ES2871049T3 - Método para determinar la identidad de tinciones histológicas - Google Patents

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Abstract

Un método para evaluar una tinción histológica, el método que comprende: a) medir en un espectrofotómetro un espectro de absorbancia de la tinción histológica en un intervalo predefinido; b) identificar una o más longitudes de onda de absorbancia máxima del espectro medido; c) comparar la una o más longitudes de onda identificadas de absorbancia máxima con una biblioteca que comprende longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima para una pluralidad de tinciones histológicas; y d) determinar la identidad de la tinción histológica en base a la comparación.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para determinar la identidad de tinciones histológicas
Antecedentes
En histología se utilizan muchas tinciones diferentes y variaciones de las mismas. Por ejemplo, en hematología, se usan varias variaciones diferentes de tinción histológica de Romanowsky para diferenciar los tipos de células sanguíneas en una película de sangre extendida sobre un portaobjetos de vidrio. En particular, se usan dos tipos distintos de tinciones conocidas como Wright Giemsa (WG) y May Grunwald (MG). Además, la mezcla de May Grunwald es usada a menudo en combinación con la tinción de Giemsa para producir la formulación de May Grunwald Giemsa (MGG). Todos los tipos de formulaciones de tinción de Romanowsky se preparan a partir de dos colorantes principales, Eosina Y y Azul de metileno mediante el uso de una variedad de procesos, cada uno resulta en una formulación de tinción distinta
La tinción de Wright es una mezcla de eosinatos (colorantes de Eosina Y) de azul de metileno policromado. La tinción de May Grunwald es un equivalente alemán de la tinción de Jenner, que es un eosinato de azul de metileno similar a la tinción de Wright, pero diferentes en que no usa el azul de metileno policromado. El azul de metileno policromado es una solución alcalina de azul de metileno que se somete a una desmetilación oxidativa progresiva con el envejecimiento (maduración) para producir formas de todos los intermedios tri, di, mono y no metílicos, lo que resulta en una mezcla de azul de metileno, azures, tionina y violeta de metileno.
Cuando se aplica para la tinción de películas de sangre periférica, cualquier tipo de tinción de Romanowsky producirá, en general, un tipo similar de coloración celular. Sin embargo, pequeñas pero importantes diferencias en la formulación de tinción permitirán diferenciar condiciones específicas en las células sanguíneas tales como, por ejemplo, granulación tóxica en neutrófilos. Si la formulación de tinción no es óptima (por ejemplo, carece de una fracción suficiente de azul de metileno puro en proporción a sus derivados), los gránulos neutrófilos normales tienden a un exceso de tinciones y a parecer gránulos tóxicos. La composición de la tinción óptima también mejora el tinción de nucleolos y glóbulos rojos policromatofílicos (reticulocitos). Por lo tanto, es importante mantener y controlar estrictamente la composición específica de cualquier formulación de tinción dada, tal como se logra en los procesos de optimización.
Debido a que las composiciones de las tinciones de tipo Romanowsky son muy similares, es difícil, si no imposible, discriminar entre cualquier tinción (WG, MG o MGG) estrechamente relacionadas y/o variaciones de la misma tinción mediante la inspección visual o a través del uso de instrumentos comunes de laboratorio, tal como la medición del pH de la tinción.
En histología automatizada, por ejemplo, como se realiza mediante dispositivos automatizados de preparación de portaobjetos histológicos o hematológicos, puede usarse varias tinciones en dependencia del ensayo particular a realizarse o las preferencias del usuario. Los dispositivos automatizados de preparación de portaobjetos, independientemente de si un dispositivo en particular usa una sola tinción o varias tinciones, requieren que un usuario humano cargue la(s) tinción(s). Como tal, las tinciones pueden ser inadvertidamente mal identificadas y la tinción equivocada puede cargarse en el dispositivo. Además, las tinciones pueden llegar mal identificadas, sin que el usuario del dispositivo lo sepa, debido, por ejemplo, a un mal etiquetado accidental o una preparación inadecuada. El almacenamiento en estantes en condiciones inadecuadas puede afectar la composición de la tinción, no perceptible mediante la inspección visual.
Los protocolos de tinción dependen en gran medida de usar la tinción adecuada. Así, cuando se usa una tinción mal identificada o preparada incorrectamente, el procedimiento probablemente producirá un resultado no deseado, por ejemplo, una coloración subóptima. Mientras que la identidad de la tinción puede determinarse de forma concluyente mediante métodos analíticos complejos usados para determinar la composición de la tinción, por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), estos métodos son arduos y consumen tiempo y recursos significativos. La HPLC también requiere un conjunto de analitos de referencia para identificar picos (bandas) en un cromatograma que podrían ser difíciles de obtener para una mezcla tan compleja como el azul de metileno policromado.
El azul de metileno es un colorante catiónico (es decir, produce iones o cationes con carga positiva) que, en su forma pura, exhibe dos bandas principales de absorción a 293 nm (transición n - n*) y 664 nm (transición n - n*) en soluciones acuosas, con una banda de 664 nm (que produce color azul) que tiene un hombro a 610 nm correspondiente a la transición vibrónica 0-1. Los detalles de la absorción dependen de un número de factores, que incluyen la protonación, la adsorción a otros materiales y la metacromasia, la formación de dímeros y agregados de orden superior en dependencia de la concentración y otras interacciones. A su vez, la Eosina Y es un colorante ácido (se ioniza en solución para producir iones o aniones con cargas negativa) que exhibe una banda de absorción principal a 524 nm (produciendo color rojo).
Por tanto, la absorbancia óptica de una molécula de colorante es sensible a las modificaciones que la molécula de colorante puede sufrir en el proceso de preparación de la tinción.
El documento US 6165734A (Applied Spectral Imaging Ltd) describe un método de análisis in situ de una muestra biológica que comprende las etapas de (a) tinción de la muestra biológica con tinciones N, de las cuales se selecciona una primera tinción del grupo que consiste en una primera tinción inmunohistoquímica, una primera tinción histológica y una primera tinción de ploidía de ADN, y se selecciona una segunda tinción del grupo que consiste en una segunda tinción inmunohistoquímica, una segunda tinción histológica y una segunda tinción de ploidía de ADN, y (b) mediante el uso de un dispositivo de recogida de datos espectrales para recoger datos espectrales de la muestra biológica, en donde el dispositivo de recogida de datos espectrales y las tinciones N se seleccionan de manera que se pueda recoger un componente espectral asociado con cada una de las tinciones N.
Resumen
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para evaluar una tinción histológica, el método que comprende: a) medir en un espectrofotómetro un espectro de absorbancia de la tinción histológica en un intervalo predefinido; b) identificar una o más longitudes de onda de absorbancia máxima a partir del espectro medido; c) comparar una o más longitudes de onda identificadas de absorbancia máxima con una biblioteca que comprende longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima para una pluralidad de tinciones histológicas; y d) determinar la identidad de la tinción histológica en base a la comparación.
El método puede incluir generar un informe de la evaluación, en donde el informe comprende información específica de la tinción seleccionada del grupo que consiste en la identidad de la tinción histológica, una o más longitudes de onda de absorbancia máxima, una o más mediciones de absorbancia en el intervalo predefinido o una porción del mismo, o sus combinaciones.
El intervalo predefinido en el cual se mide el espectro de absorbancia puede estar dentro de 200 nm a 800 nm, 500 nm a 700 nm, 600 nm a 700 nm, 640 nm a 670 nm, 500 nm a 550 nm o 200 nm a 400 nm.
El método puede incluir medir en el espectrofotómetro el espectro de absorbancia de la tinción histológica en dos o más intervalos predefinidos, que incluyen, por ejemplo, en donde los dos o más intervalos predefinidos comprenden un primer intervalo predefinido que es o está dentro de 500 nm a 700 nm y un segundo intervalo predefinido que es o está dentro de 200 nm a 400 nm.
El método puede incluir diluir la tinción histológica antes de medir el espectro de absorbancia con un solvente donde la dilución específica y el solvente específico usado para diluir la tinción específicamente corresponden a las longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima con las que se comparan las longitudes de onda medidas, por ejemplo, donde las longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima se obtuvieron a partir de muestras de referencia diluidas a la misma dilución y con el mismo solvente que la tinción histológica que se está midiendo. La tinción puede diluirse a 1:200 con agua.
El método para identificar una tinción histológica puede incluir preparar una pluralidad de diluciones de la tinción histológica y realizar las etapas del método para cada dilución de la pluralidad de diluciones de la tinción histológica. El método para identificar una tinción histológica puede incluir preparar una primera dilución y una segunda dilución, en donde la segunda dilución es la mitad de la concentración de la primera dilución.
El método para identificar una tinción histológica puede incluir identificar un valor de desplazamiento espectral a partir de un espectro medido. La biblioteca de longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima puede incluir además una pluralidad de valores de desplazamiento espectral para una pluralidad de tinciones histológicas y la comparación puede comprender además comparar el valor de desplazamiento espectral medido con la biblioteca.
El método para identificar una tinción histológica puede incluir identificar un valor del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima a partir del espectro medido. La biblioteca de longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima puede comprender además una pluralidad de valores del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima para una pluralidad de tinciones histológicas y la comparación puede comprender además comparar el valor del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima con la biblioteca.
La pluralidad de tinciones histológicas puede incluir tinciones de Romanowsky, que incluyen, por ejemplo, Wright Giemsa, May Grunwald y May Grunwald Giemsa.
El método para identificar una tinción histológica puede incluir medir en un espectrofotómetro el espectro de absorbancia de la tinción histológica donde el espectro de absorbancia se mide con una resolución de al menos 1 nm.
La biblioteca de longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima puede incluir una referencia a una longitud de onda de absorbancia máxima a esencialmente 656 nm para May Grunwald, una pluralidad de valores de desplazamiento espectral para una pluralidad de composiciones de tinción de May Grunwald en donde el valor de desplazamiento espectral se mide a partir de la longitud de onda de referencia de absorbancia máxima de 656 nm para May Grunwald y/o una pluralidad de valores del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima para una pluralidad de composiciones de tinción de May Grunwald.
La biblioteca de longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima puede incluir una referencia a una longitud de onda de absorbancia máxima a esencialmente 659 nm para Wright Giemsa, una pluralidad de valores de desplazamiento espectral para una pluralidad de composiciones de tinción de Wright Giemsa en donde el valor de desplazamiento espectral se mide a partir de la longitud de onda de referencia de absorbancia máxima de 659 nm para Wright Giemsa y/o una pluralidad de valores del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima para una pluralidad de composiciones de tinción de Wright Giemsa.
La biblioteca de longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima puede incluir una referencia a una longitud de onda de absorbancia máxima para May Grunwald Giemsa, una pluralidad de valores de desplazamiento espectral para una pluralidad de composiciones de tinción de May Grunwald Giemsa en donde el valor de desplazamiento espectral se mide a partir de la longitud de onda de referencia de absorbancia máxima para May Grunwald Giemsa y/o una pluralidad de valores del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima para una pluralidad de composiciones de tinción de May Grunwald Giemsa.
El método puede incluir hacer una pluralidad de evaluaciones de la tinción histológica a lo largo del tiempo con el fin de monitorear la calidad de la tinción.
El método puede incluir transferir una alícuota de la tinción histológica desde un contenedor de almacenamiento a un recipiente de análisis antes de la medición, por ejemplo, cuando el recipiente de análisis es una cubeta, un capilar o una placa de múltiples pocillos.
La medición del método puede tener lugar dentro de un analizador de histología o fuera de un analizador de histología. Después de realizar la medición fuera de un analizador de histología, el espectro de absorbancia de la tinción histológica, una o más longitudes de onda de absorbancia máxima derivadas de la misma o sus combinaciones pueden transferirse al analizador de histología. El espectro de absorbancia de la tinción histológica, una o más longitudes de onda de absorbancia máxima derivadas de la misma o sus combinaciones pueden transferirse a través de una conexión de datos alámbrica que conecta el espectrofotómetro al analizador de histología. El espectro de absorbancia de la tinción histológica, una o más longitudes de onda de absorbancia máxima derivadas del mismo o sus combinaciones pueden transferirse mediante el uso de un medio de almacenamiento legible por ordenador.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 proporciona los picos de absorbancia en ~655 nm para varias diluciones dentro de la especificación y no dentro de especificación de formulaciones de tinciones de Wright Giemsa (WG) y May Grunwald (MG) como se describió en la presente descripción.
La Figura 2 proporciona para la comparación imágenes de ejemplo de células teñidas con formulaciones dentro de la especificación y no dentro de la especificación de WG.
La Figura 3 proporciona para la comparación imágenes de ejemplo de células teñidas con formulaciones dentro de la especificación y no dentro de la especificación de MG.
Las Figuras 4A y 4B representan los espectros de absorción de tinciones de WG y MG que tienen varias formulaciones y concentraciones.
Las Figuras 5A y 5B representan los espectros de absorción de tinciones de WG y MG preparadas a diferentes concentraciones de sus formulaciones objetivo.
Las Figuras 6A y 6B representan una comparación entre los espectros de absorción de tinciones de WG y MG preparadas a diferentes concentraciones de sus formulaciones objetivo.
Las Figuras 7A y 7B representan los espectros para las tinciones de WG y MG de diferentes proveedores que muestran las distintas posiciones espectrales de los picos de absorbancia debido a formulaciones ligeramente diferentes.
La Figura 8 representa los diferentes espectros a través de 200 nm a 800 nm para MG, May Grunwald Giemsa (MGG) y WG, demostrando características espectrales únicas entre las tres tinciones.
Definiciones
Los términos "espectrofotometría" y "espectrofotométrica" como se usa en la presente generalmente se refieren a métodos que implican el uso de un espectrofotómetro. Por "espectrofotómetro" se entiende generalmente un instrumento que mide la cantidad de luz de una o más longitudes de onda espectrales especificadas mediante el uso de un fotómetro, en donde una o más longitudes de onda pueden ser una longitud de onda discreta o un color (por ejemplo, una longitud de onda de un solo tamaño medida en nanómetros (nm)) o un intervalo de longitudes de onda o colores que incluyen, por ejemplo, una pluralidad de longitudes de onda discretas medidas a través de un intervalo definido del espectro. La cantidad de luz medida en un espectrofotómetro generalmente está relacionada con la luz que pasa a través de un medio, donde el medio puede ser una sustancia de interés para la que se está determinando una espectrofotométrica. La medición cuantitativa de la luz que pasa a través de un medio se expresa generalmente en términos de o se refiere a la absorbancia. Sin embargo, en algunos casos, una medición espectrofotométrica también puede referirse a o expresarse en términos de reflexión, transmitancia, etc. La medición cuantitativa obtenida de un espectrofotómetro puede ser una medición bruta o total o absoluta (por ejemplo, absorbancia absoluta) o la medición puede ser una medición relativa, por ejemplo, un porcentaje o relación, que incluye, por ejemplo, un porcentaje de un valor de referencia o medición de control (por ejemplo, por ciento de absorbancia, por ciento de transmitancia, etc.).
Los términos "espectros" y "espectro" como se usa en la presente generalmente se refieren a una colección o banda de longitudes de onda o colores de radiación electromagnética dentro de los intervalos visibles y adyacentes que incluyen pero no se limitan, por ejemplo, el intervalo ultravioleta-visible (UV-vis), el intervalo visible (intervalo ultravioleta, intervalo ultravioleta cercano, intervalo violeta, intervalo azul, intervalo verde, intervalo amarillo, intervalo naranja, intervalo rojo, intervalo infrarrojo, intervalo infrarrojo cercano, intervalo infrarrojo medio, intervalo infrarrojo lejano, etc. En algunos casos, un espectro puede referirse al intervalo total de longitudes de onda a través del cual se midió la luz. En algunos casos, un espectro puede referirse a una porción del intervalo de longitudes de onda a través del cual se midió la luz. Por ejemplo, un espectro que se obtiene de un espectrofotómetro puede reflejar todo el intervalo de longitudes de onda medidas o una porción de las longitudes de onda medidas.
El término "evaluar" incluye cualquier forma de medición e incluye determinar si un elemento está presente o no. Los términos "determinar", "medir", "valorar", "evaluar" y "ensayar" son usados indistintamente e incluyen determinaciones cuantitativas y cualitativas. Puede evaluarse de forma relativa o absoluta. "Evaluar la identidad de" incluye determinar la identidad más probable de un compuesto, formulación o sustancia particular, y/o determinar si un compuesto, formulación o sustancia prevista está presente o ausente. "Evaluar la calidad de" incluye hacer una evaluación cualitativa o cuantitativa de la calidad, por ejemplo, a través de la comparación de un valor determinado con una referencia o estándar de calidad conocido.
El término "histología" e "histológico" como se usa en la presente generalmente se refiere al análisis microscópico de la anatomía celular y/o morfología de células que se obtienen de un organismo pluricelular que incluye, pero no se limita a, plantas y animales. Como tal, una "tinción histológica" se refiere a una tinción usada en el análisis de la anatomía y/o morfología celular y un "analizador de histología" se refiere a un instrumento que analiza la anatomía y/o morfología de células que se obtienen de un animal pluricelular. Como se usa en la presente, un analizador de histología generalmente se referirá a un instrumento que usa una o más tinciones histológicas para hacer una evaluación histológica.
El término "citología" y "citológico" como se usa en la presente generalmente se refiere a una subclase de histología que incluye el análisis microscópico de células individuales, células disociadas, células sueltas, conglomerados de células, etc. Las células de una muestra citológica pueden ser células en u obtenidas de uno o más fluidos corporales. Como tal, una "tinción citológica" se refiere a una tinción usada en el análisis de células individuales, células disociadas, células sueltas, conglomerados de células, etc. y un "analizador de citología" se refiere a un instrumento que analiza la anatomía y/o morfología de células individuales, células disociadas, células sueltas, conglomerados de células, etc. Como se usa en la presente, un analizador de citología generalmente se referirá a un instrumento que usa una o más tinciones citológicas para hacer una evaluación citológica.
El término "fluido corporal" como se usa en la presente generalmente se refiere a fluidos derivados de una "muestra biológica" que abarca una variedad de tipos de muestras que se obtienen de un individuo o una población de individuos y puede usarse en un ensayo de diagnóstico, de monitoreo o de cribado. La definición abarca la sangre y otras muestras líquidas de origen biológico. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de cualquier forma después de su obtención, tal como por mezcla o agrupación de muestras individuales, tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento de ciertos componentes, tales como las células nucleadas, células no nucleadas, patógenos, etc.
El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica y también incluye células en cultivo, sobrenadantes de células, lisados de células, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejido. El término "muestra biológica" incluye orina, saliva, fluido cefalorraquídeo, fluido intersticial, fluido ocular, fluido sinovial, fracciones de sangre tales como plasma y suero, y similares.
El término "entrada", como se usa en la presente, se usa para referirse a cualquier forma de ingresar información en un ordenador, tal como, por ejemplo, a través del uso de una interfaz del usuario. Por ejemplo, en ciertos casos, la entrada puede implicar la selección de un espectro de referencia o una característica espectral o una biblioteca de la misma que ya está presente en un sistema informático. En otros casos, la entrada puede implicar agregar un espectro o una característica espectral a un sistema informático, por ejemplo, mediante la medición del espectro de una muestra en un dispositivo capaz de interactuar con un ordenador. La entrada también puede realizarse mediante el uso de una interfaz del usuario.
Como se usa en la presente, el término "ejecutar" se usa para referirse a una acción que un usuario realiza para iniciar un programa.
Los términos "control", "ensayo de control", "muestra de control" y similares, se refieren a una muestra, prueba u otra porción de un procedimiento experimental o procedimiento de diagnóstico o diseño experimental para los que se conoce un resultado esperado con gran certeza, por ejemplo, con el fin de indicar si los resultados obtenidos de las muestras experimentales asociadas son fiables, indicar con qué grado de confianza los resultados experimentales asociados indican un resultado verdadero y/o para permitir la calibración de los resultados experimentales. Por ejemplo, en algunos casos, un control puede ser un ensayo de "control negativo" de manera que se excluya un componente esencial del ensayo de manera que un experimentador pueda tener una gran certeza de que el ensayo de control negativo no producirá un resultado positivo. En algunos casos, un control puede ser un "control positivo" de manera que todos los componentes de un ensayo particular se caracterizan y se sabe que, cuando se combinan, para producir un resultado particular en el ensayo que se realiza, de manera que un experimentador pueda tener una gran certeza de que el ensayo de control positivo no producirá un resultado positivo. Los controles también pueden incluir muestras "en blanco", muestras "estándar" (por ejemplo, muestras "estándar de oro"), muestras validadas, etc.
Descripción detallada
La presente descripción proporciona métodos espectrofotométricos para evaluar las tinciones histológicas usadas en un analizador de histología. Los métodos resultan útiles en varias evaluaciones, que incluyen determinar la identidad de una tinción histológica, determinar la calidad de una tinción histológica, etc. También se describen, pero no se reivindican, los dispositivos y los sistemas para practicar los métodos descritos. Fuera del alcance de la invención reivindicada, la presente descripción también describe medios legibles por ordenador que contienen bibliotecas de características espectrofotométricas de referencia de tinciones histológicas útiles para evaluar una tinción histológica usada en un analizador de histología y medios legibles por ordenador que contienen instrucciones que hacen que un dispositivo informático realice etapas para hacer una evaluación de una tinción histológica.
Antes de que la presente invención se describa con mayor detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a las modalidades particulares descritas, ya que pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción es solo para el propósito de describir las modalidades particulares, y no pretende limitarse, dado que el alcance de la presente invención se limitará solo mediante las reivindicaciones adjuntas.
Donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, a la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto lo dicte claramente de cualquier otra manera, entre los límites superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, se abarca dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también se abarcan dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Donde el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de estos límites incluidos también se incluyen en la invención.
Ciertos intervalos se presentan en la presente descripción con valores numéricos precedidos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" se usa en la presente descripción para proporcionar soporte literal para el número exacto que precede, así como también un número que está cerca de o aproximadamente al número que el término precede. Para determinar si un número está cerca de o aproximadamente a un número específicamente recitado, el número que está cerca o aproximadamente no recitado puede ser un número que, en el contexto en el que se presenta, proporciona el equivalente sustancial del número específicamente recitado.
A menos que se definan de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por una persona experta en la técnica a la que pertenece esta invención.
Se hace notar que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de cualquier otra manera. Se hace notar además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración se pretende para servir como base de antecedente para el uso de tal terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la recitación de los elementos de acuerdo con la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
Métodos
La presente descripción incluye métodos espectrofotométricos para evaluar tinciones histológicas, los métodos que comprenden medir las características espectrofotométricas de una tinción histológica del sujeto mediante el uso de un espectrofotómetro para identificar una o más características que son específicas de una tinción particular y/o una formulación de tinción para varios propósitos.
Características espectrofotométricas
Las características espectrofotométricas de interés incluyen, pero no se limitan a, la posición de uno o más picos, el ancho de uno o más picos y la absorbancia máxima de uno o más picos. En algunos casos, las características espectrofotométricas de interés incluyen, pero no se limitan a, las características relativas de los picos entre dos o más picos diferentes, que incluyen, pero no se limitan a, las posiciones relativas entre dos o más picos del espectro, los picos de absorbancia relativos de dos o más picos del espectro, los anchos relativos de dos o más picos del espectro, etc.
Sin estar limitada por la teoría, la presente descripción se basa en el descubrimiento de que las características espectrales de una formulación de tinción particular dependen de la interacción de los componentes individuales de la tinción y dependen de las cantidades relativas de los componentes de tinción individuales. Por ejemplo, las cantidades relativas de los componentes X e Y de una tinción pueden resultar en diferentes características espectrales en la formulación 1 en comparación con la formulación 2 donde las formulaciones 1 y 2 difieren en las cantidades relativas del componente X al componente Y policía su modo de preparación. Así, incluso aquellas tinciones que tienen sólo relaciones ligeramente diferentes de componentes de tinción variarán en sus características espectrales. En consecuencia, cada formulación de tinción histológica tiene características espectrales específicas que pueden medirse y usarse para varias evaluaciones.
En algunos casos, una característica espectral específica de una tinción histológica o formulación de tinción particular puede ser la posición de una absorbancia máxima que se obtiene mediante la medición de un espectro de absorbancia de la tinción histológica en un espectrofotómetro. La posición de una absorbancia máxima puede determinarse a través de varios métodos. Por ejemplo, en un número de modalidades descritas en la presente descripción, la posición de una absorbancia máxima se determina en base a la absorbancia máxima del pico donde el término "absorbancia máxima" (también se refiere como longitud de onda de absorbancia máxima (es decir, Amáx)), como se usa en la presente, se refiere a la longitud de onda a la que el pico alcanza su máximo de absorbancia más alto. En otros casos, la posición del pico puede determinarse mediante medios distintos del absorbancia máxima, que incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, la longitud de onda correspondiente a la media del ancho del pico, la longitud de onda correspondiente a la media del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima, la longitud de onda correspondiente a la mediana del ancho del pico, la longitud de onda correspondiente a la mediana del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima, etc.
En algunos casos, la posición del pico puede determinarse teniendo en cuenta los picos menores u "hombros" presentes dentro de la banda espectral del pico principal. En algunos casos, la posición del pico puede determinarse sin tener en cuenta los picos menores u "hombros" presentes dentro de la banda espectral del pico principal.
La posición del pico puede expresarse en términos absolutos que incluyen, por ejemplo, de acuerdo con la longitud de onda del pico. La posición absoluta de un absorbancia máxima variará en dependencia de la formulación de tinción particular y puede variar de aproximadamente 200 nm o menos a aproximadamente 800 nm o más, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, 200 nm a 800 nm, 200 nm a 700 nm, 200 nm a 600 nm, 200 nm a 500 nm, 200 nm a 400 nm, 300 nm a 800 nm, 300 nm a 700 nm, 300 nm a 600 nm, 300 nm a 500 nm, 300 nm a 400 nm, 400 nm a 800 nm, 400 nm a 700 nm, 400 nm a 600 nm, 400 nm a 500 nm, 500 nm a 800 nm, 500 nm a 700 nm, 500 nm a 600 nm, 500 nm a 550 nm, 600 nm a 800 nm, 600 nm a 700 nm, 600 nm a 670 nm, 640 nm a 700 nm, 640 nm a 670 nm, etc.
En algunos casos, la posición absoluta de un absorbancia máxima puede ser 200 nm, 201 nm, 202 nm, 203 nm, 204 nm, 205 nm, 206 nm, 207 nm, 208 nm, 209 nm, 210 nm, 211 nm, 212 nm, 213 nm, 214 nm, 215 nm, 216 nm, 217 nm, 218 nm, 219 nm, 220 nm, 221 nm, 222 nm, 223 nm, 224 nm, 225 nm, 226 nm, 227 nm, 228 nm, 229 nm, 230 nm, 231 nm, 232 nm, 233 nm, 234 nm, 235 nm, 236 nm, 237 nm, 238 nm, 239 nm, 240 nm, 241 nm, 242 nm, 243 nm, 244 nm, 245 nm, 246 nm, 247 nm, 248 nm, 249 nm, 250 nm, 251 nm, 252 nm, 253 nm, 254 nm, 255 nm, 256 nm, 257 nm, 258 nm, 259 nm, 260 nm, 261 nm, 262 nm, 263 nm, 264 nm, 265 nm, 266 nm, 267 nm, 268 nm, 269 nm, 270 nm, 271 nm, 272 nm, 273 nm, 274 nm, 275 nm, 276 nm, 277 nm, 278 nm, 279 nm, 280 nm, 281 nm, 282 nm, 283 nm, 284 nm, 285 nm, 286 nm, 287 nm, 288 nm, 289 nm, 290 nm, 291 nm, 292 nm, 293 nm, 294 nm, 295 nm, 296 nm, 297 nm, 298 nm, 299 nm, 300 nm, 301 nm, 302 nm, 303 nm, 304 nm, 305 nm, 306 nm, 307 nm, 308 nm, 309 nm, 310 nm, 311 nm, 312 nm, 313 nm, 314 nm, 315 nm, 316 nm, 317 nm, 318 nm, 319 nm, 320 nm, 321 nm, 322 nm, 323 nm, 324 nm, 325 nm, 326 nm, 327 nm, 328 nm, 329 nm, 330 nm, 331 nm, 332 nm, 333 nm, 334 nm, 335 nm, 336 nm, 337 nm, 338 nm, 339 nm, 340 nm, 341 nm, 342 nm, 343 nm, 344 nm, 345 nm, 346 nm, 347 nm, 348 nm, 349 nm, 350 nm,351 nm, 352 nm, 353 nm, 354 nm, 355 nm, 356 nm, 357 nm, 358 nm, 359 nm, 360 nm, 361 nm, 362 nm, 363 nm, 364 nm, 365 nm, 366 nm, 367 nm, 368 nm, 369 nm, 370 nm, 371 nm, 372 nm, 373 nm, 374 nm, 375 nm, 376 nm, 377 nm, 378 nm, 379 nm, 380 nm, 381 nm, 382 nm, 383 nm, 384 nm, 385 nm, 386 nm, 387 nm, 388 nm, 389 nm, 390 nm, 391 nm, 392 nm, 393 nm, 394 nm, 395 nm, 396 nm, 397 nm, 398 nm, 399 nm, 400 nm, 401 nm, 402 nm, 403 nm, 404 nm, 405 nm, 406 nm, 407 nm, 408 nm, 409 nm, 410 nm, 411 nm, 412 nm, 413 nm, 414 nm, 415 nm, 416 nm, 417 nm, 418 nm, 419 nm, 420 nm, 421 nm, 422 nm, 423 nm, 424 nm, 425 nm, 426 nm, 427 nm, 428 nm, 429 nm, 430 nm, 431 nm, 432 nm, 433 nm, 434 nm, 435 nm, 436 nm, 437 nm, 438nm, 439 nm, 440 nm, 441 nm, 442 nm, 443 nm, 444 nm, 445 nm, 446 nm, 447 nm, 448 nm, 449 nm, 450 nm, 451 nm, 452 nm, 453 nm, 454 nm, 455 nm, 456 nm, 457 nm, 458 nm, 459 nm, 460 nm, 461 nm, 462 nm, 463 nm, 464 nm, 465 nm, 466 nm, 467 nm, 468 nm, 469 nm, 470 nm, 471 nm, 472 nm, 473 nm, 474 nm, 475 nm, 476 nm, 477 nm, 478 nm, 479 nm, 480 nm, 481 nm, 482 nm, 483 nm, 484 nm, 485 nm, 486 nm, 487 nm, 488 nm, 489 nm, 490 nm, 491 nm, 492 nm, 493 nm, 494 nm, 495 nm, 496 nm, 497 nm, 498 nm, 499 nm, 500 nm, 501 nm, 502 nm, 503 nm, 504 nm, 505 nm, 506 nm, 507 nm, 508 nm, 509 nm, 510 nm, 511 nm, 512 nm, 513 nm, 514 nm, 515 nm, 516 nm, 517 nm, 518 nm, 519 nm, 520 nm, 521 nm, 522 nm, 523 nm, 524 nm, 525 nm, 526 nm, 527 nm, 528 nm, 529 nm, 530 nm, 531 nm, 532 nm, 533 nm, 534 nm, 535 nm, 536 nm, 537 nm, 538 nm, 539 nm, 540 nm, 541 nm, 542 nm, 543 nm, 544 nm, 545 nm, 546 nm, 547 nm, 548 nm, 549 nm, 550 nm, 551 nm, 552 nm, 553 nm, 554 nm, 555 nm, 556 nm, 557 nm, 558 nm, 559 nm, 560 nm, 561 nm, 562 nm, 563 nm, 564 nm, 565 nm, 566 nm, 567 nm, 568 nm, 569 nm, 570 nm, 571 nm, 572 nm, 573 nm, 574 nm, 575 nm, 576 nm, 577 nm, 578 nm, 579 nm, 580 nm, 581 nm, 582 nm, 583 nm, 584 nm, 585 nm, 586 nm, 587 nm, 588 nm, 589 nm, 590 nm, 591 nm, 592 nm, 593 nm, 594 nm, 595 nm, 596 nm, 597 nm, 598 nm, 599 nm, 600 nm, 601 nm, 602 nm, 603 nm, 604 nm, 605 nm, 606 nm, 607 nm, 608 nm, 609 nm, 610 nm, 611 nm, 612 nm, 613 nm, 614 nm, 615 nm, 616 nm, 617 nm, 618 nm, 619 nm, 620 nm, 621 nm, 622 nm, 623 nm, 624 nm, 625 nm, 626 nm, 627 nm, 628 nm, 629 nm, 630 nm, 631 nm, 632 nm, 633 nm, 634 nm, 635 nm, 636 nm, 637 nm, 638 nm, 639 nm, 640 nm, 641 nm, 642 nm, 643 nm, 644 nm, 645 nm, 646 nm, 647 nm, 648 nm, 649 nm, 650 nm, 651 nm, 652 nm, 653 nm, 654 nm, 655 nm, 656 nm, 657 nm, 658 nm, 659 nm, 660 nm, 661 nm, 662 nm, 663 nm, 664 nm, 665 nm, 666 nm, 667 nm, 668 nm, 669 nm, 670 nm, 671 nm, 672 nm, 673 nm, 674 nm, 675 nm, 676 nm, 677 nm, 678 nm, 679 nm, 680 nm, 681 nm, 682 nm, 683 nm, 684 nm, 685 nm, 686 nm, 687 nm, 688 nm, 689 nm, 690 nm, 691 nm, 692 nm, 693 nm, 694 nm, 695 nm, 696 nm, 697 nm, 698 nm, 699 nm, 700 nm, 701 nm, 702 nm, 703 nm, 704 nm, 705 nm, 706 nm, 707 nm, 708 nm, 709 nm, 710 nm, 711 nm, 712 nm, 713 nm, 714 nm, 715 nm, 716 nm, 717 nm, 718 nm, 719 nm, 720 nm, 721 nm, 722 nm, 723 nm, 724 nm, 725 nm, 726 nm, 727 nm, 728 nm, 729 nm, 730 nm, 731 nm, 732 nm, 733 nm, 734 nm, 735 nm, 736 nm, 737 nm, 738 nm, 739 nm, 740 nm, 741 nm, 742 nm, 743 nm, 744 nm, 745 nm, 746 nm, 747 nm, 748 nm, 749 nm, 750 nm, 751 nm, 752 nm, 753 nm, 754 nm, 755 nm, 756 nm, 757 nm, 758 nm, 759 nm, 760 nm, 761 nm, 762 nm, 763 nm, 764 nm, 765 nm, 766 nm, 767 nm, 768 nm, 769 nm, 770 nm, 771 nm, 772 nm, 773 nm, 774 nm, 775 nm, 776 nm, 777 nm, 778 nm, 779 nm, 780 nm, 781 nm, 782 nm, 783 nm, 784 nm, 785 nm, 786 nm, 787 nm, 788 nm, 789 nm, 790 nm, 791 nm, 792 nm, 793 nm, 794 nm, 795 nm, 796 nm, 797 nm, 798 nm, 799 nm u 800 nm.
En algunos casos, la posición del pico puede expresarse en términos relativos que incluyen, por ejemplo, la posición del pico con relación a un pico de referencia, por ejemplo, en una tinción, formulación de tinción o componente de tinción diferente. Por ejemplo, la posición del pico puede expresarse con relación a una formulación de tinción estándar que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, una formulación validada de la tinción, una formulación objetivo de la tinción, una formulación de referencia de la tinción, una formulación de límite de especificación inferior de la tinción, un límite de especificación superior de la tinción, etc. En algunos casos, el pico de referencia con el que se compara un pico medido es una medición anterior de la misma tinción o de la misma formulación de tinción que incluye, por ejemplo, donde se evalúa la estabilidad y/o inestabilidad (por ejemplo, degradación) del pico se evalúa a lo largo del tiempo.
En ciertos casos, la posición relativa del pico puede describirse en términos de desplazamiento o desplazamiento espectral. Como se usa en la presente, los términos "desplazamiento" o "desplazamiento espectral" en relación con los picos de absorbancia se refiere a la diferencia en una posición de pico espectral medido en comparación con una posición de un pico de referencia. El desplazamiento espectral también puede, en algunos casos, referirse a desplazamientos a mayor o menor absorbancia con o sin un cambio en la posición de la absorbancia máxima del pico. Como tal, los desplazamientos espectrales abarcados dentro del término descrito incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un desplazamiento positivo (un desplazamiento a una longitud de onda más larga), un desplazamiento negativo (un desplazamiento a una longitud de onda más corta) y sus combinaciones. En algunos casos, un desplazamiento puede describirse en relación al color de la longitud de onda de la luz hacia la cual se observa el desplazamiento, que incluye, por ejemplo, un desplazamiento al rojo lejano, un desplazamiento al rojo, un desplazamiento al naranja, un desplazamiento al amarillo, un desplazamiento al verde, un desplazamiento al azul, un desplazamiento al violeta, un desplazamiento al ultravioleta, etc.
El desplazamiento espectral puede representarse como un aumento (es decir, un desplazamiento positivo, un desplazamiento a una longitud de onda más larga, etc.) o una disminución (un desplazamiento negativo, t, un desplazamiento a una longitud de onda más corta, etc.) en la longitud de onda en comparación con la longitud de onda de referencia. La cantidad de desplazamiento espectral dependerá de la formulación de una tinción histológica específica y del pico de referencia con el que se compara. Como tal, el desplazamiento espectral de un pico medido puede variar de menos de -10 nm a 10 nm o más, que incluye pero no se limita a, por ejemplo, -10 nm a 10 nm, -10 nm a 9 nm, -10 nm a 8 nm, -10 nm a 7 nm, -10 nm a 6 nm, -10 nm a 5 nm, -10 nm a 4 nm, -10 nm a 3 nm, -10 nm a 2 nm, -10 nm a 1 nm, -9 nm a 10 nm, -8 nm a 10 nm, -7 nm a 10 nm, -6 nm a 10 nm, -5 nm a 10 nm, -4 nm a 10 nm, -3 nm a 10 nm, -2 nm a 10 nm, -1 nm a 10 nm, -9 nm a 9 nm, -8 nm a 8 nm, -7 nm a 7 nm, -6 nm a 6 nm, -5 nm a 5 nm, -4 nm a 4 nm, -3 nm a 3 nm, -2 nm a 2 nm, -1 nm a 1 nm, 0 nm a 1 nm, -1 nm a 0 nm y similares. El desplazamiento espectral generalmente tendrá un límite superior de ± 20 nm o menos, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, ± 19 nm o menos, ± 18 nm o menos, ± 17 nm o menos, ± 16 nm o menos, ± 15 nm o menos, ± 14 nm o menos, ± 13 nm o menos, ± 12 nm o menos, ± 11 nm o menos o ± 10 nm o menos. El desplazamiento espectral generalmente tendrá un límite inferior de ± 1 nm o más.
En algunos casos, el desplazamiento de espectros de un pico medido puede ser -10 nm, -9 nm, -8 nm, -7 nm, -6 nm, -5 nm, -4 nm, -3 nm, -2 nm, -1 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm o 10 nm.
En algunos casos, la posición del pico puede expresarse con relación a una absorbancia máxima, por ejemplo, una absorbancia máxima medido o esperado, de un componente de la tinción o el desplazamiento espectral puede calcularse mediante el uso de una absorbancia máxima, por ejemplo, una absorbancia máxima medido o esperado, de un componente de la tinción. Por ejemplo, una formulación de tinción que tiene dos o más componentes de tinción puede tener una absorbancia máxima que se expresa con relación a un componente de la tinción. Como se ha descrito anteriormente, los componentes individuales de la tinción afectan las características espectrales generales de la tinción de manera que los picos de absorbancia de una formulación de tinción pueden ser diferentes de los picos de absorbancia de los componentes individuales de la tinción. Por ejemplo, un pico de una formulación de tinción puede ser de 1 o más nanómetros (nm), hasta e incluyendo 20 nm, diferente del pico esperado o medido de un componente de la tinción, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, más de 1 nm diferente, más de 2 nm diferente, más de 3 nm diferente, más de 4 nm diferente, más de 5 nm diferente, más de 6 nm diferente, más de 7 nm diferente, más de 8 nm diferente, más de 9 nm diferente, más de 10 nm diferente, etc.
En algunos casos, un pico de una formulación de tinción puede tener un desplazamiento espectral de un pico esperado o medido de un componente de la tinción que varía de -10 nm a 10 nm, que incluye pero no se limita a, por ejemplo, -10 nm a 9 nm, -10 nm a 8 nm, -10 nm a 7 nm, -10 nm a 6 nm, -10 nm a 5 nm, -10 nm a 4 nm, -10 nm a 3 nm, -10 nm a 2 nm, -10 nm a 1 nm, -9 nm a 10 nm, -8 nm a 10 nm, -7 nm a 10 nm, -6 nm a 10 nm, -5 nm a 10 nm, -4 nm a 10 nm, -3 nm a 10 nm, -2 nm a 10 nm, -1 nm a 10 nm, -9 nm a 9 nm, -8 nm a 8 nm, -7 nm a 7 nm, -6 nm a 6 nm, -5 nm a 5 nm, -4 nm a 4 nm, -3 nm a 3 nm, -2 nm a 2 nm, -1 nm a 1 nm, 0 nm a 1 nm, -1 nm a 0 nm y similares.
En algunos casos, un pico de una formulación de tinción puede tener un desplazamiento espectral de un pico esperado 0 medido de un componente de la tinción de -10 nm, -9 nm, -8 nm, -7 nm, -6 nm, -5 nm, -4 nm, -3 nm, -2 nm, -1 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm o 10 nm.
En algunos casos, una característica espectral específica de una tinción histológica o formulación de tinción particular puede ser un ancho de uno o más picos que se obtienen mediante la medición de un espectro de absorbancia de la tinción histológica en un espectrofotómetro. Cualquier medida conveniente del ancho del pico puede resultar útil como característica espectral específica de una tinción histológica o formulación de tinción particular siempre que la medida del ancho diferencie suficientemente la tinción histológica o la formulación de tinción. Por ejemplo, el ancho del pico puede medirse en cualquier valor de absorbancia conveniente siempre que el ancho del pico en el valor de absorbancia elegido diferencie la tinción histológica o la formulación de tinción de otras tinciones histológicas o formulaciones de tinción.
Las medidas del ancho del pico pueden ser absolutas o relativas en dependencia de la medida realizada, los espectros adquiridos, la comparación a realizarse, etc. Por ejemplo, las medidas absolutas del ancho del pico pueden expresarse en términos de longitudes de onda medidas en nanómetros (nm) y pueden calcularse en base a la diferencia entre la longitud de onda en el primer borde del pico y la longitud de onda en el segundo borde del pico en un nivel de absorbancia particular. Por ejemplo, puede calcularse un ancho del pico de X nm en la absorbancia Y para el primer pico mediante la determinación de la diferencia entre la longitud de onda en el primer borde del pico y la longitud de onda en el segundo borde del pico en el valor de absorbancia Y. Cálculos similares pueden realizarse para cualquier pico o combinaciones de picos de un espectro a varios valores de absorbancia. En algunos casos, la determinación del ancho del pico se facilita por la superposición de varios espectros de diferentes tinciones y/o diferentes formulaciones de tinción, por ejemplo, como se representa en la Figura 7A. Un experto en la materia comprenderá fácilmente que el ancho del pico puede calcularse y compararse para dos o más picos de uno o más espectros independientemente de si los espectros están superpuestos.
Como la forma de los picos individuales dentro de un espectro variará con diferentes tinciones, diferentes formulaciones, diferentes condiciones de ensayo, etc., también variará la absorbancia óptima a la que se calcula el ancho del pico. En algunos casos, la absorbancia puede basarse en la absorbancia real medida del pico, por ejemplo, el valor de absorbancia bruto devuelto por el espectrofotómetro. En otros casos, la absorbancia puede basarse en la absorbancia relativa del pico, por ejemplo, expresada como una proporción de la absorbancia máxima del pico, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, 10 % de absorbancia máxima, 20 % de absorbancia máxima, 25 % de absorbancia máxima, 30 % de absorbancia máxima, 40 % de absorbancia máxima, 50 % de absorbancia máxima (es decir, la mitad de la absorbancia máxima), 60 % de absorbancia máxima, 70 % de absorbancia máxima, 75 % de absorbancia máxima, 80 % de absorbancia máxima, 90 % de absorbancia máxima, etc. Un experto en la materia comprenderá fácilmente que, donde se hacen comparaciones entre las mediciones del ancho del pico para dos picos que tienen diferentes valores de absorbancia máxima, la absorbancia real medida de los picos, la absorbancia relativa de los picos o alguna normalización de la absorbancia real o relativa de los picos puede usarse en dependencia del contexto particular de las mediciones.
En algunos casos, una característica espectral específica de una tinción histológica o formulación de tinción particular puede ser un valor de absorbancia máxima que se obtiene mediante la medición un espectro de absorbancia de la tinción histológica en un espectrofotómetro. En algunos casos, el valor de absorbancia máxima puede basarse en la absorbancia real medida del pico, por ejemplo, el valor de absorbancia bruto devuelto mediante el espectrofotómetro a varias longitudes de onda. En otros casos, el valor de absorbancia máxima puede basarse en la absorbancia relativa del pico, por ejemplo, expresada como absorbancia proporcional en comparación con una muestra de referencia que incluye, por ejemplo, la absorbancia máxima de la muestra de referencia (por ejemplo, una muestra "en blanco", una muestra "conocida", un "estándar de referencia", la absorbancia de una tinción validada, etc.). Por ejemplo, un valor de absorbancia máxima relativo puede expresarse como una proporción del valor de referencia medido o almacenado que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, 10 % de absorbancia de referencia, 20 % de absorbancia de referencia, 25 % de absorbancia de referencia, 30 % de absorbancia de referencia, 40 % de absorbancia de referencia, 50 % de absorbancia de referencia, 60 % de absorbancia de referencia, 70 % de absorbancia de referencia, 75 % de absorbancia de referencia, 80 % de absorbancia de referencia, 90 % de absorbancia de referencia, etc. Un experto en la materia comprenderá fácilmente que, donde se hacen comparaciones entre los valores de absorbancia máxima para dos picos que tienen diferentes posiciones de picos de absorbancia máxima, puede usarse los valores de absorbancia máxima medidos realmente de los picos, los valores de absorbancia máxima relativos de los picos o alguna normalización de los valores de absorbancia máxima reales o relativos de los picos en dependencia del contexto particular de las mediciones. En consecuencia, en algunos casos, la diferencia medida entre dos valores de absorbancia máxima para los picos correspondientes de dos tinciones diferentes, dos formulaciones de tinción diferente o la misma tinción adquirida en momentos diferentes puede usarse en una evaluación como se describió en la presente descripción.
Las características espectrales específicas se medirán generalmente en un intervalo espectral definido. En algunos casos, el intervalo espectral definido puede incluir todas las medidas de longitud de onda que se obtienen del espectrofotómetro (es decir, el espectro total). En otros casos, el intervalo espectral definido puede incluir una porción de las medidas de longitud de onda que se obtienen del espectrofotómetro (es decir, un espectro parcial). El intervalo de espectros puede predefinirse, por ejemplo, en base a un intervalo espectral conocido donde se esperan características espectrales discriminatorias, o puede determinarse siguiendo los escaneos del espectro total de dos o más tinciones a compararse. En algunos casos, puede usarse un intervalo predefinido para una medición inicial y puede usarse uno o más intervalos posteriores siguiendo la medición inicial, por ejemplo, donde la medición inicial activa el uso de uno o más intervalos posteriores.
Los intervalos espectrales útiles variarán en dependencia de las tinciones específicas y/o formulaciones de tinción que deban diferenciarse y la(s) posición(es) de las características espectrales discriminatorias dentro del espectro. Como tal, los intervalos espectrales en los cuales se mide la absorbancia de acuerdo con los métodos como se describió en la presente descripción pueden variar de aproximadamente 200 nm o menos a aproximadamente 800 nm o más, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, 200 nm a 800 nm, 200 nm a 700 nm, 200 nm a 600 nm, 200 nm a 200 nm a 400 nm, 300 nm a 800 nm, 300 nm a 700 nm, 300 nm a 600 nm, 300 nm a 500 nm, 300 nm a 400 nm, 400 nm a 800 nm, 400 nm a 700 nm, 400 nm a 600 nm, 400 nm a 500 nm, 500 nm a 800 nm, 500 nm a 700 nm, 500 nm a 600 nm, 500 nm a 550 nm, 600 nm a 800 nm, 600 nm a 700 nm, 600 nm a 670 nm, 640 nm a 700 nm, 640 nm a 670 nm y similares.
Como entenderá el experto en la materia, la resolución de los espectros medidos será de suficiente resolución para discriminar las características espectrales de dos o más tinciones y/o dos o más formulaciones de tinción. En consecuencia, la resolución espectral requerida dependerá de la evaluación a hacerse y de la(s) característica(s) espectral(es) a medirse. Por ejemplo, en algunos casos donde las características espectrales entre dos tinciones o dos formulaciones de tinción a discriminarse difieren en la longitud de onda, por ejemplo, por 2 nm o menos, la resolución espectral será de al menos 1 nm o menos. En consecuencia, puede emplearse cualquier resolución espectral apropiada siempre que la resolución sea suficiente para hacer la discriminación deseada. Así, las resoluciones espectrales apropiadas pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, al menos 10 nm, al menos 9 nm al menos 8 nm, al menos 7 nm, al menos 6 nm, al menos 5 nm, al menos 4 nm, al menos 3 nm, al menos 2 nm, al menos 1,0 nm y similares.
En algunos casos, se obtiene una característica espectral en una longitud de onda específica sin el uso de un intervalo espectral. Por ejemplo, una longitud de onda específica predeterminada, por ejemplo, que se basa en una longitud de onda conocida donde se esperan características espectrales discriminatorias, puede usarse para obtener datos de absorbancia útiles para hacer una evaluación como se describió en la presente descripción.
Espectrofotómetros
Cualquier espectrofotómetro conveniente puede resultar útil en hacer mediciones espectrofotométricas de acuerdo con los métodos como se describió en la presente descripción, siempre que el espectrofotómetro sea adecuado para medir la absorbancia en un intervalo de espectro dentro del cual existen características espectrofotométricas discriminatorias de la tinción sujeta. Como mínimo, un espectrofotómetro adecuado para usar en los métodos descritos incluirá una fuente de luz capaz de generar luz adecuada para una medición espectrofotométrica, una región de análisis de muestra configurada para posicionar la muestra en la trayectoria de la luz generada de la fuente de luz y un detector adecuado para detectar la luz generada de la fuente de luz que pasa a través de la muestra (por ejemplo, un fotodiodo). Además, un espectrofotómetro adecuado también puede incluir componentes ópticos adicionales para la manipulación de la luz, por ejemplo, manipulación de la luz generada antes de pasar a través de la muestra (por ejemplo, un filtro, un colimador, un polarizador, un espejo (por ejemplo, un espejo dicroico), un prisma, una lente, etc.) o la manipulación de la luz transmitida a través de la muestra (por ejemplo, un espejo, un amplificador, etc.). La detección de la señal dentro del espectrofotómetro generalmente implica la conversión de la señal óptica (por ejemplo, la luz transmitida a través de la muestra) en una señal eléctrica de manera que el resultado de la medición pueda mostrarse (por ejemplo, en una pantalla digital), almacenado en memoria electrónica, o de cualquier otra manera proporcionada por un usuario (por ejemplo, impresa en un informe en papel) o transportada a otros componentes aguas abajo.
En algunos casos, el método puede incluir el uso de un espectrofotómetro externo para medir el espectro de absorbancia de la tinción histológica. Por "externo" se entiende que el espectrofotómetro no está dentro del analizador de histología.
En determinadas modalidades, un espectrofotómetro externo puede ser un espectrofotómetro autónomo. Cualquier espectrofotómetro autónomo conveniente puede resultar útil en los métodos como se describió en la presente descripción, siempre que el espectrofotómetro autónomo sea capaz de hacer mediciones de absorbancia a lo largo del (de los) intervalo (s) espectral (es) apropiado (s). Por ejemplo, en algunos casos, los espectrofotómetros autónomos adecuados incluirán, pero no se limitan a, por ejemplo, los disponibles comercialmente de proveedores tales como: ABB (www(punto)abb(punto)com), Agilent (www(punto)agilent(punto)com), Analytik Jena (www(punto)analytikjena(punto)com), Aurora Biomed (www(punto)aurorabiomed(punto)com), B&W Tek (www(punto)bwtek(punto)com), BaySpec (www(punto)bayspec(punto)com), Beckman Coulter (www(punto)beckmancoulter(punto)com), Biochrom (www(punto)biochrom(punto)co(punto)uk), BioTek (www(punto)biotek(punto)com), Bruker (www(punto)bruker(punto)com), Buck Scientific (www(punto)bucksci(punto)com), BWB Technologies (www(punto)bwbtech(punto)com), Cecil Instruments (www(punto)cecilinstruments(punto)com), CRAIC (www(punto)microspectra(punto)com), Eppendorf (www(punto)eppendorfna(punto)com), GBC Scientific (www(punto)gbcscientific(punto)com), GE Healthcare (www(punto)gelifesciences(punto)com), Hach (www(punto)hach(punto)com), Hamamatsu Fotónica (www(punto)hamamatsu(punto)com), Hitachi High Technologies (www(punto)hitachi-hta(punto)com), HORIBA Scientific (www(punto)horiba(punto)com/Scientific), JASCO (www(punto)jascoinc(punto)com), Malvern Instruments (www(punto)malvern(punto)com), Newport (www(punto)newport(punto)com), Ocean Optics (www(punto)oceanoptics(punto)com), PerkinElmer (www(punto)perkinelmer(punto)com), Renishaw (www(punto)renishaw(punto)com), Rigaku Raman (www(punto)rigakuraman(punto)com), SciAps (http(dos puntos)//sciaps(punto)com), SI Photonics (www(punto)siphotonics(punto)com), Shimadzu (www(punto)shimadzu(punto)com), Tec5USA (www(punto)tec5usa(punto)com), Thermo Fisher Scientific (www(punto)thermoscientific(punto)com) y similares.
En algunos casos, el método puede incluir el uso de un espectrofotómetro interno para medir el espectro de absorbancia de la tinción histológica. Por "interno" se entiende que el espectrofotómetro está dentro del analizador de histología. En tales casos, un espectrofotómetro interno puede compartir uno o más componentes del analizador de histología, lo que significa que tanto el analizador de histología como el espectrofotómetro usan el componente común en uno o más procesos mientras realizan sus funciones normales. Los componentes compartidos entre un espectrofotómetro interno y el analizador de histología que aloja el espectrofotómetro interno pueden variar y, pueden en algunos casos incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, reactivos, componentes de manipulación de líquidos o muestras, componentes de fuente de energía, componentes de almacenamiento de reactivos, componentes de transferencia de datos, datos componentes de almacenamiento, componentes de procesamiento de datos, componentes de salida de datos, componentes de visualización, componentes de interfaz del usuario, etc. En algunos casos, un espectrofotómetro interno puede ensamblarse a partir de componentes disponibles comercialmente, siempre que el espectrofotómetro ensamblado sea capaz de hacer mediciones de absorbancia a lo largo del (de los) intervalo(s) espectral(es) apropiado(s).
Los espectrofotómetros externos útiles o componentes de los mismos (por ejemplo, para su uso en un espectrofotómetro interno) pueden incluir aquellos espectrofotómetros disponibles comercialmente en, por ejemplo, Hitachi (que incluye, por ejemplo, los modelos U-0080d, U-1900, U-2900/2910, U-3900/3900H, etc. o componentes de los mismos), Analytik Jena AG (que incluye, por ejemplo, los modelos SPECORD 200/250/50/40/S 600/S 300 UV VIS, SPEK 2000, SPEKOL 1300, etc. o componentes de los mismos), PerkinElmer (que incluye, por ejemplo, los modelos LAMBDA 1050, 950, 850,750, 650, 25, 35, 45, XLS, XLS+, etc. o componentes de los mismos), Varian (que incluye, por ejemplo, los modelos Cary 4000, Cary 100, Cary 5000, Cary 6000i, etc. o componentes del mismo), BioTek Instruments (que incluye, por ejemplo, los modelos de espectrofotómetro de microplacas Epoch, PowerWaveXS, PowerWaveHT, etc. o componentes de los mismos), Cecil Instruments (que incluye, por ejemplo, los modelos Serie 1000 UV/Visible, Super Aurius, Aurius UV/Visable, BioQuest, GeneQuest, DietQuest, ReflectaScan Reflectance, Aquarius, AquaQuest, etc. o componentes de los mismos), Shimadzu (que incluye, por ejemplo, los modelos UVmini-1240, UV-2550, UV-1800, UV-3600, etc. o componentes de los mismos), Jasco (que incluye, por ejemplo, los modelos V-660, V650, V630, V-670, etc. o componentes de los mismos), Thermo Scientific (que incluye, por ejemplo, los modelos NanoDrop 2000c, 2000, 8000, etc. o componentes de los mismos), SI Photonics (que incluye, por ejemplo, los modelos 420, 440, etc. o componentes de los mismos), Hach (que incluye, por ejemplo, el modelo DR 5000 o componentes del mismo), Beckman Coulter (que incluye, por ejemplo, los modelos DU 800, DU 720/730, etc. o componentes de los mismos), Agilent (que incluye, por ejemplo, el modelo número 8453 Espectrofotómetro UV-Vis o componentes del mismo), Jenway (que incluye, por ejemplo, los modelos números 6800, 6705, 6715, etc. o componentes de los mismos), Aurora (que incluye por ejemplo, el modelo número UV-VIS 230 o componentes del mismo), y similares.
En algunos casos, los espectrofotómetros externos, que incluyen los componentes de los mismos, y/o los espectrofotómetros internos o componentes de los mismos pueden incluir, en parte o en su totalidad, aquellos espectrofotómetros y componentes relacionados descritos en patentes de Estados Unidos núms. 8,638,433; 8,502,969; 8,189,199; 8,115,922; 8,049,884; 7,932,095; 7,787,120; 7,359,049; 7,262,844; 6,643,016; 5,162,868.
Antes de medir un espectro de una tinción histológica en un espectrofotómetro, puede prepararse la tinción histológica o una muestra de la misma para su análisis. La preparación para el análisis de una tinción o una muestra de la misma puede incluir la transferencia de una alícuota de la tinción a un recipiente de análisis que sea compatible con el espectrofotómetro. Los recipientes de análisis compatibles variarán en dependencia del espectrofotómetro particular empleado y el volumen de la muestra a probarse. En algunos casos, los recipientes de análisis adecuados incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, una cubeta, un capilar y una placa de múltiples pocillos. En consecuencia, la transferencia de la alícuota al recipiente de análisis puede realizarse mediante cualquier método adecuado que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, el pipeteo de la muestra en el recipiente, el bombeo de la muestra al recipiente o a través del recipiente (por ejemplo, a través de presión positiva), la transferencia de la muestra a través de la acción capilar, la transferencia de la muestra a través de presión negativa, la transferencia de la muestra a través de la gravedad, etc.
En algunos casos, la muestra puede diluirse antes, durante o después de la transferencia al recipiente de análisis. Por ejemplo, en algunos casos puede añadirse un diluyente apropiado a la muestra antes de transferirla al recipiente de análisis, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, en un recipiente de dilución o recipiente de mezcla. En algunos casos, puede agregarse un diluyente adecuado a la muestra durante la transferencia al recipiente de análisis, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, donde un diluyente apropiado está presente en el recipiente de análisis antes de la adición de la muestra y la muestra se diluye al mezclarse con el diluyente en el recipiente de análisis. En algunos casos, puede agregarse un diluyente adecuado a la muestra después de transferirla al recipiente de análisis, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, donde la muestra se adiciona a un recipiente de análisis vacío y se adiciona un diluyente apropiado al recipiente de análisis después de que la muestra está presente.
Los diluyentes apropiados variarán en dependencia de la naturaleza de la medición espectroscópica a realizarse y de la tinción histológica específica a analizarse. Por ejemplo, en algunos casos, un diluyente apropiado puede ser un solvente acuoso que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, agua, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina tamponada con tris (TBS) y similares. En algunos casos, un diluyente apropiado puede ser un solvente orgánico que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, etanol, metanol, isopropanol, cloroformo y similares. En algunos casos, un diluyente apropiado puede ser el principal solvente de la tinción a analizarse.
Cualquier dilución conveniente puede resultar útil en los métodos como se describió en la presente descripción siempre que la dilución permita la detección espectrofotométrica de características espectrales distintivas cuando la tinción diluida se mide en un espectrofotómetro. Las diluciones apropiadas variarán en dependencia de la concentración inicial de la tinción, el volumen de la alícuota a analizarse, el espectrofotómetro particular a usarse, etc. En algunos casos, las diluciones apropiadas pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:15, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:25, aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:40, aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:60, aproximadamente 1:70, aproximadamente 1:75, aproximadamente 1:80, aproximadamente 1:90, aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:150, aproximadamente 1:200, aproximadamente 1:250, aproximadamente 1:300, aproximadamente 1:400, aproximadamente 1:500, aproximadamente 1:600, aproximadamente 1:700, aproximadamente 1:750, aproximadamente 1:800, aproximadamente 1:900, aproximadamente 1:1000, aproximadamente 1:1500, aproximadamente 1:2000 y similares.
En algunos casos, el método puede incluir la preparación de dos o más diluciones o una serie de diluciones antes de las mediciones de absorbancia en un espectrofotómetro para producir una pluralidad de espectros de absorbancia para la tinción histológica en las dos o más diluciones.
Manchas histológicas
La presente descripción incluye métodos para evaluar una tinción histológica usada en un analizador de histología mediante la medición del espectro de absorbancia de la tinción histológica en un espectrofotómetro. Como se usa en la presente descripción, las tinciones de histología usadas en el análisis microscópico de la anatomía celular y/o morfología de células que se obtienen de un organismo pluricelular. Las tinciones de histología generalmente incluyen al menos un colorante que tiñe uno o más tipos de células y/o componentes de uno o más tipos de células con un color contrastante. Las tinciones de histología también pueden incluir al menos una contra tinción que tiñe el resto de las células o el resto de la célula de un color diferente. Las técnicas histológicas, tinciones y métodos de tinción son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, aquellas descritas en Kierman. Métodos histológicos e histoquímicos: Teoría y práctica. Oxford: Butterworth/Heinemann, 1999 y Bancroft y Stevens. Teoría y práctica de las técnicas histológicas. Nueva York, NY.: Churchill Livingstone, 1996.
Las técnicas de tinción histológicas pueden ser específicas, teñir una o más células particulares de una manera específica, o no específica, teñir esencialmente todas las células o la mayoría de las células de la misma o similar manera. Las tinciones histológicas incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, tinciones de azul alcián, tinciones de azul de anilina, tinciones de Azan, tinciones de fucsina de ácido escarlata de Biebrich, tinciones de carbol-fucsina, tinciones de alumbre de cromo/hemotoxilina, tinciones de rojo congo, tinciones de cristal violeta, tinciones de rojo rápido, tinciones de hematoxilina y eosina (H&E), tinciones de hematoxilina de hierro, tinciones de azul de isamina/eosina, tinciones de Jenner, tinciones de hematoxilina de ácido fosfotúngstico de Mallory (PTAH), tinciones de tricrómico de Mallory, tinciones de Masson, tinciones de verde malaquita, tinciones de verde de metil pironina (MGP), tinciones de Nissl y azul de metileno, tinciones de Nissl, tinciones de aceite rojo O, tinciones de orceína, tinciones de ácido ósmico, tinciones de tetróxido de osmio, tinciones de Papanicolaou, tinciones de ácido Peryódico de Schiff(PAS), tinciones de reticulina, tinciones de Romanowsky, tinciones de safranina O, tinciones de plata, tinciones de negro de Sudán y de osmio, tinciones de azul de toluidina, tricrómico AB, tricrómico LG, tinciones de azul tripán, tinciones de van Gieson, tinciones de Verhoff, tinciones de resorcina-fucsina de Weigert y similares.
Los colorantes incluidos en las tinciones histológicas variarán en dependencia de la formulación de tinción y el resultado de tinción deseado. En algunos casos, los colorantes útiles en las tinciones histológicas pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, sal de calcio de fucsina ácida, fucsina ácida, azul alciano, rojo de alizarina, azul de anilina, sal de diamonio azul de anilina, colorante de auramina O, Azure, cloruro de Azure A, Azure B, Fucsina Básica, Marrón Bismarck Y, Azul Cresilo Brillante, Verde Brillante, Carmín, Rojo Congo, Acetato Violeta Cresilo, Violeta Cristal, Rojo Darrow, Eosina, Eosina B, Eosina Y, Sal disódica de Eosina Y, Eritrosina B, Eritrosina extra azulada, Etil eosina, Verde rápido FCF, Hematoxilina, Carmín índigo, Verde Janus B, Verde claro SF Amarillento, Sal oxalato de verde malaquita, Azul de metil, Verde de metil, Cloruro de zinc verde de metil, Naranja de metil, Violeta de metil 2B, Azul de metileno, Violeta de metileno (Bernthsen), rojo neutro, nigrosina, azul del Nilo A, aceite rojo O, naranja G, sal de sodio naranja II, orceína sintética, colorante de floxina B, pironina B, pironina G, pironina Y, sal de sodio de resazurina, sal de sodio de rosa de Bengala, Safranina O, Sudán Negro B, Sudán III, Sudán IV, sal de etato Thionin, toluidina, azul de toluidina O y similares.
En algunos casos, las tinciones histológicas evaluadas en los métodos en cuestión incluyen tinciones de Romanowsky. Las tinciones de Romanowsky son generalmente tinciones neutras compuestas por varios componentes que incluyen, pero no se limitan a los colorantes azul de metileno (por ejemplo, Azure B) y eosina (por ejemplo, Eosina Y). Los azures son colorantes básicos que se unen a los núcleos ácidos y dan como resultado un color de azul a púrpura. La eosina es un colorante ácido que es atraído por el citoplasma alcalino lo que produce una coloración roja. Las tinciones de Romanowsky varían e incluyen varias formulaciones, que incluyen aquellas que contienen varios análogos de Azure y eosina. Las tinciones de Romanowsky y sus mecanismos de tinción son bien conocidos y se describen en, por ejemplo, Horobin y Walter. Histoquímica (1987) 86:331-336; Marshall y otros J Clin Pathol (1978) 31(3):280-2; Marshall y otros J Clin Pathol. (1975) 28(11 ):920-3; J Clin Pathol (1975) 28(8):680-5.
Las tinciones de Romanowsky incluyen, pero no se limitan a la tinción de Giemsa, la tinción de Wright, la tinción de Wright Giemsa, la tinción de Jenner, la tinción de Jenner-Giemsa, la tinción de Leishman, la tinción de May Grunwald, la tinción de May Grunwals Giemsa y similares. Cada tinción de Romanowsky puede existir en varias formulaciones o como derivada de varias recetas diferentes o como suministrada de varios proveedores. Las formulaciones de tinción de Romanowsky pueden incluir varios componentes de tinción que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, azul de metileno, Azure A, Azure B, Azure C, azul de toluidina, tionina, violeta de metileno Bernthsen, metil tionolina, tionolina, eosina, eosina Y, tribromofluoresceína, fluoresceína, colorantes de tiazina y similares. Las formulaciones de tinción de Romanowsky pueden incluir varios solventes para disolver los componentes de la tinción que incluyen solventes acuosos y orgánicos que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, agua y alcoholes, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, metanol, etanol, alcohol isopropílico, etc.
Sin estar limitada por la teoría, se considera que las proporciones particulares de los componentes (incluidos los componentes de colorante, solventes, etc.) de las tinciones de Romanowsky, y las tinciones histológicas en general, influyen en la interacción de los componentes de tinción para producir la coloración particular de las células preparadas con cada tinción. El color que resulta de una formulación de tinción es el resultado de estas interacciones y, por lo tanto, es más complejo que el simple resultado aditivo de los componentes individuales. La presente descripción describe cómo se descubrió que estas complejas interacciones conducen a desplazamientos en los picos de absorbancia de los componentes individuales de las tinciones, lo que resulta en un perfil de pico que es específico para cada formulación de tinción. En consecuencia, incluso las tinciones muy similares, que incluyen, por ejemplo, aquellas que no pueden diferenciarse mediante el ojo humano y aquellas tinciones del mismo tipo, pero de diferentes fabricantes, pueden diferenciarse en base a los métodos espectroscópicos descritos.
En algunos casos, las tinciones histológicas a evaluarse o diferenciarse incluyen tinciones de Romanowsky que
incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, las de Wright Giemsa, May Grunwald y May Grunwald Giemsa. Las
tinciones histológicas evaluadas incluyen tinciones hematológicas, tinciones citológicas y similares. Las tinciones
histológicas de la presente descripción incluyen aquellas tinciones usadas en un analizador de histología que incluye,
por ejemplo, un analizador de histología automatizado, un analizador de citología automatizado, un analizador
hematológico automatizado, etc. Los analizadores de histología de la presente descripción incluyen pero no se limitan
a, por ejemplo, aquellos disponibles comercialmente de Abbott Laboratories y/o Abbott Diagnostics (que incluyen, por
ejemplo, los sistemas CELL-DYN y similares), de Sysmex (que incluyen, por ejemplo, el Sysmex DI60, CellaVision
DM1200 y los sistemas CellaVision DM9600 y similares), de MEDICA (que incluyen, por ejemplo, los sistemas
EasyCell, y similares), de Horiba (que incluyen, por ejemplo, los sistemas Pentra y Micros, y similares), de Siemens
(que incluyen, por ejemplo, los sistemas ADVIA y Kematek, y similares), de Beckman Coulter (que incluyen, por
ejemplo, los sistemas UniCel y similares), etc.
Las tinciones histológicas y los componentes de las mismas incluyen, aquellas disponibles comercialmente de dichos
proveedores que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, Sigma Aldrich, Thermo Fisher Scientific, Avantor
Proformance Materials, VWR International, Polysciences Inc. y similares.
Bibliotecas
La presente descripción incluye métodos para evaluar una tinción histológica mediante la medición el espectro de
absorbancia de la tinción histológica y comparar una o más características espectrales de la tinción histológica con
una biblioteca de características espectrales para un número de tinciones histológicas y/o formulaciones de tinción
histológica. Las bibliotecas descritas en la presente descripción pueden incluir cualquiera o todas las características
espectrales para cualquiera o todas las tinciones histológicas. En algunos casos, las bibliotecas descritas en la
presente descripción incluirán, pero no se limitan a, cualquiera o todas las características espectrales descritas en la
presente descripción para cualquiera o todas las tinciones histológicas descritas en la presente descripción o
formulaciones de las mismas.
Como mínimo, una biblioteca para evaluar una tinción histológica incluirá dos o más tinciones histológicas o
formulaciones de tinción y una o más características espectrales correspondientes de las dos o más tinciones
histológicas o formulaciones de tinción. El número de tinciones histológicas representadas en la biblioteca variará en
dependencia de, por ejemplo, el uso deseado de la biblioteca y/o del analizador de histología particular, y puede variar
de 1 a aproximadamente 50, que incluye pero no se limita a, por ejemplo, 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 27, 1 a 26, 1 a 25, 1 a 24, 1 a 23, 1 a 22, 1 a 21, 1 a 20, 1 a 19, 1 a 18, 1 a 17, 1 a 16, 1 a 15, 1 a 14, 1 a 13, 1 a 12,
1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, etc.
El número de formulaciones de tinción histológica para cada tinción histológica representada en la biblioteca variará
en dependencia de, por ejemplo, la tinción deseada y/o del analizador histológico particular, y puede variar de 1 a
aproximadamente 20, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, 1 a 20, 1 a 19, 1 a 18, 1 a 17, 1 a 16, 1 a 15, 1 a
14, 1 a 13, 1 a 12, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, etc.
El número de características espectrales diferentes para cada tinción histológica o cada formulación de tinción
representada en la biblioteca variará en dependencia de, por ejemplo, la tinción deseada, la formulación deseada y/o
el analizador de histología particular, y puede variar de 1 a aproximadamente 10 que incluye, pero no se limita a, por
ejemplo, 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, etc. En algunos casos, el número de características
espectrales diferentes para cada tinción histológica o cada formulación de tinción representada en la biblioteca será
de 10 o menos, que incluye, pero no se limita a 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos,
3 o menos, 2 o menos, o puede ser 1. En algunos casos, el número de características espectrales diferentes para
cada tinción histológica o cada formulación de tinción representada en la biblioteca será de 1 o más, que incluye, pero
no se limita a 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, etc. Cada
característica espectral diferente puede representarse por varios valores individuales en dependencia del número de
picos o del número de mediciones diferentes tomadas para cada pico.
En algunos casos, la biblioteca incluirá valores correspondientes a la posición de uno o más picos de una pluralidad
de tinciones histológicas o formulaciones de las mismas. En algunos casos, la biblioteca incluirá valores
correspondientes al ancho (que incluyen, por ejemplo, el ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima) de uno
o más picos de una pluralidad de tinciones histológicas o formulaciones de las mismas. En algunos casos, la biblioteca
incluirá valores correspondientes a la absorbancia máxima de uno o más picos de una pluralidad de tinciones
histológicas o formulaciones de las mismas. En algunos casos, la biblioteca incluirá valores correspondientes a las
características relativas del pico de una pluralidad de tinciones histológicas o formulaciones de las mismas. En algunos
casos, la biblioteca incluirá valores correspondientes a los desplazamientos espectrales de una pluralidad de tinciones
histológicas o formulaciones de las mismas. En algunos casos, la biblioteca incluirá una combinación de valores que
incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, una combinación de valores correspondientes a la posición de uno o más
picos, valores correspondientes al ancho de uno o más picos, valores correspondientes a la absorbancia máxima de
uno o más picos, valores correspondientes a las características relativas del pico, valores correspondientes a los
desplazamientos espectrales o subcombinaciones de los mismos.
En algunos casos, los valores de la biblioteca para la pluralidad de tinciones histológicas o formulaciones de las mismas serán valores del espectro total, lo que significa que los valores no están limitados por el intervalo del espectro e incluyen valores a lo largo de todo el espectro medible. En otros casos, los valores de la biblioteca para la pluralidad de tinciones histológicas o formulaciones de las mismas serán valores de intervalo del espectro, lo que significa que los valores están limitados a un intervalo espectral particular que incluye de aproximadamente 200 nm o menos a aproximadamente 800 nm o más, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 200 nm a 800 nm, 200 nm a 700 nm, 200 nm a 600 nm, 200 nm a 500 nm, 200 nm a 400 nm, 300 nm a 800 nm, 300 nm a 700 nm, 300 nm 600 nm, 300 nm a 500 nm, 300 nm a 400 nm, 400 nm a 800 nm, 400 nm a 700 nm, 400 nm a 600 nm, 400 nm a 500 nm, 500 nm a 800 nm, 500 nm a 700 nm, 500 nm a 600 nm, 500 nm a 550 nm, 600 nm a 800 nm, 600 nm a 700 nm, 600 nm a 670 nm, 640 nm a 700 nm, 640 nm a 670 nm y similares.
En algunos casos, la biblioteca es una biblioteca de características espectrales de tinciones de Romanowsky e incluye una o más características espectrales para una pluralidad de tinciones de Romanowsky que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, Wright Giemsa, May Grunwald y May Grunwald Giemsa.
En algunos casos, la biblioteca incluirá una o más características espectrales de referencia para Wright Giemsa que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un valor de referencia correspondiente a la posición de uno o más picos de Wright Giemsa, un valor de referencia correspondiente al ancho de uno o más picos de Wright Giemsa, un valor de referencia correspondiente al absorbancia máxima de uno o más picos de Wright Giemsa, un valor de referencia correspondiente a un desplazamiento espectral del pico de Wright Giemsa, etc. En algunos casos, la biblioteca incluirá la longitud de onda de referencia de absorbancia máxima esencialmente a 659 nm para Wright Giemsa y/o los picos de longitud de onda de referencia de uno o más componentes individuales de la tinción de Wright Giemsa.
En algunos casos, la biblioteca incluirá una o más características espectrales de referencia para May Grunwald, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un valor de referencia correspondiente a la posición de uno o más picos de May Grunwald, un valor de referencia correspondiente al ancho de uno o más picos de May Grunwald, un valor de referencia correspondiente al absorbancia máxima de uno o más picos de May Grunwald, un valor de referencia correspondiente a un desplazamiento espectral del pico de May Grunwald, etc. En algunos casos, la biblioteca incluirá la longitud de onda de referencia de absorbancia máxima esencialmente a 656 nm para May Grunwald y/o los picos de longitud de onda de referencia de uno o más componentes individuales de la tinción de May Grunwald.
En algunos casos, la biblioteca incluirá una o más características espectrales de referencia para May Grunwald Giemsa, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un valor de referencia correspondiente a la posición de uno o más picos de May Grunwald Giemsa, un valor de referencia correspondiente al ancho de uno o más picos de May Grunwald Giemsa, un valor de referencia correspondiente al absorbancia máxima de uno o más picos de May Grunwald Giemsa, un valor de referencia correspondiente a un desplazamiento espectral del pico de May Grunwald Giemsa, etc.
En algunos casos, la biblioteca incluirá características espectrales de referencia para Wright Giemsa, May Grunwald y May Grunwald Giemsa, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un valor de referencia correspondiente a la posición de uno o más picos para cada una de las tres tinciones, un valor de referencia correspondiente al ancho de uno o más picos para cada una de las tres tinciones, un valor de referencia correspondiente al absorbancia máxima de uno o más picos para cada una de las tres tinciones, un valor de referencia correspondiente a un desplazamiento espectral del pico para cada una de las tres tinciones, etc.
En algunos casos, una biblioteca incluirá valores de referencia correspondientes a formulaciones de tinción incorrectas. Por ejemplo, en algunos casos una biblioteca puede incluir formulaciones que se encuentran para que funcionen fuera de las especificaciones o formulaciones que se encuentran para producir resultados no deseados. Dichos valores de referencia para formulaciones de tinción incorrectos pueden servir, en algunos casos, para proporcionar límites o umbrales para evaluaciones particulares que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, evaluaciones de la calidad de las tinciones.
En algunos casos, una biblioteca incluirá valores de referencia correspondientes a tinciones "caducadas". Por "caducado" como se usa en la presente se entiende que se refiere a una tinción que en un momento siguiente a la formulación realizada funcionaba dentro de las especificaciones, pero en el momento de usar la tinción ya no funciona dentro de las especificaciones. Una tinción puede expirar con el paso del tiempo y/o a través del almacenamiento o la exposición a condiciones insuficientes para mantener el rendimiento de la tinción. Por ejemplo, en algunos casos, una biblioteca puede incluir tinciones que se han formulado y dejado que caduquen, o a través del paso de un tiempo suficiente o a través del almacenamiento inadecuado de la tinción u otra exposición de la tinción a condiciones, que incluyen las ambientales, suficientes para alterar las características de la tinción e impactar negativamente en el rendimiento de la tinción. Dichos valores de referencia para formulaciones de tinción caducadas pueden servir, en algunos casos, para proporcionar límites o umbrales para evaluaciones particulares que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, evaluaciones de la calidad de la tinción.
Como se describió con más detalle en la presente descripción, las bibliotecas de la presente descripción pueden utilizarse en comparaciones hechas con valores medidos para realizar evaluaciones de tinciones histológicas. Las bibliotecas pueden almacenarse digitalmente en un medio legible por ordenador no transitorio y puede accederse a ellas por circuitos y/o un dispositivo informático para realizar los métodos como se describió en la presente descripción. Evaluaciones
La presente descripción incluye evaluaciones de tinciones histológicas usadas en un analizador de histología hechas mediante el uso de métodos espectrofotométricos. Las evaluaciones descritas en la presente descripción se basan generalmente en la comparación de una o más características espectrales del espectro de absorbancia medido de una tinción histológica del sujeto con características espectrales de referencia contenidas en una biblioteca de tales características para una pluralidad de tinciones histológicas y/o formulaciones de tinción.
En algunos casos, la evaluación se usa para determinar la identidad de la tinción histológica del sujeto. Por ejemplo, puede obtenerse una tinción histológica del sujeto de identidad desconocida o supuesta y puede determinarse el espectro de absorbancia de la tinción por la medición de la tinción en un espectrofotómetro. A partir del espectro medido, pueden determinarse una o más características espectrales de la tinción y compararse con un valor de referencia para determinar la identidad de la tinción y/o confirmar la identidad de la tinción.
En algunos casos, la comparación incluye buscar una coincidencia exacta con una o más características espectrales y, cuando se encuentra una coincidencia exacta, se devuelve la identidad de la tinción o se confirma la supuesta identidad de la tinción. En otros casos, la comparación incluye buscar al menos una coincidencia cercana a una o más características espectrales y cuando se encuentra al menos una coincidencia cercana, se devuelve la identidad de la tinción o se confirma la supuesta identidad de la tinción. Por "coincidencia cercana" se entiende que la coincidencia de las características medidas con el valor de referencia está dentro de un intervalo predeterminado que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, dentro de un porcentaje predeterminado del valor de referencia (por ejemplo, ± 10 %, ± 9 %, ± 8 %, ± 7 %, ± 6 %, ± 5 %, ± 4 %, ± 3 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,9 %, ± 0,8 %, ± 0,7 %, ± 0,6 %, ± 0,5 %, ± 0,4 %, ± 0,3 %, ± 0,2 %, ± 0,1 %, etc.), dentro de una desviación estándar del valor de referencia o múltiplo o porción del mismo (por ejemplo, dentro de dos desviaciones estándar, dentro de una desviación estándar, con 0,5 desviaciones estándar, etc.), dentro del error estándar de la media, dentro de un intervalo de confianza (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza (CI) del 99 %, dentro del CI del 98 %, dentro del CI del 97 %, dentro del CI del 96 %, dentro del CI del95 %, dentro del CI del 94 %, dentro del CI del 93 %, dentro del CI del 92 %, dentro del CI del 91 %, dentro del CI del 90 %, dentro del CI del 85 %, dentro del CI del 80 %, dentro del CI del 75 %, etc.), dentro de un número específico de unidades del valor de referencia (por ejemplo, dentro de ± 1 nm de una longitud de onda de referencia, dentro de ± 2 nm de una longitud de onda de referencia, dentro de ± 3 nm de una longitud de onda de referencia, dentro de ± 4 nm de una longitud de onda de referencia, dentro de ± 5 nm de una longitud de onda de referencia, etc.), y similares.
En algunos casos, la evaluación puede incluir la comparación de dos o más características espectrales diferentes y una coincidencia puede basarse en al menos dos de las características espectrales diferentes que sean una coincidencia exacta con los valores de referencia correspondientes. En algunos casos, la evaluación puede incluir la comparación de dos o más características espectrales diferentes y una coincidencia puede basarse en al menos dos de las características espectrales diferentes que sean al menos coincidencias cercanas con los valores de referencia correspondientes.
En algunos casos, la evaluación se usa para determinar la identidad de una tinción de Romanowsky. Por ejemplo, puede obtenerse una tinción de Romanowsky del sujeto, de identidad desconocida o supuesta y puede determinarse el espectro de absorbancia de la tinción por la medición de la tinción en un espectrofotómetro. A partir del espectro medido, pueden determinarse una o más características espectrales de la tinción y compararse con un valor de referencia para determinar la identidad de la tinción de Romanowsky y/o confirmar la identidad de la tinción de Romanowsky. En algunos casos, la evaluación determina si la tinción es Wright Giemsa. En algunos casos, la evaluación determina si la tinción es May Grunwald. En algunos casos, la evaluación determina si la tinción es May Grunwald Giemsa.
En algunos casos, la evaluación de la identidad de la tinción histológica del sujeto incluye identificar una formulación particular de la tinción histológica. El término "composición" y "formulación" como se usa en la presente para referirse a composiciones y formulaciones de tinción histológica se usan indistintamente y generalmente para referirse a los componentes combinados de una tinción histológica particular y sus cantidades específicas relacionadas entre sí. Por ejemplo, dos tinciones del mismo tipo, por ejemplo, dos tinciones de Romanowsky o dos machas de Giemsa, aunque del mismo tipo, pueden tener diferentes composiciones o formulaciones. Pueden prepararse formulaciones diferentes a propósito, por ejemplo, a partir de recetas diferentes o por la inclusión/exclusión de un aditivo, o pueden prepararse accidentalmente, por ejemplo, por la inclusión inadvertida de una cantidad inadecuada de un componente particular o la inclusión/exclusión inadvertida de un colorante inadecuado u otro agente. Las diferentes formulaciones pueden deberse a varios factores que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, formulaciones diferentes preparadas por diferentes fabricantes, formulaciones diferentes preparadas por un solo fabricante, preparación de una formulación que está fuera de la especificación, procesamiento inadecuado durante el proceso de formulación (que incluye, por ejemplo, dilución inadecuada, filtración inadecuada, calentamiento inadecuado, etc.), etc.
En algunos casos, una formulación inadecuada puede haber sido en algún momento una formulación adecuada y puede haber "caducado" para convertirse en una formulación inadecuada a través de otros medios que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la contaminación, la evaporación, etc. Como tal, en algunos casos, una evaluación para determinar si una tinción está formulada inadecuadamente también puede evaluar si la tinción ha caducado o se ha convertido en una formulación inadecuada o una formulación que se espera que funcione fuera de las especificaciones.
En algunos casos, puede realizarse una evaluación como se describió en la presente descripción para determinar la calidad de la tinción. Por ejemplo, en algunos casos puede evaluarse una tinción de identidad conocida o identidad supuesta para determinar si la tinción es de la calidad suficiente o deseada. En algunos casos, puede obtenerse una tinción de identidad conocida o identidad supuesta y puede determinarse el espectro de absorbancia de la tinción mediante la medición de la tinción en un espectrofotómetro. A partir del espectro medido, pueden determinarse una o más características espectrales de la tinción y compararse con un valor de referencia para determinar la calidad de la tinción y/o confirmar la calidad de la tinción.
En algunos casos, la determinación de la calidad de la tinción incluye comparar la tinción con uno o más umbrales o intervalos de calidad de referencia de una característica espectral particular. Los umbrales de calidad de referencia y los intervalos de características espectrales pueden determinarse por cualquier método conveniente. Por ejemplo, en algunos casos, los umbrales o intervalos de calidad de referencia se determinan al preparar una pluralidad de diferentes formulaciones de tinción y probar las formulaciones para las características deseadas o no deseadas, e identificar qué formulaciones tienen las características deseadas o no deseadas, y determinar las características espectrales para las formulaciones y correlacionar la presencia o ausencia de las características deseadas o no deseadas con las características espectrales de las formulaciones.
Dichas características deseadas o no deseadas variarán, pudiendo incluir, pero no se limitan a, las características de rendimiento de la formulación en un ensayo histológico. Las características de rendimiento de la formulación pueden determinarse en un ensayo histológico automático o manual. En algunos casos, el ensayo histológico es un ensayo hematológico que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, un recuento sanguíneo, un cribado hematológico de muestras conocidas, etc. En algunos casos, las características de rendimiento deseadas de un ensayo histológico o hematológico incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la coloración celular deseada, la identificación celular correcta/incorrecta, la clasificación celular correcta/incorrecta, la evaluación de la tinción por expertos, la puntuación de la tinción por expertos, etc. En algunos casos, las características de rendimiento se evalúan para todos los tipos de células de la muestra. En algunos casos, las características de rendimiento se evalúan para tipos de células específicas de la muestra, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, leucocitos, basófilos, eosinófilos, linfocitos, monocitos, neutrófilos, plaquetas, glóbulos rojos, etc. En algunos casos, las características de rendimiento de la formulación se evalúan en un ensayo histológico que requiere que un experto humano evalúe las características de rendimiento. En algunos casos, las características de rendimiento de la formulación se evalúan en un ensayo histológico realizado, por ejemplo, mediante el uso de un analizador de histología que realiza un análisis por ordenador.
En algunos casos, un ensayo que no requiera un experto humano puede considerarse un ensayo imparcial para evaluar las características de rendimiento de la formulación.
La característica espectral medida puede compararse con uno o más umbrales o intervalos de calidad de referencia por una variedad de medios que incluyen comparar la característica medida con el umbral o intervalo y si la característica medida está por encima o más abajo del umbral como se desee o dentro del intervalo, entonces la calidad de la tinción se devuelve como adecuada. En algunos casos, el intervalo de calidad puede determinarse como valores por encima y más abajo de un valor objetivo (por ejemplo, un valor objetivo determinado a partir del análisis espectral de una formulación de tinción objetiva). Por ejemplo, un intervalo de calidad puede estar dentro de un porcentaje predeterminado del valor objetivo (por ejemplo, ± 10 %, ± 9 %, ± 8 %, ± 7 %, ± 6 %, ± 5 %, ± 4 %, ± 3 %,
± 2 %, ± 1%, ± 0,9 %, ± 0,8 %, ± 0,7 %, ± 0,6 %, ± 0,5 %, ± 0,4 %, ± 0,3 %, ± 0,2 %, ± 0,1 %, etc.), dentro de una desviación estándar del valor objetivo o múltiplo o porción del mismo (por ejemplo, dentro de dos desviaciones estándar, dentro de una desviación estándar, con 0,5 desviaciones estándar, etc.), dentro del error estándar de la media, dentro de un intervalo de confianza (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza (CI) del 99 %, dentro del CI del 98 %, dentro del CI del 97 %, dentro del CI del 96 %, dentro del CI del 95 %, dentro del CI del 94 %, dentro del CI del 93 %, dentro del CI del 92 %, dentro del CI del 91 %, dentro del CI del 90 %, dentro del CI del 85 %, dentro del CI del 80 %, dentro del CI del 75 %, etc.), dentro de un número específico de unidades del valor objetivo (por ejemplo, dentro de ± 1 nm de una longitud de onda objetivo, dentro de ± 2 nm de una longitud de onda objetivo, dentro de
± 3 nm de una longitud de onda objetivo, dentro de ± 4 nm de una longitud de onda objetivo, dentro de ± 5 nm de una longitud de onda objetivo, etc.), y similares.
Como tal, en algunos casos la calidad de la tinción se evalúa en base a la diferencia de la tinción del sujeto de una tinción de referencia y cuando la tinción del sujeto está fuera de un intervalo de referencia, la tinción del sujeto se considera de calidad adecuada. La calidad adecuada de una formulación de tinción puede evaluarse en base a la presencia o ausencia de características deseadas o no deseadas y/o características de desempeño medidas como se describió anteriormente.
En algunos casos, un umbral de calidad puede determinarse como un valor en o por encima de un valor objetivo donde el valor objetivo se determina al evaluar el rendimiento y las características espectrales para una pluralidad de tinciones o formulaciones de tinción y aquellas formulaciones que tienen un desempeño adecuado son aquellas que miden en o por encima del valor espectral objetivo.
En algunos casos, un umbral de calidad puede determinarse como un valor en o más abajo de un valor objetivo donde el valor objetivo se determina al evaluar el rendimiento y las características espectrales para una pluralidad de tinciones o formulaciones de tinción y aquellas formulaciones que tienen un desempeño adecuado son aquellas que miden en o más abajo del valor espectral objetivo.
En algunos casos, la calidad de una tinción histológica puede evaluarse de acuerdo con un programa de tiempo predeterminado, por ejemplo, para identificar cuándo caduca una tinción, para predecir cuándo una tinción funcionará adecuadamente, para predecir cuándo una tinción puede funcionar fuera de las especificaciones, para predecir cuándo una tinción puede producir una o más características de desempeño no deseadas, etc. La frecuencia óptima para evaluar la calidad de la tinción variará y dependerá de la tinción y/o formulación en particular, las condiciones de almacenamiento de la tinción, etc. En algunos casos, la calidad de la tinción se evalúa al menos anualmente, lo que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, al menos trimestralmente, al menos semestralmente, al menos mensualmente, al menos bimensualmente, al menos semanalmente, al menos quincenalmente, al menos cada dos días, al menos diariamente, etc.
En algunos casos, una evaluación, que incluye la identidad, la calidad u otras evaluaciones, se realiza bajo demanda, por ejemplo, como lo especificado por un usuario. En otros casos, se realiza una evaluación antes de usar el analizador de histología dentro del cual se usa la tinción, que incluye pero no se limita a, por ejemplo, al iniciar el analizador de histología, antes de ejecutar una muestra en el analizador de histología, después de ejecutar un número predeterminado de muestras (que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, después de ejecutar 5 muestras, después de ejecutar 10 muestras, después de ejecutar 20 muestras, después de ejecutar 50 muestras, después de ejecutar 100 muestras, después de ejecutar 500 muestras, después de ejecutar 1000 muestras, etc.) en el analizador de histología, etc.
Dispositivos y sistemas
Fuera del alcance de la invención reivindicada, la presente descripción incluye dispositivos y sistemas espectrofotométricos para realizar los métodos y para evaluar las tinciones histológicas usadas en un analizador de histología como se describió en la presente descripción.
Los dispositivos y sistemas que se configuran para realizar los métodos descritos en la presente descripción generalmente incluirán al menos un espectrofotómetro, una biblioteca de características espectrales de referencia para varias tinciones histológicas o formulaciones de las mismas, y circuitos de procesamiento espectral. Los componentes pueden ensamblarse en un solo dispositivo o pueden ensamblarse como un sistema de componentes separados entre dos o más dispositivos. En algunos casos, un dispositivo, un sistema o componentes del mismo pueden ser externos pero cercanos (es decir, unidos a la carcasa externa de o en la misma superficie de trabajo o dentro de la misma habitación o edificio, etc.) del analizador de histología que usa la tinción evaluada. En otros casos, un dispositivo, un sistema o componentes del mismo pueden colocarse internamente (es decir, dentro de, dentro o alojado dentro de) del analizador de histología que usa la tinción evaluada.
Cualquier espectrofotómetro conveniente como se describió anteriormente, puede resultar útil en un dispositivo, y/o sistema para hacer mediciones espectrofotométricas de acuerdo con los métodos como se describió en la presente descripción, siempre que el espectrofotómetro sea adecuado para medir la absorbancia en un intervalo de espectro dentro del cual existen características espectrofotométricas discriminatorias de la tinción del sujeto. Tales espectrofotómetros y componentes de los mismos son bien conocidos. Los espectrofotómetros adecuados y componentes de los mismos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, aquellos descritos en la presente descripción.
En algunos casos, un sistema de la presente descripción puede incluir un analizador de absorbancia o colectivamente un analizador de absorbancia y un analizador de histología, donde un analizador de absorbancia incluye al menos un espectrofotómetro y un medio para almacenar los espectros medidos producidos mediante el espectrofotómetro. En algunos casos, un analizador de absorbancia también puede incluir una biblioteca de características espectrales de referencia para una pluralidad de tinciones histológicas y/o formulaciones de tinción. En algunos casos, un analizador de absorbancia también puede incluir circuitos de procesamiento de espectros para realizar una o más de las características espectrales de identificación a partir de los espectros medidos y/o comparar las características espectrales medidas con las características espectrales de referencia. En algunos casos, un analizador de absorbancia también puede incluir uno o más medios de almacenamiento extraíbles legibles por ordenador para almacenar espectros medidos, características espectrales y/o el resultado de cualquier análisis y/o comparaciones.
En algunos casos, los dispositivos y/o sistemas de la presente descripción incluyen una biblioteca para evaluar una tinción histológica, como se describió anteriormente, que incluye, por ejemplo, al menos dos o más tinciones histológicas o formulaciones de tinción y una o más características espectrales correspondientes de las dos o más tinciones histológicas o formulaciones de tinción. En muchos casos, la biblioteca incluirá una pluralidad de características espectrales de referencia para varias tinciones histológicas y/o formulaciones de tinción. La biblioteca puede almacenarse en el dispositivo o sistema, por ejemplo, almacenarse electrónicamente en un medio legible por ordenador no transitorio u otra memoria de ordenador. En algunos casos, la biblioteca puede ser extraíble y/o actualizable de manera que puedan agregarse características espectrales para nuevas tinciones o formulaciones al reemplazar la biblioteca y/o actualizar la biblioteca.
En algunos casos, los componentes de los sistemas como se describió en la presente descripción pueden conectarse por una conexión de datos alámbrica. Cualquier conexión de datos alámbrica adecuada y apropiada puede resultar útil para conectar los componentes de los sistemas de evaluación de tinciones histológicas, por ejemplo, como se describió en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, cables disponibles comercialmente, como un cable USB, un cable coaxial, un cable en serie, un cable C2G o Cat2, un cable Cat5/Cat5e/Cat6/Cat6a, un cable Token Ring (Cat4), un cable VGA, un cable HDMI, un cable RCA, un cable de fibra óptica y similares. En algunos casos, por ejemplo, donde la seguridad de los datos es menos preocupante, pueden emplearse conexiones de datos inalámbricas que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, conexiones de radiofrecuencia (por ejemplo, redes inalámbricas PAN/LAN/MAN/WAN, conexiones de radio UHF, etc.), una conexión de transmisión de datos por infrarrojos, conexiones de datos ópticas inalámbricas y similares.
En algunos casos, los dispositivos y/o sistemas de la presente descripción incluyen circuitos de procesamiento de espectros. Dichos circuitos de procesamiento de espectros pueden programarse y/o contener instrucciones para realizar una o más tareas relacionadas con el procesamiento de los espectros medidos recibidos del espectrofotómetro. Por ejemplo, en algunos casos, los circuitos de procesamiento de espectros se programan para identificar una o más características espectrales, descritas anteriormente, a partir de un espectro medido recibido del espectrofotómetro. En algunos casos, los circuitos de procesamiento de espectros se programan para hacer una comparación entre una característica espectral medida y una característica espectral de referencia, por ejemplo, como almacenar en una biblioteca, para hacer una evaluación de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción.
En algunos casos, los circuitos de procesamiento de espectros pueden programarse para, después de la comparación, determinar además la identidad o la calidad de la tinción histológica del sujeto. En los casos en donde se evalúa la identidad de la tinción, tales determinaciones requieren que los circuitos de procesamiento de espectros asocien el resultado de la comparación con una biblioteca de características espectrales para varias tinciones y/o formulaciones de tinción con el fin de identificar una coincidencia (por ejemplo, una coincidencia exacta, una coincidencia cercana, una mejor coincidencia, etc.). En los casos donde se evalúa la calidad de la tinción, tales determinaciones requieren que los circuitos de procesamiento de espectros asocien el resultado de la comparación con uno o más umbrales o intervalos de calidad de características espectrales para la identidad de la tinción supuesta o conocida con el fin de determinar si la tinción del sujeto está dentro de un intervalo de calidad o por encima o más abajo de un umbral de calidad.
En algunos casos, los circuitos de procesamiento de espectros pueden programarse para incorporar en una comparación o evaluación un criterio proporcionado por el usuario. Por ejemplo, en algunos casos, la entrada de un usuario puede proporcionar la identidad supuesta de la tinción del sujeto o una calidad supuesta de la tinción del sujeto y los circuitos de procesamiento de espectros pueden programarse para evaluar si los datos proporcionados por el usuario coinciden o se correlacionan con el resultado de la evaluación. En algunos casos, los circuitos de procesamiento de espectros se configuran o se programan para comparar la identidad supuesta de la tinción histológica con la identidad evaluada de la tinción histológica y la salida de un resultado en cuanto a si la identidad supuesta y la identidad evaluada de la tinción histológica coinciden. En algunos casos, los circuitos de procesamiento de espectros se configuran o se programan para comparar la calidad supuesta de la tinción histológica con la calidad evaluada de la tinción histológica y la salida de un resultado en cuanto a si la calidad de la tinción histológica es suficiente para usarla en un ensayo histológico. En algunos casos, se supone automáticamente que la tinción es de calidad suficiente para realizar un ensayo histológico a menos que se indique de cualquier otra manera mediante un resultado de los circuitos de procesamiento de espectros.
En algunos casos, los circuitos de procesamiento de espectros son capaces de la activación de funciones adicionales del dispositivo o sistema. Por ejemplo, en algunos casos, el resultado de una evaluación procesada por los circuitos de procesamiento de espectros resulta en la activación de un sistema de señalización, por ejemplo, para indicar a un usuario el resultado de la evaluación (por ejemplo, indicar la identidad de la tinción, indicar la calidad de la tinción, etc.). Dichas indicaciones pueden mostrarse en una interfaz del usuario o pueden informarse por un sistema de señalización que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, una alarma, una luz indicadora, etc. En otros casos, el resultado de una evaluación procesada por los circuitos de procesamiento de espectros resulta en la activación de mediciones espectrales adicionales de la muestra. En algunos casos, el resultado de una evaluación procesada por los circuitos de procesamiento de espectros resulta en la activación de la expulsión de la tinción del sujeto o la terminación de un ensayo histológico solicitado mediante el uso de la tinción del sujeto, por ejemplo, donde se determina que la tinción del sujeto no es de la identidad supuesta o de suficiente calidad.
En algunos casos, los dispositivos y sistemas como se describió en la presente descripción incluyen además un sistema de señales donde el sistema de señales puede configurarse para informar el resultado de una evaluación.
Tales sistemas de señales variarán en dependencia de la configuración particular del dispositivo y/o sistema y pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, una alarma, una luz indicadora, una pantalla (por ejemplo, un monitor del ordenador, una interfaz del usuario gráfica (GUI), etc.), una impresora configurada para imprimir, por ejemplo, en medios tangibles (que incluyen, por ejemplo, papel o cinta), y similares. En algunos casos, el sistema de señales indica, por ejemplo, sonidos, luces o muestra de cualquier otra manera, a un usuario cuando la identidad supuesta y la identidad evaluada de la tinción histológica no coinciden. En algunos casos, el sistema de señales indica, por ejemplo, sonidos, luces, o muestra de cualquier otra manera, a un usuario cuando la calidad de la tinción evaluada está por encima o más abajo de un umbral de calidad o dentro de o fuera de un intervalo de calidad.
En algunos casos, los circuitos de procesamiento de espectros son capaces de la activación de funciones adicionales del dispositivo o sistema que no dependen del resultado de la evaluación. Por ejemplo, en algunos casos, los circuitos de procesamiento de espectros se configuran para activar el dispositivo o sistema para realizar evaluaciones de una tinción histológica de acuerdo con un programa de tiempo predeterminado. En algunos casos, las evaluaciones activadas de acuerdo con un calendario predeterminado son evaluaciones regulares de la calidad de la tinción.
Los circuitos de procesamiento de espectros se configuran o programan específicamente para realizar las funciones de acuerdo con los métodos como se describió en la presente descripción, que incluyen las funciones de mediciones espectrales y las tareas de análisis, y puede incluir al menos una unidad de procesamiento de datos para realizar funciones relacionadas con los datos.
Por "unidad de procesamiento de datos", como se usa en la presente, se entiende cualquier combinación de hardware y/o software que realizará las funciones que se requieren de ella. Por ejemplo, cualquier unidad de procesamiento de datos en la presente descripción puede ser un microprocesador digital programable tal como el disponible en forma de controlador electrónico, ordenador central, servidor u ordenador personal (de escritorio o portátil). Donde la unidad de procesamiento de datos es programable, la programación adecuada puede comunicarse desde una ubicación remota a la unidad de procesamiento de datos, o guardada previamente en un producto de programa informático (como un medio de almacenamiento legible por ordenador portátil o fijo, ya sea basado en un dispositivo magnético, óptico o de estado sólido).
Sustancialmente, cualquier circuito puede configurarse para un arreglo funcional dentro de los dispositivos y sistemas para realizar los métodos descritos en la presente descripción. La arquitectura de hardware de tales circuitos, incluye, por ejemplo, un ordenador configurada específicamente, bien conocida por un experto en la técnica, y puede comprender componentes de hardware que incluyen uno o más procesadores (CPU), una memoria de acceso aleatorio (RAM), una memoria de solo lectura (ROM), un medio de almacenamiento de datos interno o externo (por ejemplo, unidad de disco duro). Tales circuitos también pueden comprender una o más tarjetas gráficas para procesar y enviar información gráfica a los medios de visualización. Los componentes anteriores pueden interconectarse adecuadamente a través de un bus dentro de los circuitos, por ejemplo, dentro de un ordenador de uso específico. Los circuitos pueden comprender además interfaces adecuadas para comunicarse con componentes externos de propósito general, tal como un monitor, teclado, mouse, red, etc. Los circuitos pueden ser capaces de procesar en paralelo o pueden ser parte de una red configurada para la computación paralela o distributiva para aumentar la potencia de procesamiento de los presentes métodos y programas. El código de programa leído desde el medio de almacenamiento puede escribirse en una memoria proporcionada en una placa extendida que se inserta en los circuitos, o en una unidad extendida que se conecta a los circuitos, y una CPU o similar proporcionada en la placa extendida o en la unidad extendida puede realmente realizar una parte o todas las operaciones de acuerdo con las instrucciones de la programación, con el fin de realizar las funciones descritas.
Los dispositivos y sistemas de la presente descripción pueden incluir además una "memoria" que sea capaz de almacenar información de manera que sea accesible y recuperable en una fecha posterior por un ordenador. Puede elegirse cualquier estructura de almacenamiento de datos conveniente, en base a los medios usados para acceder a la información almacenada. La información puede almacenarse en una "memoria permanente" (es decir, memoria que no se borra por la terminación del suministro eléctrico a un ordenador o procesador) o "memoria no permanente". El disco duro del ordenador, el CD-ROM, el disquete, la unidad flash portátil y el DVD son todos ejemplos de memoria permanente. La memoria de acceso aleatorio (RAM) es un ejemplo de memoria no permanente. Un archivo en la memoria permanente puede editarse y reescribirse.
Además de los componentes de los dispositivos y sistemas de la presente descripción, por ejemplo, como se describió anteriormente, los sistemas de la descripción pueden incluir un número de componentes adicionales, tales como dispositivos de salida de datos, por ejemplo, monitores y/o altavoces, dispositivos de entrada de datos, por ejemplo, puertos de interfaz, teclados, etc., componentes de manejo de fluidos, fuentes de energía, etc.
Medio legible por ordenador
Fuera del alcance de la invención reivindicada, la presente descripción incluye un medio legible por ordenador, que incluye un medio legible por ordenador no transitorio, que almacena instrucciones para métodos espectrofotométricos para evaluar tinciones histológicas usadas en un analizador de histología. La presente descripción incluye un medio legible por ordenador que almacena instrucciones que, cuando se ejecutan por un dispositivo informático, hacen que el dispositivo informático mida las características espectrofotométricas de una tinción histológica del sujeto mediante el uso de un espectrofotómetro para identificar una o más características que son específicas de una tinción y/o formulación de tinción particular y hacer una evaluación de la tinción o formulación.
En algunos casos, un medio legible por ordenador de la presente descripción almacena instrucciones que hacen que un dispositivo informático realice una o más de las etapas de evaluación de una tinción histológica del sujeto de acuerdo con los métodos como se describió en la presente descripción. Por ejemplo, en algunos casos, un medio legible por ordenador de la presente descripción almacena instrucciones que hacen que un dispositivo informático haga una comparación de las características espectrales medidas y las características espectrales almacenadas en una biblioteca. En algunos casos, un medio legible por ordenador de la presente descripción almacena instrucciones que hacen que un dispositivo informático haga una determinación, por ejemplo, de la identidad de la tinción o de la calidad de la tinción, en base a la comparación de las características espectrales medidas y las características espectrales almacenadas en una biblioteca.
En algunos casos, un medio legible por ordenador de la presente descripción almacena una biblioteca de características espectrales de referencia, por ejemplo, como se describió en la presente descripción, de varias tinciones histológicas y/o varias formulaciones de tinciones histológicas para usar en la realización de los métodos como se describió en la presente descripción. Tal medio legible por ordenador puede ser o no un componente de un dispositivo o sistema más grande, por ejemplo, como se describió en la presente descripción. Dicho medio legible por ordenador puede ser o no extraíble de un dispositivo o sistema más grande, por ejemplo, como se describió en la presente descripción. En algunos casos, la biblioteca puede ser específica para una categoría particular de tinciones histológicas, por ejemplo, un medio legible por ordenador puede almacenar una biblioteca de características espectrales de referencia específicamente para tinciones de Romanowsky, que incluyen, por ejemplo, cualquiera o todas las características espectrales de referencia descritas en la presente descripción para las tinciones de Romanowsky. En algunos casos, el medio legible por ordenador de la presente descripción almacena una biblioteca de características espectrales de referencia que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, características espectrales de referencia para May Grunwald, Wright Giemsa o May Grunwald Giemsa o sus combinaciones.
En algunos casos, un medio legible por ordenador de la presente descripción almacena al menos ambas instrucciones que hacen que un dispositivo informático realice una o más de las etapas de evaluación de una tinción histológica del sujeto de acuerdo con los métodos como se describió en la presente descripción y una biblioteca de características espectrales de referencia. En algunos casos, un medio legible por ordenador que almacena ambas instrucciones que hacen que un dispositivo informático realice uno o más de las etapas para evaluar una tinción histológica del sujeto de acuerdo con los métodos como se describió en la presente descripción y una biblioteca de características espectrales de referencia es específica para las tinciones de Romanowsky e incluye características espectrales de referencia para May Grunwald, Wright Giemsa o May Grunwald Giemsa o sus combinaciones.
En ciertos casos, las instrucciones de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción pueden codificarse en un medio legible por ordenador en forma de "programación", donde el término "medio legible por ordenador" como se usa en la presente se refiere a cualquier medio de almacenamiento o transmisión que participe en proporcionar instrucciones y/o datos a un ordenador para su ejecución y/o procesamiento. Ejemplos de medios de almacenamiento incluyen un disquete, disco duro, disco óptico, disco magneto-óptico, CD-ROM, CD-R, cinta magnética, tarjeta de memoria no volátil, ROM, DVD-ROM, disco Blue-ray, disco de estado sólido, y almacenamiento conectado en red (NAS), ya sea que dichos dispositivos sean internos o externos al ordenador. Un archivo que contiene información puede "almacenarse" en un medio legible por ordenador, donde "almacenar" significa grabar la información de manera que sea accesible y recuperable en una fecha posterior por un ordenador.
El método implementado por ordenador descrito en la presente descripción puede ejecutarse mediante el uso de la programación que puede escribirse en uno o más de cualquier número de lenguajes de programación informáticos. Tales lenguajes incluyen, por ejemplo, Java (Sun Microsystems, Inc., Santa Clara, California), Visual Basic (Microsoft Corp., Redmond, Washington) y C++ (AT&T Corp., Bedminster, Nueva Jersey), así como también muchos otros.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no por medio de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de la muestra de tinción
Las tinciones de Romanowsky, que incluyen las tinciones de Wright Giemsa (WG) y May Grunwald (MG), se prepararon para incluir composiciones de tinción que estaban dentro de las especificaciones e intencionalmente fuera de las especificaciones. Específicamente, se prepararon tinciones que estaban más abajo de la especificación, dentro de la especificación, pero más abajo del objetivo, en el objetivo, dentro de la especificación, pero por encima del objetivo y por encima de la especificación. Las mediciones de absorbancia máxima a aproximadamente 655 nm para las tinciones objetivo y fuera del objetivo preparadas como diluciones 1:200 en agua desionizada (DI) se proporcionan en la Tabla 1 (Figura 1).
Ejemplo 2 : Determinación de límites inferiores de absorbancia
La absorbancia inicial de las tinciones WG y MG preparadas diferentemente se determinaron a 655 nm y 517 nm y se proporcionan en las Tablas 2 y 3, respectivamente.
Tabla 2.
Figure imgf000022_0002
Tabla 3.
Figure imgf000022_0001
Las mediciones de absorbancia de las tinciones se realizaron de acuerdo con el siguiente procedimiento mediante el uso de diluciones 1:200 de cada tinción en agua DI:
1. Mediante el uso de una pipeta, se colocó una alícuota de 250 pl de la muestra de tinción en un matraz aforado de 50 ml.
2. El matraz aforado se llenó hasta la marca de 50 ml mediante el uso de agua DI para llegar a una dilución de tinción 1:200.
3. Se tapó el matraz aforado y se mezcló mediante la inversión del matraz 3-4 veces.
4. Las etapas 1-3 se repitieron dos veces más, para generar un total de 3 réplicas de muestras diluidas independientes para cada muestra de tinción.
5. Se realizaron escaneos de OD (200-800 nm) en todas las diluciones 1:200 preparadas de acuerdo con el siguiente procedimiento:
5.1. La línea base de absorbancia se registró en el instrumento mediante el uso de una cubeta (de cuarzo) rellenada con 3 ml de agua DI (solvente).
5.2. Se ejecutó un escaneo de OD en la alícuota de la tinción y se registró la absorbancia máxima para los 2 picos más altos (típicamente ~650 nm y ~525 nm).
5.3. Se repitieron las etapas 5.1 y 5.2 para las 2 réplicas adicionales de muestras diluidas independientes.
5.4. Los archivos de absorbancia del espectrofotómetro se almacenaron en un archivo informático.
Para comparar la coloración de las células entre las diferentes muestras de tinción WG con diferentes valores de absorbancia y diferentes concentraciones de colorante, se proporcionan imágenes de ejemplo (Figura 2). Para comparar la coloración de las células entre las diferentes muestras de tinción MG con diferentes valores de absorbancia y diferentes concentraciones de colorante, se proporcionan además imágenes de ejemplo (Figura 3).
Ejemplo 3: Discriminación espectral de diferentes tinciones de Romanowsky
Las tinciones de Wright Giemsa y May Grunwald se discriminaron mediante el uso de mediciones de absorción espectral. Se midió el espectro de absorción para una tinción en la región espectral de 200-800 nm con una etapa de 1,0 nm. Se identificó una posición exacta del pico en el intervalo espectral de 650-665 nm con una precisión de ± 1,0 nm. Para las formulaciones de tinción particulares y las mediciones de absorbancia usadas en este ejemplo, cuando la posición del pico de absorción se ubicó en A = 659 nm ± 1 nm, la tinción se reconoció como Wright Giemsa, mientras que cuando la posición del pico se ubicó en A = 655 nm ± 1 nm, la tinción se identificó como May Grunwald (ver Figuras 4A-4B).
Para aumentar la precisión de las mediciones y la confiabilidad de la conclusión, la medición de los espectros de absorción puede repetirse para varias concentraciones de las muestras originales para monitorear las posiciones espectrales de los picos a medida que los valores de absorción o aumentan o disminuyen. Como se observa, las longitudes de onda de identificación de los picos permanecen constantes (ver Figuras 5A-5B y Figuras 6A-6B).
Ambas tinciones la WG y la MG son mezclas de compuestos iniciales similares, que sin embargo tienen pequeñas pero medibles diferencias en los espectros de absorción debido a formulaciones ligeramente diferentes de esos compuestos. La tinción de Wright Giemsa es clásicamente una mezcla de colorantes Azure, eosina y azul de metileno, mientras que May Grunwald se compone de colorantes de eosina y azul de metileno. Los diferentes tipos de Azure tienen picos de absorción que varían en el intervalo de A ~ 647-659 nm mientras que los picos de absorción de eosina se encuentran en la región A ~ 515-530 nm. Una formulación útil de Wright Giemsa usada en hematología e instrumentos de hematología automatizados tiene dos picos de absorción ubicados respectivamente a 517 nm ± 1 nm y 659 nm ± 1 nm, mientras que una formulación útil de May Grunwald usada en hematología e instrumentos de hematología automatizados tiene picos posicionados a 517 nm ± 1 nm y 655 nm ± 1 nm. Por lo tanto, el desplazamiento espectral de AA = 3 nm del pico rojo proporciona un medio para discriminar estos dos tipos de tinciones.
Las Figuras 4A-4B: Los espectros de absorción de tinciones de Wright Giemsa y May Grunwald que tienen formulaciones y concentraciones específicas (Figura 4A) que muestra un desplazamiento espectral distinto del pico rojo mediante Aa = 3 nm entre las dos tinciones (Figura 4B). Los espectros de absorción de estas tinciones preparadas a varias concentraciones de sus formulaciones específicas demuestran que los valores de absorbancia disminuyen de los picos mientras que el desplazamiento espectral del pico rojo AA = 3 nm permanece constante.
Las Figuras 5A-5B: Los espectros de absorción de las tinciones de Wright Giemsa (Figura 5A) y May Grunwald (Figura 5B) preparadas a diferentes concentraciones de sus formulaciones específicas demuestran que las posiciones de los picos de absorción en el área de lectura son únicas para cada tipo de tinción y son independientes de la concentración.
Las Figuras 6A-6B: La comparación entre los espectros de absorción de tinciones de Wright Giemsa and May Grunwald preparadas a diferentes concentraciones de sus formulaciones específicas (Figuras 6A-6B). Los espectros de absorción de estas tinciones demuestran varios valores de absorbancia de los picos, mientras que un desplazamiento espectral del pico rojo AA = 3 nm permanece constante a lo largo de varias concentraciones de tinción (Figura 6B).
Los espectros de absorción de las tinciones de Wright Giemsa y May Grunwald de diferentes fabricantes (es decir, proveedores) se preparan en formulaciones ligeramente diferentes. Estas formulaciones diferentes tienen distintas posiciones espectrales de picos de absorbancia. Por ejemplo, como se demuestra en las Figuras 7A y 7B las posiciones espectrales de los picos de absorbancia en la región espectral roja pueden usarse para diferenciar las tinciones de dos fabricantes diferentes (es decir, "Proveedor A" y "Proveedor B"). El desplazamiento espectral del pico rojo (A A) entre los picos de las tinciones de los diferentes proveedores pueden usarse para identificar positivamente la tinción específica (A = 655 nm ± A A).
La Figura 8: los espectros extendidos que cubren de 200 nm a 800 nm demuestran además los perfiles de absorbancia únicos de las tinciones individuales. Pueden usarse picos únicos en el intervalo de UV para discriminar una tinción de otra.
Los espectros de absorbancia para MG, MGG y WG en la región espectral de 200 nm a 800 nm (Figura 8) demuestran las tres bandas de absorción principales, posicionadas en ~ 293 nm (azul de metileno), ~520 nm (eosina), ~ 664 nm (azul de metileno) y hombro a ~ 610 nm (azul de metileno) característico de las formulaciones de tinción. Los desplazamientos espectrales de las posiciones de los picos con respecto a las principales bandas de absorbancia de los colorantes puros, así como también la amplitud de los picos y sus correspondientes relaciones son características únicas de las formulaciones de tinción específicas.
Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, es fácilmente evidente para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para evaluar una tinción histológica, el método que comprende:
a) medir en un espectrofotómetro un espectro de absorbancia de la tinción histológica en un intervalo predefinido;
b) identificar una o más longitudes de onda de absorbancia máxima del espectro medido;
c) comparar la una o más longitudes de onda identificadas de absorbancia máxima con una biblioteca que comprende longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima para una pluralidad de tinciones histológicas; y
d) determinar la identidad de la tinción histológica en base a la comparación.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además generar un informe de la evaluación.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el informe comprende información específica de la tinción seleccionada del grupo que consiste en: la identidad de la tinción histológica, una o más longitudes de onda de absorbancia máxima, una o más mediciones de absorbancia en el intervalo predefinido o una porción del mismo, y sus combinaciones.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el intervalo predefinido es o está dentro de:
a) 200 nm a 800 nm;
b) 500 nm a 700 nm;
c) 600 nm a 700 nm;
d) 640 nm a 670 nm; o
e) 500 nm a 550 nm.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende medir en el espectrofotómetro el espectro de absorbancia de la tinción histológica en dos o más intervalos predefinidos.
6. El método de la reivindicación 5, en donde los dos o más intervalos predefinidos comprenden un primer intervalo predefinido que es o está dentro de 500 nm a 700 nm y un segundo intervalo predefinido que es o está dentro de 200 nm a 400 nm.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además diluir la tinción histológica antes de medir el espectro de absorbancia con un solvente y la dilución y el solvente corresponden específicamente a las longitudes de onda de referencia de absorbancia máxima para la pluralidad de tinciones histológicas.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la tinción histológica es una formulación de dos o más tinciones y la identificación comprende además identificar un valor de desplazamiento espectral con relación a un componente de la formulación del espectro medido, la biblioteca comprende además una pluralidad de valores de desplazamiento espectral para una pluralidad de tinciones histológicas que son formulaciones de dos o más tinciones y la comparación comprende además comparar el valor de desplazamiento espectral con la biblioteca.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la identificación comprende además identificar un valor del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima del espectro medido, la biblioteca comprende además una pluralidad de valores del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima para una pluralidad de tinciones histológicas y la comparación comprende además comparar el valor del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima con la biblioteca.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la pluralidad de tinciones histológicas comprende tinciones de Romanowsky.
11. El método de la reivindicación 8, en donde la biblioteca comprende una pluralidad de valores de desplazamiento espectral para una pluralidad de composiciones de tinción de May Grunwald en donde los valores de desplazamiento espectral se miden a partir de la longitud de onda de referencia de absorbancia máxima de 656 nm para May Grunwald.
12. El método de la reivindicación 9, en donde la biblioteca comprende una pluralidad de valores del ancho del pico a la mitad de la absorbancia máxima para una pluralidad de composiciones de tinción de May Grunwald.
13. El método de la reivindicación 8, en donde la biblioteca comprende una pluralidad de valores de desplazamiento espectral para una pluralidad de composiciones de tinción de Wright Giemsa en donde los valores de desplazamiento espectral se miden a partir de la longitud de onda de referencia de absorbancia máxima de 659 nm para Wright Giemsa.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112763435A (zh) * 2021-04-01 2021-05-07 爱沐风优(西安)生物科技有限公司 一种肺炎链球菌致死性定量评估方法
CN114067315B (zh) * 2021-10-23 2022-11-29 广州市艾贝泰生物科技有限公司 细胞计数方法、装置、计算机设备和存储介质

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2932529B2 (ja) 1989-09-30 1999-08-09 株式会社島津製作所 分光光度計
US5859700A (en) * 1995-11-22 1999-01-12 Kairos Scientific, Inc. High resolution imaging microscope (HIRIM) and uses thereof
US6165734A (en) * 1995-12-12 2000-12-26 Applied Spectral Imaging Ltd. In-situ method of analyzing cells
US6294331B1 (en) * 1997-08-08 2001-09-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for assessing genetic and phenotypic markers by simultaneous multicolor visualization of chromogenic dyes using brightfield microscopy and spectral imaging
EP1297320B1 (en) 2000-06-27 2008-02-27 Alberta Research Council Multiple pathlength spectrophotometer
US7932095B2 (en) 2000-10-18 2011-04-26 Herpst Robert D Sample holding substrate for use with an infrared spectrophotometer or filtometer and methods of manufacture and use thereof
WO2002093134A1 (en) * 2001-05-15 2002-11-21 Seroptix, Inc. Method for determining the presence of infection in an individual
US7468161B2 (en) * 2002-04-15 2008-12-23 Ventana Medical Systems, Inc. Automated high volume slide processing system
US20080070324A1 (en) * 2002-07-15 2008-03-20 Floyd Alton D Quantity control device for microscope slide staining assays
CN100525701C (zh) * 2002-12-12 2009-08-12 奥林巴斯株式会社 成像装置
US8185317B2 (en) * 2003-06-12 2012-05-22 Cytyc Corporation Method and system of determining the stain quality of slides using scatter plot distribution
WO2005030999A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc Methods to detect lineage-specific cells
JP4269997B2 (ja) 2004-03-26 2009-05-27 株式会社島津製作所 分光光度計
US7262844B2 (en) 2005-01-13 2007-08-28 The Curators Of The University Of Missouri Ultrasensitive spectrophotometer
WO2007080583A2 (en) * 2006-01-10 2007-07-19 Applied Spectral Imaging Ltd. Methods and systems for analyzing biological samples
US8049884B2 (en) 2006-10-06 2011-11-01 Shimadzu Corporation Spectrophotometer
US7799570B2 (en) * 2007-03-29 2010-09-21 Uchicago Argonne, Llc Methods for validating the presence of and characterizing proteins deposited onto an array
JP4536754B2 (ja) 2007-06-28 2010-09-01 株式会社日立ハイテクノロジーズ 分光光度計及び液体クロマトグラフィ
US8115922B2 (en) 2008-02-29 2012-02-14 Starna Cells, Inc. Apparatus and method for adapting conventional cuvettes for use in a vertical light beam spectrophotometer
US8199999B2 (en) * 2008-06-17 2012-06-12 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Image classifier training
EP2344861B1 (en) 2008-10-03 2017-11-22 NanoDrop Technologies LLC Dual sample mode spectrophotometer
US8502969B2 (en) 2009-12-16 2013-08-06 Boule Medical Ab Miniature flow-through cuvette and spectrophotometer containing the same
US8638433B1 (en) 2011-09-15 2014-01-28 John R. Amend Visual spectrophotometer
BR112015001592B1 (pt) * 2012-07-25 2022-07-26 Labrador Diagnostics Llc Método para analisar uma amostra
WO2014089478A1 (en) * 2012-12-07 2014-06-12 University Of Tennessee Research Foundation Methods of numerical analysis for platelet disorders and computer-readable media and systems for performing the same
US10964001B2 (en) * 2013-01-10 2021-03-30 Akoya Biosciences, Inc. Multispectral imaging systems and methods
CA2900842C (en) * 2013-03-12 2020-01-21 Ventana Medical Systems, Inc. Digitally enhanced microscopy for multiplexed histology
CN109142195B (zh) * 2013-03-15 2021-10-01 艾瑞思国际股份有限公司 用于体液样品中的粒子分析的自聚焦***和方法
US9526480B2 (en) * 2013-11-27 2016-12-27 Elwha Llc Devices and methods for profiling microbiota of skin
CN104198458B (zh) * 2014-09-26 2017-02-22 哈尔滨工业大学 一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像***及其成像方法

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