TW201335375A - 提升檢測kras編碼子12及13突變之靈敏度及專一性之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關於一種於DNA樣品中檢測KRAS基因之編碼子12-13突變的方法,該方法包含:藉由使用一突變型探針、與此突變型探針配對之一野生型探針、一正向引子及一反向引子,進行一等位基因檢測法來檢測在DNA樣品之KRAS基因編碼子12-13中一個或一個以上的突變,其中突變探針會偵測DNA樣品中KRAS基因編碼子12-13上在1A、1T、1C、2A、2T、2C或5A之單一核苷酸突變,且每一引子長度皆不超過25個核苷酸,每一引子係用來放大橫跨KRAS外顯子2編碼子12-13之一區段,其中,此突變型及野生型探針係以不同的螢光染劑標記。
Description
本發明係關於一種檢測KRAS c12-13基因突變型的方法,能專一且靈敏地診斷癌症及/或作癌症預後的評估。
KRAS(正式名稱:v-Ki-ras2 Kirsten小鼠肉瘤病毒同源制癌基因;別名:KRAS2,RASK2;基因庫登錄號NM_033360,係全部併入本發明以供參酌)係一種在EGFR所活化的訊息傳遞路徑中的小型GTP酶,影響癌細胞的生長、存活及分化等過程。EGFR被認為是種會引發上皮細胞異常增生的致癌因子,抗EGFR的標把藥物對全世界數以百萬計的此類癌症病患,有控制惡化的功效。有c12-13突變的K-ras所產生的組成蛋白,GTP酶會不斷被激活,GTP鍵結也被改變。屬EGFR下游的K-ras突變蛋白,即持久活化的GTP酶,會使抗EGFR標把藥物的療效不彰。
K-ras基因中單一核苷酸的錯誤及取代,主要發生於編碼12及13(>98%)的第1、第2及第5的核苷酸位點,常見於胰腺癌(75-90%)、肺腺癌(20-50%)、以及結腸癌(CRC,30-60%)等上皮細胞性腫瘤,而有K-ras突變的病人不建議使用抗EGFR藥物,例如panitumumab及cetuximab(VECTIBIX®及ERBITUX®),因治療效果會受阻。KRAS的檢測已成為肺腺癌及CRC病患的用藥指南,而KRAS突變狀態的評估亦可提供癌症進展、轉移以及CRC遺傳潛因等的預測值,此外,
檢測胰腺癌病患血漿中的KRAS突變,可得知腫瘤細胞的殘餘,有助於評估病人治療的效果;膽汁中偵測到KRAS突變,亦助於膽道癌的早期診斷。
目前KRAS熱點突變的快速篩選正值發展,檢測效果有賴於探針(probe)及引子(primer)的組合,然而其設計與組合如何能提升等位基因(allele)鑑別的靈敏度及專一性則鮮少被討論。
於一態樣中,本發明係關於在DNA樣本中,檢測KRAS基因編碼子12-13突變的方法,該方法包括:以不同螢光標示的突變型探針、及與之對應的野生型探針,搭配一正向及一反向引子進行等位基因鑑別的檢測法。上述的突變型探針係針對位於KRAS基因編碼子12-13的主要單一核苷酸突變包括:1A、1T、1C、2A、2T、2C或5A,搭配一對各不超過25個核苷酸長度的引子,放大橫跨KRAS外顯子2編碼子12-13的區段,其中,突變型及野生型探針的螢光標示各為Fam及Vic。
其他態樣將藉由以下較佳實施例配合圖式的描述而更明瞭,在不背離本發明精神及揭露之新穎構想範圍下,可作各種不同的改變及修飾。
本發明之一或多個實施例所隨附的圖式以及描述將會解釋本發明之範疇,而圖式所使用的相同參酌編號盡可能代表實施例中相同或相似的元件。
於發明之上下文以及於特殊上下文中所使用的每一個術語,基本上在其所屬技術領域中有其常見之意義,用於描述本發明之特定術語於以下或說明書之其他處探討,以進一步導引從事者瞭解本發明之描述。為求便利,說明書中的特定術語將會藉由例如斜體字及/或引號而強調,而此強調並不會影響該術語的範疇以及意義,且於相同上下文中,無論是否有特別強調,該術語的範疇及意義皆相同。另外,由於相同事物可由多種方式描述,因此,在此討論之任一個或多個術語亦可以替代詞或同義字描述,但並非說明書中任何一個特殊含意的術語皆需在此討論及詳述。本發明會對特殊的術語提供其同義字,然而於此所列舉之一或多個同義字並不會排除其他同義字的使用,本說明書任何地方所使用的任何術語僅為說明使用,並不會侷限本發明或任何示範術語的範疇及意含。同樣的,本說明書中的各種實施例亦不會限制本發明之範疇。
除非有其他的定義,否則與本發明相關之所有技術及科學術語皆和所屬技術領域具有共同技藝者所瞭解的意思相同,假如有不同處,將會於說明書中加以定義。
於此所使用的「大約(around)」、「大概(about)」或「近乎(approximately)」代表一給定值或給定範圍的百分比20以內,較佳為百分比10以內,更佳為百分比5以內。在此,若給定之數量無特別指出「大約(around)」、「大概(about)」
或「近乎(approximately)」之詞語時,亦能推測該給定之數量隱含有大約的意思。
於此,所屬技術領域具有共同技藝者能瞭解,本發明所敘的數量或範圍意指包含本發明相關特殊領域適當且合理的範圍。
於此,「橫跨KRAS外顯子2編碼子12-13之區段」意指「包含KRAS基因外顯子2編碼子12-13序列之核苷酸序列」。
於此,一術語「探針對(paired probes)」或「一(配)對探針(a pair of probes)」係表示包含一突變型探針以及一野生型探針之探針對,其中野生型探針係與突變型探針配對的設計。
質量控制(QC)突變型係與突變型探針相同的DNA序列。QC突變型的使用量被固定為平行測試(parallel PCR)的QC野生型DNA量的1~5%。舉例來說,使用突變型探針2CM(SEQ ID NO:5)時,則QC突變型需包含SEQ ID NO:5之核苷酸序列,且當使用突變型探針NIA(SEQ ID NO:9)時,則QC突變型需包含SEQ ID NO:9之核苷酸序列等等。
於此,一用語「可比強度(comparable intensity)」意指DNA樣本的螢光訊號強度達到等同於QC突變型的螢光強度,表示該DNA樣本具有該突變型。偵測DNA樣本時,平行檢測QC突變型,係為建立突變型鑑別的基礎螢光讀值(baseline)。
單一鹼基的配對錯誤會降低鹼基鍵結的能量以及熔點(Tm),係等位基因專一的寡核苷酸(allele specific oligonucleotide,ASO)的雜交基礎。ASO的應用常見於傳統的斑點雜交(dot blot)、即時PCR(qPCR)之螢光探針以及當下盛行的微陣列DNA晶片,而鍵結結構的強度係決定於探針序列的Tm以及打開擴增子(amplicon)二級結構的難易。因此,探針的序列以及擴增子的長度或結構,在以ASO為基礎的臨床檢測上扮演重要的角色。
本發明係以即時PCR(qPCR)為平台,同時增強及檢測K-ras的c12-13區段,使用能放大該區段的引子以及能鑑別突變型的雜交探針,進行寡核苷酸序列專一的等位基因檢測。於一較佳實施例中,Taqman探針的小凹槽鍵結(MGB),能使短的探針(13-20個核苷酸鏈)具有高熔點差(△Tm)。本發明係應用等位基因專一的寡核苷酸(allele specific oligonucleotide,ASO)雜交在快速、簡單的qPCR上,藉由探針對及引子對的序列及配對的改換,改善K-ras c12-13突變型檢測的檢測能力。
以qPCR鑑定K-ras基因型,必須能在佔絕大多數的野生型中分辨出各位點的突變等位基因。此困難有兩個層面:一為測試材料(檢樣的基因)本身的異質性,另為檢測法的極限。檢樣基因的異質性可能受到腫瘤對非腫瘤的成分模板(template)混合,野生型及突變型DNA的莫耳量不均,突變屬雜合或純合性(heterozygosity or homozygosity)等的影響。近來K-ras突變檢測多半以原發性腫瘤組織(primary
tumor tissue)為樣本,不僅取得容易且腫瘤細胞量充足,因手術前有內視鏡辨別腫瘤所在,由切片也可確認癌細胞的分佈。對癌細胞已轉移的病人,則有約20%未在先前發現有原發性腫瘤,即無腫瘤的移除及切片被保存。故而唯有藉由剛切除的轉移性腫瘤組織樣本,例如肝或陽性淋巴結等,進行測試。然而,K-ras狀態在原發性及轉移性腫瘤組織的不一致,並不罕見。(Mariani et al.(2010)“Concordant analysis of KRAS status in primary colon carcinoma and matched metastasis.Anticancer Res”30,4229-35)
不同探針對有二級結構的擴增子(amplicon)(尤其是鍵結區(binding motifs)的附近)親和力也不同,不能僅以熔點(Tm)的估算來改良等位基因的探針及引子。首先,以ABI的SNP軟體v1.3搜尋適合的引子(例如AS12F及AS12R)以及部分探針的序列,透過平行測試以及個別因子(例如探針、引子、Taq DNA聚合酶)等的替換,評估結果選出較佳的因子後,又重複三次才予以確認。參考Chow,L.et al.(2012)“依性別及結腸癌之病理表現型,以等位基因檢測法檢測K-ras c12-13基因型的頻率差異(Differences in the frequencies of K-ras c12-13 genotypes by gender and pathologic phenotypes in colorectal tumors measured using the allele discrimination method.Environmental and Molecular Mutagenesis)”53:22-31,亦併入本發明以供參酌。此外,不同的樣本來源(組織切片、新鮮或冷凍組織、病人血清)、所含的模板種類(gDNA或cDNA)及使用量等亦有評估以確認效果。
於此的Taq DNA聚合酶並無特別限制,可包含TaqMan快速通用PCR預混試劑(TaqMan Fast Universal PCR Master Mix)(Applied Biosystems,CA,USA)以及KAPA探針快速qPCR套組(KAPA Probe Fast qPCR Kit)(Kapa Biosystems,MA,USA)。
該qPCR儀器可包括ABI 7900及ABI 7500 Fast,但不限於此。
人類DNA包含基因體DNA(gDNA)以及mRNA反轉錄的互補DNA(cDNA)。於本發明一實施例中,石蠟包埋(FFPE)的人類組織gDNA係以DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagene,Valencia,CA,USA)萃取。另一方面,冷凍組織或新鮮培養的癌細胞株的mRNA可使用Trizol(Invitrogen,NY,USA)萃取並反轉錄成cDNA。本發明可同步偵測樣本中七個等位基因,每次的檢測反應無論有多少個樣本(於8x12孔盤中,除去必要的QC突變型,最多為11個樣本),都必須包含各別突變型的QC以解釋偵測結果。除了等位基因專一探針之外,全部七個反應的反應試劑皆相同。
於臨床應用上,本發明可利用適當的萃取溶液抽取豐富且新鮮的血清DNA作為樣本。
於一態樣中,本發明係關於在DNA樣本中,檢測KRAS第12及13編碼子上單一核苷酸突變之方法,其包括:藉由使用一突變型探針、一相對應的野生型探針、一正向及一反向引子,以等位基因鑑別法檢測DNA樣本是否有
KRASc12-13的某個或多個突變。該突變型探針係針對KRASc12-13上的1A、1T、1C、2A、2T、2C或5A單一核苷酸突變,而放大KRAS外顯子2編碼子12-13區段的引子,長度皆不超過25個核苷酸;突變型及野生型探針則標示有不同的螢光染劑。
該突變型及野生型探針配對係選自下列群組:(i)SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2配對;(ii)SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:4配對;(iii)SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:2配對;(iv)SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8配對;(v)SEQ ID NO:9與SEQ ID NO:8或10配對;(vi)SEQ ID NO:11與SEQ ID NO:10配對;以及(vii)SEQ ID NO:12與SEQ ID NO:13配對。
於本發明一實施例中,檢測步驟包括:(a)將DNA樣本與成對探針、引子以及聚合酶鏈鎖反應(PCR)試劑混合;(b)放大橫跨KRAS外顯子2編碼子12-13之區段;(c)測量DNA樣本中突變型探針的螢光強度;以及(d)比較對應的質量控制(QC)突變型的螢光強度,若相近(comparable)或較強則代表具有突變型。
於本發明另一實施例中,正向及反向引子係各自獨立包含核苷酸序列SEQ ID NO:14及15。
於本發明另一實施例中,上述方法係包含:檢測KRASc12-13上1A、1T、1C、2A、2T、2C及5A的突變型,其中的探針配對包含以下的成對序列:(i)SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2配對;(ii)SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:4配對;(iii)SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:2配對;(iv)SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8配對;(v)SEQ ID NO:9與SEQ ID NO:8或10配對;(vi)SEQ ID NO:11與SEQ ID NO:10配對;以及(vii)SEQ ID NO:12與SEQ ID NO:13配對。
於本發明另一實施例中,該突變型探針係以FAM標記。
於本發明另一實施例中,該野生型探針係以VIC標記。
於本發明另一實施例中,每一探針長度皆不超過18或16個核苷酸。
於本發明另一實施例中,引子係用於放大小於80或70鹼基對(bp)的擴增子(amplicon)。
於本發明另一實施例中,引子係用於放大包含SEQ ID NO:16核苷酸序列的DNA片段。
於本發明另一實施例中,引子係用於放大由SEQ ID NO:16的核苷酸序列組成的DNA片段。
於本發明另一實施例中,該放大的步驟包含行使即時PCR(qPCR)。
於本發明之另一實施例中,該DNA樣本係包含由腫瘤活檢(biopsy)、石蠟包埋(FFPE)的腫瘤組織切片、新鮮或
冷凍的腫瘤組織,或培養的癌細胞株所製備的gDNA或cDNA。
於本發明另一實施例中,有切片係來自黏液性或轉移性直腸癌、或膽管癌腫瘤。
於本發明另一實施例中,cDNA係製備於冷凍腫瘤組織。
於本發明另一實施例中,DNA係得自於CRC病人的血清。
於本發明另一實施例中,gDNA的量不大於10 ng/μl.
在不限定本發明範疇下,以下係提供本發明相關之實施例之儀器、裝置、方法及結果。於實施例中用來便於閱讀者的名稱及副標題並不限制本發明之範疇,此外,於此所提出及揭露的理論,無論正確與否皆歸入本發明之範疇,且無論任何理論或功能組合,只要能實施本發明即屬本發明之範圍。
將取字21個腫瘤細胞株(結腸癌或肺癌)的gDNA進行KRAS定序及測試,而腫瘤樣本係收集自2007至2009年間204位自願參加的結腸癌病人,所有腫瘤檢體經蘇木精伊紅(Hematoxylin and Eosin)染色,由台灣國家衛生研究院之癌症研究所病理學者重新評估,此研究獲得成大醫院人體試驗委員會認可。
同步以Fam標示的1A、1T、1C、2A、2T、2C及5A突變型探針以及以Vic標示的同向野生型探針(如表1所設計),檢測突變型(Y)及野生型(X)等位基因。每個即時PCR(qPCR)反應,加入1X TaqMan基因分形試劑(Genotyping Master Mix)(P/N4352042,購自Applied Biosystem)或1X KAPA引子快速qPCR試劑(KAPA Probe Fast qPCR Kit Master Mix Universal)(KK4701,購自Kapa Biosystems),20或10 ng gDNA或100 ng cDNA反轉錄自RNA,3.38 pmole的Fam-及Vic-標示的探針對,以及9 pmole的引子。設定ABI PRISM 7900HT或7500快速序列檢測系統(Fast Sequence Detection System)(購自Applied Biosystems)的流程為:50℃下2分鐘,95℃下10分鐘,接著在95℃下15秒後,循環40次60℃下60秒。正向控制組(positive control)的QC突變型,係由定點突變(site directed mutagenesis)所產生,經大量複製後萃取得到的DNA質體,混1-5%於野生型DNA質體中。每個測試都要包括無模板的控制組(no-template control,NTC),作為負向控制組(negative control)。
所有等位基因偵測各個K-ras突變型的螢光標示探針如表1所列。
於表1中,探針1TM、2TM、2CM、5AM分別偵測1T、2T、2C及5A之突變,而新探針N1A、N2A及N1C分別偵測1A、2A及1C底線之單一突變。
PCR引子:測試過的引子序列如下:正向引子:1F:TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTG(SEQ ID NO:14);AS12F:AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:21;由外顯子2前端序列往後建構)。
反向引子:AS12R:GCTGTATCGTCAAGGCACTCTT(SEQ ID NO:15);1R:TCgTCCACAAAATgATTCTgAA(SEQ ID NO:22;由外顯子2後端序列往前建構)。
經證實(畫底線)較佳的引子可合成66 bp的擴增子,其野生型擴增子序列為:TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGC(SEQ ID NO:16),其中底線為1F及AS12R(互補性)的序列。
另一方面,1F及AS12R可能合成的突變型擴增子的序列,可表示為:tgactgaa tataaacttg tggtagttgg agct NNtgAc gtaggcaaga gtgccttgac gatacagc,其字母「NN」代表除野生型G外的三個可能的核苷酸(A、C、T)。
結合1F及AS12R引子與新的K-ras探針配對(表1中粗體所標示的序列頭銜),能改善K-ras c12-13的常見7個突變型的等位基因檢測。
K-Ras NM_004985外顯子2序列如下:
tggtagttgg agct ggtggc gtaggcaaga gtgccttgac gatacagcta ccaacaatag ag/(SEQ ID NO:17),編碼子12區段為ggt,而編碼子13區域為ggc,框起來的序列為AS12F及1R(互補序列),另外,SEQ ID NO:17序列包含SEQ ID NO:16序列。
在總體積15 μl的PRC反應中,各成份的最終濃度如下:
表3列示所偵測的單一核苷酸突變的位置及種類。
樣本中各等位基因反應的Fam強度(Y),與1%至5%對應的QC突變型,即本定性測量法的區分點,做比較(圖2及3),除了純質性突變型(homogeneous mutant)外,代表野生型的Vic(X軸),或強或弱會在所有樣本中看到。訊號呈現無論是顏色圖式或數字皆由excel檔輸出。凡樣本之Y值等於或高於QC突變型Y值係判定為具有突變。實施例中的長條圖代表多次實驗所獲Y值的平均值。
等位基因鑑別檢測雖為定性分析法,藉由增加與野生型的Fam強度差(△Y),提升QC突變型的測出量從起始的5%到最後低於1%。改善此檢測的過程包括改變:引子的配對以縮短擴增子的長度從80至66 bp,及探針的序列及其配對(實施例4)。最後,含引子1F及AS12R的探針N1A、N1C、
1T、N2A、2C、2T及5A經證實可達到檢測1% QC突變型的靈敏度。
本發明證實等位基因專一的探針以及引子序列與擴增子長度可能會影響檢測的效果,而所改變的序列經不同試劑、儀器以及樣本型態的組合,尚有進一步改善檢測靈敏度及專一性的空間。
為了比較三種方法的結果,靈敏度定義為測量確認為正確突變(視為陽性對照)的比例,而專一性係測量確認為正確野生型(視為陰性對照)的比例。若一方法所測量的等位基因結果不同於其他兩個方法,則被視為偽陽性或偽陰性。
(為正確陽性的陽性可能性)
(為正確陰性的陰性的可能性)
以等位基因檢測、定序及RFLP方法初試21株癌細胞,證實六個有K-ras c12的突變(A549及H358於第一鹼基及SW480、SW620、PRMI-8226及H2444於第二鹼基),八個有c13的突變(H1355、H1734及H1755於第一鹼基及DLD-1、HCT-8、HCT-116、Lovo及SW48於第二鹼基),以及七個K-ras野生型。RFLP所測到的15株有突變型的細胞中,有一個是
偽突變型(6.7%)(A172),係限制酶裂解核酸不完全所致,在FFPE組織此問題更惡化(n=62)(表4)。
在RFLP所測出的25個K-ras突變型中,有8個被等位基因檢測及定序法證實為偽突變(8/25=32%),16個正確以及1個有不同的突變型(1/17=6%錯誤突變型)。由於RFLP在FFPE樣本的靈敏度(在混合樣本中能偵測>10%以上的突變型)及專一性(82%,表4)均較差,故被dHPLC取代作為第三種檢測法以證實等位基因與定序檢測法的結果差異。
定序法在FFPE組織樣本,有12.4%的錯誤率,其定序結果的圖式中多有雜訊,其中有些檢樣在做定序前即呈現較差的PCR產量。首次定序即失敗檢樣,在至少加倍量後才再送出檢測。該研究發現DNA定序偵測到具有雙突變型的檢樣多於等位基因法(表6),經第三個方法證實多半為偽,故而稍微降低DNA定序法的靈敏度及專一性(各為98.8%及97.5%,表5)。在定序一些較老的組織時,發現偏性突變(biased mutation)隨著Taq聚合酶的種類(Viogene,Qiagene,Invitrogen及KB HotStart)而不同,可能因生物降解或組織處理不良所致的DNA片段化。較新的DNA定序技術例如:焦磷酸定序(pyrosequencing)及新一代定序(NGS),無須經過PCR步驟而較可能克服上述問題。
RFLP檢測因PCR操作及限制酶作用常結果難料外(專一性差如表4所示),也費時(至少兩天)。定序除了結果有12.4%錯誤率,整體仍有很高靈敏度的(98.8%,表5)及專一性(97.5%),堪任臨床檢測;但其在技術上的限制及誤差
率高導致解誤的困難及結果的延遲。表4顯示62個CRC樣本的RFLP結果,表5比較等位基因與DNA定序檢測法的結果。
RFLP的靈敏度=100%(17/17)而專一性=82%(37/45)。
RFLP的偽MT=32%(8/25)而錯的MT=6%(1/17)。
以定序及等位基因檢測法的結果確認RFLP結果的對錯。
第三個檢測方法(dHPLC)已證實等位基因檢測法的靈敏度(100%)及專一性(100%)均比定序高,基因型結果的比較見表6。等位基因檢測法與定序法所測得的不同基因型中,經dHPLC證實為正確的有一個突變型(5A)及三個野生型(定序為一野生型、一2T、2A5A及1C5A的雙突變)。雖然雙突變與腫瘤內部的基因異質性(intratumoral genetic heterogeneity)有關,但需顯微解剖(microdissection)來證實。相較qPCR法,雙突變傾向發生於定序及SSCP檢測法[Bazan et al.,2002;Span M,1996]。整體而言,偵測204個CRC檢樣得到有83個K-RAS突變(40.7%),其中20%為G12D(GAT),7.4%為12V(GTT),7.4%為13D(GAC),及5.3%其他四種突變的總合(12C,12R,12A及12S)。
等位基因檢測法的準確性分析分兩種,運行內的精確度(intra-run precision)即隨機測試21個檢樣三次的重複性,及運行間的精確度(inter-run precision)係評估五個檢樣五次連同每次的QC組(5%QC突變型,WT以及NTC)的重複性,其中,五個CRC檢樣為兩個2A突變型(P18及P48),一個2T突變型(P30)以及兩個野生型(P02及P04)(Chow等,2012)。各檢樣的Fam螢光(MT)值在三重複或五次檢測中的標準差(SDs)都很小,證實檢測的準確性及再現性均良好。因此,由比較不同方法的結果及統計分析該檢測法在病人
檢樣的精確度與再現性,等位基因檢測法的確符合臨床檢測的要求(CLIA指導方針)。
在較少數的膽管細胞癌(cholangiacarcinoma)檢樣(n=40),評估並比較等位基因檢測法及DNA定序法的KRAS突變結果,發現等位基因檢測法較定序法多偵測到2個突變型及一個不同的突變型,扣除13個腫瘤細胞量不到5%的檢樣後,至少有7%的偵測率。檢測法的表現有賴於監測必要的QC,既用以區別每次的錯誤是發生在檢測前(檢樣及準備)或檢測法本身,更監視檢測操作的穩定性(圖1)。
不同於經歷二次PCR放大的RFLP及DNA定序法,等位基因檢測法能同步放大及偵測基因型,減少PCR放大的錯誤機率。新引子縮短qPCR擴增子的長度(從80 bp至66 bp)後,在FFPE檢樣的偵測率及靈敏度得到改善,相反地定序法的擴增子必須是150至250 bp的片段。該新引子係1F取代AS12F與原引子AS12R配對,加上新探針(表1之N1A、N1C、N2A及N2C)更大幅提升檢測靈敏度,由偵測5%突變型(圖1)至1%突變型(圖5及6)。新的N2A(圖2A)及N2C(圖3A)探針在等位基因檢測,較舊的(A,圈起來所示中之圓點)更能區分5至100%的2A或2C突變型。由突變型及野生型的Fam(Y)強度差(△Y=YMT-YWT)可看出新引子1F增加N2A探針的靈敏度,由偵測2A突變型5%提升至1%(圖2B)。但1F引子對新的N2C探針則未必優於舊的2C探針(圖3B),因偵測5%
2C及2C5A的QC突變型及含有2C的RPMI-8226細胞時,顯示舊的2C探針的△Y較佳。故除2C外,所有偵測到的5%突變型的△Y顯示於圖4A,及持續兩個月監測N1C探針的Fam(Y)值(圖4B)。
以新的ASO序列比較不同試劑,Kapa探針快速qPCR套組(KAPA Probe Fast qPCR Kit)及TaqMan快速通用PCR預混試劑(TaqMan Fast Universal PCR Master Mix)(圖5),以及儀器,ABI 7900及7500 Fast(圖6A及6B)。以1%及2%QC突變型測試新的ASO序列,所測得的Fam強度(Y)隨百分比增加的程度即反映出靈敏度。
細胞在每個反應的gDNA量,由20降低至10 ng(圖7)。新ASO的組合檢測兩共培養細胞的K-ras基因型,在10 ng gDNA(圖8)及100 ng cDNA(圖9)均與個別細胞的K-ras基因型有對應。分析少數CRC病人冷凍組織的RNA及少量血清檢樣時,雖腫瘤gDNA有測到2T及5A突變型,但凍存-80℃超過1年的6個血清DNA則未檢測到(圖10)。在冷凍組織mRNA反轉錄成cDNA檢測到2T及2A雙突變型,但缺乏gDNA數據的驗證。雖然檢樣有限,K-ras檢測是一種非侵入性診斷工具,其應用在循環DNA(circulating DNA)及組織
RNA的潛力,也可能在臨床上產生較大的影響力,例如高危險個體即時基因變異的快速篩檢。本發明簡單又快速,是極具臨床應用價值的檢測法。
以上所述的實施例僅供說明及闡釋,並非詳盡或限制本發明所揭露的精確形式,而上述教示還可能有多種的修飾及變化。
所描述的實施例及範例係用以解釋本發明的原理及實際應用,以使精通本領域者能運用本發明及其中的實施例,或做改良以適於特殊的用途。在不背離本發明的精神及範疇下,此領域之精通者會將實施例明顯轉換,因此,本發明的範疇是由附加的請求項而非前面的描述或實施例加以定義。
本發明所引用及詳述的包括專利、專利申請案以及各種參考文獻,僅用於說明本發明,並非承認他們是本發明的「前身技術」。在此說明書中被引用及討論的所有參考文獻全都以同樣的原則認定,就如同每份參考文獻也有其各引用的文獻。
圖1顯示K-ras等位基因檢測法在包含野生型(wt)以及5%突變型(mt)質體DNA之質量控制組(QC)的月監測,其係執行於服務CRC病患期間(Chow等)。
圖2顯示K-ras檢測的靈敏度,由測量5%2A突變型(A:係在可區別的範圍內最低的百分比)提升至1%(B),係新的突變
型探針-N2A(CTGATGGCGTAGGC;SEQ ID NO:11)配野生型探針TTGGAGCTGGTGGC(SEQ ID NO:10),加上新引子1F(TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTG;SEQ ID NO:14)配引子AS12R(GCTGTATCGTCAAGGCACTCTT;SEQ ID NO:15)所達成。但與引子對1F/1R(TCgTCCACAAAATgATTCTgAA;SEQ ID NO:22)或AS12F(AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT;SEQ ID NO:21)/AS12R,N2A突變型探針分辨突變型的能力則不穩。
圖3A顯示起初將N2C突變型探針(CC TACGCCAGCAGC;SEQ ID NO:6)配野生型探針(CCTACGCCACCAGCT;SEQ ID NO:2)似乎有類似N2A的趨勢,但進一步觀察其區別5% 2C及2C5A質體DNA以及含2C的RPMI-8226細胞基因體DNA(gDNA)的Y差異(△Y)(B),以同樣的1F引子(TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTG;SEQ ID NO:14)配AS12R(GCTGTATCGTCAAGGCACTCTT;SEQ ID NO:15),發現略遜於舊的2C探針(CTACGCCAGCAGCT;SEQ ID NO:5)。無論是新的或舊的探針在區分2C等位基因,與AS12F(AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT;SEQ ID NO:21)/AS12R引子對(primer pairs)的效果優於1F(SEQ ID NO:14)/1R(TCgTCCACAAAATgATTCTgAA;SEQ ID NO:22)引子對。
圖4顯示除了2C外,新探針以及引子偵測所有5%QC突變型的△Y(當時的靈敏度);其中N1C突變型探針
(TTGGAGCTCGTGGC;SEQ ID NO:12)配野生型探針TTGGAGCTGGTGGCGT(SEQ ID NO:13)區別等位基因的能力似乎較佳(2009六月及七月的監測)(B)。
圖5顯示等位基因以新的探針及引子檢測1%及2%QC突變型的靈敏度(以△Y來看),ABI試劑(實心長條圖)-TaqMan快速通用PCR預混試劑(TaqMan Fast Universal PCR Master Mix)的效果優於較便宜的KAPA探針快速qPCR套組(KAPA Probe Fast qPCR Kit)許多(空心長條圖)(A);但在新的探針1A、1C及2A(所圈之內),KAPA試劑亦有不錯的靈敏度(B)。
圖6比較新探針及引子偵測1%及2%QC突變型的靈敏度(以△Y來看),在ABI 7900(A)及7500(B)儀器間的差異。
圖7比較細胞gDNA的10及20 ng使用量對K-ras等位基因檢測(新的引子及探針)的影響,結果相當。1C被省略因未發現具有1C突變型的細胞,詳細的探針對參見表1。
圖8顯示新探針及引子偵測細胞gDNA 10 ng,從共培養的兩種細胞所得的K-ras基因型相當於個別的基因型,例如:具野生型的Honel與具5A的DLD1共培養(H+D)測得5A型;各別的2T、1A及5A探針對參見表1。
圖9顯示新探針及引子偵測細胞cDNA 100 ng,從共培養的兩種細胞所得的基因型相當於個別的基因型,例如:具2T的SW480與5A的DLD1共培養(S+D)測得2T及5A型;A549的1A在與Honel或DLD1共培養時會訊號減弱,但與SW480則不會,不排除基因的表現在共培養時可能被干擾。
圖10顯示在血清DNA(20 ng)中測不到突變型的6位CRC病患(檢樣完整的有五位),病患I20及I350的腫瘤(T;非腫瘤,N)gDNA有測到2T及5A突變型;此外,病患I78的冷凍腫瘤組織cDNA(100 ng)(右側小表中)雖有測到2A2T雙突變型,但缺乏gDNA的檢樣做應證。
<110> 國家衛生研究院
周俐慧
劉滄梧
<120> 提升檢測KRAS編碼子12及13突變之靈敏度及專一性之方法(METHODS FOR IMPROVING SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF SCREENING ASSAYS OF KRAS CODONS 12 AND 13 MUTATIONS)
<130> S 3525/0556-P 040TW
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Homo sapiens
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<220>
<223> AS12F
<400> 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1R
<400> 22
Claims (20)
- 一種在一DNA樣本中檢測一KRAS基因編碼子12-13的突變型的方法,係包含:在該DNA樣品的KRAS基因編碼子12-13中,藉由一等位基因檢測法,使用一突變型探針、與該突變型探針配對之一野生型探針、一正向引子及一反向引子來檢測DNA檢樣中該KRAS基因編碼子12-13的突變型,其中該突變探針係偵測DNA樣品中KRAS編碼子12-13在1A、1T、1C、2A、2T、2C或5A之單一核苷酸突變,且每一該引子長度皆不超過25個核苷酸以放大橫跨一KRAS外顯子2編碼子12-13之區段,其中,該突變型及野生型探針係以不同螢光染劑標示。
- 如申請專利範圍第1項所示之方法,其中該檢測步驟包含:(i)混合該DNA樣本與該突變型及該野生型探針對、引子對以及聚合酶連鎖反應(PCR)試劑;(ii)放大橫跨該KRAS外顯子2編碼子12-13之該區段;(iii)測量該DNA樣本中,該突變型探針之該螢光染劑的強度;以及(iv)比較突變型探針與其對應的該質量控制(QC)突變型的螢光強度,若相近(comparable)或較強則代表該突變的存在。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該正向及該反向引子係分別包含核苷酸序列SEQ ID NO:14及15。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該突變型以及該野生型之探針係一選自以下群組之探針對 (i)SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2配對;(ii)SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:4配對;(iii)SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:2配對;(iv)SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8配對;(v)SEQ ID NO:9與SEQ ID NO:8或10配對;(vi)SEQ ID NO:11與SEQ ID NO:10配對;以及(vii)SEQ ID NO:12與SEQ ID NO:13配對。
- 如申請專利範圍第4項所述之方法,其中該正向及該反向引子分別為核苷酸序列SEQ ID NO:14及15。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該突變型探針係以FAM標記。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法,其中該野生型探針係以VIC標記。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,係包含檢測KRAS編碼子12-13上1A、1T、1C、2A、2T、2C及5A的突變,所包含探針對如下:(i)SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2之配對;(ii)SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:4之配對;(iii)SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:2之配對;(iv)SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8之配對;(v)SEQ ID NO:9與SEQ ID NO:8或10之配對;(vi)SEQ ID NO:11與SEQ ID NO:10之配對;以及(vii)SEQ ID NO:12與SEQ ID NO:13之配對。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法,其中該正向及反向引子分別為核苷酸序列SEQ ID NO:14及15。
- 如申請專利範圍第8項所示之方法,其中該檢測步驟包含:(a)混合該DNA樣本與該突變型及該野生型探針對、引子對以及聚合酶連鎖反應(PCR)試劑;(b)放大橫跨該KRAS外顯子2編碼子12-13之該區段;(c)測量該DNA樣本中,該突變型探針之該螢光染劑的強度;以及(d)比較各自的突變型探針與其對應的該質量控制(QC)突變型的螢光強度,若相近(comparable)或較強則代表該突變的存在。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中每一探針長度不超過18或16個核苷酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該DNA檢樣包含:由一腫瘤活檢樣本、一石蠟包埋的腫瘤組織切片(FFPE)、一新鮮或冷凍的腫瘤塊或一培養的癌細胞株所製備的一基因體DNA(gDNA)或cDNA。
- 如申請專利範圍第12項所述之方法,該腫瘤切片係來自結直腸癌(CRC)、黏液組織(mucinous)或轉移性腫瘤、膽管癌(cholangiocarcinoma)或肺癌等病患。
- 如申請專利範圍第12項所述之方法,其中該cDNA係由一冷凍或新鮮的腫瘤組織所製備。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法,其中該放大之步驟包含進行一即時PCR(real time PCR或qPCR)。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該引子係適用於放大小於80或70鹼基對(bp)的擴增子(amplicon)。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法,其中該引子係適用於放大包含該核苷酸序列SEQ ID NO:16之一DNA片段。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法,其中該引子係適用於放大由核苷酸序列SEQ ID NO:16所組成之一DNA片段。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該DNA檢樣係包含取自於CRC病患之一血清DNA。
- 如申請專利範圍第12項所述之方法,其中該檢樣gDNA的量不超過10 ng/μl。
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CN113624665A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-11-09 | 中国药科大学 | 一种抗肿瘤候选化合物在治疗结直肠癌药物中的应用及测定方法 |
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- 2012-02-24 TW TW101106402A patent/TW201335375A/zh unknown
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