JP7046973B2 - 抗ｏｘ４０抗体およびその使用 - Google Patents

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Description

発明の背景
本発明は、ＯＸ４０と特異的に結合する新規な抗体および抗体フラグメントならびに前記抗体または抗体フラグメントを含んでなる組成物に関する。加えて、本発明は、前記抗体またはその抗体フラグメントをコードする核酸およびそれを含んでなる宿主細胞、ならびに関連するその使用に関する。加えて、本発明は、治療および診断のための前記抗体および抗体フラグメントの使用に関する。
ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４およびＡＣＴ３５としても知られる）は、最初はラットＣＤ４ Ｔ細胞上のＴ細胞活性化マーカーとして記載され(Paterson DJ, Jefferies WA, Green JR, Brandon MR, Corthesy P, Puklavec M, Williams AF. Antigens of activated rat T lymphocytes including a molecule of 50,000 Mr detected only on CD4 positive T blasts. Mol Immunol. 1987; 24: 1281-1290)、その後、ＴＣＲ動員において上方調節されることが示された(Mallett S, Fossum S, Barclay AN. Characterization of the MRC OX40 antigen of activated CD4 positive T lymphocytes - a molecule related to nerve growth factor receptor. EMBO J. 1990; 9: 1063-1068)。ＯＸ４０はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および好中球上で同定された(D. J. Paterson, W. A. Jefferies, J. R. Green et al., “Antigens of activated Rat T lymphocytes including a molecule of 50,000 M(r) detected only on CD4 positive T blasts,” Molecular Immunology, vol. 24, no. 12, pp. 1281-1290, 1987)。ＯＸ４０シグナル伝達は、Ｔ細胞に対する補助刺激シグナルを増強して細胞増殖、生存、エフェクター機能および遊走の促進をもたらし得る(Gramaglia I, Weinberg AD, Lemon M, Croft M. Ox-40 ligand: a potent costimulatory molecule for sustaining primary CD4 T cell responses. J Immunol. 1998; 161: 6510-6517；Gramaglia I, Jember A, Pippig SD, Weinberg AD, Killeen N, Croft M. The OX40 costimulatory receptor determines the development of CD4 memory by regulating primary clonal expansion. J Immunol. 2000; 165: 3043-3050)。
ＯＸ４０のリガンドであるＯＸ４０Ｌは、主として抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現され、その発現はＣＤ４０および肥満細胞シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ならびに炎症性サイトカインにより誘導され得る。ＡＰＣに加え、平滑筋細胞および血管内皮細胞などの非造血細胞もＯＸ４０Ｌを発現し得る。ＯＸ４０Ｌを過剰発現するトランスジェニックマウスでは、Ｔ細胞の活性化が増強され、免疫化するとこれらのマウスはＴ細胞応答の増強を生じた(Murata K, Nose M, Ndhlovu LC, Sato T, Sugamura K, Ishii N. Constitutive OX40/OX40 ligand interaction induces autoimmune-like diseases. J Immunol. 2002; 169: 4628-4636, およびSato T, Ishii N, Murata K, Kikuchi K, Nakagawa S, Ndhlovu LC, Sugamura K. Consequences of OX40-OX40 ligand interactions in langerhans cell function: enhanced contact hypersensitivity responses in OX40L-transgenic mice. Eur J Immunol. 2002; 32:3326-3335)。このデータは、ＯＸ４０Ｌ発現がＴ細胞におけるＯＸ４０シグナル伝達の制限因子であることを示唆している。
腫瘍担持マウスでは、リンパ腫、黒色腫、肉腫、結腸癌、乳癌および神経膠腫などの種々のマウス悪性腫瘍細胞株のマウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるマウスＯＸ４０の結合（可溶型マウスＯＸ４０Ｌ－免疫グロブリン融合タンパク質またはマウスＯＸ４０Ｌ模倣剤、例えば、抗マウスＣＤ１３４特異的抗体による）が抗腫瘍免疫を増強し、無腫瘍生存をもたらす(Sugamura et al. Nature Rev Imm. 2004; 4: 420-431)。
抗原に対する哺乳動物の免疫応答は、ＯＸ４０と組み合わせたＯＸ４０結合剤の使用によって増強されることが示唆されている（ＷＯ９９／４２５８５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２０００）。この文献では一般にＯＸ４０結合剤に言及しているが、重要性はＯＸ４０Ｌまたはその一部の使用にあり、抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０Ｌと等価な物として開示されている。実際に、Ｗｅｉｎｂｅｒｇのグループがこの試験をヒト以外の霊長類研究に使用した際にも、ＯＸ４０Ｌ結合部位に結合し、一般にＯＸ４０Ｌを模倣する抗体を再度意図的に選択した。
Al-Shamkhani et al. (Eur J Chem. 1996; 26: 1695-1699)は、活性化されたマウスＴ細胞上でのＯＸ４０の差次的発現を調べるために、ＯＸ４０Ｌ結合を遮断しなかったＯＸ８６と呼ばれる抗ＯＸ４０抗体を使用し；Hirschhorn-Cymerman et al. (J Exp Med. 2009; 206: 1103-1116)は、マウスモデルにおいて潜在的化学免疫療法としてＯＸ８６およびシクロホスファミドを使用した。しかしながら、ＯＸ８６はヒトＯＸ４０と結合しないと思われ、ヒトで有効な抗体を選択する場合には、Ｗｅｉｎｂｅｒｇの研究に従って、ＯＸ４０Ｌ結合部位に結合する抗体が選択されることになろう。
重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒトＯＸ４０の連結（ヒトＯＸ４０上のＯＸ４０Ｌ結合ドメインと相互作用する抗ヒトＯＸ４０特異的抗体による；ＵＳ２００９／０２１４５６０Ａ１）は抗腫瘍免疫を増強し、これがリンパ腫、前立腺癌、結腸癌および乳癌などの様々なヒト悪性腫瘍細胞株における腫瘍成長阻害をもたらす。
ヒトにおいて、ヒトＯＸ４０の連結により媒介される抗腫瘍免疫応答の正確な機序は確認されていないが、ＯＸ４０膜貫通シグナル伝達経路により媒介されると思われ、これはＯＸ４０Ｌとの相互作用により刺激される。この相互作用は、三量体ＯＸ４０ＬおよびＯＸ４０の結合によって媒介される。現行の抗癌治療では、抗ＯＸ４０抗体よりも強力な薬物として三量体を形成したＯＸ４０リガンドを使用することが奨励される(Morris et al. Mol Immunol. 2007; 44: 3112-3121)。
加えて、単剤抗ＯＸ４０治療は、免疫性の低い腫瘍には十分な抗腫瘍免疫原性を提供せず、ＯＸ４０と他の戦略の組合せを開発することも望ましい。ＯＸ４０シグナル伝達と腫瘍細胞で調節不全である他のシグナル伝達経路（例えば、血管新生経路、ＰＤ－１経路）の組合せを調節することは治療効力をさらに増進し得ることが判明している。
しかしながら、種々の癌、免疫関連疾患およびＴ細胞機能不全疾患をより良好に治療するまたは遅延させるために、当技術分野で公知の抗ＯＸ４０抗体よりもＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの結合を遮断しにくい新規な抗ＯＸ４０抗体を開発する必要がなお存在する。
発明の概要
本出願人らは驚くことに、Ｔ細胞を活性化し、Ｔ細胞により媒介される抗腫瘍活性を誘導するために、ヒトＯＸ４０に結合した抗体またはそのフラグメント（例えば、抗原結合フラグメントが使用され、ここで、前記抗体またはそのフラグメントはヒトＯＸ４０と良好に結合しつつ、ヒトＯＸ４０とＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）との結合を遮断しにくく、免疫応答の増強をもたらし得ることを見出した。
好ましくは、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞を活性化することができ、例えば、Ｔ－エフェクター細胞の免疫刺激性／エフェクター機能を増強し、かつ／またはこれらの細胞を増殖させ、かつ／またはＴ－制御細胞の免疫抑制機能を下方調節することができる。より好ましくは、この抗体は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を惹起することができる。いくつかの実施形態では、本発明のＯＸ４０抗体は、種々の癌、免疫関連疾患およびＴ細胞機能不全障害を治療するまたは遅延させるために使用することができる。
よって、本発明は、ヒトＯＸ４０またはカニクイザルＯＸ４０と結合する抗体またはそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を提供し、この抗体またはそのフラグメントは、ヒトまたはカニクイザルＯＸ４０とそのリガンドＯＸ４０Ｌとの結合を遮断しにくい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントはヒトＯＸ４０と結合しつつ、ヒトＯＸ４０とそのリガンド（ＯＸ４０Ｌ）との結合を遮断しにくく（例えば、既知のＯＸ４０抗体またはＯＸ４０Ｌと比較）、免疫応答の増強をもたらし得る。
好ましくは、ヒトまたはカニクイザルＯＸ４０とそのリガンドＯＸ４０Ｌの間の結合に対する本発明の抗体またはそのフラグメントの遮断は、ＯＸ４０Ｌリガンドまたは当技術分野で公知の他の抗ＯＸ４０抗体（例えば、ポガリズマブ）の遮断よりも小さい。より好ましくは、抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ヒトまたはカニクイザルＯＸ４０とのその強い結合（例えば、既知の抗ＯＸ４０抗体、例えば、ポガリズマブに匹敵）を維持しつつ、ヒトまたはカニクイザルＯＸ４０とそのリガンドＯＸ４０Ｌの間の結合を（例えば、ＯＸ４０Ｌの遮断よりも、またはポガリズマブの遮断よりも）遮断しにくい。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントは、ヒトＯＸ４０またはカニクイザルＯＸ４０と結合する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントは、ネズミＯＸ４０と結合しないか、またはヒトもしくはカニクイザルＯＸ４０と結合するよりもネズミＯＸ４０と結合しにくく、このネズミＯＸ４０は例えばラットＯＸ４０またはマウスＯＸ４０である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、アゴニスト活性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ヒトＯＸ４０またはカニクイザルＯＸ４０と約２００ｎＭ未満、好ましくは、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ以下、より好ましくは、約９ｎＭ以下、より好ましくは、約８ｎＭ以下、より好ましくは、約７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭまたは２ｎＭ以下のＫＤで結合し、最も好ましくは、ＫＤは約１ｎＭまたは０．８ｎＭまたは０．４ｎＭまたは０．３ｎＭまたは０．２ｎＭまたは０．１ｎＭ以下である。いくつかの実施形態では、抗体結合親和性は、バイオライト干渉法(Bio-light interferometry)（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏアフィニティー測定）またはＭＳＤアッセイを用いて決定される。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントによるヒトＯＸ４０またはカニクイザルＯＸ４０への結合は、フローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）アッセイを用いて決定される。いくつかの実施形態では、細胞内のヒトＯＸ４０またはカニクイザルＯＸ４０への結合は、約１０ｎＭ、９ｎｍまたは８ｎｍ以下のＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０またはカニクイザルＯＸ４０への結合は、約７ｎＭまたは約６ｎＭまたは約５ｎｍまたは約４ｎｍまたは約３ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーにより行ったアッセイでは、抗体または抗体フラグメントは、ＯＸ４０を発現しない対応する対照細胞と比較して、ＭＦＩ＞１０００倍の差、好ましくは、＞１１００倍の差、１２００倍の差、１３００倍の差、１４００倍の差、１５００倍の差、１６００倍の差、１７００倍の差、１８００倍の差、１９００倍の差、２０００倍の差、２１００倍の差、２２００倍の差、２３００倍の差、２４００倍の差または２５００倍の差で細胞上に発現されたＯＸ４０と結合する。
別の側面では、本発明は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）を活性化することができるアゴニスト活性を有する抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントを提供する。よって、いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントはＴ細胞を活性化することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、例えば、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞増殖を増加させること、および／またはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞のγ－インターフェロン産生を増加させること（例えば、本発明の抗ＯＸ４０抗体もしくそのフラグメントの処置前の増殖および／もしくはサイトカイン生産と比較して、または対照抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）によって処置されたＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖および／もしくはサイトカイン産生と比較して）によってＣＤ４＋エフェクターＴ細胞機能を増強する。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮｇなどのγ－インターフェロンまたはＩＬ－２などのインターロイキンである。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、腫瘍内（浸潤性）ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数（例えばＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の総数、または例えばＣＤ４５＋細胞中のＣＤ４＋細胞のパーセンテージ）を、例えば、本発明の抗ＯＸ４０抗体もしくはそのフラグメントによる処置前（または対照抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）による処置後）の腫瘍内（浸潤性）ＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較して増加させる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、γ－インターフェロンを発現する腫瘍内（浸潤性）ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、γ－インターフェロンを発現するＣＤ４＋細胞の総数、または全ＣＤ４＋細胞中のγ－インターフェロンを発現するＣＤ４＋細胞のパーセンテージ）を、例えば、本発明の抗ＯＸ４０抗体もしくはそのフラグメントによる処置前（または対照抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）により処置後）のγ－インターフェロンを発現する腫瘍内（浸潤性）ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数と比較して増加させる。
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、Ｔ細胞活性化の後に放出されるサイトカインのレベルによって評価される。よって、本発明は、ＩｇＧ対照で処置したＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン産生と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン産生を増強することができる抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、サイトカインは、γ－インターフェロン（例えば、ＩＦＮｇ）またはインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）などの炎症性サイトカインである。
好ましくは、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ－２のレベルを、対応する対照ＩｇＧｔと比較して約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０倍までまたはそれを超えて増大させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ－２のレベルを、対応する対照ＩｇＧ抗体と比較して約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７倍までまたはそれを超えて増大させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＦＮｇレベルを、対応する対照ＩｇＧ抗体と比較して１、２、３倍またはそれを超えて増大させることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のサイトカイン分泌レベルは、ＥＬＩＳＡにより決定される。
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、ＯＸ４０シグナル伝達（例えば、ＮＦκＢ下流シグナル伝達のモニタリング）によって評価される。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＯＸ４０を発現する標的細胞においてＯＸ４０シグナル伝達を増強する。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０シグナル伝達は、ＮＦｋＢ下流シグナル伝達をモニタリングすることによって検出される。
よって、本発明は、対照ＩｇＧ抗体と比較してＮＦＫＢにより媒介される転写活性レベルを増強する抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＮＦκＢにより媒介される転写活性のレベルを、対応する対照ＩｇＧ抗体と比較して約１、２、３、４、５、６、７倍またはそれを超えて増大させることができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、腫瘍内（浸潤性）ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の総数、または例えばＣＤ４５＋細胞中のＣＤ８＋のパーセンテージ）を、例えば、本発明の抗ＯＸ４０抗体もしくはそのフラグメントで処置する前（または対照抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）で処置した後）の腫瘍内（浸潤性）ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数と比較して増大させる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、γ－インターフェロンを発現する腫瘍内（浸潤性）ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、総ＣＤ８＋細胞中のγ－インターフェロンを発現するＣＤ８＋細胞のパーセンテージ）を、例えば、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントで処理する前（または対照抗体例えばＩｇＧ抗体による処置後）のγ－インターフェロンを発現する腫瘍内（浸潤性）ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞の数と比較して増大させる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、例えば、メモリーＴ細胞の増殖を増加させること、および／またはメモリー細胞におけるサイトカイン産生を増加させることによってメモリーＴ細胞機能を増強する。いくつかの実施形態では、サイトカインは、γ－インターフェロン（例えば、ＩＦＮｇ）またはインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）である。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を惹起することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ヒトエフェクター細胞と、例えば、ヒトエフェクター細胞で発現されるＦｃγＲ（例えば、活性化ＦｃγＲ）と結合する。いくつかの実施形態では、ヒトエフェクター細胞は、ＡＤＣＣエフェクター機能を遂行する（遂行することができる）。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントの機能は、抗体架橋を必要とする。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントの機能は、以下のうちの１以上である：ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖および／またはサイトカイン産生を増加させる、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の増殖および／またはサイトカイン生成を増大させる、および／またはＡＤＣＣにより細胞を減らす。いくつかの実施形態では、抗体架橋は、細胞培養プレートなどの固相表面に接着する抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を提供することによって決定される。いくつかの実施形態では、抗体架橋は、抗体のＩｇＧ Ｆｃ部分に突然変異（例えば、アミノ酸突然変異）を導入し、その変異抗体の機能を試験することによって決定される。いくつかの実施形態では、抗体架橋は、ＦｃｇＲＩＩｂにより達成される。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、抗体架橋なくその機能を達成することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＦｃｇＲＩＩｂの不在下でその機能を達成することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、より良好な抗腫瘍活性を有する。例えば、対照ＩｇＧまたは既知の抗ＯＸ４０抗体と比較して、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、対象において腫瘍体積を低減することができ、好ましくは、一方で、対象の体重に影響を及ぼさない。
本明細書に記載の対照としてのＩｇＧ抗体には、ＩｇＧ１抗体、またはＩｇＧ４抗体またはＩｇＧ２抗体、例えば、表７に示されるような軽鎖および重鎖を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体が含まれる。
好ましい実施形態では、本発明は、上記の抗ＯＸ４０抗体の特性のうち１以上を有する抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含んでなり、ここで、前記ＨＣＶＲは、
（ｉ）表Ｂに挙げられる抗体のいずれか１つのＨＣＶＲに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または
（ｉｉ）（ｉ）の配列と比較して３つのＣＤＲ領域に全部で少なくとも１つ、かつ１０もしくは５以下のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を含んでなる配列
を含んでなる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなり、ここで、前記ＬＣＶＲは、
（ｉ）表Ｂに挙げられる抗体のいずれかのＬＣＶＲに含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列；または
（ｉｉ）（ｉ）の配列と比較して３つのＣＤＲ領域に全部で少なくとも１つ、かつ１０もしくは５以下のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を含んでなる配列
を含んでなる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域ＨＣＶＲと軽鎖可変領域ＬＣＶＲを含んでなり、ここで、
（ａ）前記ＨＣＶＲは、
（ｉ）表Ｂに挙げられる抗体のいずれかのＨＣＶＲに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または
（ｉｉ）（ｉ）の配列と比較して前記３つのＣＤＲ領域に全部で少なくとも１、１０もしくは５以下のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を含んでなる配列
を含み；かつ／または
（ｂ）前記ＬＣＶＲは、
（ｉ）表Ｂに挙げられる抗体のいずれかのＬＣＶＲに含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列；または
（ｉｉ）（ｉ）の配列と比較して３つのＣＤＲ領域に全部で少なくとも１つ、かつ１０または５以下のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を含んでなる配列
を含む。
好ましい実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９もしくは１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、またはそのアミノ酸配列からなる。
好ましい実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７もしくは１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、またはからなる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および／または軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなり、ここで、
（ｉ）前記ＨＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなり、ここで、ＨＣＤＲ１は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなり、またはＨＣＤＲ１は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２もしくは３つの変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなり；ＨＣＤＲ２は、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなる、またはＨＣＤＲ２は、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２もしくは３つの変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなり；ＨＣＤＲ３は、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなり、またはＨＣＤＲ３は、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２もしくは３つの変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなり；かつ／または
（ｉｉ）ここで、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでなり、ここで、ＬＣＤＲ１は、配列番号４１、４２、４３、４４、４５および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなり、またはＬＣＤＲ１は、配列番号４１、４２、４３、４４、４５および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２もしくは３つの変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなり；ＬＣＤＲ２は、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなり、またはＬＣＤＲ２は、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２もしくは３つの変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなり；ＬＣＤＲ３は、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなり、またはＬＣＤＲ３は、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２もしくは３つの変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなる。
好ましい実施形態では、本発明は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなる抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、
（ａ）前記ＨＣＶＲは、
（ｉ）表Ａに示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の組合せ；または
（ｉｉ）前記３つのＣＤＲ領域に全部で少なくとも１つ、かつ１０もしくは５以下のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を含んでなる（ｉ）のＨＣＤＲ組合せの変異体を含み；かつ／または
（ｂ）前記ＬＣＶＲは、
（ｉ）表Ａに示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の組合せ；または
（ｉｉ）（ｉ）のＬＣＤＲ組合せの変異体、前記変異体は、前記３つのＣＤＲ領域に全部で少なくとも１つ、かつ１０または５以下のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換）を含んでなる、
を含む。
好ましい実施形態では、本発明は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなる抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、前記ＨＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなり、前記ＬＣＶＲは、（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでなり、ここで、前記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の組合せは、以下のように表される（表Ａ）：
Figure 0007046973000001
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域ＨＣＶＲおよび／または軽鎖可変領域ＬＣＶＲを含んでなり、ここで、
（ａ）重鎖可変領域ＨＣＶＲは、
（ｉ）配列番号１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９および１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなるか；または
（ｉｉ）配列番号１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９および１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９および１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１以上（好ましくは、１０以下、より好ましくは、５以下）のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、より好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなり、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域には存在せず；かつ／または
（ｂ）軽鎖可変領域ＬＣＶＲは、
（ｉ）配列番号１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなるか；
（ｉｉ）配列番号１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１以上（好ましくは、１０以下、より好ましくは、５以下）のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、より好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなる、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域には存在しない。
好ましい実施形態では、本発明は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなる抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、前記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれる重鎖可変領域ＨＣＶＲと軽鎖可変領域ＬＣＶＲの組合せは、以下のように表される（表Ｂ）：
Figure 0007046973000002
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖および／または軽鎖を含んでなり、ここで、
（ａ）重鎖は、
（ｉ）配列番号１８９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６もしくは１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなるか；
（ｉｉ）配列番号１８９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６もしくは１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号１８９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６もしくは１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１以上（好ましくは、２０もしくは１０以下、より好ましくは、５以下）のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、より好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなり、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域には存在せず、より好ましくは、前記アミノ酸変異は重鎖可変領域には存在せず；かつ／または
（ｂ）軽鎖は、
（ｉ）配列番号１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５もしくは１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなるか；
（ｉｉ）配列番号１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５もしくは１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、もしくはからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５もしくは１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１以上（好ましくは、２０もしくは１０以下、より好ましくは、５以下）のアミノ酸変異（好ましくは、アミノ酸置換、より好ましくは、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含んでなり、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域には存在せず、より好ましくは、前記アミノ酸変異は軽鎖可変領域には存在しない。
好ましい実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖と軽鎖を含んでなり、ここで、前記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれる重鎖と軽鎖の組合せは、以下の通りである（表Ｃ）：
Figure 0007046973000003
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントの重鎖は、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＬＶＰＧＳＴＧ（配列番号１８２）などのシグナルペプチド配列をさらに含んでなる。
本発明の一つの実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸変異は、アミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変異は、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＯＸ４０と結合することができ、かつ、ＯＸ４０とそのリガンドＯＸ４０Ｌとの結合を遮断しにくい。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、機能的Ｆｃ領域を有する。いくつかの実施形態では、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能はＡＤＣＣである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域またはヒトＩｇＧ２のＦｃ領域である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、以下の特徴のうち１以上を有する：
（ｉ）ＯＸ４０（特に、ヒトＯＸ４０）に対して表５に挙げられる抗体のいずれかと同じまたは同等の結合親和性および／または特異性を示す；
（ｉｉ）ＯＸ４０（特に、ヒトＯＸ４０）に対する、表５に挙げられる抗体のいずれかの結合を阻害する（例えば、競合的に阻害する）；
（ｉｉｉ）表５に示される抗体のいずれかが結合するエピトープと同じまたは重複するエピトープと結合する；
（ｉｖ）表５に示される抗体のいずれかと、ＯＸ４０（特に、ヒトＯＸ４０）との結合に関して競合する；
（ｖ）表５に挙げられる抗体のいずれかの生物学的特性のうち１以上を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、ＩｇＧｌ型の抗体またはＩｇＧ２型の抗体またはＩｇＧ４型の抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体のフレームワーク配列の少なくとも一部はヒトコンセンサスフレームワーク配列である。一つの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体はまた、その抗体フラグメント、好ましくは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）または（Ｆａｂ’）２、シングルドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）または線形抗体からなる群から選択される抗体フラグメントも包含する。
特定の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体分子は、二重特異性または多重特異性抗体分子の形態である。一つの実施形態では、二重特異性抗体分子は、ＯＸ４０に第１の結合特異性およびＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１および／もしくはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に第２の結合特異性を有する。一つの実施形態では、二重特異性抗体分子は、ＯＸ４０およびＰＤ－１と結合する。別の実施形態では、二重特異性抗体分子は、ＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１と結合する。さらに別の実施形態では、二重特異性抗体分子は、ＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ２と結合する。多重特異性抗体分子は、上記の分子に対する結合特異性の任意の組合せを持ち得る。多重特異性抗体分子は、例えば、ＯＸ４０に第１の結合特異性ならびに以下の分子：ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１もしくはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２のうち１以上に第２および第３の結合特異性を含んでなる三重特異性抗体分子であり得る。
一つの側面において、本発明は、上記の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントのいずれかをコードする核酸を提供する。一つの実施形態では、前記核酸を含んでなるベクターが提供される。一つの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。一つの実施形態では、前記ベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。一つの実施形態では、宿主細胞は、真核生物である。別の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントの生産に好適な他の細胞から選択される。別の実施形態では、宿主細胞は原核生物である。
一つの実施形態では、本発明は、抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を生産する方法を提供し、その方法は、宿主細胞を、前記抗体またはそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）をコードする核酸の発現に好適な条件下で培養すること、および場合により、前記抗体またはそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を単離することを含んでなる。一つの実施形態では、この方法は、宿主細胞から抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を回収することをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体のいずれかと細胞傷害性薬剤などの他の薬剤とを含んでなる免疫複合体を提供する。いくつかの実施形態では、免疫複合体は、癌、好ましくは、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌、胃癌、結腸癌などを治療するために使用される。
いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメント、好ましくは、その抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の免疫複合体のいずれかを含んでなる組成物を提供し、好ましくは、この組成物は医薬組成物である。一つの実施形態では、この組成物は、薬学上許容可能なアジュバントをさらに含んでなる。一つの実施形態では、組成物、例えば、医薬組成物は、本発明の抗ＯＸ４０抗体もしくはそのフラグメント、またはその免疫複合体と１以上の他の治療薬（例えば、化学療法薬、抗血管新生薬、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体）の組合せを含んでなる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、癌、好ましくは、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌、胃癌、結腸癌などの治療に使用される。
一つの側面において、本発明は、対象Ｔ細胞を活性化する、またはＴ細胞により媒介される抗腫瘍活性を誘導する、または身体の免疫応答を惹起する方法に関し、その方法は、前記対象に有効量の本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメント、免疫複合体または医薬組成物のいずれかを投与することを含んでなる。本発明はまた、対象においてＴ細胞を活性化する、またはＴ細胞により媒介される抗腫瘍活性を誘導する、または身体の免疫応答を惹起するための組成物または薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントのいずれかの使用に関する。
別の側面では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、前記対象に有効量の本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメント、免疫複合体または医薬組成物のいずれかを投与することを含んでなる方法に関する。一つの実施形態では、癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌、胃癌、結腸癌などである。別の側面では、本発明はまた、対象における癌の治療のための薬剤の製造のための本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントのいずれかの使用に関する。一つの実施形態では、癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌、胃癌、結腸癌などである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象に１以上の療法（例えば、治療様式および／または他の治療薬）を投与することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、治療様式には、手術および／または放射線療法が含まれる。いくつかの実施形態では、他の治療薬は、化学療法薬、ＰＤ－１軸結合拮抗薬（例えば、抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ２抗体）、または抗血管新生薬（例えば、ベバシズマブ）からなる群から選択される。
別の側面では、本発明は、対象において癌を治療するための薬剤の製造における、ＰＤ－１軸結合拮抗薬（例えば、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ２抗体）と組み合わせた本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントの使用に関する。一つの実施形態では、癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌、胃癌、結腸癌などである。
いくつかの実施形態では、対象または個体は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
一つの側面において、本発明は、サンプル中のＯＸ４０を検出する方法であって、（ａ）本明細書に記載のサンプルを抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントと接触させること；および（ｂ）抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントとＯＸ４０との間の複合体の形成を検出することを含んでなる方法に関する。一つの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、検出可能なように標識される。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントのいずれかを含んでなるキットまたは製品に関する。いくつかの実施形態では、キットまたは製品は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントと場合により薬学上許容可能なアジュバント、および場合により１以上の付加的な治療薬（例えば、化学療法薬、ＰＤ－１軸結合拮抗薬（例えば、抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ２抗体）、抗血管新生薬（例えば、ベバシズマブ）とを含んでなる。いくつかの実施形態では、キットまたは製品は、癌の治療のための薬剤の投与に関する説明書をさらに含んでなる。
本発明はまた、本明細書に記載の実施形態のいずれかの任意の組合せを包含する。本明細書に記載の実施形態のいずれか、またはそれらの任意の組合せは、本明細書に記載される本発明の抗ＯＸ４０抗体またはフラグメントならびにその方法および使用のいずれかおよび総てに適用可能である。
図１は、フローサイトメトリーにより測定される濃度の上昇に伴う、ＣＨＯ細胞で産生された本発明の抗体による、ＯＸ４０ＬとＣＨＯ細胞上で発現されたＯＸ４０との結合の遮断を示す。 図２は、ＰＨＡと、ＣＨＯ細胞で産生されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２型の本発明の抗体により活性化されたＰＢＭＣにおけるＴ細胞の活性化時のＩＬ－２分泌を示す。 図３は、ヒトＯＸ４０およびＮＦｋＢプロモーター－ｌｕｃで安定にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔにおける、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激とＣＨＯ細胞で生成されたＩｇＧ１またはＩｇＧ２形式の本発明の抗体による、ルシフェラーゼリポーターの検出を示す。 図４は、ヒトＯＸ４０およびＮＦｋＢプロモーター－ｌｕｃで安定にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔにおける、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激と、ＣＨＯ細胞で生成されたＩｇＧ２形式の本発明の抗体による、ルシフェラーゼリポーターの検出を示す。 図５は、ヒトＯＸ４０およびＮＦｋＢプロモーター－ｌｕｃで安定にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔにおける、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激と、ＣＨＯ細胞で生成されたＩｇＧ１またはＩｇＧ２形式の本発明の抗体による、ルシフェラーゼリポーターの検出を示す。なお、ＪｕｒｋａｔはＲａｊｉ細胞と混合する。 図６は、ヒトＯＸ４０およびＮＦｋＢプロモーター－ｌｕｃで安定にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔにおける、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激と、ＣＨＯ細胞で生成されたＩｇＧ１形式の本発明の抗体による、ルシフェラーゼリポーターの検出を示す。なお、ＪｕｒｋａｔはＲａｊｉ細胞と混合する。 図７は、ＳＥＥ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＣＨＯ細胞で産生されたＩｇＧ１またはＩｇＧ２形式の本発明のＯＸ４０抗体を用いたＤＣ共培養アッセイを示す。 図８は、Ｒａｊｉ細胞と混合した場合の、ヒトＯＸ４０およびＮＦｋＢプロモーター－ｌｕｃで安定にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞における、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の刺激と、組換えＯＸ４０ＬおよびＣＨＯ細胞で生成されたＩｇＧ１またはＩｇＧ２形式の本発明の抗体または対照（ＩｇＧ４ ポガリズマブ、ＯＸ４０Ｌ）による、ルシフェラーゼリポーターの検出を示す。 図９は、ルシフェラーゼリポーターに基づく系における、ＨＥＫ２９３細胞で生成されたＩｇＧ１形式の本発明の抗体による、ヒトＯＸ４０発現ＣＨＯ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す。 図１０は、ルシフェラーゼリポーターに基づく系における、ＨＥＫ２９３細胞で生成されたＩｇＧ２形式の本発明の抗体による、ヒトＯＸ４０発現ＣＨＯ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す。 図１１は、Ｈｕ－ＰＢＭＣ ＬｏＶｏ腫瘍マウスモデルにおける、ＮＯＧマウスにＣＨＯ細胞で生成されたＩｇＧ１形式の本発明のＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２－ｇ１抗体を投与することによる、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す（各曲線は１個体のマウスのデータを表す）。 図１２は、Ｈｕ－ＰＢＭＣ ＬｏＶｏ腫瘍マウスモデルにおける、ＮＯＧマウスにＣＨＯ細胞で生成されたＩｇＧ２形式の本発明のＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２３５１５－ｇ２抗体を投与することによる、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す（各曲線は１個体のマウスのデータを表す）。 図１３は、ＮＯＧマウスにＣＨＯ細胞で生成されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２形式の本発明のＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２－ｇ１およびＡＤＩ－２３５１５－ｇ２を投与することによる、Ｈｕ－ＰＢＭＣ ＬｏＶｏ腫瘍マウスモデルを示す。腫瘍移植後２８日目の最終の腫瘍体積測定を示す。 図１４は、ＮＯＧマウスにＣＨＯ細胞で生成されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２形式の本発明のＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２－ｇ１およびＡＤＩ－２３５１５－ｇ２を投与することによる、Ｈｕ－ＰＢＭＣ ＬｏＶｏ腫瘍マウスモデルを示す。 図１５は、ＭＣ３８担癌ＯＸ４０トランスジェニックマウスにおける、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＯＸ４０抗体の有効性に関する試験を示す。
詳細な説明
定義
本発明を以下で詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、溶液、および試薬は変更可能であるため、これらに限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される技術用語は特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解される。本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、そうではないことが定義されない限り、本発明が属する技術分野の熟練者が共通に理解しているものと同じ意味を有する。
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が使用され、単数形で使用される用語は複数形も含む場合があり、適切であればその逆もある。本明細書で使用される技術用語は特定の実施形態を記載するためのものであり、限定を意図しないと理解される。
用語「約」は、数値に関して使用される場合、下限は特定の数値の５％未満から上限は特定の数値の５％を超える範囲の数値を包含することを意味する。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原）の間の総ての非共有結合的相互作用の総和の強度を意味する。本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、特に断りのない限り、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバーの間の１：１の相互作用を表す固有の結合親和性を意味する。分子Ｘの、その相手Ｙに対する親和性は、一般に、平衡解離定数（ＫＤ）により表される。親和性は、当技術分野で公知のものおよび本明細書に記載のものを含む、当技術分野で公知の従来法によって測定することができる。
用語「抗ＯＸ４０抗体」、「抗ＯＸ４０」、「ＯＸ４０抗体」または「ＯＸ４０に結合する抗体」とは、本明細書で使用する場合、抗体が（ヒトまたはカニクイザル）ＯＸ４０を標的とする診断薬および／または治療薬として使用することができる十分な親和性で（ヒトまたはカニクイザル）ＯＸ４０タンパク質またはそのフラグメントと結合し得る抗体を意味する。一つの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはバイオライト干渉法またはＭＳＤアッセイによって測定した場合に、（ヒトまたはカニクイザル）ＯＸ４０に対する抗体の結合の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％もしくは約９０％またはそれを超える値よりも少ない程度で、非（ヒトまたはカニクイザル）ＯＸ４０タンパク質と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ヒトまたはカニクイザルＯＸ４０と、平衡の平衡解離定数（ＫＤ）、≦平衡解離ｃｏ－７Ｍ以下、例えば、１０－７Ｍ～１０－１０Ｍ、例えば、１０－８Ｍ～１０－９Ｍ）で結合する。
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、例えば、真核生物、原核生物、またはファージクローンに由来する単コピーまたはクローニング抗体を意味し、それらを生産する方法を意味するのではない。モノクローナル抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレー技術、ＣＤＲグラフティングなどの合成技術、またはこのような技術もしくは当技術分野で公知の他の技術の組合せによって生産することができる。
「天然抗体」とは、種々の構造を有する天然の免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合された２本の同一の軽鎖と２本の同一の重鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖は、重鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）とその後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、軽鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）とその後に定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づきカッパ（κ）およびガンマ（λ）と呼ばれる２タイプのうち一方に割り当てることができる。「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含んでなる。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧｌ Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ならびにそれらの天然変異体が含まれる。
「抗体フラグメント」は、完全な抗体が結合する抗原と結合する完全な抗体の一部を含んでなる、完全な抗体以外の分子を意味する。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；シングルドメイン抗体；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、抗体分子と特異的に相互作用する抗原（例えば、ＯＸ４０）の一部を意味する。この部分（本明細書ではエピトープ決定基と呼ばれる）は、一般に、アミノ酸側鎖または糖側鎖またはその成分などの要素を含んでなる。エピトープ決定基は、当技術分野で公知のまたは本明細書に開示される方法に従って（例えば、結晶学により、または水素－重水素交換により）定義することができる。エピトープ決定基と特異的に相互作用する抗体分子の少なくとも１つまたはいくつかの部分は一般に、ＣＤＲ内に位置する。一般に、エピトープは、特定の三次元構造的特徴を有する。一般に、エピトープは、特定の電荷特徴を有する。エピトープには線形エピトープもあれれば、立体配座エピトープもある。
参照抗体と同じ「同じまたは重複するエピトープと結合する抗体」は、競合アッセイにおいて参照抗体とその抗原の結合を５０％以上遮断する抗体を意味し、および逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体とその抗原の結合を５０％以上遮断する。例示的競合アッセイが本明細書に示される。
その抗原との結合に関して参照抗体と競合する抗体とは、競合アッセイにおいて参照抗体とその抗原の結合を５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％またはそれを超えて遮断する抗体を意味する。言い換えれば、参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体とその抗原の結合を５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％またはそれを超えて遮断する。多くのタイプの競合結合アッセイが、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイなどの別のアッセイとともに抗原結合タンパク質が競合するかどうかを決定するために使用できる（例えば、Stahli et al, 1983, Method in Enzymology 9: 242-253参照）。
参照抗体とその抗原の結合を阻害する（例えば、競合的に阻害する）抗体は、参照抗体とその抗原の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％またはそれを超える結合を阻害する抗体を意味する。逆に、参照抗体は、抗体とその抗原の結合を５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％またはそれを超えて阻害する。抗体とその抗原の結合は、親和性（例えば、平衡解離定数）によって測定することができる。親和性を決定するための方法は当技術分野で公知である。
参照抗体と同じまたは同等の結合親和性および／または特異性を示す抗体とは、参照抗体の結合親和性および／または特異性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％またはそれを超える割合を有する抗体を意味する。これは結合親和性および／または特異性を決定するために当技術分野で公知のいずれの方法によって決定することもできる。
当技術分野で公知の抗体にはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらの抗体のいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに細分することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼称される。当業者は、実際の要件に従って本発明の適当なクラスの抗体を選択および取得することができる。
「ＩｇＧ型の抗体」とは、抗体の重鎖定常領域が属するＩｇＧ型を意味する。同じタイプの総ての抗体の重鎖定常領域は同一であり、異なるタイプの抗体間では重鎖定常領域は異なる。例えば、ＩｇＧｌ型の抗体は、重鎖定常領域ＩｇドメインがＩｇＧ１であるＩｇドメインを意味する。
用語「機能不全」は、免疫機能不全に関して、抗原刺激に対する免疫応答性が低下した状態を意味する。用語「機能不全の」はまた、本明細書で使用する場合、抗原認識に対する不応性または不応答性、具体的には、抗原認識を下流Ｔ細胞エフェクター機能、例えば、増殖、サイトカイン産生（例えば、γインターフェロン）および／または標的細胞死滅に翻訳する能力の障害も含む。
「ＯＸ４０リガンド／ＯＸ４０ＬへのヒトＯＸ４０の結合のより低い遮断」という表現は、本明細書で使用する場合、本発明の抗体が、既知のＯＸ４０抗体（例えば、ポガリズマブ）またはＯＸ４０Ｌと比較して低い程度でＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合を遮断することを意味する。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合の程度は、既知のＯＸ４０抗体（例えば、ポガリズマブ）またはＯＸ４０Ｌの存在下でのＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合の程度と比較して、本発明の抗ＯＸ４０抗体の存在下で低下が小さくなる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体の存在下でのＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合の程度の低下は、陰性対照（例えば、ＩｇＧ抗体）の存在下でのＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合の程度と比較して約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％より低いかまたはそれを超えて低い。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合の程度は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子により決定される。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合の程度は、フローサイトメトリーにより決定される。
「Ｔ細胞を活性化する」とは、生物学的機能を更新、持続または増強するようにエフェクターまたはメモリーＴ細胞を誘導する、しむける、または刺激することを意味する。Ｔ細胞機能を増強する例としては、介入前のレベルと比較してのＣＤ８＋エフェクターＴ細胞からのγ－インターフェロン（例えば、ＩＦＮｇ）またはインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の分泌の増大、ＣＤ４＋メモリーおよび／またはエフェクターＴ細胞からのγ－インターフェロン（例えば、ＩＦＮｇ）またはインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の分泌の増大、ＣＤ４＋エフェクターおよび／またはメモリーＴ細胞の増殖の増大、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の増殖の増大、抗原応答性（例えば、排除）の増大が含まれる。一つの実施形態では、増強のレベルは、少なくとも５０％、あるいは６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０倍以上である。この増強を測定する方法は、当業者に既知である。
「腫瘍免疫」とは、腫瘍が免疫認識および排除を回避するプロセスを意味する。よって、治療概念としての腫瘍免疫は、このような回避が弱化した場合に「処置」され、腫瘍は免疫系によって認識され、攻撃される。腫瘍認識の例としては、腫瘍結合、腫瘍退縮および腫瘍排除が含まれる。
「免疫原性」とは、免疫応答を惹起する特定の物質の能力を意味する。腫瘍は免疫原性があり、腫瘍免疫原性の増強は、免疫応答による腫瘍細胞の排除の助けとなる。
「抗体のアゴニスト活性」は、本明細書で使用する場合、抗体が、抗体が結合する抗原の生物学的活性を活性化し得る活性である。
「抗血管新生薬」とは、血管の発生を遮断する、またはある程度干渉する化合物を意味する。抗血管新生薬は、例えば、血管新生の促進に関与する成長因子または成長因子受容体に結合する小分子または抗体であり得る。一つの実施形態では、抗血管新生薬は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体、例えば、ベバシズマブ（アバスチン）である。
用語「ＰＤ－１軸結合拮抗薬」とは、ＰＤ－１シグナル伝達軸に対するシグナル伝達から生じるＴ細胞の機能不全を取り除くようにＰＤ－１軸結合相手とその結合相手のうちいずれか１以上との相互作用を阻害する分子を意味し、その結果は、Ｔ細胞機能（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞死滅）を回復させるまたは増強することである。本明細書で使用する場合、ＰＤ－１軸結合拮抗薬としては、ＰＤ－１結合拮抗薬（例えば、ＰＤ－１抗体）、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）およびＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬（例えば、ＰＤ－Ｌ２抗体）が含まれる。
用語「ＰＤ－１結合拮抗薬」は、ＰＤ－１と、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２などのその結合相手のうち１以上との相互作用から生じるシグナル伝達を低下させる、遮断する、阻害する、排除するまたはそれに干渉する分子を意味する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合拮抗薬は、ＰＤ－１とその結合相手のうち１以上との結合を阻害する分子である。特定の側面において、ＰＤ－１結合拮抗薬は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２との結合を阻害する。例えば、ＰＤ－１結合拮抗薬としては、抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチドおよびＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２との相互作用から生じるシグナル伝達を低下させる、遮断する、阻害する、排除するまたはそれに干渉するその他の分子が含まれる。一つの実施形態では、ＰＤ－１結合拮抗薬は、機能不全型Ｔ細胞の機能不全を小さくする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ように、Ｔリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によってまたは細胞表面タンパク質を介して媒介される負の補助刺激シグナルにより媒介されるＰＤ－１を介したシグナル伝達を低下させる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合拮抗薬は、抗ＰＤ－１抗体である。特定の側面において、ＰＤ－１結合拮抗薬は、ＷＯ２０１５／０９５４２３に開示されるように、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ－０１１（ピジリズマブ）またはＡＭＰ－２２４である。
用語「ＰＤ－Ｌｌ結合拮抗薬」は、ＰＤ－Ｌｌとその結合相手のうちいずれか１以上、例えば、ＰＤ－１、Ｂ７－１との相互作用から生じるシグナル伝達を低下させる、遮断する、阻害する、排除するまたはそれに干渉する分子を意味する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌｌ結合拮抗薬は、ＰＤ－Ｌｌとその結合相手との結合を阻害する分子である。特定の側面において、ＰＤ－Ｌｌ結合拮抗薬は、ＰＤ－ＬｌとＰＤ－１および／またはＢ７－１との結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌｌ結合拮抗薬としては、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチドおよびＰＤ－Ｌｌとその結合相手のうち１以上、例えば、ＰＤ－１、Ｂ７－１との相互作用から生じるシグナル伝達を低下させる、遮断する、阻害する、排除するまたはそれに干渉するその他の分子が含まれる。一つの実施形態では、ＰＤ－Ｌｌ結合拮抗薬は、機能不全型Ｔ細胞の機能不全を小さくする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ように、Ｔリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によってまたは細胞表面タンパク質を介して媒介される負の補助刺激シグナルにより媒介されるＰＤ－１を介したシグナル伝達を低下させる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌｌ結合拮抗薬は、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体である。特定の側面において、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体は、ＷＯ２０１５／０９５４２３に開示されるように、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ－１１０５、ＭＰＤＬ３２８０ＡまたはＭＥＤＩ４７３６である。
用語「ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬」は、ＰＤ－Ｌ２とその結合相手のうちいずれか１以上、例えば、ＰＤ－１との相互作用から生じるシグナル伝達を低下させる、遮断する、阻害する、排除するまたはそれに干渉する分子を意味する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬は、ＰＤ－Ｌ２とその結合相手のうち１以上との結合を阻害する分子である。特定の側面において、ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬は、ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２拮抗薬としては、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチドおよびＰＤ－Ｌ２とその結合相手のうちいずれか１以上、例えば、ＰＤ－１との相互作用から生じるシグナル伝達を低下させる、遮断する、阻害する、排除するまたはそれに干渉するその他の分子が含まれる。一つの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬は、機能不全型Ｔ細胞の機能不全を小さくする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ように、Ｔリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によってまたは細胞表面タンパク質を介して媒介される負の補助刺激シグナルにより媒介されるＰＤ－Ｌ２を介したシグナル伝達を低下させる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬は、イムノアドヘシンである。
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌免疫グロブリンが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、その後、その標的細胞を細胞毒素で死滅させることを可能とする細胞傷害の一形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃｙＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球はＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、およびＦｃｙＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の第４６４頁の表３にまとめられている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号または米国特許第６，７３７，０５６号（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されているものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が含まれる。代わりに、または加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているものなどの動物モデルで評価することができる。ＡＤＣＣ活性を評価するための例示的アッセイは、本明細書の例に示されている。
本明細書で使用する場合、用語「ＯＸ４０」は、特に断りのない限り、霊長類（例えば、ヒト、カニクイザル）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含むいずれの脊椎動物源に由来するいずれの天然ＯＸ４０も意味する。この用語は、「全長」、非プロセシングＯＸ４０および細胞内でのプロセシングによるいずれの形態のＯＸ４０も包含する。この用語はまた、スプライス変異体または対立遺伝子変異体などのＯＸ４０の天然変異体も包含する。
「ＯＸ４０活性化」とは、ＯＸ４０受容体の活性化を意味する。一般に、ＯＸ４０の活性化は、シグナル伝達をもたらす。
用語「細胞傷害性薬剤」は、本発明で使用する場合、細胞機能を阻害するもしくは妨げる、および／または細胞死または破壊を引き起こす物質を意味する。細胞傷害性薬剤の例については、ＷＯ２０１５／１５３５１３に開示されているものを参照。
「化学療法薬」には、癌の治療に有用な化学化合物を含む。化学療法薬の例については、ＷＯ２０１５／１５３５１３に開示されているものを参照。これには、エルロチニブ（タルセバ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ベルケード（商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、ジスルフィラム、アルキル化剤、例えば、チオテパ；スルホン酸アルキル；アジリジンなど；および上記のいずれかの薬学上許容可能な塩、酸、または誘導体が含まれる。化学療法薬としてはまた、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、インターフェロン、ベバシズマブ(bevacuzimab)、ベキサロテンなど、およびそれらの薬学上許容可能な塩も含まれる。化学療法薬としてはまた、鎮痛、解熱および抗炎症作用を有する非ステロイド系抗炎症薬も含まれる。本発明に使用可能な種々の化学療法薬の詳細な説明および概論については、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされるＰＣＴ国際出願ＷＯ２０１５／１５３５１３に開示されているものを参照されたい。
用語「サイトカイン」は、細胞間伝達物質として別の細胞に働きかけるある細胞集団によって放出されるタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン；インターロイキン（ＩＬ）例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－ｌα、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ－αまたはＴＮＦ－β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）ならびにγインターフェロンを含む他のポリペプチド因子がある。本明細書で使用する場合、サイトカインという用語には、天然源または組換え細胞培養由来のタンパク質、ならびに合成により生産された小分子実体およびそれらの薬学上許容可能な誘導体および塩を含む天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
用語「ダイアボディ」は、同じポリペプチド鎖に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が連結したもの（ＶＨ－ＶＬ）を含んでなり、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメント、および前記抗体フラグメントを意味する。これらのドメインは、同じ鎖上の２つのドメインを互いに対合させるには短いリンカーを使用することによって、他鎖上の相補的ドメインと対合して２つの抗原結合部位を形成することを余儀なくされる。ダイアボディは、二価または二重特異性であってよい。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Hudson et al, Nat. Med. 9: 129-134 (2003)；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)にさらに詳細に記載されている。トリアボディおよびテトラボディもまたHudson et al, Nat. Med. 9: 129-134 (2003)に記載されている。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」としては、Ｃｌｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節などが含まれる。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせることを必要とし、本明細書に開示されているような様々なアッセイを用いて評価することができる。
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を意味し、これは抗体同位体によって異なる。抗体エフェクターの機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；およびＢ細胞活性化が含まれる。
「ヒトエフェクター細胞」とは、１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を遂行する白血球を意味する。特定の実施形態では、細胞は少なくともＦｃｙＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を遂行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が含まれる。エフェクター細胞は、天然源、例えば、血液から単離され得る。
用語「有効量」は、患者に単回または複数回用量で投与した際に、治療を受ける患者に所望の効果をもたらす本発明の抗体またはフラグメントの量または用量を意味する。有効量は、当業者としての主治医により、哺乳動物の種；その大きさ、齢および健康状態；関与する特定の疾患；疾患の程度または重篤度；個々の患者の応答；投与される特定の抗体；投与様式；投与される処方物のバイオアベイラビリティ特性；選択される投与計画；および任意の並行療法の使用などの様々な因子を考慮することによって容易に決定することができる。
本発明での使用に好適な「抗体およびそれらの抗原結合フラグメント」としては、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、ヘテロコンジュゲート、多重特異性、組換え、異種、異型接合性、キメラ、ヒト化（特にＣＤＲにグラフとされたもの）、脱免疫化、またはヒト抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されたフラグメント、Ｆｄ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ダイアボディまたはテトラボディ(Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (14), 6444-6448)、ナノボディ（シングルドメイン抗体とも呼ばれる）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる。
用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために本明細書で使用され、Ｆｃ領域は、定常領域の少なくとも一部を含んでなる。この用語には天然Ｆｃ領域配列およびＦｃ領域変異体が含まれる。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボニル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。特に断りのない限り、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National. Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体と抗原の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを意味する。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインは一般に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)参照）。シングルＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するに十分であり得る。さらに、それぞれ相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、抗原と結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを用いて特定の抗原と結合する抗体を単離してもよい。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)参照。
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）（例えば、相補性決定領域）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる。よって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は一般に、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ））内に以下の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４で見られる。
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメイン内の配列が超可変であり、構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、エピトープとの結合を主要に担う。重鎖および軽鎖のＣＤＲは、一般に、Ｎ末端から順番に符番してＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。抗体重鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体軽鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。所与の軽鎖可変領域または重鎖可変領域アミノ酸配列において、各ＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、例えば、抗体の三次元構造とおよびＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ(Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883, Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))、抗体配列の変動に基づくＫａｂａｔ(Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987))、ＡｂＭ（バース大学）、Ｃｏｎｔａｃｔ（ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）(imgt.cines.fr/ on the World Wide Web)、および多数の結晶構造を用いたアフィニティープロパゲーションクラスタリングに基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義を含むいくつかの周知の抗体ＣＤＲ割り当てシステムの１つまたは組合せを用いて決定することができる。本発明の抗体のＣＤＲの境界は、当業者により、異なる割り当てシステムまたは組合せなどの当技術分野のいずれかの側面に従って決定することができる。
しかしながら、異なる割り当てシステムに基づいて得られた同じ抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる場合があることに留意するべきである。すなわち、異なる割り当てシステムで定義された同じ抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる。よって、抗体が本発明により定義される特定のＣＤＲ配列によって定義される場合、その抗体の範囲は、可変領域配列がその特定のＣＤＲ配列を含んでなるが、異なるプロトコール（例えば、異なる割り当てシステムまたは組合せ）の適用のために本発明によって定義された特定のＣＤＲ境界とは異なるＣＤＲ境界が主張される抗体も包含する。
異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかしながら、ＣＤＲは抗体によって異なるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸だけが抗原結合に直接関わる。抗原結合の「最小結合単位」を得るために、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ、およびＮｏｒｔｈ法のうち少なくとも２つを用いて最小の重複領域を決定することができる。最小結合単位は、ＣＤＲの下位部分であり得る。当業者には自明であるように、ＣＤＲ配列の残りの部分の残基は、抗体の構造およびタンパク質折り畳みによって決定することができる。よって、本発明はまた、本明細書で提供されるＣＤＲのいずれかの変異体も企図する。例えば、あるＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基は不変のままであり得るが、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｃｈｉａにより定義された他のＣＤＲ残基は保存的アミノ酸残基によって置換されてもよい。
用語「宿主細胞」は、外因性の核酸が導入された細胞を意味し、このような細胞の後代を含む。宿主細胞としは、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これには初代形質転換細胞および継代数によらずそれに由来する後代が含まれる。後代は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含み得る。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異後代が本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生されたまたはヒト抗体レパートリーまたはその他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源から誘導された抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も多く存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブタイプからである。一般に、配列のサブタイプは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に開示されているようなサブタイプである。ある実施形態では、ＶＬに関して、サブタイプは、Ｋａｂａｔら前掲のようなサブタイプκＩである。いくつかの実施形態では、ＶＨに関して、サブタイプは、Ｋａｂａｔら前掲のようなサブタイプＩＩＩである。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含んでなるキメラ抗体を意味する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に総てを含んでなり、ここで、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の総てまたは実質的に総ては非ヒト抗体に相当し、ＦＲの総てまたは実質的に総てはヒト抗体に相当する。ヒト化抗体は場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部含んでなり得る。「ヒト化型」の抗体、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を受けた抗体を意味する。
用語「癌」および「癌性」は、一般に調節を欠いた細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理状態を意味する、または表す。癌の例としては、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより詳しい例としては、限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)（消化管癌および消化管間質癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌(kidney or renal cancer)、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、肢端黒子型黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、メイグス症候群に関連する異常な血管増殖、脳および頭頸部癌、および関連の転移が含まれる。特定の実施形態では、本発明の抗体による治療を受け得る癌としては、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌、胃癌または結腸癌が含まれ、それらの癌の転移形態も含む。
用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を意味する。一つの実施形態では、細胞増殖性障害は癌である。
用語「腫瘍」は、悪性であれ良性であれ、総ての新生細胞成長および増殖、ならびに総ての前癌および癌性細胞および組織を意味する。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書に言及される場合、相互に排他的ではない。
「免疫複合体」とは、限定されるものではないが細胞傷害性薬剤を含む１以上の他の薬剤にコンジュゲートされた抗体である。
「個体」または「対象」としては、哺乳動物が含まれる。哺乳動物としては、限定されるものではないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。本発明の特定の実施形態では、個体または対象はヒトである。
「単離された抗体」は、その天然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定した場合に９５％または９９％純度よりも高く精製される。抗体純度の評価方法の総説としては、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)参照。
「単離された核酸」は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸としては、通常に核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、この核酸分子は染色体外に存在するか、またはその天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。
「抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントをコードする単離された核酸」とは、抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖および軽鎖をコードする１以上の核酸分子を意味し、単一のベクターまたは別のベクターに含まれるこのような核酸分子、ならびに宿主細胞内の１以上の位置に存在するこのような核酸分子を含む。
参照ポリペプチド配列に対しての「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインし、最大配列同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入した後、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮せずに、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一の、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、当技術分野において様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公開コンピューターソフトウエアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを得るために必要なアルゴリズムを含め、配列のアラインのために適当なパラメーターを決定することができる。
配列同一性のパーセンテージが本明細書に言及される場合、これらのパーセンテージは、そうではないことが示されない限り、より長い配列の全長に対して計算される。より長い配列の全長に対する計算は、核酸配列およびポリペプチド配列の両方に当てはまる。
用語「医薬組成物」は、そこに含まれる有効成分の生物学的活性を有効とするような形態にあり、かつ、処方物が投与される対象に許容されない毒性がある付加的成分を含有しない処方物を意味する。
用語「薬学上許容可能なアジュバント」は、治療薬と併用投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全および不完全））、賦形剤またはビヒクルを意味する。
本明細書で使用する場合、「治療する」とは、既存の症状、病態、障害、または疾患の進行または重篤度を緩徐化する、中断する、阻止する、緩和する、停止させる、軽減する、または逆転させることを意味する。
用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、それが連結された別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターが含まれる。ある種のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を命令することができる。このようなベクターは本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
「対象／患者サンプル」とは、癌患者または癌対象から得られた細胞の集合物または流体を意味する。組織または細胞サンプルの供給源は、新鮮な、凍結および／または保存された器官または組織サンプルまたは生検もしくは穿刺物に由来するものなどの固形組織；血液または任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹腔液、または間質液などの体液；対象の妊娠または発生のいずれかの時点からの細胞であり得る。組織サンプルは、保存剤、抗凝固剤、バッファー、固定剤、栄養素、または抗生物質などの、天然の組織とは本来混合されていない特定の化合物であり得る。本明細書における腫瘍サンプルの例としては、限定されるものではないが、腫瘍生検、穿刺吸引物、気管支洗浄液、胸膜液、痰、尿、外科術検体、循環腫瘍細胞、血清、血漿、循環血漿タンパク質、腹水、腫瘍に由来するまたは腫瘍様特性を示す初代細胞培養物または細胞株、ならびに保存腫瘍サンプル、例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍サンプルまたは凍結腫瘍サンプルが含まれる。
本明細書に定義されるキットまたは製品に含まれる「説明書」は、適応症、用途、用量、投与、併用療法、禁忌および／またはこのような治療製品に関する適用の注意についての情報を含む治療製品の市販パッケージに一般に含まれる説明書を意味する。
本発明の抗体
よって、本発明は、抗ＯＸ４０抗体ならびにそのフラグメントを提供する。
本発明の一つの実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸変異としては、アミノ酸の置換、挿入または欠失が含まれる。好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変異は、アミノ酸置換、好ましくは、保存的置換である。
好ましい実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸変異は、ＣＤＲ外（例えば、ＦＲ内）の領域に存在する。より好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変異は、重鎖可変領域外および／または軽鎖可変領域外の領域に存在する。
いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換である。保存的置換は、あるアミノ酸が同じクラス内の別のアミノ酸で置換される、例えば、ある酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸で置換されるか、ある塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸で置換されるか、またはある中性アミノ酸は別の中性アミノ酸で置換されることを意味する。例示的置換を以下の表Ｄに示す。
Figure 0007046973000004
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖または重鎖に翻訳後修飾を有する抗体またはそのフラグメントを包含する。
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または低減するために変更される。抗体に対するグリコシル化部位の付加または削除は、好都合には、１以上のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって達成され得る。いくつかの適用では、所望でないグリコシル化部位を除去する改変は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増強するためにフコースモジュールを除去する有用な改変であり得る（Shield et al. (2002) JBC 277: 26733参照）。他の適用では、ガラクトシル化の改変は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変更するために実施することができる。
特定の実施形態では、例えば、癌または細胞増殖疾患の治療において抗体の効率を高めるために、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に１以上のアミノ酸改変が導入され、それにより、Ｆｃ領域変異体を作出することができる。Ｆｃ領域変異体は、１以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含んでなるヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでなり得る。
特定の実施形態では、抗体の１以上の残基がシステイン残基で置換されたシステイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作出することが望ましい場合がある。
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手できるある特定の付加的非タンパク質部分へとさらに改変することができる。抗体の誘導体化に好適な部分としては、限定されるものではないが、水可溶性ポリマーが含まれる。水可溶性ポリマーの限定されない例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびグルカンまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＯＸ４０抗体のフラグメントを包含する。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントにより形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体に対するパパイン消化により生成される２つの同一の抗原結合フラグメントは「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれ、それぞれ単一の抗原結合部位と残部の「Ｆｃ」フラグメントを有する。その名称は、結晶化しやすい能力を表す。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはペプシン処理によって生成され、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原架橋能がある。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、ヒト化抗体である。その総ての内容が引用することにより本明細書の一部とされるＡｌｍａｇｒｏ ＆ Ｆｒａｎｓｓｏｎｓ(Almagro JC and Fransson J (2008) Frontiers in Bioscience 13: 1619-1633)に概説されているように、抗体をヒト化するための種々の方法は当業者に知られている。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の多様な技術を用いて調製することができる。ヒト抗体は一般に、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol 5: 368-74 (2001)およびLonberg, Curr. Opin. Immunol 20: 450-459 (2008)に記載されている。
本発明の抗体は、コンビナトリアルライブラリーを所望の１または複数の活性を有する抗体に関してスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、ファージディスプレーライブラリーを作出し、そのようなライブラリーを所望の結合特性を有する抗体に関してスクリーニングするための多様な方法が当技術分野で公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)にさらに記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、他の薬剤、例えば、治療用成分、例えば、細胞傷害性薬剤または免疫抑制薬（「免疫複合体」）にコンジュゲートされた抗ＯＸ４０モノクローナル抗体を包含する。細胞傷害性薬剤としては、細胞に有害な薬剤が含まれる。免疫複合体を形成するのに好適な細胞傷害性薬剤（例えば、化学療法薬）の例は当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１参照。例えば、細胞傷害性薬剤としては、限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたはその他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸ヒドロラーゼなどの酵素およびそれらのフラグメント；抗生剤；細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素（それらのフラグメントおよび／または変異体を含む）などの毒素；ならびに種々の周知の抗腫瘍または抗癌薬が含まれる。一つの実施形態では、細胞傷害性薬剤は、ＰＤ－１軸結合拮抗薬である。一つの実施形態では、細胞傷害性薬剤は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ２抗体などの抗体である。一つの実施形態では、細胞傷害性薬剤は、ベバシズマブなどの抗血管新生薬である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。多重特異性モノクローナル抗体は、標的ポリペプチドの種々のエピトープに特異的であってもよいし、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含んでもよい。例えば、Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60-69参照。抗ＯＸ４０モノクローナル抗体は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質に連結してもよいし、またはそれと共発現させてもよい。例えば、抗体またはそのフラグメントは、第２またはそれを超える結合特異性を有する二重特異性または多重特異性を作製するために、抗体別の抗体または抗体フラグメント（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ２抗体または前記抗体のフラグメント）などの１以上の他の分子と機能的に連結してよい（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合、またはその他による）。
本発明の核酸抗体およびそれを含んでなる宿主細胞
一つの側面において、本発明は、上記の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントのいずれかをコードする核酸を提供する。核酸は、抗体の軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域を含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸、または抗体の軽鎖および／もしくは重鎖を含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなり得る。抗体の重鎖可変領域をコードする例示的核酸配列は、配列番号９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４もしくは１０５から選択される核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である核酸配列を含んでなるか、または配列番号９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４もしくは１０５から選択される核酸配列を含んでなる。抗体の軽鎖可変領域をコードする例示的核酸配列は、配列番号１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８もしくは１２９から選択される核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である核酸配列を含んでなるか、または配列番号１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８もしくは１２９から選択される核酸配列を含んでなる。
一つの実施形態では、前記核酸を含んでなる１以上のベクターが提供される。一つの実施形態では、ベクターは、発現ベクター、例えば、真核生物の発現ベクターである。ベクターとしては、限定されるものではないが、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージ、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。好ましい実施形態では、本発明の発現ベクターは、ｐＴＴ５発現ベクターである。
一つの実施形態では、前記ベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。抗体コードベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には、細菌で生産されてよい。細菌での抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、および同第５，８４０，５２３号参照。また、大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載しているCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003, pp. 245-254も参照。発現後、抗体は、可溶性画分の細菌細胞ペーストから単離すればよく、さらに精製することができる。
一つの実施形態では、宿主細胞は、真核生物である。別の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントの生産に使用するのに好適なその他の細胞からなる群から選択される。例えば、糸状真菌または酵母などの真核生物微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。例えば、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌および酵母株は、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の生産をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004)、およびLi et al, Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006)参照。グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。脊椎動物細胞もまた宿主として使用することができる。例えば、懸濁増殖に好適となるように操作された哺乳動物細胞株も使用可能である。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児腎臓株（例えばGraham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)などに記載されているような２９３ＨＥＫまたは２９３細胞）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞(Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体の生産に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説としては、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)参照。
一つの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体を生産する方法が提供され、その方法は、上記に提供されるような抗体発現に好適な条件下で抗体をコードする核酸を含んでなる宿主細胞を培養すること、および場合により、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含んでなる。抗ＯＸ４０抗体を生産するように組み換えるために、抗体（例えば上記のような抗体）をコードする核酸を単離し、宿主細胞でのさらなるクローニングおよび／または発現のための１以上のベクターに挿入する。このような核酸は、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離し配列決定を行うことができる。
決定法
本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによってそれらの物理／化学的特性および／または生物学的活性に関して同定、スクリーニング、または特性決定を行うことができる。一つの側面において、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原結合活性に関して試験される。ＯＸ４０への結合は当技術分野で公知の方法を用いて決定することができ、例示的方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、バイオライト干渉法（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏアフィニティー測定）またはＭＳＤアッセイが使用される。
別の側面では、ＯＸ４０との結合に関して本明細書で開示される抗ＯＸ４０抗体のいずれかと競合する抗体を同定するために競合アッセイが使用できる。特定の実施形態では、このような競合抗体は、本明細書で開示される抗ＯＸ４０抗体のいずれかが結合するエピトープと同一であるまたは重複するエピトープ（例えば、線形または立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープの位置を決定するための詳細な例示的方法は、Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に見出せる。
本発明はまた、生物学的に活性な抗ＯＸ４０抗体を同定するためのアッセイも提供する。生物学的活性としては、例えば、ＯＸ４０への結合（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＯＸ４０への結合）、ＯＸ４０により媒介されるシグナル伝達の増強（例えば、ＮＦｋＢにより媒介される転写の増強）、ヒトＯＸ４０を発現する細胞のＡＤＣＣによる弱化、Ｔエフェクター細胞機能（例えば、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞）の増大（例えば、エフェクターＴ細胞の増殖の増大および／またはエフェクターＴ細胞のサイトカイン産生（例えば、γインターフェロンもしくはインターロイキン）の増大による）、メモリーＴ細胞機能（例えば、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞）の増大（例えば、メモリーＴ細胞増殖の増大および／またはメモリーＴ細胞のサイトカイン産生（例えば、γインターフェロンもしくはインターロイキン）の増大による）、ヒトエフェクター細胞への結合を含み得る。ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、このような生物学的活性に関して試験される。
Ｔ細胞の活性化は、当技術分野で公知の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、Ｔ細胞の活性化は、γインターフェロンまたはインターロイキンなどのＴ細胞活性化後に放出されるサイトカインのレベルによって決定される。ＯＸ４０シグナル伝達はまた、Ｔ細胞の活性化を判定するための当技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。一つの実施形態では、リポーター遺伝子（例えば、βルシフェラーゼ）に融合されたＮＦｋＢプロモーターを含んでなる、ヒトＯＸ４０およびリポーター遺伝子を発現するトランスジェニック細胞が作出される。細胞に抗ＯＸ４０抗体を付加するとＮＦｋＢ転写が上昇し、これはリポーター遺伝子に関するアッセイ（例えば、ルシフェラーゼリポーターアッセイ）を用いて検出される。
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのいずれかで使用するための細胞としては、ＯＸ４０を天然に発現するか、またはＯＸ４０を発現するように操作された細胞または細胞株が含まれる。このような細胞としては、ＯＸ４０を天然に発現する活性化されたＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、および活性化されたメモリーＴ細胞が含まれる。このような細胞にはまた、ＯＸ４０を発現する細胞株および通常ＯＸ４０を発現しないがＯＸ４０をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞株も含まれる。
上記のアッセイはいずれも、抗ＯＸ４０抗体を本発明の免疫複合体に置き換えるか、または抗ＯＸ４０抗体に本発明の免疫複合体を補うことによって行えることが認識されるであろう。
上記のアッセイはいずれも抗ＯＸ４０抗体および他の活性薬剤を用いて行えることが認識されるであろう。
医薬組成物および医薬製剤
本発明はまた、抗ＯＸ４０抗体またはその免疫複合体を含んでなる組成物（医薬組成物または医薬製剤を含む）および抗ＯＸ４０抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなる組成物を含む。特定の実施形態では、組成物は、ＯＸ４０と結合する１以上の抗体もしくはそのフラグメントまたはＯＸ４０と結合する１以上の抗体またはそのフラグメントをコードする１以上のポリヌクレオチドを含んでなる。これらの組成物はまた、バッファーを含め、当技術分野で公知の薬学上許容可能な担体、薬学上許容可能な賦形剤などの好適な薬学上許容可能なアジュバントを含んでよい。
本発明において使用するのに好適な薬学上許容可能な担体は、水、および石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油などの無菌の液体であり得る。水は、医薬組成物が静脈投与される場合には好ましい担体である。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体担体として使用可能であり、特に、注射溶液として使用される。好適な製薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリル、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。賦形剤およびその使用に関しては、"Handbook of Pharmaceutical Excipients", 第5版, R. C. Rowe, P. J. Seskey and S. C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicagoも参照。所望により、組成物はまた、微量の湿潤剤、乳化剤、またはｐＨバッファーも含有してよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態であり得る。経口処方物は、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンなどの標準的な担体を含有してよい。
本発明の抗ＯＸ４０抗体を含んでなる医薬製剤は、所望の純度を有する本発明の抗ＯＸ４０抗体を１以上の任意選択の薬学上許容可能なアジュバントと混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.,編 (1980))、好ましくは、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。
例示的凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号およびＷＯ２００６／０４４９０８（後者はヒスチジン－酢酸バッファーを含む）に記載されているものが含まれる。
本発明の医薬組成物または処方物はまた、治療される特定の適応症に必要とされる１以上の有効成分、好ましくは、互いの補完的活性に悪影響を及ぼさない有効成分を含有してもよい。例えば、化学療法薬、ＰＤ－１軸結合拮抗薬（例えば、抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ２抗体）または抗血管新生薬（例えば、ベバシズマブ）などの他の抗癌有効成分をさらに提供することも望ましい。有効成分は、好適には、意図される使用に有効な量で組み合わせて存在する。
徐放性処方物が好ましい場合がある。徐放性処方物の好適な例としては、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスはフィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態である。
本発明の抗体を含んでなる医薬製剤の他の成分に関しては、ＷＯ２０１５／１５３５１３に開示されているものも参照されたい。
抗体処置および使用
一つの側面において、本発明は、対象においてＴ細胞を活性化する、またはＴ細胞により媒介される抗腫瘍活性を誘導する、または身体の免疫応答を増強する方法であって、前記対象に有効量の抗ＯＸ４０抗体もしくはそのフラグメントのいずれか、または前記抗体もしくはフラグメントを含んでなる免疫複合体もしくは医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
別の側面では、本発明は、対象において腫瘍、例えば、癌を治療する方法であって、前記対象に有効量の本明細書に記載のいずれかの抗ＯＸ４０抗体もしくはそのフラグメント、または免疫複合体もしくは前記抗体もしくはフラグメントを含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関する。一つの実施形態では、癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌、胃癌、結腸癌などである。
別の側面では、本発明は、対象において抗体依存性細胞介在性細胞傷害を惹起する方法であって、前記対象に有効量の本明細書に記載のいずれかの抗ＯＸ４０抗体もしくはそのフラグメント、または前記抗体もしくはフラグメントを含んでなる免疫複合体もしくは医薬組成物を投与することを含んでなるに関する。
別の側面では、本発明は、対象において種々の癌、免疫関連疾患、およびＴ細胞機能不全疾患を治療するまたは遅延させる方法であって、前記対象に有効量の本明細書に記載のいずれかの抗ＯＸ４０抗体もしくはそのフラグメント、または前記抗体もしくはフラグメントを含んでなる免疫複合体もしくは医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象に１以上の療法（例えば、治療様式および／または他の治療薬）を投与することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、治療様式には、手術および／または放射線療法が含まれる。いくつかの実施形態では、他の治療薬は、化学療法薬、ＰＤ－１軸結合拮抗薬（例えば、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ２抗体）、抗血管新生薬（例えば、ベバケート(bevacate)）ビーズモノクローナル抗体）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、対象または個体は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
他の態様において、本発明は、上述の関連の疾患または病態の治療のための薬剤の製造または調製における抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントの使用を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその抗体フラグメントは、病態および／またはその病態に関連する症状の発症を遅延させ得る。
いくつかの実施形態では、本発明に好適な癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌、胃癌、結腸癌などからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、癌の例は、限定されるものではないが、Ｂ細胞増殖性障害がさらに含まれ、これには限定されるものではないが、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））およびリンパ球性白血病がさらに含まれる。
本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の癌は、ヒトエフェクター細胞（例えば、ヒトエフェクター細胞浸潤物）を呈する。ヒトエフェクター細胞を検出するための方法は当技術分野で周知であり、例えばＩＨＣによるものを含む。いくつかの実施形態では、癌は、高レベルのヒトエフェクター細胞を呈する。いくつかの実施形態では、ヒトエフェクター細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球のうち１以上である。
本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の癌は、ＦｃＲを発現する細胞（例えば、ＦｃＲを発現する細胞の浸潤物）を呈する。ＦｃＲを検出するための方法は当技術分野で周知であり、例えばＩＨＣによるものを含む。いくつかの実施形態では、癌は、高レベルのＦｃＲ発現細胞を呈する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＦｃγＲである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＦｃγＲを活性化している。いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経芽腫、黒色腫、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、または肝細胞癌である。
本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、アゴニスト活性を有する本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントの投与を腫瘍抗原の投与と組み合わせる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、タンパク質を含んでなる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、核酸を含んでなる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および使用は、対象に１以上の療法（例えば、治療様式および／または他の治療薬）を投与することをさらに含んでなる。本発明の抗体は、療法において単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの付加的治療薬と併用投与してもよい。
このような組合せ療法は、組合せ投与（例えば、２種類以上の治療薬が同じまたは別の処方物に含まれる）、および個別投与（この場合、本発明の抗体の投与は、１または複数の付加的治療薬の投与前、投与と同時、および／または投与後に行うことができる）を包含する。一つの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体の投与と付加的治療薬の投与は、互いに約１か月以内、または約１週間、２週間もしくは３週間以内、または約１日、２日、３日、４日、５日、もしくは６日以内に行う。本発明の抗体はまた、手術または放射線療法と組み合わせて使用することができる。
いくつかの実施形態では、治療様式には、手術（例えば、腫瘍切除）；放射線療法（例えば、照射領域が設計される三次元等角放射線療法を含む外部粒子線療法）、局所照射（例えば、予め選択した標的もしくは器官に向けた照射）または焦点照射）が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、化学療法または化学療法薬と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、放射線療法または放射線療法薬と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、標的療法または標的治療薬と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、免疫療法または免疫治療薬、例えば、モノクローナル抗体と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＰＡＲＰ阻害剤（例えば、オラパラニブ(Olaparanib)、ルカパリブ、ニラパリブ、セディラニブ、ＢＭＮ６７３、ベリパリブ）と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＰＤ－１軸結合拮抗薬と組み合わせて投与することができる。ＰＤ－１軸結合拮抗薬としては、限定されるものではないが、ＰＤ－１結合拮抗薬、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬およびＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬が含まれる。「ＰＤ－１」の別称には、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２が含まれる。「ＰＤ－Ｌ１」の別称には、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－４、ＣＤ２７４、およびＢ７－Ｈが含まれる。「ＰＤ－Ｌ２」の別称には、Ｂ７－ＤＣ、Ｂｔｄｃ、およびＣＤ２７３が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＰＤ－Ｌ２は、ヒトＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合拮抗薬は、ＰＤ－１とそのリガンドまたは結合相手との結合を阻害する分子である。特定の側面において、ＰＤ－１リガンドは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２である。別の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬は、ＰＤ－Ｌ１とその結合相手との結合を阻害する分子である。特定の側面において、ＰＤ－Ｌ１結合相手は、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬は、ＰＤ－Ｌ２とその結合相手との結合を阻害する分子である。特定の側面において、ＰＤ－Ｌ２結合相手は、ＰＤ－１である。拮抗薬は、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合拮抗薬は、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ、オプジーボ）、Ｍｅｒｃｋ ３４７５（ＭＫ－３４７５、ペンブロリズマブ、キートルーダ）およびＣＴ－０１１（ピジリズマブ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合拮抗薬は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の細胞外またはＰＤ－１結合部分を含んでなるイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合拮抗薬は、ＡＭＰ－２２４である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬は、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６およびＭＤＸ－１１０５からなる群から選択される。ＭＤＸ－１１０５は、ＢＭＳ－９３６５５９としても知られ、ＷＯ２００７／００５８７４に記載されている抗ＰＤ－Ｌｌ抗体である。抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（それぞれ配列番号２０および２１で示される重鎖および軽鎖可変領域配列）は、ＷＯ２０１０／０７７６３４ Ａｌに記載されている抗ＰＤ－Ｌｌである。ＭＤＸ－１１０６は、ＭＤＸ－１１０６－０４、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８またはニボルマブとしても知られ、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。Ｍｅｒｃｋ ３４７５は、ＭＫ－３４７５、ＳＣＨ－９００４７５またはペンブロリズマブとしても知られ、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１は、ｈＢＡＴ、ｈＢＡＴ－１またはピジリズマブとしても知られ、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ＡＭＰ－２２４は、Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られ、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ－１１０６である。「ＭＤＸ－１１０６」の別称には、ＭＤＸ－１１０６－０４、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８またはニボルマブが含まれる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｕｍｂｅｒ： ９４６４１４－９４－４）である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、活性化補助刺激分子に対するアゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、活性化補助刺激分子としては、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、またはＣＤ１２７を含み得る。いくつかの実施形態では、活性化補助刺激分子に対するアゴニストは、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、またはＣＤ１２７に結合するアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、阻害性補助刺激分子に対するアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、阻害性補助刺激分子としては、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２としても知られる）、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、またはアルギナーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、阻害性補助刺激分子に対するアンタゴニストは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３（例えば、ＬＡＧ－３－ＩｇＧ融合タンパク質（ＩＭＰ３２１））、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、またはアルギナーゼに結合するアンタゴニスト抗体である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＴＬ）養子免疫細胞移入を含んでなる処置と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、血管新生阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ベバシズマブ（アバスチン（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、血管新生阻害剤と組み合わせて、また、ＰＤ－１軸結合拮抗薬（例えば、抗ＰＤ－１抗体などのＰＤ－１結合拮抗薬、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体などのＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬、および抗ＰＤ－Ｌ２抗体などのＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ベバシズマブおよびＰＤ－１軸結合拮抗薬（例えば、抗ＰＤ－１抗体などのＰＤ－１結合拮抗薬、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体などのＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬、および抗ＰＤ－Ｌ２抗体などのＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ベバシズマブおよびＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ、オプジーボ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ベバシズマブおよびＭｅｒｃｋ ３４７５（ＭＫ－３４７５、ペンブロリズマブ、キートルーダ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ベバシズマブおよびＣＴ－０１１（ピジリズマブ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ベバシズマブおよびＹＷ２４３．５５．Ｓ７０と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ベバシズマブおよびＭＰＤＬ３２８０Ａと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ベバシズマブおよびＭＥＤＩ４７３６と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ベバシズマブおよびＭＤＸ－１１０５と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、抗腫瘍薬剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、オビヌツズマブおよびＰＤ－１軸結合拮抗薬（例えば、抗ＰＤ－１抗体などのＰＤ－１結合拮抗薬、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体などのＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬、および抗ＰＤ－Ｌ２抗体などのＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬）と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、癌ワクチンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、ペプチド癌ワクチンであり、いくつかの実施形態では、個別化ペプチドワクチンである。いくつかの実施形態では、ペプチド癌ワクチンは、多価長鎖ペプチド、マルチペプチド、ペプチドカクテル、ハイブリッドペプチド、またはペプチドパルス樹状細胞ワクチンである（例えば、Yamada et al., Cancer Sci, 104: 14-21, 2013参照）。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、アジュバントと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＴＬＲアゴニスト、例えば、ポリＩＣＬＣ（ヒルトノール（商標）としても知られる）、ＬＰＳ、ＭＰＬ、またはＣｐＧ ＯＤＮを含んでなる処置と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７など）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、標的化ＣＸＣＬ１０の処置と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、標的化ＣＣＬ５の処置と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ＬＦＡ－１またはＩＣＡＭｌアゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、セレクチンアゴニストと組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤（例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）およびＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１および／またはＭＥＫ２）の阻害剤（例えば、コビメチニブまたはトラメチニブ）と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、エストロゲン受容体を選択的に分解する薬剤と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、放射線療法と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与することができる。
本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントと組合せが可能なさらなる療法または治療薬または医薬または有効成分は、ＷＯ２０１５／１５３５１３に記載されている。
上記の組合せ療法は、組合せ投与（例えば、２種類以上の治療薬が同じまたは別の処方物に含まれる）、および個別投与（この場合、本発明の抗体の投与は、付加的治療薬および／またはアジュバントの投与前、投与と同時、および／または投与後に行うことができる）を包含する。本発明の抗体はまた、放射線療法と組み合わせて投与することもできる。
本発明の抗体（およびいずれかの付加的治療薬）は、非経口、肺内、および鼻腔内を含む、所望により、局所処置、病巣内投与のための任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投与は、例えば、一つには投与が短期か長期的かによって、静脈内または皮下注射などの注射によるなどのいずれの好適な経路によることもできる。限定されるものではないが、本明細書では、単回または様々な時点にわたる多回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む様々な投与計画が企図される。
疾患の予防または治療のために、本発明の抗体の適当な用量（単独でまたは１以上の他の付加的治療薬と組み合わせて使用する場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重篤度および経過、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されルか、過去の療法、患者の臨床歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の裁量によって異なる。抗体は、好適には、患者に一度でまたは一連の処置にわたって投与される。
診断および検出のための方法および組成物
特定の実施形態では、本明細書に提供されるいずれの抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントも、生体サンプル中のＯＸ４０の存在を検出するために使用可能である。用語「検出」は、本明細書において、定量的または定性的検出を含めて使用される。特定の実施形態では、生体サンプルは、血液、血清、または生物起源の別の液体サンプルである。特定の実施形態では、生体サンプルは、細胞または組織を含んでなる。
一つの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、診断法または検出法のために提供される。別の側面では、方法は、生体サンプル中のＯＸ４０の存在を検出するために提供される。特定の実施形態では、この方法は、生体サンプル中のＯＸ４０タンパク質の存在を検出することを含んでなる。特定の実施形態では、ＯＸ４０は、ヒトＯＸ４０である。特定の実施形態では、この方法は、生体サンプルと本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体を、抗ＯＸ４０抗体とＯＸ４０の結合を可能とする条件下で接触させること、および抗ＯＸ４０抗体とＯＸ４０の間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含んでなる。この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。一つの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＯＸ４０抗体による処置に好適な対象を選択するために使用され、例えば、この場合、ＯＸ４０は、患者を選択するためのバイオマーカーである。
一つの実施形態では、本発明の抗体は、癌または腫瘍を診断するために使用することができる。
特定の実施形態では、標識された抗ＯＸ４０抗体が提供される。マーカーとしては、限定されるものではないが、直接検出されるマーカーまたは部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、電気的高密度標識、化学発光標識および放射性標識）、ならびに例えば酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出される部分、例えば、酵素またはリガンドが含まれる。例示的マーカーとしては、限定されるものではないが、放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ、蛍光団、例えば、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、フルオレセイン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ）、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リアーゼ、炭水化物オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環式オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ならびにＨＲ、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどの、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素、ビオチン／アビジン、スピン標識、ファージ標識、安定なフリーラジカルなどが含まれる。
一つの側面において、本発明は、抗ＯＸ４０抗体療法に応答する可能性のある癌患者を特定するためなどの診断法を提供する。
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体治療に応答する可能性のある患者を特定するための方法または癌を診断するための方法が提供され、その方法は、（ｉ）患者の癌サンプルからＦｃＲ発現細胞の存在または不在または量（例えば、所与の各サンプルサイズについての数）を決定すること；（ｉｉ）そのサンプルがＦｃＲ発現細胞を含有すれば（例えば、多数のＦｃＲ発現細胞）、患者が応答する可能性があるとして特定されるか、または前記患者をＦｃＲ（例えば、高ＦｃＲ）を含んでなる癌を有すると診断することを含んでなる。ＦｃＲ発現細胞を検出するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、ＩＨＣを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＦｃγＲである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、活性化ＦｃγＲである。いくつかの実施形態では、癌は、本明細書に記載の癌のいずれかである。いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経芽腫、黒色腫、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）または肝細胞癌である。いくつかの実施形態では、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体処置に応答する可能性のある患者を特定するための方法または癌を診断するための方法が提供され、その方法は、（ｉ）患者の癌サンプルからヒトエフェクター細胞（例えば、浸潤性エフェクター細胞）の存在または不在または量（例えば、所与の各サンプルサイズについての数）決定すること、および（ｉｉ）そのサンプルがエフェクター細胞（例えば、多数のエフェクター細胞）を含んでなれば、その患者は応答する可能性があると特定されるか、またはヒトエフェクター細胞を含んでなる癌を有すると診断されることを含んでなる。浸潤性ヒトエフェクター細胞を検出するための方法は当技術分野で周知である、例えば、ＩＨＣを含む。いくつかの実施形態では、ヒトエフェクター細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球のうち１以上である。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、活性化ＦｃγＲを発現する。いくつかの実施形態では、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。いくつかの実施形態では、癌は、本明細書に記載の癌のいずれかである。いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経芽腫、黒色腫、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）または肝細胞癌である。
いくつかの実施形態では、癌患者に治療を推奨するための方法が提供され、その方法は、抗ＯＸ４０抗体処置に応答する可能性のある患者を特定するための方法または上記のような癌を診断するための方法の工程、および（ｉｉｉ）そのサンプルがＦｃＲ発現細胞を有するか、またはヒトエフェクター細胞を有する場合には、抗ＯＸ４０抗体（例えば、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメント）処置が奨励されることを含んでなる。
いくつかの実施形態では、癌患者を治療するための方法が提供され、その方法は、抗ＯＸ４０抗体処置に応答する可能性のある患者を特定するための方法または上記のような癌を診断するための方法の工程、および（ｉｉｉ）そのサンプルがＦｃＲ発現細胞を有するか、またはヒトエフェクター細胞を有する場合には、その患者が抗ＯＸ４０抗体（例えば、本発明の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメント）で処置されることを含んでなる。
本明細書に提供されるいずれかの発明のいくつかの実施形態では、サンプルは抗ＯＸ４０抗体による処置前に得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、癌薬物による処置前に得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、癌転移後に得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、ホルマリンで固定され、パラフィンでコーティングされる（ＦＦＰＥ）。いくつかの実施形態では、サンプルは、生検（例えば、コア生検）、外科検体（例えば、外科的に切除された検体に由来）、または穿刺吸引物である。
本発明の例示的抗ＯＸ４０抗体の配列
Figure 0007046973000005
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Figure 0007046973000012
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本発明のこれらおよびその他の側面および実施形態は図面（以下に簡単に記載する）および発明の詳細な説明に記載され、以下の例で例示される。上述のおよび本出願を通しての特徴のいずれかまたは総て本発明の種々の実施形態において組合せが可能である。本発明を以下の例によりさらに説明するが、それらは例示であって限定ではないと理解されるべきであり、当業者は様々な改変を行うことができる。
例１．抗ＯＸ４０抗体および対照抗体の作製および精製
抗ＯＸ４０抗体は、Ａｄｉｍａｂ抗体プラットフォームにより同定された。ライブラリーおよびスクリーニング法でのそれらの使用は、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，２０１３；ＷＯ２００９０３６３７９；ＷＯ２０１０１０５２５６；Ｗ０２０１２００９５６８に記載されている。
以下の本発明の抗ＯＸ４０抗体を酵母またはＣＨＯ－Ｓ細胞または２９３ ＨＥＫ細胞で発現させた後に精製した：
Figure 0007046973000030
以下の対照抗体を２９３ＨＥＫ細胞で発現させた後に精製した：
Figure 0007046973000031
本明細書で使用する場合、ポガリズマブは、Proposed INN: List 114(http://www.who.int/medicines/publications/druginformation/innlists/PL114.pdf参照)からの重鎖および軽鎖配列を利用する２９３ ＨＥＫ細胞で一過性発現させたヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体である。本明細書で使用する場合、Ｈｕ１０６－２２２は、米国特許第ＵＳ９００６３９９号からの重鎖および軽鎖配列を利用する２９３ ＨＥＫ細胞で一過性発現させたヒト化ＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体である。本明細書で使用する場合、１１Ｄ４は、米国特許第ＵＳ８２３６９３０号からの重鎖および軽鎖配列を利用する２９３ ＨＥＫ細胞で一過性発現させたヒト化ＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体である。本明細書で使用する場合、タボリキシズマブは、Proposed INN: List 115(http://www.who.int/medicines/publications/druginformation/innlists/PL115.pdf参照)からの重鎖および軽鎖配列を利用する２９３ ＨＥＫ細胞で一過性発現させたヒト化ＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体である。
酵母材料の処理について：
酵母クローンは飽和まで増殖させた後、３０℃で４８時間誘導した。誘導後、酵母細胞をペレットとし、上清を精製のために採種した。プロテインＡカラムを用いてＩｇＧを精製し、酢酸、ＰＨ２．０で溶出させた。Ｆａｂフラグメントはパパイン消化により作製し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｅａｒｅ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。
ＣＨＯ－Ｓ細胞の処理について：
発現ＣＨＯ－Ｓ細胞株は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ－Ｓ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造者の説明に従って作製した。ｍＡｂ発現のために、重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列を、ｐＣＨＯ １．０プラスミドに、軽鎖の上流に重鎖となるように挿入した。全長ヒトＯＸ４０ ＣＤＳ配列（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）を安定な過剰発現細胞株の作出のためのｐＣＨＯ １．０ベクターに挿入した。
２９３ＨＥＫ細胞の処理について：
２９３ＨＥＫ細胞でのタンパク質の一過性発現のために、スタンドアローンベクターに抗体の重鎖および軽鎖をクローニングしたベクターｐＴＴ５を使用した。２９３ＨＥＫ細胞へのトランスフェクションは、ＰＥＩとともに標準的な手順を用いて行い、培養７日後に上清を集め、ＡＫＴＡシステム（ＧＥ）で精製した。
例２：抗ＯＸ４０抗体に関する結合動態および親和性アッセイ
ヒトＯＸ４０の動態および平衡解離定数（ＫＤ）を本発明の抗体に関して、ＭＳＤおよびバイオライト干渉（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）アッセイ法を用いて決定した。
１．ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＫＤアッセイ（バイオライト干渉法）
ＦｏｒｔｅＢｉｏアフィニティー測定は、一般に従前に記載されている通りに(Estep, P., et al., High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8.)に行った。簡単に述べれば、ＦｏｒｔｅＢｉｏアフィニティー測定は、センサーをオフラインで、アッセイバッファー中で３０分間平衡化し、次いで、ベースラインの確立のために６０秒間オンラインでモニタリングし、オンラインでＡＨＱセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に上記のようにして得た精製抗体をロードすることによって行った。抗体をロードしたセンサーを５分間、１００ｎＭのＯＸ４０抗原に曝し、その後、それらを、解離速度の測定のために５分解離させるためにアッセイバッファーに移した。動態は１：１結合モデルを用いて分析した。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８（酵母で発現されたＩｇＧ１型の抗ＯＸ４０抗体のＦａｂ形式）、ヒトＯＸ４０＿Ｆｃ（抗体Ｆｃ部分に結合するヒトＯＸ４０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）とマイクロモル以下の範囲の一価ＫＤで結合する。抗体がセンサーチップ上にあった場合、ＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２００９６、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８（ＩｇＧ１形式で、酵母で発現された抗ＯＸ４０抗体）は、ヒトＯＸ４０＿Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）と１桁のナノモル以下の範囲のアビディティーとしての(avid)ＫＤ値で結合し、ｃｙｎｏ ＯＸ４０＿Ｆｃ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）と２桁の(double single digit)ナノモル以下で結合する。抗体がセンサーチップ上にあった場合、ＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００７８およびＡＤＩ－２００９６（ＩｇＧ１形式で、酵母で発現された抗ＯＸ４０抗体）は、マウスＯＸ４０＿Ｆｃ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）と、１桁のナノモル値で結合する（表８）。
Figure 0007046973000032
ＡＤＩ－２０１１２およびＡＤＩ－２００７８の親和性成熟の後、その後代ＡＤＩ－２５６５０、ＡＤＩ－２５６５１、ＡＤＩ－２５６５２、ＡＤＩ－２５６５３、ＡＤＩ－２５６５４、ＡＤＩ－２３５１５、ＡＤＩ－２３５１８、およびＡＤＩ－２３５１９は、センサーチップ上のヒトＯＸ４０＿Ｆｃに結合している場合に、酵母で発現されたＩｇＧ１から産生されたＦａｂ形式の抗体のＫＤ値により示される一価結合の改善;ＩｇＧ１形式で、酵母で発現され、溶液中のヒトＯＸ４０＿Ｆｃと結合する抗体がセンサーチップ上にあった場合の、アビディティーとしての結合親和性の改善；およびＩｇＧ１形式で、酵母で発現され、溶液中のｃｙｎｏ ＯＸ４０＿Ｆｃと結合する抗体がセンサーチップ上にあった場合の結合親和性の改善を示す（表９）。
Figure 0007046973000033
ＭＳＤ－ＳＥＴ動態アッセイ
平衡親和性の測定は、Estep, P., et al., MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8を参照。溶液平衡滴定（ＳＥＴ）は、ＰＢＳ＋０．１％ＩｇＧ不含ＢＳＡ（ＰＢＳＦ）中で行い、ここで、抗原（ビオチン－ＯＸ－４０モノマー（ビオチン化ＯＸ４０、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）が１０～１００ｐＭで一定に維持され、５～１００ｎＭで始めるＦａｂまたはｍＡｂの連続３～５倍連続希釈液（実験条件はサンプルに依存する）とともにインキュベートされる。ＰＢＳで２０ｎＭに希釈した抗体を標準的な結合ＭＳＤ－ＥＣＬプレート（マルチアレイ９６ウェルプレート、カタログ番号：Ｌ１５ＸＡ－３，https://www.mesoscale.com/en/products/l15xa-3/）に４℃で一晩または室温で３０分間コーティングする。プレートを、７００ｒｐｍで振盪しながら、ＢＳＡで３０分間ブロッキングする。次に、プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳＦ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄する。ＳＥＴサンプルを適用し、プレート上で１５０秒、７００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートし、その後、洗浄する。プレートに捕捉された抗原を、ＰＢＳＦ中２５０ｎｇ／ｍＬのスルホタグ標識ストレプトアビジンを用いて、プレート上で３分間インキュベートすることにより検出する。これらのプレートを洗浄バッファーで３回洗浄した後、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００装置で、界面活性剤を含む１倍リードバッファーＴ（カタログ番号Ｒ９２ＴＣ－１ https://www.mesoscale.com/en/products/r92tc-1/）を用いて読み取る。遊離抗原のパーセンテージをＰｒｉｓｍにて滴定抗体の関数としてプロットし、二次方程式に当てはめてＫＤを抽出する。処理量を高めるために、ＳＥＴサンプルの調製のためを含め、ＭＳＤ－ＳＥＴ実験にはリキッドハンドリングロボットを使用する。
上記アッセイに記載の通りに行った実験では、ＩｇＧ１形式で、酵母で発現されたＦａｂ型のＡＤＩ－２５６５０、ＡＤＩ－２５６５１、ＡＤＩ－２５６５２、ＡＤＩ－２５６５３、ＡＤＩ－２５６５４、ＡＤＩ－２３５１５およびＡＤＩ－２３５１９は、ヒトＯＸ４０に、検出可能なナノモル以下の一価ＫＤ値（表１０）で結合する。
Figure 0007046973000034
例３：本発明の抗ＯＸ４０抗体とヒトＯＸ４０との結合
本発明の抗体とヒトＯＸ４０との結合は、フローサイトメトリーに基づくアッセイで測定することができる。
１．ＣＨＯ細胞上のヒトＯＸ４０への結合
ヒトＯＸ４０を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＯＸ４０細胞）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＭＣＳ中にクローニングしたヒトＯＸ４０ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＨＧ１０４８１－Ｇ）でトランスフェクトすることによって作出した。ＣＨＯ－ｈＯＸ４０細胞（０．２×１０６細胞）を１００ｎＭの試験抗体とともに、氷上で３０分間、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ中でインキュベートする。次に、細胞を少なくとも２回洗浄し、二次抗体（ＰＥ標識、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、終濃度５μｇ／ｍｌ）とともに氷上で３０分間、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ中でインキュベートする（遮光）。細胞を少なくとも２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析する。フローサイトメトリーはＣａｎｔｏ ＩＩシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＭＦＩを相応に計算する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２００９６、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８（ＩｇＧ１形式、酵母で発現）は、ＣＨＯ細胞上で過剰発現されたＯＸ４０に、染色した野生型ＣＨＯ細胞と比較して＞１０００倍の差のＭＦＩ値で結合する（表１１）。
Figure 0007046973000035
ＡＤＩ－２０１１２およびＡＤＩ－２００７８の親和性成熟の後に上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、その後代ＡＤＩ－２５６５０、ＡＤＩ－２５６５１、ＡＤＩ－２５６５２、ＡＤＩ－２５６５３、ＡＤＩ－２５６５４、ＡＤＩ－２３５１５、ＡＤＩ－２３５１８、およびＡＤＩ－２３５１９は、ヒトＯＸ４０を過剰発現するＣＨＯ細胞に対する結合強度を保持する（表１２）。
Figure 0007046973000036
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、２９３ＨＥＫ細胞で発現されたＩｇＧ１形式のＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２０１１２およびＡＤＩ－２０１１８は、ＣＨＯ細胞上で過剰発現されたＯＸ４０に、それぞれ２．７３４、２．８７４、２．７９９、および６．７１ｎＭのＥＣ５０値で結合する（表１３）。
Figure 0007046973000037
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＩｇＧ２形式で、２９３ＨＥＫ細胞で発現されたＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２０１１２およびＡＤＩ－２０１１８は、ＣＨＯ細胞上で過剰発現されたＯＸ４０に、それぞれ５．４９、４．０２２、２．７７７、および５．８３８ｎＭのＥＣ５０値で結合する（表１４）。
Figure 0007046973000038
２．２９３ＨＥＫ細胞上のヒトＯＸ４０への結合
本発明の抗体とヒトＯＸ４０との結合は、フローサイトメトリーアッセイで測定することができる。ヒトＯＸ４０を過剰発現する２９３ＨＥＫ細胞（０．２×１０６細胞、上記のＣＨＯ細胞に関するものと同様のように方法により調製）を、１００ｎＭの試験抗体とともに、氷上で３０分間、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ中でインキュベートする。次に、細胞を少なくとも２回洗浄し、氷上で３０分間、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ中、二次抗体（ＰＥ標識、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、終濃度５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートする（遮光）。細胞を少なくとも２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析する。フローサイトメトリーはＡｃｃｕｒｉ Ｃ６システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＭＦＩを相応に計算する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２００９６、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８（ＩｇＧ１形式、酵母で発現）は、陰性対照としてのＩｇＧ１対照と比較して、ＯＸ４０に用量依存的に結合する（表１５）。
Figure 0007046973000039
３．活性化された初代ＣＤ４＋Ｔ細胞上のヒトＯＸ４０への結合
本発明の抗体と初代Ｔ細胞上のヒトＯＸ４０との結合は、フローサイトメトリーアッセイで測定することができる。
健常ドナーからの初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４８時間活性化し、０．２×１０６細胞を１００ｎＭの試験抗体とともに、氷上で３０分間、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ中でインキュベートする。次に、細胞を少なくとも２回洗浄し、二次抗体（ＰＥ標識、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、終濃度５μｇ／ｍｌ）とともに、氷上で３０分間、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ中でインキュベートする（遮光）。細胞を少なくとも２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析する。フローサイトメトリーはＡｃｃｕｒｉ Ｃ６システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＭＦＩを相応に計算する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２００９６、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８（ＩｇＧ１形式、酵母で発現）は、ＯＸ４０に、陰性対照としてのＩｇＧ１対照と比較して高いＭＦＩシグナルで結合する（表１６）。
Figure 0007046973000040
例４．ＣＨＯ細胞上でのヒトＯＸ４０ＬとＯＸ４０の間の相互作用に対する本発明の抗体の遮断
本発明の抗体のヒトＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合を遮断する能力は、フローサイトメトリーにより測定することができる。
方法１：
上記の例３に記載の通りに調製した０．２×１０６のヒトＯＸ４０発現ＣＨＯ細胞を試験抗体（１００ｎＭ）とともに、氷上で３０分間、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ中でインキュベートする。次に、細胞を３回洗浄し、ＮＨＳ－ＦＩｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を結合させたＯＸ４０Ｌ－ｈＦｃ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手）（約１０μｇ／ｍｌ）とともに、氷上で３０分間、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ中でインキュベートする（遮光）。細胞を３回洗浄する。フローサイトメトリーはＡｃｃｕｒｉ Ｃ６システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＭＦＩをＣ６ソフトウエアで計算する。
上記のアッセイにより行った実験では、ＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２００９６、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８（ＩｇＧ１形式、酵母で発現）は、ヒトＯＸ４０Ｌ－ＦＩＴＣの結合を種々のレベルで遮断し、ＡＤＩ－２００５１のＦＩＴＣシグナル遮断だけがＯＸ４０Ｌのそれよりやや強く、１９，３４４に対して１７，２２５のＭＦＩ値であった。ＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２００９６、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８は、ＯＸ４０Ｌよりも高いＭＦＩ値を示し、それぞれ３４，３４２、３３，６８７、３２，８１３、２８，１１２、３１，９１７、２２，５２５、２４，０２０．５、および２６，５８０．５である（表１７）。
Figure 0007046973000041
方法２：
方法１に記載の通りの染色法を用い、ネズミＦｃと融合したＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０Ｌ－ｍＦｃ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手）と次いで抗ネズミＦＣ－ＦＩＴＣ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）も使用した。フローサイトメトリーは、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＭＦＩをＣ６ソフトウエアで計算する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＡＤＩ－２３５１５－ｇ２およびＡＤＩ－２０１１２－ｇ１（それぞれＩｇＧ２およびＩｇＧ１アイソフォーム、ＣＨＯ細胞で発現）は、ＣＨＯ細胞上のＯＸ４０への、マウスＦｃに融合されたヒトＯＸ４０Ｌ（６０μｇ／ｍｌ）の結合を遮断したが、ポガリズマブよりも低く、ＯＸ４０Ｌと同等のレベルの遮断活性を示した（図１）。なおここで、対照ＩｇＧ４は、配列番号１７８の重鎖および配列番号１７９の軽鎖を含んでなる（以下の内容においてＩｇＧ４対照については同じである）。
例５．本発明の抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性
１．プレート結合抗体Ｔ細胞活性化アッセイ
Ｔ細胞の単離は、Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて製造者の説明に従って行う。１．５ｍｌ試験管ラックに合う磁石を用いて不要な磁性ビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）を除く。
本発明の抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、Ｔ細胞の活性化の後にＴ細胞による炎症性サイトカインの放出を測定することによって評価することができる。９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を最適下限の抗ＣＤ３（０．２５μｇ／ｍｌ）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および抗ＯＸ４０（６μｇ／ｍｌ）試験抗体で、３７摂氏度で２時間または４摂氏度で一晩コーティングした。洗浄後、１００，０００のＣＤ４＋初代Ｔ細胞を各ウェルの、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）溶液を含む合計２００μｌの培地に加えた。５日後、ＩＬ－２分泌レベルをＥＬＩＳＡ（Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により試験した。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、酵母細胞で生成されたＩｇＧ１形式のＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２００９６、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８は、ＩＬ－２およびＩＦＮｇの分泌をＩｇＧ４対照よりも増加させ、２名の異なる健常ドナーからのＴ細胞で、ＩＬ－２レベルでは最大１００倍増、ＩＦＮｇレベルでは約３倍の差が見られた（表１８）。
Figure 0007046973000042
２．可溶性抗体Ｔ細胞活性化アッセイ
アッセイ１：
本発明の抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、Ｔ細胞の活性化後にＴ細胞の炎症性サイトカインの放出を測定することによって評価することができる。１００，０００のＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）および２００ｎＭの抗ＯＸ４０候補抗体によって５日間刺激する。ＩＬ－２分泌は、ＥＬＩＳＡ（Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により試験する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、酵母細胞で生成されたＩｇＧ１形式のＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２００９６、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８は、ＩＬ－２分泌をＩｇＧ４対照よりも増加させ、６名の異なる健常ドナーからのＩＬ－２レベルに最大１０倍の増加が見られた（表１９）。
Figure 0007046973000043
アッセイ２：
本発明の抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、Ｔ細胞の活性化後にＴ細胞による炎症性サイトカインの放出を測定することによって評価することができる。１００，０００のＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（１μｇ／ｍｌの濃度）、抗ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（２μｇ／ｍｌの濃度）および１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌまたは４０μｇ／ｍｌの抗ＯＸ４０抗体で５日間刺激した。ＩＬ－２分泌は、ＥＬＩＳＡ（Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により試験する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＨＥＫ２９３細胞で発現されたＩｇＧ１形式の抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２００５７２００５１、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２０１１２およびＡＤＩ－２０１１８は、ＩｇＧ１対照と比較して、ＩＬ－２の分泌を、２０ｕｇ／ｍｌ以上の濃度で増加させ（表２０）また、ＨＥＫ２９３細胞で発現されたＩｇＧ２形式の抗ＯＸ４０抗体は、総ての濃度においてＩＬ－２の分泌を増加させた（表２１）。
Figure 0007046973000044
Figure 0007046973000045
アッセイ３：
本発明の抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、Ｔ細胞の活性化後にＴ細胞による炎症性サイトカインの放出を測定することによって評価することができる。１００，０００のＰＢＭＣを、ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）および５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌの抗ＯＸ４０抗体で５日間刺激した後、ＥＬＩＳＡ（Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によりＩＬ－２分泌を試験する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＣＨＯ細胞で発現されたＡＤＩ－２００７８－ｇ１（ＩｇＧ１形式）、ＡＤＩ－２００７８－ｇ２（ＩｇＧ２形式）、ＡＤＩ－２０１１２－ｇ１（ＩｇＧ１形式）、およびＡＤＩ－２０１１２－ｇ２（ＩｇＧ２形式）は、ＩＬ－２の分泌を５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌのＩｇＧ１対照およびＩｇＧ２対照よりも増加させ、対照抗体１１Ｄ４、Ｈｕ１０６－２２２、およびポガリズマブの水準よりも高かった（図２）。
３．ルシフェラーゼリポーターＴ細胞活性化アッセイ
本発明の抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、ルシフェラーゼリポーターアッセイＮＦｋＢにより媒介される転写の活性化の増強を測定することによって評価することができる。ヒトＯＸ４０を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（ＵＳ、ＡＴＣＣ）（Ｓｉｎｏから購入）およびＮＦｋＢルシフェラーゼ構築物（ＮＦｋＢプロモーター－ｌｕｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を溶液中の抗ＯＸ４０抗体（１００ｎＭ）とともにＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）または抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で１８時間刺激し、次いで、細胞溶解および基質の添加後に試験を行い、検出装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で相対的ルシフェラーゼ発現誘導を示す生物発光を測定する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、酵母細胞で発現されたＩｇＧ１形式のＡＤＩ－２００４８、ＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００６５、ＡＤＩ－２００６６、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２００９６、ＡＤＩ－２０１１２、ＡＤＩ－２０１１３およびＡＤＩ－２０１１８は、ルシフェラーゼ発現をＩｇＧ４対照よりも大幅に増加させ、ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）または抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の活性化を用いた場合にそれぞれ最大４倍および７倍のシグナル増加である（表２２）。
Figure 0007046973000046
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をアクチベーターとして用いた場合、ＣＨＯ細胞で一過性発現されたヒトＩｇＧ２ ＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２００７８－ｇ２は、ＩｇＧ対照（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２対照）、ＡＤＩ－２００７８－ｇ１（ＣＨＯ細胞で発現されたヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体）、ＡＤＩ－２０１１２－ｇ１（ＣＨＯ細胞で発現されたヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体）、ＡＤＩ－２０１１２－ｇ２（ＣＨＯ細胞で発現されたヒトＩｇＧ２ ＯＸ４０抗体）、ポガリズマブおよびＨｕ１０６－２２２よりも大幅にルシフェラーゼ発現を増加させた（図３）。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＣＨＯ細胞で発現されたヒトＩｇＧ２ ＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２００７８－ｇ２は、ルシフェラーゼ発現を、ＩｇＧ対照（ＩｇＧ１対照）、およびＣＨＯ細胞で発現された親和性成熟ヒトＩｇＧ２ ＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２３５１５－ｇ２よりも大幅に増加させ、ＡＤＩ－２００７８－ｇ２のＥＣ５０値が５．７３９ｎＭであるのに対して、ＡＤＩ－２３５１５－ｇ２は、０．３９０４ｎＭというより低いＥＣ５０値を有する（図４）。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、共刺激シグナルを提供するためにＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）を、また、ＩｇＧ架橋のためにＦｃｇＲＩＩｂを加えた場合、ヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２０１１２－ｇ１、ヒトＩｇＧ２ ＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２０１１２－ｇ２、ヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２００７８－ｇ１、ヒトＩｇＧ２ ＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２００７８－ｇ２（総てＣＨＯ細胞で発現）は、ＯＸ４０の活性化を介してルシフェラーゼ発現を、ＩｇＧ対照（ＩｇＧ１対照およびＩｇＧ２対照）よりも大幅に相加させ、ＥＣ５０値はそれぞれ０．０６０５１ｎＭ、０．２４６３ｎＭ、０．０９６４４ｎＭ、および１．３９８ｎＭであった。ＡＤＩ－２０１１２－ｇ１は、ポガリズマブ、Ｈｕ１０６－２２２および１１Ｄ４に比べて同等またはより良いアゴニストである（図５）。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＣＨＯ細胞で生成されたヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２５６５４－ｇ１は、ＣＨＯ細胞で生成されたヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２－ｇ１の親和性成熟形態であり；ＣＨＯ細胞で生成されたヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２３５１５－ｇ１は、ＣＨＯ細胞で生成されたヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２００７８－ｇ１の親和性成熟形態である。ＡＤＩ－２５６５４－ｇ１およびＡＤＩ－２３５１５－ｇ１はより良好なアゴニスト活性を示し、ＡＤＩ－２０１１２－ｇ１が０．２５７６ｎＭのＥＣ５０を有するのに対して、ＥＣ５０値はそれぞれ０．０２８１７ｎＭ、および０．１７４３ｎＭであった（図６）。
４．混合リンパ球反応（ＭＬＲ）／ＤＣ Ｔ細胞共培養アッセイ
本発明の抗体によるＯＸ４０シグナルのアゴニスト活性は、混合リンパ球反応またはＤＣ－Ｔ細胞共培養アッセイ中のＩＬ－２の放出を測定することによって評価することができる。６ウェル組織培養プレートの各ウェルまたはＴ２５組織培養フラスコに２×１０６のＰＢＭＣを播種する。細胞を２～３時間インキュベートし、単球を接着させる。
未熟骨髄ｍｏＤＣは、ＰＢＭＣ由来単球（１×１０６細胞／ｍｌ）を、１％ＡＢ血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０μＭ β－Ｍｅ、ＩＬ－４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、または各２５～５０ｎｇ／ｍｌを含有するＸ－ＶＩＶＯ １５培地で培養することにより生成した。２日後に、ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦを添加した新鮮培地を加える。５日目に、細胞を凍結させるか、または３×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で、２日間、ｒＴＮＦａ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ－１ｂ（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍｌ）および１μＭ ＰＧＥ２を含有する刺激カクテルを添加することにより成熟を誘導する。Ｔ細胞の単離は、Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて製造者の説明に従って行う。１．５ｍｌ試験化合物ラックに合う磁石を用いて不要な磁性ビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）を除く。
９６丸底組織培養プレートで、３７℃で４～５日間、１００，０００～２００，０００の単離Ｔ細胞（ドナーから）を１０，０００～２０，０００の同種異系ｍｏＤＣ（上記の通り）を総容量２００μｌで混合する。Ｔ細胞の活性化を増強するためにＳＥＥ（１ｎｇ／ｍｌ）を加えた。試験抗体をＭＬＲの開始時に加え、培養期間中インキュベートする。ＩＬ－２の検出は製造者の説明に従って行う（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＯＤ測定値はＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）で決定する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＣＨＯ細胞で発現されたＩｇＧ２形式のヒト抗体であるＡＤＩ－２３５１５－ｇ２、およびＣＨＯ細胞で発現されたヒトＩｇＧ１抗体であるＡＤＩ－２０１１２－ｇ１は、約１３．３μｇ／ｍｌ、約４．４μｇ／ｍｌおよび約１．４８μｇ／ｍｌの濃度で用いた場合、ポガリズマブ、１１Ｄ４、Ｈｕ１０６－２２２、およびタボリキシズマブと同等かまたはそれより良好にＩＬ－２を増加させた。ポガリズマブは、総ての濃度で低いアゴニスト活性を示し、４０μｇ／ｍｌの１１Ｄ４、Ｈｕ１０６－２２２、タボリキシズマブ、ＡＤＩ－２３５１５－ｇ１、およびＡＤＩ－２０１１２－ｇ１は、ＯＸ４０抗体の最高濃度４０μｇ／ｍｌでより低いアゴニスト活性を示した（図７、ＩｇＧ対照はＩｇＧ１対照である）。
例６．ルシフェラーゼリポーターに基づく本発明の抗体によるＯＸ４０Ｌにより媒介されるＯＸ４０のＴ細胞活性化の検出
本発明の抗ＯＸ４０抗体の遮断活性は、ＯＸ４０Ｌにより媒介されるＯＸ４０のＴ細胞活性化の遮断における抗体の傾向を測定することによって評価することができる。Ｔ細胞の活性化特性は、ＮＦｋＢにより媒介される転写活性により評価される（例５参照）。ヒトＯＸ４０およびＮＦｋＢ－ルシフェラーゼ構築物（ＮＦｋＢプロモーター－ｌｕｃ、ＵＳ Ｐｒｏｍｅｇａ）を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（ＵＳ ＡＴＣＣ）を、溶液中、抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および組換えＯＸ４０Ｌ（６０ μｇ／ｍｌ；Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と漸増濃度の抗ＯＸ４０抗体（本発明のＣＨＯ細胞で発現されたＩｇＧ１形式のＡＤＩ－０１１２－ｇ１、本発明のＣＨＯ細胞で発現されたＩｇＧ２形式のＡＤＩ－２３５１５－Ｇ２）およびＩｇＧ４対照、ポガリズマブ、ＯＸ４０Ｌ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手）で１８時間活性化し、次いで、細胞溶解および基質の添加の後に試験し、吸光度を測定した。
ポガリズマブは、約０．０８ｎＭを超える濃度でＯＸ４０Ｌに基づく活性化を容易に遮断したが、ＣＨＯ細胞で生成されたヒトＩｇＧ１ ＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２０１１２－ｇ１、およびＣＨＯ細胞で生成されたヒトＩｇＧ２ ＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２３５１５－ｇ２は、２０ｎＭ以上でＯＸ４０Ｌに基づく活性化を遮断した（図８）。
例７．本発明の抗体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害
ルシフェラーゼリポーターに基づく抗体依存性細胞介在性細胞傷害アッセイ
ＯＸ４０抗体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性は、ルシフェラーゼリポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定することができる。標的細胞（ヒトＯＸ４０を発現するＣＨＯ細胞、上記の通りに調製）を、１０％Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を含有する２５μｌのＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）に１．２×１０６細胞／ｍｌで播種する。１μｇ／ｍｌ抗体の１：３連続希釈液を作製し、２５μｌ／ウェルを加える。６×１０６細胞／ｍｌのＡＤＣＣエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を播種し、５％ＣＯ２で３７℃にて６時間インキュベートする。７５μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、混合物を２０分間で室温とする。プレートを３００ｇ／分で２分間遠心分離する。１２０μｌの細胞上清を注意深くオプティプレートに移す。このプレートを照度計で読み取る。曲線を当てはめ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を用いて抗体応答のＥＣ５０を決定する。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＨＥＫ２９３細胞で発現されたＩｇＧ１形式のＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２０１１２、およびＡＤＩ－２０１１８は、ルシフェラーゼ発現を増加させ、ＥＣ５０値はそれぞれ０．３６５３、０．９１０９、０．７３０４、および０．８８６７ｎＭである（図９）。ＨＥＫ２９３細胞で発現されたＩｇＧ２アイソタイプのＡＤＩ－２００５１、ＡＤＩ－２００７８、ＡＤＩ－２０１１２、およびＡＤＩ－２０１１８は、ＡＤＣＣ活性を惹起しなかった（図１０）。
例８．本発明の抗体の抗腫瘍活性
本発明のＯＸ４０抗体の抗腫瘍有効性は、ヒト化マウスモデル（ＮＯＧ ｈｕ－ＰＢＭＣ ＬｏＶｏ腫瘍モデル）で検討することができる。
ＬｏＶｏヒト結腸癌細胞（ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ－２２９）をＡＴＣＣの説明（Ｆ－１２Ｋ）に従って培養した。６６万個のヒトＰＢＭＣを含有する０．２ｍＬのＰＢＳに懸濁させた２００万個のＬｏＶｏ細胞を雌ＮＯＧ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．）の右側腹部に移植した。
試験中、腫瘍重および体重を週２回測定し、マウスは、腫瘍がエンドポイントに達するか、またはマウスが＞２０％の体重減となった場合に安楽死させた。移植後３日目に、マウスを６～７個体ずつの群に無作為化し、平均腫瘍体積をデジタルノギスで評価し、各群について腫瘍体積をｍｍ３で式：（幅）２×長さ／２により計算し、およそ５０ｍｍ３であった。
移植後３、７、１１、および１４（または１５）日目に、マウスの腹膜内に（ＩＰ）、ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇの関連ＩｇＧアイソタイプ対照（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ）、または抗ＯＸ４０抗体（ＣＨＯ細胞で発現されたＩｇＧ１形式ヒトＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２０１１２－ｇ１またはＣＨＯ細胞で発現されたＩｇＧ１形式のヒトＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２３５１５－ｇ２）を投与した。
上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＣＨＯ細胞で発現されたＩｇＧ１形式のヒトＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２０１１２－ｇ１は、ＩｇＧ対照（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ）に比べて（図１１）、また、ポガリズマブおよび１１Ｄ４に比べて（図１３）、腫瘍体積の増大を低減する。上記のアッセイに記載の通りに行った実験では、ＣＨＯ細胞で発現されたＩｇＧ２形式のヒトＯＸ４０抗体であるＡＤＩ－２３５１５－ｇ２は、ＩｇＧ対照（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ）（図１２）、ポガリズマブおよび１１Ｄ４（図１３）に比べて、腫瘍体積の増大を有意に低減する。ＡＤＩ－２０１１２－ｇ１およびＡＤＩ－２３５１５－ｇ２は、ＩｇＧ対照、ポガリズマブ、および１１Ｄ４に比べてマウスの体重に有意な影響を及ぼさない（図１４）。
例９：薬物動態アッセイ
雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスへの、ＡＤＩ－２００７８－ＩｇＧ１（ＩｇＧ１形式、ＣＨＯ細胞で発現）、ＡＤＩ－２００７８－ＩｇＧ２（ＩｇＧ２形式、ＣＨＯ細胞で発現）、ＡＤＩ－２０１１２－ＩｇＧ１（ＩｇＧ１形式、ＣＨＯ細胞で発現）、ＡＤＩ－２０１１２－ＩｇＧ２（ＩｇＧ２形式、ＣＨＯ細胞で発現）の１０ｍｇ／ｋｇ抗体のｉ．ｖ．投与後に、薬物動態データを評価した。この用量を体重に基づいてマウスに注射した。
採血は投与の開始時に始めた。ｉ．ｖ．投与については、投与時点は０．０８３時間（５分）、２１日までを含んだ。各時点で３個体のマウスから採血した。およそ１００ｕｌの血液をマイクロ遠沈管に採種した。血液サンプルは氷上で、３０００ＲＰＭの速度設定で少なくとも１０分間置き、およそ４０～５０ｕｌの血清を得た。
マウスに投与した抗体の血清濃度は、プレートに基づくサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたイムノアッセイによって決定した。簡単に述べれば、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４４２４０４）を４℃で一晩、０．２ＭのＣＢＳ（ＰＨ９．４）中１ｕｇ／ｍＬのＯＸ４０（ＡＣＲＯ、カタログ番号１０４４－５ＣＩＳ１－ＡＦ）でコーティングした。洗浄後、次に、このプレートを周囲温度にて１．５時間、５％脱脂乳でブロッキングし、マウス血清サンプルを室温で１．５時間コーティングプレートに適用した。抗ＯＸ４０抗体を用いて、０．３１５～８０ｎｇ／ｍＬの範囲のプールした正常マウス血清およびＱＣサンプルで標準曲線を作成した。
結合した抗ＯＸ４０抗体は、０．０５％ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ）中５％ＢＳＡで１：１００，０００希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号Ａ８０－１０４Ｐ－８４）を用いて検出した。洗浄工程の後、プレートを室温で１０～１５分間ＴＭＢで現像し、これを５分後に２Ｎ硫酸を添加することによって停止させた。光学密度は、Ｔｈｅｒｍｏ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ）を用いて４５０ｎｍで測定し、６２０ｎｍ参照波長を差し引いた。定量は、Ｓｋａｎｉｔソフトウエア３．１（Ｔｈｅｒｍｏ）を用い、作成した標準曲線の４パラメータロジスティック（１／Ｙ２）回帰に基づいた。
ＰＫパラメーター（Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、ｔ１／２、Ｃｌ、およびＶｓｓ）は、各群の濃度の平均を用いてノンコンパートメントモデルに基づくＰＫＳｏｌｖｅｒソフトウエアにより分析した（表２３）。
Figure 0007046973000047
例１０．ＭＣ３８担癌ＯＸ４０トランスジェニックマウスでの抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＯＸ４０抗体の医薬的有効性に関する検討
本検討では、抗ＰＤ１抗体Ｃと組み合わせた種々の用量の抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２－ＩｇＧ１（本例および図１５ではＡＤＩ－２０１１２と呼ばれる）の相乗的抗腫瘍有効性を検討するためにＭＣ３８（マウス腸管癌細胞）担癌ＯＸ４０トランスジェニックマウスを使用した。抗体Ｃは、プログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）に対するモノクローナル抗体（特許出願番号：ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０７２１９０）である。
ヒトＯＸ４０トランスジェニックマウス
Ｃ５７Ｂ１／６バックグラウンドを有する雌ヒトＯＸ４０トランスジェニックマウス（およそ８週齢）は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｏｄｅｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。マウスを到着後７日間飼育し、その後、試験を開始した。
細胞
ＭＣ３８ネズミ結腸癌細胞は、Ｈｅｙｕａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（上海）から購入し、説明に厳格に従って、その後のｉｎ ｖｉｖｏ試験のために通常通りに継代培養した。これらの細胞を遠心分離により集め、無菌ＰＢＳに再懸濁させ、５×１０ｅ６／ｍｌの細胞密度に調整した。０日目に、０．２ｍｌの細胞懸濁液をヒトＯＸ４０トランスジェニックマウスの右腹部領域に皮下接種し（１×１０６細胞／マウス）、ＭＣ３８－ｈＯＸ４０担癌マウスモデルを確立した。
投与
腫瘍細胞接種の６日後に、各マウスの腫瘍体積を測定し、８７．４ｍｍ３～２２８．４ｍｍ３の範囲の腫瘍体積を有するマウスを選択し、各群の平均初期体積が約１１０ｍｍ３となるように平均腫瘍体積に従って群分けした。
マウスを７群に分け（各群７個体）、各群に以下の用量の抗体を腹腔内注射した：
群１（対照群）：ｈ－ＩｇＧ（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ）、１０ｍｇ／ｋｇ；
群２：抗ＯＸ４０抗体（ＡＤＩ－２０１１２）、０．１ｍｇ／ｋｇ；
群３：抗ＯＸ４０抗体（ＡＤＩ－２０１１２）、１ｍｇ／ｋｇ；
群４：抗ＯＸ４０抗体（ＡＤＩ－２０１１２）、１０ｍｇ／ｋｇ；
群５：ＰＤ－１抗体（抗体Ｃ）、０．５ｍｇ／ｋｇ；
群６：抗ＯＸ４０抗体（ＡＤＩ－２０１１２）１ｍｇ／ｋｇ＋ＰＤ－１抗体（抗体Ｃ）０．５ｍｇ／ｋｇ；
群７：抗ＯＸ４０抗体（ＡＤＩ－２０１１２）１０ｍｇ／ｋｇ＋ＰＤ－１抗体（抗体Ｃ）０．５ｍｇ／ｋｇ。
試薬の注射
接種後６日目に、各群のマウスに上記７群の試薬をそれぞれ２回／週の頻度で２週間、腹腔内注射によって当業者とした。
分析：
腫瘍重および体重を試験中、６日目（投与前）から週２回測定し、４週間絶えずモニタリングした。腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を、ノギスを用いて測定し、腫瘍体積（Ｖ）を次の用に計算した：Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２。各マウス群からの腫瘍サイズを時間に対してプロットした。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、統計的有意性を判定した。総ての分析でＰ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
２９日目の試験の終了時にマウスを安楽死させた。単離した腫瘍組織の写真を撮影し、秤量し、各群の腫瘍重および体積（腫瘍最終体積）を測定し、相対腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ（％））を計算した。
結果
試験の結果は、１週間の投与後に、群１（ｈ－ＩｇＧ－１０ｍｇ／ｋｇ）に比べて、群２～４（ＡＤＩ－２０１１２－０．１ｍｇ／ｋｇ、ＡＤＩ－２０１１２－１ｍｇ／ｋｇ、ＡＤＩ－２０１１２－１０ｍｇ／ｋｇ）は用量依存的に、ＭＣ３８－ｈＯＸ４０担癌マウスの腫瘍増殖を阻害し、腫瘍体積および腫瘍重が減少し、腫瘍増殖も緩徐化したことを示した。これらの試験結果はまた、本発明の抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２は抗ＰＤ－１ ｍＡｂ抗体Ｃと良好な相乗的抗腫瘍効果を示したことも示した。具体的な結果は次の通りである。
図１５に示されるように、１週間の投与後に、群１（ｈ－ＩｇＧ－１０ｍｇ／ｋｇ群）に比べて、群２（ＡＤＩ－２０１１２－０．１ｍｇ／ｋｇ群）もまた遅い腫瘍増殖を示したが、群３～７（ＡＤＩ－２０１１２－１ｍｇ／ｋｇ群、ＡＤＩ－２０１１２－１０ｍｇ／ｋｇ群、抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ群、ＡＤＩ－２０１１２－１ｍｇ／ｋｇ＋抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ、ＡＤＩ－２０１１２－１０ｍｇ／ｋｇ＋抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ）は有意な抗腫瘍効果を示した。群１（ｈ－ＩｇＧ－１０ｍｇ／ｋｇ投与群）のマウスの５００ｍｍ３までの腫瘍増殖には１４日を要したが、群２（ＡＤＩ－２０１１２－０．１ｍｇ／ｋｇ投与群）は１９日を要し、群３（ＡＤＩ－２０１１２－１ｍｇ／ｋｇ群）は２２日を要し、群４（ＡＤＩ－２０１１２－１０ｍｇ／ｋｇ群）は２６日を要し、群５（抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ群）、群６（ＡＤＩ）－２０１１２－１ｍｇ／ｋｇ＋抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ群）、群７（ＡＤＩ－２０１１２－１０ｍｇ／ｋｇ＋抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ群）の平均腫瘍体積は２９日までで５００ｍｍ３未満であった。
２９日後に試験を終了した際に、いくつかの試験群では、マウスの腫瘍は完全に消失していた。以下の表２４は、各群の腫瘍が完全に消失したマウスの数をまとめたものである。
Figure 0007046973000048
上の表に示されるように、群５（抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ群）では、３個体のマウスの腫瘍が完全に消失し；群６（２０１１２－１ｍｇ／ｋｇ＋抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ群）では６個体のマウスの腫瘍が完全に消失し；群７（２０１１２－１０ｍｇ／ｋｇ＋抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ）では７個体のマウスの腫瘍が完全に消失した。
加えて、本発明はまた、２９日目の終了時に各群のマウスで相対腫瘍増殖阻害率を計算した。相対腫瘍増殖阻害率は、次のように計算する：
相対腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）＝１００％×（Ｔｖｏｌｃｏｎｔｒｏｌ－Ｔｖｏｌｔｒｅａｔｅｄ）／（Ｔｖｏｌｃｏｎｔｒｏｌ－Ｔｖｏｌｐｒｅｄｏｓｅ）
式中、Ｔｖｏｌｃｏｎｔｒｏｌ－Ｔｖｏｌｔｒｅａｔｅｄ＝対照群における投与後の腫瘍最終体積－薬物投与群における投与後の腫瘍最終体積；Ｔｖｏｌｃｏｎｔｒｏｌ－Ｔｖｏｌｐｒｅｄｏｓｅ＝対照群における投与後の腫瘍最終体積－対照群における投与前の腫瘍体積（６日目の投与前の腫瘍体積）。
計算結果を下表２５に示す。
Figure 0007046973000049
試験の結果は、群６（ＡＤＩ－２０１１２－１ｍｇ／ｋｇ＋抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ群）および群７（ＡＤＩ－２０１１２－１０ｍｇ／ｋｇ＋抗体Ｃ－０．５ｍｇ／ｋｇ群）では、腫瘍増殖阻害率はそれぞれ１０２％および１０４％であったこと、および抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせた場合に相乗的抗腫瘍効果を示すことを示した。

Claims (37)

  1. 重鎖可変領域ＨＣＶＲおよび軽鎖可変領域ＬＣＶＲを含んでなる抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記ＨＣＶＲが、配列番号１０６、１０７、１０８、１０９、１１０または１１１で表されるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるものであり、前記ＬＣＶＲが、配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるものである、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 重鎖および軽鎖を含んでなる抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖が、配列番号１８９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または１４９で表されるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるものであり、前記軽鎖が、配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるものである、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 抗体がＩｇＧ１形式の抗体またはＩｇＧ２形式の抗体またはＩｇＧ４形式の抗体である、請求項１または２に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 抗体がヒト抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 抗原結合フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、一本鎖抗体または（Ｆａｂ’）２、シングルドメイン抗体、ダイアボディまたは線形抗体からなる群から選択される抗体フラグメントである、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. 前記一本鎖抗体がｓｃＦｖである、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. 前記抗体が二重特異性または多重特異性抗体分子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. 前記二重特異性抗体分子が、ＯＸ４０、およびＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２と結合する、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸。
  11. 請求項１０に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
  12. 発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
  13. 請求項１０に記載の核酸または請求項１１または１２に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
  14. 宿主細胞が原核生物または真核生物である、請求項１３に記載の宿主細胞。
  15. 宿主細胞が、酵母細胞、哺乳動物細胞、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントの生産に好適な他の細胞から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
  16. 宿主細胞が、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
  17. 抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の宿主細胞を、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸の発現に好適な条件下で培養することを含んでなる、方法。
  18. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントを単離することをさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
  19. 宿主細胞から抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することをさらに含んでなる、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、免疫複合体。
  21. 他の薬剤をさらに含んでなる、請求項２０に記載の免疫複合体。
  22. 前記薬剤が細胞傷害性薬剤である、請求項２１に記載の免疫複合体。
  23. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項２０～２２のいずれか一項に記載の免疫複合体を含んでなる、医薬組成物。
  24. Ｔ細胞の活性化に使用するための、またはＴ細胞により媒介される抗腫瘍活性の誘導に使用するための、または身体の免疫応答の増強に使用するための、または対象において癌の治療に使用するための、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記癌が、肺癌、肝臓癌、胃癌、または結腸癌である、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. 薬学上許容可能なアジュバントをさらに含んでなる、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  28. １以上の他の治療薬をさらに含んでなる、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  29. 前記治療薬が、化学療法薬、抗血管新生薬、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ２抗体である、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 前記抗血管新生薬がベバシズマブである、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. Ｔ細胞の活性化に使用するための、またはＴ細胞により媒介される抗腫瘍活性の誘導に使用するための、または身体の免疫応答の増強に使用するための、または対象において癌の治療に使用するための薬剤の製造における、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項２０～２２のいずれか一項に記載の免疫複合体の使用。
  32. 前記癌が肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌、胃癌、または結腸癌である、請求項３１に記載の使用。
  33. 前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項３２に記載の使用。
  34. 前記薬剤が、前記対象に１以上の療法と組み合わせて投与するためのものである、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の使用。
  35. 前記療法が、治療様式および／または他の治療薬である、請求項３４に記載の使用。
  36. 前記治療様式が手術および／もしくは放射線療法を含み、かつ／または他の治療薬が、化学療法薬、ＰＤ－１軸結合拮抗薬、および抗血管新生薬からなる群から選択される、請求項３５に記載の使用。
  37. 前記ＰＤ－１軸結合拮抗薬が、抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ２抗体から選択され、かつ／または前記抗血管新生薬がベバシズマブである、請求項３６に記載の使用。
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