CN114599801A - 用于测试肺癌风险的试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

描述了用于诊断形成肺癌的风险的试剂盒和方法及其用途。在第一方面，本文描述了肺癌风险测试试剂盒，其包括用于测量一组肺癌驱动基因中多个低VAF(限定为VAF<1％)突变体的试剂；和为此的说明书。

Description

用于测试肺癌风险的试剂盒和方法

相关申请的交叉引用

本申请是根据35USC§371下2020年9月8日提交的国际申请PCT/US2020/xxxxxx的国家阶段申请，该申请要求2019年9月8日提交的美国临时申请系列号62/897,343的权益，其全部公开内容通过引用明确并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的项目号CA086368和美国国家癌症研究所授予的Early Detection Research Network Sub-Award 0000921356的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

发明领域

本发明涉及用于测试肺癌风险的试剂盒和方法。

发明背景

肺癌是男性和女性癌症相关死亡的一个主要原因，吸烟是最重要的可预防风险因素。尽管有广泛的戒烟举措，但由于过去和持续的香烟使用，以及缺乏对晚期疾病的有效治疗，肺癌将在未来几十年继续成为最致命的癌症。

减少肺癌死亡的主要策略是通过减少接触烟草制品来预防，并通过年度低剂量CT(LDCT)扫描对高危受试者进行筛查，以在肺癌处于早期阶段和可治愈时诊断肺癌。每年的LDCT筛查显著降低肺癌死亡率。然而，目前根据人口统计标准推荐进行筛查的人群中肺癌风险存在很大的个体间差异。总体而言，在目前符合筛查标准的人群中，肺癌发病率较低(即<10％)，这与低阳性预测值和特异性有关。

然而，一个挑战是癌症包含许多独特的群体亚克隆。当敏感克隆被杀死时，选择提供抗性的突变来生存。

目前的策略是在产生抗性时重新取样并鉴定新的优势克隆。然而，鉴定抗性亚克隆和潜在驱动因素取决于测定的详细程度。此外，由于不精确性的多种来源，传统的NGS方法会产生信号伪象，从而难以鉴定变异等位基因分数(VAF)<2.5％的突变。

此外，临床NGS中不精确性的来源的一些非限制性示例包括由于涉及PCR扩增的文库制备(扩增子和杂交捕获)引起的技术错误，PCR扩增以对应于聚合酶失真性(～10^-4)的比率引入错误；以及测序引起的技术错误，其中每个下一代测序(NGS)平台都有与之相关的核苷酸替换错误率，这限制了其准确测序DNA链的能力。

临床NGS中不精确性的其他来源包括导致随机取样误差的样品量的变化。诊断样品可能是有限制的，因为例如，细针抽吸(FNA)产生的材料很少超出细胞学分析所需的材料；和/或核心活组织检查产生的结果很少超出组织学分析所需的材料。此外，循环肿瘤DNA(ctDNA)高度可变且依赖于疾病进展，因此可测量的基因组拷贝在血浆样品中通常有限。

临床NGS中不精确性的其他来源包括样品质量错误，其中DNA可能在处理过程中受损并导致更高比率的技术错误，不代表真正的生物学变异。例如，DNA损伤的来源发生在处理期间，包括保存细胞组织的***固定石蜡包埋(FFPE)方法，以及DNA提取和测序方案期间。许多证据表明FFPE损伤是***性的和时间依赖性的。

因此，需要标准化和质量控制来为低频变异检出(calling)提供实验室间协调。

例如，在最近的一项研究中，使用能够测量变异等位基因频率(VAF)>1.0％的突变的靶向NGS来评估来自一组受试者的肺癌组织和相邻匹配的正常组织中的驱动基因体细胞突变。密切靠近每种癌症的非癌肺组织中鉴定了大量已知是肺癌驱动因素的突变。因此，VAF>1％的突变测量可能支持开发用于流行肺癌的早期诊断和/或遗传表征的生物标志物。然而，克隆发生率随着距癌症部位的距离成比例地减少，在不受癌症影响的肺的正常气道或鼻上皮中很少有突变体。因此，这种方法不支持开发针对未来偶然肺癌风险的非侵入性测试。(Kadara H,Sivakumar S,Jakubek Y,San Lucas FA,Lang W,McDowell T,等人,Mutations in Normal Airway Epithelium Elucidate Spatiotemporal Resolution ofLung Cancer,Am J Respir Crit Care Med.,2019)。

因此，需要能够使NGS测量成为与肺癌风险高度相关的测试特征的组合以及更好地控制与NGS相关的定量和定性技术错误的方法和试剂盒。满足这些需求将允许根据肺癌风险对个体进行更准确的分层，从而降低与LCDT筛查相关的成本和危害。

发明概述

在第一方面，本文描述了肺癌风险测试试剂盒，包括用于测量一组肺癌驱动基因中的多个低VAF(定义为VAF<1％)突变体的试剂；和为此的说明书。

在一些实施方案中，试剂盒包括用于通过下一代测序测量在正常气道上皮细胞中多个基因中的表达和/或体细胞突变的试剂，该试剂盒包括：针对每个靶基因的PCR引物，针对每个靶基因的合成内标，和制备PCR产物作为用于下一代测序的文库的试剂。

在一些实施方案中，试剂盒包括用于通过下一代测序测量在正常气道上皮细胞中多个基因中的表达和/或体细胞突变的试剂，该试剂盒包括：针对每个靶基因的DNA捕获探针，针对每个靶基因的合成内标，和制备诱饵-捕获产物作为用于下一代测序的文库的试剂。

在一些实施方案中，VAF＜0.01％。

在一些实施方案中，VAF为约5×10-4(0.05％)。

在一些实施方案中，内标的纳入可靠地测量变异频率低至0.05％的突变，和不纳入内标情况下变异频率低至5％的突变。

在一些实施方案中，其中包含内标可靠地测量变异频率低至0.05％的突变。

在一些实施方案中，所述试剂盒或方法使得能够测量低至0.05％的VAF且无任何限制(即不纳入的情况为5％(5％without inclusion))。

在一些实施方案中，包括合成的内标。

在一些实施方案中，肺癌风险相关驱动基因包括以下中的一种或多种：TP53、PIK3CA、BRAF、KRAS、NRAS、NOTCHI、EGFR和ERBB2。

在一些实施方案中，肺癌风险相关驱动基因包括以下中的一种或多种：CDKN1A、E2F1、ERCC1、ERCC4、ERCC5、GPX1、GSTP1、KEAP1、RB1、TP63和XRCC1。

在一些实施方案中，在来自气道上皮细胞的RNA或DNA中测量分析物。

在一些实施方案中，在非侵入性获得的样本中测量分析物，所述样本包括呼出气凝结物和通过鼻刷获得的气道上皮细胞。

在一些实施方案中，每个试剂盒或方法提供用于测量一个或多个肺癌风险测试所包括的多个分析物所必需的试剂和说明书。

在一些实施方案中，每个试剂盒或方法用于测量在多个患者样本中每个测试所包括的每种分析物。

在另一方面，本文描述了诊断受试者是否处于发展肺癌的风险的方法。在一个实施方案中，该方法包括：

从受试者获得生物样品；

使用本文权利要求中任一项的任何一个试剂盒来测量生物样品中一组肺癌驱动基因的水平，从而获得物理数据以确定生物样品中的水平是否高于对照中的水平；

将生物样品中的水平与对照中的水平进行比较；

通过控制不精确性的来源、假阳性和假阴性来区分真突变和伪象；和，

如果物理数据表明生物样品中的水平与对照中的水平显著不同，则鉴定该受试者处于发展肺癌的风险。

在另一方面，本文描述了为被诊断患有肺癌的受试者确定可行的治疗建议的方法，包括：

从受试者获得生物样品以检测满足阈值标准为正值的至少一个特征，其使用与EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK1、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH 1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS基因杂交并对其扩增的一组探针，以检测满足阈值标准为正值的至少一个特征；和，

基于检测到的具有正值的至少一个阳性特征，为该受试者确定可行的治疗建议。

在另一方面，本文描述了治疗处于发展肺癌的风险的患者的方法，其中在医疗管理(例如，筛查肺癌和/或预防性治疗)之前，通过使用本文所请求保护的任一试剂盒评估发展肺癌的风险；和

对处于发展肺癌的低风险的患者进行常规的长期评估；并随后施用医学治疗；和，

对处于发展肺癌的高风险或受肺癌影响的患者进行预防性医疗管理或切除病灶的手术；和随后施用医学治疗。

在一些实施方案中，低VAF突变体的测量包括：

基于相对于已知数量的合成内标分子的样本分析物的测量，计算每个样本中每种分析物测量的检测限/定量限。

在一些实施方案中，所述方法包括进行以下步骤：

步骤1)多重梯度PCR，以使具有不同熔解温度的引物与特定靶标退火；

步骤2)单重PCR，然后进行定量和等摩尔混合，使得等量加载到测序仪上；和

步骤3)基于肺癌和肺癌变前病灶中的高发生率选择PCR靶标。

在一些实施方案中，诊断或评估包括以下中的一项或多项：肺癌的诊断，肺癌阶段的诊断，肺癌类型或分类的诊断，肺癌复发的诊断或检测，肺癌消退的诊断或检测，肺癌的预后，或肺癌对手术或非手术疗法的应答的评估。

在一些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。

在一些实施方案中，测试受试者已经接受过实体瘤切除术手术和/或化学疗法和/或放射治疗。

在一些实施方案中，所述方法还包括使患者接受进行性短期评估的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还包括使患者接受使用抗癌药物的疗法的步骤。

在另一方面，本文描述了所述试剂盒和方法用于促进FDA和其他监管机构批准在区域实验室中以试剂盒或方法形式进行肺癌风险测试的用途。

在另一方面，本文描述了所述试剂盒和方法用于促进FDA和其他监管机构批准在区域实验室中以试剂盒或方法的形式对癌细胞中突变的测量进行测试，然后指导癌症的靶向疗法的用途。

在另一方面，本文描述了所述试剂盒和方法用于促进FDA和其他监管机构批准在区域实验室中以试剂盒或方法形式对癌细胞中极低VAF(低至0.01％)突变的无独特分子指标(UMI)的测量进行测试，然后指导癌症的靶向疗法的用途。

在另一方面，本文描述了所述试剂盒和方法用于使得能够测量非侵入性获得的样本例如呼出气凝结物、支气管刷和/或鼻刷样本中的肺癌风险的用途。

在另一方面，本文描述了所述试剂盒和方法用于使得能够测量气道上皮细胞中非常低VAF突变的用途。

在另一方面，本文描述了所述试剂盒和方法用于测量癌细胞中的突变，然后指导癌症的靶向疗法的用途。

在另一方面，本文描述了所述试剂盒和方法用于测量正常气道细胞中这些基因的突变以确定癌症的风险的用途。

本发明的其他***、方法、特征和优点对于本领域技术人员来说在检查以下附图和详细描述后将是或将变得显而易见。旨在将所有这些附加***、方法、特征和优点包括在本说明书内，落入本发明的范围内，并受所附权利要求的保护。

附图简要说明

本专利或申请文件可以包含一幅或多幅彩色绘图和/或一幅或多幅照片。专利局将根据请求和支付必要费用提供具有彩色绘图和/或照片的本专利或专利申请出版物的副本。

图1A.在患者样本中鉴定的突变。样品突变信号对比IS测序错误。样品突变的变异等位基因频率(VAF)(红色三角形)相对于19个IS重复中相应核苷酸特异性错误变体的VAF(黑色圆圈)。VAF＝位点特异性变异等位基因读段/总等位基因读段。

图1B.显示随着VAF％的上升，CA和NC受试者之间的差异如何缩小，突出了检测具有超低VAF的变异的重要性。很可能一旦克隆将其VAF增加到显著大小，免疫***就会将其消除。因此，能够鉴定低VAF克隆可以区分那些处于肺癌高风险和低风险的。

图2A-2B.TP53突变平均发生率的群组间比较。图2A-在每个单独的TP53外显子5、6或7中每个群组内受试者中的平均突变发生率(突变/靶碱基/受试者)。图2B-组合的三个TP53外显子靶标的群组和取代特异性平均突变发生率。图2C-TP53热点位点处的突变数量。插图：根据突变类型的突变数量。突变定义为基于列联表分析，VAF(变异等位基因读段/总等位基因读段)>0.05％且显著高于IS背景VAF的突变。CA-SMK受试者中的TP53突变在“热点”肺癌驱动突变位点处显著富集。(p＝0.002)。

图3A-3B.受试者特异性突变发生率的群组间比较。(图3A)仅TP53外显子或(图3B)TP53外显子、PIK3CA和BRAF中，受试者特异性突变发生率的群组间比较。

图4A-4C.EGFR突变平均发生率的群组间比较。图4A-每个EGFR外显子(18、19、20或21)中每个群组内受试者中的平均突变发生率(突变/靶碱基/受试者)。图4B-组合的四个EGFR外显子靶标的群组和取代特异性平均突变发生率。图4C-EGFR热点位点处的突变数量。插图：根据突变类型的突变数量。突变定义为根据列联表分析，VAF(变异等位基因读段/总等位基因读段)>5x10^-4(0.05％)且显著高于IS背景VAF的突变。

图5.Qiagen CLC基因组学工作台设置。

图6.如何设计用于NGS的内标(IS)添加(spike-in)分子的示意图。

图7.对于不同类型的序列变异，天然模板组和内标组观察到的序列变异的频率。

图8.四次重复的内标误差，显示个体重复误差和平均误差。

图9A.外显子EGFR_18(红色)、EGFR_20(蓝色)和EGFR_21(绿色)的混合捕获面板，显示IS频率(％)。

图9B.NT频率(％)显示了外显子EGFR_18(红色)、EGFR_20(蓝色)和EGFR_21(绿色)的重复测量、空白限(LOB)和变异等位基因频率。在没有内标的情况下，空白限(LOB)计算基于所有核苷酸位置处的所有变体类型的平均错误频率。这有效地提高了检测限(LOD)并防止对VAF<5％的变体进行统计确定。

图9C.内标使得能够计算每个核苷酸位置处的每种变体类型的空白限(LOB)，从而提供检测限(LOD)的位点特异性测定。这允许在LOB足够低的位置处鉴定VAF<1％的变体。

图9D.外显子EGFR_18(红色)、EGFR_20(蓝色)和EGFR_21(绿色)的预期NT、报告NT和报告IS的比较。

图10.将内标应用于片段化的FDA样品。

图11.跨19个内标重复的TP53(外显子6)处的转换测序错误，显示了TP53反式激活结构域、TP53 DNA结合结构域和TP53四聚化结构域的变异等位基因频率。

图12.样品7中的TP53(外显子6)转换变体。

图13. 19个患者样本中相对于IS的突变。

发明详述

在整个本公开内容中，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过显示引用来引用。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容在此通过引用并入本公开内容，以更全面地描述本发明所属的现有技术。

定义和缩写

AEC-气道上皮细胞

CA-SMK-癌症受试者、吸烟者

COSMIC-癌症中体细胞突变的目录

FASMIC-癌症中体细胞突变的功能注释

FDA-食品和药物管理局

HUGO-人类基因组组织

IS-内标，合成DNA

ISM-内标混合物

LCRT-肺癌风险测试

LDCT-低剂量计算机断层扫描

NC-NON-非癌症受试者、非吸烟者

NC-SMK-非癌症受试者，吸烟者

NC-TOT-非癌症受试者、非吸烟者+吸烟者(所有非癌症受试者)

NGS-下一代测序

NT-天然模板，来自样本DNA的靶向区域

PCR-聚合酶链式反应

SNP-单核苷酸多态性

VAF-变异等位基因频率

TCGA-癌症基因组图谱

“基因”是基因组中的一个或多个核苷酸序列，它们一起编码一种或多种表达的分子，例如RNA或多肽。基因可以包括被转录成RNA的编码序列，该RNA随后可以被翻译成多肽序列，并且可以包括协助基因复制或表达的相关结构或调控序列。

标志物、探针或引物的“组/集合”指标志物探针、引物或从其衍生的数据的集合或组，用于共同目的(例如，评估个体发展癌症的风险)。经常地，对应于标志物、探针或引物的数据，或源自它们的使用的数据，存储在电子介质中。虽然组中的每个成员都具有针对特定目的的效用，但从该组中选择的单个标志物以及包括一些但不是所有标志物的子集在实现特定目的方面也是有效的。

如本文所用，“样本”可以指为分析而收集的材料，例如培养物拭子，一小撮组织，活检提取物，体液例如唾液、血液和/或尿的小瓶等，从任何生物实体获取用于研究、诊断或其他目的。

样本还可以指通常在活检例如内窥镜活检(使用刷子和/或镊子)、针吸取活检(包括细针吸取活检)中收集的量，以及分选细胞群(例如，流式分选的细胞群)和/或显微解剖材料(例如，激光捕获的显微解剖组织)中提供的量。例如，疑似癌性病灶的活检，通常通过细针吸取(FNA)活检进行，骨髓也通过活检获得，并且脑组织、发育胚胎和动物模型可以通过激光捕获显微解剖的样品获得。

如本文所用的“生物实体”可以指能够携带核酸的任何实体，包括任何物种，例如病毒、细胞、组织、体外培养物、植物、动物、参与临床试验的受试者，和/或被诊断或治疗疾病或病况的受试者。

如本文所用，“样品”可以指用于给定的测定、反应、运行、试验和/或实验的样本材料。例如，样品可以包括所收集的样本材料的等分试样，直至并包括所有样本。如本文所用，术语测定、反应、运行、试验和/或实验可以互换使用。

在一些实施方案中，收集的样本可包含少于约100,000个细胞、少于约10,000个细胞、少于约5,000个细胞、少于约1,000个细胞、少于约500个细胞、少于约100个细胞、少于约50个细胞，或少于约10个细胞。

在一些实施方案中，评估、评价和/或测量核酸可以指提供对样本和/或样品中核酸量的测量，例如，以确定基因的表达水平。在一些实施方案中，提供量的测量是指检测目标核酸的存在或不存在。在一些实施方案中，提供量的测量可以指定量核酸的量，例如，提供存在的核酸量的浓度或程度的量度。在一些实施方案中，提供核酸量的测量是指计算核酸的量，例如，指示样品中存在的核酸分子的数量。“目标核酸”可以被称为“靶”核酸，和/或“目标基因”，例如被评估的基因，可以被称为靶基因。核酸分子的数量也可以称为在样品和/或样本中发现的核酸的拷贝数。

如本文所用，“核酸”可以指任何长度的核苷酸和/或核苷酸样分子的聚合形式。在某些实施方案中，核酸可以用作合成互补核酸的模板，例如，通过碱基互补掺入核苷酸单元。例如，核酸可以包含天然存在的DNA，例如基因组DNA；RNA，例如mRNA，和/或可以包含合成分子，包括但不限于以任何方式产生的cDNA和重组分子。例如，核酸可以由化学合成、逆转录、DNA复制或这些产生方法的组合产生。亚基之间的连接可以由磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯等或由非磷酸酯基团提供，例如但不限于肽核酸(PNA)中使用的肽型连接。连接基团可以是手性或非手性的。多核苷酸可以具有任何三维结构，包括单链、双链和三螺旋分子，这些分子可以是例如DNA、RNA或杂合DNA/RNA分子。

核苷酸样分子可以指可以基本上像核苷酸一样起作用的结构部分，例如表现出与DNA或RNA中出现的一个或多个碱基的碱基互补性和/或能够碱基互补掺入。术语“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“核酸分子”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”在本文中可以与“核酸”互换使用。在一些具体实施方案中，待测量的核酸可以包含对应于特定基因的序列。

在一些实施方案中，收集的样本包含待测量的RNA，例如，在组织培养物中表达的mRNA。在一些实施方案中，收集的样本包含待测量的DNA，例如从转录物逆转录的cDNA。在一些实施方案中，待测量的核酸以其他核酸分子的异质混合物提供。

如本文所用，术语“天然模板”可指直接或间接从可用作扩增模板的样本获得的核酸。例如，它可以指对应于要测量其表达的基因的cDNA分子，其中cDNA被扩增和定量。

术语“引物”通常是指当条件适合于引物延伸产物的合成时，能够充当沿互补链的合成起始点的核酸。

一般说明

本文描述了用于评估样品中核酸量的试剂盒和方法。在一些实施方案中，该方法允许测量少量核酸，例如，核酸在样本中以低量表达、少量核酸保持完整和/或提供少量样本的情况下。

用于NGS的内标(IS)添加分子的设计

首先参考图6，显示了如何设计用于NGS的内标(IS)添加分子的示意图。

IS是除了已知的一个或多个核苷酸变化外，与靶分析物同源的合成DNA分子。

IS设计目标：与靶标分析物DNA天然模板(NT)表现相同但可区分

IS用途：1)定量文库制备物中每种靶分析物NT的可测量基因组拷贝，以及2定量和表征核苷酸位点特异性技术错误

IS实施：1)在NGS文库制备之前以1:1的基因组拷贝比将样品DNA与已知数量的IS分子混合；2)共扩增IS+NT混合物；3)制备测序文库；和，4)对样品测序。

内标“添加分子”是定制的perl脚本，它使用一个或多个核苷酸变化将IS读段与样品读段分开。天然模板(NT)中的错误谱在内标(IS)中几乎相同。

因此，IS控制文库特异性错误谱，如图7所示，其显示了对于不同类型的序列变异，天然模板组和内标组观察到的序列变异的频率。

另外，如图8所示，核苷酸特异性技术错误是可重现的。图8显示了四次重复的内标错误，显示了个体重复错误和平均错误。每个NT碱基位置的核苷酸特异性技术错误与相应的IS位置相匹配。此外，DNA图景影响区域间和核苷酸间的测序错误→IS和NT表现方式相同。

因此，将IS添加到每个反应中可以控制文库制备中的变异(例如，干扰物质、组内和组间杂交效率、连接效率、扩增)。

内标还控制不精确性的来源，使每个核苷酸处的置信区间都较窄：核苷酸特异性错误频率；平台特异性错误和聚合酶特异性错误。

图9A-9D显示内标能够实现位点特异性LOD(几率的对数)。图9A显示了外显子EGFR_18(红色)、EGFR_20(蓝色)和EGFR_21(绿色)的混合捕获组，显示了IS频率(％)。图9B-9C显示了NT频率(％)，显示了外显子EGFR_18(红色)、EGFR_20(蓝色)和EGFR_21(绿色)的重复测量、LOB和变异等位基因频率。图9D显示了外显子EGFR_18(红色)、EGFR_20(蓝色)和EGFR_21(绿色)的预期NT、报告的NT和报告的IS的比较。因此，图9A-9D显示基于外部过程性能估计的传统方法不支持<5％的VAF测量。此外，替代校正方法很复杂，并且需要多10到20倍的测序读段。

图10显示了将内标(IS)应用于片段化的FDA样品。基于由内标(IS)确定的位点特异性LOB，用LOD鉴定的已知突变。

多重梯度PCR使得具有不同熔解温度的引物能够与特定靶标退火。单重PCR，然后是定量和等摩尔混合，可以将等量加载到测序仪上。基于肺癌和肺癌变前病灶中的高发生率选择PCR靶标。

在竞争性多重PCR扩增子NGS文库制备之前，为各种肺癌驱动基因中的每一个制备合成DNA内标(IS)，并与每个AEC基因组(gDNA)样本混合。开发了定制Perl脚本，用于将来自每个靶标的IS读段和相应的样本gDNA读段分离到单独的文件中，以进行并行变异频率分析。这种方法能够可靠地检测VAF低至5x10^-4(0.05％)的突变。然后将该方法应用于回顾性病例对照研究。具体而言，通过支气管镜刷活检从19名受试者的正常气道收集AEC标本，其中包括11名肺癌病例和8名非癌症对照，并测试了肺癌风险与AEC驱动基因突变的关联。

图11是跨19个内标(S)重复的TP53(外显子6)的转换测序错误的示例，显示了TP53反式激活结构域、TP53 DNA结合结构域和TP53四聚化结构域的变异等位基因频率(VAF)。

图12是样品中TP53(外显子6)的转换变体的示例，显示了TP53反式激活结构域、TP53 DNA结合结构域和TP53四聚化结构域的变体等位基因频率(VAF)。

图13显示了19个患者样本中相对于IS的突变。在19个患者样本中鉴定出129个显著变异。这些变体的VAF范围从0.05％到0.46％。在11个癌症样本中发现了99个变体。在8个非癌症样本中发现了30个变体。此外，与没有癌症的吸烟者相比，患有癌症的吸烟者的变体显著增加。

本文描述了试剂盒或方法，其包括用于在肺癌风险测试中测量分析物的试剂和说明书。

该试剂盒或方法纳入了用于测量分析物的试剂，这些分析物之前没有被描述为包括在肺癌风险测试中。

具体而言，肺癌风险测试(LCRT)试剂盒或方法包括用于测量肺癌驱动基因中的多个低变异等位基因频率(VAF){即VAF<0.01ll-.0％l)突变体，所述肺癌驱动基因包括TP53、PIK3CA、BRAF、KRAS、NRAS、NOTCHI、EGFR和ERBB2。

可以纳入用于诸如CDKN1A、E2F1、ERCC1、ERCC4、ERCC5、GPX1、GSTP1、KEAP1、RB1、TP53、TP63和XRCC1的基因的其他试剂。

这些分析物可以在来自气道上皮细胞的RNA或DNA中测量，并且可以在非侵入性获得的样本(包括呼出气凝结物和通过鼻刷获得的气道上皮细胞)中测量。

本文还描述了用于测量低VAF突变体的方法，基于相对于已知数量的合成内标分子的样本分析物的测量，计算测量每个样本中每种分析物测量的检测限/定量限。

在某些实施方案中，这些试剂盒和方法可用于促进FDA和其他监管机构批准在区域实验室中以试剂盒或方法形式进行肺癌风险测试。

在某些实施方案中，这些试剂盒和方法可用于使得能够测量非侵入性获得的样本，例如呼出气凝结物、鼻刷样本、痰、口腔上皮、血液等中的肺癌风险。

在某些实施方案中，这些试剂盒和方法可用于使得能够测量气道上皮细胞中非常低的VAF突变。

实施例

本文所述的方法和实施方案在以下实施例中进一步定义，其中所有份数和百分比均以重量计，并且度数为摄氏度，除非另有说明。本发明的某些实施方案在本文的实施例中定义。应当理解，这些实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但仅以示例说明的方式给出。通过本文的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。

0.05-1.0％VAF范围内的突变的测量使得能够对与癌症风险相关的AEC体细胞突变进行更多信息分析。在肺癌受试者中，与吸烟和年龄相匹配的非癌症受试者相比，TP53突变对于吸烟和年龄特征更为普遍(p<0.05)并且显著更富集。

方法

研究群组纳入和表征。

对于这项回顾性病例对照研究，使用了从19名受试者收集的AEC样本，包括11名患有肺癌的吸烟者(CA-SMK)、5名年龄和吸烟史相匹配的无癌症吸烟者(NC-SMK)，以及3名没有癌症的非吸烟者(NC-NON)(表1)。

受试者在2000年至2018年期间参加了托莱多大学医学中心(UTMC)的研究试验。本研究中包括的每个受试者都根据托莱多大学机构审查委员会批准的协议提供了书面知情同意书。从医学病历中获得临床特征，包括肺癌诊断、吸烟史和人口统计信息。肺癌组织学经过解剖和临床病理学认证的独立病理学家审查和确认。

样本采集

在根据护理指示标准进行的诊断程序时，通过正常出现的气道上皮的支气管镜刷活检获得AEC。对于诊断为肺癌的患者，AEC的采样来自与癌症无关的肺主支气管。标本立即放入冷盐水中，并在收集一小时内进行处理。

DNA提取和定量

根据制造商方案，使用FlexiGene DNA试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从每个受试者大约500,000个AEC中提取基因组DNA(gDNA)，并使用在分泌珠蛋白家族1A成员1基因中充分表征的基因组基因座的竞争性聚合酶链式反应(PCR)扩增进行定量。

靶标选择

癌症基因组图谱(TCGA)项目最近报道的七个基因区域中的12个基因座在非小细胞肺癌中最常突变，选择为靶标。根据人类基因组组织(HUGO)名称指定的带外显子编号和括号中提供的缩写的靶标区域，包括B-Raf原癌基因外显子15(BRAF_15)、表皮生长因子受体外显子18-21(EGFR_18、EGFR_19、EGFR_20、EGFR_21)、erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)、KRAS原癌基因外显子2(KRAS_2)、notch受体1外显子26(NOTCH1_26)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α外显子10(PIK3CA_10)和肿瘤蛋白p53外显子5-7(TP53_5、TP53_6、TP53_7)。为这些目标中的每一个开发了引物。

除NOTCH1_26之外的所有靶标的引物在多重和下游文库制备中有效执行。因此，报告了其余11个靶标的数据。

合成内标混合物制备

上述用于TCGA靶标的竞争性合成DNA内标(IS)分子设计为具有相对于靶标分析物天然模板(NT)的每50个碱基的已知二核苷酸取代突变。这使得在本研究中使用的PCR扩增子文库或其他正在进行的研究(此处未报告)中的随机片段杂合捕获文库的测序后数据处理期间，能够分离NT和IS读段。IS被克隆到质粒中，并选择纯克隆分离物，使用Sanger测序确认以验证最终序列。采取这一额外的纯化步骤来选择没有任何由合成引入的潜在错误的克隆。由于内源性大肠杆菌聚合酶的高保真度，克隆的IS中变体的频率可预计为10^-7至10^-8—远低于本研究所需的检测限。将每个克隆的质粒线性化，通过数字液滴PCR进行定量，然后以相等的基因组拷贝平衡组合。由Accugenomics,Inc.(Wilmington,NC)制备了含有等浓度(每个基因组拷贝)每个线性化靶标分析物IS分子的内标混合物(ISM)。

在组合的文库制备和测序步骤期间，合成IS中发生技术上衍生的碱基取代错误的发生率与gDNA测试样品中的相应靶序列中相同。因此，每个IS控制靶标特异性位点和碱基替换错误率的区域差异。

多重竞争性PCR扩增子文库

为了扩增样品中的每个靶标并最大化检测到低频变体的机会，为每个AEC DNA样品制备了多重竞争性PCR扩增子文库。对条件进行了优化，以最小化PCR期间的技术错误，包括使用报告的错误频率为10^-6的Q5 HotStart高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)和最小化每轮的PCR循环。

第1轮：竞争性多重PCR

由Life Technologies(Carlsbad,CA)合成了十二种具有通用尾部的靶标特异性引物。通过将TE缓冲液(10mM Tris-Cl，pH 7.4，0.1mM EDTA)添加到冻干的引物中以制备100μM储备溶液，为每种靶标创建单独的引物溶液。通过混合5μL的每100μM正向和反向引物储备溶液并用TE缓冲液使最终体积达到200μL，制备2.5μM多重引物混合物。

对于每个受试者，将AEC DNA的等分试样与ISM的相等基因组拷贝组合以控制在文库制备和/或测序期间发生的核苷酸特异性取代错误。准备在混合物中含有样品和IS两者的至少50,000个基因组当量的反应，混合物为6μL 5X Q5缓冲液(New England Biolabs，Ipswich，MA)，0.6μL 10mM dNTP(Promega，Madison，WI)，3μL 2.5μM多重引物混合物，1.5μL2％w/v牛血清白蛋白(New England Biolabs，Ipswich，MA)，0.3μL Q5 HotStart高保真DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich，MA，Ipswich，MA)，和分子级水，至最终反应体积为30μL。

每种竞争性多重反应混合物在7500Fast Real-Time PCR System(AppliedBiosystems,Foster City,CA)中在改良的梯度PCR条件下扩增总共20个循环：95℃/2min(Q5 HotStart DNA聚合酶激活)；94℃/10秒(变性)、70℃/10秒、68℃/10秒、66℃/10秒、64℃/10秒、62℃/10秒(退火)，和72℃/30秒(延伸)的20个循环；最后延伸的72℃/2min延伸，以确保所有产物完全延伸。根据制造商方案，使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen,Hilden,Germany)对PCR产物进行柱纯化。

第2轮：单重PCR

在多重扩增之后，使用每种分别靶标的引物(终浓度为500nM)进行第二轮12个平行单重PCR反应，以确保对于多重中效率较低的引物进行产物的稳健扩增。如上所述使用高保真Q5热启动聚合酶和其他PCR试剂。

在7500快速实时PCR***(Applied Biosystems,Foster City,CA)中使用以下条件将单重反应扩增15个循环：95℃/2min(Q5聚合酶活化)；94℃/10秒(变性)、65℃/20sec(退火)和72℃/30sec(延伸)的15个循环；最后延伸的72℃/2min延伸，以确保所有产物完全延伸。根据制造商方案(Agilent Technologies,Deutschland GmbH,Waldbronn,Germany)，使用带有DNA 1000试剂盒试剂的DNA芯片，使用Agilent 2100生物分析仪检查每个单重PCR产物的质量和量。然后，样品特异性单重反应(a)以等摩尔量混合以确保测序读段计数中靶标读段的相等平衡和(b)根据制造商方案使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Hilden，Germany)进行柱纯化。

第3轮：添加样品特异性的条形码

使用一组独特的双索引条形码引物标记来自每个患者样品的单重反应的柱纯化混合物，以降低对测序读段错误索引/条形码的可能性。设计了一对包含条形码序列和Illumina引发位点的融合引物，其中：1)它们的3'端与在初始多重和单重反应期间添加的通用序列尾部互补，2)在其5'，10-核苷酸索引/条形码序列，以及(3)在其5'，IlluminaRead 1或Read 2引发位点。每个反应中条形码引物的最终浓度为500nM。PCR条件与单重反应所描述的条件相同，只是循环数减少到10。

根据制造商方案，使用带有DNA 1000试剂盒试剂的DNA芯片，使用Agilent 2100生物分析仪检查PCR产物的质量和量，并用分子级水稀释100倍以输入到最终测序衔接物PCR中。

第4轮：添加测序衔接物

使用第二组融合引物用Illumina平台特异性衔接物标记单独稀释的条形码样品，该第二组融合引物设计为具有其3'端与Illumina Read 1或Read 2引发位点互补和5'Illumina测序衔接物，使用与第3轮中使用的相同PCR条件。

样品合并

在第4轮之后，如上所述，在Agilent 2100生物分析仪上对每个独特条形码化的样品进行定量。然后将样品以等摩尔比混合，以优化每个文库最终接收的测序读段的百分比；在大多数情况下，使用1:1。

产物纯化和测序

使用凝胶电泳在2％w/v琼脂糖凝胶上纯化组合的测序文库。然后切出所得产物条带，将其与不需要的异二聚体分离，使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，Hilden，Germany)进行提取，并在50μL洗脱缓冲液中洗脱。纯化的测序文库被送到密歇根大学基因组学核心设施，用于在Illumina NextSeq 550测序仪上进行下一代测序。

NGS数据的分析

由密歇根大学基因组学核心设施生成的FASTQ数据文件使用定制Perl脚本进行处理，以将内标(IS)和天然模板(NT)读段分离为分开的NT和IS文件，然后使用Qiagen CLCGenomics Workbench 12软件套件并行分析，用于质量修整、比对和变异检出，如图5所示。

引物序列、内标二核苷酸位置以及它们的5'和3'碱基以及已知的单核苷酸多态性(SNP)位置被排除在变体分析之外。

变体检出

基于NT信号检出变体，所述NT信号显著高于在IS中针对每个相应位置处的相应突变类型测量的背景错误。使用列联表卡方分析对每个核苷酸位置的每个单独变体类型确定显著性，以识别合并样品中的稀有变体。为了最大化高于噪声的信号的测试严格性，如果样本中变异读段与野生型读段的比例显著高于与相应的样本混合的IS中同一位点处的变异读段与野生型读段的比例，也高于在与其他18个样本中的每一个混合的IS中观察到的比例，则检出变异。因此，仅当样本中变异读段与野生型读段的比例显著高于19个IS复制中的每一个时，才将样本中的每个变体视为真阳性(p<0.05)。基于评估的核苷酸数量(760bp)和每个核苷酸位置处可能的取代突变数量，使用Bonferroni校正用于假发现。此外，为了避免来自随机抽样的潜在分析变化，仅检出具有高于IS噪声的显著信号和VAF>0.05％的突变。

变体注释和热点分析

使用包括dbSNP、COSMIC和FASMIC在内的公开可用的数据库来表征被检出的变体的致病性。使用在Menorial Sloan Kettering(MSK)癌症中心开发的cBioPortal forCancer Genomics评估已知致癌热点的识别和相应图的生成。

统计分析

使用R:A Language and Environment for Statistical Computing(www.R- project.org/)进行基于在每个核苷酸位置的每个单独变体类型的列联表卡方分析的变体检出。使用卡方分布的Kruskal-Wallis检验对检出的变体的热点富集进行评估。基于突变类型和靶标的突变发生率使用Kruskal-Wallis检验和Nemenyi检验(用于多重比较)来评估。

结果

对非癌气道上皮中低频突变的测量

在这项对来自19名受试者的正常气道的AEC样本中的11个驱动基因靶区域的研究中，有129个检出的变体具有VAF范围从5x10^-4(0.05％)至4.6x10^-3(0.46％)。如方法部分所述，使用0.05％的VAF最小阈值来最小化随机采样导致的错误发现的风险。在129个被检出的变体中，同一位点的相应变体的样品突变信号(Mutation VAF)和背景技术错误(噪声)(IS VAF)之间的关系如图1A所示。

对于每个样品突变VAF，显示了19个IS的IS VAF。这些代表了与包含突变的样品混合的IS的VAF，以及与其他18个样品混合的每个IS的VAF。这些19个独立的IS重复值显示了实验中IS VAF(错误)测量值周围的变异。IS VAF值的重复间变异随着IS VAF的降低而增加，这与泊松分布对随机取样的影响一致。

此外，由于这些位点中的一些位点的技术错误非常低，因此没有IS VAF值(图1A)。

泊松分布的这些影响对观察到的样品突变的显著性的统计分析提出了挑战。如果所有四个组成部分(样品参考和变异等位基因，以及IS参考和变异(错误)等位基因)至少有10个测序读段，则简单的Z分数分析是合适的。使用0.05％的最小样本突变VAF确保每个检出的样品突变的至少10个变异等位基因读段。然而，当相应的IS错误非常低时，IS变异等位基因读段计数低于10，有时甚至为零。

如果对于每个IS重复有至少一个变体等位基因读段，则使用泊松精确检验将是合适的。在本研究中，由于目标热点区域的IS错误非常低，以至于对于某些测量，对应于观察到的样品变体的IS变体读段为零，即使采用深度测序，使用列联表方法来确定本研究中的每个样品突变的显著性也是有利的。

图1B显示在AEC中可检测到的TP53突变取决于VAF(％)检测的检测下限。

先前未发现在气道上皮细胞中测量肺癌风险的TP53突变测试的一个关键原因是，尽管努力这样做，但常用方法不能可靠地测量VAF<1％的突变。

靶向区域中测序错误的特征

如图1A所示，在检出样品变体的靶标区域内位点处的最大测序错误(重复的中值IS VAF)为0.06％。该错误率远低于在Illumina平台上观察到的全外显子组测序错误率。此外，正如其他人所报道的，这是一个关键因素，它使得能够有意义地检出低频变体，而无需采用具有伴随成本和计算要求的独特分子索引(UMI)的方法。

AEC中低频突变的发生率

突变发生率被计算为每个靶标评估的每个核苷酸位置的检出突变。根据引物跨越的区域和由于IS中的修饰以使IS读段与NT读段分离而阻止分析的二核苷酸位点的数量，对每个靶标评估的核苷酸数量有所不同。在所有19名受试者中，每个受试者的靶标DNA区域(760bp)的平均突变发生率(突变/bp/受试者)为8.9x10^-3。(表2)。

该AEC突变发生率值远高于针对仅检测具有相对高变异频率(VAF>1％)(14)或更敏感但非靶向的突变体的方法所报道的值。然而，它与使用基于PCR的高灵敏度方法对AEC进行的其他分析是一致的。

TP53、PIK3CA和BRAF中低频取代突变与肺癌的关联

在三个测量的TP53外显子中，相对于吸烟和年龄匹配的NC-SMK受试者，来自CA-SMK受试者的AEC中取代突变的发生率(突变/bp/受试者)高10.4倍(p<0.05)(图2A，表3)。

此外，在7名癌症受试者和非癌症受试者中观察到PIK3CA或BRAF突变(表3)。

值得注意的是，TP53(图2C)中的大多数突变、PIK3CA中的所有突变和BRAF中的三个突变之一发生在先前确定的与驱动癌发生的生物学变化相关的“热点”中。

为了实现开发可能有助于改善肺癌风险确定的生物标志物的目标，我们评估了这些低频突变的发生率的受试者特异性群组间差异。根据在这项小型回顾性病例对照研究中获得的数据，0.02突变/bp的TP53外显子突变发生率截留值将具有100％特异性和55％的灵敏性(图3A)。当TP53外显子突变与PIK3CA和BRAF突变组合时观察到类似的区别(图3B)。

CA-SMK受试者中几乎所有的TP53突变都是烟草特征或年龄相关突变(C>A、C>T和T>C取代)(图2B，表4)，非常接近对于肺癌组织报告的TP53突变谱。癌症受试者中每种类型的烟草或年龄特征TP53突变的发生率显著高于非癌症受试者，包括C>A(p＝0.002)、C>T(p＝0.003)和T>C(p＝0.001)(表4)。

例如，虽然C到A突变占CA-SMK受试者的AEC中观察到的TP53突变的29.8％(17/57)，但在所有非癌症受试者(NC-TOT)观察到仅一个C到A的TP53突变(表4)。在本研究中，C>T转换占肺癌受试者TP53突变的47％。此外，CA-SMK受试者中的TP53突变在“热点”肺癌驱动突变位点处显著富集(p＝0.002)(图2C)。

TP53突变与吸烟史缺乏关联

值得注意的是，在非癌症受试者中，吸烟与较高的TP53突变发生率无关(表3)。具体来说，只有一半的NC-SMK受试者具有VAF>0.05％的TP53突变，并且在每种情况下，仅观察到一个变体(表3)。由于PIK3CA和BRAF突变数量少，因此无法建立吸烟关联。

与肺癌无关的低频AEC突变的特征

与TP53相比，在非TP53靶标处，突变发生率在癌症中与非癌症受试者相比没有显著差异(表3)。在测量的11个靶标中，EGFR_20靶标区域中的突变计数最高，在所有受试者中总共观察到43个突变(表3)。癌症和非癌症之间的EGFR_20突变发生率没有差异(分别为3.9x10^-2vs 3.8x10^-2；p＝0.72)(图4A，表3)，吸烟和非吸烟之间没有关联(分别为3.4x10^{- 2}vs 4.5x10^-2；p＝0.74)。ERBB2突变(N＝17)显示出与EGFR_20的相似的谱，没有年龄或烟草特征突变模式，并且在群组之间没有差异。值得注意的是，与TP53中C>T转换的高比例(29/61；48％)相反，只有1/43(2.3％)的EGFR_20突变和1个ERBB2突变是C>T(图3B)。此外，大多数EGFR_20突变是同义的并且不被预测为致病性的(图3C)。

讨论

AEC中低频突变的测量

在本研究中测量AEC中低频突变的能力是由于所靶向的区域中的低技术错误(图1)，和使用合成内标来控制基于位点和变异特异性的技术错误(图1)。本研究中受试者的AEC中低频TP53突变的发生率范围与先前报道的相似。驱动突变位点和吸烟特征中TP53突变的富集提供了另一个验证来源，即观察到的突变是真阳性。

鉴定与肺癌风险相关的TP53突变场效应

与吸烟和年龄匹配的NC受试者相比，CA受试者的AEC中低频TP53热点致病性吸烟和年龄特征突变的较高发生率代表了与肺癌风险密切相关的损伤领域(图2A，图2B、图3A、表3、表4)。

因此，低频率(即，VAF<1％)的结果表明AEC中的TP53热点突变是肺癌风险生物标志物。此外，包含BRAF和PIK3CA中低频可操作突变可以进一步提高该生物标志物的准确性(图3B)。

肺癌易感性部分归因于对与吸烟相关的DNA损伤和与年龄相关的DNA复制错误的次优保护。有证据表明遗传性和获得性原因导致AEC对DNA损伤的保护效果次优。例如，AEC中关键DNA修复、抗氧化和细胞周期控制基因的调控存在较大的个体间变化，基于这种变化的肺癌风险测试(LCRT)对肺癌受试者的识别具有高的准确性。

LCRT生物标志物中的变量之一是TP53转录物丰度，并且在AEC中TP53表达有100倍的变化。TP53在对DNA损伤应答而上调DNA修复基因方面起关键作用，TP53蛋白直接调节AEC中的关键核苷酸切除修复(NER)基因ERCC5。

rs2296147(ERCC5的5'-调控区中的TP53识别位点)处的种系等位基因变异与AEC中ERCC5等位基因特异性表达的变异相关。TP53对ERCC5转录调控的遗传性个体间变异的作用是显著的，因为ERCC5是转录偶联NER中的限速酶，与吸烟相关的突变是由于对烟草烟雾致癌物代谢物与转录链上鸟嘌呤的环外N2位结合而产生的DNA加合物的NER效率低下造成的。

因此，由遗传的种系变异确定的TP53对ERCC5的次优调节是导致癌症受试者中TP53转录链中烟草烟雾诱导的热点突变的较高发生率的重要因素。

解读非致病性EGFR突变

对于EGFR总突变或者吸烟特征或年龄特征突变，癌症和非癌症受试者或吸烟者和非吸烟者之间的发生率没有差异(图4A，图4B；表2，表3)。取代模式(在C>A和C>G之间均匀分布)与先前描述的特征3最一致，其与次优同源重组DNA双链断裂修复相关。此外，本文提供的证据支持观察到的EGFR外显子20突变不赋予生长优势的结论。

具体而言，与观察到的非同义致病性TP53吸烟和年龄相关突变相比，只有1/43的EGFR_20突变是同义的并且存在于已知的致病热点处(图4C)。

现在认为具有这种类型突变的克隆群体可能作为干细胞增殖(以在胎儿-幼年期间产生气道上皮)中的随机DNA复制错误发生。

使用能够检测低至5x10^-5(0.005％)的VAF的高灵敏度错配PCR测定来测试烟草烟雾对非癌症患者的AEC中低VAF体细胞突变的发生率的影响，包括TP53、KRAS和HPRT1基因中的突变。令人惊讶的是，在这些非癌症受试者中，吸烟对AEC中TP53或KRAS突变的发生率没有影响。

现在还认为，在没有肺癌的个体中，无论是吸烟者还是非吸烟者，气道上皮中的大多数低频突变是在胎儿/新生儿期组织发育期间发生的细胞复制相关随机突变事件的结果。

靶向性化学预防的生物标志物

目前，没有针对肺癌相关的TP53突变的靶向疗法。然而，在11名肺癌受试者中的6名的AEC中检测到肺癌相关PIK3CA或BRAF热点的突变，而没有在非癌症受试者中检测到(表3)。对于本研究中的每个受试者，从大约500,000个AEC中提取DNA，对于PIK3CA或BRAF突变阳性的六个受试者中的每一个，平均突变VAF为约10^-3。因此，如果克隆以相似的发生率均匀分布，使用先前估计的在双肺的整个支气管树中5x10⁸个AEC，预期每个受试者1,000个菌落中总共有10⁵个突变。针对PIK3CA和BRAF的相对无毒的基因靶向疗法已获得FDA批准或正在针对某些癌症进行高级试验。例如，阿培利司(alpelisib)目前正处于III期试验中用于治疗肺癌和其他组织的癌症中的PIK3CA驱动突变，而达帕菲尼(dabrafenib)和曲美替尼的组合在治疗BRAF:V600E突变的非小细胞肺癌方面具有明显的疗效。

因此，目前描述的AEC中PIK3CA/BRAF发生率的测试是有用的，其中AEC突变谱是在治疗患有癌症的肺癌受试者之前和之后测量的。因此，耐受性良好的基因靶向疗法可以减轻促进肺癌发展的AEC损伤突变领域的负担。然后，可以考虑对AEC中PIK3CA/BRAF突变发生率升高的个体进行化学预防试验。

在癌症驱动突变的靶向NGS分析中使用内标进行核苷酸位点特异性和变异特异性错误表征和控制

如图1所示，对于本研究中横跨的靶向驱动基因区域，在IS中测量的相应真阳性样品变异的中值技术错误VAF为0.014％。这种错误率与其他研究报告的错误率相似，这些研究在Illumina平台上使用靶向NGS来评估癌症驱动基因热点区域。

目前描述的方法的一个关键优势是，在每个文库样品制备中包含具有确认的参考序列的合成内标使得能够对每个文库中每个核苷酸位点处的每个变异的技术错误进行定性和定量表征。这种方法能够确定每次测量中每个检测到的变异相对于背景错误的显著性，这对于所有诊断应用程序(包括那些使用NGS的)都是期望的。

将本文所述的合成IS用于靶向NGS诊断类似于现在在液相色谱和气相色谱以及质谱诊断应用中已成为标准的IS应用。

因此，使用本文提出的用于错误控制的低成本、低复杂性方法非常适合分析驱动基因区域中VAF>0.05％的体细胞突变。由于可用于NGS分析的临床样本大小的实际限制，有理由认为样本确定的突变VAF下限>0.05％。

应用的非限制性示例

在一些实施方案中，用于获得指示生物状态的数字指标的方法包括提供对应于第一生物状态和第二生物状态中的每一个的2个样品；测量和/或计算2个样品的每一个中2种核酸的每一种的量；将量作为可在多个样品之间直接比较的数值提供；数学计算对应于第一和第二生物状态的每一个的数值；并确定区分两种生物状态的数学计算。如本文所用的第一和第二生物状态对应于待比较的两种生物状态，例如待区分的两种表型状态。非限制性例子包括，例如，非疾病(正常)组织对比疾病组织；显示治疗性药物应答的培养物对比显示较少治疗性药物应答的培养物；表现出药物不良应答的受试者对比表现出较少不良应答的受试者；治疗组的受试者对比未治疗组的受试者等。

如本文所用，“生物学状态”可以指表型状态，例如临床相关表型或其他目标代谢状况。生物学状态可以包括例如疾病表型、对疾病状态或非疾病状态的倾向；治疗性药物应答或对这种应答的倾向、不良药物应答(例如药物毒性)或对这种应答的倾向、对药物的抗性或表现出这种抗性的倾向等。在优选的实施方案中，获得的数值指标可以作为生物标志物，例如通过与感兴趣的表型相关联。在一些实施方案中，药物可以是抗肿瘤药物。在某些实施方案中，使用本文所述的方法可以提供个性化医疗。

在某些实施方案中，生物学状态对应于基因的正常表达水平。在生物状态不对应于正常水平的情况下，例如落在期望范围之外，可以指示非正常，例如疾病状况。

区分特定生物状态(例如疾病或代谢状况)的数值指标可用作给定状况和/或与其相关的状况的生物标志物。

在一些实施方案中，待测量的一种或多种核酸与一种生物状态的关联程度高于其他。例如，在一些实施方案中，待评估的一种或多种核酸与第一生物学状态相关，而不与第二生物学状态相关。

当核酸与生物学状态正相关或负相关时，可以说核酸与特定生物学状态“相关”。例如，当与第二生物学状态相比，核酸在第一生物学状态中以更高的量出现时，可以说核酸与第一生物学状态“正相关”。例如，与非癌细胞相比，在癌细胞中高表达的基因可以说与癌症呈正相关。另一方面，与第二生物状态相比，在第一生物状态中以较低量存在的核酸可以说与第一生物状态负相关。

待测量和/或计数的核酸可以对应于与特定表型相关的基因。核酸的序列可以对应于基因的转录、表达和/或调节区(例如，转录因子例如用于共调节的转录因子的调节区)。

在一些实施方案中，测量超过2种基因的表达量并将其用于提供指示生物状态的数字指标。例如，在某些情况下，多种基因的表达模式用于表征给定的表型状态，例如临床相关的表型。在一些实施方案中，可以测量至少约5种基因、至少约10种基因、至少约20种基因、至少约50种基因或至少约70种基因的表达量并用于提供指示生物状态的数字指标。在本发明的一些实施方案中，可以测量少于约90种基因、少于约100种基因、少于约120种基因、少于约150种基因或少于约200种基因的表达量并用于提供指示生物状态的数字指标。

可以通过本领域中(例如在数学、统计和/或计算领域中)已知的任何方法来实现确定使用哪种数学计算来提供指示生物状态的数字指标。在一些实施方案中，确定数学计算涉及使用软件。例如，在一些实施方案中，可以使用机器学习软件。

数学计算数值可以指使用任何方程、运算、公式和/或规则来交互数值，例如，和、差、乘积、商、对数幂和/或其他数学计算。在一些实施方案中，通过用分子除以分母来计算数值指标，其中分子对应于一种核酸的量并且分母对应于另一种核酸的量。在某些实施方案中，分子对应于与给定生物学状态正相关的基因，而分母对应于与生物学状态负相关的基因。在一些实施方案中，可以使用多于一种与被评估的生物状态正相关的基因和多于一种与被评估的生物状态负相关的基因。例如，在一些实施方案中，可以导出包括分子中正相关基因的数值和分母中等量负相关基因的数值的数值指标。在这种平衡的数值指标中，参考核酸数值相互抵消。在一些实施方案中，平衡的数值可以中和提供参考核酸的基因表达中的变化的影响。在一些实施方案中，数值指标是通过一系列一个或多个数学函数来计算的。

在一些实施方案中，可以比较例如区分多于2种生物状态。例如，在一些实施方案中，可以从一系列生物学状态提供样品，例如对应于疾病进展的不同阶段，例如癌症的不同阶段。例如，处于癌症不同阶段的细胞包括非癌细胞与非转移性癌细胞与转移性细胞，来自给定患者在疾病过程中的不同时间。在优选的实施方案中，可以开发生物标志物来预测哪种化学治疗剂对给定类型的癌症(例如，在特定患者中)最有效。

非癌细胞可以包括血肿和/或疤痕组织的细胞，以及来自非癌症患者的形态正常的实质，例如，非癌症患者相关的或与癌症患者不相关的。非癌细胞还可以包括来自癌症患者的形态正常的实质，例如来自同一组织和/或同一器官中靠近癌症部位的部位；来自远离癌症部位的部位，例如在同一器官***中的不同组织和/或器官中，或来自更远的部位，例如在不同器官和/或不同器官***中。

获得的数值指标可以作为数据库提供。数字指标和/或其数据库可用于诊断，例如在临床测试的开发和应用中。

诊断应用

在一些实施方案中，提供了一种识别生物学状态的方法。在一些实施方案中，该方法包括测量和/或计数样品中两种核酸中每一种的量，以数值形式提供所述量；并利用数值提供数值指标，其中数值指标指示生物状态。

可以根据各种实施方案如上所述地确定指示生物状态的数值指标。样品可以从样本中获得，例如，从待治疗的受试者中采集的样本。受试者可以在临床环境中，包括例如医院、医疗保健提供者办公室、诊所和/或其他医疗保健和/或研究机构。然后可以测量和/或计数样品中目标核酸(一种或多种)的量。

在某些实施方案中，在要评估给定数量的基因的情况下，可以同时获得给定数量的基因的表达数据。通过将某些基因的表达模式与数据库中的基因进行比较，可以确定具有该基因表达模式的肿瘤最有可能响应的化学治疗剂。

在一些实施方案中，该方法可用于在突变的内源基因存在的情况下定量外源正常基因。使用跨越缺失区域的引物，可以选择性地扩增和定量转染的正常基因和/或组成型异常基因的表达。

在一些实施方案中，本文所述的方法可用于确定正常表达水平，例如，提供对应于正常基因转录物表达水平的数值。这样的实施方案可用于指示正常的生物学状态，至少就评估基因的表达而言。

正常表达水平可以指在通常不与疾病、创伤和/或其他细胞损伤相关的条件下转录物的表达水平。在一些实施方案中，正常表达水平可以作为数字提供，或者优选地作为对应于特定基因的正常表达范围的数值范围，例如在实验误差的+/-百分比内。样品中给定核酸(例如对应于特定基因的核酸)获得的数值的比较可以与已确立的正常数值进行比较，例如通过与本文提供的数据库中的数据进行比较。由于数值可以指示样品中核酸分子的数量，这种比较可以指示基因是否在正常水平内表达。

在一些实施方案中，该方法可用于鉴定生物学状态，包括评估第一样品中核酸的量，并提供作为数值的所述量，其中所述数值在许多其他样品之间可直接比较。在一些实施方案中，该数值可能直接与无限数量的其他样品进行比较。可以在不同的时间对样品进行评估，例如在不同的日子；在同一实验室在相同或不同的实验中；和/或在不同实验室的不同实验中。

治疗性应用

一些实施方案提供了一种改进药物开发的方法。例如，可以使用内标的标准化混合物、数值的数据库和/或数值指标的数据库来改进药物开发。

在一些实施方案中，在这些阶段中的一个或多个阶段测量和/或计数基因表达的调节，例如以确定候选药物的效果。例如，可以将候选药物(例如，在给定阶段鉴定的)施用于生物实体。生物实体可以是任何能够携带核酸的实体，如上所述，并且可以基于药物开发阶段适当地选择。例如，在先导鉴定阶段，生物实体可以是体外培养物。在临床试验阶段，生物实体可以是人类患者。

然后可以评估候选药物对基因表达的影响，例如，使用本发明的各种实施方案。例如，可以从生物实体收集核酸样品，并且可以测量和/或计数目标核酸的量。例如，量可以以数值和/或数字指标提供。然后可以将一个量与在药物开发的不同阶段该核酸的另一个量进行比较；和/或数据库中的数值和/或指标比较。这种比较可以为以一种或多种方式改变药物开发过程提供信息。

改变药物开发的步骤可以指在开发药物的过程中进行一个或多个改变，优选地以便减少药物开发的时间和/或费用。例如，改变可以包括对临床试验进行分层。临床试验的分层可以指例如对临床试验中患者群体细分和/或确定特定个体是否可以进入临床试验和/或继续到临床试验的后续阶段。例如，可以基于使用本发明的各种实施方案确定的患者的基因构成的一个或多个特征来细分患者。例如，考虑在临床前阶段获得的数值，例如，从发现对应于对候选药物缺乏应答的体外培养物中获得的数值。在临床试验阶段，数值相同或相近的受试者可免于参加试验。相应地改变了药物开发过程，从而节省了时间和成本。

试剂盒

本文所述的内部扩增对照(IAC)/竞争性内标(IS)可以组装并以试剂盒的形式提供。在一些实施方案中，试剂盒提供了进行PCR，包括多重PCR和下一代测序(NGS)所需的IAC和试剂。IAC可以以浓度已知的单一浓缩形式提供，或在溶液中连续稀释至几种已知工作浓度中的至少一种。

试剂盒可以包括如本文所述的150个已鉴定的内源性靶标的IS，或如本文所述的28个ERCC(外部RNA对照联合体(External RNA Control Consortium))靶标的IS，或两者。

这些IS可以在溶液中提供，允许IS保持稳定长达数年。

试剂盒还可以提供专门设计用于扩增150个内源性靶标的IS、28个ERCC靶标的IS和它们相应的天然靶标的引物。

试剂盒还可以提供一个或多个容器，容器装有一种或多种必需的PCR试剂，包括但不限于dNTP、反应缓冲液、Taq聚合酶和无RNA酶的水。可选地与此类容器相关联的是由管理IAC和相关试剂的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了该机构对制造、使用或销售用于研究用途的批准。

试剂盒可以包括使用试剂盒中包含的IS来制备、执行和分析PCR，包括多重PCR和NGS的适当说明书。说明书可以是任何合适的格式，包括但不限于印刷品、录像带、计算机可读盘或光盘。

在本说明书中提及的所有出版物，包括专利和非专利文献，都明确地通过引用并入本文。本文引用的任何文件的引用并不意味着承认上述任何文件是相关的现有技术。所有关于这些文件的日期或内容的陈述均基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容正确性的任何承认。

虽然已经参考各种优选实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的基本范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等效物代替其要素。此外，可以进行许多修改以使特定情况或材料适应本发明的教导而不背离本发明的基本范围。

因此，本发明不旨在限于本文公开的预期用于实施本发明的特定实施方案，而是本发明将包括落入权利要求范围内的所有实施方案。

Claims (31)

1.一种肺癌风险测试试剂盒，包含用于测量一组肺癌驱动基因中的多个低变异等位基因频率(VAF)突变体的试剂；和，

其说明书。

2.权利要求1所述的试剂盒，其中包含：

a)针对每个靶基因的聚合酶链式反应(PCR)引物，

b)针对每个靶基因的合成内标，和

c)制备PCR产物用于作为下一代测序的文库的试剂。

3.权利要求1所述的试剂盒，其中所述一组肺癌驱动基因包括以下中的一种或多种：TP53、PIK3CA、BRAF、KRAS、NRAS、NOTCHI、EGFR和ERBB2。

4.权利要求1所述的试剂盒，其中所述一组肺癌驱动基因包括以下中的一种或多种：CDKN1A、E2F1、ERCC1、ERCC4、ERCC5、GPX1、GSTP1、KEAP1、RB1、TP63和XRCC1。

5.权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒提供用于测量多个VAF突变体所必需的试剂和说明书。

6.权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒提供在多个患者样本中进行测试所必需的试剂和说明书。

7.一种诊断受试者是否处于形成肺癌的风险的方法，包括：

a)从受试者获得生物样品；

b)测量所述生物样品中的一组肺癌驱动基因中的多个低变异等位基因频率(VAF)突变体，从而获得物理数据以确定所述生物样品中VAF突变体的水平是否高于对照中的水平；

c)将步骤b)的样品中获得的水平与对照中的水平进行比较；

d)通过控制不精确性、假阳性和假阴性的来源来区分真突变和伪象；和，

e)如果物理数据表明生物样品中的水平与对照中的水平显著不同，则将该受试者鉴定为处于形成癌症的风险。

8.权利要求7所述的方法，其中所述一组肺癌驱动基因包括以下中的一种或多种：TP53、PIK3CA、BRAF、KRAS、NRAS、NOTCHI、EGFR和ERBB2。

9.权利要求7所述的方法，其中所述一组肺癌驱动基因包括以下中的一种或多种：CDKN1A、E2F1、ERCC1、ERCC4、ERCC5、GPX1、GSTP1、KEAP1、RB1、TP63和XRCC1。

10.权利要求7、8或9所述的方法，其中低VAF突变体的测量包括：

基于相对于已知数量的合成内标分子的样本分析物的测量，计算每个样本中每种分析物测量的检测限/定量限。

11.权利要求7、8或9所述的方法，包括进行以下步骤：

1)进行多重梯度PCR，以使具有不同熔解温度的引物与特定靶标退火；和

2)进行单重PCR，然后进行定量和等摩尔混合，使得等量加载到测序仪上；

其中基于肺癌和肺癌变前病灶中的高发生率来选择PCR靶标。

12.权利要求7、8或9所述的方法，其中诊断或评估包括以下中的一项或多项：

肺癌的诊断，

肺癌阶段的诊断，

肺癌类型或分类的诊断，

肺癌复发的诊断或检测，

肺癌消退的诊断或检测，

肺癌的预后，和

肺癌对手术或非手术疗法的应答的评估。

13.权利要求12所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。

14.权利要求12所述的方法，其中受试者接受过实体瘤切除术的手术和/或化学疗法、和/或放射治疗。

15.权利要求7、8或9所述的方法，还包括使受试者接受进行性的短期评估。

16.权利要求7、8或9所述的方法，还包括使受试者接受使用抗癌药物的疗法。

17.权利要求7、8或9所述的方法，其中VAF＜0.01％。

18.权利要求7、8或9所述的方法，其中VAF为约5×10^-4(0.05％)。

19.权利要求7、8或9所述的方法，其中内标的纳入可靠地测量变异频率低至0.05％的突变，和不纳入内标的情况下变异频率5％的突变。

20.权利要求7、8或9所述的方法，其中内标的纳入不使用独特分子指标(UMI)地可靠地测量VAF低至0.01％的低变异频率突变。

21.权利要求7、8或9所述的方法，其中生物样品包含来自气道上皮细胞的RNA或DNA。

22.权利要求7、8或9所述的方法，其中生物样品包括非侵入性获得的样本，包括呼出气凝结物和通过鼻刷获得的气道上皮细胞。

23.一种为被诊断患有肺癌的受试者确定可行治疗建议的方法，包括：

a)从受试者获得生物样品；

b)通过以下检测满足阈值标准为正值的至少一个特征：

使用与EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK1、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH 1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS基因杂交并对其扩增的一组探针以检测具有正值的至少一个特征；和，

c)基于检测到的具有正值的至少一个阳性特征，为受试者确定可行治疗建议。

24.一种治疗处于形成肺癌的风险的患者的方法，其中在医疗管理之前，通过使用权利要求1所述的试剂盒评估形成肺癌的风险，其中：

对处于形成肺癌的低风险的患者进行常规的长期评估；并随后施用医学治疗；和/或，

对处于形成肺癌或受肺癌影响的高风险的患者进行肺癌筛查、和/或预防肺癌的医学治疗、医疗和/或放射、和/或切除病灶的手术。

25.本文的试剂盒和方法用于促进FDA和其他监管机构批准在区域实验室以试剂盒或方法形式进行肺癌风险测试的用途。

26.本文的试剂盒和方法用于促进FDA和其他监管机构批准在区域实验室以试剂盒或方法的形式对癌细胞中突变的测量进行测量，然后指导癌症的靶向疗法的用途。

27.本文的试剂盒和方法用于促进FDA和其他监管机构批准在区域实验室以试剂盒或方法形式对癌细胞中极低VAF(低至0.01％)突变的无独特分子指标(UMI)的测量进行测试，然后指导癌症的靶向疗法的用途。

28.本文的试剂盒和方法用于使得能够测量非侵入性获得的样本，例如呼出气凝结物、支气管刷和/或鼻刷样本中的肺癌风险的用途。

29.本文的试剂盒和方法用于使得能够测量气道上皮细胞中极低VAF突变的用途。

30.本文的试剂盒和方法用于测量癌细胞中的突变，然后指导癌症的靶向疗法的用途。

31.本文的试剂盒和方法用于测量正常气道细胞中一组基因的突变以确定癌症的风险的用途。

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