JPWO2010047317A1 - 間質性膀胱炎を検出するための新規マーカー - Google Patents
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Abstract
Description
現在、間質性膀胱炎の確定診断は、多くの除外診断の後に行われる水圧拡張時膀胱鏡検査(以下膀胱鏡検査)により行われる。膀胱鏡検査とは、麻酔下膀胱に水を注入して強制的に膀胱を拡張した後、ハンナー潰瘍または点状出血の有無を確認する検査である。ハンナー潰瘍と点状出血のうちハンナー潰瘍は間質性膀胱炎に特異的な所見であり、必須診断所見の1つである。しかし、ハンナー潰瘍確認のための唯一の方法である膀胱鏡検査は極めて専門的検査であり、医師の熟練度・経験により診断結果が左右され得る客観性、正確性に欠ける診断方法である。さらに、膀胱鏡検査の合併症として膀胱破裂という重篤な事例が報告されている(例えば、非特許文献1参照)。また、間質性膀胱炎と類似疾患である膀胱上皮内癌とは膀胱鏡所見において類似点が多い為、膀胱鏡検査を行っても膀胱内皮癌であるリスクを内包する(例えば、非特許文献2参照)。
したがって、間質性膀胱炎の診断マーカー、特にハンナー潰瘍を伴う重篤な間質性膀胱炎(潰瘍型間質性膀胱炎)の診断マーカーとして、低侵襲で合併症がなく、直接的かつ特異的な診断マーカーの開発が切望されている。
抗増殖因子APF(antiproliferative factor)は、間質性膀胱炎患者群と対照群との重なりが最も少ない為、現在、間質性膀胱炎の最も有望なマーカーとして報告されている(例えば、非特許文献3参照)。APFをマーカーとして利用する場合、APFの活性を膀胱上皮細胞の増殖抑制活性で検出する必要がある(例えば、非特許文献4参照)。しかし、このような検出方法は細胞培養系で測定する必要がある。そのため、活性値が間接的に測定されること、測定方法が煩雑であること、測定値がばらつくという問題がある。
この他のマーカーとしてアズール顆粒、ウロプラキンが挙げられる。
アズール顆粒をマーカーとする方法は、尿中の好中球エラスターゼまたはミエロペルオキシダーゼの量を測定する方法である。アズール顆粒は、間質性膀胱炎患者の痛みの有無に相関するため、間質性膀胱炎の症状改善マーカーとして利用されうる。しかし、間質性膀胱炎の類型、即ち潰瘍型・非潰瘍型を判別するものではない(例えば、特許文献1参照)。
ウロプラキン(UP)をマーカーとする方法は、膀胱生検組織中のウロプラキン遺伝子発現量を定量する方法である。ウロプラキンIII(UPIII)が間質性膀胱炎患者で有意に発現量が増加している為、ウロプラキンは間質性膀胱炎を検出する為に利用できると開示されている(例えば、特許文献2参照)。
しかし、いずれの報告例においても、潰瘍型間質性膀胱炎を感度良く、特異的に検出するマーカー遺伝子の報告は未だ無い。
(1)TNFSF14、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCR2、AZGP1およびOVOL1から選択される少なくとも1種の遺伝子をマーカーとする間質性膀胱炎を検出する方法。
(2)間質性膀胱炎が、潰瘍性間質性膀胱炎である、〔1〕記載の方法。
(3)TNFSF14、CXCL10、AZGP1およびOVOL1から選択される少なくとも1種の遺伝子をマーカーとする、〔1〕又は〔2〕記載の方法。
(4)前記マーカー遺伝子から転写されるmRNAを調製する工程を含む、〔1〕〜〔3〕の何れか一項記載の方法。
(5)mRNAから変換されるcDNAを調製する工程を含む、〔4〕記載の方法。
(6)cDNAから転写される標識化されたcRNAを調製する工程を含む、〔5〕記載の方法。
(7)標識化されたcRNAをフラグメント化する工程を含む、〔6〕記載の方法。
(8)前記マーカー遺伝子を検出するためのプローブを用いる工程を含む、〔1〕〜〔3〕の何れか一項記載の方法。
(9)標識化されたcRNAのフラグメントとプローブとをハイブリダイズさせる工程を含む、〔8〕記載の方法。
(10)標識化されたcRNAのフラグメントの発現量をDNAマイクロアレイにより測定する工程を含む、〔9〕記載の方法。
(11)TNFSF14、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCR2、AZGP1およびOVOL1から選択される少なくとも1種以上の遺伝子を検出するためのプローブを含む、間質性膀胱炎の検査キット。
なお、遺伝子またはDNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば、発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含むことができる。
被験者から検体を得、total RNAを調製する。total RNAから本発明のマーカー遺伝子由来のポリヌクレオチドを調製する。調製されたポリヌクレオチドをプローブとハイブリダイズさせる。その結果得られるマーカー遺伝子の発現量を測定し、マーカー遺伝子の定量をする。マーカー遺伝子の発現量により間質性膀胱炎を検出する。
本発明のマーカー遺伝子を用いての間質性膀胱炎を診断する為のcRNAを定量する為のキットは、cRNAフラグメントを得る為の試薬、DNAマイクロアレイ、説明書等を含む。cRNAフラグメントを得る為の試薬としては、反応試薬、酵素および緩衝液等が含まれる。
本発明のマーカー遺伝子を検出することによる間質性膀胱炎の検出方法は、各種間質性膀胱炎動物モデルの評価に用いることもできる。間質性膀胱炎動物モデルとしては、マウス、ラット、イヌ、サル、チンパンジーなどの哺乳動物が挙げられる。これらの動物の膀胱組織を採取し、前記(B)間質性膀胱炎を検出する方法に記載の方法でマーカー遺伝子の発現量を測定する。遺伝子発現量の変化量を指標として、間質性膀胱炎、特に潰瘍型間質性膀胱炎の動物モデルとしての妥当性評価を行うことができる。
なお、前記(1)および(2)記載の遺伝子は、ヒト由来の遺伝子配列である為、動物モデルにおいては使用する種のヒト遺伝子に相当する遺伝子をマーカーとして用いる。このような遺伝子としては、表4に示した遺伝子を利用することができる。
検体
潰瘍型IC患者(間質性膀胱炎患者の膀胱の非潰瘍部位)における膀胱粘膜の遺伝子発現変動プロファイルを検討するため、潰瘍型IC患者6例と対照5例(膀胱ガン患者の非腫瘍部位)の検体(膀胱粘膜生検サンプル)を収集した。膀胱粘膜生検サンプル(生検サンプル)は、当該研究への臨床検体の使用に関するインフォームドコンセントに基づき、患者本人または代理人の同意を得た上で採取されたものである。採取後の生検サンプルを速やかに十分量のRNAlater試薬(キアゲン社)に浸漬し、−80℃で安定的に保存した。適宜膀胱粘膜からRNeasy mini kit(キアゲン社)を用いてキアゲン社のプロトコルに従いtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAの濃度を常法に従って測定した後、−30℃にて冷凍保存した。
DNAマイクロアレイ法
アジレントテクノロジーズ社の試薬キット(Low RNA Fluorescent Linear Amplification kit、製品番号5188−5339)を用い、プロトコル(Low RNA Fluorescent Linear Amplification kit対応プロトコル)に従ってマイクロアレイ実験を行った。抽出したtotal RNA(200−1,000 ng)を用い、T7 promoter primerおよびMMLV−Reverse Transcriptaseの存在下において40℃、2時間反応させることにより相補的DNA(cDNA)を合成した。さらに得られたcDNAをもとにシアニン3(Cy3)−CTPおよびT7 RNA polymeraseの存在下において40℃、2時間反応させることにより、Cy3ラベル化相補的RNA(cRNA)を合成した。得られたcRNA(1650ng)をフラグメンテーション緩衝液中で60℃、30分反応させることによりフラグメント化した後、Whole Human Genome 44K DNA microarray(製品番号G4112F)に65℃で17時間ハイブリダイズさせた。その後Wash buffer1、Wash buffer2(製品番号5188−5327)およびアセトニトリル中で適宜洗浄した後、アジレント・マイクロアレイスキャナを用いて画像データを取得した。さらに画像解析ソフトFeature Extraction ver.8.5(アジレントテクノロジーズ社)により、発現量の定量データを算出した。
データ解析
個々のサンプルに対応する発現量の定量データファイルをGeneSpring ver.7.3(アジレントテクノロジーズ社)に取り込み、発現データを解析することによって、潰瘍型IC患者群において遺伝子発現に変化の認められる遺伝子の同定を試みた。具体的には潰瘍型IC群と対照群の二群の比較はPer Chip(各サンプルのraw signalの中央値による)正規化後、Per Gene(各プローブのraw signalの中央値による)正規化を行い、Volcano Plot Analysisにより、潰瘍型IC群の定量データを対照群の定量データで除することにより算出された相対的な遺伝子発現量比変化(発現量フォールド変化)及びt−testにおける有意差(p−value)に基づき、それぞれ発現量フォールド変化を4倍以上、p−value cutoffを0.001以下に設定することによって97遺伝子に対応するプローブを抽出した。さらにGeneSpring ver.7.3を用い、前記97遺伝子について階層的クラスタリング解析を行った。さらに目視による検討(マニュアル・インスペクション)を加えた。マニュアル・インスペクションによる選択の条件としては、次の4条件とした。1)正常な膀胱組織で安定して発現する遺伝子、2)潰瘍型間質性膀胱炎の膀胱組織中で安定して発現する遺伝子、3)相対的な遺伝子発現量が潰瘍型IC患者群において全例増加または対照群において全例低下している遺伝子、4)相対的な遺伝子発現量が潰瘍型IC患者群において全例低下または対照群において全例増加している遺伝子とした。その結果、潰瘍型IC患者群と対照群とを分離するマーカー遺伝子として表5に示したTNFSF14、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCR2、AZGP1およびOVOL1が見出された。
マーカー遺伝子の感度および特異性による評価
実施例3で見出したマーカー遺伝子について、カットオフ値を選定可能な範囲からマーカー遺伝子評価の為の任意の値(評価用カットオフ値)を求め、感度および特異度を指標としてマーカー遺伝子としての有用性を評価した。以下、評価の一例を示した。
実施例3で見出したマーカー遺伝子の評価用カットオフ値は、次の通り設定した。マイクロアレイにより、検体のマーカー遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の蛍光強度をマイクロアレイで測定して得られた検体の蛍光強度(Raw siganl強度)は、ハウスキーピング遺伝子の蛍光強度中央値との比を計算し、正規化(ノーマライゼーション)した。TNFSF14、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3およびCCR2については、間質性膀胱炎患者群における正規化された蛍光強度の最小値と対照群の正規化された蛍光強度の最大値との平均値を計算し、これを評価用カットオフ値とした。また、AZGP1およびOVOL1については、間質性膀胱炎患者群における正規化された蛍光強度の最大値と対照群の正規化された蛍光強度の最小値との平均値を計算し、これを評価用カットオフ値とした。各マーカー遺伝子における正規化された蛍光強度による評価用カットオフ値とその設定値から期待される感度および特異度を表6に示した。また、比較例として特許文献2記載の公知マーカー遺伝子であるウロプラキンIII(UPK3B)についても、感度および特異度を本発明のマーカー遺伝子と同様に算出し、表6に示した。
<配列表2>配列番号2は、ヒトCXCL9のDNAの配列である。
<配列表3>配列番号3は、ヒトCXCL10のDNAの配列である。
<配列表4>配列番号4は、ヒトCXCL11のDNAの配列である。
<配列表5>配列番号5は、ヒトCXCR3のDNAの配列である。
<配列表6>配列番号6は、ヒトCCR2のDNAの配列である。
<配列表7>配列番号7は、ヒトAZGP1のDNAの配列である。
<配列表8>配列番号8は、ヒトOVOL1のDNAの配列番号である。
<配列表9>配列番号9は、本発明のマーカー遺伝子の1つであるTNFSF14を検出する為のプローブの配列である。
<配列表10>配列番号10は、本発明のマーカー遺伝子の1つであるCXCL9を検出する為のプローブの配列である。
<配列表11>配列番号11は、本発明のマーカー遺伝子の1つであるCXCL10を検出する為のプローブの配列である。
<配列表12>配列番号12は、本発明のマーカー遺伝子の1つであるCXCL11を検出する為のプローブの配列である。
<配列表13>配列番号13は、本発明のマーカー遺伝子の1つであるCXCR3を検出する為のプローブの配列である。
<配列表14>配列番号14は、本発明のマーカー遺伝子の1つであるCCR2を検出する為のプローブの配列である。
<配列表15>配列番号15は、本発明のマーカー遺伝子の1つであるAZGP1を検出する為のプローブの配列である。
<配列表16>配列番号16は、本発明のマーカー遺伝子の1つであるOVOL1を検出する為のプローブの配列である。
<配列表17>配列番号17は、ラットTnfsf14のDNAの配列である。
<配列表18>配列番号18は、ラットCxcl9のDNAの配列である。
<配列表19>配列番号19は、ラットCxcl10のDNAの配列である。
<配列表20>配列番号20は、ラットCxcl11のDNAの配列である。
<配列表21>配列番号21は、ラットCxcr3のDNAの配列である。
<配列表22>配列番号22は、ラットCcr2のDNAの配列である。
<配列表23>配列番号23は、ラットAzgp1のDNAの配列である。
<配列表24>配列番号24は、ラットOvol1のDNAの配列である。
<配列表25>配列番号25は、マウスTnfsf14のDNAの配列である。
<配列表26>配列番号26は、マウスCxcl9のDNAの配列である。
<配列表27>配列番号27は、マウスCxcl10のDNAの配列である。
<配列表28>配列番号28は、マウスCxcl11のDNAの配列である。
<配列表29>配列番号29は、マウスCxcr3のDNAの配列である。
<配列表30>配列番号30は、マウスCcr2のDNAの配列である。
<配列表31>配列番号31は、マウスAzgp1のDNAの配列である。
<配列表32>配列番号32は、マウスOvol1のDNAの配列である。
Claims (11)
- TNFSF14、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCR2、AZGP1およびOVOL1から選択される少なくとも1種の遺伝子をマーカーとする間質性膀胱炎を検出する方法。
- 間質性膀胱炎が、潰瘍性間質性膀胱炎である、請求項1記載の方法。
- TNFSF14、CXCL10、AZGP1およびOVOL1から選択される少なくとも1種の遺伝子をマーカーとする、請求項1又は2記載の方法。
- 前記マーカー遺伝子から転写されるmRNAを調製する工程を含む、請求項1〜3の何れか一項記載の方法。
- mRNAから変換されるcDNAを調製する工程を含む、請求項4記載の方法。
- cDNAから転写される標識化されたcRNAを調製する工程を含む、請求項5記載の方法。
- 標識化されたcRNAをフラグメント化する工程を含む、請求項6記載の方法。
- 前記マーカー遺伝子を検出するためのプローブを用いる工程を含む、請求項1〜3の何れか一項記載の方法。
- 標識化されたcRNAのフラグメントとプローブとをハイブリダイズさせる工程を含む、請求項8記載の方法。
- 標識化されたcRNAのフラグメントの発現量をDNAマイクロアレイにより測定する工程を含む、請求項9記載の方法。
- TNFSF14、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCR2、AZGP1およびOVOL1から選択される少なくとも1種以上の遺伝子を検出するためのプローブを含む、間質性膀胱炎の検査キット。
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