JP2017518038A - 抗her2完全ヒト抗体の突然変異体抗体、及びそれをコードする遺伝子並びにそれらの使用 - Google Patents
抗her2完全ヒト抗体の突然変異体抗体、及びそれをコードする遺伝子並びにそれらの使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
ELISA技術の抗原−抗体結合の特異性を利用して、ヒトHER2(細胞外ドメイン)−Fc融合タンパク質(hHER2−Fcと略する)抗原をELISAプレート上にコートし、コートした抗原に特異的に結合したファージを洗浄し、ピックアップした。ヒトHER2−Fc(Sino Biological Inc.から購入したもの、カタログ番号:10004−H02H)抗原はPBS(0.01M Na2HPO4・12H2O+0.002M KH2PO4+0.14M NaCl+0.002M KCl,pH=8.6)により5μg/mlに希釈し、ELISAプレートに100μl/ウェルにて加え、4℃、一晩コートした。プレートはPBST(0.05%のTween 20を含むPBS緩衝液)で4回洗浄し、その後5%BSA(アメリカ合衆国、Amresco Inc.から購入したもの、カタログ番号:0332−100g、溶液はPBSである)を300μl/ウェルにて、37℃、1時間、ブロッキングを行った。プレートはPBSTにて2回、再洗浄した。7×1010の独立したクローンを含む完全ヒトscFvファージ抗体ライブラリーの懸濁液(複数の健康な個体のリンパ細胞からの抗体可変領域遺伝子を人工的に合成した重鎖CDR3遺伝子と組み合わせることにより、EUREKA(北京)Biotechnology Ltd.により構築されたもの)を、ELISAプレートに100μl/ウェルにて加え、37℃で2時間、インキュベーションを行った。インキュベーションが終了した後に、ELISAプレートのウェルの中のファージ懸濁液は吸引された。その後、PBSTを各々のウェルに300μl/ウェルにて加え、ウェルの内容物を5分間の間、充分に流し去り、コートした抗原に特異的に結合していないファージを除去した。0.1%BSA(アメリカ合衆国、Amresco Inc.、カタログ番号:0332−100g、溶液はPBSである)を含む0.2Mグリシン−HCl(pH=2.2)溶出液を加え、室温で10分間、インキュベーションを行った。その後、コートした抗原に特異的に結合したファージを溶出するために、ウェル中の内容物を充分に流し去った。溶出したファージ懸濁液は1M Tris−HCl(pH9.1)緩衝液で中和した。溶出したファージは(約0.3から0.4であるOD600の値で示される)対数増殖期における1mLのバクテリアTG1(アメリカ合衆国、Lucigen Inc.、カタログ番号:60500−0)に加え、得られたバクテリア溶液は37℃、1時間、静置することにより感染させた。10μlの感染バクテリア溶液を10倍連続希釈に供し、10倍、100倍、1000倍希釈をプレーティングし、カウントした。90μlの感染バクテリア溶液を最終濃度10%グリセリンのグリセリン中、−80℃にて保存した。残りの感染バクテリア溶液は全て150mm 2×YT−A固体プレート(17g/Lのトリプトン、10g/Lの酵母エキス、5g/Lの塩化ナトリウム、15g/Lの寒天及び100μg/mlのアンピシリン)上にプレーティングし、37℃、一晩培養した。5mlの2×YT−A−10%グリセリン培地を150mmプレートに一晩加えた。プレートは滅菌した播種ロッドを用いて、残留バクテリア溶液がプレート上から無くなるまで、静かに掻爬した。第2回目の増幅段階において、適切な量の掻爬したバクテリア溶液を5mlの2×YT−AMP−グルコース液体培地(17g/Lのトリプトン、10g/Lの酵母エキス、5g/Lの塩化ナトリウム、2%のグルコース及び100μg/mlのアンピシリン)(OD600は好ましくは約0.05から0.1である)に加え、37℃、200rpmで対数増殖期まで培養した(OD600は約0.3から0.4である)。その後、バクテリアの総数の20倍の量のM13K07ヘルパーファージ(アメリカ合衆国、NEB Inc.から購入したもの、カタログ番号:N0315S)を加え、37℃、1時間、感染を行った。感染後、1500g、5分間で回収したバクテリアのペレットを2×YT−AMP−Kana培地(17g/Lのトリプトン、10g/Lの酵母エキス、5g/Lの塩化ナトリウム、50μg/mlのカナマイシン及び100μg/mlのアンピシリン)に再懸濁させ、30℃、200rpm、一晩培養し、組み換えファージの増幅及び調製を完結させた。第2段階のピックアップ及び第3段階の増幅及びピックアップは同じ要領で実行された。バクテリアコロニーを5mlの2×YT−AMP−グルコース液体培地(17g/Lのトリプトン、10g/Lの酵母エキス、5g/Lの塩化ナトリウム、2%のグルコース及び100μg/mlのアンピシリン)へ移し、37℃、200rpm、一晩培養した。プラスミドはプラスミド抽出キット(アメリカ合衆国、Qiagen Inc.から購入したもの、カタログ番号:12943)を用いて抽出し、塩基配列決定法により同定し、−80℃にて保存した。
酵素結合性免疫吸着検定法(ELISA)を用いて、実施例1において得られたヒトHER2−Fcに特異的に結合するファージの免疫反応性をさらに同定した。ヒトHER2−Fc抗原(Sino Biological Inc.から購入したもの、カタログ番号:10004−H02H)をPBS(pH=8.6)により、2μg/mlに希釈し、ELISAプレートに100μl/ウェルにて加え、4℃、一晩コーティングを行った。プレートはPBSTを用いて4回洗浄し、その後、5%BSA(アメリカ合衆国、Amresco社から購入したもの、カタログ番号:0332−100g、溶液はPBSである)を300μl/ウェルにて加え、37℃、1時間、ブロッキングを行った。プレートは再びPBSTを用いて2回洗浄し、その後、ファージクローンの懸濁液を100μl/ウェルにて加え、37℃で、2時間、インキュベーションを行った。プレートはPBSTを用いて4回洗浄した。HRP標識化抗M13K07ファージ抗体(アメリカ合衆国、GE Inc.から購入したもの、カタログ番号:27−9421−01、PBSTを用いて1:5000希釈、100μl/ウェル)を加え、室温で、1時間、インキュベーションを行った。プレートはPBSTを用いて4回洗浄し、その後、可溶単一成分基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Tiangen Co., Ltd.から購入したもの、カタログ番号:PA107−01)を100μl/ウェルにて加え、室温で15分間、可視化のためにインキュベーションを行った。停止溶液(1M硫酸)を50μl/ウェルにて加え、450/570nm波長の吸光度を多機能ELISAプレート(アメリカ合衆国、バイオラッド社、モデル680マイクロリーダー)上で読み取った。
102個のヒトHER2−Fc特異的scFvの、種間交差反応性、及びHERファミリーメンバー間の分子間交差反応性を、ELISAを用いて検出した。コーティングのためのヒトHER2−Fc抗原をサルHER2−Fc(Sino Biological Inc.から購入したもの、カタログ番号:90295−C02H)、マウスHER2−Fc(Sino Biological Inc.から購入したもの、カタログ番号:50714−M02H)、ヒトHER1−Fc(Sino Biological Inc.から購入したもの、カタログ番号:10001−H02H)、ヒトHER3−Fc(Sino Biological Inc.から購入したもの、カタログ番号:10201−H05H)及びヒトHER4−Fc(Sino Biological Inc.から購入したもの、カタログ番号:10363−H02H)に置き換えること以外は実施例2と同様の手順に従った。それぞれの抗原はPBS(pH=8.6)により2μg/mlに希釈し、100μl/ウェルにてELISAプレートに加え、コーティングを4℃、一晩行った。プレートはPBSTを用いて4回洗浄し、その後、5%BSA(アメリカ合衆国、Amresco社から購入したもの、カタログ番号:0332−100g、溶液はPBSである)を300μl/ウェルにて加え、37℃で、1時間、ブロッキングを行った。プレートは再びPBSTを用いて2回洗浄し、その後、ScFvファージの102クローンの懸濁液を100μl/ウェルにて加え、37℃で、2時間、インキュベーションを行った。プレートはPBSTを用いて4回洗浄した。HRP標識化抗M13K07ファージ抗体(アメリカ合衆国、GE Inc.から購入したもの、カタログ番号:27−9421−01、PBSTを用いて1:5000希釈、100μl/ウェル)を加え、室温で、1時間、インキュベーションを行った。プレートはPBSTを用いて4回洗浄し、その後、可溶単一成分基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Tiangen Co., Ltd.から購入したもの、カタログ番号:PA107−01)を100μl/ウェルにて加え、室温で15分間、可視化のためにインキュベーションを行った。停止溶液(1M硫酸)を50μl/ウェルにて加え、450/570nm波長の吸光度を多機能ELISAプレート(アメリカ合衆国、バイオラッド社、モデル680マイクロリーダー)上で読み取った。
102クローンのScFvファージの親和性ランキングをELISAによって行った。最初の濃度が25μg/mlであるヒトHER2−Fc抗原を、PBS緩衝液を用いた10倍希釈に供し、8つの濃度勾配を得た。希釈液はそれぞれ102クローンのScFvファージと共に、室温で4時間インキュベーションし、平衡に達しさせた。その後、得られた混合液を2μg/mlのヒトHER2−Fc抗原(pH=8.6 PBS、4℃、一晩、100μl/ウェル)で予めコートしたELISAプレートに加え、ELISAプレートは5%BSA(アメリカ合衆国、Amresco Inc.から購入したもの、カタログ番号:0332−100g、溶液はPBSである)を用いて捕獲されなかったScFv抗体が結合することから遮蔽するようにした。HRP標識化抗M13ファージ抗体(アメリカ合衆国、GE Inc.、カタログ番号:27−9421−01、PBSTにより1:5000希釈、100μl/ウェル)を加え、検出を実施例2と同様の手順にて実行した。102の陽性クローンの親和性ランキングをIC50値の観点で行った(IC50値がより低ければ、より高い親和性を示す)。
組み換え全長IgG1アイソタイプ抗体GB235−019(組み換え全長抗体配列019クローンはGB235−019と命名された)のための真核生物発現ベクターをScFvファージの102クローン塩基配列から構築した。完全ヒトScFvファージライブラリーからのスクリーニングにより得られたWG1−019単鎖抗体クローン(ScFvファージライブラリーからのスクリーニングにより得られた単鎖抗体配列クローンはWG1−019と命名された)のヌクレオチド配列は配列番号9であり、配列番号3(配列番号1のアミノ酸配列をコードするもの)及び配列番号4(配列番号2のアミノ酸配列をコードするもの)のヌクレオチド配列をそれぞれ有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。シグナルペプチドはMELGLSWIFLLAILKGVQCのアミノ酸配列とATGGAGTTGGGACTGTCTTGGATTTTCCTGTTGGCTATTCTGAAAGGTGTGCAGTGTのヌクレオチド配列を有していた(Shanghai Generay Biotech Co, Ltdにより合成したもの)。
1−1:5’−GAATTCGCGGCCGCATGGAGTTGGGACTG−3’
2−3:5’−CTGGGTCATCTGGATGTCACACTGCACACCTTTC−3’
3−3:5’−GAAAGGTGTGCAGTGTGACATCCAGATGACCCAG−3’
4−4:5’−GATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATCTCCACCTTG−3’
5−2:5’−ATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATC−3’
6−1:5’−GTTTAAACGGATCCCTAACACTCTCCCCTGTTG−3’
7−7:5’−GTACCAGCTGGACCTC ACACTGCACACCTTTC−3’
8−7:5’−GAAAGGTGTGCAGTGTGAGGTCCAGCTGGTAC−3’
9−1:5’−GATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTCAC−3’
10−1:5’−ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC−3’
11−1:5’−GTTTAAACGGATCCTCATTTACCGGGAGACAGGGAG−3’
実施例5において構築したGB235−019抗体についての組み換えベクターの発現のために、フリースタイル293F細胞(アメリカ合衆国、Invitrogen社から購入したもの、カタログ番号:R790−07)を共形質移入する方法を使用することができる。形質移入の24時間前に、フリースタイル293F細胞を6×105細胞/mlに継代培養し、温度自動調節器付きシェーカー上で135rpm、37℃、8% CO2の条件下で、形質移入の日に(血球数計測法による)細胞密度が1.2〜1.5×106細胞/mlとなるように培養した。細胞はフリースタイル293培地(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.、カタログ番号:12338−018)を用いて、密度が1×106細胞/mlとなるように希釈した。最良の形質移入を確実にするためには(トリパンブルー染色法による)細胞生存度が95%を超えるべきである。
10μgのGB235−019抗体中にジチオスレイトールを最終濃度20mMになるように加え、混合液を水槽に37℃で、30分間インキュベーションし、全ての鎖間ジスルフィド結合を破壊した。分離した軽鎖及び重鎖は質量分析計を組み合わせた逆相クロマトグラフィーを用いて解析した。ウォーターズ H−クラス・バイオ超高速液体クロマトグラフィー(アメリカ合衆国、Waters Inc.)を使用して、クロマトグラフィーカラム:PLRP−S 300Å, 3.0μm、2.1×150mm(アメリカ合衆国、Agilent Inc.から購入したもの、カタログ番号:1912−3301)で;移動相:A(水)、B(アセトニトリル)及びC(1%トリフルオロ酢酸)で、4分後に35%Bである勾配を20分後に42%Bに変化させた。ここでC相は10%に維持し、流速は0.3mL/分、及び添加量は20μgである。サーモLTQ−Orbitrapディスカバリー(Thermo LTQ−Orbitrap Discovery)質量分析計(アメリカ合衆国、Thermo Fisher社)を使用した。ここでスプレイング電圧(spraying voltage)は3.7 KVであり、チューブレンズは230Vであり、キャピラリー温度は300℃であり、分解能は30000であり、質量−電荷比の範囲は1000から3000である。重鎖(GOFグリカン型を含むFc)の理論的分子量を、GPMAW6.0ソフトウェアを用いて計算すると50416.7Daであり、軽鎖の理論的分子量は23120.8Daであった。質量分析計から生成されたオリジナルシグナルはPROMASSソフトウェアを用いてデコンヴォリューションを行い、対応する測定分子量を得た。
保存的なN−グリコシル化部位はAsn−X−Thr/Serであり、ここでXはProを除く任意のアミノ酸である。N−連結グリカンはAsn−X−Ser/Thr特徴的配列のAsn残基に結合していた(Imperiali B, O’Connor SE. Effect of N−linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol 3 (6): 643−649)。実施例5において得られた全長抗体GB235−019のFabフレームワーク領域3のAsn73位はN−グリコシル化部位であった。保存的なN−グリコシル化部位はAsn−X−Ser/Thrのユニーク配列に変異を入れることにより取り除いた(Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks−2003. Nat Biotechnol, 2003, 21:865−870)。IgBLAST配列比較により、生殖細胞系列遺伝子におけるAsp−Thr−Serの組み合わせの存在が明らかになった。ヌクレオチド配列比較により示されたように、Asnに対応するコドン「AAC」はAsnをAspに変化させるように「GAC」と変異させることもできた。Asn及びGlnの両方はアミド型のアミノ酸であり、Glnが側鎖にAsnよりも1つ多いメチル基を有する点でそれらは互いに保存的な置換である。同様に、Asnに対応するコドン「AAC」はAsnをGlnに変化させるように「CAG」と変異させることもできた。IgBLASTにより、生殖細胞系列遺伝子内でSerの位置におけるAlaの存在が明らかになった。生殖細胞系列ヌクレオチド配列比較により、Serに対応するコドン「TCC」は、SerをAlaに置き換えるために「GCC」に変異させることもできた。
12−1:5’−GTCACCATGACCAGGGACACCTCCAT−3’
12−2:5’−ATGGAGGTGTCCCTGGTCATGGTGAC−3’
13−1:5’−GTCACCATGACCAGGCAGACCTCCATAAGC−3’
13−2:5’−GCTTATGGAGGTCTGCCTGGTCATGGTGAC−3’
14−1:5’−CATGACCAGGAACACCGCCATAAGCAC−3’
14−2:5’−GTGCTTATGGCGGTGTTCCTGGTCATG−3’
実施例8において構築した突然変異体抗体についての組み換えベクターの発現は、実施例6におけるものと同じ手順によって行った。293−VH−CH−N73D、293−VH−CH−N73Q及び293−VH−CH−S75Aは、フリースタイル293F細胞(アメリカ合衆国、Invitrogen社から購入したもの、カタログ番号:R790−07)に共形質移入するためにそれぞれ293−VL−CLと共に使用した。
実施例9において得られた突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75Aの還元分子量を解析する方法は実施例7のものと同じである。10μgのGB235−019突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75Aの各々にジチオスレイトールを最終濃度20mMになるように加え、突然変異体抗体を水槽にて37℃で、30分間インキュベーションし、全ての鎖間ジスルフィド結合を破壊した。分離した軽鎖及び重鎖は質量分析計を組み合わせた逆相クロマトグラフィーを用いて解析した。ウォーターズ H−クラス・バイオ超高速液体クロマトグラフィー(アメリカ合衆国、Waters Inc.)を使用して、クロマトグラフィーカラム:PLRP−S 300Å, 3.0μm、2.1×150mm(アメリカ合衆国、Agilent Inc.から購入したもの、カタログ番号:1912−3301)で;移動相:A(水)、B(アセトニトリル)及びC(1%TFA)、4分後に35%Bから20分後に42%Bへの勾配にした、ここでC相は10%に維持し、流速は0.3mL/分、及び添加量は20μgである。サーモLTQ−Orbitrapディスカバリー(Thermo LTQ−Orbitrap Discovery)質量分析計(アメリカ合衆国、Thermo Fisher Inc.)を使用した。ここでスプレイング電圧は3.7KVであり、チューブレンズは230Vであり、キャピラリー温度は300℃であり、分解能は30000であり、質量−電荷比の範囲は1000から3000である。3つの突然変異体抗体の重鎖(GOFグリカン型を含むFc)の理論的分子量を、GPMAW6.0ソフトウェアを用いて計算すると、GB235−019S75Aについては50400.7Da、GB235−019N73Dについては50417.7Da及びGB235−019 N73Qについては50430.7Daであった。質量分析計から収集されたオリジナルシグナルはPROMASSソフトウェアを用いてデコンヴォリューションを行い、対応する測定分子量を得た。
GB235−019野生型抗体(GB235−019WT)及び突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75AのヒトHER2抗原への結合能を、ELISA結合アッセイを用いて下記の手順により検証した。ヒトHER2抗原(Sino Biological Inc.から購入したもの、カタログ番号:10004−H08H)を、PBSを用いて1μg/mlに希釈し、ELISAプレートに100μl/ウェルにて加え、4℃、一晩コーティングを行った。プレートはPBSTを用いて4回洗浄し、その後、5%BSA(アメリカ合衆国、Amresco社から購入したもの、カタログ番号:0332−100g、溶液はPBSである)を300μl/ウェルにて加え、室温で1時間、ブロッキングを行った。プレートを、PBSTを用いて4回洗浄した後、GB235−019WT抗体及び突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75Aの各々、並びにペルツズマブ(Roche Corp.から購入したもの)及びハーセプチン(Roche Corp.から購入したもの)のそれぞれを5μg/mlから始めて、5倍希釈に供し、7つの濃度勾配を得た。各々の希釈液はELISAプレートに100μl/ウェルにて加え、室温で1時間インキュベーションした。プレートはPBSTを用いて4回洗浄し、その後HRP標識化ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体(アメリカ合衆国、CalBiochem Inc.から購入したもの、カタログ番号:AP113A−K)を、PBS緩衝液を用いて1:10000に希釈し、ELISAプレートに100μl/ウェルにて加え、室温で1時間、インキュベーションを行った。プレートはPBSTを用いて4回洗浄し、その後、可溶単一成分基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Tiangen Co., Ltd.から購入したもの、カタログ番号:PA107−01)を100μl/ウェルにて加え、室温で15分間、可視化のためにインキュベーションを行った。停止溶液(1M硫酸)を50μl/ウェルにて加え、450/630nm波長の吸光度をM5多機能ELISAプレート(アメリカ合衆国、Molecular Devices Inc.)上で読み取った。
乳がんBT−474細胞は中程度レベルのHER2及びHER3並びに高レベルのP−HER2を発現するが、P−HER3は発現しない(Richard M. Neve. Acollection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. CANCER CELL, 2006, 515−527)。本明細書において上記に定義したように、乳がんBT−474細胞はHER2陽性腫瘍細胞である。ヘレグリン−α(アメリカ合衆国、R&D Inc.から購入したもの、カタログ番号:296−HR)を補填した完全培地を用いた増殖阻害アッセイにおいて、対数増殖期のBT−474細胞を96ウェル培養プレート内で10%のウシ胎仔血清(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.から購入したもの、カタログ番号:A10491)を含むRPMI1640完全培地(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.から購入したもの、カタログ番号:10099−141)内で5000細胞/ウェルにて、37℃、5% CO2中で24時間、培養した。GB235−019WT抗体及び突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75Aを別途に、並びにハーセプチンと組み合わせて投与することにより阻害アッセイを行った。別途投与グループ内において、GB235−019WT抗体及びGB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75A突然変異体抗体並びにペルツズマブ及びハーセプチンをそれぞれ加えた(最終操作濃度、75、18.8、4.7、1.2、0.29、0.07、0.018、0.005、0.0011、及び0μg/ml);並びに組み合わせ投与グループにおいて、上記の用量のGB235−019WT、GB235−019N73D、GB235−019N73Q、GB235−019S75A及びペルツズマブの各々はハーセプチンと組み合わせて投与した。2時間の上記のような抗体処置の後、最終操作濃度100ng/mlのヘレグリン−α溶液を加えた。ここでウェルにはヘレグリン−α溶液の添加が無いウェルも含めている。プレートはさらに37℃、5% CO2中、6日間、培養した。アラマーブルー(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.から購入したもの、カタログ番号:DAL1100)をBT−474細胞の生存率を検出するために加え、544/590nmにおける蛍光度をM5多機能ELISAプレートリーダー(アメリカ合衆国、Molecular Devices Inc.)上で読み取った。
対数増殖期のBT−474細胞は6ウェル培養プレート中で10%ウシ胎仔血清(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.から購入したもの、カタログ番号:10099−141)を含むRPMI1640完全培地(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.から購入したもの、カタログ番号:A10491)内に1.8×105細胞/ウェルにて、37℃で、5%CO2中、24時間、培養した。次の日、培地を廃棄し、0.1%ウシ胎仔血清(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.から購入したもの、カタログ番号:10099−141)を含む低血清培養用培地を代わりに使用し、24時間、インキュベーションした。
乳がんMCF7細胞は低レベルのHER2及び高レベルのHER3を発現するが、P−HER2及びP−HER3は発現しない(Richard M. Neve. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. CANCER CELL, 2006: 515−527)。上記に定義したように、乳がんMCF7細胞はHER2陰性腫瘍細胞である。対数増殖期におけるMCF7細胞を6ウェル培養プレート中で10%ウシ胎仔血清(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.から購入したもの、カタログ番号:10099−141)を含むRPMI1640完全培地(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.から購入したもの、カタログ番号:A10491)内に1.8×105細胞/ウェルにて、24時間、培養した。次の日、培地を廃棄し、0.1%ウシ胎仔血清を含む低血清培養用培地を代わりに使用し、24時間、飢餓培養を行った。MCF7細胞を20μg/mlの各々のGB235−019WT抗体及び突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75Aで処置し、ペルツズマブ及びハーセプチンを別途に又はRPMI−0.1%ウシ胎仔血清培養液内に組み合わせて6時間、投与した。10分間の誘導のためにヘレグリン−α(アメリカ合衆国、R&D Inc.から購入したもの、カタログ番号:296−HR)を100ng/mlの操作最終濃度にて加えた。ここでウェルにはヘレグリン−αを添加しないブランク対照ウェルを含めている。反応を停止するために、プレートは予め4℃で冷却したPBSを用いて1度洗浄した。その後、120μlのLDS(アメリカ合衆国、Invitrogen Inc.から購入したもの、カタログ番号:NP0007)をプレートに加え、プレートは氷上に置いた。細胞可溶化物を即座に回収し、後の使用のために−80℃にて保存した。
GB235−019突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75Aを、それらの純度を決定するために分子サイズ排除クロマトグラフィー(SEC−HPLC)にそれぞれ供した。実験条件は下記の通りである:ウォーターズ2695液体クロマトグラフィー(アメリカ合衆国、Waters Inc.);連結したTSKゲル G3000SWXLクロマトグラフィーカラム(2カラム)(アメリカ合衆国、Waters Inc.から購入したもの);0.1Mリン酸緩衝液、0.1M塩化ナトリウム、pH7.0、1.0mL/min、30分間のアイソクラチック保持である移動相;各々の抗体30μgである添加量;及び280nmである検出波長。
突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75Aはそれぞれ画像化キャピラリー等電点電気泳動(imaging capillary isoelectric focusing;iCIEF)に供し、それぞれの主要ピークの等電点(pI)及び荷電アイソマーの純度を決定した。実験条件は下記の通りである:プロテインシンプル(ProteinSimple) iCE280 キャピラリー等電点電気泳動装置(アメリカ合衆国、Protein Simple Inc.);iCIEFカートリッジ(アメリカ合衆国、Protein Simple Inc.から購入したもの);両性電解質溶液は、12μlのファーマライト(Pharmalyte)3−10(アメリカ合衆国、GE Inc.から購入したもの、カタログ番号:17045601)、0.5μlのpIマーカー5.85(アメリカ合衆国、GE Inc.から購入したもの、カタログ番号:17−0472−01)、0.5μlのpIマーカー9.77(アメリカ合衆国、GE Inc.から購入したもの、カタログ番号:17−0473−01)、
2μlの500mM L−アルギニン(Sangon Inc.から購入したもの、カタログ番号:AB0205−100g)、2μlの200mM イミノ二酢酸(Sangon Inc.から購入したもの、カタログ番号:IB0530−100g)、70μlの1%メチルセルロース(Sangon Inc.から購入したもの、カタログ番号:MB0616−250g)及び113μlの5.3M尿素(Sangon Inc.から購入したもの、カタログ番号:UB0148−500g)を混合することにより調製した。添加溶液を180μlの両性電解質溶液を20μlの2.5mg/mLタンパク質溶液と混合することにより調製した。サンプルシステムは1500V、1分間、プレフォーカスさせ、3000V、10分間、フォーカスさせた。フォーカスパターンは280nmの検出波長でCCDカメラを用いて記録した。
突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75Aは、それぞれ還元キャピラリーゲル電気泳動解析(rCE−SDS)に供し、それぞれの純度(軽鎖及び重鎖のパーセンテージの合計)について決定した。実験条件は下記の通りである。SDS−MW解析キット(アメリカ合衆国、Beckman Inc.から購入したもの、カタログ番号:390953)及び非コーティングキャピラリーチューブ(Micro solv Inc.から購入したもの)を解析に使用した。100mM Tris−HCl、pH9.0、1% SDS(Sangon Inc.から購入したもの、カタログ番号:SB0485−100g)溶液をβ−メルカプトエタノール(アメリカ合衆国、Sigma Inc.から購入したもの、カタログ番号:M6250)と55:5の割合で混合させた。60μlの上述の混合溶液を40μlの2.5mg/mLサンプル溶液と混合させ、70℃の水槽に10分間インキュベーションした。サンプル添加は5KV、20秒間で行い、分離は15KV、30分間で行った。波長を214nmとして、UV検出器を使用した。
突然変異体抗体GB235−019N73D、GB235−019N73Q及びGB235−019S75Aは、示差走査熱量測定(DSC)にそれぞれ供し、それぞれのTm値(50%の生物学的分子がその温度においてアンフォールド状態にあることを意味する、相転移温度)を決定した。実験条件は下記の通りである。130μlの検出細胞容量を有するマイクロキャル(MicroCal) VP−キャピラリー DSC示差走査熱量測定器(アメリカ合衆国、GE Inc.)を使用した。3つの突然変異体抗体をPBS(0.01M Na2HPO4・12H2O+0.002M KH2PO4+0.14M NaCl+0.002M KCl,pH=8.6)を用いて各々0.9mg/mLに希釈した。PBSはブランク対照として使用し、温度変化を30℃から95℃へと設定し、スキャニング速度を60℃/時に設定した。
Claims (10)
- 抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号10及び配列番号2;配列番号11及び配列番号2、或いは、配列番号12及び配列番号2である、抗HER2完全ヒト抗体。
- Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv又はscFvの形態である、請求項1に記載の抗HER2完全ヒト抗体。
- ヒトIgGの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み;好ましくは、ヒトIgGがIgG1であり、より好ましくは、ヒトIgG重鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号5であり、ヒトIgG軽鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号6である、請求項1に記載の抗HER2完全ヒト抗体。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗HER2完全ヒト抗体をコードするヌクレオチド配列であって、好ましくは、前記ヌクレオチド配列において、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号13、配列番号14又は配列番号15であり、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号4である、ヌクレオチド配列。
- 請求項4に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が前記発現ベクターの発現制御配列に作動可能に連結しており;好ましくは、前記発現ベクターはpGEM−Tベクター又は293ベクターである、発現ベクター。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗HER2完全ヒト抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗HER2完全ヒト抗体及び1つ又は複数の付加的なHER2陽性腫瘍治療剤を含み、前記1つ又は複数の付加的なHER2陽性腫瘍治療剤がハーセプチン又はペルツズマブである、組み合わせ薬剤。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗HER2完全ヒト抗体を含む、ヒトHER2を検出するためのキット。
- 対象のHER2陽性腫瘍、弱陽性腫瘍又は陰性腫瘍を治療するための薬剤の調製における、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗HER2完全ヒト抗体の使用であって、好ましくは、前記HER2陽性腫瘍が、HER2陽性の乳がん、胃がん、肺がん、肺非小細胞がん、骨のがん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門がん、大腸がん、卵管がん、子宮体がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織のがん、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿道がん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆嚢がん、慢性又は急性白血病、リンパ細胞リンパ腫、中枢神経系(CNS)がん、脊髄腫瘍、脳幹の神経膠腫、多形性神経膠芽細胞腫、星細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌及び下垂体腺腫から選択される、使用。
- 対象がHER2陽性腫瘍、弱陽性腫瘍又は陰性腫瘍を有するヒトである、請求項9に記載の使用。
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