JP2015535431A - 核酸の標準化された配列決定のための方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
[0001] この出願は2012年11月26日に出願された米国仮出願一連番号61/729,853、2012年11月27日に出願された米国仮出願一連番号61/730,463、および2013年3月14日に出願された米国仮出願一連番号61/784,394の利益を主張し、その全開示は参照により明確に本明細書に援用される。
[0002] 本発明は国立衛生研究所により与えられた助成金番号CA138397およびHL108016の下での米国政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
[0017] PCRに基づくNGSライブラリーの調製における非系統的誤差に関して対照するための方法であって、対象の天然核酸鋳型と同一のプライミング部位を、そのPCR反応におけるその天然標的の速度論を模倣し、そうしてPCR効率における標的特異的変動に関して対照するために共有することを含む方法も本明細書において記載される。
前記の第1核酸に関する競合鋳型および前記の第1核酸を含む多くの試料中に存在する第2核酸に関する競合鋳型を含む一連の系列希釈した標準化された混合物を提供し、
ここで前記の競合鋳型は互いと比較して既知の濃度であり;前記の第1核酸を含む前記の試料の1つを前記の系列希釈した標準化された混合物の1番目と組み合わせ;
前記の第1核酸および前記の第1核酸に関する前記の競合鋳型を同時増幅してその増幅産物を生成し;第1の関係を得て、
前記の第1の関係は前記の第1核酸の前記の増幅産物を前記の第1核酸に関する前記の競合鋳型の前記の増幅産物に対して比較し;前記の第1の関係が約1:10〜約10:1の範囲内であるかどうかを決定し;
そうではない場合、前記の組み合わせ、同時増幅、取得および決定工程を前記の系列希釈した標準化された混合物の2番目を用いて繰り返し;
前記の第2核酸および前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型を同時増幅してその増幅産物を生成し;
第2の関係を得て、前記の第2の関係は前記の第2核酸の前記の増幅産物を前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型の前記の増幅産物に対して比較し;そして
前記の第1および前記の第2の関係を比較する。
前記の第1の関係が約1:100〜約100:1、または約1:1000〜約1000:1、または約1:10,000〜約10,000:1の範囲内であるかどうかを決定し、
そうではない場合、前記の組み合わせ、同時増幅、取得および決定工程を前記の系列希釈した標準化された混合物の2番目を用いて繰り返し;
前記の第2核酸および前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型を同時増幅してその増幅産物を生成し;第2の関係を得て;
前記の第2の関係は前記の第2核酸の前記の増幅産物を前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型の前記の増幅産物に対して比較し;そして
前記の第1および前記の第2の関係を比較する。
[0055] 試料中の核酸の量を評価するための方法が本明細書において記載される。一部の態様において、その方法は、例えば核酸が標本中で低い量で発現されている場合に、少量の核酸が完全なままである場合に、および/または少量の標本が提供される場合に、少量の核酸の測定を可能にする。
[0067] 方法の一般的記載
[0068] 配列決定ライブラリーの調製は、以下の工程のいくつかの組み合わせまたは全部を含む:1)核酸の断片化;2)隣接する核酸アダプター配列を結合させる役目を果たすインビボクローニング;3)インビトロアダプターライゲーション;4)PCRに基づくアダプター付加;ならびに5)ポリメラーゼによる埋め(fill−in)および環状化によりその配列を捕捉するためのプローブのライゲーションを含み、または含まず、プローブ配列内に含有されたアダプターを用いる、単分子反転プローブ型技術。
[0081] また、特定の態様において、内部標準のさらなる添加は天然標的存在量の収束を可能にし、そうして倍の比率(fold−proportion)の天然標的存在量が互いに向かって正規化されることにより直接配列決定の費用が低減される。
[00101] NGSライブラリー調製およびその後の核酸存在量の測定に関する競合IACを用いた多重PCR
[00102] FDAに出資された配列決定品質管理(SEQC)計画において用いられた(既に様々な条件下で多重qPCR、マイクロアレイおよびNGSプラットフォームにより測定された核酸存在量を有する)参照物質RNA用量設定プールを得た。
[00104] そのNGSライブラリー調製を、個々の試験サイト内での、実験室間での、および異なる核酸測定プラットフォームにわたる核酸存在量測定の再現性に関して競合IACを用いた多重PCRを用いて評価した。
[00107] ヒトゲノム中の150種類の独特に転写される遺伝子のそれぞれに関する101塩基対領域(すなわちアンプリコン)に対応する順方向および逆方向プライマーを設計した。それぞれのプライマーは一様な68℃の融解温度を有するように設計された。それぞれのプライマーは、マルチテンプレートPCRに関して用いることができる、例えば最初の多重PCR後にバーコードおよび配列決定アダプター配列の付加において用いることができるユニバーサルテール配列も含有していた。これらのプライマーはIntegrated DNA Technologies(IDT)により合成され、それを等モル比で組み合わせ、希釈して50ナノモル濃度のそれぞれのプライマーの最終作動濃度にした。それぞれ101塩基長の150種類の競合内部増幅対照(IAC)の対応する混合物がIntegrated DNA Technologies(IDT)により合成された。その競合IACのそれぞれはそれらのそれぞれの天然核酸鋳型標的に対する同一の標的特異的プライミング部位を含有していた。配列決定後のデータ分析の間に競合IACをその対応する天然標的と区別することができるように、これらの同一の順方向および逆方向プライミング部位の内側にその配列の内部部位において6ヌクレオチドの置換があった。
[00123] 内部標準混合物を用いたPCRに駆動されるライブラリー調製後の定量的配列決定は分析性能を向上させており、費用を低減する。
[00129] 入力としての系列用量設定された競合IAC混合物と混合されたgDNAを用いて、106の桁にわたる線形ダイナミックレンジを平均R2=0.995(0.993−0.997;95%CI)で観察した。試料Cに関する予想値対観察値の相関係数はR2=0.96であり、試料Dに関する予想値対観察値の相関係数はR2=0.94であり、ROC曲線により決定された3倍の変化を検出する正確性は97%(95〜99%;95%CI)であった。わずか400,000の配列決定の読みに基づく測定のサイト間の相関係数は、天然標的間の存在量の約105の桁の線形ダイナミックレンジにわたってR2=0.92であった。
[00136] 図12(結果2)は同じライブラリー調製の複製の配列決定(サイト内)を示し、ここでX軸=180万の配列決定の読みであり、Y軸=300万の配列決定の読みである。
[00143] 標準化されたRNA配列決定(STARSEQ)
[00144] 標準化されたRNA配列決定(STARSEQ)を、2つの別個の参照物質を用いて評価した:1)トレド大学医療センター(UTMC)の施設内治験審査委員会により承認されたプロトコルに従うUTMCにおける表現型が正常な人の血液に由来するゲノムDNA(gDNA)(匿名化された723の試料)、および2)FDAに出資された配列決定品質管理(SEQC)計画(以前のMAQCコンソーシアム)により提供された4種類の参照RNA試料(A、B、CおよびD)。試料AはStratageneから得られたユニバーサルヒト参照RNAからなる。試料BはAmbionから得られたヒト脳参照RNAからなる。SEQC計画に関して、次いで試料AおよびBをそれぞれAmbion外部RNA対照コンソーシアム(ERCC)スパイクイン(Spike−In)対照RNA混合物1および2と、総RNA濃度に基づいて試料AおよびB中で2%の終濃度を達成するように組み合わせた。
[00147] それぞれ10マイクログラムの1μg/μLの濃度の試料A〜D参照RNA物質をFDAに出資されたSEQC計画から得た(fda.gov/科学研究/生物情報学ツール/マイクロアレイ品質管理計画)。それぞれの試料に関して2μg分割量のRNAを逆転写した。それぞれの逆転写反応はSuperscript III逆転写(Life Technologies)およびオリゴ(dT)プライミングに関する製造業者のプロトコルを用いて90μL体積で行われた。逆転写後、それぞれの試料に関する2つの90μLのcDNA生成物を組み合わせて単一の180μL体積にした(逆転写1;RT1)。試料Aに関して、2つの2μg分割量のRNAの追加のセットを別個のマスターミックスを用いて逆転写した(逆転写2;RT2)。
[00149] マイクロアレイ品質管理(MAQC)コンソーシアムは以前に多重qPCRおよびマイクロアレイプラットフォームの性能を評価するために1,297遺伝子のリストを選択した。このリストから、STARSEQアッセイを開発するために150種類の内在性標的を選択した。これらの150のアッセイは、部分的にはそれらが表す遺伝子標的が106より大きいダイナミックレンジにわたって発現しているために選択された。これらの試薬を用いて、gDNAおよび逆転写された参照RNA試料A〜D中のそれぞれの遺伝子標的の絶対的ならびに相対的な比率を測定した。加えて、92種類の外部RNA対照コンソーシアム(ERCC)標的の内の28種類もSTARSEQアッセイを開発するために選択した。
[00151] 順方向および逆方向PCRプライマーを、ヒトゲノム中の150種類の独特に転写される遺伝子および28種類のERCC標的のそれぞれに関する対応する101bpのアンプリコン領域に対して設計した。それぞれの順方向および逆方向プライマーのセットは、Primer3ソフトウェア(Untergasser et al, NAR, 2012)を用いて一様な68℃の融解温度を有するように設計された。標的以外へのプライミングを最小限にするため、プライマー対の特異性をGenomeTester 1.3を用いて検証し、大きさが1000bp未満のあらゆる追加のアンプリコンを同定した。それぞれのプライマーはヒトゲノム中に存在しないユニバーサルテール配列も含有し、それはマルチテンプレートPCRでのバーコードおよびプラットフォーム特異的配列決定アダプターの追加のために用いることができる。順方向ユニバーサルテールは整列されたプライマー伸長(arrayed primer extension)のために用いられるアダプター(APEX−2)と配列が同じであり、一方で逆方向テール配列は最後の4つの3’塩基を除いて順方向テール配列と同じであり、それは配列決定の間に方向性を可能にする。150種類の内在性標的および28種類のERCC標的に関するユニバーサルテールを有する標的特異的プライマーは、それぞれIntegrated DNA Technologies(IDT)およびLife technologiesにより合成された。内在性またはERCC標的に関するプライマープールを、合成されたプライマーを当モル比で組み合わせ、希釈トリス−EDTA緩衝液中でそれぞれのプライマーに関して50nMの最終作動濃度に希釈することにより作製した。
[00153] それぞれの101bpの競合内部標準(IS)を、それらのそれぞれの天然核酸標的と同一の標的特異的プライミング部位を保持するように設計した(図18A〜18B)。配列決定後のデータ分析の間に競合ISをその対応する天然標的と区別することができるように、これらの同一のプライミング部位の内側に6ヌクレオチドの置換がある。内在性標的に対応する150種類の競合ISはIntegrated DNA Technologies(IDT)により合成され、ERCC標的に対応する28種類の競合ISはLife technologiesにより合成された。
[00157] それぞれの多重競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に関して、以下のものを含有する10μLの反応体積を調製した:1μLの天然鋳型、1μLの様々な入力濃度における競合IS混合物、1μLの対応するプライマー混合物、1μLの2mM dNTP、1μLの10×Idaho Technology反応緩衝液(30mM MgCl2を含む)、0.1μLのPromega GoTaqホットスタートTaqポリメラーゼ(5u/μL)および4.9μLのRNAアーゼを含まない水(図18A)。ゲノムDNAを150種類の内在性標的に相当する競合IS混合物の系列希釈した混合物を含有する10個の別個の多重PCR反応中にスパイクした。これらの10個の希釈は、2×106〜103コピーの存在量の装填の範囲のIS混合物の一連の3倍希釈に相当する。RT1に関する試料A〜DのcDNAを、28種類のERCC標的に相当する競合IS混合物の系列希釈した混合物を含有する5つの別個の多重PCR反応中にスパイクした。これらの5つの希釈は、IS混合物の一連の希釈に相当する:106、105、104、103および300コピーの装填。試料A(RT1およびRT2)、B、CおよびDに関する逆転写されたRNAを、150種類の内在性標的に相当する競合IS混合物の系列希釈した混合物を含有する12個の別個の多重PCR反応中にスパイクした。これらの12個の希釈は、6×107〜3.4×102コピーの存在量の装填の範囲のIS混合物の一連の3倍希釈に相当する。合計17μLのそれぞれのcDNA試料が多重競合PCRの間に消費され、これはそれぞれの試料に関して約377ngのRNAに対応する。
[00159] 図18A NT=天然標的(例えばcDNA、gDNA等);IS=内部標準、a)プライマー配列において特定の天然標的に相同であり、従ってその天然標的と増幅に関して競合するが、b)そのプライマー部位に対して内側に1個以上の塩基置換を含有し、従ってその天然標的と識別することができる、ssDNAまたはdsDNA分子。それぞれの遺伝子に関するIS鋳型は、内部標準混合物中の他の遺伝子に関するISに対して固定された関係にある。
[00162] 多重PCRのレベルを増大させることは、用いるプライマーの濃度における釣り合った減少を必要とする。プライマー濃度を減少させることは、多重PCRにおいて2つの主な作用を有する:1)プライマーダイマー産物の形成を低減し、そして2)プラトーなアンプリコン産物形成が早期にdNTPが限られた試薬になるのを防ぐ(プライマーがより少ない方法)。この後者の作用は、それが全ての標的鋳型がプラトー相に達することを可能にし、競合ISの存在下でシグナル圧縮なしで高存在量標的の過剰標本抽出/配列決定を大幅に低減するため、重要である(図19A〜19C、図20A〜20B)。
[00164] 図19Aは、仮定のcDNA試料内の2種類の天然標的(NT)を示す。1つの天然標的は高存在量、108コピーであり(“豊富な”NT)、一方で別の天然標的は低存在量、102コピーであり(“稀な”NT)、これは標的間の存在量における100万倍の差を表す。この仮定のcDNA試料を、105コピーにおける固定された濃度の関係を有する内部標準(IS)の混合物と組み合わせる。
[00169] 図20Aは、ERCC(n=104)および内在性(n=400)cDNA標的に関する実際の比例した配列決定データを示す。X軸は最低存在量の標的(100に設定された)に対して標準化されたライブラリー調製におけるそれぞれの標的の比例した存在量を表す。Y軸は最低存在量の標的を少なくとも1回配列決定するために必要とされる比例した配列決定の読み(カバー度(coverage))の単位における。
[00174] 図21Aは試料A、B、CおよびDにおけるERCC標的の存在量の測定されたシグナルを示す。点はNTおよびISの両方に関して少なくとも15の配列決定の読みを有するそれらのライブラリー調製からのERCC測定値の中央値を表す。X軸の単位は、ERCCスパイクイン対照の既知の濃度に関するAmbion製品文献、SEQCプロジェクトの物質調製プロトコル、およびそれぞれの標的に関する仮定された100%の逆転写収率に由来する。
[00180] ライブラリー調製あたりのコピー数の単位での試料A中のcDNA標的の絶対シグナル存在量を、別々の日、異なるサイト(OU=オハイオ大学;UTMC=トレド大学医療センター)において、そして異なる逆転写調製(RT1およびRT2)の間で測定した。点はNTおよびISの両方に関して少なくとも15の配列決定の読みを有するそれらのライブラリー調製からのERCC測定値の中央値を表す。図22Aは日の間の作用を示す(n=88)。図22Bは日の間およびサイト間の作用を示す(n=81)。図22Cは日の間およびライブラリー間の作用を示す(n=92)。図22Dは、日の間、サイト間およびライブラリー間の作用を示す(n=80)。図22E〜22Fは、試料CおよびDが試料AおよびBからの総RNAのそれぞれ3:1および1:3混合物に相当することを示している。これらの比率を用いてAおよびBの測定値から試料CおよびDに関する予想される測定値を計算し(x軸)、試料C(n=86)およびD(n=90)の実際の測定値(y軸)に対してプロットした。
[00182] STARSEQおよびTaqMan qPCR(図24はTaqManおよびSTARSEQ測定の間の差のプロットを示す)またはIllumina RNA配列決定(図25はIllumina RNA配列決定およびSTARSEQ測定の間の差のプロットを示す)の間の試料AおよびBの測定値に関する差の平均をそれぞれの内在性標的に関して決定した。この差をTaqMan qPCRまたはIllumina RNA配列決定の試料CおよびDに関する測定値から減算し、CおよびDのSTARSEQ測定値(y軸)に対してプロットした(x軸)。
[00185] 図26において示されるように、アッセイ測定性能をERCCならびに内在性cDNA標的に関するSEQC試料A、B、CおよびDにおいて評価した。内在性標的はgDNA対照に対しても評価した(図18B参照)。
[00189] 融合プライマーのセットを、それらの3’末端が多重競合PCRの間に付加されたユニバーサルAPEX−2配列テールに相補的であるように設計した。これらの融合プライマーは、4ヌクレオチドのインデックス/バーコード配列およびそれに対して5’側に順方向または逆方向ion torrentアンプリコン配列決定アダプターのテールを有する(図26)。順方向および逆方向配列決定プライマーの両方が、それぞれの試料に二重に指標を付け、配列の読みに誤った指標を付ける可能性を低減するために意図的にバーコード付加されている;両方のバーコードは一致していなければならない。それぞれのバーコード付加反応に関して、以下のものを含有する10μLの反応体積を調製した:1μLの多重競合PCR産物、1μLの1μM順方向および逆方向バーコード付加プライマー、1μLの2mM dNTP、1μLの10×Idaho Technology反応緩衝液(30mM MgCl2を含む)、0.1μLのPromega GoTaqホットスタートTaqポリメラーゼ(5u/μL)ならびに4.9μLのRNAアーゼを含まない水。それぞれのバーコード化反応に対してair thermocycler(RapidCycler(Idaho Technology,Inc.アイダホ州アイダホフォールズ))中で以下の条件下でサイクルを行った:95℃/3分間(Taq活性化);94℃/5秒間(変性)、58℃/10秒間(アニーリング)、および72℃/15秒間(伸長)を15サイクル。反応容器をすぐに取り出し、すべてのその後の工程の間4℃で保つ。この工程の間の目標は、バーコード付加された産物のヘテロ2量体化を防ぐことである。ヘテロ2量体化のタイプに応じて、配列決定後の整列のエラーが偽の配列決定の塩基の判定(calls)から生じる可能性があり、結果として測定の精度および正確性が低下する。次いで新しくバーコード付加された多重競合PCR配列決定ライブラリーをAgilent 2100 Bioanalyzer上でDNAチップをDNA 1000キットの試薬と共に製造業者のプロトコルに従って用いて定量化する(Agilent Technologies Deutschland GmbH、ヴァルトブロン、ドイツ)。次いで独特にバーコード付加された配列決定ライブラリーを、それぞれのライブラリーが最終的に受け入れるであろう配列決定の読みの百分率を最適化するように既知の化学量論比で混合し;ほとんどの場合1:1が用いられる。
[00191] 26のSTARSEQ測定結果は、測定未満(less than measurement)の報告を戻す(report back)ために十分なデータを有していた。その26の測定の内で、TaqManは14に関して未検出(ND)を報告し、RNA配列決定は1に関してNDを報告した(図27参照)。STARSEQはISを検出することができたが、存在するNTを正確に定量化することはできなかったため、これらはTaqManおよびRNA検出に関する偽陰性の検出を表す。測定未満は[1/(ISの配列決定の計数)]×そのライブラリー調製中に装填されたISの濃度として計算された。
[00193] 図28は、差のSDが図21中に存在するデータから計算されることを示す。アッセイ内試料内SDは、それぞれの試料A〜D内のアッセイ内SDの中央値から計算される。アッセイ内試料間SDは、試料A〜Dにわたるアッセイ内SDの中央値から計算される。アッセイ間試料間SDは、試料A〜Dにわたる残差(residuals)のアッセイ間SDの中央値から計算される。そのSDはLog10値で報告されるため、それは変動係数(CV)の報告とおおよそ同等である。
[00195] 特定の態様において、バーコード付加された配列決定ライブラリーの精製の間にシステムが強い変性剤またはカオトロピック塩類、例えば塩酸グアニジンまたはチオシアン酸グアニジンを用いないことが必要である。これらの薬剤は結果として下流の鋳型のヘテロ2量体化、偽の配列決定の塩基の判定および配列決定後のアラインメントのエラーをもたらす。この理由のため、それぞれのバーコード付加された配列決定ライブラリーの混合物をLife Technologies E−Gel SizeSelect 2%アガロースゲルを用いて精製し、それは変性剤またはカオトロピック塩類の使用を報告しておらず、電気泳動による分離の間の熱変性を防ぐために冷蔵室中で運転することができる。次いで精製された配列決定ライブラリーをIon Torrent配列決定プラットフォームのためのKAPAライブラリー定量化キット(Kapa Biosystems)を用いて定量化した。この定量化に基づいて、ライブラリーを適切に希釈し、トレド大学医療センター(UTMC)、オハイオ州トレドおよびオハイオ大学(OU)、オハイオ州アセンズにおいて製造業者の推奨に従ってIon Torrent PGM配列決定サービスのために調製した。
[00197] NGSサービスからの生の配列決定データはFASTQ形式で提供されて戻された。配列決定の読みを抽出し、それぞれの配列決定の読みを3つの別個のFASTQファイルに解析する(parsed):1)順方向(query-barcode.fastq)および2)逆方向バーコード(query-revbarcode.fastq)領域、ならびに3)標的特異的プライミング部位に対して内側の領域に対応するアンプリコンの中央部分(query-subject.fastq)、ここで6ヌクレオチド置換がNTおよび対応する競合ISの間に存在するはずである。
[00199] その3つのFASTQファイルのそれぞれを、それがバーコード(barcode.fa)であるか、またはアンプリコン領域(subject.fa)であるかに対応する既知の参照FASTAデータベースと、BLAT様の速い正確な検索ツール(BFAST、バージョン0.7.0a)を用いてアラインメントし、配列アラインメント/マップ(SAM)形式でファイルを出力した。インデックスデータベースに対するBFASTのマッチおよびSAMファイルの出力を、1)順方向バーコード、2)逆方向バーコードおよび3)捕捉したアンプリコン対象配列を含有するトリミングしたFASTQファイルに関して実施した。
[00201] 次いで配列の読みのIDをマッチングのための鍵として用いて1)順方向および2)逆方向バーコード、ならびに3)アンプリコン領域からの3つのSAMファイルのそれぞれを合わせて実用的な抽出および報告言語(PERL)ハッシュテーブルにした(http://www.perl.org/)。バーコードおよびアンプリコンのアラインメントに基づいて、それぞれの配列決定の読みをビンして(binned)、所与の試料調製に関するIS入力濃度およびそれがBFASTアラインメントによりNTと判定されるかまたはISと判定されるかに対応するアレイにした。順方向および逆方向バーコードアラインメントの判定が一致しなかった場合、その配列の読みはビンされなかった。結果として得られたビンされた配列決定の読みのハッシュテーブルはカンマで区切られた形式で出力され、統計的方法の節で概説するように処理された。
[00203] 少なくとも14の配列決定の読みがNTおよびISのそれぞれに関して必要とされた。正確な希釈倍率は、多数のアッセイ標的にわたる、そして多数の系列希釈された内部標準のスパイクインにわたるNT:IS比の変化に基づいて決定された。次いで内部標準の希釈度にNT:IS比を掛けた。それぞれのアッセイは、内部標準の多数の希釈度のため、アッセイあたり多数の測定値を有していた。これらの測定値のSTDEVが分散において10倍未満である場合、これらの測定値の中央値を受け入れた。正確な測定値は内部標準濃度の予め決められたアッセイの系統的偏りに基づいていた。これらの測定値の母集団を母集団の中央値に対して標準化した。
[00205] それぞれの天然標的(gDNAまたはcDNA)を、ISMの交差用量設定した濃度内のそのそれぞれの内部標準と比較して測定した(図18)。それぞれ天然標的(NT)およびそれぞれの競合内部標準(IS)に関する少なくとも15の配列決定の読みの実験による閾値は、NT:IS比を有効であると考えるための最適な包含/排除基準であった(検出力>80%;第1種過誤率<0.05;2倍のNT:IS比の変化を検出すること)(図18)。上記の基準を満たす1つより多い測定値を有するそれらのアッセイに関して、測定値間の1000%より大きい変動係数(CV)は、その特定の試料におけるそのアッセイ測定値に関する排除のきっかけとなった。
[00207] それぞれの遺伝子標的および下付きのiで示したそれぞれのIS混合物の入力濃度を有する技術的複製に関して、天然標的の濃度の推定値(NCi)を天然標的(NTi)および内部標準(ISi)の両方の観察された/ビンされた配列計数、ならびに内部標準の(ライブラリー調製あたりの鋳型コピー数の単位での)既知の出発濃度(SCi)に基づいて計算した。
[00210] 適用の限定的でない例
[00211] 一部の態様において、生物学的状態を示す数値的指標を得るための方法は、第1の生物学的状態および第2の生物学的状態のそれぞれに対応する2つの試料を提供すること;その2つの試料のそれぞれにおける2種類の核酸のそれぞれの量を測定する、および/または数えること;その量をいくつかの試料間で直接比較することができる数値として提供すること;その第1および第2の生物学的状態のそれぞれに対応する数値を数学的に計算すること;ならびにその2つの生物学的状態を識別する数学的計算を決定することを含む。本明細書で用いられるような第1および第2の生物学的状態は、比較すべき2つの生物学的状態、たとえば識別すべき2つの表現型の状態に対応する。限定的でない例には、たとえば非疾患(正常)組織対疾患組織;療法薬応答を示す培養物対より少ないその療法薬応答を示す培養物;有害な薬物応答を示す対象対より少ない有害な応答を示す対象;処置された対象の群対処置されていない対象の群等が含まれる。
[00218] 一部の態様において、2個より多くの遺伝子の発現量が測定され、生物学的状態を示す数値的指標の提供において用いられる。例えば、一部の場合において、多数の遺伝子の発現パターンを所与の表現型の状態、例えば臨床的に関連する表現型を特性付けるために用いる。一部の態様において、少なくとも約5個の遺伝子、少なくとも約10個の遺伝子、少なくとも約20個の遺伝子、少なくとも約50個の遺伝子、または少なくとも約70個の遺伝子を測定して生物学的状態を示す数値的指標を提供するために用いることができる。本発明の一部の態様において、約90個未満の遺伝子、約100個未満の遺伝子、約120個未満の遺伝子、約150個未満の遺伝子、または約200個未満の遺伝子を測定して生物学的状態を示す数値的指標を提供するために用いることができる。
[00225] 一部の態様において、生物学的状態を同定する方法が提供される。一部の態様において、その方法は以下の工程を含む:試料中の2種類の核酸のそれぞれの量を測定し、および/または数え、その量を数値として提供し;そしてその数値を用いて数値的指標を提供し、それによりその数値的指標がその生物学的状態を示す。
[00233] 一部の態様は、薬物開発を向上させる方法を提供する。例えば、内部標準の標準化された混合物、数値のデータベース、および/または数値的指標のデータベースを用いて薬物開発を向上させることができる。
[00238] 本明細書で記載された内部増幅対照(IAC)/競合内部標準(IS)は、組み合わせてキットの形態で提供することができる。一部の態様において、そのキットはIACならびに多重PCRおよび次世代配列決定(NGS)が含まれるPCRを実施するために必要な試薬を提供する。そのIACはその濃度が既知である単一の濃縮された形態で提供されてよく、または溶液中でいくつかの既知の作動濃度の少なくとも1つに系列希釈されてよい。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
[態様1]以下の工程:
NGSライブラリー調製において対象の天然核酸標的鋳型と同一のプライミング部位を共有する内部増幅対照(IAC)を含ませ;
増幅反応において天然核酸標的の速度論を模倣し、そして
増幅効率における試料、プラットフォーム、実験、操作者および/または標的特異的変動に関して対照する;
を含む、増幅に基づく次世代配列決定(NGS)ライブラリー調製において非系統的誤差に関して対照するための方法。
[態様2]増幅に基づくNGSがPCRに基づく次世代配列決定(NGS)を含む、態様1の方法。
[態様3]以下の工程:
1種類以上の対象の天然核酸鋳型と同一のプライミング部位を共有する1種類以上の内部増幅対照(IAC)を含ませ;
標的分析物の間で存在量の収束を引き起こす一方でそれぞれの天然核酸標的鋳型のそのそれぞれのIACに対する元の比率を保持し;そして、
それぞれの標的分析物の元の存在量の表現に関する定量的情報を保持し、低い数の配列決定の読みによる定量化を可能にする;
を含む、標的分析物の存在量を制御する一方で該標的分析物の元の存在量に関する定量的情報を保持するための方法。
[態様4]以下の工程:
i)それぞれの天然核酸標的に対応する既知の数の内部増幅対照(IAC)核酸分子を含む混合物を調製し;そして
ii)工程i)のIAC混合物を天然核酸標的を含有する試料と配列決定のためのライブラリーの調製の前に、またはライブラリー調製が必要でない場合は配列決定の前に混合し;
ここでそれぞれの天然核酸標的は配列決定により同定可能である核酸配列に対する1個以上の変化を除いてそのそれぞれのIACに類似しており、かつここでそのような変化には用いられるヌクレオチドの順序または組成に対する欠失、付加、または置換の1つ以上が含まれ得る;
iii)ライブラリー調製前に該試料中に入力されたIAC核酸分子の既知の数と共に、該天然核酸標的とそのそれぞれのIACとの間の配列決定事象の比率を評価し、そして
iv)ライブラリー調製および配列決定の前の元の試料中のそれぞれの天然核酸標的の元の量を定量可能であるように決定する;
を含む、過剰に表現される天然核酸標的の過剰標本抽出および深い配列決定と関係する確率的標本抽出誤差を低減するための方法。
[態様5]工程i)における既知の数が存在量、濃度および量の1以上を含む、態様4の方法。
[態様6]工程iii)における配列決定事象が観察、計数および読みの1以上を含む、態様4の方法。
[態様7]以下の工程:
非系統的誤差および/またはシーケンサー機器特異的偏りが天然核酸標的および内部増幅対照(IAC)の両方により同様に経験されるように、ライブラリー調製前に核酸標的の試料中に内部増幅対照(IAC)を導入する;
を含む、試料中の天然核酸標的の天然核酸標的コピー数を定量可能であるように決定するための方法。
[態様8]配列決定ライブラリー調製の終了時に、それぞれの固有の天然標的の間の相対的比率が該ライブラリーにおいて等モルの存在量に向かって収束するであろう、態様7の方法。
[態様9]等モルの存在量がライブラリーにおける均一な存在量を含む、態様8の方法。
[態様10]天然核酸標的間の存在量の範囲における10倍ごとの低減に関して10倍少ない配列決定の読みが必要とされる、先行する態様のいずれかの方法。
[態様11]さらに以下の工程:
内部増幅対照(IAC)を用いる配列決定を用いる核酸定量化により生成される臨床分子診断結果の実験室間比較を実施する;
を含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様12]以下の工程:
i)少なくとも1種類の天然核酸標的とそのそれぞれの内部増幅対照(IAC)標準との間の配列決定事象の比率を評価し;
ii)ライブラリー調製前に試料中に入力されたIAC分子の元の数を評価し;そして
iii)元のIAC入力数に天然核酸標的/IACの比率倍を掛けることにより、ライブラリー調製および配列決定の前の該試料中のそれぞれの天然核酸標的に関する元の分子数を決定する;
を含む方法。
[態様13]方法に競合IAC分子の同じ混合物を多数の異なる試験において用いることが含まれる、態様12の方法。
[態様14]さらに以下の工程:
多数の試料、実験および/またはプラットフォームにわたって多数の天然核酸標的の高度に多重化された分析を実施する;
を含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様15]天然核酸標的鋳型間の存在量が100万倍より大きく異なる、先行する態様のいずれかの方法。
[態様16]天然核酸標的鋳型間の存在量が10万倍より大きく異なる、先行する態様のいずれかの方法。
[態様17]天然核酸標的鋳型間の存在量が1万倍より大きく異なる、先行する態様のいずれかの方法。
[態様18]天然核酸標的鋳型間の存在量が1000倍より大きく異なる、先行する態様のいずれかの方法。
[態様19]さらに第1試料中の第1天然核酸標的の量を決定することを含み、以下の工程:
i)前記の第1核酸に関する競合鋳型および前記の第1試料中の第2核酸に関する競合鋳型を含む標準化された混合物を提供し、ここで前記の競合鋳型は互いと比較して既知の濃度であり;
ii)前記の第1試料を前記の標準化された混合物と組み合わせ;
iii)前記の第1核酸および前記の第1核酸に関する前記の競合鋳型を同時増幅してその第1増幅産物を生成し;
iv)前記の第1増幅産物を希釈し;
v)さらに前記の第1核酸の、および前記の第1核酸に関する前記の競合鋳型の前記の希釈した第1増幅産物を同時増幅してその第2増幅産物を生成し;そして
vi)前記の第2核酸および前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型を同時増幅してその第1増幅産物を生成する;
を含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様20]第1天然核酸標的の量を決定するための方法であって、以下の工程:
i)前記の第1天然核酸鋳型に関する競合内部増幅対照(IAC)と、前記の第1天然核酸標的を含む多くの試料中に存在する第2天然核酸標的に関する競合IACとを含む一連の系列希釈された標準化された混合物を提供し、ここで前記の競合IACは互いと比較して既知の濃度であり;
ii)前記の第1天然核酸標的を含む前記の試料の1つを前記の系列希釈した標準化された混合物の1番目と組み合わせ;
iii)前記の第1天然核酸標的および前記の第1天然核酸標的に関する前記の競合IACを同時増幅してその増幅産物を生成し;
iv)第1の関係を得て、前記の第1の関係は前記の第1天然核酸標的の前記の増幅産物を前記の第1天然核酸標的に関する前記の競合IACの前記の増幅産物に対して比較し;
v)前記の第1の関係が約1:10〜約10:1の範囲内であるかどうかを決定し;そうではない場合、前記の組み合わせ、同時増幅、取得および決定工程を前記の系列希釈された標準化された混合物の2番目を用いて繰り返し;
vi)前記の第2天然核酸標的および前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACを同時増幅してその増幅産物を生成し;
vii)第2の関係を得て、前記の第2の関係は前記の第2天然核酸標的の前記の増幅産物を前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACの前記の増幅産物に対して比較し;そして
viii)前記の第1および前記の第2の関係を比較する;
を含む、前記方法。
[態様21]前記の第1天然核酸標的の前記の増幅産物の前記の第1天然核酸配列に関する前記の競合IACの前記の増幅産物に対する比較において、前記の第1の関係が約1:100〜約100:1、または約1:1000〜約1000:1、または約1:10,000〜約10,000:1の範囲内であるかどうかが決定され;
そうではない場合、前記の組み合わせ、同時増幅、取得および決定工程を前記の系列希釈された標準化された混合物の2番目を用いて繰り返し;
前記の第2核酸および前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型を同時増幅してその増幅産物を生成し;
第2の関係を得て、前記の第2の関係は前記の第2核酸の前記の増幅産物を前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型の前記の増幅産物に対して比較し;そして
前記の第1および前記の第2の関係を比較する、態様21の方法。
[態様22]同時増幅反応からの産物を組み合わせ、第1ラウンドの増幅からのそれぞれの天然核酸標的および競合IAC産物を認識し、配列決定を容易にするために5’末端において遺伝子特異的バーコードプライマーおよびユニバーサルプライマーも有するプライマー対を用いて増幅の第2ラウンドにおいて増幅する、態様21の方法。
[態様23]さらに、前記の第1天然核酸標的および前記の第1天然核酸標的に関する前記の競合IACの前記の増幅産物を希釈し;そしてさらに前記の希釈された増幅産物を同時増幅してそのさらなる増幅産物を生成することを含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様24]さらに、前記の第2天然核酸標的および前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACの前記の増幅産物を希釈し;そしてさらに前記の希釈された増幅産物を同時増幅してそのさらなる増幅産物を生成することを含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様25]さらに前記の第2天然核酸標的を含む混合物の一連の系列希釈を実施することを含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様26]前記の系列希釈の1つが前記の系列希釈された標準化された混合物の前記の1番目中の前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACに対しておおよそ較正された前記の第2天然核酸標的を提供するように選択される、先行する態様のいずれかの方法。
[態様27]前記の第2天然核酸標的が第1参照核酸の役目を果たす、先行する態様のいずれかの方法。
[態様28]前記の第1参照核酸が装填に関する対照である、先行する態様のいずれかの方法。
[態様29]前記の第1参照核酸がGADP、ACTBおよびβ−アクチンから選択される少なくとも1種類の遺伝子に対応する、先行する態様のいずれかの方法。
[態様30]前記の第1参照核酸が前記の系列希釈された標準化された混合物の2つの中に2種類の異なる濃度で存在する、先行する態様のいずれかの方法。
[態様31]前記の一連の系列希釈された標準化された混合物がさらに、少なくとも106個または約106個の試料中の前記の第1天然核酸標的を評価するための十分な量の前記の競合IACを含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様32]前記の一連の系列希釈された標準化された混合物がさらに他の天然核酸標的(単数または複数)に関するいくつかの他の競合IAC分子を含み、前記の競合IAC分子が互いと比較して既知の濃度であり、それにより前記の他の天然核酸標的(単数または複数)の評価を可能にする、先行する態様のいずれかの方法。
[態様33]前記の他の天然核酸標的の少なくとも1種類が第2参照核酸の役目を果たす、先行する態様のいずれかの方法。
[態様34]前記の第2参照核酸がCADP、ACTBおよびβ−アクチンから選択される少なくとも1種類の遺伝子に対応する、先行する態様のいずれかの方法。
[態様35]前記の評価がさらに以下の工程:
i)前記の第2参照核酸および前記の第2参照核酸に関する前記の競合IACを同時増幅してその増幅産物を生成し;
ii)第3の関係を得て、前記の第3の関係は前記の第2参照核酸の前記の増幅産物を前記の第2参照核酸に関する前記の競合鋳型の前記の増幅産物に対して比較し;そして、
iii)前記の第1および前記の第3の関係を比較する;
を含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様36]前記の一連の系列希釈された標準化された混合物がさらに106個より多い、または約106個の試料中の前記の他の天然核酸標的(単数または複数)を評価するための十分な量の前記の数の他の競合IAC(単数または複数)を含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様37]前記の第1天然核酸標的および前記の他の天然核酸標的(単数または複数)の量が2桁より大きい、または約2桁の範囲にわたって異なっている、先行する態様のいずれかの方法。
[態様38]前記の第1天然核酸標的に関する前記の競合IACが前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACと比較した一連の濃度で存在する、先行する態様のいずれかの方法。
[態様39]前記の第1または前記の第2の関係を得ることが、微少流体装置、キャピラリー電気泳動、オリゴヌクレオチドアレイ、質量分析、またはクロマトグラフィーの使用を含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様40]前記の標準化された混合物がcDNA装填、核酸内増幅効率、核酸間増幅効率、標本間増幅効率、試料間増幅効率、および試料内増幅効率から選択される少なくとも2つの変動の源に関して対照する、先行する態様のいずれかの方法。
[態様41]前記の系列の前記の標準化された混合物の少なくとも1つが前記の試料の1つにおける1,000分子未満または約1,000分子の前記の第1天然核酸標的を数えることができる、先行する態様のいずれかの方法。
[態様42]前記の方法がコンピューターで実施される、先行する態様のいずれかの方法。
[態様43]前記のコンピューターでの実施がロボット取扱者に前記の系列希釈された標準化された混合物の前記の1番目を組み合わせに関して選択するように指示することを含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様44]前記のコンピューターでの実施が前記の第1の関係を得ることを含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様45]前記の前記の第1の関係を得ることが曲線下面積を決定することを含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様46]前記のコンピューターでの実施が前記のロボット取扱者に前記の第1の関係に基づいて前記の系列希釈された標準化された混合物の前記の2番目を選択するように指示することを含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様47]前記の第1核酸がRNA分子を含む、先行する態様のいずれかの方法。
[態様48]前記の第1天然核酸標的がDNA分子を含む、先行する態様のいずれかの方法。
Claims (48)
- 以下の工程:
NGSライブラリー調製において対象の天然核酸標的鋳型と同一のプライミング部位を共有する内部増幅対照(IAC)を含ませ;
増幅反応において天然核酸標的の速度論を模倣し、そして
増幅効率における試料、プラットフォーム、実験、操作者および/または標的特異的変動に関して対照する;
を含む、増幅に基づく次世代配列決定(NGS)ライブラリー調製において非系統的誤差に関して対照するための方法。 - 増幅に基づくNGSがPCRに基づく次世代配列決定(NGS)を含む、請求項1に記載の方法。
- 以下の工程:
1種類以上の対象の天然核酸鋳型と同一のプライミング部位を共有する1種類以上の内部増幅対照(IAC)を含ませ;
標的分析物の間で存在量の収束を引き起こす一方でそれぞれの天然核酸標的鋳型のそのそれぞれのIACに対する元の比率を保持し;そして、
それぞれの標的分析物の元の存在量の表現に関する定量的情報を保持し、低い数の配列決定の読みによる定量化を可能にする;
を含む、標的分析物の存在量を制御する一方で該標的分析物の元の存在量に関する定量的情報を保持するための方法。 - 以下の工程:
i)それぞれの天然核酸標的に対応する既知の数の内部増幅対照(IAC)核酸分子を含む混合物を調製し;そして
ii)工程i)のIAC混合物を天然核酸標的を含有する試料と配列決定のためのライブラリーの調製の前に、またはライブラリー調製が必要でない場合は配列決定の前に混合し;
ここでそれぞれの天然核酸標的は配列決定により同定可能である核酸配列に対する1個以上の変化を除いてそのそれぞれのIACに類似しており、かつここでそのような変化には用いられるヌクレオチドの順序または組成に対する欠失、付加、または置換の1つ以上が含まれ得る;
iii)ライブラリー調製前に該試料中に入力されたIAC核酸分子の既知の数と共に、該天然核酸標的とそのそれぞれのIACとの間の配列決定事象の比率を評価し、そして
iv)ライブラリー調製および配列決定の前の元の試料中のそれぞれの天然核酸標的の元の量を定量可能であるように決定する;
を含む、過剰に表現される天然核酸標的の過剰標本抽出および深い配列決定と関係する確率的標本抽出誤差を低減するための方法。 - 工程i)における既知の数が存在量、濃度および量の1以上を含む、請求項4に記載の方法。
- 工程iii)における配列決定事象が観察、計数および読みの1以上を含む、請求項4に記載の方法。
- 以下の工程:
非系統的誤差および/またはシーケンサー機器特異的偏りが天然核酸標的および内部増幅対照(IAC)の両方により同様に経験されるように、ライブラリー調製前に核酸標的の試料中に内部増幅対照(IAC)を導入する;
を含む、試料中の天然核酸標的の天然核酸標的コピー数を定量可能であるように決定するための方法。 - 配列決定ライブラリー調製の終了時に、それぞれの固有の天然標的の間の相対的比率が該ライブラリーにおいて等モルの存在量に向かって収束するであろう、請求項7に記載の方法。
- 等モルの存在量がライブラリーにおける均一な存在量を含む、請求項8に記載の方法。
- 天然核酸標的間の存在量の範囲における10倍ごとの低減に関して10倍少ない配列決定の読みが必要とされる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- さらに以下の工程:
内部増幅対照(IAC)を用いる配列決定を用いる核酸定量化により生成される臨床分子診断結果の実験室間比較を実施する;
を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 以下の工程:
i)少なくとも1種類の天然核酸標的とそのそれぞれの内部増幅対照(IAC)標準との間の配列決定事象の比率を評価し;
ii)ライブラリー調製前に試料中に入力されたIAC分子の元の数を評価し;そして
iii)元のIAC入力数に天然核酸標的/IACの比率倍を掛けることにより、ライブラリー調製および配列決定の前の該試料中のそれぞれの天然核酸標的に関する元の分子数を決定する;
を含む方法。 - 方法に競合IAC分子の同じ混合物を多数の異なる試験において用いることが含まれる、請求項12に記載の方法。
- さらに以下の工程:
多数の試料、実験および/またはプラットフォームにわたって多数の天然核酸標的の高度に多重化された分析を実施する;
を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 天然核酸標的鋳型間の存在量が100万倍より大きく異なる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 天然核酸標的鋳型間の存在量が10万倍より大きく異なる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 天然核酸標的鋳型間の存在量が1万倍より大きく異なる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 天然核酸標的鋳型間の存在量が1000倍より大きく異なる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- さらに第1試料中の第1天然核酸標的の量を決定することを含み、以下の工程:
i)前記の第1核酸に関する競合鋳型および前記の第1試料中の第2核酸に関する競合鋳型を含む標準化された混合物を提供し、ここで前記の競合鋳型は互いと比較して既知の濃度であり;
ii)前記の第1試料を前記の標準化された混合物と組み合わせ;
iii)前記の第1核酸および前記の第1核酸に関する前記の競合鋳型を同時増幅してその第1増幅産物を生成し;
iv)前記の第1増幅産物を希釈し;
v)さらに前記の第1核酸の、および前記の第1核酸に関する前記の競合鋳型の前記の希釈した第1増幅産物を同時増幅してその第2増幅産物を生成し;そして
vi)前記の第2核酸および前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型を同時増幅してその第1増幅産物を生成する;
を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 第1天然核酸標的の量を決定するための方法であって、以下の工程:
i)前記の第1天然核酸鋳型に関する競合内部増幅対照(IAC)と、前記の第1天然核酸標的を含む多くの試料中に存在する第2天然核酸標的に関する競合IACとを含む一連の系列希釈された標準化された混合物を提供し、ここで前記の競合IACは互いと比較して既知の濃度であり;
ii)前記の第1天然核酸標的を含む前記の試料の1つを前記の系列希釈した標準化された混合物の1番目と組み合わせ;
iii)前記の第1天然核酸標的および前記の第1天然核酸標的に関する前記の競合IACを同時増幅してその増幅産物を生成し;
iv)第1の関係を得て、前記の第1の関係は前記の第1天然核酸標的の前記の増幅産物を前記の第1天然核酸標的に関する前記の競合IACの前記の増幅産物に対して比較し;
v)前記の第1の関係が約1:10〜約10:1の範囲内であるかどうかを決定し;そうではない場合、前記の組み合わせ、同時増幅、取得および決定工程を前記の系列希釈された標準化された混合物の2番目を用いて繰り返し;
vi)前記の第2天然核酸標的および前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACを同時増幅してその増幅産物を生成し;
vii)第2の関係を得て、前記の第2の関係は前記の第2天然核酸標的の前記の増幅産物を前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACの前記の増幅産物に対して比較し;そして
viii)前記の第1および前記の第2の関係を比較する;
を含む、前記方法。 - 前記の第1天然核酸標的の前記の増幅産物の前記の第1天然核酸配列に関する前記の競合IACの前記の増幅産物に対する比較において、前記の第1の関係が約1:100〜約100:1、または約1:1000〜約1000:1、または約1:10,000〜約10,000:1の範囲内であるかどうかが決定され;
そうではない場合、前記の組み合わせ、同時増幅、取得および決定工程を前記の系列希釈された標準化された混合物の2番目を用いて繰り返し;
前記の第2核酸および前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型を同時増幅してその増幅産物を生成し;
第2の関係を得て、前記の第2の関係は前記の第2核酸の前記の増幅産物を前記の第2核酸に関する前記の競合鋳型の前記の増幅産物に対して比較し;そして
前記の第1および前記の第2の関係を比較する、請求項21に記載の方法。 - 同時増幅反応からの産物を組み合わせ、第1ラウンドの増幅からのそれぞれの天然核酸標的および競合IAC産物を認識し、配列決定を容易にするために5‘末端において遺伝子特異的バーコードプライマーおよびユニバーサルプライマーも有するプライマー対を用いて増幅の第2ラウンドにおいて増幅する、請求項21に記載の方法。
- さらに、前記の第1天然核酸標的および前記の第1天然核酸標的に関する前記の競合IACの前記の増幅産物を希釈し;そしてさらに前記の希釈された増幅産物を同時増幅してそのさらなる増幅産物を生成することを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記の第2天然核酸標的および前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACの前記の増幅産物を希釈し;そしてさらに前記の希釈された増幅産物を同時増幅してそのさらなる増幅産物を生成することを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- さらに前記の第2天然核酸標的を含む混合物の一連の系列希釈を実施することを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の系列希釈の1つが前記の系列希釈された標準化された混合物の前記の1番目中の前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACに対しておおよそ較正された前記の第2天然核酸標的を提供するように選択される、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第2天然核酸標的が第1参照核酸の役目を果たす、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第1参照核酸が装填に関する対照である、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第1参照核酸がGADP、ACTBおよびβ−アクチンから選択される少なくとも1種類の遺伝子に対応する、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第1参照核酸が前記の系列希釈された標準化された混合物の2つの中に2種類の異なる濃度で存在する、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の一連の系列希釈された標準化された混合物がさらに、少なくとも106個または約106個の試料中の前記の第1天然核酸標的を評価するための十分な量の前記の競合IACを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の一連の系列希釈された標準化された混合物がさらに他の天然核酸標的(単数または複数)に関するいくつかの他の競合IAC分子を含み、前記の競合IAC分子が互いと比較して既知の濃度であり、それにより前記の他の天然核酸標的(単数または複数)の評価を可能にする、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の他の天然核酸標的の少なくとも1種類が第2参照核酸の役目を果たす、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第2参照核酸がCADP、ACTBおよびβ−アクチンから選択される少なくとも1種類の遺伝子に対応する、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の評価がさらに以下の工程:
i)前記の第2参照核酸および前記の第2参照核酸に関する前記の競合IACを同時増幅してその増幅産物を生成し;
ii)第3の関係を得て、前記の第3の関係は前記の第2参照核酸の前記の増幅産物を前記の第2参照核酸に関する前記の競合鋳型の前記の増幅産物に対して比較し;そして、
iii)前記の第1および前記の第3の関係を比較する;
を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 前記の一連の系列希釈された標準化された混合物がさらに106個より多い、または約106個の試料中の前記の他の天然核酸標的(単数または複数)を評価するための十分な量の前記の数の他の競合IAC(単数または複数)を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第1天然核酸標的および前記の他の天然核酸標的(単数または複数)の量が2桁より大きい、または約2桁の範囲にわたって異なっている、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第1天然核酸標的に関する前記の競合IACが前記の第2天然核酸標的に関する前記の競合IACと比較した一連の濃度で存在する、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第1または前記の第2の関係を得ることが、微少流体装置、キャピラリー電気泳動、オリゴヌクレオチドアレイ、質量分析、またはクロマトグラフィーの使用を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の標準化された混合物がcDNA装填、核酸内増幅効率、核酸間増幅効率、標本間増幅効率、試料間増幅効率、および試料内増幅効率から選択される少なくとも2つの変動の源に関して対照する、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の系列の前記の標準化された混合物の少なくとも1つが前記の試料の1つにおける1,000分子未満または約1,000分子の前記の第1天然核酸標的を数えることができる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の方法がコンピューターで実施される、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記のコンピューターでの実施がロボット取扱者に前記の系列希釈された標準化された混合物の前記の1番目を組み合わせに関して選択するように指示することを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記のコンピューターでの実施が前記の第1の関係を得ることを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の前記の第1の関係を得ることが曲線下面積を決定することを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記のコンピューターでの実施が前記のロボット取扱者に前記の第1の関係に基づいて前記の系列希釈された標準化された混合物の前記の2番目を選択するように指示することを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第1核酸がRNA分子を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第1天然核酸標的がDNA分子を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
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