KR102593409B1 - Her3 항원 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

HER3 항원 결합 분자가 개시된다. 또한 HER3 항원 결합 분자를 인코딩하는 핵산 및 발현 벡터, 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법이 개시된다.

Description

HER3 항원 결합 분자
본 출원은 2018년 3월 29일자로 출원된 PCT/EP2018/058259, 및 2018년 10월 25일자로 출원된 US 16/170,370의 우선권을 주장하며, 그의 내용 및 요소들은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명은 분자 생물학, 보다 구체적으로 항체 기술의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의학적 치료 및 예방 방법에 관한 것이다.
증가된 HER3 발현은 유방암, 위암, 두경부암, 췌장암, 난소암 및 폐암을 포함하는 다발성 고형 종양에서 불량한 예후와 관련된다. HER3 매개 신호전달(signalling)은 종양 진행에 악영향을 미치고, HER3 상향조절은 항-HER2 및 항-EGFR 요법에 대한 내성과 관련되며, 항-PD-1 요법에 불응성인 고형 종양은 항-PD-1 요법에 대해 반응성인 것과 비교하여, HER3 발현이 더 높은 것으로 나타났다.
HER3-결합 항체는 예를 들어, 문헌[Zhang et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica (2016) 48(1): 39-48]에 기재되어 있다. 항-HER3 항체 LJM-716은 HER3 세포외 도메인의 하위도메인 II 및 IV 상의 에피토프에 결합하여, HER3을 불활성 입체형태로 고정한다 (문헌[Garner et al., Cancer Res (2013) 73: 6024-6035]). MM-121 (세리반투맙 (seribantumab)으로도 공지됨)은 헤레굴린 (heregulin) (HRG)과 HER3의 결합을 차단함으로써 HER3 매개 신호전달을 억제하는 것으로 나타났다 (문헌[Schoeberl et al., Sci. Signal. (2009) 2 (77): ra31). 파트리투맙 (Patritumab) (U-1287 및 AMG-888로도 공지됨)은 또한 헤레굴린과 HER3의 결합을 차단한다 (예를 들어, 문헌[Shimizu et al. Cancer Chemother Pharmacol. (2017) 79 (3): 489-495] 참조). RG7116 (룸레투주맙 (lumretuzumab) 및 RO-5479599)는 HER3 세포외 도메인의 하위도메인 I에서 에피토프를 인식한다 (예를 들어, 문헌[Mirschberger et al. Cancer Research (2013) 73 (16) 5183-5194] 참조). KTN3379는 하위도메인 III의 아미노산 잔기 (서열번호 1의 다음 위치에 해당: Gly476, Pro477, Arg481, Gly452, Arg475, Ser450, Gly420, Ala451, Gly419, Arg421, Thr394, Leu423, Arg426, Gly427, Lys356, Leu358, Leu358, Lys356, Ala330, Lys329 및 Gly337) 및 하위도메인 II의 Met310, Glu311 및 Pro328와의 상호작용을 통해 HER3에 결합한다 (문헌[Lee et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Oct 27; 112(43):13225] 참조). AV-203 (CAN-017로도 공지됨)은 NRG1과 HER3의 결합을 차단하고, HER3 분해를 촉진하는 것으로 나타났다 (문헌[Meetze et al., Eur J Cancer 2012; 48: 126] 참조). REGN1400은 또한 HER3과 리간드의 결합을 억제한다 (문헌[Zhang et al., Mol Cancer Ther (2014) 13: 1345-1355] 참조). RG7597 (둘리고투주맙 (duligotuzumab))은 HER3 및 EGFR 둘 모두에 결합할 수 있는 이중 작용 Fab (DAF)이며, HER3의 하위도메인 III에 결합한다 (문헌[Schaefer et al., Cancer Cell (2011) 20 (4): 472-486] 참조). MM-111 및 MM-141은 HER3과 HRG 리간드 결합을 억제하는 HER3-결합 아암을 갖는 이중특이적 항체이다 (문헌[McDonagh et al. Mol Cancer Ther (2012) 11:582-593 및 Fitzgerald et al., Mol Cancer Ther (2014) 13:410-425] 참조).
제1 양상에서 본 발명은 세포외 영역 하위도메인 II에서의 HER3에 결합할 수 있는 선택적으로 단리된 항원 결합 분자를 제공한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230 및 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 99의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 158의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 159의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 160의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 165의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 166의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 167의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 129의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 130의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 136의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 137의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 138의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 145의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 146의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 74의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(ii) 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 75의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(iii) 서열번호 26의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 76의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(iv) 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 77의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(v) 서열번호 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 78의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(vi) 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 78의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(vii) 서열번호 30의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 78의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(viii) 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(ix) 서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(x) 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 80의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xi) 서열번호 34의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 81의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xii) 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 82의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xiii) 서열번호 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xiv) 서열번호 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 84의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xv) 서열번호 38의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 85의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xvi) 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 86의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xvii) 서열번호 40의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 87의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xviii) 서열번호 127의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 135의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xix) 서열번호 143의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 150의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xx) 서열번호 157의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 164의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 서열번호 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(ii) 서열번호 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 84의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(iii) 서열번호 38의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 85의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인간 HER3 및 마우스 HER3, 랫트 HER3 및 시노몰구스 마카퀴 (cynomolgus macaque) HER3 중 하나 이상에 결합할 수 있다.
또한 (i) 본 발명에 따른 항원 결합 분자, 및 (ii) HER3 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 포함하는 선택적으로 단리된 항원 결합 분자가 제공된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 세포 표면에 HER3을 발현하는 세포에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3-매개 신호전달을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Fc 영역을 포함하며, 상기 Fc 영역은: (i) 위치 242에 해당하는 위치의 C, 및 위치 334에 해당하는 위치의 C, 및 (ii) 위치 236에 해당하는 위치의 A, 위치 239에 해당하는 위치의 D, 위치 332에 해당하는 위치의 E, 위치 330에 해당하는 위치의 L, 위치 345에 해당하는 위치의 K, 및 위치 430에 해당하는 위치의 G 중 하나 이상을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 위치 242에 해당하는 위치의 C, 위치 334에 해당하는 위치의 C, 위치 236에 해당하는 위치의 A, 위치 239에 해당하는 위치의 D, 위치 332에 해당하는 위치의 E, 및 위치 330에 해당하는 위치의 L을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)가 제공된다.
또한 본 발명에 따른 항원 결합 분자 또는 CAR을 인코딩하는 선택적으로 단리된 핵산 또는 다수의 핵산이 제공된다.
또한 본 발명에 따른 핵산 또는 다수의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터가 제공된다.
또한 항원 결합 분자, CAR, 본 발명에 따른 핵산 또는 다수의 핵산 또는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
또한 핵산(들) 또는 발현 벡터(들)로부터의 항원 결합 분자 또는 CAR의 발현에 적합한 조건 하에 본 발명에 따른 핵산 또는 다수의 핵산 또는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명에 따른 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한 의학적 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물이 제공된다.
또한 암의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물이 제공된다.
또한 암의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에서 본 발명에 따른 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 용도가 제공된다.
또한 암의 치료 또는 예방 방법으로서, 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본 발명에 따른 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 다양한 양상에 따르면, 본 방법은 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 억제제의 투여를 추가로 포함하고, 선택적으로 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 억제제는 HER2 및/또는 EGFR에 의해 매개되는 신호전달의 억제제이다.
일부 실시형태에서, 암은 EGFR 계열 구성원을 발현하는 세포를 포함하는 암, HER3을 발현하는 세포를 포함하는 암, 고형 종양 (solid tumor), 유방암, 유방 암종 (breast carcinoma), 유관 암종 (ductal carcinoma), 위암, 위 암종 (gastric carcinoma), 위 선암종 (gastric adenocarcinoma), 결장직장암 (colorectal cancer), 결장직장 암종 (colorectal carcinoma), 결장직장 선암종 (colorectal adenocarcinoma), 두경부암 (head and neck cancer), 두경부의 편평 세포 암종 (squamous cell carcinoma of the head and neck) (SCCHN), 폐암, 폐 선암종 (lung adenocarcinoma), 편평 세포 폐 암종 (squamous cell lung carcinoma), 난소암, 난소 암종 (ovarian carcinoma), 난소 장액성 선암종 (ovarian serous adenocarcinoma), 신장암, 신세포 암종 (renal cell carcinoma), 신장 투명 세포 암종 (renal clear cell carcinoma), 신세포 선암종 (renal cell adenocarcinoma), 유두 신세포 암종 (renal papillary cell carcinoma), 췌장암, 췌장 선암종 (pancreatic adenocarcinoma), 췌관 선암종 (pancreatic ductal adenocarcinoma), 자궁경부암 (cervical cancer), 자궁경부 편평 세포 암종 (cervical squamous cell carcinoma), 피부암, 흑색종 (melanoma), 식도암, 식도 선암종 (esophageal adenocarcinoma), 간암, 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma), 담관암종 (cholangiocarcinoma), 자궁암, 자궁 체부 내막 암종 (uterine corpus endometrial carcinoma), 갑상선암, 갑상선 암종 (thyroid carcinoma), 갈색세포종 (pheochromocytoma), 부신경절종 (paraganglioma), 방광암, 방광 요로상피 암종 (bladder urothelial carcinoma), 전립선암, 전립선 선암종 (prostate adenocarcinoma), 육종 (sarcoma) 및 흉선종 (thymoma)으로부터 선택된다.
또한 HER3-매개 신호전달을 억제하는 방법으로서, HER3-발현 세포와 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 HER3-발현 세포의 수 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 본 방법은 HER3-발현 세포와 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 HER3에 결합된 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 포함하는 선택적으로 단리된 시험관내 복합체(in vitro complex)가 제공된다.
또한 HER3을 포함하거나, 포함하는 것으로 추측되는 샘플과 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계, 및 항원 결합 분자와 HER3의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 HER3-표적화된 제제를 사용한 치료를 위해 대상체를 선택하거나 계층화(stratifying)하는 방법으로서, 본 방법은 시험관내에서, 대상체로부터의 샘플과 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계 및 항원 결합 분자와 HER3의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 시험관내 또는 생체내 진단제 또는 예후제(prognostic agent)로서의, 본 발명에 따른 항원 결합 분자의 용도가 제공된다.
또한 암을 검출하거나, 국재화하거나 영상화하는 방법에서의 본 발명에 따른 항원 결합 분자의 용도로서, 선택적으로 암은 EGFR 계열 구성원을 발현하는 세포를 포함하는 암, HER3을 발현하는 세포를 포함하는 암, 고형 종양, 유방암, 유방 암종, 유관 암종, 위암, 위 암종, 위 선암종, 결장직장암, 결장직장 암종, 결장직장 선암종, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종 (SCCHN), 폐암, 폐 선암종, 편평 세포 폐 암종, 난소암, 난소 암종, 난소 장액성 선암종, 신장암, 신세포 암종, 신장 투명 세포 암종, 신세포 선암종, 유두 신세포 암종, 췌장암, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁경부암, 자궁경부 편평 세포 암종, 피부암, 흑색종, 식도암, 식도 선암종, 간암, 간세포 암종, 담관암종, 자궁암, 자궁 체부 내막 암종, 갑상선암, 갑상선 암종, 갈색세포종, 부신경절종, 방광암, 방광 요로상피 암종, 전립선암, 전립선 선암종, 육종 및 흉선종으로부터 선택되는 용도가 제공된다.
상세한 설명
본 발명은 공지된 항-HER3 항체와 비교하여 개선된 특성을 갖는 신규한 HER3-결합 분자에 관한 것이다.
본 발명자들은 HER3의 세포외 영역의 특정 대상 영역에 결합하는 항원 결합 분자의 표적화된 생성을 수행하였다. 본 발명의 HER3 결합 분자는 종래 기술에 개시된 항원 결합 분자와 비교하여 적절한 생물물리적 및/또는 기능적 특성의 조합을 제공한다.
본 발명의 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3의 세포외 영역의 하위도메인 II (서열번호 16)에 결합할 수 있으며, 결합된 HER3 분자와 상호작용 파트너의 결합을 억제한다.
특히, HER3-결합 본 명세서에 기재된 항원 결합 분자는 HER3의 에피토프에 결합하여, 광범위한 암에 대한 항암 활성을 제외하고, HER3과 상호작용 파트너의 결합의 강력한 억제, 하류 신호전달의 강력한 억제를 제공하는 것으로 나타났다.
HER3
HER3 (또한 예를 들어, ERBB3 LCCS2, MDA-BF-1로 공지됨)은 UniProt P21860에 의해 확인된 단백질이다. 인간 ERBB3 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA의 대안적인 스플라이싱은 5개의 상이한 이소형: 이소형 1 (UniProt: P21860-1, v1; 서열번호 1); 이소형 2 (UniProt: P21860-2; 서열번호 2) (위치 141로부터 서열번호 1과 상이한 서열을 포함하고, 서열번호 1의 위치 183 내지 1342에 해당하는 아미노산 서열이 부재함); 이소형 3 (UniProt: P21860-3; 서열번호 3 (서열번호 1 대비 치환 C331F를 포함하고, 서열번호 1의 위치 332 내지 1342에 해당하는 아미노산 서열이 부재함); 이소형 4 (UniProt: P21860-4; 서열번호 4) (서열번호 1의 위치 1 내지 59에 해당하는 아미노산 서열이 부재함); 및 이소형 5 (UniProt: P21860-5; 서열번호 5) (서열번호 1의 위치 1 내지 643에 해당하는 아미노산 서열이 부재함)를 생성한다.
서열번호 1 내지 3의 N-말단 19개 아미노산은 신호 펩타이드를 구성하므로, 성숙한 형태의 HER3 이소형 1, 2 및 3 (즉, 신호 펩타이드를 제거하기 위한 처리 후)은 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
HER3의 구조 및 기능은 예를 들어, 문헌[Cho and Leahy Science (2002) 297 (5585):1330-1333, Singer et al., Journal of Biological Chemistry (2001) 276, 44266-44274, Roskoski et al., Pharmacol. Res. (2014) 79: 34-74, Bazley 및 Gullick Endocrine-Related Cancers (2005) S17-S27 and Mujoo et al., Oncotarget (2014) 5(21):10222-10236]에 기재되어 있으며, 상기 문헌 각각은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. HER3은 2개의 류신 다존재 하위도메인 (도메인 I 및 III, 각각 서열번호 15 및 17에 제시됨) 및 2개의 시스테인 다존재 하위도메인 (도메인 II 및 IV, 각각 서열번호 16 및 18에 제시됨)을 포함하는 N-말단 세포외 영역 (서열번호 9)을 갖는 단일 통과 막관통 ErbB 수용체 티로신 키나제이다. 도메인 II는 다른 HER 수용체 분자와의 분자간 상호작용에 관여하는 β 헤어핀 이량체화 루프 (서열번호 19)를 포함한다. 세포외 영역은 막관통 영역 (서열번호 10)을 통해 세포질 영역 (서열번호 11)에 연결된다. 세포질 영역은 막근접 절편 (서열번호 12), 단백질 키나제 도메인 (서열번호 13) 및 C-말단 절편 (서열번호 14)를 포함한다.
HER3을 통한 신호전달은 수용체 동종이량체화 (즉, 다른 HER3 수용체와 함께) 또는 이종이량체화 (다른 HER 수용체, 예를 들어 HER2와 함께) 및 결과적으로 세포질 영역의 티로신의 단백질 키나제 도메인에 의한 자가인산화를 포함한다. 인산화된 티로신 잔기는 어댑터 (adaptor)/효과기 단백질 (예를 들어, Grb2 및 포스포리파제 Cγ (PLCγ), src 상동체 도메인 2 (SH2) 또는 포스포티로신 결합 (PTB) 도메인 포함)을 집합시킨다.
HER3을 통한 신호전달은 리간드 의존적 또는 리간드 비의존적 방식으로 활성화될 수 있다. 리간드가 부재하는 경우, HER3 수용체 분자는 일반적으로 수용체 이량체화를 억제하는 입체형태를 갖는 단량체로서 세포 표면에서 발현되며, 하위도메인 II의 이량체화 루프가 하위도메인 IV상의 포켓과 분자 내 접촉된다. HER3 리간드 예컨대, 뉴레굴린 (neuregulin)(NRG), 예를 들어, NRG1 (또한 헤레굴린, HRG로도 공지됨) 또는 NRG2와 세포외 영역의 하위도메인 I 및 III의 결합은 입체형태 변화를 유발하여, 하위도메인 II의 이량체화 루프가 노출되어, 수용체 이량체화 및 신호전달을 촉진한다. HER3의 일부 암 관련 돌연변이는 불활성 '폐쇄된' 입체형태의 형성에 필요한 하위도메인 II 및 IV의 상호작용을 방해할 수 있으며, 이에 따라 리간드 결합의 부재 하에 이량체화 루프의 항시적 제시 및 HER3 매개 신호전달의 활성화를 유발할 수 있다 (예를 들어 문헌[Jaiswal et al., Cancer Cell (2013) 23 (5): 603-617] 참조).
본 명세서에서, "HER3"은 임의의 종(species)으로부터의 HER3을 지칭하며 임의의 종으로부터의 HER3 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단백질의 "단편", "변이체" 또는 "상동체"는 참조 단백질(예컨대, 참조 이소형)의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것으로 선택적으로 특징화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 참조 단백질의 단편, 변이체, 이소형 및 상동체는 참조 단백질에 의해 수행된 기능을 수행하는 능력에 의해 특징화될 수 있다.
"단편"은 참조 단백질의 분획을 일반적으로 지칭한다. "변이체"는 일반적으로 참조 단백질의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 다른 변형을 포함하는 아미노산 서열을 갖지만, 참조 단백질의 아미노산 서열에 대해 고려할만한 정도의 서열 동일성(예컨대, 적어도 60%)을 보유하는 단백질을 지칭한다. "이소형"은 일반적으로 참조 단백질의 종과 동일한 종에 의해 발현된 참조 단백질의 변이체를 지칭한다. (예를 들어, HER3 이소형 1 내지 5는 모두 서로의 이소형임). "상동체"는 일반적으로 참조 단백질의 종과 비교하여 상이한 종에 의해 생성된 참조 단백질의 변이체를 지칭한다. 예를 들어, 인간 HER3 이소형 1 (P21860-1, v1; 서열번호 1) 및 레서스 마카퀴 (Rhesus macaque) HER3 (UniProt: F7HEH3-1, v2; 서열번호 20)은 서로의 상동체이다. 상동체는 오르소로그(orthologue)를 포함한다.
참조 단백질의 "단편"은, 선택적으로 참조 단백질(즉, 이로부터 단편이 유래된 단백질)의 길이의 적어도 20%일 수 있고 참조 단백질의 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 하나의 아미노산의 최대 길이를 가질 수 있지만, 임의의 길이(아미노산 수에 의한)일 수 있다.
HER3의 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200개의 아미노산 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있으며, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200 또는 1300개의 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, HER3은 포유류로부터의 HER3 (예를 들어, 영장류 (레서스, 시노몰구스, 비인간 영장류 또는 인간) 및/또는 설치류 (예를 들어, 랫트 또는 쥣과동물) HER3)이다. HER3의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로 소정의 종, 예를 들어, 인간으로부터의 미성숙 또는 성숙 HER3 이소형의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로할 수 있다.
이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 예를 들어 기능적 특성/활성에 대한 적절한 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 참조 HER3 (예를 들어, 인간 HER3 이소형 1)의 기능적 특성/활성을 갖는 기능적 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체일 수 있다. 예를 들어, HER3의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 HER2, NRG1 (유형 I, II, III, IV, V 또는 VI) 또는 NRG2 (α 또는 β) 중 하나 이상과 관련성을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, HER3은 서열번호 1 내지 8 중 하나에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, HER3의 단편은 서열번호 9 내지 19 중 하나, 예를 들어, 9, 16 또는 19 중 하나에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
표적 분자 상의 특정 대상 영역
본 발명의 항원 결합 분자는 HER3의 특정 대상 영역을 표적화하도록 특별히 설계되었다. 2 단계 접근법에서, 예측된 항원성, 기능 및 안전성에 대한 분석 후 표적화할 HER3 영역을 선택하였다. 그 후 표적 영역에 해당하는 펩타이드를 면역원으로 사용하여 특정 단일클론 항체를 생성하고, 천연 상태에서 HER3에 결합할 수 있는 확인된 항체를 후속 스크리닝하여, HER3의 표적 영역에 특이적인 항체를 제조하였다. 이 접근법은 항체 에피토프에 대한 정교한 제어를 제공한다.
본 발명의 항원 결합 분자는 이들이 결합하는 HER3 영역을 참조하여 규정할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3의 특정 대상 영역에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인접하는 아미노산 서열 (즉, 아미노산 1차 서열)로 구성된 HER3의 선형 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 아미노산 서열의 불연속 아미노산 서열로 구성된 HER3의 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3의 세포외 영역 (예를 들어, 서열번호 9에 제시된 영역)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3의 세포외 영역의 하위도메인 II (예를 들어, 서열번호 16에 제시된 영역)에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 229에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 229에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230 및 231에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230 및 231에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 231에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 231에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 21에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 21에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 19에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 19에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 22에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 22에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 1의 위치 260 내지 279에 해당하는 HER3의 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 1의 위치 260 내지 279에 해당하는 HER3의 영역의 아미노산 잔기와 접촉하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23에 제시된 HER3의 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23에 제시된 HER3의 영역의 아미노산 잔기와 접촉하지 않는다.
항체가 결합하는 펩타이드/폴리펩타이드의 영역은 항체-항원 복합체의 X-선 공결정학 분석, 펩타이드 스캐닝, 돌연변이 유발 맵핑, 질량 분석법에 의한 수소-중수소 교환 분석, 파지 디스플레이, 경쟁 ELISA 및 단백질 분해 기반 '보호' 방법을 포함하여 당 업계에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 당업자에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌[Gershoni et al., BioDrugs, 2007, 21(3): 145-156]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 본 명세서에 기재된 항체 클론 10D1, 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92, 10D1_c93, 10A6, 4-35-B2 또는 4-35-B4 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 HER3의 영역에 동일한 HER3의 영역 또는 중첩된 HER3의 영역에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 항체 클론 10D1_c89, 10D1_c90 또는 10D1_c91 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 HER3의 영역에 동일한 HER3의 영역 또는 중첩된 HER3의 영역에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 항체 클론 10D1_c89의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 HER3의 영역에 동일한 HER3의 영역 또는 중첩된 HER3의 영역에 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 단량체 사슬을 지칭한다. 펩타이드는 통상적으로 약 2 내지 50개의 아미노산 영역의 길이를 갖는다. "폴리펩타이드"는 2개 이상의 펩타이드의 중합체 사슬이다. 폴리펩타이드는 일반적으로 약 50개 아미노산보다 긴 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 서열번호 1, 3, 4, 6 또는 8 중 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230 및 231의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 231의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 1의 위치 260 내지 279에 해당하는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다.
소정의 펩타이드/폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 ELISA에 의한 분석, 면역블롯 (예를 들어, 웨스턴블롯), 면역침전, 표면 플라스몬 공명 (SPR; 예를 들어, 문헌[Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442] 참조) 또는 생물층 간섭계 (예를 들어, 문헌[Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507] 참조)을 포함하여 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다.
항원 결합 분자가 참조 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있는 실시형태에서, 상기 펩타이드/폴리펩타이드는 참조 아미노산 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 하나 이상의 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 펩타이드/폴리펩타이드는 참조 아미노산 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 예를 들어, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 1 내지 40, 1 내지 50, 5 내지 10, 5 내지 20, 5 내지 30, 5 내지 40, 5 내지 50, 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 20 내지 30, 20 내지 40 또는 20 내지 50개의 추가의 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 참조 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단 (즉, N-말단 및 C-말단)에 제공된 추가 아미노산 (들)은 HER3의 아미노산 서열과 관련하여 참조 서열의 말단 위치에 해당한다. 예를 들어, 항원 결합 분자가 서열번호 23의 서열 및 서열번호 23의 C-말단에 추가의 2개의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 결합할 수 있는 경우, 추가의 2개의 아미노산은 트레오닌 및 리신일 수 있으며, 이는 서열번호 1의 위치 278 및 279에 해당한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 본 명세서에 기재된 항체 클론 10D1, 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92, 10D1_c93, 10A6, 4-35-B2 또는 4-35-B4 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 항체 클론 10D1_c89, 10D1_c90 또는 10D1_c91 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 항체 클론 10D1_c89의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
항원 결합 분자
본 발명은 HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 제공한다.
"항원-결합 분자"는 표적 항원에 결합할 수 있는 분자를 지칭하며, 관련 표적 분자(들)에 대한 결합을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다클론 항체, 단일특이적인(monospecific) 및 다중특이적인 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편(예컨대, Fv, scFv, Fab, scFab, F(ab')2, Fab2, 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), scFv-Fc, 미니보디(minibody), 단일 도메인 항체(예컨대, VhH 등)를 포함한다.
본 발명의 항원-결합 분자는 표적 항원(들)에 결합할 수 있는 모이어티(moiety)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 모이어티는 표적 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 모이어티는 표적 항원에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer), 예컨대 핵산 앱타머를 포함하거나 이로 이루어진다(예를 들면, Zhou and Rossi Nat Rev Drug Discov. 2017 16(3):181-202에서 검토됨). 일부 실시형태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 모이어티는 항원-결합 펩타이드/폴리펩타이드, 예컨대, 펩타이드 앱타머, 티오레독신, 모노보디, 안티칼린, 쿠니츠 도메인(Kunitz domain), 아비머(avimer), 노틴(knottin), 피노머(fynomer), 아트리머(atrimer), DARPin, 아피보디(affibody), 나노보디(nanobody)(즉, 단일-도메인 항체(sdAb)) 아필린, 아르마딜로 반복 단백질(ArmRP), OBody 또는 피브로넥틴을 포함하거나 이로 이루어진다(예컨대, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 Reverdatto et al., Curr Top Med Chem. 2015; 15(12): 1082-1101에서 검토됨)(참조: 또한 예컨대, Boersma et al., J Biol Chem (2011) 286:41273-85 and Emanuel et al., Mabs (2011) 3:38-48).
본 발명의 항원-결합 분자는 일반적으로 표적 항원에 특이적 결합할 수 있는 항체의 VH 및 VL을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함한다. VH 및 VL에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 또한 본 명세서에서 Fv 영역으로서 지칭될 수 있다.
항원-결합 분자는 항원-결합 폴리펩타이드, 또는 항원-결합 폴리펩타이드 복합체일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 항원-결합 분자는 항원-결합 도메인을 함께 형성하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로 회합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드(예컨대, VH 및 VL을 포함하는 scFv의 경우, 또는 VH-CH1 및 VL-CL을 포함하는 scFab의 경우)를 포함하는 보다 큰 폴리펩타이드의 부분을 형성한다.
항원-결합 분자는 하나 이상의 폴리펩타이드(예컨대, 2, 3, 4, 6, 또는 8 폴리펩타이드)의 비-공유결합성 또는 공유결합성 복합체, 예컨대, 2개의 중쇄 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 IgG-유사 항원-결합 분자를 지칭할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 분자는 HER3에 결합할 수 있는 단일클론 항체(mAb)의 서열을 사용하여 설계되고, 제조될 수 있다. 항체의 항원-결합 영역, 예를 들어, 단일 사슬 가변 단편(scFv), Fab 및 F(ab')2 단편이 또한 사용/제공될 수 있다. "항원-결합 영역"은 이에 대해 소정의 항체가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항체의 임의의 단편이다.
항체는 일반적으로 6개의 상보성-결정 영역 CDR을 포함한다; 중쇄 가변(VH) 영역내 3개: HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 경쇄 가변(VL) 영역내 3개: LC-CDR1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3. 6개의 CDR은 함께 항체의 파라토프(paratope)를 정의하며, 이는 표적 항원에 결합하는 항체의 부분이다.
VH 영역 및 VL 영역은 각각의 CDR의 어느 하나의 양상의 백본 영역(FR)을 포함하며, 이는 CDR에 대한 스캐폴드(scaffold)를 제공한다. N-말단으로부터 C-말단까지, VH 영역은 다음의 구조: N 말단-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C 말단을 포함하고; VL 영역은 다음의 구조: N 말단-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C 말단을 포함한다.
문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))에 기재된 것과 같은, 항체 CDR 및 FR, 및 문헌[Retter et al., Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suppl 1): D671-D674)에 기재된 바와 같은 항체 CDR 및 FR을 정의하는데 수개의 상이한 협약(convention)이 존재한다. 본 명세서에 기재된 항체 클론의 VH 영역 및 VL 영역의 CDR 및 FR은 국제 IMGT(ImMunoGeneTics) 정보 시스템(문헌[LeFranc et al., Nucleic Res. (2015) 43(데이타베이스 쟁점):D413-22])에 따라 정의되었으며, 이는 문헌[Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. (2003) 27:55-77]에 기재된 바와 같은 IMGT V-DOMAIN 번호매김 규칙을 사용한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 FR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 CDR 및 FR을 포함한다. 즉, 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 본 명세서에 기재된 HER3-결합 항체 클론 (즉, 항-HER3 항체 클론 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92, 10D1_c93, 10D1, 10A6, 4-35-B2 또는 4-35-B4; 예를 들어, 10D1_c89, 10D1_c90 또는 10D1_c91; 예를 들어, 10D1_c89)의 VH/VL 영역이거나, 이로부터 유래된 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (1) 내지 (10) 중 하나에 따른 VH 영역을 포함한다:
(1) 다음 CDR을 포함하는 (10D1 유래) VH 영역:
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(2) 다음 CDR을 포함하는 (10D1, 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c87, 10D1_c92, 10D1_c93) VH 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(3) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c85v1, 10D1_c85v2) VH 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(4) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c85o1) VH 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(5) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c85o2) VH 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(6) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c89, 10D1_c90) VH 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(7) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c91) VH 영역:
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(8) 다음 CDR을 포함하는 (10A6) VH 영역:
서열번호 158의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 159의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 160의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(9) 다음 CDR을 포함하는 (4-35-B2) VH 영역:
서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 129의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 130의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(10) 다음 CDR을 포함하는 (4-35-B4) VH 영역:
서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 145의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 146의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (11) 내지 (24) 중 하나에 따른 VH 영역을 포함한다:
(11) 다음 FR을 포함하는 (10D1) VH 영역:
서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(12) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c75, 10D1_c92) VH 영역:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(13) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1) VH 영역:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(14) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c78v2) VH 영역:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(15) 다음 FR을 포함하는 (10D1_11B) VH 영역:
서열번호 224의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(16) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c85v1) VH 영역:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(17) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2) VH 영역:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(18) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c87, 10D1_c93) VH 영역:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(19) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c89) VH 영역:
서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(20) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c90) VH 영역:
서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(21) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c91) VH 영역:
서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(22) 다음 FR을 포함하는 (10A6) VH 영역:
서열번호 161의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 162의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 163의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(23) 다음 FR을 포함하는 (4-35-B2) VH 영역:
서열번호 131의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 132의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 133의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 134의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(24) 다음 FR을 포함하는 (4-35-B4) VH 영역:
서열번호 147의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 148의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 149의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 상기 (1) 내지 (10)에 따른 CDR, 및 상기 (11) 내지 (24) 중 하나에 따른 FR을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (25) 내지 (41) 중 하나에 따른 VH 영역을 포함한다:
(25) (1)에 따른 CDR 및 (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20) 또는 (21)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(26) (2)에 따른 CDR 및 (11)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(27) (2)에 따른 CDR 및 (12)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(28) (2)에 따른 CDR 및 (13)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(29) (2)에 따른 CDR 및 (14)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(30) (2)에 따른 CDR 및 (15)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(31) (2)에 따른 CDR 및 (18)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(32) (3)에 따른 CDR 및 (16)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(33) (3)에 따른 CDR 및 (17)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(34) (4)에 따른 CDR 및 (17)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(35) (5)에 따른 CDR 및 (17)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(36) (6)에 따른 CDR 및 (19)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(37) (6)에 따른 CDR 및 (20)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(38) (7)에 따른 CDR 및 (21)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(39) (8)에 따른 CDR 및 (22)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(40) (9)에 따른 CDR 및 (23)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(41) (10)에 따른 CDR 및 (24)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (42) 내지 (61) 중 하나에 따른 VH 영역을 포함한다:
(42) 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(43) 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(44) 서열번호 26의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(45) 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(46) 서열번호 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(47) 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(48) 서열번호 30의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(49) 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(50) 서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(51) 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(52) 서열번호 34의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(53) 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(54) 서열번호 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(55) 서열번호 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(56) 서열번호 38의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(57) 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(58) 서열번호 40의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(59) 서열번호 127의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(60) 서열번호 143의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(61) 서열번호 157의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (62) 내지 (71) 중 하나에 따른 VL 영역을 포함한다:
(62) 다음 CDR을 포함하는 (10D1 유래) VL 영역:
서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 99의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR39;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(63) 다음 CDR을 포함하는 (10D1, 10D1_c75, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c91, 10D1_c93) VL 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(64) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c76) VL 영역:
서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(65) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c77) VL 영역:
서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(66) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2) VL 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(67) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c90) VL 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(68) 다음 CDR을 포함하는 (10D1_c92) VL 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(69) 다음 CDR을 포함하는 (10A6) VL 영역:
서열번호 165의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 166의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 167의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(70) 다음 CDR을 포함하는 (4-35-B2) VL 영역:
서열번호 136의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 137의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 138의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(71) 다음 CDR을 포함하는 (4-35-B4) VL 영역:
서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (72) 내지 (86) 중 하나에 따른 VL 영역을 포함한다:
(72) 다음 FR을 포함하는 (10D1) VL 영역:
서열번호 106의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 113의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 123의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 126의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(73) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c75) VL 영역:
서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 107의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(74) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c76) VL 영역:
서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(75) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c77) VL 영역:
서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 116의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(76) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B) VL 영역:
서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 117의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(77) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2) VL 영역:
서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 118의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(78) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c87) VL 영역:
서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 109의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 119의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(79) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c89) VL 영역:
서열번호 104의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 110의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 120의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 125의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(80) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c90) VL 영역:
서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 110의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 121의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(81) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c91) VL 영역:
서열번호 104의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 111의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 122의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 125의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(82) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c92) VL 영역:
서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 112의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(83) 다음 FR을 포함하는 (10D1_c93) VL 영역:
서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 119의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(84) 다음 FR을 포함하는 (10A6) VL 영역:
서열번호 168의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 169의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 170의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 142의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(85) 다음 FR을 포함하는 (4-35-B2) VL 영역:
서열번호 139의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 140의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 141의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 142의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(86) 다음 FR을 포함하는 (4-35-B4) VL 영역:
서열번호 154의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 155의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 156의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 142의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 상기 (62) 내지 (71) 중 하나에 따른 CDR, 및 상기 (72) 내지 (86) 중 하나에 따른 FR을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (87) 내지 (102) 중 하나에 따른 VL 영역을 포함한다:
(87) (62)에 따른 CDR 및 (72), (73), (74), (75), (76), (77), (78), (79), (80), (81), (82) 또는 (83)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(88) (63)에 따른 CDR 및 (72))에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(89) (63)에 따른 CDR 및 (73)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(90) (63)에 따른 CDR 및 (76)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(91) (63)에 따른 CDR 및 (78)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(92) (63)에 따른 CDR 및 (79)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(93) (63)에 따른 CDR 및 (81)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(94) (63)에 따른 CDR 및 (83)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(95) (64)에 따른 CDR 및 (74)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(96) (65)에 따른 CDR 및 (75)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(97) (66)에 따른 CDR 및 (77)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(98) (67)에 따른 CDR 및 (80)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(99) (68)에 따른 CDR 및 (82)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(100) (69)에 따른 CDR 및 (84)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(101) (70)에 따른 CDR 및 (85)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(102) (71)에 따른 CDR 및 (86)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (103) 내지 (119) 중 하나에 따른 VL 영역을 포함한다:
(103) 서열번호 74의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(104) 서열번호 75의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(105) 서열번호 76의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(106) 서열번호 77의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(107) 서열번호 78의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(108) 서열번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(109) 서열번호 80의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(110) 서열번호 81의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(111) 서열번호 82의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(112) 서열번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(113) 서열번호 84의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(114) 서열번호 85의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(115) 서열번호 86의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(116) 서열번호 87의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(117) 서열번호 135의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(118) 서열번호 150의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(119) 서열번호 164의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 상기 (1) 내지 (61) 중 어느 하나에 따른 VH 영역, 및 상기 (62) 내지 (119) 중 어느 하나에 따른 VL 영역을 포함한다.
하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 본 발명에 따른 실시형태에서, 치환은 예를 들면, 다음 표에 따른 보존적 치환일 수 있다. 일부 실시형태에서, 중간 컬럼내 동일한 블록 내의 아미노산은 치환된다. 일부 실시형태에서, 가장 우측 컬럼의 동일한 라인 내의 아미노산은 치환된다:
일부 실시형태에서, 치환(들)은 기능적으로 보존적일 수 있다. 즉, 일부 실시형태에서, 치환은 등가의 비치환된 분자와 비교하여 치환을 포함하는 항원-결합 분자의 하나 이상의 기능적 특성(예컨대, 표적 결합)에 영향을 미치지 않을 수 있다(또는 실질적으로 영향을 미치지 않을 수 있다).
항체의 항원-결합 영역의 VH 및 VL 영역은 함께 Fv 영역을 구성한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항원-결합 분자는 HER3에 결합하는 Fv 영역을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Fv의 VH 및 VL 영역은 링커 영역(linker region), 즉, 단일 사슬 Fv(scFv)에 의해 결합된 단일 폴리펩타이드로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 면역글로불린 중쇄 불변 서열 중 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 IgG(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예컨대, IgA1, IgA2), IgD, IgE 또는 IgM의 중쇄 불변 서열이거나, 이로부터 유도된다.
일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 G 1 불변(IGHG1; UniProt: P01857-1, v1; 서열번호 171)이다. 서열번호 171의 1번 내지 98번 위치는 CH1 영역(서열번호 172)을 형성한다. 서열번호 171의 99번 내지 110번 위치는 CH1 영역과 CH2 영역 사이에 힌지 영역(서열번호 173)을 형성한다. 서열번호 171의 111번 내지 223번 위치는 CH2 영역(서열번호 174)을 형성한다. 서열번호 171의 224번 내지 330번 위치는 CH3 영역(서열번호 175)을 형성한다.
예시된 항원-결합 분자는 pFUSE-CHIg-hG1을 사용하여 제조될 수 있으며, 이는 CH3 영역내에 치환 D356E, L358M (EU 번호매김에 따라 번호매김된 위치)을 포함한다. pFUSE-CHIg-hG1에 의해 인코딩되는 CH3 영역의 아미노산 서열은 서열번호 176에 나타낸다. CH3 영역은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 분자의 Fc 영역에 대한 변형에 따라서 추가의 치환으로 제공될 수 있음을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, CH1 영역은 서열번호 172의 서열 또는 서열번호 172의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH1-CH2 힌지 (hinge) 영역은 서열번호 173의 서열 또는 서열번호 173의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH2 영역은 서열번호 174의 서열 또는 서열번호 174의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH3 영역은 서열번호 175 또는 176의 서열 또는 서열번호 175 또는 176의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 면역글로불린 경쇄 불변 서열의 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 카파 불변(IGKC; Cκ; UniProt: P01834-1, v2; 서열번호 177)이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 람다 불변(IGLC; Cλ), 예컨대, IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 또는 IGLC7이다. 일부 실시형태에서, CL 영역은 서열번호 177의 서열, 또는 서열번호 177의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
항체의 항원-결합 영역의 VL 및 경쇄 불변(CL) 영역, 및 VH 영역 및 중쇄 불변 1(CH1) 영역은 함께 Fab 영역을 구성한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VH, CH1, VL 및 CL(예컨대, Cκ 또는 Cλ)을 포함하는 Fab 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fab 영역은 VH 및 CH1을 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, VH-CH1 융합 폴리펩타이드), 및 VL 및 CL(예컨대, VL-CL 융합 폴리펩타이드)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fab 영역은 VH 및 CL을 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, VH-CL 융합 폴리펩타이드) 및 VL 및 CH를 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, VL-CH1 융합 폴리펩타이드)를 포함하는데; 즉, 일부 실시형태에서, Fab 영역은 CrossFab 영역이다. 일부 실시형태에서, Fab 또는 CrossFab의 VH, CH1, VL 및 CL 영역은 링커 영역에 의해 결합된 단일 폴리펩타이드로서, 즉, 단일 사슬 Fab(scFab) 또는 단일 사슬 CrossFab(scCrossFab)로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 HER3에 결합하는 Fab 영역을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 HER3에 결합하는 전체 항체를 포함하거나, 이로 이루어진다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "전체 항체"는 면역글로불린(Ig)의 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭한다. 상이한 종류의 면역글로불린 및 이의 구조는 예컨대, 문헌[Schroeder and Cavacini J Allergy Clin Immunol. (2010) 125(202): S41-S52]에 기재되어 있으며, 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
G형의 면역글로불린(즉, IgG)은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 ~150 kDa 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 중쇄는 VH에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 유사하게 경쇄는 VL에 이어서 CL을 포함한다. 중쇄에 따라서, 면역글로불린은 IgG(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예컨대, IgA1, IgA2), IgD, IgE, 또는 IgM로서 분류될 수 있다. 경쇄는 카파(κ) 또는 람다(λ)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 HER3에 결합하는 IgG(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예컨대, IgA1, IgA2), IgD, IgE, 또는 IgM을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3에 대해 적어도 1가 결합이다. 결합 원자가는 소정의 항원 결정기에 대한 항원 결합 분자의 결합 부위 수를 지칭한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3에 대한 하나 초과의 결합 부위, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 결합 부위를 포함한다. 결합 부위는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 예를 들어 HER3의 경우 2가, 3가 또는 4가이다.
본 발명의 실시형태는 다중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이다. "다중특이적"이라는 것은, 항원-결합 분자가 하나 이상의 표적에 대한 특이적인 결합을 나타냄을 의미한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 이중특이적 항원-결합 분자이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 적어도 2개의 상이한 항원-결합 도메인(즉, 예컨대, 동일하지 않은 VH 및 VL을 포함하는 적어도 2개의 항원-결합 도메인)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 HER3 및 또 다른 표적 (예를 들어, HER3 이외의 항원)에 결합하므로, 적어도 이중특이적이다. 용어 "이중특이적"은 항원-결합 분자가 적어도 2개의 명확한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 항원-결합 분자(예컨대, 다중특이적 항원-결합 분자)는 이에 대해 항원-결합 분자가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, HER3 및 HER3 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자는: (i) HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 분자, 및 (ii) HER3 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명에 따른 항원-결합 분자(예컨대, 다중특이적 항원-결합 분자)는 이에 대해 항원-결합 분자가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항원-결합 폴리펩타이드 또는 항원-결합 폴리펩타이드 복합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자는 예를 들어, (i) 경쇄 폴리펩타이드 (구조 VL-CL 포함) 및 중쇄 폴리펩타이드 (구조 VH-CH1-CH2-CH3 포함)를 포함하는 HER3에 결합할 수 있는 항원 결합 폴리펩타이드 복합체, 및 (ii) 경쇄 폴리펩타이드 (구조 VL-CL 포함) 및 중쇄 폴리펩타이드 (구조 VH-CH1-CH2-CH3 포함)를 포함하는 HER3 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 폴리펩타이드 복합체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 보다 큰 항원-결합 분자(예컨대, 다중특이적 항원-결합 분자)의 구성성분 항원-결합 분자는 보다 큰 항원-결합 분자의 "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 영역"으로 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 분자, 및 HER3 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, HER3 이외의 항원은 면역 세포 표면 분자이다. 일부 실시형태에서, HER3 이외의 항원은 암 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, HER3 이외의 항원은 수용체 분자, 예컨대, 세포 표면 수용체이다. 일부 실시형태에서, HER3 이외의 항원은 세포 신호전달 분자, 예컨대, 사이토킨, 케모킨, 인터페론, 인터루킨 또는 림포킨이다. 일부 실시형태에서, HER3 이외의 항원은 성장 인자 또는 호르몬이다.
암 세포 항원은 암 세포에 의해 발현되거나 과-발현된 항원이다. 암 세포 항원은 임의의 펩타이드/폴리펩타이드, 당단백질, 지단백질, 글리칸, 당지질, 지질, 또는 이의 단편일 수 있다. 암 세포 항원의 발현은 암과 관련될 수 있다. 암 세포 항원은 암 세포에 의해 비정상적으로 발현될 수 있거나(예컨대, 암 세포 항원은 비정상적인 국재화로 발현될 수 있다), 암 세포에 의해 비정상적인 구조로 발현될 수 있다. 암 세포 항원은 면역 반응을 유발할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 암 세포의 세포 표면에서 발현된다(즉, 암 세포 항원은 암 세포 표면 항원이다). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자에 의해 결합되는 항원의 부분이 암 세포의 외부 표면(즉, 세포외) 상에 나타난다. 암 세포 항원은 암-관련된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 세포 항원은 이의 발현이 암의 증상의 발달, 진행 또는 중증도와 관련된 항원이다. 암-관련된 항원은 암의 원인 또는 병리학과 관련될 수 있거나, 암의 결과로서 비정상적으로 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 세포 항원은 이의 발현이 예컨대, 비교가능한 비-암성 세포(예컨대, 동일한 조직/세포형으로부터 유래된 비-암성 세포)에 의한 이의 발현 수준과 비교하여, 암의 세포에 의해 상향조절된(예컨대, RNA 및/또는 단백질 수준에서) 항원이다. 일부 실시형태에서, 암-관련된 항원은 암성 세포에 의해 우선적으로 발현될 수 있고, 비교가능한 비-암성 세포(예컨대, 동일한 조직/세포형으로부터 유래된 비-암성 세포)에 의해 발현되지 않는다. 일부 실시형태에서, 암-관련된 항원은 돌연변이된 종양유전자 또는 돌연변이된 종양 억제인자 유전자의 생성물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암-관련된 항원은 과발현된 세포 단백질의 생성물, 종양유전자성 바이러스에 의해 생성된 암 항원, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), 또는 세포 표면 당지질 또는 당단백질일 수 있다.
일부 실시형태에서, HER3 이외의 항원은 HER3 관련 암 세포에 의해 발현되는 항원이다. HER3 관련 암은 HER3을 발현하는 암 (예를 들어, 세포 표면에서 HER3 단백질을 발현함)일 수 있고; 이러한 암은 "HER3-양성" 암으로 지칭될 수 있다. HER3 관련 암에는 HER3 유전자/단백질 발현이 암 증상의 발병, 발달, 진행 또는 중증도, 및/또는 전이에 대한 위험 인자이고/거나 이와 양성적으로 관련된 암이 포함된다. HER3 관련 암에는 문헌[Zhang et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica (2016) 48(1):39-48 및 Sithanandam 및 Anderson Cancer Gene Ther (2008) 15(7):413-448]에 기재된 암이 포함되며, 상기 문헌 둘 모두는 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서 HER3 관련 암은 폐암 (예를 들어, NSCLC), 흑색종, 유방암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 위암, 결장암 또는 구강암일 수 있다.
면역 세포 표면 분자는 면역 세포의 세포 표면에서 또는 위에 발현된 임의의 펩타이드/폴리펩타이드, 당단백질, 지단백질, 글리칸, 당지질, 지질, 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자에 의해 결합된 면역 세포 표면 분자의 부분은 면역 세포의 외부 표면 상에 있다(즉, 세포외이다). 면역 세포 표면 분자는 임의의 면역 세포의 세포 표면에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 조혈 기원의 세포, 예컨대, 호중구, 호산구, 호염기구, 수지 세포, 림프구, 또는 단핵구일 수 있다. 림프구는 예컨대, T 세포, B 세포, 천연 킬러(NK) 세포, NKT 세포 또는 선천성 림프구 세포(ILC), 또는 이의 전구체(예컨대, 흉선 세포 또는 프레(pre)-B 세포)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 표면 분자는 공자극 분자 (예를 들어, CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 또는 CD27) 또는 이들의 리간드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 표면 분자는 체크포인트 분자 (예를 들어, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, VISTA, TIGIT 또는 BTLA) 또는 이들의 리간드일 수 있다.
본 발명에 따른 다중특이적 항원-결합 분자는 문헌[Brinkmann and Kontermann MAbs (2017) 9(2): 182-212], 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다)에 기재된 양식과 같은, 임의의 적합한 양식으로 제공될 수 있다. 적합한 양식은 문헌[Brinkmann and Kontermann MAbs (2017) 9(2): 182-212]의 도 2에 나타낸 것: 항체 접합체(conjugate), 예컨대, IgG2, F(ab')2 또는 CovX-보디(Body); IgG 또는 IgG-유사 분자, 예컨대, IgG, 키메라 IgG, κλ-보디 일반적인 HC; CH1/CL 융합 단백질, 예컨대, scFv2-CH1/CL, VHH2-CH1/CL; '가변 도메인 단독" 이중특이적인 항원-결합 분자, 예컨대, 탄뎀(tandem) scFv(taFV), 트리플보디(triplebody), 디아보디(diabody: Db), dsDb, Db(kih), DART, scDB, dsFv-dsFv, tandAbs, 삼중 헤드(triple head), 탄뎀 dAb/VHH, 4가(tertravalent) dAb.VHH; 비-Ig 융합 단백질, 예컨대, scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-알부민, taFv-독소, 미니항체, DNL-Fab2, DNL-Fab2-scFv, DNL-Fab2-IgG-사이토킨2, ImmTAC(TCR-scFv); 변형된 Fc 및 CH3 융합 단백질, 예컨대, scFv-Fc(kih), scFv-Fc(CH3 전하 쌍), scFv-Fc(EW-RVT), scFv-fc(HA-TF), scFv-Fc(SEED보디), taFv-Fc(kih), scFv-Fc(kih)-Fv, Fab-Fc(kih)-scFv, Fab-scFv-Fc(kih), Fab-scFv-Fc(BEAT), Fab-scFv-Fc (SEED보디), DART-Fc, scFv-CH3(kih), TriFab; Fc 융합체, 예컨대, 디-디아보디(Di-diabody), scDb-Fc, taFv-Fc, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, Fab-scFv-Fc, scFv4-Ig, scFv2-Fcab; CH3 융합체, 예컨대, 디아-디아보디(Dia-diabody), scDb-CH3; IgE/IgM CH2 융합체, 예컨대, scFv-EHD2-scFv, scFvMHD2-scFv; Fab 융합 단백질, 예컨대, Fab-scFv(비보디(bibody)), Fab-scFv2(트리보디), Fab-Fv, Fab-dsFv, Fab-VHH, 직교(orthogonal) Fab-Fab; 비-Ig 융합 단백질, 예컨대, DNL-Fab3, DNL-Fab2-scFv, DNL-Fab2-IgG-사이토킨2; 비대칭 IgG 또는 IgG-유사 분자, 예컨대, IgG(kih), IgG(kih) 일반적인 LC, ZW1 IgG 일반적인 LC, 비클로닉스(Biclonics) 일반적인 LC, CrossMab, CrossMab(kih), scFab-IgG(kih), Fab-scFab-IgG(kih), 직교의 Fab IgG(kih), DuetMab, CH3 전하 쌍+CH1/CL 전하 쌍, 힌지/CH3 전하 쌍, SEED-보디, 두오보디(Duobody), 포-인-원(four-in-one)-CrossMab(kih), LUZ-Y 일반적인 LC; LUZ-Y scFab-IgG, FcFc*; 첨부되고(appended) Fc-변형된 IgG, 예컨대, IgG(kih)-Fv, IgG HA-TF-Fv, IgG(kih)scFab, scFab-Fc(kih)-scFv2, scFab-Fc(kih)-scFv, 하프(half) DVD-Ig, DVI-Ig(포-인-원), CrossMab-Fab; 변형된 Fc 및 CH3 융합 단백질, 예컨대, Fab-Fc(kih)-scFv, Fab-scFv-Fc(kih), Fab-scFv-Fc(BEAT), Fab-scFv-Fc-SEED보디, TriFab; 첨부된 IgG-HC 융합체, 예컨대, IgG-HC, scFv, IgG-dAb, IgG-taFV, IgG-CrossFab, IgG-직교의 Fab, IgG-(CαCβ) Fab, scFv-HC-IgG, 탐뎀 Fab-IgG(직교의 Fab) Fab-IgG(CαCβ Fab), Fab-IgG(CR3), Fab-힌지-IgG(CR3); 첨부된 IgG-LC 융합체, 예컨대, IgG-scFv(LC), scFv(LC)-IgG, dAb-IgG; 첨부된 IgG-HC 및 LC 융합체, 예컨대, DVD-Ig, TVD-Ig, CODV-Ig, scFv4-IgG, 지보디(Zybody); Fc 융합체, 예컨대, Fab-scFv-Fc, scFv4-Ig; F(ab')2 융합체, 예컨대, F(ab')2-scFv2; CH1/CL 융합 단백질, 예컨대, scFv2-CH1-힌지/CL; 변형된 IgG, 예컨대, DAF(투-인-원(two-in one)-IgG), DutaMab, Mab2; 및 비-Ig 융합체, 예컨대, DNL-Fab4-IgG을 포함한다.
당업자는 이중특이적인 항원-결합 분자를 설계하여 제조할 수 있다. 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하는 방법은 항원-결합 분자 또는 항체 단편을, 예를 들면, 문헌[Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antigen-binding molecules. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16], 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 환원성 이황화물 또는 비-환원성 티오에테르 결합과 화학적으로 가교결합시킴을 포함한다. 예를 들면, N-석신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)를 사용하여, 예컨대, 힌지 영역 SH-그룹을 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교결합시켜 이황화물-연결된 이중특이적 F(ab)2 이종이량체를 생성할 수 있다.
이중특이적 항원-결합 분자를 생성하는 다른 방법은 항체-생성 하이브리도마를 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시켜 예를 들면, 문헌[D. M. and Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antigen-binding molecules. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16]에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 사량체 세포(quadroma 세포)를 생성함을 포함한다.
본 발명에 따른 이중특이적 항원-결합 분자는 또한 예를 들면, 문헌[Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), at Chapter 40: Production of Bispecific Antigen-binding molecules: Diabodies and Tandem scFv(Hornig and Farber-Schwarz), or French, How to make bispecific antigen-binding molecules, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339], 이들 둘 다의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 항원-결합 분자에 대한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물(construct)로부터의 발현에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 2개의 항원-결합 단편에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인(즉, HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 단편에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원-결합 단편에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 인코딩하고, 항원-결합 단편 사이에 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기술에 의해 제조할 수 있다. 재조합 이중특이적인 항체는 이후 적합한 숙주 세포(예컨대, 포유류 숙주 세포) 내에서 작제물의 발현(예컨대, 시험관내)에 의해 생성될 수 있으며, 발현된 재조합 이중특이적인 항체는 이후 선택적으로 정제될 수 있다.
Fc 영역
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 Fc 영역을 포함한다.
IgG IgA 및 IgD 이소형에서, Fc 영역은 하나의 폴리펩타이드로부터의 CH2 및 CH3 영역, 및 다른 폴리펩타이드로부터의 CH2 및 CH3 영역으로 구성된다. 2개의 폴리펩타이드로부터의 CH2 및 CH3 영역은 함께 Fc 영역을 형성한다. IgM 및 IgE 이소형에서, Fc 영역은 3개의 불변 도메인 (CH2, CH3 및 CH4)을 포함하고, 2개의 폴리펩타이드로부터의 CH2 내지 CH4는 함께 Fc 영역을 형성한다.
본 개시내용의 다양한 양상에 따른 바람직한 실시형태에서, Fc 영역은 2개의 폴리펩타이드를 포함하며, 각 폴리펩타이드는 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 Fc 영역의 회합을 촉진하는 CH2 및 CH3 영역 중 하나 이상에서의 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 항원-결합 분자의 구성성분 폴리펩타이드의 재조합 공-발현 및 후속적인 회합은 수개의 가능한 조합으로 이끈다. 재조합체 생성시 항원-결합 분자내 폴리펩타이드의 목적한 조합의 수율을 개선시키기 위해, 중쇄 폴리펩타이드의 목적한 조합의 회합을 촉진시키는 변형(들)을 Fc 영역 내에 도입하는 것이 유리하다. 변형은 예컨대, 상이한 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 영역 사이에 소수성 및/또는 정전기적 상호작용을 촉진할 수 있다. 적합한 변형은 예컨대, 문헌[Ha et al., Front. Immnol (2016) 7:394]에 기재되어 있으며, 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 항원-결합 분자는 문헌[Ha et al., Front. Immnol (2016) 7:394: KiH, KiHs-s, HA-TF, ZW1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTs-s, SEED 또는 A107]의 표 1에 나타낸 바와 같이, 다음의 양식 중 하나에 따라 Fc 영역의 CH3 영역내 쌍을 이룬 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 예컨대, 문헌[US 7,695,936 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재된 바와 같은, "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 또는 "KiH" 변형을 포함한다. 이러한 실시형태에서, Fc 영역의 CH3 영역 중 하나는 "놉" 변형을 포함하고, 다른 CH3 영역은 "홀" 변형을 포함한다. "놉" 및 "홀" 변형은 각각의 CH3 영역 내에 위치함으로써 "놉"은 "홀" 내에 위치하여 폴리펩타이드의 이종이량체화를 촉진(및 이종이랑체화를 억제)하고/하거나 이종이량체를 안정화시킨다. 놉은 작은 측쇄를 갖는 아미노산을 보다 큰 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 타이로신 또는 트립토판)으로 치환시킴으로써 작제된다. 홀은 큰 측쇄를 갖는 아미노산을 보다 작은 측쇄를 갖는 것(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환시킴으로써 생성된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자의 Fc 영역의 CH3 영역 중 하나는 치환(본 명세서의 Fc, CH2 및 CH3 영역내 위치/치환의 번호매김은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 번호매김 시스템에 따른다) T366W를 포함하며, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Y407V를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자의 Fc 영역의 CH3 영역 중 하나는 치환 T366W를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 T366S 및 L368A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자의 Fc 영역의 CH3 영역 중 하나는 치환 T366W를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Y407V, T366S 및 L368A를 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 예컨대, 제WO 2014/131694 A1호에 기재된 바와 같은 "DD-KK" 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 E356K 및 D399K를 포함한다. 변형은 CH3 영역 사이에 정전기적 상호작용을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 "두오보디" 양식으로 지칭된, 문헌[Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2013) 110(13):5145-50]에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K409R을 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 K405L을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 문헌[Strop et al., J Mol Biol. (2012) 420(3):204-19]에 기재된 바와 같은 "EEE-RRR" 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 D221E, P228E 및 L368E를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 D221R, P228R 및 K409R을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 문헌[Choi et al., Mol Cancer Ther (2013) 12(12):2748-59]에 기재된 "EW-RVT"를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K360E 및 K409W를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Q347R, D399V 및 F405T를 포함한다.
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 S354C를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Y349C를 포함한다. 이러한 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개의 CH3 영역 사이에 이황화물 브릿지(disulphide bridge)의 형성을 야기함으로써 이종이량체를 추가로 안정화시킨다(Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15).
일부 실시형태에서, Fc 영역은 "KiHS-S" 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 T366W 및 S354C를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 문헌[Davis et al., Protein Eng Des Sel (2010) 23(4):195-202]에 기재된 바와 같은 "SEED" 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 인간 IgG1 CH3 및 IgA CH3의 β-가닥 절편(β-strand segment)은 교환된다.
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 S364H 및 F405A를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Y349T 및 T394F를 포함한다(참조: 예컨대, Moore et al., MAbs (2011) 3(6):546-57).
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 T350V, T366L, K392L 및 T394W를 포함한다(참조: 예컨대, Von Kreudenstein et al., MAbs (2013) 5(5):646-54).
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K360D, D399M 및 Y407A를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 E345R, Q347R, T366V 및 K409V를 포함한다(참조: 예컨대, Leaver-Fay et al., Structure (2016) 24(4):641-51).
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K370E 및 K409W를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 E357N, D399V 및 F405T를 포함한다(참조: 예컨대, Choi et al., PLoS One (2015) 10(12):e0145349).
Fc-매개 기능은 Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포-매개 식세포작용 (ADCP), 보체-의존적 세포독성 (CDC), 막 공격 복합체 (MAC)의 형성, 세포 탈과립화, 사이토카인 및/또는 케모카인 생성, 및 항원 처리 및 제시를 포함한다.
Fc-매개 기능에 영향을 미치는 항체 Fc 영역에 대한 변형은 예를 들어 문헌[Wang et al., Protein Cell (2018) 9(1):63-73]에 기재된 것과 같이 당 업계에 공지되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 특히, 항체 효과기 기능에 영향을 미치는 것으로 공지된 예시적인 Fc 영역 변형은 문헌[Wang et al., Protein Cell (2018) 9(1):63-73]의 표 1에 요약되어 있다.
치환 F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L의 조합은 문헌[Stavenhagen et al. Cancer Res. (2007)]에 FcγRIIIa에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 ADCC를 향상시키는 것으로 기재되어 있다. 치환 S239D/I332E 또는 S239D/I332E/A330L의 조합은 문헌[Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA. (2006)103:4005-4010]에 FcγRIIIa에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 ADCC를 증가시키는 것으로 기재되어 있다. 치환 S239D/I332E/A330L의 조합은 또한 FcγRIIb에 대한 결합을 감소시키고, 따라서 ADCC를 증가시키는 것으로 기재되어 있다. 치환 S298A/E333A/K334A의 조합은 문헌[Shields et al., J Biol Chem. (2001) 276:6591-6604]에 FcγRIIIa에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 ADCC를 증가시키는 것으로 기재되어 있다. 하나의 중쇄의 치환 L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A의 조합 및 다른 중쇄의 치환 D270E/K326D/A330M/K334E의 조합은 문헌[Mimoto et al., MAbs. (2013): 5:229-236]에 FcγRIIIa에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 ADCC를 증가시키는 것으로 기재되어 있다. 치환 G236A/S239D/I332E의 조합은 문헌[Richards et al., Mol Cancer Ther. (2008) 7:2517-2527]에 FcγRIIa에 대한 결합을 증가시키고, FcγRIIIa에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 ADCP를 증가시키는 것으로 기재되어 있다.
치환 K326W/E333S의 조합은 문헌[Idusogie et al. J Immunol. (2001) 166(4):2571-5]에 C1q에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 CDC를 증가시키는 것으로 기재되어 있다. 치환 S267E/H268F/S324T의 조합은 문헌[Moore et al. MAbs. (2010) 2(2):181-9]에 C1q에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 CDC를 증가시키는 것으로 기재되어 있다. 문헌[Natsume et al., Cancer Res. (2008) 68(10):3863-72]에 기재된 치환의 조합은 C1q에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 CDC를 증가시키는 것으로 보고되었다. 치환 E345R/E430G/S440Y의 조합은 문헌[Diebolder et al. Science (2014) 343(6176):1260-3]에 6량체화를 증가시키고, 따라서 CDC를 증가시키는 것으로 기재되어 있다.
치환 M252Y/S254T/T256E의 조합은 문헌[Dall'Acqua et al. J Immunol. (2002) 169:5171-5180]에 pH 6.0에서 FcRn에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 항원 결합 분자 반감기를 증가시키는 것으로 기재되어 있다. 치환 M428L/N434S의 조합은 문헌[Zalevsky et al. Nat Biotechnol. (2010) 28:157-159]에 pH 6.0에서 FcRn에 대한 결합을 증가시키고, 따라서 항원 결합 분자 반감기를 증가시키는 것으로 기재되어 있다.
중쇄 불변 영역/Fc 영역/CH2-CH3 영역/CH2 영역/CH3 영역이 참조 위치(들)/치환(들)에 "해당하는" 위치(들)/치환(들)을 포함하는 것으로 본 명세서에 기재된 경우, 상동성 중쇄 불변 영역/Fc 영역/CH2-CH3 영역/CH2 영역/CH3 영역의 균등한 위치(들)/치환(들)이 고려된다.
Fc 영역은 특이적 위치(들)/치환(들)을 포함하는 것으로 기재된 경우, 위치(들)/치환(들)은 함께 Fc 영역을 형성하는 폴리펩타이드 사슬 중 하나 또는 둘 모두에 존재할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서의 위치는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 인간 면역글로불린 불변 영역 아미노산 서열의 위치를 지칭한다. 예로서, 인간 IgG1의 치환 L242C 및 K334C는 서열번호 171에 따라 넘버링된 인간 IgG1 불변 영역의 위치 125의 L>C 치환, 및 위치 217의 K>C 치환에 해당한다.
상동성 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역 (즉, 서열번호 171에 제시된 아미노산 서열)에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역이다. 상동성 Fc 영역은 인간 IgG1의 CH2-CH3 영역 (즉, 서열번호 174 및 175에 제시된 아미노산 서열)에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로 구성된 Fc 영역이다. 상동성 CH2 영역은 인간 IgG1의 CH2 영역 (즉, 서열번호 174에 제시된 아미노산 서열)에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CH2 영역이다. 상동성 CH3 영역은 인간 IgG1의 CH3 영역 (즉, 서열번호 175에 제시된 아미노산 서열)에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CH3 영역이다.
인간 IgG1에서 확인된 위치에 해당하는 위치는 예를 들어 ClustalOmega (문헌[Soding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960])와 같은 서열 정렬 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있는 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 Fc 매개 기능을 증가시키는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 Fc 영역은 ADCC를 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서 Fc 영역은 ADCP를 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서 Fc 영역은 CDC를 증가시키는 변형을 포함한다. Fc 매개 기능 (예를 들어, ADCC, ADCP, CDC)을 증가시키는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 해당하는 비변형 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자와 비교하여 관련 효과기 기능의 증가된 수준을 유도한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 하나 이상의 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRIIa, FcγRIIIa)에 대한 친화도를 증가시키는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. Fc 수용체에 대한 친화도를 증가시키는 변형은 Fc-매개 효과기 기능 예컨대, 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC) 및/또는 항체-의존적 세포 식세포작용 (ADCP)을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 C1q에 대한 친화도를 감소시키는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함하며; 이러한 변형은 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 감소시키는데 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 6량체 형성을 증가시키는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 친화도를 증가시키고, C1q에 대한 친화도를 감소시키고/거나, 6량체 형성을 증가시킬 수 있는 Fc 영역에 대한 변형이 예를 들어 문헌[Saxena and Wu Front Immunol. (2016) 7:580]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 문헌[Saxena and Wu Front Immunol. (2016) 7:580]의 표 1에 나타낸 하나 이상의 치환을 포함하는 CH2/CH3을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 Fc 수용체와의 결합을 증가시키는 변형을 포함하는 Fc를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 Fcγ 수용체와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb 중 하나 이상과의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIIa와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIa와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIb와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcRn과의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 보체 단백질과의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 C1q와의 결합을 증가시키거나 감소시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 항원 결합 분자의 6량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 항원 결합 분자 반감기를 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 공동 결합을 증가시키는 변형을 포함한다.
본 명세서에서 "Fcγ 수용체"는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으며, 임의의 종으로부터의 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다. 유사하게, "FcγRI", "FcγRIIa", "FcγRIIb", "FcγRIIc", "FcγRIIIa" 및 "FcγRIIIb"는 각각 임의의 종으로부터의 FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb를 지칭하며, 임의의 종으로부터의 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다. 인간은 6 가지 상이한 부류의 Fc γ 수용체 (마우스 오르소로그는 괄호 안에 제시됨): FcγRI (mFcγRI), FcγRIIa (mFcγRIII), FcγRIIb (mFcγRIIb), FcγRIIc, FcγRIIIa (mFcγRIV) 및 FcγRIIIb를 갖는다. 이체 Fc γ 수용체는 예를 들어 인간 FcγRIIIa의 158V 및 158F 다형체 및 인간 FcγRIIa의 167H 및 167R 다형체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 다음 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)을 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 CH2-CH3 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다: 위치 242에 해당하는 위치의 C; 위치 334에 해당하는 위치의 C; 위치 236에 해당하는 위치의 A; 위치 239에 해당하는 위치의 D; 위치 332에 해당하는 위치의 E; 위치 330에 해당하는 위치의 L; 위치 345에 해당하는 위치의 K; 및 위치 430에 해당하는 위치의 G.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 다음 치환 (또는 해당 치환) 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)을 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 CH2-CH3 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다: L242C, K334C, G236A, S239D, I332E, A330L, E345K, 및 E430G.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 위치 242에 해당하는 위치의 C를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 위치 334에 해당하는 위치의 C를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함). 일부 실시형태에서, Fc 영역은 위치 242에 해당하는 위치의 C 및 위치 334에 해당하는 위치의 C를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 위치 236에 해당하는 위치의 A를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 위치 239에 해당하는 위치의 D를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함). 일부 실시형태에서, Fc 영역은 위치 236에 해당하는 위치의 A, 및 위치 239에 해당하는 위치의 D를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 위치 332에 해당하는 위치의 E를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 위치 236에 해당하는 위치의 A, 위치 239에 해당하는 위치의 D, 및 위치 332에 해당하는 위치의 E를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 위치 330에 해당하는 위치의 L을 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 위치 236에 해당하는 위치의 A, 위치 239에 해당하는 위치의 D, 위치 332에 해당하는 위치의 E, 및 위치 330에 해당하는 위치의 L을 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 위치 345에 해당하는 위치의 K를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 위치 430에 해당하는 위치의 G를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함). 일부 실시형태에서, Fc 영역은 위치 345에 해당하는 위치의 K, 및 위치 430에 해당하는 위치의 G를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 위치 242에 해당하는 위치의 C, 위치 334에 해당하는 위치의 C, 위치 236에 해당하는 위치의 A, 및 위치 239에 해당하는 위치의 D를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 위치 242에 해당하는 위치의 C, 위치 334에 해당하는 위치의 C, 위치 236에 해당하는 위치의 A, 위치 239에 해당하는 위치의 D, 및 위치 332에 해당하는 위치의 E를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 위치 242에 해당하는 위치의 C, 위치 334에 해당하는 위치의 C, 위치 236에 해당하는 위치의 A, 위치 239에 해당하는 위치의 D, 위치 332에 해당하는 위치의 E, 및 위치 330에 해당하는 위치의 L을 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 위치 242에 해당하는 위치의 C, 위치 334에 해당하는 위치의 C, 위치 345에 해당하는 위치의 K, 및 위치 430에 해당하는 위치의 G를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 CH2-CH3 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 치환 L242C (또는 균등물 치환)를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 K334C (또는 균등물 치환)를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함). 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 L242C (또는 균등물 치환) 및 치환 K334C (또는 균등물 치환)를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 치환 G236A (또는 균등물 치환)를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 S239D (또는 균등물 치환)를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함). 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 G236A (또는 균등물 치환), 및 치환 S239D (또는 균등물 치환)를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 치환 I332E (또는 균등물 치환)를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 G236A (또는 균등물 치환), 치환 S239D (또는 균등물 치환), 및 치환 I332E (또는 균등물 치환)를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 치환 A330L (또는 균등물 치환)을 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 G236A (또는 균등물 치환), 치환 S239D (또는 균등물 치환), 치환 I332E (또는 균등물 치환), 및 치환 A330L (또는 균등물 치환)을 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 치환 E345K (또는 균등물 치환)를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 E430G (또는 균등물 치환)를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함). 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 E345K (또는 균등물 치환), 및 치환 E430G (또는 균등물 치환)를 포함한다 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함함).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 치환 L242C (또는 균등물 치환), 치환 K334C (또는 균등물 치환), 치환 G236A (또는 균등물 치환), 및 치환 S239D (또는 균등물 치환)를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 치환 L242C (또는 균등물 치환), 치환 K334C (또는 균등물 치환), 치환 G236A (또는 균등물 치환), 치환 S239D (또는 균등물 치환), 및 치환 I332E (또는 균등물 치환)를 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 치환 L242C (또는 균등물 치환), 치환 K334C (또는 균등물 치환), 치환 G236A (또는 균등물 치환), 치환 S239D (또는 균등물 치환), 치환 I332E (또는 균등물 치환), 및 치환 A330L (또는 균등물 치환)을 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역, CH2-CH3 영역 또는 CH2 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 치환 L242C (또는 균등물 치환), 치환 K334C (또는 균등물 치환), 치환 E345K (또는 균등물 치환), 및 치환 E430G (또는 균등물 치환)을 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 CH2-CH3 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)을 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 CH2-CH3 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다: 위치 243에 해당하는 위치의 L, 위치 292에 해당하는 위치의 P, 위치 300에 해당하는 위치의 L, 위치 305에 해당하는 위치의 I 및 위치 396에 해당하는 위치의 L; 위치 239에 해당하는 위치의 D 및 위치 332에 해당하는 위치의 E; 위치 239에 해당하는 위치의 D, 위치 332에 해당하는 위치의 E 및 위치 330에 해당하는 위치의 L; 위치 298에 해당하는 위치의 A, 위치 333에 해당하는 위치의 A 및 위치 334에 해당하는 위치의 A; 위치 234에 해당하는 위치의 Y, 위치 235에 해당하는 위치의 Q, 위치 236에 해당하는 위치의 W, 위치 239에 해당하는 위치의 M, 위치 268에 해당하는 위치의 D, 위치 270에 해당하는 위치의 E 및 위치 298에 해당하는 위치의 A; 위치 270에 해당하는 위치의 E, 위치 326에 해당하는 위치의 D, 위치 330에 해당하는 위치의 M 및 위치 334에 해당하는 위치의 E; 위치 236에 해당하는 위치의 A, 위치 239에 해당하는 위치의 D 및 위치 332에 해당하는 위치의 E; 위치 326에 해당하는 위치의 W 및 위치 333에 해당하는 위치의 S; 위치 267에 해당하는 위치의 E, 위치 268에 해당하는 위치의 F 및 위치 324에 해당하는 위치의 T; 위치 345에 해당하는 위치의 R, 위치 430에 해당하는 위치의 G 및 위치 440에 해당하는 위치의 Y; 위치 252에 해당하는 위치의 Y, 위치 254에 해당하는 위치의 T 및 위치 256에 해당하는 위치의 E; 및 위치 428에 해당하는 위치의 L 및 위치 434에 해당하는 위치의 S.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음 치환의 조합 (또는 해당 치환) 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)을 포함하는 (예를 들어, 이를 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 CH2-CH3 영역을 포함하는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는) Fc 영역을 포함한다: F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L; S239D/I332E; S239D/I332E/A330L; S298A/E333A/K334A; L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A; D270E/K326D/A330M/K334E; G236A/S239D/I332E; K326W/E333S; S267E/H268F/S324T; E345R/E430G/S440Y; M252Y/S254T/T256E; 및 M428L/N434S.
폴리펩타이드
본 발명은 또한 항원-결합 분자의 폴리펩타이드 구성성분을 제공한다. 폴리펩타이드는 단리되거나 실질적으로 정제된 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 항원-결합 분자는 폴리펩타이드의 복합체일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드가 하나 이상의 도메인 또는 영역을 포함하는 본 명세서에서, 다수의 도메인/영역은 바람직하게는 동일한 폴리펩타이드 사슬내에 존재 하는 것으로 인식될 것이다. 즉, 폴리펩타이드는 하나 이상의 도메인을 포함하거나 영역은 도메인/영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 VH를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 VL을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 중쇄 불변 영역(CH)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 면역글로불린(Ig)의 CH1, CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄 불변 서열 중 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH1 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH1-CH2 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH2 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH3 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH2-CH3 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 치환/아미노산 치환의 조합 중 어느 하나를 포함하는 CH3 영역을 포함한다(예컨대, 상기 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Ha et al., Front. Immnol (2016) 7:394]의 표 1에 나타남): T366W; T366S, L368A 및 Y407V; T366W 및 S354C; T366S, L368A, Y407V 및 Y349C; S364H 및 F405A; Y349T 및 T394F; T350V, L351Y, F405A and Y407V; T350V, T366L, K392L 및 T394W; K360D, D399M 및 Y407A; E345R, Q347R, T366V 및 K409V; K409D 및 K392D; D399K 및 E356K; K360E 및 K409W; Q347R, D399V 및 F405T; K360E, K409W 및 Y349C; Q347R, D399V, F405T 및 S354C; K370E 및 K409W; 및 E357N, D399V 및 F405T.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드의 CH2 및/또는 CH3 영역은 폴리펩타이드와 CH2 및/또는 CH3 영역을 포함하는 다른 폴리펩타이드의 회합을 촉진시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 면역글로불린 경쇄 불변 서열 중 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 다음 중 하나에 따른 N-말단으로부터 C-말단까지의 구조를 포함한다:
(i) VH
(ii) VL
(iii) VH-CH1
(iv) VL-CL
(v) VL-CH1
(vi) VH-CL
(vii) VH-CH1-CH2-CH3
(viii) VL-CL-CH2-CH3
(ix) VL-CH1-CH2-CH3
(x) VH-CL-CH2-CH3
또한, 본 발명의 폴리펩타이드로 구성된 항원-결합 분자가 본 발명에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 폴리펩타이드의 다음의 조합 중 하나를 포함한다:
(A) VH+VL
(B) VH-CH1+VL-CL
(C) VL-CH1+VH-CL
(D) VH-CH1-CH2-CH3+ VL-CL
(E) VH-CL-CH2-CH3+ VL-CH1
(F) VL-CH1-CH2-CH3+ VH-CL
(G) VL-CL-CH2-CH3+ VH-CH1
(H) VH-CH1-CH2-CH3+ VL-CL-CH2-CH3
(I) VH-CL-CH2-CH3+ VL-CH1-CH2-CH3
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 상기 (A) 내지 (I)에 나타낸 조합의 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함한다. 예로써, 상기 (D)를 참조로, 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 구조 VH-CH1-CH2-CH3를 포함하는 2개의 폴리펩타이드, 및 구조 VL-CL를 포함하는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 다음의 폴리펩타이드의 조합 중 하나를 포함한다:
(J) VH (항-HER3)+VL (항-HER3)
(K) VH (항-HER3)-CH1+VL (항-HER3)-CL
(L) VL (항-HER3)-CH1+VH (항-HER3)-CL
(M) VH (항-HER3)-CH1-CH2-CH3+ VL (항-HER3)-CL
(N) VH (항-HER3)-CL-CH2-CH3+ VL (항-HER3)-CH1
(O) VL (항-HER3)-CH1-CH2-CH3+ VH (항-HER3)-CL
(P) VL (항-HER3)-CL-CH2-CH3+ VH (항-HER3)-CH1
(Q) VH (항-HER3)-CH1-CH2-CH3+ VL (항-HER3)-CL-CH2-CH3
(R) VH (항-HER3)-CL-CH2-CH3+ VL (항-HER3)-CH1-CH2-CH3
여기서: "VH(항-HER3)"는 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예컨대, 상기 (1) 내지 (61) 중 하나에 정의된 바와 같은 HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 VH를 지칭하며; "VL(항-HER3)"은 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예컨대, 상기 (62) 내지 (119) 중 하나에 정의된 바와 같은 HER3에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 VL을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 187 내지 223 중 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
링커 및 추가의 서열
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 CH1 영역과 CH2 영역 사이에 제공된다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 CL 영역과 CH2 영역 사이에 제공된다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 서열번호 173의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 아미노산 서열번호 사이에 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 링커 서열은 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 VH, VL, CH1-CH2 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 중 하나 이상의 한쪽 또는 양쪽 말단에 제공될 수 있다.
링커 서열은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369]에 기재되어 있고, 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 가요성(flexible) 링커 서열일 수 있다. 가요성 링커 서열은 링커 서열에 의해 연결된 아미노산 서열의 상대적인 이동을 허용한다. 가요성 링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 몇개는 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369]에서 확인된다. 가요성 링커 서열은 흔히 고 비율의 글리신 및/또는 세린 잔기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커 서열은 적어도 하나의 글리신 잔기 및/또는 적어도 하나의 세린 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 또는 1-10개의 아미노산의 길이를 갖는다.
본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 추가의 아미노산 또는 아미노산의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 아미노산 서열(들)을 포함함으로써 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 발현, 접힘(folding), 트래피킹(trafficking), 프로세싱, 정제 또는 검출을 촉진한다. 예를 들면, 항원-결합 분자/폴리펩타이드는 선택적으로 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 N-또는 C-말단에서 His, (예컨대, 6XHis), Myc, GST, MBP, FLAG, HA, E, 또는 바이오틴 태그 (Biotin tag)를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자/폴리펩타이드는 검출가능한 모이어티(moiety), 예컨대, 형광성, 발광성, 면역-검출가능한, 방사선, 화학적, 핵산 또는 효소 표지(enzyme label)를 포함한다.
본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 신호 펩타이드(또한 리더 서열 또는 신호 서열로서 공지됨)를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 일반적으로 5 내지 30개의 소수성 아미노산의 서열로 이루어지며, 이는 단일 알파 나선을 형성한다. 분비된 단백질 및 세포 표면에서 발현된 단백질은 흔히 신호 펩타이드를 포함한다.
신호 펩타이드는 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 N-말단에 존재할 수 있으며, 새로이 합성된 항원-결합 분자/폴리펩타이드 내에 존재할 수 있다. 신호 펩타이드는 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 효율적인 트래피킹 및 분비를 위해 제공된다. 신호 펩타이드는 흔히 절단(cleavage)에 의해 제거되므로, 항원-결합 분자/폴리펩타이드를 발현하는 세포로부터 분비된 성숙한 항원-결합 분자/폴리펩타이드 내에 포함되지 않는다.
신호 펩타이드는 많은 단백질의 경우 알려져 있으며, 데이타베이스, 예를 들면, GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, 단백질 정보 공급원(Protein Information Resource), 단백질 데이타 뱅크(Protein Data Bank), Ensembl, 및 InterPro에 기록되어 있고/있거나 예컨대, 아미노산 서열 분석 도구, 예를 들면, 신호P (Petersen et al., 2011 Nature Methods 8: 785-786) 또는 신호-BLAST (Frank and Sippl, 2008 Bioinformatics 24: 2172-2176)를 사용하여 확인/예측할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자/폴리펩타이드의 신호 펩타이드는 서열번호 178 내지 186 중 하나의 아미노산 서열에 적어도 80%, 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
표지 및 접합체
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 검출가능한 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 검출가능한 모이어티, 예컨대, 형광성 표지, 인광성 표지, 발광성 표지, 면역-검출가능한 표지(예컨대, 에피토프 태그), 방사표지, 화학적, 핵산 또는 효소적 표지를 포함한다. 항원-결합 분자는 검출가능한 모이어티로 공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로 표지될 수 있다.
형광성 표지는 예컨대, 플루오레세인, 로다민, 알로피코시아닌, 에오신 및 NDB, 희토류의 녹색 형광성 단백질(GFP) 킬레이트, 예를 들면, 유로퓸(Eu), 테르븀(Tb) 및 사마륨(Sm), 테트라메틸 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 4-메틸 움벨리페론, 7-아미노-4-메틸 쿠마린, Cy3, 및 Cy5를 포함한다. 방사표지는 방사선동위원소, 예를 들면, 요오드123, 요오드125, 요오드126, 요오드131, 요오드133, 브롬77, 테크네튬99m, 인듐111, 인듐113m, 갈륨67, 갈륨68, 루테늄95, 루테늄97, 루테늄103, 루테늄105, 수은207, 수은203, 레늄99m, 레늄101, 레늄105, 스칸듐47, 텔루륨121m, 텔루륨122m, 텔루륨125m, 툴륨165, 툴륨l167, 튤륨168, 구리67, 불소18, 이트륨90, 팔라듐100, 비스무쓰217 및 안티모니211를 포함한다. 발광성 표지는 방사발광성, 화학발광성(예컨대, 아크리디늄 에스테르, 루미놀, 이소루미놀) 및 생물발광성 표지를 포함한다. 면역-검출성 표지는 합텐(hapten), 펩타이드/폴리펩타이드, 항체, 수용체 및 리간드, 예를 들면, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 디곡시게닌을 포함한다. 핵산 표지는 앱타머를 포함한다. 효소 표지는 예컨대, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 글루코즈 옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 루시퍼라제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 화학 모이어티에 접합된다. 화학 모이어티는 치료 효과를 제공하기 위한 모이어티일 수 있다. 항체-약물 접합체는 예컨대, 문헌[Parslow et al., Biomedicines. 2016 Sep; 4(3):14]에서 검토된다. 일부 실시형태에서, 화학적 모이어티는 약물 모이어티(예컨대, 세포독성제)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 모이어티는 화학치료제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 모이어티는 칼리체아미신(calicheamicin), DM1, DM4, 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), SN-38, 독소루비신, 두오카르마이신, D6.5 및 PBD로부터 선택된다.
항원-결합 분자의 특수한 예시적인 실시형태
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 187의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 188의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 189의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 190의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 191의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 192의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 193의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 195의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 194의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 195의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 196의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 195의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 197의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 199의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 198의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 199의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 200의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 201의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 202의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 203의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 204의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 205의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 206의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 207의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 208의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 209의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 210의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 211의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 212의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 213의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 214의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 215의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 216의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 217의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 218의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 219의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 220의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 221의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 222의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 223의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 225의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 207의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 226의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 207의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 227의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 217의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 228의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 217의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
항원 결합 분자의 기능적 특성
본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 특정의 기능적 특성을 참조로 특성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 다음의 특성 중 하나 이상을 지닐 수 있다:
HER3 (예를 들어, 인간, 마우스, 랫트 또는 시노몰구스 마카퀴 HER3)에 결합한다;
EGFR 및/또는 HER2에 결합하지 않는다;
HER3-발현 세포에 결합한다;
HER3의 세포외 영역의 하위도메인 II에 결합한다;
HER3이 개방 및 폐쇄 입체형태인 경우, HER3에 결합한다;
NRG에 비의존적으로 HER3에 결합한다;
HER3에 대한 결합에 대해, MM-121 및/또는 LJM-716와 경쟁하지 않는다;
HER3에 대한 결합에 대해, M-05-74 및/또는 M-08-11와 경쟁하지 않는다;
[01259HER3 및 HER3의 상호작용 파트너 (예를 들어, HER3, HER2, EGFR, HER4, HGFR, IGF1R 및/또는 cMet) 사이의 상호작용을 억제한다;
HER3-매개 신호전달을 억제한다;
HER3-발현 세포의 증식 (예를 들어, NRG에 의한 자극에 대한 반응)을 억제한다;
HER3-발현 세포에 의한 PI3K/AKT/mTOR 및/또는 MAPK 신호전달 (예를 들어, NRG에 의한 자극에 대한 반응)을 억제한다;
활성 Fcγ 수용체 (예를 들어, FcγRIIIa)에 결합한다;
활성 Fcγ 수용체에 대한 증가된 결합;
서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자와 비교하여, 활성 Fcγ 수용체에 대한 증가된 결합;
서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자와 비교하여, 억제 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합;
서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자와 비교하여, 억제 Fcγ 수용체에 비해 활성 Fcγ 수용체에 대한 증가된 결합;
서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자와 비교하여, 보체 단백질 (예를 들어, C1q)에 대해 증가되거나 감소된 결합;
서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자와 비교하여, 증가된 6량체화;
서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자와 비교하여, 증가된 ADCC 활성;
서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자와 비교하여, 증가된 ADCP 활성;
서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자와 비교하여, 증가되거나 감소된 CDC 활성;
서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자와 비교하여, 유사하거나 증가된 열 안정성;
HER3-발현 세포의 사멸을 증가시킨다;
HER3-발현 세포의 수/비율을 감소시킨다;
및
생체내에서 암의 발달 및/또는 진행을 억제한다.
본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 바람직하게는 HER3에 대해 특이적인 결합을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "특이적인 결합"은 항원에 대해 선택적이며, 비-표적 항원에 대해 비-특이적인 결합으로부터 구별될 수 있는 결합을 지칭한다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자는 바람직하게는 표적에 고 친화도, 및/또는 이것이 다른 비-표적 분자에 결합하는 것보다 더 긴 기간으로 결합한다.
소정의 분자에 특이적으로 결합하는 소정의 폴리펩타이드이 능력은 당해 분야에 공지된 방법에 따른 분석, 예를 들면, ELISA, 표면 플라스몬 공명(SPR; 참조: 예컨대, Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442), 생물-층 간섭계(생물층 간섭계)(참조: 예컨대, Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507), 유동 세포분석법, 또는 방사표지된 항원-결합 분석(RIA) 효소-표지된 면역흡착성 분석에 의해 측정될 수 있다. 이러한 분석을 통해 소정의 분자에 대한 결합은 측정되고, 정량화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합은 소정의 분석에서 검출된 반응일 수 있다.
일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 항원-결합 분자의 결합 정도는 예컨대, ELISA, SPR, 생물-층 간섭계 또는 RIA에 의해 측정된 바와 같이 표적 분자에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 대안적으로, 결합 특이성은 결합 친화도 양상에서 반영될 수 있으며 여기서 항원-결합 분자는 비-표적 분자에 대한 항원-결합 분자의 KD보다 적어도 0.1 자릿수(즉, 0.1 x 10n, 여기서 n은 자릿수를 나타내는 정수이다) 더 큰 해리 상수(KD)로 결합한다. 이는 선택적으로 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 또는 2.0 중 하나일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인간 HER3, 마우스 HER3, 랫트 HER3 및/또는 시노몰구스 마카퀴 (마카퀴 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis)) HER3과의 결합을 나타낸다. 즉, 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인간 HER3, 마우스 HER3, 랫트 HER3 및/또는 시노몰구스 마카퀴 HER3에 대해 교차 반응성이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 비인간 영장류의 HER3과 교차 반응성을 나타낸다. 모델 종에서 HER3에 대한 교차 반응을 통해 대용 분자에 의존하지 않고도 동계 모델에서 효능을 생체내에서 탐색할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인간 HER3, 마우스 HER3, 랫트 HER3 및/또는 시노몰구스 마카퀴 HER3에 결합하고; HER2 및/또는 EGFR (예를 들어, 인간 HER2 및/또는 인간 EGFR)에 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 EGFR (예를 들어, 인간 EGFR)에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER2 (예를 들어, 인간 HER2)에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 이외의 EGFR 단백질 계열의 구성원에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다 (즉, 이와 교차 반응하지 않음). 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 EGFR, HER2 및/또는 HER4에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3 (예를 들어, 인간 HER3)에 결합하고, KD는 10 μM 이하, 바람직하게는 ≤5 μM, ≤2 μM, ≤1 μM, ≤500 nM, ≤400 nM, ≤300 nM, ≤200 nM, ≤100 nM, ≤95 nM, ≤90 nM, ≤85 nM, ≤80 nM, ≤75 nM, ≤70 nM, ≤65 nM, ≤60 nM, ≤55 nM, ≤50 nM, ≤45 nM, ≤40 nM, ≤35 nM, ≤30 nM, ≤25 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM ≤3 nM, ≤2 nM, ≤1 nM, ≤900 pM, ≤800 pM, ≤700 pM, ≤600 pM, ≤500 pM, ≤400 pM, ≤300 pM, ≤200 pM, ≤100 pM, ≤90 pM, ≤80 pM, ≤70 pM, ≤60 pM, ≤50 pM, ≤40 pM, ≤30 pM, ≤20 pM, ≤10 pM, ≤9 pM, ≤8 pM, ≤7 pM, ≤6 pM, ≤5 pM, ≤4 pM, ≤3 pM, ≤2 pM, ≤1 pM 중 하나이다.
본 발명의 항원-결합 분자는 목적한 HER3의 특수한 영역에 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 항원-결합 분자의 항원-결합 영역은 아미노산의 연속된 서열(즉, 아미노산 1차 서열)로 이루어진 HER3의 선형 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 아미노산 서열의 아미노산의 불연속 서열로 이루어진 HER3의 구조적 에피토프에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3의 세포외 영역 (예를 들어, 서열번호 9에 제시된 영역)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3의 세포외 영역의 하위도메인 II (예를 들어, 서열번호 16에 제시된 영역)에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 229에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 229에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230 및 231에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230 및 231에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 231에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 231에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 21에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 21에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 19에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 19에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 22에 제시된 HER3의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 22에 제시된 HER3의 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기와 접촉한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 서열번호 1, 3, 4, 6 또는 8 중 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230 및 231의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 230의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 231의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 1의 위치 260 내지 279에 해당하는 HER3의 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 1의 위치 260 내지 279에 해당하는 HER3의 영역의 아미노산 잔기와 접촉하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23에 제시된 HER3의 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23에 제시된 HER3의 영역의 아미노산 잔기와 접촉하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 1의 위치 260 내지 279에 해당하는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 단량체의 사슬을 지칭한다. 펩타이드는 통상적으로 약 2 내지 50개 아미노산의 영역내 길이를 갖는다. "폴리펩타이드"는 2개 이상의 펩타이드의 중합체 사슬이다. 폴리펩타이드는 통상적으로 약 50개 아미노산 이상의 길이를 갖는다.
소정의 펩타이드/폴리펩타이드에 결합하는 항원-결합 분자의 능력은 당업자에게 잘 공지된 방법, 예를 들면, ELISA, 면역블롯(예컨대, 웨스턴블롯), 면역침전, 표면 플라스몬 공명 및 생물층 간섭법에 의해 분석될 수 있다.
HER3에 대한 리간드 결합은 HER3의 동종 또는 이종이량체화를 가능하게 하는 입체형태 변화를 촉진하여 하류 경로의 활성화를 초래한다. HER3은 '폐쇄' 및 '개방' 입체형태를 나타낸다. 폐쇄 입체형태는 HER3이 테더링 (tethering)된 입체형태이고, 수용체 동종 또는 이종이량체화에 사용할 수 없음을 의미한다. 개방 형태 란 HER3이 확장된 형태이고 수용체 동종이량체화 또는 이종이량체화에 이용 가능함을 의미한다.
일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3이 개방 입체형태일 때 HER3에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3이 폐쇄 입체형태일 때 HER3에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3이 개방 및/또는 폐쇄 입체형태일 때 HER3에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3이 개방 및/또는 폐쇄 입체형태일 때 HER3 엑토도메인에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3이 개방 및/또는 폐쇄 입체형태일 때 HER3 이량체화 아암에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이량체화 아암에 결합하면, 항원 결합 분자는 HER3과 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3에 대한 리간드의 존재 및/또는 부재하에 HER3에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3에 대한 리간드와 비의존적으로 HER3에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서 리간드는 NRG, NRG-1 및/또는 NRG-2이다. HER3은 HER3의 동종 또는 이종이량체화를 가능하게 하는 입체형태 변화를 촉진하는 세포외 도메인에 대한 리간드 결합에 의해 활성화된다. 리간드 결합에 비의존적으로 항원 결합 분자와 HER3의 결합은 항원 결합 분자가 리간드 부재 및 리간드 존재 입체형태 상태 둘 모두에서 HER3의 작용을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3에 결합하는 리간드와 경쟁하지 않는다. 일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 리간드 결합 부위에서 HER3에 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 클론 10D1, 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92, 10D1_c93, 10A6, 4-35-B2 또는 4-35-B4 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 HER3의 영역에 동일한 HER3의 영역 또는 중첩된 HER3의 영역에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 클론 10D1_c89, 10D1_c90 또는 10D1_c91 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 HER3의 영역에 동일한 HER3의 영역 또는 중첩된 HER3의 영역에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 클론 10D1_c89의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 HER3의 영역에 동일한 HER3의 영역 또는 중첩된 HER3의 영역에 결합할 수 있다.
항체가 결합하는 펩타이드/폴리펩타이드의 영역은 당해 분야에 잘 공지된 다양한 방법, 예를 들면, 항체-항원 복합체의 X-선 공-결정학 분석, 펩타이드 스캐닝, 돌연변이유발 맵핑, 질량 분광법에 의한 수소-중소수 교환 분석, 파아지 디스플레이, 경쟁 ELISA 및 단백질분해-기반 '보호' 방법을 사용하여 당업자에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 문헌[Gershoni et al., BioDrugs, 2007, 21(3):145-156]에 기재되어 있으며, 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 이러한 방법은 또한 항원 결합 분자가 상이한 입체형태의 단백질에 결합할 수 있는지를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 항-HER3 항체 클론 MM-121 (예를 들어, 문헌[Schoeberl et al., Sci. Signal. (2009) 2(77): ra31]에 기재됨) 및/또는 LJM-716 (예를 들어, 문헌[Garner et al., Cancer Res (2013) 73: 6024-6035]에 기재됨)의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 HER3의 영역 또는 중첩되는 HER3의 영역에서 HER3에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3에 대한 결합에 대해, 항-HER3 항체 클론 MM-121 및/또는 LJM-716의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁을 나타내지 않으며, 이는 예를 들어 SPR 분석에 의해 측정되는 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 HER3가 세포 표면에서(즉, 세포막 내 또는 세포막에서) 발현된 경우 항원-결합 분자(즉, 세포외 항원-결합 분자)에 접근가능한 영역내 HER3에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 HER3을 발현하는 세포의 세포 표면에서 발현된 HER3에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3-발현 세포 (예를 들어, HER3+ 세포, 예를 들어, HER3+ 암 세포)에 결합할 수 있다.
소정의 세포형에 결합하는 항원-결합 분자의 능력은 세포를 항원-결합 분자와 접촉시키고, 예컨대, 결합하지 않은 항원-결합 분자를 제거하기 위한 세척 단계 후에 세포에 결합된 항원-결합 분자를 검출함으로써 분석할 수 있다. 면역 세포 표면 분자-발현 세포 및/또는 암 세포 항원-발현 세포에 결합하는 항원-결합 분자의 능력은 유동 세포분석법 및 면역형광 현미경 검사법과 같은 방법으로 분석할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 분자는 HER3의 길항제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 HER3 및/또는 HER3의 결합 파트너 (예를 들어, HER3 (즉, 동종이량체화의 경우), HER2, EGFR, HER4, HGFR, IGF1R 및/또는 cMet)에 의해 매개된 기능 또는 공정(예컨대, 상호작용, 신호전달 또는 다른 활성)을 억제할 수 있다. 본 명세서에서, '억제'는 대조군 상태에 비해 감소, 축소 또는 약화를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3 및 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. HER3의 상호작용 파트너는 HER3과 동일한 세포에 의해 발현될 수 있다. 상호작용 파트너 또는 HER3은 세포 표면 (즉, 세포막 내 또는 상)에 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, HER3의 상호작용 파트너는 EGFR 단백질 계열의 구성원, 예를 들어, HER3, HER2, EGFR, HER4, HGFR, IGF1R 및/또는 cMet일 수 있다. 일부 실시형태에서, HER3의 상호작용 파트너는 IGF1R 및/또는 cMet일 수 있다. HER3 및 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용은 폴리펩타이드 복합체의 형성을 초래할 수 있다. 폴리펩타이드 복합체를 형성하기 위한 HER3 및 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용은 다량체화로서 지칭될 수 있다. 다량체화가 폴리펩타이드 단량체 간에 이루어지는 경우, 다량체화는 이량체화로 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 단량체 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 HER2 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 EGFR 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 HER4 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 HGFR 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 IGF1R 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 cMet 사이의 상호작용을 억제할 수 있다.
상호작용의 억제는 HER3과 HER3의 상호작용 파트너 (예를 들어, 서열번호 19에 나타낸 HER3의 이량체화 루프) 사이의 상호작용에 필요한 HER3 영역과 항원 결합 분자의 결합에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3과 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용에 필요한 HER3의 하나 이상의 잔기와 접촉하고; 이런 방식으로 항원 결합 분자는 해당 영역을 사용할 수 없게 하여 상호작용을 억제한다. 일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3에 결합에 결합하여, 이러한 방식으로, HER3과 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제/방지한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3과 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용에 필요한 HER3 영역에 대한 HER3의 상호작용 파트너의 접근을 억제/방지하고; 이는 예를 들어, HER3과 상호작용 파트너 사이의 상호작용에 필요한 HER3 영역으로의 HER3의 상호작용 파트너의 접근의 입체적 억제를 통해, 항원 결합 분자가 HER3과 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용에 필요한 HER3 영역에 접촉하지 않는 경우에도 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 단량체의 동종이량체화를 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 HER2 간의 이량체화를 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 EGFR 간의 이량체화를 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 HER4 간의 이량체화를 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 HGFR 간의 이량체화를 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 IGF1R 간의 이량체화를 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 cMet 간의 이량체화를 억제할 수 있다.
2개의 인자 사이의 상호작용을 억제하는 항원-결합 분자의 능력은 예를 들면, 항체/단편의 존재 하에서 상호작용의 분석, 또는 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다와 항체/단편의 인큐베이션(incubation)에 의해 측정할 수 있다. 소정의 항원-결합 분자가 2개의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있는지를 측정하기 위한 분석에는 경쟁 ELISA 분석이 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 및 HER3의 상호작용 파트너 간의 상호작용의 경쟁적 억제제이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 적합한 분석에서 항원 결합 분자의 존재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하)에 HER3 및 HER3의 상호작용 파트너 (예를 들어, HER3, HER2, EGFR, HER4, HGFR, IGF1R 및/또는 cMet) 사이의 상호작용을 HER3 및 HER3의 상호작용 파트너 간의 상호작용 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배, 또는 ≤0.01배로 증가시킬 수 있다.
상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제하는 항원 결합 분자의 능력은 또한 그러한 상호작용의 하류 기능적 결과의 분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, HER3과 HER3의 상호작용 파트너 간의 상호작용의 하류 기능적 결과에는 PI3K/AKT/mTOR 및/또는 MAPK 신호가 포함된다. 예를 들어, HER3 및 HER3 상호작용 파트너의 상호작용을 억제하는 항원 결합 분자의 능력은 항원 결합 분자의 존재하에 NRG로 처리한 후 PI3K/AKT/mTOR 및/또는 MAPK 신호전달 분석에 의해 측정될 수 있다. 신호 도입 경로의 인산화된 구성원을 검출할 수 있는 항체를 사용하여, PI3K/AKT/mTOR 및/또는 MAPK 신호전달을 검출하고, 정량화할 수 있다.
HER3과 HER3의 상호작용 파트너의 상호작용을 억제하는 항원 결합 분자의 능력은 또한 항원 결합 분자의 존재하에 NRG로 처리한 후 HER3을 발현하는 세포의 증식을 분석함으로써 측정될 수 있다. 세포 증식은 예를 들어 시간 경과에 따른 세포 수의 변화의 검출, 3H-티미딘의 혼입에 대한 시험관내 분석 또는 CFSE 희석 분석에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Fulcher and Wong, Immunol Cell Biol (1999) 77 (6): 559-564]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 예를 들어 BRAF V600에 대한 돌연변이를 보유하는 세포, 예를 들어 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이를 포함하는 세포의 증식을 억제할 수 있다 (실시예 10 참조).
일부 실시형태에서 항원 결합 분자는 HER3-매개 신호전달을 억제한다. HER3 매개 신호전달은 예를 들어 HER3 매개 신호전달의 상관관계 분석, 예를 들어 PI3K/AKT/mTOR 및/또는 MAPK 신호 도입 경로 중 하나 이상의 신호 도입 분자의 인산화 및/또는 세포 증식을 사용하여 분석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3-발현 세포에 의한 PI3K/AKT/mTOR 및/또는 MAPK 신호전달을 억제할 수 있다. PI3K/AKT/mTOR 및/또는 MAPK 신호전달 수준은 NRG로 자극 후 PI3K/AKT/mTOR 및/또는 MAPK 경로의 성분 중 하나 이상의 인산화 수준의 검출 및 정량화에 의해 분석될 수 있다 (실시예 4.3 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 예를 들어 NRG에 의한 자극에 대한 반응으로 HER3-발현 세포의 증식을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 적합한 분석에서 HER3-발현 세포의 증식을 항원 결합 분자의 존재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하)에 HER3-발현 세포의 증식 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배로 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 적합한 분석에서 HER3-발현 세포에 의한 PI3K/AKT/mTOR 및/또는 MAPK 신호전달을 HER3-발현 세포의 증식을 항원 결합 분자의 존재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하)에 HER3-발현 세포의 신호전달 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배로 증가시킬 수 있다.
HER3-매개 신호전달은 시험관내에서, 예를 들어 실시예 8.9에 기재된 바와 같이, 또는 생체내에서, 예를 들어 실시예 11에 기재된 바와 같이 조사될 수 있다.
ADCC 활성은 예를 들어, 문헌[Yamashita et al., Scientific Reports (2016) 6:19772] (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 방법에 따르거나, 예를 들어, 문헌[Jedema et al., Blood (2004) 103: 2677-82 (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)]에 기재된 51Cr 방출 분석에 의해 분석될 수 있다. ADCC 활성은 또한 제조업체의 지침에 따라 Pierce LDH 세포독성 분석 키트를 사용하여 분석될 수 있다 (본 명세서의 실시예 5에 기재됨).
ADCP는 예를 들어, 문헌[Kamen et al., J Immunol (2017) 198 (1 Supplement) 157.17 (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)]에 기재된 방법에 따라 분석될 수 있다.
CDC를 유도하는 능력은, 예를 들어, 문헌[Schlothauer et al., Protein Engineering, Design and Selection (2016), 29 (10): 457-466] (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 예를 들어 C1q 결합 분석을 사용하여, 분석될 수 있다.
항원 결합 분자의 열 안정성은 예를 들어, 문헌[He et al., J Pharm Sci. (2010)]에 기재된 시차 주사 형광 측정법 및 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 포함하여 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 분석될 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 열 안정성은 용해 온도 (Tm), 비접힘 온도 또는 분해 온도 (예를 들어, ℃ 또는 F°로 표시)의 관점에서 반영될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 활성 Fcγ 수용체 (예를 들어, hFcγRIIa (예를 들어, hFcγRIIa167H, hFcγRIIa167R), hFcγRIIIa (예를 들어, hFcγRIIIa158V, hFcγRIIIa158F), mFcγRIV, mFcγRIII)에 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자에 의한 활성 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도의 1배 초과, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15배 초과 또는 20배 초과의 결합 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 활성 Fcγ 수용체와의 결합에 대한 KD는 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자의 활성 Fcγ 수용체에 대한 KD의 1배 미만, 예를 들어, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06배 미만 또는 0.05배 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 활성 Fcγ 수용체 (예를 들어, hFcγRIIa (예를 들어, hFcγRIIa167H, hFcγRIIa167R), hFcγRIIIa (예를 들어, hFcγRIIIa158V, hFcγRIIIa158F), mFcγRIV, mFcγRIII)에 1000 nM 이하, 바람직하게는 ≤500 nM, ≤100 nM, ≤75 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, 5 nM 이하, ≤4 nM ≤3 nM, ≤2 nM 또는 1 nM 이하 중 하나의 KD로 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 FcRn (예를 들어, hFcRn, mFcRn)에 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자에 의한 FcRn에 대한 결합 친화도의 1배 초과, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15배 초과 또는 20배 초과의 결합 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 FcRn과의 결합에 대한 KD는 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자의 FcRn에 대한 KD의 1배 미만, 예를 들어, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06 미만 또는 0.05배 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 FcRn (예를 들어, hFcRn, mFcRn)에 1000 nM 이하, 바람직하게는 ≤500 nM, ≤100 nM, ≤75 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM ≤3 nM, ≤2 nM 또는 ≤1 nM 중 하나의 KD로 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 억제 Fcγ 수용체 (예를 들어, hFcγRIIb mFcγRIIb)에 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자에 의한 억제 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도의 1배 미만, 예를 들어, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 미만 또는 0.1배 미만의 결합 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 억제 Fcγ 수용체와의 결합에 대한 KD는 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자의 억제 Fcγ 수용체에 대한 KD의 1배 초과, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9배 초과 또는 10배 초과이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 억제 Fcγ 수용체 (예를 들어, hFcγRIIb mFcγRIIb)에 1 nM 이상, 바람직하게는 ≥ 5 nM, ≥ 10 nM, ≥ 50 nM, ≥ 100 nM, ≥ 500 nM, ≥ 1000 nM, ≥ 2000 nM, ≥ 3000 nM, ≥ 4000 nM 또는 ≥ 5000 nM 중 하나의 KD로 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자에 대한 억제 Fcγ 수용체 (예를 들어, hFcγRIIb)에 비해, 활성 Fcγ 수용체 (예를 들어, hFcγRIIa)에 대한 결합 선택성은 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자에 의해 나타나는 결합 선택성의 1배 초과, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15배 초과 또는 20배 초과이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자에 의해 나타나는 ADCC의 1배 초과, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15배 초과 또는 20배 초과의 ADCC를 나타낸다.
일부 실시형태에서, ADCC 활성의 분석에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자에 대해 측정된 EC50 (ng/ml)은, 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자에 대해 측정되는 EC50 (ng/ml)의 예를 들어, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2배 미만 또는 0.1배 미만이다.
일부 실시형태에서, ADCC 활성의 분석에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 EC50 (ng/ml)은 500 ng/ml 이하, 바람직하게는 ≤400 ng/ml, ≤300 ng/ml, ≤200 ng/ml, ≤100 ng/ml, ≤90 ng/ml, ≤80 ng/ml, ≤70 ng/ml, ≤60 ng/ml, ≤50 ng/ml, ≤40 ng/ml, ≤30 ng/ml, ≤20 ng/ml, or ≤10 ng/ml 중 하나이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 서열번호 174 내지 175의 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3으로 구성된 Fc 영역을 갖는 균등한 항원 결합 분자의 용해 온도, 비접힘 온도 또는 분해 온도의 ≥0.75배 및 ≤ 1.25배, 예를 들어, ≥0.8배 및 ≤ 1.2배, ≥0.85배 및 ≤ 1.15배, ≥0.9배 및 ≤ 1.1배, ≥0.91배 및 ≤ 1.09배, ≥0.92배 및 ≤ 1.08배, ≥0.93배 및 ≤ 1.07배, ≥0.94배 및 ≤ 1.06배, ≥0.95배 및 ≤ 1.05배, ≥0.96배 및 ≤ 1.04배, ≥0.97배 및 ≤ 1.03배, ≥0.98배 및 ≤ 1.02배, 또는 ≥0.99배 및 ≤ 1.01배의 용해 온도, 비접힘 온도 또는 분해 온도를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3-발현 세포의 사멸을 증가시킬 수 있다. HER3-발현 세포의 사멸은 항원 결합 분자의 효과기 기능을 통해 증가될 수 있다. 항원 결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 실시형태에서, 항원 결합 분자는 보체 의존적 세포독성 (CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존적 세포 식세포작용 (ADCP) 중 하나 이상을 통해 HER3-발현 세포의 사멸을 증가시킬 수 있다.
HER3-발현 세포의 사멸을 증가시킬 수 있는 항원-결합 분자는 적절한 분석에서 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에서 검출된 세포 사멸의 수준과 비교하여, 항원-결합 분자의 존재 하에서 HER3-발현 세포의 세포 사멸의 증가된 수준을 관찰하거나, 이후 HER3-발현 세포와 항원-결합 분자의 인큐베이션에 의해 확인된다. CDC, ADCC 및 ADCP의 분석은 당업자에 널리 공지되어 있다. HER3-발현 세포의 사멸 수준은 또한 상이한 처리 조건에의 노출 후 생존 및/또는 비생존 HER3-발현 세포의 수/특성을 측정함으로써, 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3-발현 세포 (예를 들어, HER3-발현 암 세포)의 사멸을 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재) 하에서 관찰된 사멸 수준의 1배 초과, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 비교 가능한 분석에서 HER3-발현 세포 (예를 들어, HER3-발현 암 세포)의 수를 항원 결합 분자의 존재 하의 인큐베이션 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하의 인큐베이션) 후 검출되는 HER3-발현 세포 (예를 들어, HER3-발현 암 세포)의 수의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배로 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 생체내에서 암의 발달 및/또는 진행을 억제한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 예를 들어, 효과기 면역 세포에 의한 암세포 사멸의 증가를 야기한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 예를 들어, 적절한 대조군 조건과 비교하여, 생체내 암세포 수의 감소를 야기한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 종양 성장을 억제하며, 이는, 예를 들어 시간 경과에 따라 종양 크기/부피를 측정함으로써 결정되는 바와 같다.
본 발명의 항원 결합 분자는 적절한 생체내 모델, 예를 들어, 세포주 유래 이종이식 모델에서 암의 발달 및/또는 진행을 억제하는 능력에 대해 분석될 수 있다. 세포주 유래 이종이식 모델은 HER3-발현 암 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 모델은 N87 세포-유래 모델, SNU16 세포-유래 모델, FaDu 세포-유래 모델, OvCAR8 세포-유래 모델, HCC95 세포-유래 모델, A549 세포-유래 모델, ACHN 세포-유래 모델 또는 HT29 세포-유래 모델이다.
암은 본 명세서에 기재된 바와 같은 HER3-관련 암 (즉, HER3 유전자/단백질 발현이 암의 증상의 발병, 발달, 진행 또는 중증도 및/또는 전리의 위험 인자이고/거나, 양성적으로 관련된암)일 수 있다. 암은 HER3-발현 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 HER3+ 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항원-결합 분자의 투여는 예컨대, 적절한 HER3 발현 암세포주-유래된 이종이식체 모델에서 측정된 바와 같이, 암의 발달/진행의 억제, 암의 발달의 지연/예방, 종양 성장에 있어서의 감소/이에 대한 지연/이의 예방, 전이에 있어서의 감소/이에 대한 지연/이의 예방, 암의 증상의 중증도에 있어서의 감소, 암 세포의 수에 있어서의 감소, 종양 크기/용적에 있어서의 감소, 및/또는 생존(예컨대, 진행이 없는 생존)에 있어서의 증가 중 하나 이상을 유발할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 HER3-발현 암 세포주 유래 이종이식 모델에서의 종양 성장을 항원 결합 분자에 의한 처리의 부재 하 (또는 적절한 음성 대조군 항원 결합 분자에 의한 처리 후)에 관찰되는 종양 성장의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배로 억제할 수 있다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본 발명은 또한 본 발명의 항원-결합 분자 또는 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
CAR은 항원-결합 및 T 세포 활성화 기능 둘 다를 제공하는 재조합 수용체이다. CAR 구조 및 가공(engineering)은 예를 들면, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Dotti et al., Immunol Rev (2014) 257(1))에서 검토된다. CAR은 세포 막 앵커(anchor) 영역에 연결된 항원-결합 영역 및 신호전달 영역을 포함한다. 임의의 힌지 영역은 항원-결합 영역과 세포막 앵커 영역 사이에 분리를 제공할 수 있으며, 가요성 링커로서 작용할 수 있다.
본 발명의 CAR은 본 발명의 항원-결합 분자를 포함하거나 이로 이루어지거나, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 항원-결합 영역을 포함한다.
세포막 앵커 영역은 CAR의 항원-결합 영역과 신호전달 영역 사이에 제공되며 CAR을 세포외 공간내 항원-결합 영역, 및 세포내부의 신호전달 영역을 사용하여, CAR을 발현하는 세포의 세포막에 앵커시키기 위해 제공한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD3-ζ, CD4, CD8 또는 CD28 중 하나에 대한 막관통 영역 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로부터 유래된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 세포막 앵커 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 참조 아미노산 서열'로부터 유래된' 영역은 참조 서열에 대해 적어도 60%, 예컨대, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
CAR의 신호전달 영역은 T 세포의 활성화를 허용한다. CAR 신호전달 영역은 CD3-ζ의 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 CAR-발현 T 세포의 인산화 및 활성화를 위한 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(motif)(ITAM)를 제공한다. 다른 ITAM-함유 단백질, 예를 들면, FcγRI을 포함하는 신호전달 영역은 또한 CAR에 사용되었다(Haynes et al., 2001 J Immunol 166(1):182-187). CAR의 신호전달 영역은 또한 공-자극성 분자의 신호전달 영역으로부터 유래된 공-자극성 서열을 포함함으로써 표적 단백질에 대한 결합시 CAR-발현 T 세포의 활성화를 촉진시킬 수 있다. 적합한 공-자극성 분자는 CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 및 CD27을 포함한다. 일부 경우에 CAR을 가공하여 상이한 세포내 신호전달 경로의 공-자극을 위해 제공한다. 예를 들면, CD28 공자극과 관련된 신호전달은 포스파티딜이노시톨 3-키나제(P13K) 경로를 우선적으로 활성화시키는 반면, 4-1BB-매개된 신호전달은 TNF 수용체 관련 인자(TRAF) 어댑터 단백질을 통한다. 따라서 CAR의 신호전달 영역은 때때로 하나 이상의 공-자극성 분자의 신호전달 영역으로부터 유래된 공-자극성 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 및 CD27 중 하나 이상의 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로부터 유래된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 하나 이상의 공-자극성 서열을 포함한다.
임의의 힌지 영역은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 분리를 제공할 수 있으며, 가요성 링커로서 작용할 수 있다. 힌지 영역은 IgG1으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 IgG1의 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 힌지 영역을 포함한다.
또한 본 발명에 따른 CAR을 포함하는 세포가 제공된다. 본 발명에 따른 CAR을 사용하여 CAR-발현 면역 세포, 예컨대, CAR-T 또는 CAR-NK 세포를 생성할 수 있다. CAR의 면역 세포로의 가공은 시험관내에서, 배양 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 CAR의 항원-결합 영역은 임의의 적합한 양식, 예컨대, scFv, scFab 등과 함께 제공될 수 있다.
핵산 및 벡터
본 발명은 본 발명에 따른 항원-결합 분자, 폴리펩타이드 또는 CAR을 인코딩하는, 핵산, 또는 다수의 핵산을 제공한다.
일부 실시형태에서, 핵산은 예컨대, 다른 핵산, 또는 천연적으로 존재 하는 생물학적 물질로부터 정제되거나 단리된다. 일부 실시형태에서, 핵산(들)은 DNA 및/또는 RNA를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 다수의 핵산을 포함하는, 벡터, 또는 다수의 벡터를 제공한다.
뉴클레오타이드 서열은 벡터, 예컨대, 발현 벡터내에 함유될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "벡터"는 외인성 핵산을 세포내로 전달하기 위한 비히클(비히클)로서 사용된 핵산 분자이다. 벡터는 세포내에서 핵산의 발현을 위한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 발현될 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 종결 코돈(termination codon) 및 발현 인핸서(expression enhancer)를 포함한다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈을 사용하여 본 발명에 따른 벡터로부터 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"은 선택된 핵산 서열 및 조절성 핵산 서열(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)가 조절 서열의 영향 또는 제어 하에서 핵산 서열의 발현을 대체하는(함으로써 발현 카세트를 형성하는) 방식으로 공유결합으로 연결된다. 따라서, 조절 서열이 핵산 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 조절 서열을 선택된 핵산 서열에 작동적으로 연결시킨다. 이후에, 획득되는 전사체(들)을 목적한 펩타이드(들)/폴리펩타이드(들)로 해독시킬 수 있다.
적합한 벡터는 플라스미드, 이원 벡터(binary vector), DNA 벡터, mRNA 벡터, 바이러스 벡터(예컨대, 감마레트로바이러스 벡터(예컨대, 쥣과동물 백혈병 바이러스(MLV)-유래된 벡터), 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 박시니아 바이러스 벡터 및 헤르페스바이러스 벡터), 트랜스포존(transposon)-기반 벡터, 및 인공 염색체(예컨대, 효모 인공 염색체)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 진핵세포 벡터, 예컨대, 진핵 세포내에서 벡터로부터 단백질의 발현에 필수적인 성분을 포함하는 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 예컨대, 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 SV40 프로모터를 포함함으로써 단백질 발현을 구동하는 포유류 벡터일 수 있다.
본 발명에 따른 항원-결합 분자의 구성적 폴리펩타이드는 다수의 핵산의 상이한 핵산에 의해, 또는 다수의 벡터의 상이한 벡터에 의해 인코딩될 수 있다.
항원-결합 분자 및 폴리펩타이드를 포함/발현하는 세포
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항원-결합 분자, 폴리펩타이드 또는 CAR을 포함하거나 이를 발현하는 세포를 제공한다. 또한 본 발명에 따른 핵산, 다수의 핵산, 벡터 또는 다수의 벡터를 포함하거나 이를 발현하는 세포가 제공된다.
세포는 진핵 세포, 예컨대, 포유류 세포일 수 있다. 포유류은 영장류(레서스, 시노몰구스(cynomolgus), 비-인간 영장류 또는 인간) 또는 비-인간 포유류(예컨대, 토끼, 기니아 피그, 랫트, 마우스 또는 다른 설치류(로덴티아(설치류ia) 목(order)의 임의의 동물 포함), 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소(암소, 예를 들면, 낙농 암소, 또는 보스(Bos) 목의 임의의 동물), 말(에퀴다에(Equidae) 목의 임의의 동물 포함), 당나귀, 및 비-인간 영장류)일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산, 다수의 핵산, 벡터 또는 다수의 벡터를 세포내로 도입시키는 단계를 포함하여, 본 발명에 따른 핵산(들) 또는 벡터(들)을 포함하는 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산(들) 또는 벡터(들)을 세포내로 도입시키는 단계는 형질전환, 형질감염, 전기천공 또는 형질도입(예컨대, 레트로바이러스 형질도입)을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산, 다수의 핵산, 벡터 또는 다수의 벡터를 세포내로 도입시키는 단계를 포함하여, 본 발명에 따른 항원-결합 분자, 폴리펩타이드 또는 CAR을 발현하는/포함하는 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포에 의한 핵산(들) 또는 벡터(들)의 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 시험관내에서 수행된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 획득되거나 획득가능한 세포를 제공한다.
항원-결합 분자 및 폴리펩타이드의 생성
본 발명에 따른 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 폴리펩타이드의 생성 방법에 따라 제조할 수 있다.
폴리펩타이드는 화학적 합성, 예컨대, 액체 또는 고체상 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 펩타이드/폴리펩타이드는 예를 들면, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된, 문헌[Chandrudu et al., Molecules (2013), 18: 4373-4388]에 기재된 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
대안적으로, 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩타이드의 재조합 생성에 적합한 분자 생물학 기술은 둘 다 이의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Edition), Cold Spring Harbor Press, 2012, 및 Nat Methods. (2008); 5(2): 135-146]에 제시된 것과 같이, 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 항원-결합 분자의 재조합 생성 방법은 또한 둘 다 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Frenzel et al., Front Immunol. (2013); 4: 217 및 Kunert and Reinhart, Appl Microbiol Biotechnol. (2016) 100: 3451-3461]에 기재되어 있다.
일부 경우에, 본 발명의 항원-결합 분자는 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬로 구성된다. 이러한 경우에, 항원-결합 분자의 생성은 하나 이상의 폴리펩타이드의 전사 및 해독, 및 항원-결합 분자를 형성하기 위한 폴리펩타이드 사슬의 후속적인 회합을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 생성을 위해, 폴리펩타이드의 발현에 적합한 임의의 세포를 사용할 수 있다. 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 원핵 세포, 예를 들면, 아르카에아(archaea) 또는 박테리아의 세포이다. 일부 실시형태에서, 박테리아은 그람-음성 박테리아, 예를 들면, 엔테로박테리아세아에 과(family)의 박테리아, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포 예컨대, CHO, HEK(예컨대, HEK293), HeLa 또는 COS 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 폴리펩타이드를 일시적으로 또는 안정하게 발현하는 CHO 세포이다.
일부 경우에, 일부 원핵 세포는 진핵 세포와 동일한 접힘 또는 해독 후 변형을 허용하지 않으므로, 세포는 원핵 세포가 아니다. 또한, 매우 높은 발현 수준은 진핵세포내에서 가능하며 단백질은 적절한 태그를 사용하여 진핵세포로부터 정제하기에 보다 용이할 수 있다. 단백질의 배지내로의 분비를 향상시키는 구체적인 플라스미드를 또한 이용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 예컨대, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된, 문헌[Zemella et al. Chembiochem (2015) 16(17): 2420-2431]에 기재된 시스템을 사용하는 것에 따라 세포-유리된-단백질 합성(CFPS)에 의해 제조될 수 있다.
생성은 목적한 폴리펩타이드(들)을 발현하도록 변형된 진핵세포의 배양 또는 발효를 포함할 수 있다. 배양 또는 발효는 영양분, 공기/산소 및/또는 성장 인자의 적절한 공급물 제공하는 생물반응기 속에서 수행할 수 있다. 분비된 단백질은 세포로부터 배양 배지/발효 부유액(fermentation broth)을 분배하는 단계, 단백질 내용물을 추출하는 단계, 및 개개 단백질을 분리하여 분비된 폴리펩타이드(들)을 단리하는 단계에 의해 수집될 수 있다. 배양, 발효 및 분비 기술은 당해 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, (문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(4th Edition)]; 상기 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
생물반응기는 하나 이상의 용기를 포함하며 여기서 세포가 배양될 수 있다. 생물반응기 속의 배양은 반응기 내로의 반응물의 연속적인 유동, 및 반응기로부터 배양된 세포의 연속적인 유동과 함께 연속적으로 일어날 수 있다. 또한, 배양은 뱃치(batch)에서 일어날 수 있다. 생물반응기는 환경 조건, 예를 들면, pH, 산소, 용기 내로 및 외로의 유동 속도, 및 용기내에서의 교반을 모니터하고, 제어함으로써 최적의 조건을 배양되는 세포에 대해 제공한다.
목적한 항원-결합 분자/폴리펩타이드(들)을 발현하는 세포를 배양한 후, 목적한 폴리펩타이드(들)을 단리할 수 있다. 당해 분야에 공지된 세포로부터 단백질을 분리하기 위한 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 폴리펩타이드를 단리하기 위하여, 영양 배지로부터 세포를 분리하는 것이 필수적일 수 있다. 폴리펩타이드(들)이 세포로부터 분비된 경우, 세포를 분비된 목적한 폴리펩타이드(들)을 함유하는 배양 배지로부터 원심분리하여 분리하는 것이 필요할 수 있다. 목적한 폴리펩타이드(들)이 세포내에서 수집되는 경우, 단백질 단리를 세포 배양 배지로부터 세포를 분리하기 위한 원심분리, 분해 완충액을 사용한 세포 펠렛(pellet)의 처리, 및 예컨대, 초음파파쇄(sonification), 신속한 동결-해동 또는 삼투압 분리에 의한 세포 파괴를 포함할 수 있다.
다른 단백질 및 비-단백질 구성성분을 함유할 수 있는, 상청액 또는 배양 배지로부터 목적한 폴리펩타이드(들)를 단리하는 것이 바람직할 수 있다. 상청액 또는 배양 배지로부터 단백질 구성성분을 분리하기 위한 일반적인 접근법은 침전에 의한다. 상이한 용해도의 단백질은 황산암모늄과 같은 상이한 농도의 침전제에서 침전된다. 예를 들면, 저농도의 침전제에서, 수용성 단백질이 추출된다. 따라서, 상이한 증가하는 농도의 침전제를 가함으로써, 상이한 용해도의 단백질이 구별될 수 있다. 투석을 후속적으로 사용하여 분리된 단백질로부터 황산암모늄을 제거할 수 있다.
상이한 단백질을 구별하는 다른 방법, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 크로마토그래피가 당해 분야에 공지되어 있다. 이는 침전에 대한 대안으로서 사용될 수 있거나, 침전에 대해 후속적으로 수행될 수 있다.
목적한 폴리펩타이드(들)이 배양물로부터 단리되면, 폴리펩타이드(들)을 농축시키는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 단백질을 농축시키는 다수의 방법, 예를 들면, 한외여과 또는 동결건조가 당해 분야에 공지되어 있다.
조성물
본 발명은 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산, 발현 벡터 및 세포를 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산, 발현 벡터 및 세포는 임상 용도를 위한 약제학적 조성물 또는 의약으로서 제형화될 수 있으며 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 애주번트 (adjuvant)를 포함할 수 있다. 조성물은 주사 또는 주입을 포함할 수 있는 국소, 비경구, 전신계, 강내(intracavitary), 정맥내, 동맥내, 근육내, 척추강내, 안내(intraocular), 결막내, 종양내, 피하, 피내, 척추강내, 경구 또는 경피 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다.
적합한 제형은 멸균 또는 등장성 매질 속에 항원-결합 분자를 포함할 수 있다. 의약 및 약제학적 조성물은 겔을 포함하는 유체 형태로 제형화될 수 있다. 유체 제형은 인체 또는 동물체의 선택된 영역에 주사 또는 주입(예컨대, 카테터(catheter)를 통해)에 의해 투여용으로 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 예컨대, 혈관 또는 종양내로 주사 또는 주입을 위해 제형화된다.
본 명세서에 기재된 방법에 따라서 방법은 또한 약제학적으로 유용한 조성물의 생성을 위해 제공되며, 이러한 생성 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수) 또는 세포를 생성하는 단계; 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수) 또는 세포를 단리하는 단계; 및/또는 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수) 또는 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트, 부형제 또는 희석제와 혼합시키는 단계.
예를 들면, 본 명세서에 기재된 본 발명의 추가의 실시형태는 질병/병태(예컨대,암)의 치료시 사용하기 위한 의약 또는 약제학적 조성물을 제형화하거나 생성하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수) 또는 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트, 부형제 또는 희석제와 혼합시킴으로써 약제학적 조성물 또는 의약을 제형화하는 단계를 포함한다.
치료학적 및 예방학적 적용
본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 조성물은 치료학적 및 예방학적 방법에서의 용도가 발견된다.
본 발명은 의학적 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 제공한다. 또한 질병 또는 상태의 치료 또는 예방용 의약의 제조시 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산 (또는 이의 다수), 발현 벡터 (또는 이의 다수), 세포 또는 조성물의 용도가 제공된다. 대상체에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양의 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산 (또는 이의 다수), 발현 벡터 (또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 투여함을 포함하는, 질병 또는 상태의 치료 또는 예방 방법이 또한 제공된다.
방법은 질병/병태의 발달 또는 진행을 감소시키거나, 질병/병태의 증상의 완화 또는 질병/병태의 병리학에 있어서의 감소에 효과적일 수 있다. 방법은 질병/병태의 진행을 예방하는데, 예컨대, 질병/병태의 악화를 예방하거나 이의 발달 속도를 지연시키는데 효과적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 질병/병태에 있어서의 개선, 예컨대, 질병/병태의 증상에 있어서의 감소 또는 질병/병태의 중증도/활성의 일부 다른 관련성에 있어서의 감소를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 후기 단계(예컨대, 만성 단계 또는 전이)로의 질병/병태의 발달을 예방할 수 있다.
본 발명의 대상은 HER3을 발현하는 세포의 수 및/또는 활성의 감소로부터 치료 또는 예방적 이점을 유도할 수 있는 임의의 질병/병태의 치료/예방을 위해 사용될 수 있음을 인지하게될 것이다. 예를 들어, 질병/병태는 HER3를 발현하는 세포가 병리학적으로 관련된 질병/병태, 예를 들어 HER3를 발현하는 세포의 증가된 수/비율이 질병/병태의 발병, 발달 또는 진행 및/또는 질병/병태의 하나 이상의 증상의 중증도와 양성적으로 관련되거나, HER3를 발현하는 세포의 증가된 수/비율이 질병/병태의 발병, 발달 또는 진행에 대한 위험 인자인 질병/병태일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따라서 치료될/예방될 질병/병태는 예컨대, 질병/병태의 부재하에서 HER3를 발현하는 세포의 수/비율/활성과 비교하여, HER3를 발현하는 세포의 수/비율/활성에 있어서의 증가에 의해 특징화된 질병/병태이다.
일부 실시형태에서, 치료/예방될 질병/병태는 암이다.
암은 임의의 원치않는 세포 증식(또는 원치않는 세포 증식에 의해 자체적으로 나타나는 임의의 질병), 신생물 또는 종양일 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있으며, 1차 또는 2차(전이성)일 수 있다. 신생물 또는 종양은 세포의 임의의 비정상적인 성장 또는 증식일 수 있으며 임의의 조직내에 위치할 수 있다. 암은 예컨대, 부신, 부신 수질, 항문, 맹장, 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 유방, 맹장, 중추 신경계(뇌를 포함하거나 배제함), 소뇌, 자궁경관, 결장, 십이지장, 자궁내막, 상피 세포(예컨대, 신장 상피), 담낭, 식도, 교질 세포, 심장, 회장, 공장(jejunum), 신장, 누선(lacrimal glad), 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 림프모구, 턱, 종격, 장간막, 자궁근, 비인두, 장막, 구강, 난소, 췌장, 귀밑 샘, 말초 신경계, 복막, 흉막, 전립샘, 타액선, S상 결장(sigmoid 결장), 피부, 소장, 연조직, 비장, 위, 고환, 가슴샘, 갑상선, 혀, 편도선, 기도(trachea), 자궁, 음문, 및/또는 백혈구로부터 유래된 조직/세포일 수 있다.
치료될 종양은 신경 또는 비-신경계 종양일 수 있다. 신경계 종양은 중추 또는 말초 신경계, 예컨대, 신경교종, 수모세포종, 수막종, 신경섬유종, 뇌질피복 세포종(ependymoma), 신경집종, 신경섬유육종, 성상세포종 및 희소돌기아교세포종에서 기원할 수 있다. 비-신경계 암/종양은 임의의 다른 비-신경 조직에서 기원할 수 있으며, 예를 들면, 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종, 백혈병, 비-호지킨 림프종(Non-Hodgkin's lymphoma: NHL), 호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome: MDS), 피하 T-세포 림프종(CTCL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 간종양, 표피모양 암종(epidermoid carcinoma), 전립선 암종, 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 흉선 암, NSCLC, 혈액 암 및 육종을 포함한다.
HER3 및 암과의 그 관련성 및 역할은 예를 들어, 문헌[Karachaliou et al., BioDrugs. (2017) 31(1):63-73 및 Zhang et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica (2016) 48(1): 39-48]에서 검토할 수 있으며, 상기 문헌 둘 모두는 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 암은 HER3을 발현하는 세포를 포함하는 암, 고형 종양, 유방암, 유방 암종, 유관 암종, 위암, 위 암종, 위 선암종, 결장직장암, 결장직장 암종, 결장직장 선암종, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종 (SCCHN), 폐암, 폐 선암종, 편평 세포 폐 암종, 난소암, 난소 암종, 난소 장액성 선암종, 신장암, 신세포 암종, 신장 투명 세포 암종, 신세포 선암종, 유두 신세포 암종, 췌장암, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁경부암, 자궁경부 편평 세포 암종, 피부암, 흑색종, 식도암, 식도 선암종, 간암, 간세포 암종, 담관암종, 자궁암, 자궁 체부 내막 암종, 갑상선암, 갑상선 암종, 갈색세포종, 부신경절종, 방광암, 방광 요로상피 암종, 전립선암, 전립선 선암종, 육종 및 흉선종으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료될 암은 HER3-발현암, 위 암 (예를 들어, 위 암종, 위 선암종, 위장관 선암종), 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종), 유방암, 난소 암 (예를 들어, 난소 암종), 폐 암 (예를 들어, NSCLC, 폐 선암종, 편평 폐 세포 암종), 흑색종, 전립선암, oral cavity 암 (예를 들어, 구인두암), 신장 암 (예를 들어, 신세포 암종) 또는 결장직장 암 (예를 들어, 결장직장 암종), 식도암, 췌장암, 고형 암 및/또는 액형 암으로부터 선택된다.
치료/예방은 다음 중 하나 이상을 목표로할 수 있다: 암의 증상의 발병/진행의 지연/예방, 암의 증상의 중증도의 감소, 암의 세포의 생존/성장/침입/전이의 감소, 암 세포의 수의 감소 및/또는 대상체의 생존 증가.
일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 EGFR 계열 구성원 (예를 들어, HER3, EGFR, HER2 또는 HER4)을 발현하는 세포, 및/또는 EGFR 계열 구성원의 리간드를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 EGFR 계열 구성원에 대해 양성인 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 EGFR 계열 구성원 및/또는 EGFR 계열 구성원의 리간드를 과발현한다. 과발현은 균등한 비 암세포/비 종양 조직에 의한 발현 수준보다 더 큰 발현 수준의 검출에 의해 측정될 수 있다.
발현은 임의의 적절한 수단에 의해 측정될 수 있다. 발현은 유전자 발현 또는 단백질 발현일 수 있다. 유전자 발현은 예를 들어 HER3을 인코딩하는 mRNA의 검출, 예를 들어 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 측정될 수 있다. 단백질 발현은 예를 들어 항체 기반 방법, 예를 들어, 예를 들어, 웨스턴블롯, 면역조직화학, 면역세포화학, 유세포 분석 또는 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 HER3을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 HER3에 양성인 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 HER3을 과발현한다. HER3의 과발현은 균등한 비 암세포/비 종양 조직에 의한 발현 수준보다 더 큰 HER3의 발현 수준의 검출에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 환자는, 예를 들어 대상체로부터 획득된 샘플로부터 HER3을 발현하는 암, 또는 HER3을 과발현하는 암의 검출을 기반으로 하여, 본 명세서에 기재된 치료를 위해 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 HER3의 리간드 (예를 들어, NRG1 및/또는 NRG2)를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 균등한 비 암세포/비 종양 조직에 의한 발현 수준보다 더 큰 NRG1 및/또는 NRG2의 발현 수준을 나타내는 세포를 포함한다.
본 발명의 물품의 투여는 바람직하게는 "치료학적으로 유효한" 또는 "예방학적으로 유효한" 양이며, 이는 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 이점을 나타내기 위해 충분하다. 투여된 실제 양, 및 투여 속도 및 기간은 질병/병태의 특성 및 중증도 및 투여된 특수한 물품에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예컨대, 투여량에 있어서의 결정 등은 일반 숙련가 및 다른 의사의 책임하에 있으며 통상적으로 치료될 질병/장애, 개인 대상체의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 숙련의에게 공지된 다른 인자를 고려한다. 상기 언급한 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams&Wilkins)에서 찾을 수 있다.
투여는 단독으로 또는 다른 치료(treatment)와 함께 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자 또는 조성물 및 치료제(therapeutic agent)는 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 예컨대, 암의 치료/예방을 위한 추가의 치료적 또는 예방적 개입(intervention)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 또는 예방적 개입은 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 수술, 예방접종 및/또는 호르몬 치료요법으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 치료적 또는 예방적 개입은 백혈구성분채집술을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 또는 예방적 개입은 줄기세포 이식을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 대상 (예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자) 및 또 다른 EGFR 계열 구성원 (예를 들어, EGFR, HER2, HER3 또는 HER4)에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 조성물을 포함한다. 또한 본 명세서에 기재된 질병/병태의 의학적 치료 및 예방 방법에서의 이러한 조성물의 용도가 제공된다.
또한 본 명세서에 기재된 질병/병태의 치료/예방 방법으로서, 본 발명의 대상 본 발명에 따른 대상 (예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자) 및 또 다른 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 소분자 억제제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), 단일클론 항체 (및 그의 항원 결합 단편), 펩타이드/폴리펩타이드 억제제 (예를 들어, 유인 리간드/수용체 또는 펩타이드 앱타머 (aptamer)) 및 핵산 (예를 들어, 안티센스 핵산, 스플라이스-교환 핵산 또는 핵산 앱타머)을 포함한다. EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 억제제는 EGFR 계열 구성원, 상호작용 파트너 따라서, 및/또는 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달에 관여하는 하류 인자에 대한 직접적 영향을 통해 신호전달을 억제하는 제제를 포함한다.
일부 실시형태에서, EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제는 EGFR, HER2, HER4 및 HER3 중 하나 이상에 의해 매개되는 신호전달을 억제한다. EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 억제제는 예를 들어, 문헌[Yamaoka et al., Int. J. Mol. Sci. (2018), 19, 3491]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, 길항제는 pan-ErbB 억제제이다. 일부 실시형태에서, 길항제는 EGFR에 의해 매개되는 신호전달의 억제제 (예를 들어, 세툭시맙 (cetuximab), 파니투무맙 (panitumumab), 게피티닙 (gefitinib), 에를로티닙 (erlotinib), 라파티닙 (lapatinib), 아파티닙 (afatinib), 브리가티닙 (brigatinib), 이코티닙 (icotinib), 오시머티닙 (osimertinib), 잘루투무맙 (zalutumumab), 반데타닙 (vandetanib), 네시투무맙 (necitumumab), 니모투주맙 (nimotuzumab), 다코미티닙 (dacomitinib), 둘리고투주맙 또는 마투주맙 (matuzumab))이다. 일부 실시형태에서, 길항제는 HER2에 의해 매개되는 신호전달의 억제제 (예를 들어, 트라스투주맙 (trastuzumab), 퍼투주맙 (pertuzumab), 라파티닙, 네라티닙 (neratinib), 아파티닙, 다코미티닙, MM-111, MCLA-128 또는 마게툭시맙 (margetuximab))이다. 일부 실시형태에서, 길항제는 HER3에 의해 매개되는 신호전달의 억제제 (예를 들어, 세리반투맙, 룸레투주맙, 엘겜투맙 (elgemtumab), KTN3379, AV-203, GSK2849330, REGN1400, MP-RM-1, EV20, 둘리고투주맙, MM-111, 이스티라투맙 (istiratumab), MCLA-128, 파트리투맙, EZN-3920, RB200 또는 U3-1402)이다. 일부 실시형태에서, 길항제는 HER4에 의해 매개되는 신호전달의 억제제 (예를 들어, 라파티닙, 이브루티닙 (ibrutinib), 아파티닙, 다코미티닙 또는 네라티닙)이다.
일부 실시형태에서, EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제는 EGFR 계열 구성원에 의한 신호전달의 하류 효과기를 억제한다. EGFR 계열 구성원에 의한 신호전달의 하류 효과기는 예를 들어, PI3K, AKT, KRAS, BRAF, MEK/ERK 및 mTOR을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제는 MAPK/ERK 경로의 억제제이다. 일부 실시형태에서, EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제는 PI3K/ATK/mTOR 경로의 억제제이다. 일부 실시형태에서, 길항제는 PI3K 억제제 (예를 들어, 픽틸리십 (pictilisib), 부파리십 (buparlisib), 이델라리십, 코판리십 (copanlisib) 또는 두벨리십 (duvelisib))이다. 일부 실시형태에서, 길항제는 AKT 억제제 (예를 들어, MK-2206, AZD5363, 이파타서팁 (ipatasertib), VQD-002, 페리포신 (perifosine) 또는 밀테포신 (miltefosine))이다. 일부 실시형태에서, 길항제는 BRAF 억제제 (예를 들어, 베무라페닙 (vemurafenib), 다브라페닙 (dabrafenib), SB590885, XL281, RAF265, 엔코라페닙 (encorafenib), GDC-0879, PLX-4720, 소라페닙 (sorafenib) 또는 LGX818)이다. 일부 실시형태에서, 길항제는 MEK/ERK 억제제 (예를 들어, 트라메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, 셀루메티닙, PD-325901, CI-1040, PD035901 또는 TAK-733)이다. 일부 실시형태에서, 길항제는 mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신 (rapamycin), 데포롤리무스 (deforolimus), 템시롤리무스 (temsirolimus), 에베롤리무스 (everolimus), 리다포롤리무스 (ridaforolimus) 또는 사파니서팁 (sapanisertib))이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 양상에 따라 치료될 암 (단일요법 또는 조합 요법 포함)은 EGFR 계열 구성원 (예를 들어, EGFR, HER2, HER4 및/또는 HER3)에 의해 매개되는 신호전달의 길항제, 예를 들어, 상기 3 문단에 기재된 바와 같은 길항제에 의한 치료에 내성인 암이다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료에 내성인 암이 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료에 대해 내성이 발생한 암이 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료에 이전에 반응하였고, 길항제에 의한 치료에 대해 현재 내성인 암이 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료 후 재발하고/거나, 진행된 암이 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료에 대해 초기에 반응하였으나, 그 후에 상기 치료시 진행된 암이 있다.
당업자는 상기 문단에 따라 암 및 대상체를 신뢰할 수 있게 확인할 수 있다. 이러한 암 및 대상체는 예를 들어, EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료 과정 동안 시간 경과에 따라 암의 발달/진행 (및/또는 그의 상관관계)의 모니터링을 통해 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 대상체/암의 확인은 예를 들어 시험관내에서 샘플의 분석 (예를 들어, 생검)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 길항제에 의한 치료에 대한 감소된 감응성 및/또는 내성과 관련된 돌연변이를 갖는 세포를 포함하는 것으로 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 EGFR 계열 구성원의 발현이 상향조절된 세포를 포함하는 것으로 측정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 치료될 암은 EGFR 및/또는 HER2에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료에 내성인 암이다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 및/또는 HER2에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료에 내성인 암이 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 및/또는 HER2에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료에 대해 내성이 발생한 암이 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 및/또는 HER2에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료에 대해 이전에 반응하였고, 길항제에 의한 치료에 대해 현재는 내성인 암이 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 및/또는 HER2에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료 후 재발하였고/거나, 진행된 암이 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 EGFR 및/또는 HER2에 의해 매개되는 신호전달의 길항제에 의한 치료에 대해 초기에는 반응하였으나, 그 후에 상기 치료시 진행된 암이 있다.
특정 실시형태에서, 치료될 암은 BRAF의 억제제에 의한 치료에 대해 내성을 부여하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 BRAF V600의 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 BRAF V600E 또는 V600K이다.
특정 실시형태에서, 치료될 암은 BRAF의 억제제에 의한 치료에 내성을 부여하는 돌연변이 (예를 들어, BRAF V600의 돌연변이)를 포함하고, 상기 치료는 베무라페닙 또는 다라페닙 (darafenib)의 투여를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 분자는 예를 들어, PD-1, CTLA-4, LAG-3, VISTA, TIM-3, TIGIT 또는 BTLA이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 공자극 수용체는 예를 들어, CD28, CD80, CD40L, CD86, OX40, 4-1BB, CD27 또는 ICOS이다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 대상 (예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자) 및 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 대상 및 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 제제를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 질병/병태의 의학적 치료 및 예방 방법에서의 이러한 조성물의 용도가 제공된다.
또한 본 명세서에 기재된 질병/병태의 치료/예방 방법으로서, 본 발명의 대상인 본 발명에 따른 대상 (예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자) 및 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 질병/병태의 치료/예방 방법으로서, 본 발명의 대상인 본 발명에 따른 대상 (예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자) 및 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 면역 체크포인트 분자 또는 그의 리간드에 결합하여, 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 항체를 포함한다. 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 다른 제제는 면역 체크포인트 분자 또는 면역 체크포인트 분자의 리간드의 유전자/단백질 발현을 감소시킬 수 있는 제제 (예를 들어, 면역 체크포인트 분자/리간드를 인코딩하는 유전자 (들)의 전사의 억제, 면역 체크포인트 분자/리간드를 인코딩하는 RNA의 전사 후 가공의 억제, 면역 체크포인트 분자/리간드를 인코딩하는 RNA의 안정성의 감소, 면역 체크포인트 분자/리간드를 인코딩하는 RNA의 분해의 촉진, 면역 체크포인트 분자/리간드의 전사 후 가공의 억제, 면역 체크포인트 분자/리간드의 안정성의 감소 또는 면역 체크포인트 분자/리간드의 분해의 촉진에 의함) 및 소 분자 억제제를 포함한다.
공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 제제는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 공자극 수용체에 결합하여, 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉발하거나 증가시킬 수 있는 작용제 항체를 포함한다. 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 다른 제제는 공자극 수용체 또는 공자극 수용체의 리간드의 유전자/단백질 발현을 증가시킬 수 있는 제제 (예를 들어, 공자극 수용체/리간드를 인코딩하는 유전자 (들)의 전사의 촉진, 공자극 수용체/리간드를 인코딩하는 RNA의 전사 후 가공의 촉진, 공자극 수용체/리간드를 인코딩하는 RNA의 안정성의 증가, 공자극 수용체/리간드를 인코딩하는 RNA의 분해의 억제, 공자극 수용체/리간드의 전사 후 가공의 촉진, 공자극 수용체/리간드의 안정성의 증가 또는 공자극 수용체/리간드의 분해의 억제에 의함) 및 소 분자 작용제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 PD-1에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. PD-1에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 PD-1-또는 PD-L1-표적화된 제제. PD-1에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 PD-1 또는 PD-L1에 결합하여, PD-1-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 CTLA-4에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. CTLA-4에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 CTLA-4-표적화된 제제 또는 CTLA-4의 리간드, 예컨대, CD80 또는 CD86에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, CTLA-4에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 CTLA-4, CD80 또는 CD86에 결합하여, CTLA-4-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 LAG-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. LAG-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 LAG-3-표적화된 제제 또는 LAG-3 리간드, 예컨대, MHC 클래스 II에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, LAG-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 LAG-3 또는 MHC 클래스 II에 결합하여, LAG-3-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. VISTA에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 VISTA-표적화된 제제 또는 VISTA 리간드, 예컨대, VSIG-3 또는 VSIG-8에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, VISTA에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 VISTA, VSIG-3 또는 VSIG-8에 결합하여, VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 TIM-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. TIM-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 TIM-3-표적화된 제제 또는 TIM-3 리간드 예컨대, 갈렉틴 9 (Galectin 9)에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, TIM-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 TIM-3 또는 갈렉틴 9에 결합하여, TIM-3-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 TIGIT에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. TIGIT에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 TIGIT-표적화된 제제 또는 TIGIT의 리간드, 예컨대, CD113, CD112 또는 CD155에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, TIGIT에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 TIGIT, CD113, CD112 또는 CD155에 결합하여, TIGIT-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 BTLA에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. BTLA에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 BTLA-표적화된 제제 또는 BTLA 리간드, 예컨대, HVEM에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, BTLA에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 BTLA 또는 HVEM에 결합하여, BTLA-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자 및 면역 체크포인트 분자 (예를 들어, PD-1)에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제의 조합을 사용하는 방법은 제제가 단일요법으로 사용될 때 관찰되는 효과와 비교하여 개선된 치료 효과를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자 및 면역 체크포인트 분자 (예를 들어, PD-1)에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제의 조합은 상승적 (즉, 초 부가적) 치료 효과를 제공한다.
동시 투여는 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물 및 치료제를 함께, 예를 들면, 제제(조합된 제제) 둘 다를 함유하는 약제학적 조성물로서, 또는 서로 및 선택적으로 동일한 투여 경로를 통해, 예컨대, 동일한 동맥, 정맥 또는 다른 혈관으로 투여 직후의 투여를 지칭한다. 순차적인 투여는 다른 제제의 별도의 투여에 의한 소정의 시간 간격 후 항원-결합 분자/조성물 또는 치료제 중 하나의 투여를 지칭한다. 이는 일부 실시형태에서의 경우이지만, 2개의 제제를 동일한 경로에 의해 투여하는 것을 필요하지 않다. 시간 간격은 임의의 시간 간격일 수 있다.
화학치료요법 및 방사선치료요법 각각은 약물 또는 이온화 방사선(예컨대, X-선 또는 γ-선을 사용하는 방사선치료요법)을 사용한 암의 치료를 지칭한다. 약물은 화학적 실체, 예컨대, 소 분자 약제, 항생제, DNA 인터컬레이터(intercalator), 단백질 억제제(예컨대, 키나제 억제제), 또는 생물학적 제제, 예컨대, 항체, 항체 단편, 앱타머(aptamer), 핵산(예컨대, DNA, RNA), 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질일 수 있다. 약물은 약제학적 조성물 또는 의약으로서 제형화될 수 있다. 제형은 하나 이상의 약물(예컨대, 하나 이상의 활성제)과 함께 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
치료는 하나 이상의 약물의 투여를 포함할 수 있다. 약물은 단독으로 또는 다른 치료와 함께 치료될 상태에 따라 동시에 또는 후속적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 화학치료요법은 2개의 약물의 투여를 포함하는 공-치료요법일 수 있으며, 이들 중 하나 이상은 암 치료를 위해 의도될 수 있다.
화학치료요법은 하나 이상의 투여 경로, 예컨대, 비경구, 정맥내 주사, 경구, 피하, 피내 또는 종양내로 투여될 수 있다.
화학치료요법은 치료 요법에 따라 투여될 수 있다. 치료 요법은 의사 또는 의학 전문가에 의해 제조될 수 있고 치료를 필요로 하는 환자에 맞도록 조정될 수 있는 화학치료요법 투여의 예정된 시간표, 계획, 설계 또는 스케쥴일 수 있다. 치료 요법은 다음 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 환자에게 투여하기 위한 화학치료요법의 유형; 각각의 약물 또는 방사선의 투여량; 투여 사이의 시간 간격; 각각의 치료의 길이; 임의의 치료 휴일의 수 및 특성 등. 동시-치료요법의 경우, 각각의 약물이 투여되어야 하는 방법을 나타내는 단일 치료 요법이 제공될 수 있다.
화학치료요법 약물은 다음으로부터 선택될 수 있다: 아베마시클립, 아비라테론 아세테이트, 아비트렉세이트(메토트렉세이트), 아브락산(파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제형), ABVD, ABVE, ABVE-PC, AC, 아칼라브루티닙, AC-T, 아드세트리스(브렌툭시맙 베도틴), ADE, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 아드리아마이신(독소루비신 하이드로클로라이드), 아파티닙 디말레에이트, 아피니토르(에베롤리무스), 아킨제오(네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드), 알다라(이미퀴모드), 알데슬레우킨, 알레켄사(알렉티닙), 알렉티닙, 알렘투주맙, 알림타(페메트렉세드 이나트륨), 알리쿠파(코판리십 하이드로클로라이드), 주사용 알케란(멜팔란 하이드로클로라이드), 알케란 정제(멜팔란), 알록시(팔로노세트론 하이드로클로라이드), 알룬브리그(브리가티닙), 암보클로린(클로람부실), 암보클로린(클로람부실), 아미포스틴, 아미노레불린산, 아나스트로졸, 아프레피탄, 아레디아(파미드로네이트 이나트륨), 아리미덱스(아나스트로졸), 아로마신(엑세메스탄), 아라논(넬라라빈), 삼산화비소, 아르제라(오파투무맙), 아스파라기나제 에르위니아 크리산테미, 아테졸리주맙, 아바스틴(베바키주맙), 아벨루맙, 악시캅타젠 실로루셀, 악시티닙, 아자티티딘, 바벤키오(아벨루맙), BEACOPP, 베세눔(카르무스틴), 벨레오닥(벨리노스타트), 벨리노스타트, 벤다무스틴 하이드로클로라이드, BEP, 베스폰사(이노투주맙 오조가미신), 베바키주맙, 벡사로텐, 벡스사르(Bexxar)(토시투모맙 및 요오드 I 131 노시투모맙), 비칼루타미드, BiCNU(카르무스틴), 블레오마이신, 블리나투모맙, 블린사이토(Blincyto)(블리나투모맙), 보르테조밉, 보설리프(보수티닙), 보수티닙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리가티닙, BuMel, 부설판, 부설펙스(부설판), 카바지탁셀, 카보메틱스(카보잔티닙-S-말레이트), 카보잔티닙-S-말레이트, CAF, 칼??스(아칼라브루티닙), 캄패쓰(Campath)(알렘투주맙), 캄프토사르(이리노테칸 하이드로클로라이드), 카펙시타빈, CAPOX, 카락(플루오로우라실-국소), 카르보플라틴, 카르보플라틴-탁솔(CARBOPLATIN-TAXOL), 카르필조밉, 카르무브리스(카르무스틴), 카르무스틴, 카르무스틴 이식체, 카소덱스(비칼루타미드), CEM, 세리티닙, 세루비딘(독소루비신 하이드로클로라이드), 세르바릭스(재조합 HPV 2가 백신), 세툭시맙, CEV, 클로람부실, 클로람부실-프레드니손(CHLORAMBUCIL-PREDNISONE), CHOP, 시스플라틴, 클라드리빈, 클라펜(사이클로포스파미드), 클로파라빈, 클로파렉스(클로파라빈), 클로라르(Clolar)(클로파라빈), CMF, 코비메티닙, 코메트리크(카보잔티닙-S-말레이트), 코판리십 하이드로클로라이드, COPDAC, COPP, COPP-ABV, 코스메겐(닥티노마이신), 코텔릭(코비메티닙), 크리조티닙, CVP, 사이클로포스파미드, 사이포스(Cyfos)(이포스파미드), 사이람자(라무시루맙), 사이타라빈, 사이타라빈 리포좀, 사이토사르-U(사이타라빈), 사이톡산(사이클로포스파미드), 다브라페닙, 다카르바진, 다코겐(데시타빈), 닥티노마이신, 다라투무맙, 다르젤렉스(다라누무맙), 다사티닙, 다우노루비신 하이드로클로라이드, 다우노루비신 하이드로클로라이드 및 사이타라빈 리포좀, 덱시타빈, 데피브로티드 나트륨, 데피텔리오(데피브로타이드 나트륨), 데가렐릭스, 데니류킨 디프티톡스, 데노수맙, 데포시트(DepoCyt)(사이타라빈 리포좀), 덱사메타손, 덱스라족산 하이드로클로라이드, 디누툭시맙, 도세탁셀, 독실(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 독소루비신 하이드로클로라이드, 독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀, Dox-SL(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), DTIC-도메(Dome)(다카르바진), 두르발루맙, 에푸덱스(플루오로우라실-국소), 엘릭텍(라스부리카제), 엘렌스(에피루비신 하이드로클로라이드), 엘로투주맙, 엘록사틴(옥살리플라틴), 엘트롬보팩 올라민(Eltrombopag Olamine), 에멘드(아프레피탄), 엠플리시티(엘로투주맙), 에나시데닙 메실레이트, 엔줄루타미드, 에피루비신 하이드로클로라이드, EPOCH, 에르비툭스(세툭시맙), 에리불린 메실레이트, 에리벳지(Erivedge)(비스모데깁), 에를로티닙 하이드로클로라이드, 에르위나제(Erwinaze)(아스파라기나제 에르위니아 크리산테미), 에티올(아미포스틴), 에토포포스(에토포시드 포스페이트), 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 에바세트(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 에베롤리무스, 에VISTA(락록시펜 하이드로클로라이드), 에보멜라(멜팔란 하이드로클로라이드), 엑세메스탄, 5-FU(플루오로우라실 주사), 5-FU(플루오로우라실-국소), 파레스톤(토레미펜), 파리닥(파노비노스타트), 파슬로덱스(풀베스트란트), FEC, 페마라(레트로졸), 필그라스팀, 플루다라(플루다라빈 포스페이트), 플루다라빈 포스페이트, 플루오로플렉스(플루오로우라실-국소), 플루오로우라실 주사, 플루오로우라실-국소, 플루타미드, 폴렉스(메토트렉세이트), 폴렉스 PFS(메토트렉세이트), 폴피리(FOLFIRI), 폴피리-베바키주맙(FOLFIRI-BEVACIZUMAB), 폴피리-세툭시맙(FOLFIRI-세툭시맙), 폴피리녹스(FOLFIRINOX), 폴폭스(FOLFOX), 폴로틴(프랄라트렉세이트), FU-LV, 풀베스트란트, 가르다실(재조합 HPV 4가 백신), 가르다실 9(재조합 HPV 9가 백신), 가지바(오비누투주맙), 게피티닙, 겜시타빈 하이드로클로라이드, 겜시타빈-시스플라틴(GEMCITABINE-시스플라틴), 겜시타빈-옥살리플라틴(GEMCITABINE-OXALIPLATIN), 겜투주맙 오조가미신, 겜자르(겜시타빈 하이드로클로라이드), 길로트리프(아파티닙 디말레에이트), 글리벡(이마티닙 메실레이트), 글리아델(카르무스틴 이식체), 글리아델 웨이퍼(Gliadel wafer)(카르무스틴 이식체), 글루카르피다제, 고세렐린 아세테이트, 할라벤(에리불린 메실레이트), 헤만게올(프로프라놀롤 하이드로클로라이드), 헤르셉틴(트라스투주맙), HPV 2가 백신, 재조합체, HPV 9가 백신, 재조합체, HPV 4가 백신, 재조합체, 하이캄틴(토포테칸 하이드로클로라이드), 하이드레아(하이드록시우레아), 하이드록시우레아, 하이퍼-CVAD, 이브란스(팔보키클립), 이브리투모맙 티욱세탄, 이브루티닙, ICE, 이클루식(Iclusig)(포나티닙 하이드로클로라이드), 이다마이신(이다루비신 하이드로클로라이드), 이다루비신 하이드로클로라이드, 이델랄리십, 이드히파(에나시데닙 메실레이트), 이펙스(이포스파미드), 이포스파미드, 이포스파미둠(이포스파미드), IL-2(알데슬류킨), 이마티닙 메실레이트, 임브루비카(이브루티닙), 임핀지(두르발루맙), 이미퀴모드, 임믈리긱(Imlygic)(칼리모겐 라헤르파레프벡(Talimogene Laherparepvec)), 인라이타(Inlyta)(악시티닙), 이노투주납 오조가미신, 인터페론 알파-2b, 재조합체, 인터루킨-2(알데스류킨), 인트론 A(재조합 인터페론 알파-2b), 요오드 I 131 토시투모맙 및 토시투모맙, 이필리무맙, 이레싸(Iressa)(게피티닙), 이리노테칸 하이드로클로라이드, 이리노테칸 하이드로클로라이드 리포좀, 이스토닥스(로미뎁신), 익사베필론, 익사조닙 시트레이트, 익셈프라(익사베필론), 자카피(Jakafi)(룩솔리티닙 포스페이트), JEB, 제브타나(카바지탁셀), 카드실라(Kadcyla)(아도-트라스투주맙 엠탄신), 케옥시펜(랄록시펜 하이드로클로라이드), 케피반스(팔리페르민), 키트루다(펨브롤리주맙), 키스콸리(Kisqali)(리보키클립), 킴리아흐(Kymriah)(티사겐레클류셀), 카이프롤리스(카르필조밉), 란레오타이드 아세테이트, 라파티닙 디토실레이트, 라르트루보(올라라투맙), 레날리도미드, 렌바티닙 메실레이트, 렌비마(렌바티닙 메실레이트), 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류케란(클로람부실), 류프롤라이드 아세테이트, 류스타틴(클라드리빈), 레불란(아미노레불린산), 린폴리진(클로람부실), 리포독스(LipoDox)(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 로무스틴, 론수르프(트리플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드), 루프론(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포트(depot)(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포트-페드(Lupron Depot-Ped)(류프롤라이드 아세테이트), 린파르자(올라파립), 마르퀴보(빈크리스틴 설페이트 리포좀), 마툴란(프로카르바진 하이드로클로라이드), 메클로르에타민 하이드로클로라이드, 메게스트롤 아세테이트, 메키니스트(트라메티닙), 멜팔란, 멜팔란 하이드로클로라이드, 머캅토푸린, 메스나, 메스넥스(메스나), 메타졸라스톤(테모졸로마이드), 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 LPF(메토트렉세이트), 메틸날트렉손 브로마이드, 멕세이트(메토트렉세이트), 멕세이트(Mexate)-AQ(메토트렉세이트), 미도스타우린, 미토마이신 C, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 미토지트렉스(미토마이신 C), MOPP, 모조빌(플레릭사포르), 무스타르겐(메클로르에타민 하이드로클로라이드), 무타마이신(미토마이신 C), 마일레란(부설판), 마이로사르(아자시티딘), 마일로타르그(Mylotarg)(겜투주맙 오조가미신), 나노입자 파클리탁셀(파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제형), 나벨빈(비노렐빈 타르트레이트), 니시투무맙, 넬라라빈, 네오사르(사이클로스포파미드), 네라티닙 말레에이트, 네릴린스(Nerlynx)(네라티닙 말레에이트), 네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드, 뉼라스타(페그필그라스팀), 뉴포겐(필그라스팀), 넥사바르(소라페닙 토실레이트), 닐란드론(닐루타미드), 닐로티닙, 닐루타미드, 닌라로(Ninlaro)(익사조밉 시트레이트), 니라파립 토실레이트 일수화물, 니볼루맙, 놀바덱스(타목시펜 시트레이트), 엔플레이트(Nplate)(로미프로스팀), 오비누투주맙, 오돔조(소니데깁), OEPA, 오파투무맙, OFF, 올라파립, 올라라투맙, 오마세탁신 메페석시세이트, 온카스파르(페가스파르가제), 온단세트론 하이드로클로라이드, 오니바이드(Onivyde)(이리노테칸 하이드로클로라이드 리포좀), 온탁(데니류킨 디프티톡스), 옵디보(니볼루맙), OPPA, 오시메르티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제형, PAD, 팔보시클립, 팔리페르민, 팔로노세트론 하이드로클로라이드, 팔로노세트론 하이드로클로라이드 및 네투피탄트, 파미드로네이트 이나트륨, 파니투무맙, 파노비노스타트, 파라플라트(카르보플라틴), 파라플라틴(카르보플라틴), 파조파닙 하이드로클로라이드, PCV, PEB, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, 페그인터페론 알파-2b, PEG-인트론(페그인터페론 알파-2b), 펨브롤리주맙, 페메트렉세드 이나트륨, 페르제타(Perjeta)(페르투주맙), 페르투주맙, 플라티놀(시스플라틴), 플라티놀-AQ(시스플라틴), 플레릭시포르, 포말리도미드, 포말리스트(포말리도미드), 포나티닙 하이드로클로라이드, 포르트라짜(Portrazza)(네시투무맙), 프랄라트렉세이트, 프레드니손, 프로카르바진 하이드로클로라이드, 프롤류킨(알데스루킨), 프롤리아(데노수맙), 프로막타(엘트롬보팩 올라민), 프로프로파놀롤 하이드로클로라이드, 프로벤지(시풀류셀-T), 푸리네톨(머캅토푸린), 푸릭산(머캅토푸린), [항목 없음(No Entries)], 라듐 223 디클로라이드, 랄록시펜 하이드로클로라이드, 라무시루맙, 라스부리카제, R-CHOP, R-CVP, 재조합 인간 파필로마바이러스(HPV) 2가 백신, 재조합 인간 파필로마바이러스(HPV) 9가 백신, 재조합 인간 파필로마바이러스(HPV) 4가 백신, 재조합 인터페론 알파-2b, 레고라페닙, 렐리스토르(메틸날프렉손 브로마이드), R-EPOCH, 레블리미드(레날리도미드), 류마트렉스(메토트렉세이트), 리보키클립, R-ICE, 리툭산(리툭시맙), 리툭산 하이셀라(리툭시맙 및 하이알루로니다제 인간), 리툭시맙, 리툭시맙 및 하이알루로니다제 인간, 롤라피탄트 하이드로클로라이드, 로미뎁신, 로미플로스팀, 루비도마이신(다우노루비신 하이드로클로라이드), 루브라카(루카파립 캄실레이트), 루카파립 캄실레이트, 룩솔리티닙 포스페이트, 라이답트(미도스타우린), 스클레로솔 흉막내 에어로졸(Sclerosol Intrapleural Aerosol)(활석), 실툭시맙, 시풀레우셀-T, 소마툴린 데포트(란레오타이드 아세테이트), 소니데깁, 소라페닙 토실레이트, 스프라이셀(Sprycel)(다사티닙), 스탠포드(STANFORD) V, 멸균 활석 분말(활석), 스테리탈크(Steritalc)(활석), 스티바르가(Stivarga)(레고라페닙), 수니티닙 말레이트, 수텐트(수니티닙 말레이트), 실라트론(페그인터페론 알파-2b), 실반트(실툭시맙), 신리보(오마세탁신 메페석시네이트), 타블로이드(티오구아닌), TAC, 타핀라르(다브라페닙), 타그리쏘(Tagrisso)(오시메르티닙), 활석, 탈리모겐 라헤르파레프벡, 타목시펜 시트레이트, 타라빈 PFS(사이타라빈), 타르세바(에를로니팁 하이드로클로라이드), 타르그레틴(벡사로텐), 타시그나(닐로티닙), 탁솔(파클리탁셀), 탁소테레(도세탁셀), 테센트리크(아테졸리주맙), 테모다르(테모졸로마이드), 테모졸로마이드, 템시롤리무스, 탈리도마이드, 탈로미드(탈리도마이드), 티오구아닌, 티오테파, 티사겐레클류셀, 톨락(플루오로우라실-국소), 토포테칸 하이드로클로라이드, 토레미펜, 토리셀(템시롤리무스), 토시투모맙 및 요오드 I 131 토시투모맙, 토텍트(덱스라족산 하이드로클로라이드), TPF, 트라벡테딘, 트라메티닙, 트라스투주맙, 트레안다(벤다무스틴 하이드로클로라이드), 트리플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드, 트리세녹스(삼산화비소), 타이케르브(Tykerb)(라파티닙 디토실레이트), 유니툭신(디누툭시맙), 우리딘 트리아세테이트, VAC, 발루비신, 발스타(발루비신), 반데타닙, VAMP, 바루비(롤라피탄트 하이드로클로라이드), 벡티빅스(파니투무맙), VeIP, 벨반(빈블라스틴 설페이트), 벨케이드(보르테조밉), 벨사르(빈블라스틴 설페이트), 베무라페닙, 벤클렉타(베네토클락스), 베네토클락스, 베르제니오(아베마키클립), 비아두르(류플롤라이드 아세테이트), 비다자(아자시티딘), 빈블라스틴 설페이트, 빈카사르 PFS(빈크리스틴 설페이트), 빈크리스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트 리포좀, 비노렐빈 타르트레이트, VIP, 비스모데깁, 비스토가르드(우리딘 트리아세테이트), 보락사제(글루카르피다제), 보리노스타트, 보트리엔트(파조파닙 하이드로클로라이드), 바익세오스(Vyxeos)(다우노루비신 하이드로클로라이드 및 사아타라빈 리포좀), 웰코보린(류코보린 칼슘), 크살코리(Xalkori)(크리조티닙), 크셀로다(카펙시타빈), XELIRI, XELOX, 크세게바(Xgeva)(데노수맙), 크소피고(라듐 223 디클로라이드), 크탄디(Xtandi)(엔잘루타미드), 예르보이(Yervoy)(이필리무맙), 예르스카르타(Yescarta)(악시카브타겐 실로류셀), 욘델리스(트라벡테딘), 잘트랩(지브-아플리베르셉트), 자륵시오(Zarxio)(필그라스팀), 제줄라(Zejula)(니라파립 토실레이트 일수화물), 젤보라프(베무라페닙), 제발린(이브리투모맙 티욱세탄), 지네카르드(덱스라족산 하이드로클로라이드), 지브-아플리베르셉트, 조프란(온단세트론 하이드로클로라이드), 졸라덱스(고세렐린 아세테이트), 졸레드론산, 졸린자(보리노스타트), 조메타(졸렌드론산), 자이델리그(이델랄리십), 자이카디아(세리티닙) 및 자이티가(아비라테론 아세테이트).
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 트라스투주맙, 세툭시맙, 시스플라틴 (cisplatin), 5-FU 또는 카페시타빈 (capecitabine) 중 하나 이상과 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 트라스투주맙 및 시스플라틴, 및 5-FU 또는 카페시타빈와 조합하여 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 세툭시맙와 조합하여 투여된다. 세툭시맙과의 조합 투여는 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종)의 치료를 위해 특히 고려된다.
항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물의 다회의 투여량이 또한 제공될 수 있다. 투여량 중 하나 이상, 또는 각각은 다른 치료제의 동시 투여 또는 후속적 투여에 의해 동반될 수 있다.
다수의 투여량은 예정된 시간 간역으로 분리될 수 있으며, 이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 중 하나가 되도록 선택될 수 있다. 예로써, 투여량은 7, 14, 21 또는 28일마다(플러스(+) 또는 마이너스(-) 3분, 2, 또는 1일) 1회 제공될 수 있다.
검출 방법
본 발명은 또한 HER3 또는 HER3를 발현하는 세포를 검출하거나, 국재화하거나 영상화하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 물품을 제공한다.
본 명세서에 기재된 항원 결합 분자는 HER3에 대한 항원 결합 분자를 포함하는 방법에 사용된다. 이러한 방법은 결합된 항원 결합 분자 및 HER3의 복합체의 검출을 포함할 수 있다.
이와 같이, HER3을 포함하거나, 포함하는 것으로 추측되는 샘플을 접촉시키는 단계, 및 항원 결합 분자 및 HER3의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 또한 HER3을 발현하는 세포를 포함하거나, 포함하는 것으로 추측되는 샘플을 접촉시키는 단계, 및 항원 결합 분자 및 HER3을 발현하는 세포의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
면역분석, 예를 들면, 샌드위치 분석, 예컨대, ELISA를 포함하는, 적합한 방법 양식이 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 방법은 항원-결합 분자, 또는 표적(들), 또는 둘다를 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출가능한 모이어티, 예컨대, 형광성 표지, 인광성 표지, 발광성 표지, 면역-검출가능한 표지, 방사선표지, 화학물질, 핵산 또는 효소 표지로 표지하는 단계를 포함할 수 있다. 검출 기술은 당해 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있으며 표지제와 해당하도록 선택할 수 있다.
이러한 유형의 방법은 질병 또는 상태, 예컨대, 암의 진단 및/또는 예후적 평가를 위한 방법을 기준으로 제공할 수 있다. 이러한 방법은 환자 샘플에서 시험관내에서, 또는 환자 샘플의 프로세싱 후 수행될 수 있다. 일단 샘플이 수집되면, 환자는 수행될 시험관내 방법에 대해 존재될 필요가 없으므로, 이러한 방법은 인체 또는 동물체에서 실시되지 않는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 생체내에서 수행된다.
샘플 속의 검출은 질병/병태(예컨대,암)의 진단, 질병/병태에 대한 경향의 목적을 위해, 또는 질병/병태, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 질병/병태에 대한 예후(예측)을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 진단 또는 예후는 기존(이미 진단된) 질병/병태에 관한 것일 수 있다.
이러한 방법은 예를 들어 환자 샘플에서 HER3 또는 HER3을 발현하는 세포를 검출하거나 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 방법이 관련 인자를 정량화하는 단계를 포함하는 경우, 이러한 방법은 진단 또는 예후 평가의 일부로서 표준 또는 참조 값에 대해 예정된 양을 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 진단/예후 시험을 본 명세서에 기재된 것과 함께 사용함으로써 진단 또는 예후의 정확성을 향상시키거나 본 명세서에 기재된 시험을 사용함으로써 획득된 결과를 확인할 수 있다.
샘플은 임의의 조직 또는 체액으로부터 취할 수 있다. 샘플은 혈액의 양; 피브린 응괴 및 혈액 세포의 제거 후 획득된 혈액의 유체 부위를 포함할 수 있는 개의l 혈액으로부터 유래된 혈청의 양; 조직 샘플 또는 생검(biposy); 늑막 유액(pleural fluid); 뇌척수 유액(CSF); 또는 상기 개인으로부터 단리된 세포를 포함할 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 질병/병태(예컨대, 질병의 증상이 나타나거나, 질병/병태의 발병에 포함된 조직 또는 조직들)에 의해 영향받는 조직 또는 조직들로부터 획득되거나 유래될 수 있다.
본 발명은 또한 HER3-표적화된 제제에 의한 치료를 위해 대상체의 선택/계층화 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 본 발명에 따른 치료/예방을 위해 선택되거나, 예를 들어 대상체로부터 획득된 샘플에서 HER3 또는 HER3를 발현하는 세포의 검출/정량화를 기반으로 하여, 이러한 치료/예방으로부터 이점을 얻을 수 있는 개체로서 확인된다.
대상체
본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태에 따른 대상체는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 대상체는 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 비-인간 포유류일 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 대상체는 치료를 필요로 하는 질병 또는 상태(예컨대,암)으로 진단될 수 있거나, 이러한 질병/병태를 가진 것으로 예측될 수 있거나, 이러한 질병/병태가 발달할/걸릴(contracting) 위험에 처해 있을 수 있다.
본 발명에 따른 실시형태에서, 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서의 발명의 치료학적 또는 예방학적 방법에 따라 치료될 대상체는 암을 가지거나 암으로 발달할 위험이 있는 대상체이다. 본 발명에 따른 실시형태에서, 대상체는 이러한 질병/병태의 특정 마커(마커)에 대한 특성화를 기반으로 하는 방법에 따른 치료를 위해 선택될 수 있다.
키트(kit)
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시형태에서, 부품의 키트(kit of parts)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 예정된 양의 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 갖는 적어도 하나의 용기를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 생성하기 위한 물질을 포함할 수 있다.
키트는 명시된 질병/병태를 치료하기 위하여 환자에게 투여하기 위한 기재서와 함께, 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 예정된 양의 다른 치료제(예컨대, 항-감염제 또는 화학치료요법제)를 갖는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 키트는 또한 제2의 의약 또는 약제학적 조성물을 포함함으로써 2개의 의약 또는 약제학적 조성물이 동시에 또는 별도로 투여되어 이들은 특수한 질병 또는 상태에 대한 조합된 치료를 제공할 수 있다. 치료제는 또한 종양 또는 혈액에 주사 또는 주입하는데 적합하도록 제형화할 수 있다.
서열 동일성
본 명세서에 사용된 바와 같이, "서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭(gap)을 도입한 후, 서열 사이에 서열 동일성의 최대 퍼센트를 달성하기 위해, 참조 서열내 뉴클레오타이드/아미노산 잔기와 동일한 대상체 서열내 뉴클레오타이드/아미노산 잔기의 퍼센트를 지칭한다. 2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 동일성 퍼센트를 측정할 목적을 위한 쌍식 및 다중 서열 정렬은 당해 분야의 당업자에게 공지된 다양한 방식으로, 예를 들면, 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, ClustalOmega(문헌[Soeding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960]), T-coffee (문헌[Notredame et al. 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217]), Kalign (문헌[Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298)]) 및 MAFFT (문헌[Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780]) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 소프트웨어를 사용하는 경우, 예컨대, 갭 패널티 및 연장 패널티에 대한 디폴트 매개변수(default parameter)를 바람직하게 사용한다.
서열
일련의 번호의 항목
다음의 일련의 번호의 항목 (항)은 본 발명과 관련하여 고려되는 특징 및 특징의 조합에 대한 추가 설명을 제공한다:
1. 세포외 영역 하위도메인 II에서의 HER3에 결합할 수 있는 선택적으로 단리된 항원 결합 분자.
2. 제1항에 있어서, 항원 결합 분자는 HER3 및 HER3의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제하는 항원 결합 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 분자는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항원 결합 분자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 서열번호 23 또는 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항원 결합 분자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 서열번호 21 또는 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항원 결합 분자.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 99의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 158의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 159의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 160의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 165의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 166의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 167의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
19. 제1항 내지 제4항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 129의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 130의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 136의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 137의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 138의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
20. 제1항 내지 제4항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 145의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 146의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 74의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(ii) 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 75의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(iii) 서열번호 26의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 76의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(iv) 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 77의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(v) 서열번호 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 78의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(vi) 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 78의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(vii) 서열번호 30의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 78의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(viii) 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(ix) 서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(x) 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 80의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xi) 서열번호 34의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 81의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xii) 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 82의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xiii) 서열번호 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xiv) 서열번호 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 84의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xv) 서열번호 38의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 85의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xvi) 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 86의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xvii) 서열번호 40의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 87의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xviii) 서열번호 127의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 135의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xix) 서열번호 143의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 150의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
(xx) 서열번호 157의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 164의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함하는, 항원 결합 분자.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 인간 HER3 및 마우스 HER3, 랫트 HER3 및 시노몰구스 마카퀴 HER3 중 하나 이상에 결합할 수 있는, 항원 결합 분자.
23. (i) 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 및 (ii) HER3 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 포함하는 선택적으로 단리된 항원 결합 분자.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 세포 표면에 HER3을 발현하는 세포에 결합할 수 있는 항원 결합 분자.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 HER3-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항원 결합 분자.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 Fc 영역을 포함하고, Fc 영역은 (i) 위치 242에 해당하는 위치의 C, 및 위치 334에 해당하는 위치의 C, 및 (ii) 위치 236에 해당하는 위치의 A, 위치 239에 해당하는 위치의 D, 위치 332에 해당하는 위치의 E, 위치 330에 해당하는 위치의 L, 위치 345에 해당하는 위치의 K, 및 위치 430에 해당하는 위치의 G 중 하나 이상을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 항원 결합 분자.
27. 제26항에 있어서, Fc 영역은 위치 242에 해당하는 위치의 C, 위치 334에 해당하는 위치의 C, 위치 236에 해당하는 위치의 A, 위치 239에 해당하는 위치의 D, 위치 332에 해당하는 위치의 E, 및 위치 330에 해당하는 위치의 L을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 항원 결합 분자.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR).
29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제28항에 따른 CAR을 인코딩하는 선택적으로 단리된 핵산 또는 다수의 핵산.
30. 제29항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터.
31. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제28항에 따른 CAR, 제29항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산 또는 제30항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포.
32. 핵산(들) 또는 발현 벡터(들)로부터의 항원 결합 분자 또는 CAR의 발현에 적합한 조건 하에 제29항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산 또는 제30항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
33. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제28항에 따른 CAR, 제29항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제30항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터 또는 제31항에 따른 세포를 포함하는 조성물.
34. 의학적 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제28항에 따른 CAR, 제29항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제30항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제31항에 따른 세포 또는 제33항에 따른 조성물.
35. 암의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제28항에 따른 CAR, 제29항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제30항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제31항에 따른 세포 또는 제33항에 따른 조성물.
36. 암의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제28항에 따른 CAR, 제29항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제30항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제31항에 따른 세포 또는 제33항에 따른 조성물의 용도.
37. 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제28항에 따른 CAR, 제29항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제30항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제31항에 따른 세포 또는 제33항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법.
38. 본 방법은 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 억제제의 투여를 추가로 포함하고, 선택적으로 EGFR 계열 구성원에 의해 매개되는 신호전달의 억제제는 HER2 및/또는 EGFR에 의해 매개되는 신호전달의 억제제인, 제34항 또는 제35항에 따른 사용하기 위한 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물, 제36항에 따른 용도 또는 제37항에 따른 방법.
39. 암은 EGFR 계열 구성원을 발현하는 세포를 포함하는 암, HER3을 발현하는 세포를 포함하는 암, 고형 종양, 유방암, 유방 암종, 유관 암종, 위암, 위 암종, 위 선암종, 결장직장암, 결장직장 암종, 결장직장 선암종, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종 (SCCHN), 폐암, 폐 선암종, 편평 세포 폐 암종, 난소암, 난소 암종, 난소 장액성 선암종, 신장암, 신세포 암종, 신장 투명 세포 암종, 신세포 선암종, 유두 신세포 암종, 췌장암, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁경부암, 자궁경부 편평 세포 암종, 피부암, 흑색종, 식도암, 식도 선암종, 간암, 간세포 암종, 담관암종, 자궁암, 자궁 체부 내막 암종, 갑상선암, 갑상선 암종, 갈색세포종, 부신경절종, 방광암, 방광 요로상피 암종, 전립선암, 전립선 선암종, 육종 및 흉선종으로부터 선택되는 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물, 용도 또는 방법.
40. HER3-매개 신호전달을 억제하는 방법으로서, HER3-발현 세포와 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
41. HER3-발현 세포의 수 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 본 방법은 HER3-발현 세포와 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
42. HER3에 결합된 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 포함하는 선택적으로 단리된 시험관내 복합체.
43. HER3을 포함하거나, 포함하는 것으로 추측되는 샘플과 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계, 및 항원 결합 분자와 HER3의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
44. HER3-표적화된 제제를 사용한 치료를 위해 대상체를 선택하거나 계층화하는 방법으로서, 본 방법은 시험관내에서, 대상체로부터의 샘플과 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계 및 항원 결합 분자와 HER3의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
45. 시험관내 또는 생체내 진단제 또는 예후제로서의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자의 용도.
46. 암을 검출하거나, 국재화하거나 영상화하는 방법에서의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자의 용도로서, 선택적으로 암은 EGFR 계열 구성원을 발현하는 세포를 포함하는 암, HER3을 발현하는 세포를 포함하는 암, 고형 종양, 유방암, 유방 암종, 유관 암종, 위암, 위 암종, 위 선암종, 결장직장암, 결장직장 암종, 결장직장 선암종, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종 (SCCHN), 폐암, 폐 선암종, 편평 세포 폐 암종, 난소암, 난소 암종, 난소 장액성 선암종, 신장암, 신세포 암종, 신장 투명 세포 암종, 신세포 선암종, 유두 신세포 암종, 췌장암, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁경부암, 자궁경부 편평 세포 암종, 피부암, 흑색종, 식도암, 식도 선암종, 간암, 간세포 암종, 담관암종, 자궁암, 자궁 체부 내막 암종, 갑상선암, 갑상선 암종, 갈색세포종, 부신경절종, 방광암, 방광 요로상피 암종, 전립선암, 전립선 선암종, 육종 및 흉선종으로부터 선택되는 용도.
본 발명은 이러한 조합이 명확하게 허용될 수 없거나 명백히 피해지는 경우를 제외하고는 기재된 실시형태 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용된 문단 제목은 조직화 목적만을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시형태 및 실시형태는 첨부된 도면을 참조로, 예로써 이제 나타낼 것이다. 추가의 실시형태 및 실시형태는 당해 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 본 내용에서 언급된 모든 문헌은 참조로 본 명세서에 포함된다.
후속되는 청구범위를 포함하는, 본 명세서 전반에 걸쳐서, 내용이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 기재된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함 뿐만 아니라, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 배제도 암시하는 것으로 이해될 것이다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "하나"("a", "an"), 및 "그"("the")는 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 범위는 본 명세서에서 "약" 하나의 특수 값, 및/또는 "약" 다른 특수 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현된 경우, 다른 실시형태는 하나의 특수한 값으로부터 및/또는 다른 특수한 값까지를 포함한다. 유사하게, 값을 근사치로 표현하는 경우, 선행사 "약"의 사용에 의해, 특수한 값이 다른 실시형태를 형성하는 것으로 이해될 것이다.
핵산 서열이 본 명세서에 개시된 경우, 이의 역 상보체가 또한 명백히 고려된다.
본 명세서에 기재된 방법은 바람직하게는 시험관내에서 수행될 수 있다. 용어 "시험관내"는 배양물 속에서 세포로 수행된 과정을 포함하는 것으로 의도되는 반면, 용어 "생체내"는 완전한 다-세포 유기체를 사용하여/상에서의 과정을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 원리를 기재하는 실시형태 및 실험은 첨부된 도면을 참조로 이제 논의될 것이다.
도 1a 및 도 1b. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-HER3 항체에 의한 세포의 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 (도 1a, 도 1b) 항-HER3 항체 클론 10D1 및 (도 1b) 항-HER3 항체 클론 LJM716에 의한 HEK293 세포 (HER3을 발현하지 않음) 또는 HEK293 HER3 과발현 세포 (HEK293 HER3 O/E)의 염색을 보여준다.
도 2a 및 도 2b. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-HER3 항체에 의한 세포의 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 (도 2a, 도 2b) 항-HER3 항체 클론 4-35-B2 및 (도 2b) 항-HER3 항체 클론 LJM716에 의한 HEK293 세포 (HER3을 발현하지 않음) 또는 HEK293 HER3 과발현 세포 (HEK293 HER3 O/E)의 염색을 보여준다.
도 3a 및 도 3b. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-HER3 항체에 의한 세포의 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 (도 3a, 도 3b) 항-HER3 항체 클론 4-35-B4 및 (도 3b) 항-HER3 항체 클론 LJM716에 의한 HEK293 세포 (HER3을 발현하지 않음) 또는 HEK293 HER3 과발현 세포 (HEK293 HER3 O/E)의 염색을 보여준다.
도 4. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-HER3 항체에 의한 세포의 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 항-HER3 항체 클론 10A6에 의한 HEK293 세포 (HER3을 발현하지 않음) 또는 HEK293 HER3 과발현 세포 (HEK293 HER3 O/E)의 염색을 보여준다.
도 5a 및 도 5b. (도 5a) 인간, 마우스, 랫트 및 시노몰구스 마카퀴 HER3, 및 (도 5b) 인간 EGFR 및 인간 HER2에 대한 항-HER3 항체 클론 10D1의 결합의 ELISA 분석의 결과를 보여주는 그래프. EC50 값이 제시된다.
도 6a 및 도 6b. 항-HER3 항체 클론 4-35-B2와 (도 6a) 인간, 마우스, 랫트 및 시노몰구스 마카퀴 HER3, 및 (도 6b) 인간 EGFR 및 인간 HER2의 결합의 ELISA 분석의 결과를 보여주는 그래프.
도 7a 및 도 7b. 항-HER3 항체 클론 4-35-B4와 (도 7a) 인간 HER3, 인간 EGFR 및 인간 HER2, 및 (도 7b) 인간, 마우스, 랫트 및 시노몰구스 마카퀴 HER3의 결합의 ELISA 분석의 결과를 보여주는 그래프.
도 8. 항-HER3 항체 클론 10D1과 인간 HER3의 결합 친화도 분석 결과를 보여주는 대표적인 센소그램 (sensorgram). Kon, Koff 및 KD이 제시된다.
도 9. 항-HER3 항체 클론 4-35-B2와 인간 HER3의 결합 친화도 분석 결과를 보여주는 대표적인 센소그램.
도 10. 항-HER3 항체 클론 4-35-B4와 인간 HER3의 결합 친화도 분석 결과를 보여주는 대표적인 센소그램.
도 11. 시차 주사 형광측정 분석에 의한 항-HER3 항체 클론 10D1의 안정성 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 12. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 재조합적으로 발현된 항-HER3 항체 클론 10D1의 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 13. SDS-PAGE 및 웨스턴블롯에 의한 항-HER3 항체 클론 10D1 발현의 분석 결과를 보여주는 이미지. 레인: M1 = TaKaRa 단백질 마커 Cat. No. 3452; M2 = GenScript 단백질 마커 Cat. No. M00521; 1 = 감소 조건; 2 = 비감소 조건; P = 양성 대조군: 인간 IgG1, 카파 (Sigma Cat. No. I5154). 웨스턴블롯의 경우, 사용된 1차 항체는 염소 항-인간 IgG-HRP (GenScript Cat No. A00166) 및 염소 항-인간 카파-HRP (SouterhnBiotech Cat No. 2060-05)이었다.
도 14a 및 도 14b. HER3에 대한 결합에 대해, 상이한 항-HER3 항체 클론 간의 경쟁 분석의 결과를 보여주는 대표적인 센소그램 및 표.
도 15. ELISA에 의해 측정되는 바와 같이 항-HER3 항체 클론 10D1에 의한 HER3 및 HER2 간의 상호작용의 억제 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 16a 및 도 16b. 상이한 암세포주에 의한 EGFR 단백질 계열 구성원 및 그의 리간드의 유전자 및 단백질 발현을 보여주는 표 및 히스토그램.
도 17. 포스포-웨스턴블롯에 의한 N87 및 FaDu 세포에서의 HER3 매개된 신호전달에 대한 항-HER3 항체 클론 10D1 처리의 효과 분석 결과를 보여주는 이미지. UN = 비처리; T = 항-HER3 항체 클론 10D1에 의한 처리.
도 18. 인단백질 항체 어레이 분석 키트를 사용한 FaDu 세포에서의 HER3 매개된 신호전달에 대한 항-HER3 항체 클론 10D1 처리의 효과 분석 결과를 보여주는 이미지 및 그래프. 비처리 = 비처리된 FaDu 세포; 처리 = 항-HER3 항체 클론 10D1에 의해 처리된 FaDu 세포.
도 19a 및 도 19b. 항-HER3 항체 클론 10D1의 존재 하의 인큐베이션 후, CCK8 분석에 의해 측정되는 바와 같은 소정의 세포주에 대한 비처리 대조군 조건 (100%)에 대비한 세포의 컨플루언스 퍼센트를 보여주는 그래프. (도 19a)는 N87 세포에서 획득된 결과를 보여주고, (도 19b)는 FaDu 세포에서 획득된 결과를 보여준다.
도 20. N87 세포주 유래 마우스 위 암종 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 10D1을 총 10회의 투여량 동안 500 μg/투여로 격주로 복강내 투여하였다. 동일한 부피의 PBS (비히클)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 21. N87 세포주 유래 마우스 위 암종 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 4-35-B2를 총 4회의 투여량 동안 11 mg/kg/투여로 격주로 복강내 투여하였다. 동일한 양의 이소형 대조군 항체 (이소형)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 22. SNU16 세포주 유래 마우스 위 암종 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 10D1을 총 9회의 투여량 동안 500 μg/투여로 격주로 복강내 투여하였다. 동일한 부피의 PBS (비히클)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 23. 두경부 편평 세포 암종의 FaDu 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 10D1을 총 4회의 투여량 동안 500 μg/투여로 매주 복강내 투여하였다. 동일한 부피의 PBS (비히클) 또는 동일한 투여량의 이소형 대조군 항체 (이소형)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 24. 두경부 편평 세포 암종의 FaDu 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 10D1을 총 8회의 투여량 동안 500 μg/투여로 격주로 복강내 투여하였다. 동일한 부피의 PBS (비히클)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 25. 난소 암종의 OvCAR8 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 10D1을 총 9회의 투여량 동안 500 μg/투여로 격주로 복강내 투여하였다. 동일한 부피의 PBS (비히클)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 26. 편평 폐 세포 암종의 HCC-95 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 10D1을 총 4회의 투여량 동안 500 μg/투여로 격주로 복강내 투여하였다. 동일한 부피의 PBS (비히클)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 27. 폐 선암종의 A549 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 10D1을 총 10회의 투여량 동안 500 μg/투여로 격주로 복강내 투여하였다. 동일한 부피의 PBS (비히클)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 28. 폐 선암종의 A549 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 4-35-B2를 총 4회의 투여량 동안 500 μg/투여로 격주로 복강내 투여하였다. 동일한 부피의 PBS (비히클)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 29. 신세포 암종의 ACHN 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프. 항-HER3 항체 클론 10D1을 총 7회의 투여량 동안 500 μg/투여로 격주로 복강내 투여하였다. 동일한 부피의 PBS (비히클)가 제공된 대조군 처리 그룹.
도 30. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-HER3 항체 클론 10D1_c89에 의한 세포 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 HEK293 세포 (HER3을 발현하지 않음) 또는 HEK293 HER3 과발현 세포 (HEK293 HER3 O/E)의 염색을 보여준다.
도 31. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-HER3 항체 클론 10D1_c90에 의한 세포 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 HEK293 세포 (HER3을 발현하지 않음) 또는 HEK293 HER3 과발현 세포 (HEK293 HER3 O/E)의 염색을 보여준다.
도 32. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-HER3 항체 클론 10D1_c91에 의한 세포 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 HEK293 세포 (HER3을 발현하지 않음) 또는 HEK293 HER3 과발현 세포 (HEK293 HER3 O/E)의 염색을 보여준다.
도 33a 및 도 33b. 항-HER3 항체 10D1 변이체 클론과 인간 HER3의 결합의 ELISA 분석의 결과를 보여주는 그래프. (도 33a)는 항-HER3 항체 클론 10D1 (10D1P로 지칭됨), 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78, 10D1_11B (v11b78L로 지칭됨), 10D1_c85, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c93, LJM716 및 hIgG (음성 대조군)의 결합을 보여준다. (도 33b)는 33A와 동일하나 클론 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91 및 LJM716만에 대한 데이터를 보여준다.
도 34a 및 도 34b. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 재조합적으로 발현된 항-HER3 항체 10D1 변이체 클론의 분석 결과를 보여주는 그래프. (도 34a)는 항-HER3 항체 클론 10D1_c93, 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78, 10D1_11B (C78 v11b로 지칭됨), 10D1_c85, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91 및 10D1_c93에 대한 결과를 보여준다. (도 34b)는 도 33a와 동일하나, 클론 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91 및 단독에 대한 데이터를 보여준다.
도 35a 내지 도 35c. 시차 주사 형광 측정 분석에 의한 항-HER3 항체 10D1 변이체 클론의 안정성 분석 결과를 보여주는 그래프. (도 35a)는 항-HER3 항체 클론 LJM716 (또한 엘겜투맙으로 지칭됨), 10D1 (10D1 (모체)로 지칭됨), 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77 및 10D1_c78에 대한 결과를 보여준다. (도 35b)는 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_11B (c78_V11B로 지칭됨), 10D1_c85 및 10D1_c85o1에 대한 결과를 보여준다. (도 35c)는 10D1_c90, 10D1_c91 및 10D1_c93에 대한 결과를 보여준다.
도 36a 내지 도 36m. 항-HER3 항체 10D1 변이체 클론과 인간 HER3의 친화도 분석 결과를 보여주는 대표적인 센소그램. Kon, Koff 및 KD가 제시된다. (도 36a)는 클론 10D1_c89에 대한 결과를 보여주고, (도 36b)는 클론 10D1_c90에 대한 결과를 보여주고, (도 36c)는 클론 10D1_c91에 대한 결과를 보여주고, (도 36d)는 클론 10D1_c11B에 대한 결과를 보여주고, (도 36e)는 클론 10D1_c85o2에 대한 결과를 보여주고, (도 36f)는 클론 10D1_c87에 대한 결과를 보여주고, (도 36g)는 클론 10D1_c93에 대한 결과를 보여주고, (도 36h)는 클론 10D1_c76에 대한 결과를 보여주고, (도 36i)는 클론 10D1_c77에 대한 결과를 보여주고, (도 36j)는 클론 10D1_c78에 대한 결과를 보여주고, (도 36k)는 클론 10D1_c75에 대한 결과를 보여주고, (도 36l)은 클론 10D1_c85에 대한 결과를 보여주고, (도 36m)은 클론 10D1_c85o1에 대한 결과를 보여준다.
도 37. 안전성 및 발생 가능성과 관련된 항-HER3 항체 10D1 변이체 클론의 특성을 요약하는 표.
도 38a 및 도 38b. CH2 영역에서 GASDALIE 및 LCKC 치환을 포함하는 Fc-변형 항-HER3 항체 클론 10D1의 생물층 간섭계 (도 38a) 및 열 안정성 (도 38b) 분석. (도 38a) BLI는 FcγRIIIa와 Fc-변형 항-HER3 항체 클론 10D1의 결합 친화도 분석 결과를 보여주는 대표적인 센소그램을 도시한다. Kon, Koff 및 KD가 제시된다.
도 39a 및 도 39b. FcγRIIIa와 (도 39a) 비Fc-변형 항-HER3 항체 클론 10D1 및 (도 39b) CH2 영역에 GASD 치환을 포함하는 Fc-변형 항-HER3 항체 클론 10D1의 결합 친화도 분석 결과를 보여주는 대표적인 센소그램. Kon, Koff 및 KD가 제시된다.
도 40. 시차 주사 형광측정 분석에 의한 항-HER3 항체 클론 10D1 GASD 변이체의 안정성 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 41a 및 도 41b. 침묵 변이체 N297Q, 이소형 변이체, 및 시중에서 구입 가능한 항체와 비교한 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB (GASDALIE-LCKC 변이체)의 마우스 및 인간 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 보여주는 표. ND = KD가 낮은 결합 친화도로 인해 측정되지 않음.
도 42a 및 도 42b. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-HER3 항체에 의한 세포의 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 (도 42a) 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 (도 42b) 항-HER3 항체 클론 10D1 및 LJM-716에 의한 HEK293 세포 (HER3을 발현하지 않음) 또는 HEK293 HER3 과발현 세포 (HEK293 HER3 O/E)의 염색을 보여준다.
도 43. 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA와 인간 EGFR (HER1) 및 인간 HER2의 결합의 ELISA 분석 결과를 보여주는 그래프. EC50 값이 제시된다.
도 44. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-HER3 및 항-HER4 항체에 의한 세포 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA, 항-HER3 항체 LJM-716 및 MM-121, 및 시판되는 항-HER4 항체에 의한 HEK293 HER4 과발현 세포의 염색을 보여준다.
도 45. 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA와 인간, 마우스, 랫트 및 시노몰구스 마카퀴 HER3의 결합의 ELISA 분석 결과를 보여주는 그래프. EC50 값이 제시된다.
도 46a 및 도 46b. 항-HER3 항체 클론 (도 46a) 10D1F.FcA 및 (도 46b) 10D1F.FcB와 인간 HER3의 결합 친화도 분석 결과를 보여주는 대표적인 센소그램. Kon, Koff 및 KD가 제시된다.
도 47a 및 도 47b. 시차 주사 형광측정 분석에 의한 항-HER3 항체 클론 (도 47a) 10D1F.FcA 및 (도 47b) 10D1F.FcB의 안정성 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 48a 및 도 48b. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 항-HER3 항체 클론 (도 48a) 10D1F.FcA 및 (도 48b) 10D1F.FcB의 순고 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 49a 및 도 49b. HER3에 대한 결합에 대해, 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 항-HER3 항체 M-05-74 및 M-08-11 간의 경쟁 분석의 결과를 보여주는 대표적인 센소그램 및 표.
도 50. 마우스에서 항-HER3 항체 클론 10D1의 약동학 분석 결과를 보여주는 그래프 및 표.
도 51a 내지 도 51f. 마우스에서 혈구 개수 (도 51a), 전해질 지표 (도 51b) 및 간독성, 신독성 및 췌장 독성 지표 (도 51c 내지 도 51f)에 대한 항-HER3 항체 클론 10D1 처리의 효과를 보여주는 그래프. 좌측 막대는 비히클 대조군을 나타내고, 우측 막대는 10D1 처리를 나타낸다. 점선은 Charles River 기준 범위의 끝점을 나타낸다. 간독성, 신독성 및 췌장 독성 지표에는 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 아스파테이트 트랜스아미나제 (AST), 혈액 요소 질소 (BUN), 크레아티닌 (CREA), 알칼리 포스파타제 (ALP), 글루모스 (GLU), 칼슘 (CAL), 총 빌리루빈 (BIL), 총 단백질 (TPR) 및 알부민 (ALB)이 포함된다.
도 52. ELISA에 의해 측정되는 바와 같이 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 항체 MM-121, LJM-716 및 Roche M05에 의한 HER3 및 HER2 간의 상호작용의 억제 분석 결과를 보여주는 그래프 및 표.
도 53. ELISA에 의해 측정되는 바와 같은 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 항체 MM-121 및 LJM716에 의한 EGFR 및 HER3 간의 상호작용의 억제 분석 결과를 보여주는 그래프 및 표.
도 54. 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA (10D1F.A), 10D1F.FcB (10D1F.B), 10D1F-hIgG1(N297Q) 및 항-HER3 항체 LJM-716 및 세리반투맙 (MM-121)이 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 유도하는 능력의 분석 결과를 보여주는 그래프 및 표. EC50 값이 제시된다.
도 55a 내지 도 55c. 포스포-웨스턴블롯에 의한 (도 55a) N87, (도 55b) FaDu 및 (도 55c) OvCar8 세포에서 HER3 매개 신호전달에 대한 항-HER3 항체 처리의 효과 분석 결과를 보여주는 이미지.
도 56a 및 도 56b. 마우스에서 항-HER3 항체 클론 (도 56a) 10D1F.FcA 및 (도 56b) 10D1F.FcB의 약동학 분석 결과를 보여주는 그래프 및 표. 매개변수: 최대 농도 (C max), Tmax, AUC (0-336hr), AUC (0 내지 무한대), 반감기 (t½), 제거율 (CL), 정상 상태의 분포 부피 (Vss).
도 57a 내지 도 57d. 랫트에서 (도 57a) 10 mg/kg, (도 57b) 25 mg/kg, (도 57c) 100 mg/kg 및 (도 57d) 250 mg/kg의 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB의 약동학 분석 결과를 보여주는 그래프 및 표. 매개변수: 최대 농도 (C max), Tmax, AUC (0-336hr), AUC (0 내지 무한대), 반감기 (t½), 제거율 (CL), 정상 상태의 분포 부피 (Vss).
도 58a 내지 도 58f. (도 58a, 도 58b) 적혈구 지표, (도 58c) 백혈구 지표, (도 58d) 간독성, (도 58e) 신장 및 췌장 지표, 및 (도 58f) 전해질 지표에 대한 200 ug (약 10 mg/kg), 500 ug (약 25 mg/kg), 2 mg (약 100 mg/kg) 또는 5 mg (약 250 mg/kg)의 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 또는 10D1F.FcB의 처리 효과를 보여주는 그래프.
도 59a 내지 도 59d. (도 59a 및 도 59b) 항-HER3 항체 세리반투맙 및 LJM-716 및 (도 59c 및 도 59d) EGFR 계열 요법 세툭시맙, 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 비교한 N87 세포 (위암), HCC95 세포 (폐암), FaDu 세포 (두경부암), SNU-16 세포 (위암), A549 세포 (폐암), OvCar8 세포 (난소암), ACHN 세포 (신장암) 및 HT29 세포 (결장직장암)를 사용한 시험관내 마우스 암 모델에서 종양 억제 백분율에 대한 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA의 처리 효과를 보여주는 그래프.
도 60. 6주 동안 소정의 농도의 항체로의 격주 처리 후 폐 선암종의 A549 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프 (n=6, 비히클 대조군 n=8). 항체 투여는 x축에 삼각형으로 표시된다.
도 61. 6주 동안 소정의 농도의 항체로의 매주 처리 후 두경부 편평 세포 암종의 FaDu 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프 (n=6). 항체 투여는 x축에 삼각형으로 표시된다.
도 62. 6주 동안 소정의 농도의 항체로의 매주 처리 후 난소 암종의 OvCAR8 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프 (n=6). 항체 투여는 x축에 삼각형으로 표시된다.
도 63a 내지 도 63d. 시험관내 인산화 분석에서 10D1F.FcA, LJM-716 또는 세리반투맙으로 처리된 암 세포주에 대한 유전자 세트 다량화 분석에 의한 경로 활성화 분석 결과를 보여주는 박스 플롯. 도 63a는 N87 세포로부터 획득된 결과를 보여주고, 도 63b는 A549 세포로부터 획득된 결과를 보여주고, 도 63c는 OvCar8 세포로부터 획득된 결과를 보여주고, 63d는 FaDu 세포로부터 획득된 결과를 보여준다.
도 64. 소정의 시점에서 포스포-웨스턴블롯에 의한 A549 세포에서 HER3 매개 신호전달에 대한 항-HER3 항체 처리의 효과 분석 결과를 보여주는 이미지.
도 65. PathHunter 퍼투주맙 Bioassay에 의해 측정되는 바와 같은 10D1F.FcA 또는 퍼투주맙에 의한 HER2:HER3 상호작용의 억제 분석 결과를 보여주는 그래프. IC50 (M) 값이 제시된다.
도 66a 내지 도 66c. (도 66a) BCPAP (도 66b) BHT101 및 (도 66c) SW1736 세포에 의한 EGFR, HER2 및 HER3의 발현 분석 결과를 보여주는 히스토그램. 1 = 비염색 세포, 2 = 이소형 대조군, 3 = 세툭시맙, 4 = 트라스투주맙, 및 5 = 10D1F.FcA.
도 67a 내지 도 67c. 상이한 항-ErbB 항체가 시험관내에서 BRAFV600E 돌연변이 갑상선 암 세포주의 증식을 억제하는 능력의 분석 결과를 보여주는 그래프. 도 67a는 BHT101 세포에서 획득된 결과를 보여주고, 687은 BCPAP 세포에서 획득된 결과를 보여주고, 도 67c는 SW1736 세포에서 획득된 결과를 보여준다.
도 68a 내지 도 68c. 10D1F.FcA 단독 또는 베무라페닙과의 조합이 시험관내에서 BRAFV600E 돌연변이 갑상선 암 세포주의 증식을 억제하는 능력의 분석 결과를 보여주는 그래프. 도 68a는 BHT101 세포에서 획득된 결과를 보여주고, 도 68b는 SW1736 세포에서 획득된 결과를 보여주고, 도 68c는 BCPAP 세포에서 획득된 결과를 보여준다.
도 69a 내지 도 69c. 10 mg/kg, 25 mg/kg, 100 mg/kg 또는 250 mg/kg의 10D1F.FcA 또는 동일한 부피의 PBS의 투여 후 BALB/c 마우스의 대표적인 혈액 프로파일을 보여주는 표. 도 69a는 적혈구 구획의 분석 결과를 보여주고, 69b는 백혈구 구획의 분석 결과를 보여주고, 도 69c는 간, 신장 및 췌장 기능의 상관관계 및 전해질의 수준의 분석 결과를 보여준다. RBC = 적혈구, MVC = 평균 적혈구 부피, MCH = 평균 적혈구 헤모글로빈, MCHC = 평균 적혈구 헤모글로빈 농도, WBC = 백혈구, ALT = 알라닌 아미노트랜스퍼라제, ALP = 알칼리 포스파타제, CREA = 크레아티닌, BUN = 혈중 요소 질소, GLU = 글루카곤, AMY = 아밀라제, NA = 나트륨, K = 칼륨, P = 인 및 CA = 칼슘.
도 70a 내지 도 70c. 250 mg/kg 10D1F.FcA 또는 동일한 부피의 PBS의 투여 후 소정의 시점에서 SD 랫트의 대죠적인 혈액 프로파일을 보여주는 표. 도 70a는 적혈구 구획의 분석 결과를 보여주고, 도 70b는 백혈구 구획의 분석 결과를 보여주고, 도 70c는 간, 신장 및 췌장 기능의 상관관계 및 전해질의 수준의 분석 결과를 보여준다. RBC = 적혈구, MVC = 평균 적혈구 부피, MCH = 평균 적혈구 헤모글로빈, MCHC = 평균 적혈구 헤모글로빈 농도, WBC = 백혈구, ALT = 알라닌 아미노트랜스퍼라제, ALP = 알칼리 포스파타제, CREA = 크레아티닌, BUN = 혈중 요소 질소, GLU = 글루카곤, AMY = 아밀라제, NA = 나트륨, K = 칼륨, P = 인 및 CA = 칼슘.
도 71. 포스포-웨스턴블롯에 의해 측정되는 바와 같은 생체내에서 FaDu 또는 OvCar8 세포-유래 종양의 세포에서 HER3-매개 신호전달에 대한 10D1F.FcA 처리 효과 분석 결과를 보여주는 이미지.
도 72. 소정의 세포주에 의한 상이한 항-ErbB 항체의 내재화 분석 결과를 보여주는 박스 블롯
도 73a 및 도 73b. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 상이한 시점에서 소정의 세포주에 의한 10D1F.FcA 또는 트라스투주맙의 내재화 분석 결과를 보여주는 히스토그램 및 표. 도 73b는 도 73a에 나타낸 히스토그램으로부터 측정된 PE-양성 세포의 중앙값 형광 강도 및 백분율을 보여준다.
도 74. 6주 동안 소정의 농도의 소정의 항-ErbB 항체로 격주 처리한 후 위암의 N87 세포주 유래 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피 분석 결과를 보여주는 그래프 (n=6). 항체 투여는 x축에 삼각형으로 표시된다.
도 75a 및 도 75b. 10D1F.FcA를 사용한 악성 및 정상 인간 조직의 면역조직화학 염색을 보여주는 이미지. 도 75a 및 도 75b는 상이한 조직의 염색을 보여준다.
도 76. 소정의 배율에서 10D1F 또는 토끼 다클론 항-HER3 항체에 의한 A549 종양 이종이식 동결 절편의 면역조직화학적 염색을 보여주는 이미지. 2차 단독 대조군 염색이 제시된다.
도 77a 및 도 77b. 25 mg/kg으로 마우스에 복강내 투여한 후 항체가 Cmax에 도달한 혈청 농도에서 소정의 암 세포주의 시험관내 증식을 억제하는 소정의 항-ErbB 항체의 능력 분석 결과를 보여주는 막대 차트. 도 77a 및 도 77b는 상이한 세포주를 사용하여 획득된 결과를 보여준다.
실시예
다음의 실시예에서, 본 발명자들은 HER3 분자에서 목적한 특이적인 영역에 대해 표적화된 신규한 항-HER3 항체 클론의 생성, 및 생물물리학적 및 기능적 특성화 및 이러한 항원-결합 분자의 치료학적 평가를 기술한다.
실시예 1: HER3 표적 설계 및 항-HER3 항체 하이브리도마 생성
본 발명자들은 HER3-결합 단일클론 항체를 생성시키기 위해 인간 HER3 (서열번호 9)의 세포외 영역 내의 2개의 영역을 선택하였다.
1.1 하이브리도마 생성
대략 6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 InVivos(싱가포르 소재)로부터 구입하였다. 동물을 특수한 무 병원체 조건 하에 가두고 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC) 가이드라인에 부합하게 처리하였다.
하이브리도마 생성을 위해, 항원 펩타이드, 재조합 표적 단백질 또는 표적 단백질을 발현하는 세포의 시판 혼합물로 마우스를 면역화시켰다.
융합을 위한 비장을 수거하기 전에, 마우스를 3일 연속일 동안 항원 혼합물로 부스트(boost)하였다. 최종 부스트 후 24시간 째에, 총 비장세포를 단리하고, 흑색종 세포주 P3X63.Ag8.653(ATCC, USA)와, PEG로 ClonaCell-HY 하이브리도마 클로닝 키트를 사용하여 제조업자의 기재서(Stemcell Technologies, 캐나다)에 따라 융합시켰다.
융합된 세포를 ClonaCell-HY 배지 C(StemCell Technologies, 캐나다 소재) 속에서 37℃에서 5% CO2 인큐베이션기 속에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 융합된 세포를 원심분리하고, 10 ml의 ClonaCell-HY 배지 C 속에 재현탁시킨 다음, HAT 구성성분을 함유하는 반고체 메틸셀룰로즈-기반 ClonaCell-HY 배지 D(StemCell Technologies, 캐나다 소재) 90 ml와 온화하게 혼합하였으며, 이는 하이브리도마 선택과 클로닝을 한 단계로 합한다.
융합된 세포를 이후에 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이션기 속에서 성장하도록 한다. 7 내지 10일 후에, 단일 하이브리도마 클론을 단리하고, 항체 생성 하이브리도마를 효소-연결된 면역흡착성 분석(ELISA) 및 형광성-활성화된 세포 분류(FACs)로 상청액을 스크리닝함으로써 선택하였다.
1.2 항체 가변 영역 증폭 및 서열분석
총 RNA를 하이브리도마세포로부터 TRIzol 시약(Life Technologies, Inc., USA)을 사용하여 제조업자의 프로토콜을 사용하여 추출하였다. 이중-가닥 cDNA를 SMARTer RACE 5'/3' 키트(Clontech™, USA)를 사용하여 제조업자의 기재서에 따라 합성하였다. 요약하면, 1 μg의 총 RNA를 사용하여 완전한 길이의 cDNA를 5'-RACE CDS 프라이머(키트내에서 제공됨)를 사용하여 생성시키고, 5' 어댑터(SMARTer II A 프라이머)를 이후에 각각의 cDNA 내로 제조업자의 기재서에 따라 혼입시켰다. cDNA 합성 반응은 다음을 함유하였다: 5X 제1-가닥 완충액, DTT(20 mM), dNTP 혼합물(10 mM), RNase 억제제(40 U/μl) 및 SMARTScribe 역박향 전사효소(100 U/μl).
혈통별-준비된(race-ready) cDNA를 SeqAmp DNA 폴리머라제(Clontech™, USA)를 사용하여 증폭시켰다. 증폭 반응물은 SeqAmp DNA 폴리머라제, 2X Seq AMP 완충액, 어댑터 서열에 대해 상보성인, 5' SMARTer Race 키트내에 제공된 5' 일반적인(universal) 프라이머, 및 각각의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 프라이머에 대해 어닐링(annealing)된 3' 프라이머를 함유하였다. 5' 불변 영역을 앞서 보고된 프라이머 혼합물을 기반으로 문헌[Krebber et al. J. Immunol. Methods 1997; 201: 35-55, Wang et al. Journal of Immunological Methods 2000, 233; 167-177 또는 Tiller et al. Journal of Immunological Methods 2009; 350:183-193]에 의해 설계하였다. 다음의 열 프로토콜을 사용하였다: 94℃에서 1분 동안의 예비-변성 주기; 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 45초 동안의 35회 주기; 및 72℃에서 3분 동안의 최종 연장.
대략 550 bp의 획득되는 VH 및 VL PCR 생성물을 pJET1.2/평활말단(blunt) 벡터 내로 CloneJET PCR 클로닝 키트(Cloning Kit)(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 클로닝하고, 매우 충분한(competent) E. 콜라이(E. coli) DH5α를 형질전환시키는데 사용하였다. 획득되는 형질전환체로부터, 플라스미드 DNA를 Miniprep 키트(Qiagene, 독일 소재)을 사용하여 제조하고, 서열분석하였다. DNA 서열분석은 AITbiotech가 수행하였다. 이러한 서열분석 데이타를 국제 IMGT(ImMunoGeneTics) 정보 시스템(문헌[LeFranc et al., Nucleic Res. (2015) 43(데이타베이스 쟁점): D413-22])을 사용하여 분석함으로써 개개 CDR 및 골격 서열을 특성화하였다. VH 및 VL의 5' 말단에서의 신호 펩타이드를 SignalP (v 4.1; 문헌[Nielsen, in Kihara, D (ed): Protein Function Prediction (Methods in Molecular Biology vol. 1611) 59-73, Springer 2017])으로 확인하였다.
4개의 단일클론 항-HER3 항체 클론을 추가의 발생을 위해 선택하였다: 10D1, 10A6, 4-35-B2, 및 4-35-B4.
상보성 결정 영역 (CDR)을 인간 항체 프레임워크 영역을 포함하는 VH 및 VL에 이식하고, 효모 디스플레이 방법에 의해 항원 결합에 대해 추가로 최적화하여 10D1의 인간화 버전을 인실리코로 설계하였다.
효모 디스플레이를 위해, 인간화 서열을 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 단일 사슬 단편 가변 (scFv) 형식으로 전환시키고, 무작위 돌연변이 유발에 의해 돌연변이 라이브러리를 생성하기 위한 주형으로 사용하였다. 그 후, 돌연변이 PCR 라이브러리를 선형화된 pCTcon2 벡터와 함께 효모로 전기천공하여 효모 라이브러리를 생성하였다. 라이브러리를 인간 HER3 항원으로 염색하고, 최고 결합제에 대해 분류하였다. 4 내지 5회의 분류 후, 개별 효모 클론을 서열분석하여 고유한 항체 서열을 확인하였다.
실시예 2: 항체 생성 및 정제
2.1 VH 및 VL의 발현 벡터 내로의 클로닝:
항-HER3 항체 클론의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 인간-마우스 키메라 항체의 작제를 위해 pmAbDZ_IgG1_CH 및 pmAbDZ_IgG1_CL (InvivoGen, USA) 진핵생물 발현 벡터로 서브클로닝 (subcloning)하였다.
대안적으로, 항-HER3 항체 클론의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 인간-마우스 키메라 항체의 작제를 위한 pFUSE-CHIg-hG1 및 pFUSE2ss-CLIg-hk(InvivoGen, USA) 진핵세포 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. pFUSE-CHIg-hG1에 의해 인코딩되는 인간 IgG1 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역(IGHG1; UniProt:P01857-1, v1; 서열번호 176)에 대해 CH3 영역내 치환 D356E, L358M(EU 번호매김에 따라 번호매김된 위치)를 포함한다. pFUSE2ss-CLIg-hk는 인간 IgG1 경쇄 카파 불변 영역(IGCK; UniProt: P01834-1, v2)을 인코딩한다.
신호 펩타이드를 따르는 가변 영역을 클로닝 벡터로부터 SeqAmp 효소(Clontech™, USA)를 사용하여 제조업자 프로토콜에 따라 증폭시켰다. VH 또는 VL내 적절한 영역과 15 내지 20bp 오버랩 및 제한 부위로서 5' 말단에서 6 bp를 갖는 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 사용하였다. DNA 삽입체 및 벡터를 제조업자가 추천한 제한 효소로 분해하여 백본이 도입되지 않도록 보증하고, 이의 각각의 플라스미드내로 T4 리가제 효소(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 연결시켰다. 3:1의 몰 비의 DNA 삽입체 대 벡터를 연결에 사용하였다.
2.2 포유류 세포내에서 항체의 발현
항체를 1) Expi293 일시적인 발현 시스템 키트(Transient Expression System 키트)(Life Technologies, USA), 또는 2) HEK293-6E 일시적인 발현 시스템(CNRC-NRC, Canada)을 사용하여 제조업자의 기재서에 따라 발현시켰다.
1) Expi293 일시적인 발현 시스템:
세포주 유지:
HEK293F 세포(Expi293F)를 Life Technologies, Inc(USA)로부터 획득하였다. 세포를 50 IU/ml 페니실린 및 50 μg/ml 스트렙토마이신(Gibco, USA)이 보충된 혈청-유리된, 단백질-유리된, 화학적으로 정의된 배지(Expi293 발현 배지, Thermo Fisher, USA) 속에서 37℃에서 8% CO2 및 80% 습윤화된, 진탕 플랫폼이 장착된 인큐베이션기 속에서 배양하였다.
형질감염:
Expi293F 세포를 발현 플라스미드로 ExpiFectamine 293 시약 키트(Reagent 키트)(Gibco, USA)를 사용하여 이의 제조업자의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 요약하면, 유지시 세포를 배지 교환에 적용시켜 배양물을 회전시켜 항생제를 제거하고, 세포 펠렛을 형질감염 1일 전에 항생제의 부재하에서 새로운 배지 속에 재-현탁시켰다. 형질감염일에, 2.5 x 106/ml의 생존가능한 세포를 각각의 형질감염을 위해 진탕기 플라스크내에 시딩(seeding)하였다. DNA-ExpiFectamine 복합체를 혈청-감소된 배지인, Opti-MEM(Gibco, USA) 속에서, 25분 동안 실온에서 형성시킨 후 세포에 가하였다. 인핸서를 형질감염된 세포에 형질감염 후 16 내지 18 시간째에 가하였다. 동량의 배지를 형질감염 4일 후에 형질감염체에 채워 세포 응집을 방지하였다. 형질감염체를 7일째에 4000 x g에서 15분 동안 원심분리함으로써 수거하고, 0.22 μm 멸균 여과기 유닛(unit)을 통해 여과하였다.
2) HEK293-6E 일시적인 발현 시스템
세포주 유지:
HEK293-6E 세포를 National Research Council Canada로부터 구입하였다. 세포를 0.1% 콜리포(Kolliphor)-P188 및 4 mM L-글루타민(Gibco, USA) 및 25 μg/ml G-418가 보충된 혈청-유리된, 단백질-유리된, 화학적으로 정의된 Freestyle F17 배지(Invitrogen, USA) 속에서 37℃에서 5% CO2 및 80% 습윤화된, 진탕 플랫폼이 장착된 인큐베이션기 속에서 배양하였다.
형질감염:
HEK293-6E 세포를 발현 플라스미드로 PEIproTM(Polyplus, USA)을 사용하여 이의 제조업자의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 요약하면, 유지시 세포를 배지 교환에 적용시켜 원심분리로 항생제를 제거하고, 세포 펠렛을 항생제가 들어 있지 않은 신선한 배지로 형질감염 1일 전에 재-현탁시켰다. 형질감염 당일에, 1.5 내지 2 x 106개의 세포/ml의 생존가능한 세포를 각각의 형질감염을 위한 진탕기 플라스크 속에 시딩하였다. DNA 및 PEIproTM을 1:1의 비로 혼합하고, 복합체가 세포에 가하기 전 실온에서 5분 동안 F17 배지 속에서 형성하도록하였다. 0.5% (w/v)의 트립톤 N1을 형질전환체에 형질감염 후 24 내지 48시간 째에 가하였다. 형질전환체를 4000 x g에서 15분 동안 원심분리에 의해 6-7일째에 수거하고, 상청액을 0.22 μm 멸균 여과기 유닛을 통해 여과하였다.
세포를 다음의 폴리펩타이드의 조합을 인코딩하는 벡터로 형질감염시켰다:
2.3 항체 정제
친화도 정제, 완충액 교환 및 저장:
형질감염된 세포에 의해 배양 상청액내로 분비된 항체를 액체 크로마토그래피 시스템 AKTA Start(GE Healthcare, 영국 소재)을 사용하여 정제하였다. 구체적으로, 상청액을 HiTrap 단백질 G 컬럼(GE Healthcare, 영국 소재) 상에 5 ml/min의 결합 속도에서 로딩(loading)한 다음, 컬럼을 10개 컬럼 용적의 세척 완충액(20 mM 인산나트륨, pH 7.0)로 세척하였다. 결합된 mAb를 용출 완충액(0.1 M 글리신, pH 2.7)으로 용출시키고 용출제를 적절한 양의 중화 완충액(1 M 트리스, pH 9)를 함유하는 수집 튜브내로 분획화하였다. 정제된 mAb를 함유하는 중화된 용출 완충액를 PBS 내로 30K MWCO 단백질 농축제(Thermo Fisher, USA 소재) 또는 3.5K MWCO 투석 카세트(Thermo Fisher, USA)를 사용하여 교환하였다. 단일클론 항체를 0.22 μm 여과기를 통과시켜 멸균시키고, 등분(aliquoting)하고,-80℃에서 저장을 위해 순간 동결(snap-freezing)시켰다.
2.4 항체-순도 분석
크기 배제 크로마토그래피(SEC):
항체 순도를 PBS 구동 완충액 중에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 슈퍼덱스(Superdex) 200 10/30 GL 컬럼(GE Healthcare, 영국 소재)을 사용하여 AKTA Explorer 액체 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare, 영국 소재)을 사용하여 수행하였다. 500μl PBS pH 7.2 중 150μg의 항체를 실온에서 0.75ml/min의 유속으로 컬럼에 주입하였다. 단백질을 분자량에 따라 용출시켰다.
항-HER3 항체 클론 10D1 (실시예 2.2의 [1])에 대한 결과를 도 12에 나타낸다.
상이한 10D1 변이체 클론에서 획득된 결과는 도 34에 나타낸다.
나트륨-도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE):
항체 순도를 SDS-PAGE에 의해 환원 및 비-환원 조건 하에서 표준 방법에 따라 분석하였다. 요약하면, 4% 내지 20% TGX 단백질 겔(Bio-Rad, USA)을 사용하여 단백질을 Mini-Protean 전기영동 시스템(Bio-Rad, USA)을 사용하여 용해하였다. 비-환원 조건을 위해, 단백질 샘플을 2x 램믈리(Laemmli) 샘플 완충액(Bio-Rad, USA)와 혼합함으로써 변성시키고 95℃에서 5 내지 10분 동안 비등시킨 후 겔에 로딩시켰다. 환원 조건을 위해, 5%의 β-머캅토에탄올(βME), 또는 40 mM DTT(디티오트레이톨)을 함유하는 2x 샘플 완충액를 사용하였다. 전기영동을 150V의 고정 전압에서 1시간 동안 SDS 작동 완충액(25 mM 트리스, 192 mM 글리신, 1% SDS, pH 8.3) 속에서 수행하였다.
웨스턴블롯:
단백질 샘플 (30 μg)을 전술한 바와 같이 SDS-PAGE로 분획하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 그런 다음 막을 차단하고, 4℃에서 밤새 항체로 면역블롯팅하였다. PBS-Tween에서 3회 세척한 후 막을 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 화학발광 Pierce ECL 기질 웨스턴블롯 검출 시스템 (Thermo Scientific, USA) 및 오토래디오그래피 필름 (autoradiography film) (Kodak XAR 필름)에 대한 노출을 통해 결과를 시각화하였다.
검출에 사용된 1차 항체는 염소 항-인간 IgG-HRP (GenScript Cat No. A00166) 및 염소 항-인간 카파-HRP (SouterhnBiotech Cat No. 2060-05)이었다.
항-HER3 항체 클론 10D1 (실시예 2.2의 [1])에 대한 결과를 도 13에 나타낸다. 10D1는 고농도에서 쉽게 발현, 정제 및 처리되었다.
실시예 3: 생물물리적 특성화
3.1 유세포 분석에 의한 세포 표면 항원 결합 분석
야생형 HEK293 세포 (고 수준의 HER3를 발현하지 않음) 및 인간 HER3를 인코딩하는 벡터로 형질감염된 HEK293 세포 (즉, HEK 293 HER O/E 세포)의 세포를 4℃에서 1.5시간 동안 20 μg/ml의 항-HER3 항체 또는 이소형 대조군 항체와 함께 인큐베이션하였다. 항-HER3 항체 클론 LJM716 (예를 들어, 문헌[Garner et al., Cancer Res (2013) 73: 6024-6035]에 기재됨)를 양성 대조군으로 분석에 포함시켰다.
세포를 FACS 완충액(5mM EDTA 및 0.5% BSA가 들어 있는 PBS)로 3회 세척하고, FITC-접합된 항-FC 항체(Invitrogen, USA 소재) 속에서 40분 동안 2 내지 8℃에서 재현탁시켰다. 세포를 다시 세척하고, 유동 세포 분석을 위해 MACSQuant 10(Miltenyi Biotec, 독일 소재)을 사용하여 200 μL의 FACS 유동 완충액(5mM EDTA가 들어 있는 PBS) 속에 재현탁시켰다. 획득 후, 모든 미가공 데이타(raw data)를 Flowlogic 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 세포를 전방 및 양상 스캐터 프로파일(side scatter profile)을 사용하여 게이팅(gating)시키고, 양성 세포의 백분율을 천연 및 과발현 세포 집합에 대해 측정하였다.
결과는 도 1 내지 도 4 및 도 30 내지 도 32에 제시되어 있다. 항-HER3 항체는 높은 특이성으로 인간 HER3에 결합하는 것으로 나타났다. 10D1 및 LJM716은 인간 HER3-발현 세포에 대해 유사한 정도로 결합하는 것으로 나타났다.
3.2 항체 특이성 및 교차 반응성을 측정하기 위한 ELISA
ELISA를 사용하여 항체의 결합 특이성을 측정하였다. 항체를 인간 HER3 폴리펩타이드뿐만 아니라, HER3의 각각의 마우스, 랫트 및 원숭이 상동체 (Sino Biological Inc., 중국)에 대한 결합에 대해 분석하였다. 항체를 또한 인간 EGFR 및 인간 HER2 (Sino Biological Inc., 중국)에 결합하는 능력에 대해 분석하였다.
ELISA를 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히 말해서, 96-웰 플레이트 (Nunc, 덴마크)를 4℃에서 16시간 동안 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 0.1 μg/ml의 표적 폴리펩타이드로 코팅하였다. 실온에서 Tris 완충 식염수 (TBS) 중 1% BSA로 1시간 동안 차단한 후 항-HER3 항체를 일련 희석하여, 최고 농도 10μg/ml가 되도록 하고, 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 0.05% Tween 20 (TBS-T)을 포함하는 TBS로 3회 세척한 다음 HRP-접합 항-His 항체 (Life Technologies, Inc., USA)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 10분 동안 비색 검출 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (Turbo-TMB; Pierce, USA)으로 플레이트를 전개시켰다. 2M H2SO4로 반응을 정지시키고 450 nM에서 OD를 측정하였다.
ELISA의 결과는 도 5 내지 7 및 도 33에 제시되어 있다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 고농도의 항체에서도 인간 HER2 또는 인간 EGFR에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다 (도 5a). 항-HER3 항체 클론 10D1은 또한 마우스 HER3, 랫트 HER3 및 시노몰구스 마카퀴 HER3과 실질적인 교차 반응성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 5b).
항-HER3 항체 클론 4-35-B2는 인간 HER2 및 인간 EGFR에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 6a). 항-HER3 항체 클론 4-35-B2는 또한 마우스 HER3, 랫트 HER3 및 시노몰구스 마카퀴 HER3과 실질적인 교차 반응성을 나타냈다 (도 6b).
항-HER3 항체 클론 4-35-B4는 인간 HER2 및 인간 EGFR에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 7a). 항-HER3 항체 클론 4-35-B4는 또한 마우스 HER3, 랫트 HER3 및 시노몰구스 마카퀴 HER3과 실질적인 교차 반응성을 나타냈다 (도 7b).
모든 10D1 변이체는 인간 HER3에 결합하는 것으로 나타났다 (도 33a 및 도 33b).
3.3 Octet QK384 시스템을 사용한 전반적인 친화도 연구
IgG1 형식의 항-HER3 항체 클론을 인간 HER3에 대한 결합 친화도에 대해 분석하였다.
생물층 간섭계 (BLI) 실험을 Octet QK384 시스템 (ForteBio)을 사용하여 수행하였다. 항-인간 IgG 포획 (AHC) Octet 센서 팁 (Pall ForteBio, USA)을 항-HER3 항체 (25 nM)에 사용하였다. 모든 측정을 1000 rpm에서 교반하면서 25℃에서 수행하였다. His-태그 인간 HER3 항원을 120초 동안 상이한 농도로 로딩하여 항원 결합에 대한 동적 측정을 수행한 다음, 바이오센서를 웰을 포함하는 분석 완충액으로 옮겨 120초 해리 시간을 가하였다. 완충액 효과에 대해 센소그램을 참조한 다음, Octet QK384 사용자 소프트웨어 (Pall ForteBio, USA)를 사용하여 근사 (fitting)시켰다. 결합 (Kon), 해리 (Koff) 속도 상수 및 평형 해리 상수 (KD)에 대한 값을 획득하기 위해 하나의 부위 결합 모델을 사용하여 동적 반응을 전반적인 근사에 적용하였다. 소프트웨어 (R2>0.90)에 의해 안정적으로 근사될 수 있는 곡선만을 분석에 포함시켰다.
클론 10D1의 분석에 대한 대표적인 센소그램이 도 8에 제시되어 있다. 클론 10D1은 KD = 9.58 nM의 친화도로 인간 HER3에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
인간화/최적화된 10D1 변이체는 매우 높은 친화도로 인간 HER3에 결합한다. 대표적인 센소그램이 도 36a 내지 36m에 도시되어 있다.
10D1 클론 변이체에 대해 측정된 친화도는 다음과 같다:
클론 4-35-B2는 인간 HER3에 대해 결합하는 것으로 나타났고, 친화도 KD = 80.9 nM (도 9)이고, 클론 4-35-B4는 인간 HER3에 결합하는 것으로 나타났으며, 친화도 KD = 50.3 nM (도 10)이었다.
3.4 시차 주사 형광 측정에 의한 열 안정성 분석
간략히 말하면, 0.2 mg/mL의 항체와 SYPRO Orange 염료 (ThermoFisher)의 3중 반복 실험 반응 혼합물을 25μL의 PBS에서 제조하고, MicroAmp Optical 96-웰 반응 플레이트 (ThermoFisher)의 웰로 옮기고, MicroAmp Optical 접착 필름 (ThermoFisher)으로 밀봉하였다. TAMRA를 리포터로 선택하고, ROX를 수동 참조로 선택하여 7500 고속 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)에서 용해 곡선을 작성하였다. 열 프로파일에는 25℃에서 2분의 초기 단계와 99℃에서 2분의 최종 단계가 포함되었으며, 램프 속도는 1.2%였다. 미가공 데이터의 제1 유도체를 온도 함수로 그래프화하여, 변화율 용해 곡선을 획득하였다. 항체의 용해 온도 (Tm)를 유도체 곡선의 피크로부터 추출하였다.
항체 클론 10D1의 열 안정성에 대한 시차 주사 형광 측정 분석을 위해 획득된 미가공 데이터의 제1 유도체를 도 11에 나타낸다. 3개의 상이한 항체 샘플을 분석하였다. Tm은 70.3℃인 것으로 측정되었다.
또한 10D1 변이체 클론 및 LJM716에 대해 분석을 수행하였다. 미가공 데이터의 제1 유도체와 측정된 Tm을 도 35a 내지 도 35c에 나타낸다.
3.5 항-HER3 항체 10D1 에피토프 분석
항-HER3 항체 10D1을 분석하여 HER3에 대한 결합에 대해 항-HER3 항체 MM-121 및/또는 LJM-716과 경쟁하는지를 측정하였다. MM-121에 대한 에피토프를 HER3의 도메인 I에 매핑하였으며; 이는 NRG 리간드 결합 부위를 차단한다. LJM-716에 대한 에피토프를 도메인 II 및 IV에 분포된 입체형태 에피토프에 매핑하였으며, 이는 HER3을 불활성 입체형태로 잠근다.
생물층 간섭계 (BLI) 실험을 Octet QK384 시스템 (ForteBio)을 사용하여 수행하였다. 항-Penta-HIS (HIS1K) 코팅된 바이오센서 팁 (ForteBio, USA)을 사용하여 His 태그 인간 HER3를 포획하였다 (75 nM; 300 s). 포화 항체에 의한 결합을 검출한 다음 (400 nm; 600 s), 해리 단계 (120s) 후, 경쟁 항체와의 결합 검출 (300 nM; 300 s) 이후, 해리 단계 (120s)를 수행하였다. MM-121 항체의 가변 영역을 인간 IgG2 및 Ig카파 Fc 백본을 갖는 PDZ 벡터에 클로닝하였다. LJM-716 항체의 가변 영역을 인간 IgG1 및 Ig카파 Fc 백본을 갖는 PDZ 벡터에 클로닝하였다.
분석 결과는 도 14a 및 도 14b에 나타낸다. 항-HER3 항체는 HER3에 대한 결합에 대해 MM-121 및/또는 LJM-716과 경쟁하지 않는 것으로 밝혀졌다.
10D1은 MM-121 및/또는 LJM-716과는 별도의 위상적으로 원위의 HER3 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
10D1에 대한 에피토프를 전체 HER3 세포외 도메인을 포괄하는 것으로 중첩되는 15량체 아미노산을 사용하여 매핑하였다. 각각의 별개의 15량체를 C 및 N-말단에서 GS 링커에 의해 연장시키고, 384웰 플레이트에서 별개의 웰에 접합시키고, 플레이트를 0.1, 1, 10 및 100 ug/ml의 10D1 항체와 함께 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 다음, POD-접합 염소 항-인간 IgG와 함께 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로 POD 기질 용액을 웰에 20분 동안 첨가하였다. 결합 전 LI-COR Odyssey 촬영 시스템을 사용하여 425nm에서 화학발광을 측정하여 평가하고, PepSlide Analyzer 소프트웨어 패키지를 사용하여 정량화 및 분석을 수행하였다. 실험을 2중 반복 실험으로 수행하였다.
10D1 에피토프는 도메인 II에 위치한 HER3 이량체화 아암의 β-헤어핀 구조에 직접 위치하지 않고, 대신 β-헤어핀에 대해 N 말단에 이량체화 계면에 위치하는 것으로 밝혀졌다.
10D1 및 10D1 유래 클론이 결합하는 것으로 측정된 HER3의 부위는 인간 HER3의 아미노산 서열의 위치 218 내지 235에 해당하며 (예를 들어, 서열번호 1에 제시된 바와 같음); HER3의 이 영역에 대한 아미노산 서열은 서열번호 229에 제시되어 있다. 이 영역 내에 2개의 공통 결합 부위 모티프가 확인되었으며, 서열번호 230 및 231에 제시된다.
HER3의 이러한 위치에 대한 결합은 HER 계열 이종이량체화 및 그에 따른 하류 신호전달 경로를 방해하는 작용을 한다 (실시예 4 참조). 결합은 리간드 (NRG) 비의존적이다. 10D1 결합 부위는 개방 및 폐쇄 HER3 입체형태 둘 모두에 접근 가능한 용매이고, HER3 및 다른 HER 계열 구성원 간에 보존되지 않으며, 인간, 마우스, 랫트 및 원숭이 HER3 오르소로그 간에 100% 보존된다.
실시예 4: 기능적 특성화
4.1 HER2 및 HER3의 이량체화 억제
항-HER3 항체가 HER3 및 HER2의 이종이량체화를 억제하는 능력에 대해 분석하였다.
간단히 말해서, 96-웰 플레이트 (Nunc, 덴마크)를 PBS 중 0.1 μg/ml His-태그 HER2 단백질로 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 실온에서 PBS 중 1% BSA로 1시간 동안 차단한 후, 재조합 바이오티닐화된 인간 HER3 단백질을 상이한 농도의 항-HER3 항체 클론 10D1의 존재 하에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 3회 세척한 다음, HRP-접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 10분 동안 비색 검출 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (Turbo-TMB; Pierce, USA)으로 플레이트를 전개시켰다. 2M H2SO4로 반응을 정지시키고 450 nM에서 OD를 측정하였다.
결과는 도 15에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 클론 10D1은 투여량 의존적 방식으로 HER2와 HER3 사이의 상호작용을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
추가 실험에서, HER2:HER3 이량체화의 억제를 분석하였다.
추가 실험에서, 제조업체의 지침에 따라 PathHunter 퍼투주맙 Bioassay 키트 (DiscoverX)를 사용하여 HER2:HER3 이량체화의 억제를 평가하였다.
간단히 말하면, HER2 및 HER3 과발현 U2OS 세포를 1 ml의 예열된 CP5 배지를 사용하여 해동하고, 5,000개의 세포를 웰당 시딩하고, 4시간 동안 5% CO2 대기에서 37℃에서 배양하였다. 이어서 세포를 25 μg/ml에서 시작하여 8포인트 일련 희석된 10D1F.FcA 또는 퍼투주맙으로 처리하였다.
4시간 인큐베이션 후, 30 ng/ml의 헤레굴린-β2를 각 웰에 첨가하고, 세포를 추가로 16시간 동안 인큐베이션하였다. 10 μL의 PathHunter Bioassay 검출 시약 1을 웰에 첨가하고, 암소에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 40 μL PathHunter Bioassay 검출 시약 2를 첨가하고, 암소에서 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 Synergy4 Biotek을 사용하여 플레이트를 판독하였으며, 1초 지연되었다.
결과는 도 65에 제시되어 있다. 10D1F.FcA는 더 낮은 IC50에 의해 반영된 바와 같이 퍼투주맙보다 더 큰 효율로 HER2:HER3 이량체화를 억제하는 것으로 밝혀졌다.
4.2 분석에 대한 암 세포주의 확인
본 발명자들은 암 세포주에 의한 EGFR 단백질 계열 구성원의 발현을 특성화하고, 적절한 세포를 확인하여, HER3의 억제를 조사하였다.
도 16a는 암 세포주 백과사전 (CCLE; 문헌[Barretina et al., Nature (2012) 483: 603-607 and The Cancer Cell Line Encyclopedia Consortium & The Genomics of Drug Sensitivity in Cancer Consortium, Nature (2015) 528: 84-87])에 따라 N87, SNU16, HT29, FaDu, A549, HCC95, OvCAR8 및 AHCN 세포에 의한 mRNA 발현 데이터 EGFR 계열 구성원 및 리간드를 보여준다. 도 16a는 또한 FlowLogic에 의해 측정된 바와 같은 EGFR, HER2 및 HER3에 대한 단백질 발현 데이터를 보여준다.
실험에 사용된 세포주는 ATCC에서 구입하여 권장되는 대로 배양하였다. 간단히 말하면, 10% FBS 및 1% Pen/Strep이 보충된 소정의 세포 배양 배지에서 세포주를 유지시켰다. 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 배양된 세포를 96웰 플레이트에 적절한 시딩 밀도로 플레이팅하고: HT29, HCC95, FADU 및 OvCar8 세포를 2000 세포/웰로 시딩하고, NCl-N87 세포를 5000 세포/웰로 시딩하고, SNU-16, ACHN 및 세포를 1500개 세포/웰로 시딩하고, A549 세포를 1200 세포/웰로 시딩하였다.
도 16b는 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 EGFR, HER2 및 HER3의 표면 발현을 보여준다. 간단히 말해서, 500,000개의 세포를 0.5% BSA 및 2mM EDTA를 포함하는 염색 완충액에서 1차 항체 (20 μg/ml)와 함께 4℃에서 1.5시간 동안 염색하였다. 사용된 2차 항체는 4℃에서 20분 동안 10μg/ml의 항-인간 알렉사플루오르488이었다.
4.3 HER3-매개 신호전달의 억제
항-HER3 항체 10D1이 HER-3 매개 신호전달을 억제하는 능력에 대해 시험관내에서 분석하였다.
간단히 말하면, N87 및 FaDu 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% 혈청이 포함된 6웰 플레이트의 웰에 시딩하였다. 16시간 후, 세포를 1% FBS 세포 배양 배지에서 밤새 영양소 제한 배양하였다 (혈청에서 성장 인자에 의해 유발되는 신호전달을 감소시키기 위함). 다음날 세포를 50 μg/ml 항-HER3 항체 10D1로 4시간 동안 처리한 후 NRG (100 ng/ml)로 15분 자극하였다. 그런 다음 단백질을 추출하고, 표준 Bradford 단백질 분석을 사용하여 정량화하고, SDS-PAGE로 분획화하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이어서 막을 차단하고, 4℃에서 다음 항체 항-pHER3, 항-pAKT, pan 항-HER3, pan 항-AKT 및 항-베타-액틴으로 밤새 면역블롯팅하였다. 블롯을 Bio-Rad Clarity Western ECL 기질을 통해 시각화하고, 밴드를 밀도 측정 분석을 사용하여 정량화하고; 데이터를 베타 액틴 대조군으로 정규화하였다.
결과는 도 17에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 10D1은 HER3 인산화 및 하류 신호전달을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
추가 실험에서 본 발명자들은 HER3의 항-HER3 항체-매개 억제에 의해 영향을받는 세포내 신호전달 경로를 조사하였다.
FaDu 세포는 37℃, 5% CO2에서 10% 혈청이 포함된 6웰 플레이트의 웰에 시딩하였다. 16시간 후, 세포를 1% FBS 세포 배양 배지에서 밤새 영양소 제한 배양하였다. 다음날 세포를 50 μg/ml 항-HER3 항체 10D1로 4시간 동안 처리한 후 NRG (100 ng/ml)로 15분 자극하였다. 그런 다음 단백질을 추출하고 표준 Bradford 단백질 분석을 사용하여 정량화하고 4℃에서 사전 차단된 인단백질 항체 어레이 막 (Ray Biotech)으로 밤새 인큐베이션하였다. 막을 세척 완충액으로 세척하고 검출 항체 칵테일과 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 세척하고 HRP-접합된 항-IgG로 인큐베이션하였다. 2시간 후 막을 세척하고 키트 검출 완충액을 사용하여 프로빙하였다. Syngene Gbox 촬영 시스템으로 이미지를 촬영하고 각 점/인단백질의 강도를 측정하고 항체의 부재 하에 동일한 방식으로 처리된 세포에 대해 측정된 강도와 비교하여 억제 퍼센트를 계산하였다.
결과가 도 18에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 10D1은 PI3K/AKT/mTOR 및 MAPK 신호전달을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
추가 실험에서 본 발명자들은 HER3-발현 세포의 증식에 대한 항-HER3 항체 10D1 처리의 효과를 조사하였다.
간략히 말하면, N87 및 FaDu 세포를 100 μg/ml에서 시작하여, 9포인트 절반 로그 희석한 일련 희석된 농도의 항-HER3 항체 10D1로 처리하였다. 세포 증식을 제조업체의 지침에 따라 5일 후 CCK-8 증식 분석 (Dojindo, 일본)을 사용하여 측정하였다. 간단히 말하면, 1x CCK-8 용액을 각 웰에 첨가한 다음 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. OD를 450 nm에서 측정하였다.
도 19a 및 도 19b는 비처리 대조군 세포 대비 세포 컨플루언스 퍼센트를 보여준다 (데이터 점은 3개의 2중 반복 실험의 평균임).
항-HER3 항체 10D1은 N87 및 FaDu 세포에 의한 세포 증식의 투여량 의존적 억제를 나타냈다.
실시예 5: 생체내 분석
5.1 약동학적 분석
대략 6 내지 8주령의 암컷 NCr 누드 마우스를 특정 무 병원체 조건하에 수용하고, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침에 따라 처리하였다.
500μg의 항-HER3 항체를 투여하고, 기준선 (-2시간), 투여한지 0.5시간, 6시간, 24시간, 96시간, 168시간 및 336시간 후에 심장 천공에 의해 3마리 마우스로부터 혈액을 채혈하였다. 혈청 내 항체를 ELISA로 정량화하였다.
결과가 도 50에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 클론 10D1은 NCr 누드 마우스에서 16.3일의 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌다.
5.2 안전성 면역독성
항-HER3 항체 클론 10D1을 IMGT DomainGapAlign (문헌[Ehrenmann et al., Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010)]) 및 IEDB 탈면역화 (문헌[Dhanda et al., Immunology. (2018) 153(1):118-132]) 툴을 사용하여 안전성 및 면역원성에 대해 인실리코에서 분석하였다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 잠재적 면역원성 펩타이드의 수가 충분히 적어 안전한 것으로 고려되었으며, 잠재적인 발생 가능성 문제를 일으킬 수 있는 임의의 다른 특성을 보유하지 않았다.
도 37의 표는 안전성 및 발생 가능성과 관련된 10D1 변이체 클론의 특성에 대한 개요를 제공한다.
실시예 5.3에 기재된 실험에서 항-HER3 항체로 처리된 마우스를 중량 변화 및 육안 괴사 검사에 대해 모니터링하였다. 비히클 단독으로 처리된 마우스와 비교하여 이 마우스에서 차이가 검출되지 않았다.
6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스 (20 내지 25g)에 단일 투여량의 1000μg의 항-HER3 10D1 항체 또는 동일한 부피의 PBS를 복강내 주사한 실험에서 혈독성을 조사하였다. 혈액 샘플을 주사한지 96시간 후에 채혈하여 NA+, K+, 및 Cl-에 대한 전해질 지표 및 유세포 분석을 통해 상이한 유형의 백혈구의 수를 분석하였다.
도 51a 및 도 51b는 상이한 세포 유형의 수 및 전해질 지표가 Charles River 기준 범위 내에 있는 것으로 밝혀졌고 (3마리 마우스), PBS-처리된 그룹 (3마리 마우스)과 유의하게 차이가 없음을 보여준다. 좌측 막대는 비히클을 나타내고, 우측 막대는 10D1 처리, 점선으로 표시된 Charles River 기준 범위의 끝점을 나타낸다. 임상 징후, 육안 괴사 검사 또는 중량의 차이는 상이한 그룹간에 검출되지 않았다.
마우스를 또한 주사한지 96시간 후에 간독성, 신독성 및 췌장 독성의 상관관계에 대해 분석하였다. 단일 투여량의 1000μg의 항-HER3 항체의 투여 후 검출된 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 아스파테이트 트랜스아미나제 (AST), 혈중 요소 질소 (BUN), 크레아티닌 (CREA), 알칼리성 포스파타제 (ALP), 글루코스 (GLU), 칼슘 (CAL), 총 빌리루빈 (BIL), 총 단백질 (TPR) 및 알부민 (ALB)은 Charles River 기준 범위 내에 있으며, PBS 처리 그룹에서 이러한 마커의 수준과 유의하게 차이가 나지 않는 것으로 밝혀졌다. 이는 도 51c 내지 도 51f에 도시되어 있다. 좌측 막대는 비히클을 나타내고, 우측 막대는 10D1 처리, 점선으로 표시된 Charles River 기준 범위의 끝점을 나타낸다. 10D1 처리는 신장, 간 또는 췌장 지표에 영향을 미치지 않으므로, 정상적인 신장, 간 또는 췌장 기능에 영향을 미치지 않는다.
5.3 생체내 암 치료 효능 분석
대략 6 내지 8주령의 암컷 NCr 누드 마우스를 InVivos (Singapore)에서 구입하였다. 동물을 특정 무 병원체 조건하에 수용하고, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침에 따라 처리하였다.
사용된 세포주에는 N87 세포 (위암), FaDu 세포 (두경부암), OvCAR8 세포 (난소암), SNU16 세포 (위암), HT29 세포 (결장직장암), A549 세포 (폐암), HCC95 세포 (폐암) 및 AHCN 세포 (신장암)가 포함된다.
종양 부피를 디지털 캘리퍼를 사용하여 주 3회 측정하고, 공식 [L x W2/2]를 사용하여 계산하였다. 대조군 아암의 종양의 길이가 1.5 cm를 초과하는 것으로 측정되면 연구 종점에 도달한 것으로 간주하였다.
5.3.1 N87 모델
도 20은 항-HER3 항체 10D1 (실시예 2.2의 [1])의 항암 효과를 N87 세포주 유래 마우스 위 암종 모델에서 조사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 오른쪽 옆구리에 1 x 106개의 N87 세포를 피하 주사하여 모델을 확립하였다 (n = 6 마우스/처리 그룹).
10D1을 투여량당 500 μg으로 격주로 복강내 투여하고 (총 10회 투여량); 대조군 처리 그룹은 동일한 부피의 PBS가 제공되었다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 이 모델에서 매우 강력하고, 종양 성장을 약 76%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
도 21은 항-HER3 항체 클론 4-35-B4를 11 mg/kg의 투여량 (총 4회 투여량)으로 매주 복강내 투여한 유사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 항-HER3 항체 클론 4-35-B4는 이 모델에서 유사하게 매우 강력하고, 종양 성장을 약 60%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.3.2 SNU16 모델
도 22는 항-HER3 항체 10D1 (실시예 2.2의 [1])의 항암 효과를 SNU16 세포주 유래 마우스 위 암종 모델에서 조사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 오른쪽 옆구리에 1 x 106개의 SNU16 세포를 피하 주사함으로써 모델을 확립하였다 (n = 6 마우스/처리 그룹).
10D1을 투여량당 500 μg으로 격주로 복강내 투여하였고 (총 9회 투여량); 대조군 처리 그룹은 동일한 부피의 PBS가 제공되었다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 이 모델에서 매우 강력하고 종양 성장을 약 68%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.3.3 FaDu 모델
도 23은 항-HER3 항체 10D1 (실시예 2.2의 [1])의 항암 효과를 두경부 편평 세포 암종의 FaDu 세포주 유래 마우스 모델에서 조사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 암컷 NPG 마우스의 오른쪽 옆구리에 1 x 106개의 FaDu 세포를 피하 주사하여 모델을 확립하였다 (NOD scid 감마 표현형; n = 6 마우스/처리 그룹).
10D1을 투여량당 500μg (총 4회 투여량)으로 매주 복강내 투여하였다. 대조군 처리 그룹은 동일한 부피의 PBS 또는 동일한 투여량의 이소형 대조군 항체가 제공되었다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 이 모델에서 매우 강력하고 종양 성장을 약 85%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
도 24는 항-HER3 항체 10D1 (실시예 2.2의 [1])의 항암 효과를 두경부 편평 세포 암종의 FaDu 세포주 유래 마우스 모델에서 조사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 1 x 106개의 FaDu 세포를 피하 주사함으로써 모델을 확립하였다 (n = 6 마우스/처리 그룹).
10D1을 투여량당 500μg으로 격주로 복강내 투여하였고 (총 8회 투여량); 대조군 처리 그룹은 동일한 부피의 PBS가 제공되었다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 이 모델에서 매우 강력하고 종양 성장을 약 86%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.3.4 OvCAR8 모델
도 25는 항-HER3 항체 10D1 (실시예 2.2의 [1])의 항암 효과를 난소 암종의 OvCAR8 세포주 유래 마우스 모델에서 조사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 1 x 106개의 OvCAR8 세포를 피하 주사함으로써 모델을 확립하였다 (n = 6 마우스/처리 그룹).
10D1을 투여량당 500 μg으로 격주로 복강내 투여하고 (총 9회 투여량); 대조군 처리 그룹은 동일한 부피의 PBS가 제공되었다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 이 모델에서 매우 강력하고 종양 성장을 약 74%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.3.5 HCC-95 모델
도 26은 항-HER3 항체 10D1 (실시예 2.2의 [1])의 항암 효과를 편평 세포 폐 암종의 HCC-95 세포주 유래 마우스 모델에서 조사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 1 x 106개의 HCC-95 세포를 피하 주사함으로써 모델을 확립하였다 (n = 6 마우스/처리 그룹).
10D1을 투여량당 500 μg으로 격주로 복강내 투여하고 (총 9회 투여량); 대조군 처리 그룹은 동일한 부피의 PBS가 제공되었다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 이 모델에서 매우 강력하고 종양 성장을 약 90%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.3.6 A549 모델
도 27은 항-HER3 항체 10D1 (실시예 2.2의 [1])의 항암 효과를 폐 선암종의 A549 세포주 유래 마우스 모델에서 조사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 1 x 106개의 A549 세포를 피하 주사함으로써 모델을 확립하였다 (n = 6 마우스/처리 그룹).
10D1을 투여량당 500 μg으로 격주로 복강내 투여하고 (총 10회 투여량); 대조군 처리 그룹은 동일한 부피의 PBS가 제공되었다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 이 모델에서 매우 강력하고 종양 성장을 약 91%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
도 28은 암컷 NPG 마우스 (NOD scid 감마 표현형)의 오른쪽 옆구리에 1 x 106개의 A549 세포를 주사하여 확립된 A549 세포주 유래 모델에서 항-HER3 항체 클론 4-35-B2의 항암 효과를 조사한 유사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 항-HER3 항체 클론 4-35-B2를 투여량당 500μg으로 매주 복강내 투여하였다 (총 4회 투여량). 대조군 처리 그룹은 동일한 부피의 PBS가 제공되었다 (6 마우스/처리 그룹).
항-HER3 항체 클론 4-35-B2는 이 모델에서 유사하게 매우 강력하고 종양 성장을 약 63%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.3.6 ACHN 모델
도 29는 신세포 암종의 ACHN 세포주 유래 마우스 모델에서 항-HER3 항체 10D1 (실시예 2.2의 [1])의 항암 효과를 조사한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 1 x 106개의 ACHN 세포를 피하 주사함으로써 모델을 확립하였다 (n = 6 마우스/처리 그룹).
10D1을 투여량당 500 μg으로 격주로 복강내 투여하고 (총 7회 투여량); 대조군 처리 그룹은 동일한 부피의 PBS가 제공되었다.
항-HER3 항체 클론 10D1은 이 모델에서 매우 강력하고 종양 성장을 약 61%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.4 위 암종의 치료
제1 인체 실험
실패하였거나, 트라스투주맙이 제공될 수 없는 HER2+ 진행성 위암 환자를 안전 조정 '최소 예상 생물학적 효과 수준'(MABEL) 접근법에 따라 계산된 투여량의 10D1, 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92 및 10D1_c93으로부터 선택되는 항-HER3 항체의 정맥내 주사에 의해 처리한다. 투여 후 28일 동안 환자를 모니터링한다.
그런 다음, 환자를 이상사례 공통용어기준 (Common Terminology Criteria for Adverse Events) (CTCAE)에 따라 평가하여, 치료의 안전성 및 내성을 측정하고, 분자의 약동학을 측정한다.
항-HER3 항체에 의한 치료는 안전하고, 내성인 것으로 밝혀졌다.
투여량 증가-단일요법
실패하였거나, 트라스투주맙이 제공될 수 없는 HER2+ 진행성 위암 환자 12 내지 48명을 과투여량 제어 (EWOC) 투여량 증가를 통한 3+3 모델 기반 증가에 따라 10D1, 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92 및 10D1_c93 (예를 들어, 10D1_c89, 10D1_c90 또는 10D1_c91; 예를 들어, 10D1_c89)으로부터 선택되는 항-HER3 항체의 정맥내 주사에 의해 처리한다.
그런 다음 환자를 이상사례 공통용어기준 (CTCAE)에 따라 평가하여, 치료의 안전성 및 내성을 측정하고, 분자의 약동학 및 치료 효능을 평가한다. 최대 내성 투여량 (MTD) 및 최대 투여 투여량 (MAD)을 또한 측정한다.
투여량 증가-조합 요법
실패하였거나, 트라스투주맙이 제공될 수 없는 HER2+ 진행성 위암 환자 9 내지 18명을 트라스투주맙과 조합하여, 항-PD-L1 항체 (3 mg/kg)에 의한 3+3 모델 기반 증가에 따라 10D1, 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92 및 10D1_c93 (예를 들어, 10D1_c89, 10D1_c90 또는 10D1_c91; 예를 들어, 10D1_c89)으로부터 선택되는 항-HER3 항체의 정맥내 주사에 의해 처리한다.
그런 다음 환자를 이상사례 공통용어기준 (CTCAE)에 따라 평가하여, 치료의 안전성 및 내성을 측정하고, 분자의 약동학 및 치료 효능을 평가한다.
투여량 확장
최근 트라스투주맙이 실패하였고, 종양이 유전학 및 조직학적으로 잘 특성화된 HER2+ 진행성 위암 환자를 트라스투주맙, 시스플라틴, 및 5-FU 또는 카페시타빈과 조합하여, 10D1, 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92, 10D1_c93 (예를 들어, 10D1_c89, 10D1_c90 또는 10D1_c91; 예를 들어, 10D1_c89)으로부터 선택되는 항-HER3 항체로 처리한다.
항-HER3 항체는 암 세포의 수/비율을 감소시키고, 종양 세포 마커 발현을 감소시키고, 무 진행 생존을 증가시키고, 전체 생존을 증가시킬 수 있는 안전하고 내성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 6: 친화도 성숙 및 인간화 클론
모체 마우스 항체 10D1P의 가변 영역의 인간화를 CDR 이식에 의해 수행하였다. 인간 V 도메인 데이터베이스에 대해 모체 아미노산 서열을 블라스팅 (blasting)하고, 모체 서열에 대해 가장 높은 동일성을 갖는 유전자를 선택하여 이식을 위한 인간 프레임워크 서열을 확인하였다. 마우스 CDR을 선택된 인간 프레임워크에 이식할 때, 항원 결합을 보존하기 위해 프레임워크의 정규 위치의 잔기를 모체 마우스 서열로 역 돌연변이시켰다. 10D1P의 총 9개의 인간화 변이체를 설계하였다.
인간 HER3에 대한 친화도는 효모 디스플레이를 사용하여 2회 친화도 성숙에 의해 증가시켰다. 제1회에서, 9개의 설계된 변이체의 혼합 라이브러리를 무작위 돌연변이 유발에 의해 작제하고, 바이오티닐화된 항원을 사용하여 유세포 분석에 의해 스크리닝하였다. 제2회에서, 제1회에서 단리된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 클론을 주형으로 사용하여, 제2 라이브러리를 생성하고 스크리닝했다. 총 10개의 인간화 및 친화도 성숙된 클론을 단리하였다.
10D1P의 설계 및 단리된 인간화 변이체의 가변 영역에서 잠재적인 문제 (면역원성, 글리코실화 부위, 노출된 반응성 잔기, 응집 가능성)를 인실리코 예측 툴을 사용하여 평가했다. IEDB 탈면역화 툴을 사용하여 서열을 탈면역화시켰다. 10D1F의 최종 서열을 발생 가능성 특성뿐만 아니라, 시험관내 물리화학적 및 기능적 특성을 기반으로 최적화된 변이체 중에서 선택하였다.
클론 10D1F는 서열번호 36의 VH 및 서열번호 83의 VL을 포함한다. 10D1F는 인간 중쇄와 89.9% 상동성을 나타내고, 인간 경쇄와 85.3% 상동성을 나타낸다.
10D1F 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하고, 서열번호 206 및 207의 폴리펩타이드로 구성된 항원 결합 분자를 10D1F.FcA로 명명하였다 (또한 일부 경우 본 명세서에서 "10D1F.A" 또는 "항-HER3 클론 10D1_c89 IgG1"로 지칭됨-예를 들어, 실시예 2.2의 [16] 참조).
실시예 7: Fc 조작
10D1 및 10D1 변이체를 CH2 및/또는 CH3 영역에 돌연변이를 포함하도록 조작하여, 항체의 역가를 증가시키고, 예를 들어 Fc 효과기 기능을 최적화하고, 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC) 및/또는 항체-의존적 세포 식세포작용 (ADCP)을 향상시키고, 반감기를 개선시켰다.
클론 10D1 및 10D1F.FcA의 Fc 영역을 CH2 영역에 변형 'GASDALIE' (G236A, S239D, A330L, I332E) 및 'LCKC' (L242C, K334C)를 포함하도록 변형시켰다. GASDALIE 치환은 FcγRIIa (GA) 및 FcγRIIIa (SDALIE) 수용체에 대한 친화도를 증가시키고, ADCP 및 NK-매개 ADCC를 향상시키나 (실시예 8.8 참조), C1q (AL)에 대한 친화도를 감소시키고, CDC를 감소시키는 것으로 나타났다. LCKC 치환은 새로운 분자내 이황화물 가교를 생성함으로써, Fc 영역의 열 안정성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
GASDALIE 및 LCKC 돌연변이를 포함하는 10D1F.FcA 중쇄 폴리펩타이드의 변형된 버전은 서열번호 225에 제시되어 있다. 서열번호 225 및 207의 폴리펩타이드로 구성된 항원 결합 분자를 10D1F.FcB로 명명하였다 (또한 일부 경우 본 명세서에서 "10D1F.B"로 지칭됨).
CH2 영역에 GASDALIE 및 LCKC 치환을 포함하는 10D1의 변형된 버전을 제조하고, Fc 수용체 FcγRIIIa에 결합하는 그의 능력을 생물층 간섭계에 의해 분석하였다. G236A, S239D, A330L, I332E 및 L242C, K334C에 해당하는 치환 GASDALIE 및 LCKC를 포함하는 10D1 VH-CH1-CH2-CH3의 서열이 서열번호 227에 제시되어 있다.
간략히 말하면, 항-Penta-HIS (HIS1K) 코팅된 바이오센서 팁 (Pall ForteBio, USA)을 사용하여, His-태그 FcγRIIIa (V158) (270 nM)를 120초 동안 포획하였다. 모든 측정을 1000 rpm의 교반 하에 25℃에서 수행하였다. 항원 결합에 대한 결합 동적 측정을 60초 동안 상이한 농도 (500 nM 내지 15.6 nM)에서 항-HER3 항체를 인큐베이션한 다음, 바이오센서를 웰을 포함하는 분석 완충액 (pH 7.2)으로 옮김으로써 120초 해리 시간을 수행하였다. 완충 효과에 대해 센소그램을 참조한 다음, Octet QK384 사용자 소프트웨어 (Pall ForteBio, USA)를 사용하여 ㄱ근사시켰다. 결합 (Kon), 해리 (Koff) 속도 상수 및 평형 해리 상수 (KD)에 대한 값을 획득하기 위해 단일 부위 결합 모델을 사용하여 동적 반응을 전반적인 근사에 적용하였다. 소프트웨어 (R2 > 0.90)에 안정적으로 근사될 수 있는 곡선만을 분석에 포함시켰다.
변이체의 열 안정성을 또한 실시예 3.4에 기재된 바와 같이 시차 주사 형광 측정 분석에 의해 분석하였다.
도 38a 및 도 38b는 각각 GASDALIE 및 LCKC Fc 치환을 포함하는 10D1에 대한 BLI 분석 및 열 안정성 분석을 보여준다. Fc 조작된 10D1 변이체는 비 Fc 조작된 10D1 (도 39a 참조)과 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합이 유의하게 개선 (약 9배의 친화도 증가)된 것으로 나타났으며, 열 안정성은 60℃ 이상으로 유지되었다.
CH2 영역에서 GASD 치환을 포함하는 10D1에 대한 작제물을 또한 제조하였으며; G236A 및 S239D에 해당하는 치환을 포함하는 10D1 VH-CH1-CH2-CH3의 서열은 서열번호 228에 제시되어 있다.
항 HER3 항체 클론 10D1 (실시예 2.2의 [1]) 및 그 GASD 변이체의 친화도를 FcγRIIIa에 대한 결합 친화도에 대해 생물층 간섭계로 분석하였다. BLI를 상기에서 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 39a 및 도 39b는 대표적인 센소그램, Kon, Koff 및 KD 값을 보여준다. 예측된 바와 같이, 10D1 GASD 변이체 (도 39b)는 10D1 (도 39a)과 비교하여, FcγRIIIa에 대한 친화도가 극적으로 증가했다.
10D1 GASD 변이체의 열 안정성을 또한 실시예 3.4에 기재된 바와 같이 시차 주사 형광 측정 분석에 의해 분석하였다. 결과는 도 40에 제시되어 있다.
추가의 10D1F Fc 변이체
CH2 영역에 N297Q 치환을 포함하는 또 다른 항체 변이체를 생성하였다. N297Q 치환을 포함하는 10D1F VH-CH1-CH2-CH3의 대표적인 서열은 서열번호 226에 제시되어 있다. 이 '침묵 형태'는 Fc 영역의 N-연결 글리코실화와 Fcγ 수용체에 대한 Fc 결합을 둘 모두 억제하며, 이를 음성 대조군으로 사용한다.
도 41a 및 도 41b는 상기 기재된 바와 같이 측정된 인간 및 마우스 Fc 수용체에 대한 10D1F hIgG1 Fc 변이체 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB의 결합 친화도를 보여준다. 10D1F.FcB는 비 변형 10D1F.FcA 또는 시중에서 구입 가능한 항체와 비교하여 인간 및 마우스 Fcγ 및 FcRn 수용체에 대한 결합이 유의하게 개선된 것으로 밝혀졌다. ND = KD가 낮은 결합 친화도로 인해 측정되지 않음.
실시예 8: 인간화 및 변형된 클론의 특성화
8.1 유세포 분석에 의한 세포 표면 항원 결합 분석
야생형 (WT) HEK293 세포 (고 수준의 HER3을 발현하지 않음) 및 인간 HER3을 인코딩하는 벡터로 형질감염된 HEK293 세포 (즉, HEK293 HER O/E 세포)를 10 μg/ml의 인간화 항-HER3 항체 10D1F.FcA (10D1F), 항-HER3 항체 10D1 (10D1P) 또는 이소형 대조군 항체와 함께 4℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 항-HER3 항체 클론 LJM716 (예를 들어, 문헌[Garner et al., Cancer Res (2013) 73: 6024-6035, 및 실시예 3.5]에 기재됨)을 양성 대조군으로 분석에 포함시켰다.
세포를 완충액 (2mM EDTA 및 0.5% BSA가 포함된 PBS)으로 세척하고, 10μg/ml의 FITC-접합된 항-FC 항체 (Invitrogen, USA)에 4℃에서 20분 동안 재현탁시켰다. 세포를 다시 세척하고, MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec, 독일)을 사용한 유세포 분석에 대해 200 μL의 FACS 유동 완충액 (5mM EDTA가 포함된 PBS)에 재현탁시켰다. 비염색 WT 및 형질감염된 HEK293 세포를 음성 대조군으로 분석에 포함시켰다. 수집 후 모든 미가공 데이터를 Flowlogic 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 양성 세포의 전방 및 측면 스캐터 프로파일(side scatter profile) 백분율을 사용하여 세포를 게이팅 (gating)하였고 천연 및 과발현 세포 집합에 대해 측정하였다.
결과는 도 42a 및 도 42b에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 10D1F.FcA는 높은 특이성으로 인간 HER3에 결합하는 것으로 나타났다 (도 42a). 10D1F.FcA, 10D1P 및 LJM716은 인간 HER3 발현 세포에 유사한 정도로 결합하는 것으로 나타났다 (도 42b).
8.2 항체 특이성 및 교차 반응성을 측정하기 위한 ELISA
ELISA를 사용하여 10D1F.FcA 항체의 결합 특이성을 확인하였다. 항체를 인간 HER3 폴리펩타이드뿐만 아니라, 인간 HER1 (EGFR) 및 인간 HER2 (Sino Biological Inc., 중국)에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. 인간 IgG 이소형 및 비관련 항원을 음성 대조군으로 포함시켰다.
ELISA를 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 플레이트를 4℃에서 16시간 동안 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 0.1 μg/ml의 표적 폴리펩타이드로 코팅했다. 실온에서 Tris 완충 식염수 (TBS) 중 1% BSA로 1시간 동안 차단한 후, 항-HER3 항체를 최고 농도 10 μg/ml로 일련 희석하고 플레이트에 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 0.05% Tween 20 (TBS-T)을 함유하는 TBS로 3회 세척한 다음 HRP-접합 항-His 항체 (Life Technologies, Inc., USA)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 세척 후, 10분 동안 비색 검출 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (Turbo-TMB; Pierce, USA)으로 플레이트를 전개시켰다. 2M H2SO4로 반응을 정지시키고, 450 nM에서 OD를 측정하였다.
결과를 도 43에 나타낸다. 항-HER3 항체 10D1F.FcA는 고농도의 항체에서도 인간 HER2 또는 인간 HER1 (EGFR)에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다.
10D1F.FcA가 HER4에 결합하는 능력을 유세포 분석을 사용하여 분석하였다. 야생형 (WT) HEK293 세포 (고 수준의 HER4를 발현하지 않음) 및 인간 HER4를 인코딩하는 벡터로 형질감염된 HEK293 세포 (즉, HEK293 HER O/E 세포)를 10 μg/ml의 항-HER3 항체 10D1F.FcA (10D1F) 또는 이소형 대조군 항체 (음성 대조군)와 함께 4℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 실시예 3.5에 기재된 바와 같이 항-HER3 항체 클론 LJM716 (예를 들어, 문헌[Garner et al., Cancer Res (2013) 73: 6024-6035]에 기재됨) 및 MM-121 (세리반투맙)을 양성 대조군으로 분석에 포함시켰다. 또한 시판되는 항-HER4 항체 (Novus, Cat: FAB11311P)를 포함시켰다. 비염색 HEK293 세포를 음성 대조군으로 분석에 포함시켰다.
HEK293 세포를 4℃에서 1시간 동안 각 항체 10 μg/ml와 함께 인큐베이션하였다. 유세포 분석을 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 FITC-접합된 항-FC 항체 (Invitrogen, USA)와 접촉시켰다.
결과가 도 44에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 10D1F.FcA는 세포 표면 발현 HER4에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다.
또한, 항체 10D1F.FcA를 마우스, 랫트 및 원숭이로부터의 HER3 폴리펩티드 상동체 (Sino Biological Inc., 중국)에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. M. 무스쿨루스, R. 노르베지쿠스 및 M. 시노몰구스 HER3 상동체는 인간 HER3과 각각 91.1, 91.0 및 98.9% 서열 동일성을 공유하며, HER3 신호전달 경로는 4종 사이에서 보존된다.
ELISA를 상기와 같이 수행하였다.
결과는 도 45에 제시되어 있다. 10D1F.FcA 항체는 HER3 시노몰구스, 마우스, 랫트 및 인간 오르소로그에 높은 친화도로 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 종간에 실질적인 교차 반응성을 나타냈다.
8.3 Octet QK384 시스템을 사용한 전반적인 친화도 연구
항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB를 인간 HER3에 대한 결합 친화도에 대해 분석하였다.
생물층 간섭계 (BLI) 실험을 Octet QK384 시스템 (ForteBio)을 사용하여 수행하였다. 항체 (25 nM)를 항-인간 IgG 포획 (AHC) Octet 센서 팁 (Pall ForteBio, USA)에 코팅했다. 기준선 (60초), 로딩 (120초), 기준선 2 (60초), 결합 (120초), 해리 (FcA 120초, FcB 600초) 및 재생 (15초) 단계에서 적정된 HIS-태그 인간 HER3을 사용하여 결합을 검출하였다. 항원 농도는 도 46a 및 도 46b의 표에 제시되어 있다. 센소그램을 실시예 3.3에 기재된 바와 같이 분석하였다. 결합 (Kon), 해리 (Koff) 속도 상수 및 평형 해리 상수 (KD)에 대한 값을 획득하였다.
클론 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB의 분석을 위한 대표적인 센소그램이 도 46a 및 도 46b에 제시되어 있다. 10D1F.FcA는 KD = 72.6 pM의 높은 친화도로 인간 HER3에 결합한다 (도 46a). 10D1F.FcB는 KD = 22.2 pM의 높은 친화도로 인간 HER3에 결합한다 (도 46b).
8.4 시차 주사 형광 측정에 의한 열 안정성 분석
실시예 3.4에 기재된 바와 같이 항체 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB에 대해 시차 주사 형광 측정을 수행하였다.
항체 클론 10D1F.FcA의 열 안정성에 대한 시차 주사 형광 측정 분석에 대해 획득된 미가공 데이터의 제1 유도체는 도 47a에 제시된다. 3개의 상이한 항체 샘플을 분석하였으며, Tm은 70.0℃로 측정되었다.
항체 클론 10D1F.FcB의 열 안정성에 대한 시차 주사 형광 측정 분석에 대해 획득된 미가공 데이터의 제1 유도체는 도 47b에 제시되어 있다. 3개의 상이한 항체 샘플을 분석하였으며, Tm은 62.7℃로 측정되었다.
8.5 항체 순도 분석
항체 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB의 순도를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 분석하였다. 실온에서 500 μl PBS pH 7.2 중 150 μg의 10D1F.FcA 또는 500 μl PBS pH 7.45 중 150 μg의 10D1F.FcB를 각각 0.75 min/ml 또는 0.5 min/ml의 유속으로 PBS 구동 완충액의 Superdex 200 10/30 GL 컬럼에 주입하고, A280 유량을 기록하였다.
결과는 도 48a (10D1F.FcA) 및 도 48b (10D1F.FcB)에 제시되어 있다.
8.6 항-HER3 항체 10D1F.FcA 에피토프의 분석
항-HER3 항체 10D1F.FcA를 분석하여 HER3에 대한 결합에 대해 항-HER3 항체 M-05-74 또는 M-08-11 (Roche)과 경쟁하는지를 측정하였다. M-05-74 및 M-08-11의 에피토프는 둘 모두 도메인 II에 위치한 HER3 이량체화 아암의 β-헤어핀 구조에 매핑되었다. M-08-11은 HER4에 결합하지 않으며, M-05-74는 HER4 이량체화 아암을 인식한다. M-05-74 및 M-08-11의 HER3에 대한 결합은 리간드 (NRG) 비의존적이다.
BLI 실험을 실시예 3.5에 기재된 바와 같이 한 번의 변이로 수행하였으며; 400 nM의 경쟁 항체를 사용하였다. 인간 IgG1 및 Ig카파 Fc 백본을 갖는 PDZ 벡터에서 M-05-74 및 M-08-11 항체의 가변 영역을 클로닝하였다.
분석 결과는 도 49a 및 도 49b에 제시되어 있다. 항-HER3 10D1F.FcA 항체는 HER3에 대한 결합에 대해 M-05-74 또는 M-08-11과 경쟁하지 않는 것으로 밝혀졌다. 10D1F.FcA는 M-05-74 및 M-08-11과 비교하여 HER3의 별도의 위상적으로 원위의 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. HER3에 대한 10D1F.FcA의 결합은 리간드 (NRG) 비의존적이다.
결론:
인간 HER3에 대한 10D1F.FcA의 결합은 리간드 비의존적 방식으로 달성될 수 있다.
10D1F.FcA 결합 에피토프는 M-05-74 및 M-08-11의 에피토프와 별도의 위상적으로 원위에 위치한다.
8.7 HER2-HER3 및 EGFR-HER3의 이량체화 억제
항-HER3 항체 10D1F.FcA를 HER3 및 HER2의 이종이량체화를 억제하는 능력에 대해 분석하였다.
플레이트 기반 ELISA 이량체화 분석을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 플레이트를 1 μg/ml HER2-Fc 단백질로 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 플레이트를 상이한 농도의 후보 항체 10D1F.FcA, MM-121, LJM716, 퍼투주맙, Roche M05, Roche M08 또는 이소형 대조군 및 일정한 HER3 His 2 μg/ml 및 NRG 0.1 μg/ml로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 세척하고, 2차 항-HIS HRP 항체로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, TMB로 10분 동안 처리하고, 2M H2SO4 정지 용액을 사용하여 반응을 정지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
결과는 도 52에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA는 투여량 의존적 방식으로 HER2와 HER3 사이의 상호작용을 직접 억제하는 것으로 밝혀졌다.
다른 분석에서, 이량체화의 억제를 PathHunter® 퍼투주맙을 사용하여 검출하였다.
Bioassay 키트 (DiscoverX, San Francisco, USA). HER2 및 HER3 과발현 U20S 세포를 1 ml의 예열된 CP5 배지를 사용하여 해동하고, 5K 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 시딩하였다. 세포를 25 μg/ml로부터 시작하여, 8포인트 일련 희석된 일련 희석 농도의 10D1F.FcA, 세리반투맙 또는 퍼투주맙으로 처리하였다. 4시간 인큐베이션 후, 30 ng/ml의 헤레굴린-β2를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 16시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 10 μL PathHunter Bioassay 검출 시약 1을 첨가하고, 암소에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 40 μL PathHunter Bioassay 검출 시약 2를 첨가한 후, 암소에서 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 Synergy4 Biotek을 사용하여 판독하였으며, 1초 지연되었다.
10D1F.FcA는 HER2-HER3 이종이량체화의 억제에 대해 3.715e-11의 EC50 값을 갖는 것으로 밝혀졌다. 동일한 분석에서 세리반투맙/MM-121에 대한 비교 EC50 값은 6.788e-10이고, 퍼투주맙에 대한 비교 EC50 값은 2.481e-10인 것으로 확인되었다.
항-HER3 항체 10D1F.FcA가 EGFR 및 HER3의 이종이량체화를 억제하는 능력에 대해 분석하였다.
플레이트 기반 ELISA 이량체화 분석을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 플레이트를 1 μg/ml 인간 EGFR-His로 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 플레이트를 상이한 농도의 후보 항체 10D1F.FcA, MM-121, LJM716, 퍼투주맙 또는 이소형 대조군과 일정한 HER3-바이오틴 4 μg/ml 및 NRG 0.1 μg/ml로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 세척하고, 2차 항-아비딘 HRP 항체로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, TMB로 10분 동안 처리하고, 2M H2SO4 정지 용액을 사용하여 반응을 정지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
결과는 도 53에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA는 투여량 의존적 방식으로 EGFR과 HER3 간의 상호작용을 직접 억제하는 것으로 밝혀졌다.
8.8 ADCC 유도 능력 분석
항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB가 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유도하는 능력에 대해 분석하였다.
표적 세포 (HER3 과발현 HEK293)를 20,000 세포/웰의 밀도로 U-바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 10D1F.FcA, 10D1F.FcB, 10D1F.FcA_N297Q (침묵 form), LJM-716, 세리반투맙 (MM-121) 중 하나의 일련 희석 (50,000 ng/ml 내지 0.18 ng/ml)으로 처리하거나, 비처리 상태로 방치하고, 37℃ 및 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 효과기 세포 (인간 천연 사멸 세포주 No-GFP-CD16.NK-92; 176V)를 60,000 세포/웰의 밀도로 표적 세포를 포함하는 플레이트에 첨가하였다.
다음 대조군을 포함시켰다: 표적 세포 최대 LDH 방출 (표적 세포만), 자발적 방출 (표적 세포 및 항체 부재 효과기 세포), 백그라운드 (배양 배지만). 플레이트를 회전시키고, 37℃ 및 5% CO2에서 21시간 동안 인큐베이션하였다.
LDH 방출 분석 (Pierce LDH 세포독성 분석 키트): 분석 전에, 10 μl의 용해 완충액 (10X)를 표적 세포 최대 LDH 방출 대조군에 첨가하고, 20분 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 회전시키고, 50 μL의 상청액을 투명한 평 바닥 96웰 플레이트로 옮겼다. 기질을 함유하는 LDH 분석 혼합물 50 μl를 상청액에 첨가하여 반응을 개시시키고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 50μl의 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, BioTek Synergy HT 마이크로플레이트 판독기로 490 nm 및 680 nm에서 흡광도를 기록하였다.
데이터 분석을 위해, 시험 샘플로부터의 흡광도를 백그라운드 및 표적 세포 및 효과기 세포로부터 자발적으로 방출로 수정하였다. 시험 샘플의 세포독성 퍼센트를 표적 세포 최대 LDH 방출 대조군에 대한 상대값으로 계산하고, 항체 농도의 함수로 그래프화하였다.
결과는 도 54에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 10D1F.FcB는 투여량 의존적 방식으로 HER3 과발현 세포에 대해 강력한 ADCC 활성을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
8.9 HER3-매개 신호전달의 억제
항-HER3 항체 10D1F.FcA가 암 세포주에서 시험관내 HER-3 매개 신호전달을 억제하는 능력에 대해 분석하였다.
N87, FaDu 또는 OvCAR8 세포를 5% CO2로 37℃에서 밤새 10% 혈청이 포함된 6웰 플레이트의 웰에 시딩하였다. 세포를 0.2% FBS 배양 배지로 16시간 동안 영양소 제한 배양한 다음, 세포주에 해당하는 IC50에서 상이한 항체로 0.5시간 동안 처리하였다. 시험 항체는 10D1F.FcA (10D1), 세리반투맙 (SBT), 엘레겜투맙 (Elegemtumab) (LJM), 퍼투주맙 (PTM), 세툭시맙 (CTX), 및 트라스투주맙 (TZ)이었다.
수확하기 전에 세포를 100 ng/ml의 NRG1로 자극하였다. 세포주로부터 추출된 단백질을 표준 Bradford 단백질 분석을 사용하여 정량화하였다. 단백질 샘플 (50 μg)을 SDS-PAGE로 분획화하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 그런 다음 막을 차단하고 소정의 항체로 면역블롯팅하였다. 결과는 Bio-Rad Clarity Western ECL 기질을 통해 시각화하였다. 밀도 분석을 사용하여 블롯을 정량화하고, 데이터를 베타 액틴으로 정규화하였다.
결과는 도 55a 내지 도 55c에 도시되어 있다. 항-HER3 항체 10D1F.FcA는 N87 (55A), FaDu (55b), OvCar8 (55C) 및 A549 (55D) 세포주에서 HER3 인산화 및 하류 신호전달을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
N87 세포, A549 세포, OvCar8 세포 및 FaDu 세포를 사용한 실험의 경우, 항체 처리 16시간 후에 총 RNA를 추출하고, 분석하여, 유전자 세트 다량화 분석에 의한 주요 신호 도입 경로 단백질의 발현 수준을 기반으로 경로 활성화를 측정하였다.
분석 결과를 도 63a 내지 도 63d에 나타낸다. 10D1F.FcA는 하류 신호전달의 가장 효과적인 억제제였다.
A549 세포를 사용한 추가 실험에서, 세포를 0.5시간 또는 4시간 동안 상이한 항체로 처리한 것을 제외하고는 상기와 같이 시험관내 인산화 분석을 수행하였다. 결과는 도 64에 제시되어 있다.
실시예 9: 시험관내 및 생체내에서 인간화 및 변형된 클론의 분석
9.1 약동학적 분석
마우스
대략 6 내지 8주령의 암컷 NCr 누드 마우스를 특수한 무 병원체 조건 하에 수용하고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 처리하였다.
500 μg의 항-HER3 항체 10D1F.FcA 또는 10D1F.FcB를 투여하고, 기준선 (-2시간), 투여한지 6시간, 24시간, 96시간, 168시간 및 336시간 후에 심장 천공에 의해 4마리 마우스로부터 혈액을 채혈하였다. 혈청 내 항체를 ELISA로 정량화하였다.
약동학 분석에 대한 매개변수를 비구획화 모델로부터 도출하였다: 최대 농도 (C max), AUC (0-336hr), AUC (0 내지 무한대), 반감기 (t½), 제거율 (CL), 정상 상태의 분포 부피 (Vss).
결과는 도 56a 및 도 56b에 제시되어 있다. NCr 누드 마우스에서 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA는 253시간의 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌고 (도 56a), 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcB는 273시간의 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 56b).
랫트
10D1F 변이체를 분석하여 평균 중량이 320 g인 암컷 Sprague Dawley 랫트에서 단일 투여량 약동학적 프로파일을 측정하였다.
항체 클론 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB에 꼬리 정맥을 통한 저속 정맥내 주사에 의해 단일 투여량의 4 mg (약 10 mg/kg), 10 mg (약 25 mg/kg), 40 mg (약 100 mg/kg) 또는 100 mg (약 250 mg/kg)을 투여하였다. 비히클을 음성 대조군으로 투여하였다. 기준선 (-24시간), 투여한지 6시간, 24시간, 96시간, 168시간 및 336시간 후에 처리당 2마리의 랫트로부터 혈액을 채혈하였다. 혈청 내 항체를 ELISA로 정량화하였다.
약동학 분석에 대한 매개변수를 비구획화 모델로부터 도출하였다: 최대 농도 (C max), AUC (0-336hr), AUC (0 내지 무한대), 반감기 (t½), 제거율 (CL), 정상 상태의 분포 부피 (Vd).
결과는 도 57a (10 mg/kg), 도 57b (25 mg/kg), 도 57c (100 mg/kg) 및 도 57d (250 mg/kg)에 제시된다.
9.2 안전성 면역독성
10D1F.FcA 및 10D1F.FcB의 독성학적 효과를 분석하였다.
마우스
6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스 (20 내지 25 g)에 단일 투여량의 200 ug (약 10 mg/kg), 500 ug (약 25 mg/kg), 2 mg (약 100 mg/kg) 또는 5 mg (약 250 mg/kg) 중 하나의 투여량의 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB 또는 동일한 부피의 PBS를 복강내 주사하였다. 3마리의 마우스에 각각의 처리를 주사하고, 4마리의 마우스에 PBS 대조군을 주사하였다. 혈액 샘플을 주사 96시간 후에 채혈하여 RBC 지표 (총 RBC 수, 헤마토크리트, 헤모글로빈, 혈소판 개수, 평균 적혈구 부피, 평균 적혈구 헤모글로빈, 평균 적혈구 헤모글로빈 농도) 및 WBC 지표 (총 WBC 개수, 림프구 개수, 호중구 개수, 단핵구 개수)를 분석하였다. HM5 혈액 분석기를 사용하여 분석을 수행하였다.
결과는 도 58a, 도 58b (RBC 지표) 및 도 58c (WBC 지표)에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB는 RBC 지표에 영향을 미치지 않았지만, 더 높은 투여량 (10D1F.FcA 250 mg/kg, 10D1F.FcB 100 mg/kg, 10D1F.FcB 250 mg/kg)의 WBC 지표에는 영향을 미쳤다.
주사 96시간 후에 간독성, 신독성 및 췌장 독성을 또한 분석하였다. 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB는 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 알칼리 포스파타제, 알부민, 총 단백질 (간 지표; 도 58d), 크레아틴, 혈액 요소 질소, 글루코스 또는 아밀라제 (신장 및 췌장 지표; 도 58e)의 수준에 영향을 미치지 않았다. 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB는 전해질 지표인 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 인산염에 영향을 미치지 않았다 (도 58f).
10D1F.FcA 또는 10D1F.FcB로 처리된 마우스는 96시간 후 중량, 거동, 피부 상태, 구강 검사, 대변 및 소변 검사 또는 눈 검사에서 이상이 없었다. 더 높은 투여량: 10D1F.FcA 250 mg/kg, 10D1F.FcB 100 mg/kg, 10D1F.FcB 250 mg/kg으로 처리된 마우스에서 정상 크기의 약 1.5배의 비장 비대 (비장종대)가 관찰되었다.
500 μg (약 25 mg/kg) 10D1F.FcA 또는 10D1F.FcB의 반복 투여량의 독성학적 효과를 평가하기 위해 BALB/c 마우스에서 추가 연구를 수행하였다. 항체를 4주 동안 매주 1회 투여하였다. 혈액을 최초 투여 28일 후에 채혈하였다. 항체에 대한 RBC, 간, 신장, 췌장 또는 전해질 지표에는 영향이 관찰되지 않았고, 임상적 이상 징후가 없었으며, 육안 괴사 검사에서 차이가 발견되지 않았다. 총 WBC 개수, 림프구 개수 및 호중구 개수는 10D1F.FcA 또는 10D1F.FcB로 처리한 마우스에서 감소하는 것으로 관찰되었으나 독성으로 고려되지 않았다.
다른 연구에서, BALB/c 마우스에 단일 투여량의 10D1F.FcA 또는 동일한 부피의 PBS (비히클 대조군)를 투여하고, 336시간 후에 분석하였다. 대표적인 결과는 도 69a 내지 도 69c에 제시되어 있다.
랫트
6 내지 8주령 암컷 Sprague Dawley 랫트 (400 내지 450 g)에 단일 투여량의 4 mg (약 10 mg/kg), 10 mg (약 25 mg/kg), 40 mg (약 100 mg/kg), 100 mg (약 250 mg/kg) 중 하나의 투여량의 10D1F.FcA 또는 10D1F.FcB 항체를 복강내 주사하였다. 혈액을 -24시간, 6시간, 24시간, 96시간, 168시간 및 336시간째에 채혈하였다. 주사 후 최대 366시간까지는 RBC 지수에 영향을 미치지 않았고, WBC 지표에 독성 영향이 없었으며, 간, 신장, 췌장 또는 전해질 지표에 영향을 미치지 않았다. 임상적 이상 징후는 없었으며, 육안 검사에서 차이가 발견되지 않았다.
250 mg/kg 10D1F.FcA를 투여한 랫트에서 획득된 대표적인 결과를 도 70a 내지 도 70c에 나타낸다.
설치류 독성학 모델에서 독성 신호의 부재는 10D1 및 변이체에 대한 우수한 임상 안전성을 나타낸다.
9.3 시험관내 암 치료 효능 분석
항-HER3 항체 10D1F.FcA가 다수의 종양 모델: N87 세포 (위암), HCC95 세포 (폐암), FaDu 세포 (두경부암), SNU-16 세포 (위암), A549 세포 (폐암), OvCar8 세포 (난소암), ACHN 세포 (신장암) 및 HT29 세포 (결장직장암)에서 시험관내 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 분석하였다. 10D1F.FcA 효능을 다른 항-HER3 항체 세리반투맙 (MM-121) 및 LJM-716 및 기타 EGFR 계열 요법인 세툭시맙, 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 비교하였다.
세포를 1500 ug/ml에서 시작하여 9포인트 희석의 일련 희석된 농도의 치료 항체로 처리하였다. 세포 생존율을 처리 3 내지 5일 후에 CCK-8 세포 증식 분석을 사용하여 측정하였다. 제시된 세포 억제 백분율은 완충액 (PBS) 단독으로 처리된 세포에 대한 상대값이다. 데이터 포인트는 3회의 2중 반복 실험의 평균을 나타낸다.
결과는 도 59a 내지 도 59d에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 10D1F.FcA는 다른 HER3 항체 (도 59a 및 도 59b) 및 EGFR 계열 요법 (도 59c 및 도 59d)과 비교하여, 다발성 종양 모델에서 우수한 시험관내 종양 억제를 나타낸다.
도 77a 및 도 77b는 25 mg/kg의 관련 항체가 복강내 투여된 마우스에서 달성되는 Cmax 농도에서 시험관내 상이한 암 세포주의 증식을 억제하는 상이한 항-ErbB 항체의 능력을 보여준다. 10D1F.FcA는 다양한 상이한 암세포 유형의 성장을 억제하는 뛰어난 능력을 보여준다.
9.4 생체내 암 치료 효능 분석
항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB를 생체내 암 모델에서 종양 성장에 미치는 영향에 대해 평가하였다.
9.4.1 A549 모델
종양 세포를 암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 삽입하였다. 항체 (25 mg/kg 10D1F.FcA, 10D1F.FcB, 세툭시맙, LJM-716 또는 MM-121; n=6/각 처리) 또는 비히클 (n = 8)을 6주 동안 격주로 투여하였다.
결과가 도 60에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB는 둘 모두 A549 폐암 모델에서 강력한 효능을 나타냈다. 10D1F.FcB는 특히 강력한 것으로 밝혀져 종양이 퇴행하였다.
9.4.2 FaDu 모델
종양 세포를 암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 마트리겔 (matrigel )과 함께 피하 삽입하였다. 항체 (10 및 25 mg/kg 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB 또는 25 mg/kg의 세툭시맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, LJM-716 또는 MM-121; n=6/각 처리) 또는 비히클 (n = 6)을 6주 동안 매주 1회 투여하였다.
결과는 도 61에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA 및 10D1F.FcB는 둘 모두 두경부암의 FaDu 모델에서 종양 성장을 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
9.4.3 OvCar8 모델
암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 종양 세포를 마트리겔과 함께 피하 삽입하였다. 항체 (10 및 25 mg/kg 10D1F.FcA 또는 25 mg/kg 세툭시맙, LJM-716 또는 MM-121; n=6) 또는 비히클 (n=6)을 6주 동안 매주 1회 투여하였다.
결과는 도 62에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 클론 10D1F.FcA는 더 높은 투여량에서 종양 부피를 감소시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
9.4.4 N87 모델
암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 종양 세포를 마트리겔과 함께 피하 삽입하였다. 항체 (25 mg/kg 10D1F.FcA 또는 50 mg/kg의 트라스투주맙, LJM-716 또는 MM-121; n=6/각 처리) 또는 비히클 (n=6)을 6주 동안 격주로 투여하였다.
결과는 도 74에 제시되어 있다. 항-HER3 항체 10D1F.FcA는 위암의 N87 모델에서 종양 성장을 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 10: BRAFV600E 돌연변이 갑상선 암 세포주의 증식 억제 분석
다음 세포주를 조사하였다:
유세포 분석에 의해 EGFR 계열 구성원의 표면 발현에 대해 세포를 조사하였다. 간단히 말해서, 300,000개의 세포를 4℃에서 1시간 동안 20μg/ml의 10D1F.FcA, 세툭시맙 또는 트라스투주맙과 함께 인큐베이션하였다. 알렉사플루오르 (Alexafluor ) 488-접합 항-인간 항체 10 μg/ml를 2차 항체로 사용하였다 (4℃에서 40분).
결과는 도 66a 내지 도 66c에 도시되어 있다. SW1736, BHT101 및 BCPAP 세포는 EGFR, HER2 및 HER3을 발현하는 것으로 나타났다.
본 발명자들은 V600E BRAF 돌연변이를 보유하는 상이한 갑상선암 세포주의 시험관내 증식을 억제하는 상이한 HER3-결합 항체의 능력을 조사하였다.
간략히 말하면, 상이한 세포주의 세포를 1.5 x 105 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 다음날 1000 μg/ml에서 시작하여 10포인트 일련 희석된 10D1F.FcA, 세리반투맙, LJM-716, 퍼투주맙 또는 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 3일 후, CCK-8 세포 증식 분석을 사용하여 증식을 측정하였다. 증식 억제 퍼센트는 항체 대신에 동일한 부피의 PBS로 처리된 세포에 대한 상대값으로 계산하였다.
결과는 도 67a 내지 도 67c에 제시되어 있다. 10D1F.FcA는 분석된 임의의 다른 항-HER3 항체보다 BRAF V600E 돌연변이를 보유하는 세포주의 증식을 억제하는데 더 효과적인 것으로 밝혀졌다.
추가 실험에서, V600E BRAF 돌연변이를 보유하는 상이한 갑상선암 세포주의 시험관내 증식을 억제하는 10D1F.FcA 및 베무라페닙의 조합의 능력을 조사하였다.
세포를 1.5 x 105 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 다음날 200 nM 베무라페닙의 존재 또는 부재하에 1000 μg/ml로 시작하여 10포인트 일련 희석된 10D1F.FcA 또는 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 3일 후, CCK-8 세포 증식 분석을 사용하여 증식을 측정하였다. 증식 억제 퍼센트를 항체 대신에 동일한 부피의 PBS로 처리된 세포에 대한 상대값으로 계산하였다.
결과는 도 68a 내지 도 68c에 제시되어 있다. 10D1F.FcA는 베무라페닙에 감응성인 SW1736 및 BHT101 세포의 증식을 억제하는 베무라페닙의 능력을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 10D1F.FcA는 또한 베무라페닙 내성 BCPAP 세포 증식의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌다.
실시예 11: 생체내 HER3-매개 신호전달의 억제 분석
본 발명자들은 생체내에서 HER3-매개 신호전달을 억제하는 10D1F.FcA의 능력을 조사하였다.
이소성 이종이식 종양을 확립하기 위해 1 x 106개의 FaDu 또는 OvCar8 세포를 NCr 누드 마우스에 피하 도입하였다.
종양이 100 mm3 초과의 부피에 도달하면, 마우스를 25 mg/kg의 투여량의 10D1F.FcA 또는 동일한 부피의 비히클 (대조군)을 격주 복강내 주사에 의해 처리하였다. 4주 후 종양을 수확하였다. 실시예 4.3에 기재된 바와 같이 종양으로부터 단백질 추출물을 제조하고, Bradford 분석을 통해 정량화하고, 50 μg 샘플을 SDS-PAGE로 분획화하고, 항체를 사용하여 웨스턴블롯으로 분석하여, HER3 및 AKT의 생체내 인산화를 측정하였다.
결과는 도 71에 제시되어 있다. 10D1F.FcA는 생체내 종양 세포에서 HER3 및 AKT의 인산화를 억제하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 12: 항-HER3 항체의 내재화 분석
본 발명자들은 HER3-발현 세포에 의한 항-HER3 항체의 내재화를 조사했다.
요약하면, HER3, HCC95, N87 또는 OVCAR8 세포를 발현하도록 조작된 100,000개의 HEK293 세포를 96웰 조직 배양 플레이트의 웰에 시딩하고, 5% CO2에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 120 nM의 10D1F.FcA, LJM-716, 세리반투맙 또는 트라스투주맙, 및 360 nM의 pHrodo iFL Green 시약으로 처리하고, 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배양 세포를 각 웰의 4개의 상이한 필드에서 24시간 동안 30분마다 촬영하였다. 각 필드의 FITC 채널에서 최대 신호 강도를 24시간째에 정량화하였다.
결과가 도 72에 제시되어 있다. LJM-716 및 세리반투맙의 경미한 정도 내지 중간 정도의 내재화가 OvCar8 세포에서 관찰되었으며, 트라스투주맙의 중간 정도의 내재화가 N87 세포에서 관찰되었다.
HCC95, N87 또는 OvCar8 세포에서 10D1F.FcA의 유의한 내재화가 관찰되지 않았다.
예상대로, HER3을 과발현하는 HEK293 세포에서 10D1F.FcA, LJM-716 및 세리반투맙의 유의한 내재화가 관찰되었다.
추가 실험에서, 항체 내재화를 유세포 분석에 의해 조사하였다.
N87 세포를 96웰 조직 배양 플레이트의 웰에 50,000 세포/웰의 밀도로 시딩하고 밤새 부착시켰다 (37℃, 5% CO2). 10D1F.FcA 또는 트라스투주맙을 표지 시약과 혼합하고, 표지된 복합체를 세포에 첨가하였다. 세포 배양 배지를 흡인하고, PBS로 세척하고, 아큐타제 (accutase)로 처리하여, 0분, 10분, 30분, 1시간, 2시간 및 4.5시간 시점에서 샘플을 수확하였다. 아큐타제 활성을 중화하고, 세포를 FAC 완충액에 재현탁하고, 유세포 분석으로 분석하였다.
결과는 도 73a 및 도 73b에 제시되어 있다. 세포는 10D1F.FcA의 최소 내재화를 나타냈다. 이와 달리, 항-HER2 항체 트라스투주맙의 실질적인 내재화가 관찰되었다.
실시예 13: 면역조직화학에서 HER3-결합 항체의 사용
인간 HER3 단백질의 검출을 위한 면역조직화학에서 사용되는 능력에 대해 mIgG2a 형식의 항-HER3 항체 10D1F를 평가하였다.
결합 시약 (Leica Biosystems)을 사용하여 절편 처리를 수행하였다. 시중에서 입수 가능한 냉동 조직 절편의 어레이를 획득하였다. 슬라이드를 데시케이터 (desiccator)에서 10분 동안 건조시킨 다음, 단계 사이에 물 세척 및/또는 TBS-T 세정을 수행하면서, 다음 처리를 수행하였다: (i) 실온에서 10분 동안 100% 아세톤 처리에 의한 고정; (ii) 실온에서 15분 동안 3% (v/v) H2O2 처리에 의한 내인성 퍼옥시다제 차단; (iii) 실온에서 30분 동안 10% 염소 혈청 처리에 의한 차단, (iv) 4℃에서 밤새 1:250 희석의 6.2 mg/ml 용액의 10D1F-mIgG2a와의 인큐베이션, (v) 실온에서 30분 동안 HRP-중합체 접합 염소 항-마우스 항체와의 인큐베이션, (vi) 실온에서 5분 동안 Bond Mixed DAB Refine에 의한 전개 후, 탈이온수 및 1x Bond Wash로의 세정에 의한 반응 정지.
그런 다음 슬라이드를 탈수하고, 합성 봉입 매질에 봉입시키고, 고해상도로 스캔하였다.
결과는 도 75a 및 도 75b에 제시되어 있다. 10D1F는 정상 조직에 대한 교차 반응성이 낮은 악성 인간 조직 절편을 우선적으로 염색시켰다.
추가 실험에서, A549 이종이식 종양을 저온 PBS 중에 수확하고, OCT 저온 포매 배지에 포매하고, 드라이아이스에 동결시키고, -80℃에서 저장했다. 저온 유지 장치를 사용하여 10 μm 절편을 획득하였다.
슬라이드를 데시케이터에서 10분 동안 건조시킨 다음, 단계 사이에 물 세척 및/또는 TBS-T 세정을 수행하면서, 다음 처리를 수행하였다: (i) 실온에서 10분 동안 100% 아세톤 처리에 의한 고정; (ii) 실온에서 15분 동안 3% (v/v) H2O2 처리에 의한 내인성 퍼옥시다제 차단; (iii) 실온에서 30분 동안 10% 염소 혈청 처리에 의한 차단, (iv) 4℃에서 밤새 1:50 희석의 8.8 mg/ml 용액의 10D1F.FcA 또는 1:200 희석의 Sino Biological 또끼 항-HER3 (Cat. No. 10201-T24)와의 인큐베이션, (v) 실온에서 30분 동안 Invitrogen F(ab')2-염소 항-인간 IgG (H+L) HRP (A24470) (1:500) 또는 HRP-중합체 접합 염소 항-토끼 항체와의 인큐베이션, (vi) 실온에서 5분 동안 Bond Mixed DAB Refine에 의한 전개 후, 탈이온수 및 1x Bond Wash로의 세정에 의한 반응 정지.
그런 다음 슬라이드를 헤마톡실린으로 대조 염색하고, 탈수하고, 합성 봉입 매질에 봉입하고, 고해상도로 스캔하였다.
결과는 도 76에 제시되어 있다. 10D1F.FcA는 A549 종양 이종이식 동결 절편의 특정 막 및 세포질 염색을 나타냈다.
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heavy chain FR2 <400> 132 Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 15 His <210> 133 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B2 heavy chain FR3 <400> 133 Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys 1 5 10 15 Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp 20 25 30 Ser Ala Val Tyr Phe Cys 35 <210> 134 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B2 heavy chain FR4 <400> 134 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 135 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B2 light chain variable region <400> 135 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala 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chain FR3 <400> 141 Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 142 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B2, 4-35-B4, 10A6 light chain FR4 <400> 142 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 143 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 heavy chain variable region <400> 143 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Lys Ile Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Pro Lys 50 55 60 Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Leu His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 144 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 heavy chain CDR1 <400> 144 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 145 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 heavy chain CDR2 <400> 145 Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 heavy chain CDR3 <400> 146 Ala Arg Gly Leu His 1 5 <210> 147 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 heavy chain FR1 <400> 147 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 148 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 heavy chain FR2 <400> 148 Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 15 Lys <210> 149 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 heavy chain FR3 <400> 149 Asn Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr 1 5 10 15 Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Phe Cys 35 <210> 150 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 light chain variable region <400> 150 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 151 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 light chain CDR1 <400> 151 Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 152 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 light chain CDR2 <400> 152 Leu Ala Ser 1 <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 light chain CDR3 <400> 153 Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 154 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 light chain FR1 <400> 154 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 155 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 light chain FR2 <400> 155 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 156 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 light chain FR3 <400> 156 Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 157 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 heavy chain variable region <400> 157 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asn Phe Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 heavy chain CDR1 <400> 158 Gly Asn Phe Ile Thr Ser Gly Tyr Phe 1 5 <210> 159 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 heavy chain CDR2 <400> 159 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn 1 5 <210> 160 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 heavy chain CDR3 <400> 160 Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 161 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 heavy chain FR1 <400> 161 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr 20 25 <210> 162 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 heavy chain FR2 <400> 162 Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 15 Phe <210> 163 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 heavy chain FR3 <400> 163 Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr 1 5 10 15 Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 164 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 light chain variable region <400> 164 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Trp Lys Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Thr Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 165 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 light chain CDR1 <400> 165 Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 166 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 light chain CDR2 <400> 166 Trp Ala Ser 1 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 light chain CDR3 <400> 167 Gln Gln Tyr Phe Thr Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 168 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 light chain FR1 <400> 168 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser 20 25 <210> 169 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 light chain FR2 <400> 169 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 170 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 light chain FR3 <400> 170 Thr Trp Lys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala 20 25 30 Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 171 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens IgG1 consant region (IGHG1; UniProt:P01857-1, v1) <400> 171 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 172 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 IgG1 (positions 1-98 of P01857-1, v1) <400> 172 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 173 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge IgG1 (positions 99-110 of P01857-1, v1) <400> 173 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 <210> 174 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 IgG1 (positions 111-223 of P01857-1, v1) <400> 174 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 175 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 IgG1 (positions 224-330 of P01857-1, v1) <400> 175 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 176 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 (D356E, L358M; positions numbered according to EU numbering) <400> 176 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 177 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ckappa CL (IGCK; UniProt: P01834-1, v2) <400> 177 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 178 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A6 heavy chain SignalP <400> 178 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser <210> 179 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1 heavy chain SignalP <400> 179 Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Cys Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser <210> 180 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1 light chain SignalP <400> 180 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly 20 <210> 181 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B2 heavy chain SignalP <400> 181 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 182 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B2 light chain SignalP <400> 182 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Met Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Met Met Ser Arg Gly 20 <210> 183 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 heavy chain SignalP <400> 183 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser <210> 184 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 light chain SignalP <400> 184 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 185 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92, 10D1_c93 heavy chain SignalP <400> 185 Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Ile Ala Thr Leu Ala Gly 1 5 10 15 Ala Arg Cys <210> 186 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B, 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 221 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-35-B4 VL-Ckappa <400> 221 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 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Ser 20 25 30 Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Trp Lys Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Thr Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 224 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1_11B heavy chain FR1 <400> 224 Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr 20 25 <210> 225 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1F.FcA VH-CH1-CH2-CH3 (GASDALIE; LCKC) (10D1F.FcB) <400> 225 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Cys Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu 325 330 335 Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 226 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1F.FcA VH-CH1-CH2-CH3 (N297Q) <400> 226 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 227 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1 VH-CH1-CH2-CH3 (GASDALIE; LCKC) <400> 227 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Cys Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu 325 330 335 Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 228 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1 VH-CH1-CH2-CH3 (GASD) <400> 228 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 229 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER3 binding site for 10D1-derived clones <400> 229 Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly 1 5 10 15 Gly Cys <210> 230 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1 binding site motif 1 <400> 230 Pro Asn Pro Asn Gln 1 5 <210> 231 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D1 binding site motif 2 <400> 231 Asp Glu Cys Ala Gly 1 5

Claims (23)

  1. HER3에 결합할 수 있는, 단리된 항원 결합 분자로서,
    (i) 하기 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
    서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
    서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
    서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
    (ii) 하기 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
    서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
    서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
    서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
    서열번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서, 하기 프레임워크 영역 (FR)을 포함하는 VH 영역:
    서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
    서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
    서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
    서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  4. 제1항에 있어서, 하기 프레임워크 영역 (FR)을 포함하는 VL 영역:
    서열번호 104의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
    서열번호 110의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
    서열번호 120의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
    서열번호 125의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 171의 중쇄 불변 서열을 포함하는, 항원 결합 분자.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 177의 경쇄 불변 서열을 포함하는, 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 인코딩하는, 단리된 핵산 또는 다수의 단리된 핵산.
  8. 제7항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산을 포함하는, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터.
  9. 단리된 세포로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 상기 항원 결합 분자를 인코딩하는 핵산 또는 다수의 핵산, 또는 상기 핵산 또는 상기 다수의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는, 단리된 세포.
  10. 핵산(들) 또는 발현 벡터(들)로부터의 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 인코딩하는 핵산 또는 다수의 핵산을 포함하거나, 또는 상기 핵산 또는 상기 다수의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항원 결합 분자를 생산하는 방법.
  11. 암의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자; 상기 항원 결합 분자를 인코딩하는 핵산 또는 다수의 핵산; 상기 핵산 또는 상기 다수의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터; 또는 상기 항원 결합 분자, 상기 핵산 또는 상기 다수의 핵산, 또는 상기 발현 벡터 또는 상기 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 암이 HER3을 발현하는 암, 위암, 두경부암, 유방암, 난소암, 폐암, 흑색종, 전립선암, 구강암, 신장암, 대장암, 식도암, 췌장암, 고형암, 및 혈액암으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  13. HER3을 포함하거나 또는 포함하는 것으로 추측되는 샘플을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자와 시험관내에서 접촉시키는 단계; 및 항원 결합 분자와 HER3의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, HER3을 검출하기 위한 방법.
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