結合に最も重要であると知られているＩｇ２ドメインを構成する１
２９番目から２２９番目までの１０１個のアミノ酸をコードする遺伝子配列をＮＣＢＩデ
ータベースから確保した。

Ｉｇ２ドメイン（ＶＩＧ２）アミノ酸配列（配列番号１１０）：
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶ
ＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣ
ＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩ
Ｉｇ２ドメイン（ＶＩＧ２）塩基配列（配列番号１１１）：
ＡＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡ
ＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧ
ＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣ
ＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡ
ＡＡＡＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴ
ＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡ
ＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣ
ＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＡＣＡＡＴＣ
前記製作されたｃ−Ｍｅｔ抗体の重鎖とＩｇ２ドメイン（ＶＩＧ２）を連結するために
、ＧＧＧＧＳが繰り返される構造の「ＧＧＧＧＳ」（Ｇ４Ｓ）（配列番号１１６）、「Ｇ
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」（（Ｇ４Ｓ）２）（配列番号１１７）、または「ＧＧＧＧＳＧＧＧ
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」（（Ｇ４Ｓ）４）（配列番号１１８）の３種類のリンカーを
デザインし、これをｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ受容体１のＩｇ２ドメイン（ＶＩＧ２）と
の間に位置させた。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の軽鎖をコードする遺伝子、および前記抗ｃ−
Ｍｅｔ抗体の重鎖、前記リンカー、および前記ＶＥＧＦ結合断片をコードする遺伝子をバ
イオニア社に依頼して合成し、このとき、最終遺伝子の最後に終止コドン（ＴＧＡ）を挿
入した。このようにして合成された遺伝子をｐＯｐｔｉｖｅｃベクター（インビトロゲン
社）にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩクローニングサイトを用いて重鎖発現ベクターを製作した。
軽鎖発現ベクターは、前記Ｌ３−１Ｙの製作時に用いられたベクターをそのまま用いた。

構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ ｎｏ．１
２６６２）を用いて増幅され、前記重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターは４：
１の割合（８０μｇ：２０μｇ）にて２９３Ｔ細胞（２．５×１０^７）に２Ｍ ＣａＣｌ
_２を３６０μｌ添加してトランスフェクションした。次いで、１０％のＦＢＳ入りＤＭＥ
Ｍ培地において３７℃、５％のＣＯ_２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳ未添加のＤＭ
ＥＭ培地において４８時間かけて３７℃、５％のＣＯ_２の条件下で培養した。

培養された細胞を遠心分離して上澄み液各１００ｍｌを取り、ＡＫＴＡプライム（ＧＥ
ヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカラム（ＧＥヘル
スケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速で流した後、Ｉ
ｇ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出した。これをＰＢ
Ｓバッファに交換して最終的にｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合可能な抗体を精製した
。

このようにして製作された抗体を下記表３にまとめて示す。

実施例２：融合タンパク質のｃ−Ｍｅｔ標的および分解活性
２．１．親和性検査
前記製作された二重特異性融合タンパク質の結合速度をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００イン
スツルメント（ＧＥヘルスケア社製）を用いて分析した。ヒトＦａｂ結合剤（ＧＥヘルス
ケア社製）をＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１００５−３０
）の表面に製造者の説明書に従って固定化した。約９０〜１２０ＲＵのＬ３−１Ｙまたは
ＭＶ１０ＡＹを捕獲し、様々な濃度のｃ−Ｍｅｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ
．３５８−ＭＴ／ＣＦ）を前記捕獲された抗体に注入した。ここに１０ｍＭグリシン−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ１．５）溶液を注入して前記表面を再生させた。結合速度を測定するために、
前記実験において得られたデータをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥヘル
スケア社製、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を
用いて適用した。

前記ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア用いて得られた結果を下記表４に示す。

ＭＶ１０ＡＹのｃ−Ｍｅｔへの親和性は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のバックボーンアイソタイ
プ（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）とは無関係にＬ３−１Ｙ（Ｋ_Ｄ＜０．０１ｎＭ）と類似し
ていた。

２．２．ｃ−Ｍｅｔ分解ＥＬＩＳＡ（ＭＫＮ４５）
相対的なｃ−Ｍｅｔの総量は、抗体がｃ−Ｍｅｔに結合した場合、抗体の内在化によっ
て、ｃ−Ｍｅｔの分解が起こることを利用して、ｃ−Ｍｅｔの総量の増減を把握して抗体
の影響を評価するものである。ｃ−ＭｅｔとＨＧＦの結合ががん細胞の成長を促すことは
既に知られており、したがって、合計のｃ−Ｍｅｔ量が減少すれば、がん細胞の成長も低
下することに着目したものである。

ｃ−Ｍｅｔ量は定量的なＥＬＩＳＡ方法により測定し、この場合には、ｈｕｍａｎ ｔ
ｏｔａｌ ＨＧＦ Ｒ／ｃ−Ｍｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用い
てＭＫＮ４５胃がん細胞株（ＪＣＲＢ０２５４；ヘルス・サイエンス・リサーチ・リソー
ス・バンク（ＨＳＲＲＢ）、日本国新宿））において実験した。２００、０００ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌの細胞を５μｇ／ｍｌの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と混ぜて２４時間かけて培養（培地：
１０％のウシ胎児血清入りＲＰＭＩ）した後にＥＬＩＳＡ実験を行った。最終的にＳｕｐ
ｅｒ Ａｑｕａｂｌｕｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて反応させ、比色信号
(ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ)は４５０ｎｍ波長におけるＯＤ値で測定し
た。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を処理しない比較群（ｍｅｄｉａ）の値を１００％として、抗ｃ−
Ｍｅｔ抗体を処理した後の値を前記比較群に対する相対値として計算した。

前記得られた結果を図２Ａに示す。図２Ａから明らかなように、二重特異性抗体である
ＭＶ１０ＡとＭＶ１０ＡＹはそれぞれのｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｔａｒ
ｇｅｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ、単一標的抗体とも言う。）であるＬ３−１およびＬ３−
１Ｙに比べて有意的にｃ−Ｍｅｔ分解能が向上している。すなわち、ＭＶ１０Ａのｃ−Ｍ
ｅｔ分解能（７６％）は単独標的抗体Ｌ３−１の分解能（６８％）に比べて有意的に向上
され（一元配置分散分析法(Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮａｌｙｓｉｓ Ｏｆ ＶＡｒｉａｎｃ
ｅ； Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ)による分析結果、ｐ＜０．０１）、ＭＶ１０ＡＹの
場合にも分解能（７２％）が単独標的(ｓｉｎｇｌｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ)抗体Ｌ３−１
Ｙの分解能（６６％）よりも向上していた（一元配置分散分析法による分析結果ｐ＜０．
０５）。

２．３．Ａｋｔリン酸化（Ｃａｋｉ）（抗体のアゴニズム試験）
治療用抗体における安全性と効能をメカニズム基盤実験で検証した。安全性を調べるた
めに、ＡＫＴというキナーゼのリン酸化の度合いを定量的ＥＬＩＳＡ方法により測定した
。ＡＫＴによって調節されている細胞作用は、細胞増殖、細胞生存、細胞の大きさの調節
、可用栄養分への反応性、中間代謝過程、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、組織
浸潤浸潤（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ）などを含む。これらのあらゆる過程はがん
の特徴を代表するものであり、数多くの腫瘍発生タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）
と腫瘍発生抑制物質（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）はＡＫＴ経路上において相互
交差的に影響を及ぼし、シグナル伝達と古典的な代謝調節の連結点において細胞の作用を
微細に調節する機能を行う。このため、ＡＫＴの活性型であるリン酸化されたＡＫＴの度
合いが高いほど、がん細胞が一層高い活性を示し、この実施例においては、抗体が陽性対
照抗体５Ｄ５を処理したときに比べてＡＫＴのリン酸化をどれほど阻害できるかについて
検証した。

ＡＫＴのリン酸化部位はＳｅｒ４７３であり、セルシグナリング社製のＰａｔｈＳｃａ
ｎ ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ１（Ｓｅｒ４７３）ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓ
ａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡキットを用いた。前日に２００、０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌで
培養したＣａｋｉ−１細胞株（腎明細胞がん細胞株）（ＨＴＢ−４６；アメリカ合衆国培
養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス）に無血清ＤＭＥＭ培地（ＧＩ
ＢＣＯ、インビトロゲン社製）に５μｇ／ｍｌの抗体を混ぜて３０分間処理した後、ＥＬ
ＩＳＡキットを用いて実験した。結果は、パーキンエルマー社製の機械で測定して得た。
ＡＫＴのリン酸化の度合いを計算するときには、陽性対照群である５Ｄ５（アメリカ合衆
国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス）によるリン酸化の度合い
を１００％とし、その値と比較して他の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体および二重特異性抗体のリン酸
化誘導の度合いを表示した。

前記得られた結果を図２Ｂに示す。図２Ｂから明らかなように、二重特異性抗体（ＭＶ
１０Ａ、ＭＶ１０ＡＹ）は両方ともそれぞれに対応するｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体（Ｌ３−
１、Ｌ３−１Ｙ）よりもＡＫＴリン酸化を有意的に一層強力に阻害する。すなわち、ＭＶ
１０ＡのＡＫＴリン酸化阻害能（５Ｄ５対照群に比べて７９％）は単独標的抗体Ｌ３−１
の阻害能（６９％）に比べて有意に向上され（一元配置分散分析法による分析結果ｐ＜０
．０１）、ＭＶ１０ＡＹの場合にも阻害能（７４％）が単独標的抗体Ｌ３−１Ｙの分解能
（６３％）よりも向上した（一元配置分散分析法による分析結果ｐ＜０．０１）。

２．４．ＭＫＮ４５成長阻害試験（抗体効能試験）
ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５（ＪＣＲＢ０２５４）をヘルス・サイエンス・リサーチ・
リソース・バンク（ＨＳＲＲＢ、日本、新宿）から入手した。前記細胞株を１０％（ｖ／
ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．＃１６０００−０４４）と１％（
ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．＃１５４１０−１２
２）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．＃１１８７５−１１９）におい
て培養した。細胞株を５％のＣＯ_２を含む湿潤大気下の３７℃において培養し、細胞が培
養容器内で過密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になる前に継代培養した。ＣＥＤＥＸ Ａ
ｎａｌｙｚｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて細胞数を測定した。抗
体処理（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）による腫瘍細胞の増殖を調べるために、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ
Ｇｌｏ（ＣＴＧ：プロメガ社製）発光分析法（ルミネセンス測定法）を用いた。

前記分析法は、製造者の説明書に従って行った。略述すると、１０％（ｖ／ｖ）のウシ
胎児血清（ＦＢＳ）入りＲＰＭＩ１６４０培地内のＭＫＮ４５細胞をブラック９６ウェル
プレート（コーニング社製、Ｃａｔ．＃Ｃｏｓｔａｒ ３６０３）の上に１ウェル当たり
に１×１０^４ｃｅｌｌｓの濃度で分注し、１０％のＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地を用
いて、最終濃度０．００８μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、１μｇ
／ｍＬに希釈された抗体で処理した。７２時間インキューベーティング後に、ＣＴＧ溶液
１００μＬを各ウェルに添加した後、室温下で３０分間インキューベーティングした。前
記得られた発光信号をＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４マルチラベルリーダ（パーキンエルマ
ー社製、米国マサチューセッツ州ウオルサム）を用いて記録した。

前記得られた結果を図２Ｃに示す。図２Ｃから明らかなように、二重特異性抗体ＭＶ１
０Ａ（■）はそれに対応するｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体Ｌ３−１（□）に比べて０．０４μ
ｇ／ｍＬ以上の濃度において有意的に優れたＭＫＮ４５がん細胞株成長抑制効果を有する
（平均と標準偏差表示、二元配置分散分析法（２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）による分析；ボ
ンフェローニの多重比較検定により得られたｐ値を各濃度点の下に示す。^＊＊、ｐ＜０．
０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。

２．５．ＮＣＩ−Ｈ４４１成長試験（抗体のアゴニズム試験）
ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体がｃ−Ｍｅｔに結合する場合、ｃ−Ｍｅｔによる不所望のアゴ
ニズム（拮抗）現象が見られる。これは抗体の安全性と関連するため、二重特異性を有す
ることに伴い、ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体の不所望のアゴニズム性質が増大されるか否かを
評価するためにＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株を用いて試験した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株は、
ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体の投与時に、下記の特定の条件下でアゴニズムによる細胞***を
示すという性質がある。

ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株（ＡＴＣＣ Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−１７４）を無血清ＲＰＭＩ１
６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に２００、０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌで希釈して１００μｌ／ｗ
ｅｌｌで９６ウェルプレートに分注した後に２４時間かけて３７℃で５％のＣＯ_２の条件
下で培養した後、１０μｇ／ｍｌの濃度から１／５系列希釈して６個の濃度勾配で抗ｃ−
Ｍｅｔ抗体を処理した。２１時間かけて３７℃で５％のＣＯ_２の条件下で培養した後、５
−ブロモ−２'−ジオキシウリジン（５−ｂｒｏｍｏ−２'−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、
ＢｒｄＵ）を添加して細胞に取り込み、３時間さらに培養した後、ＢｒｄＵアッセイ（ロ
シュ社製、インディアナ州インディアナポリス）を行った。細胞をプレート上において変
性／固定した後に抗−ＢｒｄＵ抗体を入れて１時間後に基質を添加して３７０ｎｍにおい
てＥＬＩＳＡ ｓｐｅｃｔｒａＭａｘリーダ（モレキュラーデバイス社製、カリフォルニ
ア州サニーベール）で発色反応を測定した。最終的にＢｒｄＵを取り込んでいない細胞の
値をバックグラウンドコントロールとして制限した後、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を処理しなかっ
た比較群の値を１００％に換算（Ｙ軸）して相対値を計算した。陰性対照群としてはマウ
スのＩｇＧを用い、作動薬（ａｇｏｎｉｓｔ）としてよく知られている５Ｄ５抗体（ＡＴ
ＣＣ Ｃａｔ．＃ＨＢ１１８９５ハイブリドーマ細胞から分離精製）を陽性対照群として
用いた。

前記得られた結果を図２Ｄに示す。図２Ｄから明らかなように、ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗
体Ｌ３−１に比べて二重特異性(bispecific)抗体であるＭＶ１０ＡまたはＭＶ１０ＡＹは
アゴニズム性質が増大されていなかった。すなわち、抗体安全性に変化がなかった。

２．６．ＨＵＶＥＣ増殖抑制試験（＋ＨＧＦ）（血管新生阻害（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏ
ｇｅｎｅｓｉｓ）試験）
ＨｕＶＥＣ細胞株（ＡＴＣＣ）をＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）０．４μｇ／ｍｌと
ともにＥＧＭ２ ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ培地（Ｌｏｎｚａ Ｃａｔ．ＣＣ−３１６２）にお
いて培養した。細胞を５％のＣＯ_２を含む湿潤大気下の３７℃でインキューベーティング
した後に細胞が培養容器内で過密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になる前に継代培養した
。ＣＥＤＥＸ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて細胞
数を測定した。抗体処理（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）による腫瘍細胞成長阻害の度合いを確認す
るためにＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｚｅｒ（
ロシュ社製）を用いてリアルタイム細胞分析法を行った。前記分析法は製造者の説明書に
従って行った。略述すると、前記培養されたＨｕＶＥＣ細胞を１６−ウェルＥ−プレート
の上に１ウェル当たりに１×１０^４ｃｅｌｌｓの濃度で分注し、２４時間後にインキュベ
ーション培地を除去し、無血清培地（ＥＢＭ培地、ロンザ社製）で希釈された抗体（１０
０ｕＬ、最終的な抗体濃度１０μｇ／ｍＬ）を処理した。発生するインピーダンス値をリ
アルタイムにて測定した。リアルタイム分析は、４８時間かけて行った。

前記得られた結果を図２Ｅに示す。前記試験結果をもって、ＨＵＶＥＣの成長へのＨＧ
Ｆの影響を単独／二重特異性抗体が抑制可能な度合いをテストすることができた。図２Ｅ
から明らかなように、ＨＧＦを抑制できないベバシズマブ（韓国ロシュ社製、同量処理）
は、陰性対照群（ＨＧＦ単独）と同様に、ＨＧＦの効果に全く影響しなかった。それにも
拘わらず、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦＲの二重特異性抗体ＭＶ１０Ａは、その母体であるｃ−
Ｍｅｔ単独標的抗体Ｌ３−１に比べて一層強力なＨＧＦへの拮抗効果がある（ＭＶ１０Ａ
は６４％抑制、Ｌ３−１は４５％抑制；ＨＧＦ単独群に比べて、一元配置分散分析法によ
るｐ値表示：^＊、ｐ＜０．０５；ＮＳ、有意性なし）。

実施例３：融合タンパク質のＶＥＧＦ標的および抑制活性
３．１．親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）検査
ＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体の結合動態をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００インスツ
ルメント（ＧＥヘルスケア社製）を用いるＳＰＲ方法によって測定した。ｈＶＥＧＦ（Ｇ
Ｅヘルスケア社製、２８−９５８３−２５）をＣＭ５チップの表面に製造者の説明書に従
って固定化した。約９０ＲＵの様々な濃度（６種類の濃度）のＭＶ１０ＡＹを捕獲した。
１Ｍ ＮａＣｌ＋３０ｍＭ ＮａＯＨを３０μｌ／分の流速で６０秒間注入することによ
り、前記表面を再生した。結合動態を決定するために、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフ
トウェア（ＧＥヘルスケア社製）を用いて前記実験において得られたデータをフィットし
た（Ｋ_Ｄ＝０．４５ｎＭ）。
前記得られた結果を表５に示す。

３．２．ＨＵＶＥＣ増殖抑制試験（＋ＶＥＧＦ）
Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイムセルアナライザ（ロシュ社製）を用いて抗体処理
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）によるＨＵＶＥＣ増殖の度合いを調べて血管新生抑制効果を調べて
みた。前記分析は、製造者の説明書に従って行った。略述すると、ＨｕＶＥＣ細胞株（Ａ
ＴＣＣ）をＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）０．４μｇ／ｍｌとともにＥＧＭ２ ｂｕ
ｌｌｅｔｋｉｔ培地（Ｌｏｎｚａ Ｃａｔ．ＣＣ−３１６２）において培養した。前記培
養されたＨｕＶＥＣ細胞を１６−ウェルＥ−プレートの上に各ウェル当たりに１×１０^４
ｃｅｌｌｓの濃度で分注し、２４時間後にインキュベーション用培地を除去し、無血清培
地（ＥＢＭ培地、ロンザ社製）で希釈された抗体（１００μＬ、最終濃度１０μｇ／ｍＬ
）を処理した。発生するインピーダンス値をリアルタイムにて測定した。リアルタイム分
析は９６時間かけて行った。

前記得られた結果を図３Ａに示す。図３Ａから明らかなように、本発明による抗体と陽
性対照群として用いられたベバシズマブ（韓国ロシュ社製、同量処理）は両方ともＶＥＧ
Ｆに依存的な細胞増殖を示し、ＭＶ１０Ａは陽性対照群であるベバシズマブと比較して顕
著な細胞増殖抑制効果を示した（ＭＶ１０Ａは８６％抑制、ベバシズマブは６１％抑制；
ＶＥＧＦ単独群に比べて、一元配置分散分析法によるｐ値表示：^＊、ｐ＜０．０５；ＮＳ
、有意性なし）。

３．３．ＨＵＶＥＣ増殖抑制試験（＋ＶＥＧＦ＋ＨＧＦ）
Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイムセルアナライザ（ロシュ社製）を用いて抗体処理
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）によるＨＵＶＥＣの増殖度合いを調べて血管新生抑制効果を調べて
みた。前記分析は、製造者の説明書に従って行った。略述すると、細胞（ＨｕＶＥＣ、Ａ
ＴＣＣ）１００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦＲのリガンドであるＨ
ＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）０．４μｇ／ｍｌとＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）０
．４μｇ／ｍｌを処理してＥＧＭ２ ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ培地（Ｌｏｎｚａ Ｃａｔ．Ｃ
Ｃ−３１６２）において培養した。前記培養されたＨｕＶＥＣ細胞を１６−ウェルＥ−プ
レートの上に１ウェル当たりに１×１０^４ｃｅｌｌｓの濃度で分注し、２４時間後にイン
キュベーション用培地を除去し、無血清培地（ＥＢＭ培地、ロンザ社製）で希釈された抗
体（１００μＬ、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を処理した。発生するインピーダンス値をリ
アルタイムにて測定した。リアルタイム分析は、４８時間かけて行った。

前記得られた結果を図３Ｂに示す。図３Ｂから明らかなように、単一標的（ｃ−Ｍｅｔ
）抗体であるＬ３−１Ｙ抗体の単独投与およびベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ；
ＶＥＧＦ単一標的）抗体の単独投与時には、有意なＨｕＶＥＣ細胞増殖抑制効果が得られ
なったのに対し、二重特異性抗体であるＭＶ１０ＡＹはｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標
的とすることにより、ＨＧＦ−およびＶＥＧＦ−に依存的なＨＵＶＥＣ細胞増殖に対して
顕著な相乗的抑制効果を示す。すなわち、ベバシズマブの単独使用時に２７％抑制、Ｌ３
−１Ｙの単独使用時に１６％抑制に留まったが、二重特異性抗体であるＭＶ１０Ａは７２
％抑制効果を示して、単独抗体の使用時に比べて二重特異性抗体の使用時に顕著な相乗的
抑制効果が認められる（ボンフェローニの多重比較検定を用いた一元配置分散分析法検定
(１−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｔｅｓｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ)による有意性表示。棒グラフの上端にＨＧＦ＋Ｖ
ＥＧＦ単独群に比べてｐ値表示（^＊＊＊、ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意性なし）、各処理
群間の差分はグラフの上端に表示）。

３．４．ＨＵＶＥＣの浸潤能（ｉｎｖａｓｉｏｎ）阻害試験（＋ＶＥＧＦ）
抗体処理（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）による細胞浸潤能の阻害有無を確認するために、上部チ
ャンバと下部チャンバに分けられて上部チャンバにコラーゲンがコードされた細胞浸潤能
分析用プレート（ＢｉｏＣｏａｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ ＭＡ
ＴＲＩＧＥＬ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ；ＢＤサイエンス社製、Ｃａｔ＃．３
５４４８３）を用いて細胞浸潤能（ｉｎｖａｓｉｏｎ）を試験した。分析は、製造者の説
明書に従って行った。略述すれば、上部チャンバにはＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ；５×１
０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を分注し、下部チャンバには抗体（１０μｇ／ｍｌ）を処理
し、３７℃で培養した（ＶＥＧＦは、下部チャンバに添加、０．４μｇ／ｍｌ）。２４時
間後に、上部チャンバのコラーゲン層を貫いて下部チャンバに下降した細胞をカルセイン
で染色して蛍光顕微鏡（ツァイス社製）で観察した。

前記得られた結果と蛍光イメージを図３Ｃに示す。図３Ｃにおいて、上部は各抗体処理
群の相対的な蛍光イメージの広さを示すグラフである。ＶＥＧＦのみを処理した場合に起
こる浸潤を１００％とした相対的な値を示す。図３Ｃの下端は、実際の蛍光イメージを示
す写真である（白色が浸潤を引き起こした細胞である）。図３Ｃに示すように、ＭＶ１０
ＡＹ二重特異性抗体はＶＥＧＦ単一標的抗体であるベバシズマブに比べて顕著な浸潤能抑
制効果を示すことが確認された（ＭＶ１０ＡＹは１００％抑制、ベバシズマブは７０％抑
制）。

３．５．ＨＵＶＥＣの浸潤能阻害試験（＋ＶＥＧＦ＋ＨＧＦ）
抗体処理（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）による細胞浸潤能の阻害有無を確認するために、上部チ
ャンバと下部チャンバに分けられて上部チャンバにコラーゲンがコードされた細胞浸潤能
分析用プレート（ＢｉｏＣｏａｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ ＭＡ
ＴＲＩＧＥＬ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ；ＢＤサイエンス社製、Ｃａｔ＃．３
５４４８３）を用いて細胞浸潤能を試験した。分析は、製造者の説明書に従って行った。

略述すると、上部チャンバにはＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ；５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗ
ｅｌｌ）を分注し、下部チャンバには抗体（１０μｇ／ｍｌ）を処理し、３７℃で培養し
た（ＨＧＦ＋ＶＥＧＦは下部チャンバに添加、それぞれ０．４μｇ／ｍｌずつ）。２４時
間後に、上部チャンバのコラーゲン層を貫いて下部チャンバに下降した細胞をカルセイン
で染色して蛍光顕微鏡（ツァイス社製）で観察した。

前記得られた結果と蛍光イメージを図３Ｄに示す。図３Ｄにおいて、上部は各抗体処理
群の相対的な蛍光イメージの広さを示すグラフである。ＶＥＧ＋ＨＧＦを処理した場合に
起こる浸潤を１００％とした相対的な値を示す。値が低いほど、浸潤があまり起きていな
いことが分かる。平均と標準偏差を表示し、一元配置分散分析法による分析結果、ＶＥＧ
Ｆ＋ＨＧＦ処理群と比較したときのｐ値を各グラフの上端に示す（^＊、ｐ＜０．０５；^＊
＊＊、ｐ＜０．００１）。図３Ｄの下端は、実際の蛍光イメージを示す写真である（黒色
が浸潤を引き起こした細胞である）。図３Ｄに示すように、ＶＥＧＦとＨＧＦの存在下に
おいて、二重特異性抗体ＭＶ１０ＡＹはｃ−Ｍｅｔ単一標的抗体であるＬ３−１Ｙ抗体に
比べてＨｕＶＥＣ細胞浸潤に対して顕著に優れた阻害効果を示すことを確認することがで
きる（ＭＶ１０ＡＹは９２％抑制；Ｌ３−１Ｙは７９％抑制；ベバシズマブは８３％抑制
）。

３．６．ＨＵＶＥＣ転移能（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）阻害試験（＋ＶＥＧＦ＋ＨＧＦ）
ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦは両方とも細胞成長だけではなく、がんの転移にも関連する因子
である。それぞれの阻害剤を併用投与するときにがん細胞転移能と関連する細胞の移動に
相乗効果を示すか否かを試験した。抗体処理（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）による転移能阻害能を
評価するために下記の実験を行った。細胞の移動はがんの転移に直接的に関与するため、
下記の分析法は細胞の転移能を評価する方法として汎用される方法である。

Ｏｒｉｓ９６ウェルプレート（Ｐｌａｔｙｐｕｓ、Ｏｒｉｓ^ＴＭ細胞移動アッセイ）方
法を行った。ストッパーが内蔵された９６ウェルプレートの各ウェルにＨｕＶＥＣ細胞（
ＡＴＣＣ）を１００００個ずつ接種し、無血清培地（ＥＢＭ、ロンザ社製）においてＨＧ
Ｆ０．４μｇ／ｍｌとＶＥＧＦ０．４μｇ／ｍｌを処理し、２４時間をかけて培養した後
にストッパーを除去した。ストッパーは円形のゴム物質であり、ストッパーがあった箇所
には細胞が成長できないため、２４時間後にストッパーを除去すれば、その個所にのみ円
形の空間が生成される。

ストッパーの除去後に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ、抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ、Ｍ
Ｖ１０ＡＹ抗体を様々な濃度（０．０５〜５μｇ／ｍｌ）で処理した後、２４時間後に蛍
光物質であるカルセインＡＭ（ＢＤ）で染色すれば細胞のみが染色され、細胞がない部分
は空間として残る。このため、細胞移動が阻害されるほど、未染色空間が大きくなり、未
染色空間を観察することにより、細胞移動の度合いを測定することができる。蛍光信号の
強さは、マルチラベルリーダ（パーキンエルマー社製、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で読み取り、
これによって得られた値をＶＥＧＦ＋ＨＧＦ処理群の信号強さ１００％として換算して図
３Ｅに示す。各濃度における平均と標準誤差を示し、ＶＥＧＦ＋ＨＧＦ群に比べての統計
学的有意性を各濃度点の上端に示す（ボンフェローニの多重比較検定を用いた二元配置分
散分析法；^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

試験された全範囲の抗体の処理量において、二重特異性抗体であるＭＶ１０ＡＹはｃ−
Ｍｅｔ単一標的抗体（Ｌ３−１Ｙ）またはＶＥＧＦ単一標的抗体ベバシズマブ処理時また
は前記単一標的抗体の併用処理時と比較して顕著に優れた阻害効果を示すことを確認する
ことができる（相乗作用の確認）。これは、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に抗ＶＥＧＦ機能を加えた
ＭＶ１０ＡＹ抗体の優越性を確実に示す結果である。

実施例４：融合タンパク質の抗がん効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦとＶＥＧＦをそれぞれ抑制するときに抗がん効果が得られると知ら
れているＵ８７−ＭＧ脳がん細胞株を用いて、生体内抗がん効果試験を行った。Ｕ８７−
ＭＧ脳がん細胞株（中国科学院の細胞銀行から購入；ＡＴＣＣ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ−
１４）２．５×１０^６個（１００μＬ）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雄性、６−７週齢
、２０−２５ｇｒａｍ）に皮下注射した後、１週間が経過した後に治療群（ＭＶ１０ＡＹ
（■）、ＭＶ１０ＡＹ Ｕ３ ＨＣ９／ＩｇＧ１（□）、またはＭＶ１０ＡＹ Ｕ３ Ｈ
Ｃ９／ＩｇＧ２（○）；投与量：それぞれ０．２ｍｇ／ｋｇ（点線）または１ｍｇ／ｋｇ
（実線）；投与時期：３−４日おきにまたは１０日おきに；投与経路：静脈注射）と対照
群（ビヒクル：ＰＢＳ ０．２ｍＬ、週１回静脈注射で投与）に分けて薬物投与を始めた
。各群あたりのマウスは１５匹にした。腫瘍の大きさを１週につき２回測定し、腫瘍の大
きさ（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）は｛（長径（ｍｍ））×（短径（ｍｍ））^２｝／２に
よって計算した。治療を始めてから３０日後にマウスを安楽死させた後に腫瘍を摘出し、
腫瘍の重さを測定して、前記測定された腫瘍の大きさとともに抗がん効果の評価に用いた
。

前記得られた結果を図４Ａに示す。図４Ａの上部は、経時的な腫瘍の大きさを示し、下
部は、実験終了後に最終的に摘出された腫瘍の重さ（ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔ）を示す
。図４Ａから明らかなように、投与を始めてから２週後から全ての治療群において顕著な
腫瘍抑制効果を示した。また、前記３種類の二重特異性抗体間の治療効果には大差なく、
投与量および投与回数を増やした群において一層強力な抑制効果を示した。１ｍｇ／ｋｇ
を３〜４日ごとに注射した群においては腫瘍がほとんど観察されない程度に完璧な抗がん
効能を示した。（上部グラフは、分散分析法（ＡＮＯＶＡ）により繰り返し測定した結果
を示し、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）；下部グラフは、ダネッ
トの多重比較検定を用いた一元配置分散分析法(１−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔ
ｔ''ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ)によるビークル群（ｖｅｈｉ
ｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）に対する分析結果を示す、＊＊（ｐ＜０．０１）、^＊＊＊（ｐ＜０
．０００１））
ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体に比べてｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする二重特異性
抗体がより向上した抗がん効果を示すか否かを調べるために、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株を
用いて生体内抗がん効果実験を行った。ＮＣＩ−Ｈ４４１は、ｃ−Ｍｅｔ標的による抗が
ん効果とアゴニズム効果を両方とも示す細胞株であり、包括的な抗がん効果を示すのに最
適な細胞株であると決定した。ＮＣＩ−Ｈ４４１肺がん細胞株（ＡＴＣＣから購入、Ｃａ
ｔ．＃ ＨＴＢ−１７４）５×１０^６個（１００ｕＬ）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雄
性、５−６週齢、２０−２５ｇ）に皮下注射した後、１週間が経過した後に治療群（単独
標的抗体Ｌ３−１Ｙ、二重特異性抗体それぞれ５ｍｇ／ｋｇ、週１回投与）と対照群（ビ
ヒクル：ＰＢＳ ０．２ｍＬ、週１回静脈注射で投与）に分けて薬物投与を始めた。各群
当たりのマウスは１５匹にした。腫瘍の大きさを１週につき２回測定し、腫瘍の大きさは
｛（長径（ｍｍ））×（短径（ｍｍ））^２｝／２により計算した。治療を始めてから２６
日後にマウスを安楽死させた後に腫瘍を摘出し、腫瘍の重さを測定して、前記測定された
腫瘍の大きさとともに抗がん効果評価に用いた。
前記得られた結果を図４Ｂに示す。図４Ｂの上部は、経時的な腫瘍の大きさを示し、下部
は、実験終了後に最終的に摘出された腫瘍の重さを示す。図４Ｂに示すように、投与を始
めてから１週間後から両治療群においていずれも統計的に有意的な抗がん効果が観察され
た。特に、Ｌ３−１Ｙに比べてＭＶ１０ＡＹ治療時よりも強力な抗がん効果が得られた（
上部グラフは、分散分析法（ＡＮＯＶＡ）により繰り返し測定した結果を示し、^＊＊＊＊
（ｐ＜０．０００１）、下部グラフは、ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分
析法（１−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ''ｍｕｌｔｉｐｌｅ cｏｍｐａｒｉｓ
ｏｎ ｔｅｓｔ）によるビークル群に対する分析結果を示す、^＊（ｐ＜０．０５）、^＊＊
＊（ｐ＜０．０００１））。

実施例５：様々な抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を含む融合タンパク質
ＶＩＧ２を融合した場合、上記の例において示すＬ３−１やＬ３−１Ｙ、Ｌ３−１ＹＩ
ｇＧ２に加えて他のＣＤＲを有する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能も改善されるか否かを確認し
た。

抗ｃＭｅｔ抗体の効能は、前記実施例２．２の方法と同様にして、ｃ−Ｍｅｔ分解の度
合いを試験して測定され、このときに用いられた抗体を下記表６にまとめて示す。

前記得られた結果を図５に示す。図５から明らかなように、二重特異性抗体であるＡｂ
１−ＶＩＧ２とＡｂ２−ＶＩＧ２は、それぞれのｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体であるＡｂ１お
よびＡｂ２に比べてｃ−Ｍｅｔ分解能が向上した。すなわち、Ａｂ１−ＶＩＧ２のｃ−Ｍ
ｅｔ分解能（８３．２％）は、単独標的抗体Ａｂ１の分解能（８１．７％）に比べて向上
し、Ａｂ２−ＶＩＧ２の場合にも分解能（８１．９％）が単独標的抗体Ａｂ２の分解能（
７０．４％）よりも向上した（ｔ検定析結果ｐ＜０．０１）。

Claims (22)

1. 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片およびＶＥＧＦ結合断片を含む、融合タンパ
   ク質。
2. 前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片と前記ＶＥＧＦ結合断片との間にリンカ
   ーをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記リンカーは、１〜１００個のアミノ酸を含むペプチドリンカーである、請求項２に
   記載の融合タンパク質。
4. 前記ＶＥＧＦ結合断片は、抗ＶＥＧＦ抗体、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片、ＶＥ
   ＧＦ受容体または前記ＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ結合部位である、請求項１〜３のいずれ
   か１項に記載の融合タンパク質。
5. 前記ＶＥＧＦ結合断片は、ベバシズマブ、ベバシズマブの抗原結合断片、配列番号１０
   ９を含むＶＥＧＦ受容体、配列番号１１０を含むＶＩＧ２ポリペプチド、または配列番号
   １１０を含む配列番号１０９の１０２〜１３３８の連続するアミノ酸を含むポリペプチド
   である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
6. 前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内の連続する５以
   上のアミノ酸からなるエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片である、請
   求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
7. 前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
   配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
   配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸
   配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸残基を含む連続する８〜１９個のアミノ酸を
   含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
   配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミ
   ノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸残基を含む６〜１３個の連続するアミノ酸
   を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、
   からなる群から選択された少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配
   列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８の
   アミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のア
   ミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸残
   基を含む配列番号８９の９〜１７個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ
   −Ｌ３、
   からなる群から選択された１以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む
   軽鎖可変領域と、
   を含み、
   前記配列番号４〜９は、それぞれ下記の一般式Ｉ〜ＶＩで表わされるアミノ酸配列であ
   る抗体または抗原結合断片である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質
   ：
   一般式Ｉ
   Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号４）、
   一般式ＩＩ
   Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ_５−Ｔｈｒ（配列番号５
   ）、
   一般式ＩＩＩ
   Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ_６−Ｔｙｒ（配列番号６）、
   一般式ＩＶ
   Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_７−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘａａ_８−Ｇｌ
   ｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ_９−Ｘａａ_１０−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号７）
   一般式Ｖ
   Ｔｒｐ−Ｘａａ_１１−Ｓｅｒ−Ｘａａ_１２−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘａａ_１３（配列番号８）
   一般式ＶＩ
   Ｘａａ_１４−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_１５−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１６−Ｔｈ
   ｒ（配列番号９）
   前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ_１は存在しない、あるいは、ＰｒｏまたはＳｅｒであり
   、Ｘａａ_２はＧｌｕまたはＡｓｐであり、
   前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ_３はＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_４はＡｌａま
   たはＶａｌであり、Ｘａａ_５はＡｓｎまたはＴｈｒであり、
   前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ_６はＳｅｒまたはＴｈｒであり、
   前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ_７はＨｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘ
   ａａ_８はＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ_９はＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ_１０
   はＬｙｓまたはＡｓｎであり、
   前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ_１１はＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ_１２はＴｈｒ
   またはＬｙｓであり、Ｘａａ_１３はＳｅｒまたはＰｒｏであり、
   前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ_１４はＧｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ_{１
   ５}はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_１６はＬｅｕ
   、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
8. 前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４か
   らなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から
   選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５
   からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配
   列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群から選ばれるアミノ酸配列
   を含むものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３
   ６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配
   列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群から選ばれる
   アミノ酸配列を含むものである、請求項７に記載の融合タンパク質。
9. 前記重鎖可変領域は、配列番号１７、配列番号７４、配列番号８７、配列番号９０、配
   列番号９１、配列番号９２、配列番号９３または配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前
   記軽鎖可変領域は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番
   号７５、配列番号８８、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配
   列番号９９、または配列番号１０７のアミノ酸配列を含む、請求項７または８に記載の融
   合タンパク質。
10. 前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
    配列番号６２のアミノ酸配列、配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸
    配列、配列番号６４のアミノ酸配列、配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミ
    ノ酸配列、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６の１８番目から４６０番目
    までのアミノ酸配列を含む重鎖と、
    配列番号６８のアミノ酸配列、配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸
    配列、配列番号７０、配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、また
    は配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖とからなる抗体である、請求項７〜９のいず
    れか１項に記載の融合タンパク質。
11. 前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号１１２または配列番号１１４のアミノ酸配列を含む
    重鎖および配列番号１１３または配列番号１１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求
    項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
12. 前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項
    に記載の融合タンパク質。
13. 前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、マウス由来の抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体ま
    たはヒト抗体である、請求項１から請求項１１のうちのいずれか１項に記載の融合タンパ
    ク質。
14. 前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ
    'およびＦ（ａｂ'）_２からなる群から選ばれる、請求項１から請求項１１のうちのいずれ
    か１項に記載の融合タンパク質。
15. 請求項１から請求項１１のうちのいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、ｃ−Ｍ
    ｅｔとＶＥＧＦの二重特異性抗体。
16. 請求項１５に記載のｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦの二重特異性抗体を有効成分として含む、ｃ
    −ＭｅｔまたはＶＥＧＦ誘発疾病の予防または治療用組成物。
17. 前記ｃ−ＭｅｔまたはＶＥＧＦ誘発疾病は、がん、妊娠糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑
    変性である、請求項１６に記載の予防または治療用組成物。
18. 請求項１５に記載のｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦの二重特異性抗体を含む、ｃ−Ｍｅｔまたは
    ＶＥＧＦ誘発疾病の診断用組成物。
19. 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程を含む、
    融合タンパク質の製造方法。
20. 前記ＶＥＧＦ結合断片は、配列番号１１０のＶＩＧ２、または配列番号１０９のアミノ
    酸のうち配列番号１１０のＶＩＧ２を含んで連続する１０２〜１３３８個のアミノ酸から
    なるポリペプチドである、請求項１９に記載の製造方法。
21. 前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程にお
    いて、ｃ−Ｍｅｔ標的抗体またはその断片とＶＥＧＦ結合断片とがリンカーを介して結合
    する、請求項１９または２０に記載の製造方法。
22. 前記リンカーは、１〜１００個のアミノ酸からなるペプチドリンカーである、請求項２
    １に記載の製造方法。