CN116143933A - 抗人cd38双特异性抗体及其用途 - Google Patents

抗人cd38双特异性抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本申请提供了抗人CD38的双特异性抗体及其用途，所述双特异性抗体包含结合人CD38不同表位的两个抗原结合片段。

Description

抗人CD38双特异性抗体及其用途
发明领域
本发明通常涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，本申请涉及抗人CD38的双特异性抗体及其用途。
发明背景
CD38是一种分子量大小为46KD的II型跨膜蛋白，包括一个长的C端胞外区(258个氨基酸)、一个跨膜区(21个氨基酸)和一个短的N端(21个氨基酸)。CD38的功能体现在两方面，首先，CD38胞外区是具有ADP-核糖环化酶、环ADP-核糖水解酶、NAD多糖水解酶活性的一种胞外酶，涉及cADPR的形成和水解。当CD38作为一种ADP核糖基环化酶存在时，可以将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化为烟酰胺、腺苷二磷酸核糖(ADPR)，还可以将NAD+环化为环腺苷二磷酸核糖(cADPR)[1]。CD38的这个活性对维持体内NAD、烟酰胺等物质的动态平衡非常重要。CD38的底物主要为β-NAD以及β-NAD的衍生物(如β-NMN)，而对α-NAD、NADH等物质没有催化活性。催化反应的产物ADPR、cADPR等物质作为细胞中重要的第二信使，可以通过调控细胞钙离子的方式来影响细胞生长、胰岛素释放、T细胞激活等功能[2]。CD38催化生成的ADPR/cADPR可以继续被CD203、CD73等酶的作用下生成腺苷，而腺苷则是发挥免疫抑制功能的小分子代谢物。
另外，CD38介导跨膜信号传递。CD38与配体作用诱导白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的转录，其表达水平与刺激T细胞受体CD3的效应相似。在Jurkat细胞系中CD38启动信号传递导致一系列离散的蛋白的磷酸化，原癌基因p120c-cbl的产物是主要的蛋白，在这条信号通路中其酪氨酸被磷酸化。CD38还可以通过T细胞受体(TCR)传导信号并参与细胞应答，启动免疫蛋白的转换分泌[3]。CD38与配体结合可抑制在骨髓微环境培养的未成熟B淋巴细胞的生长。
CD38的表达和多种疾病有关，如HIV感染[4]、***红斑狼疮[5]和肿瘤。CD38在多种血液肿瘤中的表达量上调，如多发性骨髓瘤(MM)[6]、急性淋巴性白血病(ALL)[7]、慢性淋巴性白血病(CLL)[8]等。目前对CD38与肿瘤的研究基本可以确定CD38在促进肿瘤细胞生长及免疫逃逸方面具有重要的功能。CD38与肿瘤的关系基本可以概括为两点:
CD38在非实体瘤，尤其是多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)中表达量很高，且与多发性骨髓瘤预后负相关，这使得CD38成为了多发性骨髓瘤、CLL等非实体瘤靶向治疗的良好靶点之一。多发性骨髓瘤是一种浆细胞异常增生导致的恶性血液肿瘤，在血液肿瘤中占比约为10％，在所有肿瘤中的比率约为1％[9]。统计显示：在2012年，全球共有114,252例新增病例和80,119例死亡病例[10]。多发性骨髓瘤的发病率有一定的人种差异性，具体来说东亚地区的发病率要低于欧美，GLOBOCAN 2012的统计数据显示美国的发病率为3.6/10万，中国的发病率为0.6/10万[11]。
此外，CD38在某些实体瘤中也存在较高的表达。由于CD38及后续的CD203、CD73等酶共同作用生成腺苷这个具有免疫抑制活性的分子，CD38在实体瘤的肿瘤微环境中发挥了重要的免疫抑制功能，因此靶向CD38的实体瘤治疗将有望解除CD38对免疫细胞的抑制作用，使免疫治疗更好发挥作用。
2015年底，FDA批准强生靶向CD38的抗体药物Darzalex上市，用于既已接受至少3种疗法治疗的多发性骨髓瘤患者(四线疗法)。Darzalex是全球首个获批治疗多发性骨髓瘤的CD38单克隆抗体。Darzalex可以通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)等机制杀死CD38+骨髓瘤细胞[12]。2020年3月，美国FDA宣布批准赛诺菲(Sanofi)公司开发的CD38抗体Sarclisa(isatuximab-irfc)上市，与泊马度胺(pomalidomide)和***(dexamethasone)联用，治疗成年多发性骨髓瘤患者。这些患者至少接受过两种前期疗法，包括来那度胺(lenalidomide)和蛋白酶体抑制剂。
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是一类人工抗体，其包含两个不同的抗原结合位点，可以桥接两种细胞类型，或者结合一个细胞的两个分子以及结合一个分子的两个表位，产生不同于单抗的或者较单抗更强的功能，现已成为抗体工程领域的研究热点，在疾病的免疫治疗中具有广阔的应用前景。
新的抗人CD38双特异性抗体的开发和应用是本领域所需要的。因此，鉴于抗人CD38双特异性抗体具有广泛的适用性，基于临床需求，探索和研发新的抗人CD38双特异性抗体具有重要的生物学和医学意义。
发明概述
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合人CD38不同表位的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含:
如SEQ ID NO:23所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:24所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:25所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:27所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:28所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段包含:
如SEQ ID NO:29所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:30所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:31所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段的形式独立地选自单链抗体(scFv)或者Fab片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段为单链抗体(ScFv)，所述第二抗原结合片段为Fab片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段为Fab片段,所述第二抗原结合片段为CH1CL置换的Fab片段。
第二方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面所述的双特异性抗体。
第三方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗CD38介导的疾病的药物中的用途。
附图简述
图1显示了ELISA分析重组抗hCD38抗体与不同种属CD38的结合能力。
图2显示了在jurkat-dual-CD16a报告基因体系中评价重组抗hCD38抗体的ADCC活性。
图3显示了重组抗hCD38抗体的CDC活性。
图4显示了在NOD/SCID小鼠移植人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226的模型中抗hCD38抗体对肿瘤的抑制作用。
序列说明
SEQ ID NO:1显示人(homo sapiens)CD38胞外区(hCD38)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2显示食蟹猴(Macaca fascicularis)CD38胞外区(mfCD38)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示His标签(His)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示人抗体IgG1的Fc段(Fc)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示人IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6显示人IgG2亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示人IgG4亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示人κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9显示人λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10显示S5B8重链人源化S5B8VH-h2可变区的氨基酸序列，其HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:23-25所示。
SEQ ID NO:11显示S5B8轻链人源化S5B8VK-h2可变区的氨基酸序列，其LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26-28所示。
SEQ ID NO:12显示S5A10重链人源化S5A10VH-h1可变区的氨基酸序列，其HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:29-31所示。
SEQ ID NO:13显示S5A10轻链人源化S5A10VK-h1可变区的氨基酸序列，其LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:32-34所示。
SEQ ID NO:14显示抗CD38单克隆抗体达雷木单抗的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15显示抗CD38单克隆抗体达雷木单抗的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16显示S5B8VH-h2-scFv-FcH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17显示S5A10VH-h1-CH-IgG1K的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18显示S5A10VK-h1-CK的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19显示S5B8VH-h2-IgG1H1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20显示S5B8VK-h2-CK的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21显示S5A10VH-h1-CK-cross-FcK的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22显示S5A10VK-h1-CH1的氨基酸序列。
发明详述
本申请的发明人对结合人CD38的抗体药物进行了深入研发，并通过抗体工程技术得到了新的结合人CD38的双特异性抗体。在本申请的多个方面，提供了新的结合人CD38的双特异性抗体，编码所述双特异性抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子或载体的宿主细胞、制备和纯化所述双特异性抗体的方法及所述双特异性抗体的医学和生物学应用。根据本申请提供的双特异性抗体、的可变区的序列，可构建全长的双特异性抗体分子作为药物在临床上用于预防或治疗CD38介导的疾病。
除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
定义
如本文所用的术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子。靶标包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、VHH抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链可变区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链可变区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
“双特异性抗体”是指同时具有两种抗原表位结合能力的抗体。两种抗原表位可以在不同抗原上，也可是在同一抗原上。双特异性抗体可以具有多种结构构型。例如，双特异性抗体可以由两个Fc片段以及分别与其融合的两个结合部分组成(与天然抗体相似，区别在于两个臂结合不同的抗原靶标或表位)，抗原结合部可以为单链抗体(scfv)或者Fab片段的形式。双特异性抗体的两个不同的结合部各自与一个Fc片段的N端结合，两个臂的抗原结合部配置可以具有四种组合方式:scfv+Fab片段、Fab片段+scfv、scfv+scfv、Fab片段+Fab片段。Fc片段可以包含能够确保重链异聚化的突变，KIH技术(knob-in-hole，KIH)是解决重链异聚化的一种策略。通常，KIH技术是指通过改造CH3区的氨基酸序列，形成有利于异种半抗体相互配对的结构，可以在构成双特异性抗体的同时又尽可能地保持正常抗体的结构。关于KIH技术的指导，例如可参见“An efficient route to human bispecific IgG”,A.Margaret Merchant et al.,Nature Biotechnology,Volume 16,1998，通过引用的方式将该文献全文并入本文。
如本文所用的术语“结合部分”或“抗原结合片段”可互换使用，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani etal.，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。
对于一般抗体而言，抗原抗原结合片段的实例包括但不限于:(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')2片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scFv)2，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。
在双特异性抗体构建中，“结合部分”包括但不限于Fab片段的形式或单链抗体(scFv)的形式。
如本文所用的术语“单链抗体(scFv,single chain fragment variable)”是指一般利用基因工程技术构建的单链结构的抗体，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一条多肽链。在重链可变区和轻链可变区之间通常会设计一段柔性的连接肽(linker)以便重链可变区和轻链可变区可以折叠成为能够结合抗原的正确构象。
如本文所用的术语“Fab(fragment antigen binding)片段”、“Fab部分”或类似的术语是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链(VL-CL)、重链可变区和CH1片段(VH-CH1)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
如本文所用术语“肿瘤”是指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶性的。
如本文所用术语“恶性肿瘤”是指或描述哺乳动物的生理条件，其典型的特征在于不受调控的细胞生长。示例性恶性肿瘤包括：癌、实体瘤、黑素瘤肉瘤、血液肿瘤、生殖细胞瘤和胚细胞瘤。恶性肿瘤的更多具体实例包括：多发性骨髓瘤、肾癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌的肺癌，膀胱癌，乳腺癌，***，结肠癌，肝癌(hepaticcarcinoma)，包括胃肠癌的胃癌，***癌，胰腺癌，腹膜癌，肝细胞癌，成胶质细胞瘤，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，尿路癌，肝细胞瘤，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)，外阴癌，甲状腺癌，***癌，***癌，黑素瘤和B细胞淋巴瘤，脑癌及头颈癌以及相关转移灶。
如本文所用术语“血液肿瘤”是指由于异常细胞的生长增殖不受控制引起的，在多数情况下这些不正常的细胞的起源部位是骨髓，这也正是血液细胞产生的地方。示例性血液肿瘤包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。血液肿瘤的更多具体实例包括：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞白血病、幼年型粒-单核细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、伯基特白血病和成人T细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、原发性巨球蛋白血症(
Figure BDA0003364543120000101
macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、赛谢综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特指型外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。
如本文所用术语“实体瘤”是指可通过临床检查如X线摄片、CT扫描、B超或触诊扪及到的有形肿块。临床上诊治过的实体瘤分恶性和良性两种。恶性实体瘤包括：儿童霍奇金淋巴瘤：淋巴细胞为主型、结节硬化型、混合细胞型、淋巴细胞消减型；儿童非霍奇金淋巴瘤：前淋巴母细胞淋巴瘤、小无裂细胞淋巴瘤(伯基特/非伯基特淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤等；儿童肾脏肿瘤：肾母细胞瘤(Wilms瘤)、肾透明细胞癌、肾横纹肌样瘤、肾透明细胞肉瘤、肾原始神经外胚叶瘤等；儿童神经母细胞瘤：神经母细胞瘤、节细胞神经母细胞瘤、节细胞神经瘤；儿童颅外生殖细胞瘤：成熟畸胎瘤、未成熟畸胎瘤、内胚窦瘤(卵黄囊瘤)、***瘤、无性细胞瘤、绒毛膜上皮癌、胚胎癌等；骨肉瘤及软骨肉瘤；儿童横纹肌肉瘤：胚胎型、腺泡型、多形型等；儿童软组织肉瘤：纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、***肉瘤、恶性神经鞘瘤、腺泡状软组织肉瘤、上皮样肉瘤、透明细胞肉瘤、恶性黑色素瘤、滑膜肉瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤等；尤文氏家族肉瘤：尤文氏肉瘤、原始神经外胚叶瘤；儿童肝脏肿瘤：肝母细胞瘤(胚胎型、胎儿型、未分化型)、肝细胞癌；视网膜母细胞瘤；其他肿瘤：后颅窝髓母细胞瘤、鼻咽癌、甲状腺***状癌、胸腺瘤、肺母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰岛细胞瘤、回盲部类癌、间皮瘤等。良性实体瘤包括：***瘤、血管瘤、甲状舌管囊肿等。
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合人CD38不同表位的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含:
如SEQ ID NO:23所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:24所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:25所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:27所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:28所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段包含:
如SEQ ID NO:29所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:30所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:31所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第一抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第一抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第二抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第二抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段的形式独立地选自单链抗体(scFv)或者Fab片段。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一抗原结合片段为单链抗体(ScFv)，所述第二抗原结合片段为Fab片段。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一抗原结合片段为Fab片段，所述第二抗原结合片段为CH1CL置换的Fab片段。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列和SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体具有补体依赖的细胞毒性(CDC)。
第二方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面所述的双特异性抗体。
在第二方面的一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
第三方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在第三方面的一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗CD38介导的疾病。
在第三方面的一些实施方案中，所述的CD38介导的疾病为肿瘤。
在第三方面的一些实施方案中，所述的CD38介导的疾病为恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病。
在第三方面的一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述物质中的一种或多种:润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。
在第三方面的一些实施方案中，可以将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
在第三方面的一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于:口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
在第三方面的一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗CD38介导的疾病的药物中的用途。
在第四方面的一些实施方案中，所述的CD38介导的疾病为肿瘤。
在第四方面的一些实施方案中，所述的CD38介导的疾病为恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病。
第五方面，本申请提供了预防或治疗CD38介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面所述的双特异性抗体或第三方面所述的药物组合物。
在第五方面的一些实施方案中，所述的CD38介导的疾病为肿瘤。
在第五方面的一些实施方案中，所述的CD38介导的疾病为恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病。
在其他方面，本申请还提供包含编码第一方面所述的双特异性抗体的分离的核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。在其他方面，本申请还提供产生第一方面所述的双特异性抗体的方法。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸分子。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收双特异性抗体。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例
实施例1:重组蛋白的制备
制备抗CD38抗体的过程中需要用到多种不同的重组蛋白，包括人CD38胞外区(hCD38，SEQ ID NO：1)、食蟹猴CD38胞外区(mfCD38，SEQ ID NO:2)。而这些蛋白都有大量的翻译后修饰(例如糖基化或者二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达***将更有利于保持重组蛋白的结构和功能。此外，在这些重组蛋白的C端添加了His标签(His，SEQ ID:3)或者人抗体IgG1的Fc段(Fc，SEQ ID NO:4)，将更有利于重组蛋白的纯化和单克隆抗体功能的鉴定。抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO:5)，人IgG2亚型(SEQ ID NO:6)、人IgG4亚型(SEQ ID NO:7)，轻链恒定区可以是人κ亚型(SEQ ID NO:8)、人λ亚型(SEQ ID NO:9)。
根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重组蛋白的基因(包含His标签或者Fc的编码基因)。利用常规的分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或者其他阳离子转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。
His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。而Fc融合表达的重组蛋白用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其他合适的缓冲液。必要时，可以对重组蛋白样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。
实施例2:重组抗人CD38双特异性抗体和单克隆抗体的制备
参照实施例1，制备中国专利申请第201810615165.8号中的单克隆抗体S5B8h2(重链可变区S5B8VH-h2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，轻链可变区S5B8VK-h2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)和S5A10h1(重链可变区S5A10VH-h1的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，轻链可变区S5A10VK-h1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)以及对照抗体达雷木单抗(重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示)的IgG1亚型全抗体。同时制备基于不同CD38结合表位的单克隆抗体S5B8h2和S5A10h1组成的双特异性抗体。
为研究比较不同结构的双特异性抗体活性之间的区别，在“Knob-into-hole”技术的基础上，构建了基于Fab-FcK/scFv-FcH结构的双特异性抗体。具体来说，将S5A10h1-Fab融合在包含Knob突变的Fc的N端，将S5B8h2-scFv融合在包含Hole突变的Fc的N端，组成双特异性抗体S5A10h1Fab+S5B8h2ScFv，三条链分别为S5B8VH-h2-scFv-FcH1(SEQ ID NO:16)、S5A10VH-h1-CH-IgG1K(SEQ ID NO:17)、S5A10VK-h1-CK(SEQ ID NO:18)。同时，在“Knob-into-hole”和“CrossMab”技术的基础上，构建了基于Fab-FcK/Fab-CrossMab-FcH结构的双特异性抗体S5A10h1cross+S5B8h2，具体来说，把S5B8h2-Fab融合在包含hole突变的Fc的N端，把S5A10h1-Fab的CH1和CK序列进行置换，然后融合在包含Knob突变的Fc的N端，组成双特异性抗体的四条链分别为S5B8VH-h2-IgG1H1(SEQ ID NO:19)、S5B8VK-h2-CK(SEQ IDNO:20)、S5A10VH-h1-CK-cross-FcK(SEQ ID NO:21)和S5A10VK-h1-CH1(SEQ ID NO:22)。
实施例3:重组抗人CD38双特异性抗体和单克隆抗体的蛋白水平鉴定
1.重组抗人CD38双特异性抗体和单克隆抗体的亲和力分析
利用Biacore X100通过表面等离子共振技术测定亲和力。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39)，CM5芯片((BR100530)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。根据试剂盒中的说明书，使用氨基偶联的方法将抗人Fc抗体(捕获抗体)偶联至CM5芯片表面，然后稀释重组抗人CD38抗体至合适浓度，保证50-100RU左右的重组抗人CD38抗体被抗人Fc抗体捕获。将人CD38-His设置一系列的浓度梯度(100nM、33nM、11nM、3.7nM和1.23nM)流经固定相表面，用3M的MgCl2对芯片表面进行再生，在25℃下测定各重组抗人CD38抗体的亲和力。使用Biacore X100评估软件2.0.1版本对Biacore数据进行分析，拟合结果如表1所示。
表1.不同重组抗人CD38双特异性抗体和单克隆抗体结合人CD38的亲和力常数
Ka Kd KD
S5A10h1Fab+S5B8h2ScFv 1.496E+6 2.266E-4 1.514E-10
S5A10h1 1.291E+6 1.724E-3 1.335E-9
S5B8h2 1.111E+6 2.367E-5 2.131E-11
达雷木单抗 8.665E+5 2.829E-3 3.265E-9
S5A10h1cross+S5B8h2 1.434E+6 3.102E-5 2.164E-11
2.重组抗人CD38双特异性抗体和单克隆抗体与不同种属CD38的结合
将制备的hCD38-His和mfCD38-His分别包被96孔ELISA板(1.5μg/ml，100μl/孔)，在4℃下包被过夜。利用封闭液(2％的奶粉-PBST)将包被的96孔ELISA板在37℃下封闭1小时，然后分别加入各重组抗人CD38抗体和无关对照DP47，在37℃下结合1小时。之后用PBST洗涤ELISA板，加入HRP小鼠抗人IgG，在37℃下再结合1小时。之后用PBST洗涤ELISA板，并加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4溶液终止显色，使用酶标仪在492nm/630nm双波长下测定光密度值。结果如图1所示，各重组抗人CD38双特异性抗体和单克隆抗体都能识别人CD38胞外区，其中单克隆抗体S5B8h2、双特异性抗体S5A10h1Fab+S5B8h2scFv和S5A10h1cross+S5B8h2可以交叉识别食蟹猴CD38胞外区。
3.重组抗人CD38单克隆抗体的表位鉴定
利用Biacore T200通过表面等离子共振技术测定抗体的结合。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、His捕获试剂盒(28-9950-56)，CM5芯片((BR100530)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。根据试剂盒中的说明书，使用氨基偶联的方法将抗his抗体(捕获抗体)偶联至CM5芯片表面，保证饱和的50RU左右人CD38-His被捕获抗体捕获然后稀释第一抗体至合适浓度，保证饱和的第一抗体与人CD38-His完全结合。第一抗体完全结合后再将第二抗体流经固定相表面，根据第二抗体的结合量(RU)判断第一抗体与第二抗体是否结合相同表位。当第二抗体与第一抗体结合表位相同时，第二抗体无法结合到芯片上，结合量在0左右。最后用3M的MgCl2对芯片表面进行再生，使用Biacore T200评估软件3.0版对Biacore数据进行分析，拟合结果如表2所示。结果显示，S5A10h1与S5B8h2、达雷木单抗与S5B8h2为不同结合表位。达雷木单抗与S5A10h1为相同结合表位。
表2.不同重组抗人CD38单克隆抗体的表位鉴定
Figure BDA0003364543120000201
实施例4:重组抗人CD38抗体的体外活性
1、重组抗人CD38抗体的ADCC活性
本申请发明人通过将CD16a质粒转入Invivogen公司的jurkat-dual细胞中，构建了jurkat-dual-CD16a报告基因细胞株。当ADCC效应发生时，活化信号通过CD16a分子转至下游的NFκB通路，最后通过萤光素酶检测ADCC活性。
用1640+5％灭活血清作为测试培养基。将jurkat-dual-CD16a细胞用测试培养基计数后重悬至2*106个细胞/ml，高表达人CD38的靶细胞(如daudi细胞)计数后重悬至4*105个细胞/ml。取100μl jurkat-dual-CD16a细胞和50μl的daudi细胞以效靶比10:1的比例混合，并与梯度稀释(终浓度10nM起始，3倍梯度稀释，10个浓度点)的各种重组抗人CD38单克隆抗体和双特异性抗体在培养箱中共同孵育20h。离心取20μl上清，酶标仪中设置好自动上样程序，在每孔中加入50μl荧光素酶检测液quanti-luc(invivogen,货号rep-qlc2)并进行全波长检测测定萤光强度。
结果如图2所示，双特异性抗体S5A10h1Fab+S5B8h2ScFv和S5A10h1cross+S5B8h2的ADCC活性均明显强于单独的单克隆抗体S5A10h1和S5B8h2，且与达雷木单抗相当。
2、重组抗人CD38抗体的CDC活性
采集健康志愿者的血液(10mL)，其中所采集的血液由发明人及其同事作为志愿者提供，所有志愿者均已签署知情同意书。志愿者的纳入标准为:
1.年龄大于18周岁；
2.无HIV、HBV感染；
3.血常规检测正常；
4.非孕妇或哺乳期妇女。
将血液室温放置2h至凝集完成，3000rpm离心10min，小心吸出上层的血清，分装备用。
用1640+5％灭活血清作为测试培养基。将重组抗人CD38双特异性抗体和单克隆抗体用测试培养基稀释至终浓度100nM，然后以3倍浓度梯度进行稀释，共获得10个浓度的稀释液。将高表达人CD38的靶细胞(如daudi细胞)计数后重悬至5*105个细胞/ml。将100μl重组抗人CD38抗体的各种浓度稀释液和90μl高表达人CD38的靶细胞预先孵育15min，然后加入10μl的新鲜人血清(志愿者捐赠)并混匀，培养箱中孵育20h。设置靶细胞自发释放(只有靶细胞)、靶细胞最大释放(靶细胞完全裂解)、靶细胞+效应细胞自发释放(只有靶细胞+效应细胞)、培养基背景(只有培养基)和体积校正(培养基+裂解液)等一系列对照孔，用培养基将对照孔和各实验组体积保持一致。
检测前50min在靶细胞最大释放孔和体积校正孔中均加入同等体积的10×裂解液(CytoTox
Figure BDA0003364543120000211
非放射性细胞毒性检测试剂盒，promega，货号G1780)，待镜下观察靶细胞完全裂解后离心，取50μl上清，并加入50μl LDH检测液(CytoTox/>
Figure BDA0003364543120000212
非放射性细胞毒性检测试剂盒，promega，货号G1780)，避光孵育30min，孵育结束后加入50μl终止液(CytoTox/>
Figure BDA0003364543120000213
非放射性细胞毒性检测试剂盒，promega，货号G1780)，利用酶标仪在490/492nm波长下测定吸光值，并计算杀伤率。杀伤率(％)的计算公式为:
杀伤率(％)＝{实验组吸光值-(靶细胞+效应细胞自发释放)吸光值)}/{(靶细胞最大释放吸光值-体积校正吸光值)-(靶细胞自发稀释吸光值-培养基背景吸光值)}*100。
结果如图3所示，单独的单克隆抗体S5A10h1和S5B8h2均不具有CDC活性，但是S5A10h1与S5B8h2构建的两种双特异性抗体S5A10h1Fab+S5B8h2ScFv和S5A10h1cross+S5B8h2都出现了明显的CDC作用，且活性强于达雷木单抗。
实施例5:重组抗人CD38抗体的抑瘤作用
收集指数生长期的骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞，用PBS重悬至适合浓度并与基质胶以1:1的比例混合，皮下接种6-8周雌性NOD/SCID小鼠。细胞接种前一天，将小鼠进行60Co照射处理(150rad)。待肿瘤平均体积为100-120mm3时，根据动物体重和肿瘤体积对入选动物进行随机分组，保证不同组别间的肿瘤体积相似。分组当天进行第一次给药，分组给药当天定义为第0天。给药方案见表3。
每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。肿瘤大小计算公式:
肿瘤体积(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)。
初次给药后第32天进行最后一次量瘤并对所有实验动物实施安乐死，称体重。剥离肿瘤组织并称量肿瘤重量，所有实验结果以平均瘤体积±SEM(平均标准误差)表示。对各实验组进行统计分析，通过独立样本T检验方法比较治疗组(第2和3组)的相对肿瘤体积和瘤重与对照组(第1组)的相对肿瘤体积和瘤重有无显著性异。
表3.抗人CD38抗体抑瘤活性评价实验给药方案
编号 给药物质 给药剂量(mg/kg) 给药方式 给药时间
1 同型对照IgG1 10 i.p. BIW×4.5周
2 S5A10h1Fab+S5B8h2ScFv 8.3 i.p. BIW×4.5周
3 S5A10h1cross+S5B8h2 10 i.p. BIW×4.5周
肿瘤体积结果显示(图4)，第1组对照组小鼠在分组给药的第32天平均肿瘤体积为556mm3。各治疗组相较对照组统计学上均有显著性差异(p<0.01)。第2组S5A10h1Fab+S5B8h2ScFv治疗组在给药第32天平均肿瘤体积为216mm3，相对肿瘤抑制率TGI(％)为61.1％。第3组S5A10h1cross+S5B8h2治疗组在给药第32天平均肿瘤体积为221mm3，相对肿瘤抑制率TGI(％)为60.3％。瘤重分析结果与瘤体积分析结果一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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<160> 34
<170> CNIPASequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Val Pro Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg
1 5 10 15
Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His
20 25 30
Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys
35 40 45
Gly Ala Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val
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Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr
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Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser
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Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp
145 150 155 160
Val Val His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys
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Val Gln Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser
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Ser Lys Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp
225 230 235 240
Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser
245 250 255
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<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
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Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His
20 25 30
Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys
35 40 45
Gly Ala Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val
85 90 95
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Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr
115 120 125
Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser
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Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly
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Val Gln Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser
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Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile
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Ser Lys Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp
225 230 235 240
Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser
245 250 255
Gly Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
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Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
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Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
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Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ala Arg Asp Leu Leu Gln Phe Gly Asn Gln Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
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<400> 12
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Asp Leu Leu Gln Phe Gly Asn Gln Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser
245 250 255
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
260 265 270
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
275 280 285
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
290 295 300
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
305 310 315 320
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
325 330 335
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
340 345 350
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
355 360 365
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
370 375 380
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
385 390 395 400
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
405 410 415
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
420 425 430
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
435 440 445
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
450 455 460
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
465 470 475 480
Pro Gly Lys
<210> 17
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Pro Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Tyr Gly Asn Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 19
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Gln Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Leu Gln Phe Gly Asn Gln Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 20
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 21
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Pro Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Tyr Gly Asn Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
210 215 220
Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 22
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys
210
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asn Ser Trp Met His
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Glu Ile His Pro Gln Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asp Leu Leu Gln Phe Gly Asn Gln Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Ser Tyr Thr Ile His
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Tyr Ile Asn Pro Ser Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Lys Tyr Gly Asn Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr Thr
1 5

Claims (10)

1.双特异性抗体，其包含结合人CD38不同表位的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合片段包含:
如SEQ ID NO:23所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:24所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:25所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:27所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:28所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合片段包含:
如SEQ ID NO:29所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:30所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:31所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
4.如权利要求1或2所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
5.如权利要求1或3所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
6.如权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段的形式独立地选自单链抗体(scFv)或者Fab片段。
7.如权利要求6所述的双特异性抗体，其中
所述第一抗原结合片段为单链抗体(ScFv)，所述第二抗原结合片段为Fab片段；优选地，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；或者
所述第一抗原结合片段为Fab片段,所述第二抗原结合片段为CH1CL置换的Fab片段；优选地，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
8.核酸分子，其编码权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体。
9.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
10.权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体、权利要求8所述的核酸分子或权利要求9所述的药物组合物在制备用于预防或治疗CD38介导的疾病的药物中的用途；优选地，所述疾病为肿瘤；更优选地，所述疾病为恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病。
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