ES2368764T3 - ANTAGONISTAS SELECTIVOS DE huTNFR1. - Google Patents

Abstract

Un li gando de l h uTNFR1 qu e com prende una co nstrucción d e proteínas c on ( i) una o m ás s ecuencias de aminoácidos de origen humano capaces de reducir la respuesta inmunogénica de dicho ligando del huTNFR1 en humanos, y (ii) una o más secuencias de aminoácidos de origen no humano capaces de unirse de forma selectiva al huTNFR1, en la que la construcción de proteínas comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 7 como domin io variable de la cadena pesada (VH) y la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 8 com o dominio variable de la cadena ligera (VL), o un fragme nto de u n anticuerpo humanizado, siendo el fragmento una scFv que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 9.

Description

Antagonistas selectivos de huTNFR1 La presente invencion esta relacionada con un ligando que se une especificamente al receptor del factor de necrosis tumoral humano de tipo 1 (huTNFR1), el ligando comprende una o mas secuencias de aminoacidos de origen humano capaces de reducir la respuesta inmunogenica del ligando en seres humanos y una o mas secuencias de aminoacidos capaces de unirse de forma selectiva a huTNFR1. La presente invencion esta relacionada ademas con un acido nucleico que codifica dicho ligando y a una composicion farmaceutica para el tratamiento de trastornos conectados con huTNFR1. El TNF es una citoquina clave que regula la inflamacion y la apoptosis. Dependiendo del tipo celular y el contexto ambiental, el TNF puede presentar efectos opuestos, la estimulacion inmunitaria o la supresion inmunitaria, el TNF puede mediar la apoptosis asi como la resistencia a la apoptosis (Locksley et al., Cell, 2001, N° 104, p. 487-501; Aggarwal B. B., Nat. Rev. Immuno l., 2003, N° 3, p 745-756). En humanos, el TNF es una citoquina esencial que regula la funcion del sistema inmunitario innato y las respuestas inflamatorias como un todo, aunque tambien se ha reconocido c omo u n me diador pat ogenico ce ntral de u na seri e de e nfermedades agudas y cro nicas. Especificamente, en artritis r eumatoide (AR), en enfermedades intestinales inflamatorias como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, en psoriasis y en unas cuantas enfermedades raras hereditarias como el querubismo y el sindrome de fiebre periodica, asociadas con TNF y la sobreexpresion de TNFR1, respectivamente (Chatzantoni K, Mouzaki A., Curr. Top. Med. Chem., 2006, N° 6, p. 1707-1714; Ueki et al., Cell, 2007, N° 128, p. 71-83; Simon A., Van der Meer J. W., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2007, N° 292, p. R86-R98), el sistema TNF se ha identificado como el mediador patologicamente relevante. En las infecciones fulminantes virales o bacterianas que conducen al denominado sindrome d e la citoquina, el TNF se cono ce por estar muy implicado y esta bi en documentado su papel crucial como mediador del choque septico y el fallo multiorganico. El T NF tambien esta implicado en otras enfermedades, en particular enfermedades metabolicas que incluye la obesidad y la diabetes de tipo 2 (Hotamisligil G. S., Nature, 2006, N° 444, p. 860-867; Storz et al., FEBS Lett., 1998, N° 440, p 41-45) y algunas formas de hepatitis (Kusters et al., Eur. J. Immunol., 19 97, N° 27, p. 2870-2875). Ademas, el TNF, a pesar de su actividad terapeutica conocida en el tratamiento local de ciertos canceres, se considera como promotor tumoral en otras enfermedades malignas, probablemente a traves de la resistencia a la apoptosis mediada por NF-KB y otras rutas de supervivencia (Luo et al., Antibody engineering methods and protocols, 2004, Human Press, Towota, p. 135-159). Por lo tanto, los en sayos clinicos tambien exploran estrategias anti TNF como regimen terapeutico para ciertas neoplasias hematologicas (por ejemplo, AML). A partir de un punto de vista mecanicistico, se ha demostrado en numerosos modelos que incluye ratones knock-out para TNFR en los que el TNFR1 es el principal mediador de los fenotipos patologicos de TNF (Locksley et al., Cell, 2001, N° 104, p 487-501; Aggarwal et al., Nat. Rev. Immunol., 2003, N° 3, p. 745-756). En varias enfermedades inflamatorias cronicas, los reactivos neutralizadores de TNF, especificamente los anticuerpos anti TNF y proteinas de fusion de TNFR-Fc solubles, se aplican ampliamente de forma clinica. Estan aprobados tres farmacos que interfieren con la accion del TNF: Remicade (Vilcek y Feldmann, 2004) (Centocor/Tanabe), Enbrel (Immunex/Wyeth) y Humira (Celltech/Abbott). Todos los farmacos tienen como diana el TNF en si. Lo s farmacos estan apro bados para el trata miento de la artritis reumatoide (AR), AR juven il, artritis psoriasica, enfermedad de Crohn y espondilitis anquilosante. Los farmacos que tienen como diana el TNF muestran un gran exito frente a la AR, pero el efecto terapeutico dura solamente un breve periodo de tiempo, y algunos pacientes son a priori refractarios al tratamiento de anticuerpos anti T NF o desarrollan resistencia. Ademas, l a aparicion de ensayos clinicos con CDP571, un anticuerpo monoclonal humanizado especifico de TNF, por ejemplo, en la enfermedad de Crohn, son ciertamente menos prometedores de lo esperado, pidiendo el desarrollo de nuevos conceptos y reactivos cuya diana sea el sistema TNF/TNFR. Ademas de una esperada supresion inmune general, los farmacos anti TNF aprobados muestran efectos secundarios adicionales como la produccion de anticuerpos anti-dsiDNA, lupus y enfermedad neuroinflamatoria. El estado inmunosuprimido de los pacientes bajo el bloqueo general de TNF esta asociado con un aumento del riesgo de enfermedades infecciosas, incluyendo organismos comensales. En el "Estudio Lenercerpt" (1999), los ensayos clinicos de un agente anti-TNF para el tratamiento de EM tuvo que cancelarse debido a que el estado de la enfermedad empeoraba, en lugar de mejorar. El mecanismo de fondo, de esa respuesta adversa inesperada en ese momento, esta ahora aclarado y esta relacionado con el papel diferencial de TNFR1 y TNFR2 en esta enfermedad, con las senales de TNFR1 propagando la muerte neuronal y las senales de TNFR2 activando la regeneracion de la capa de mielina. En conjunto, tal como se describe mas adelante existe un aumento en las evidencias sobre las estrategias terapeuticas cuyo objetivo es que la diana selectiva sea un receptor con accion TNF que en muchas ocasiones sera superior al bloqueo general de la senalizacion de TNF. Por ejemplo, en algunos modelos de enfermedades animales detalladas mas adelante, los efectos contradictorios de la accion de TNF se explican mediante una funcion diferencial de los distintos receptores, TNFR1 y TNFR2. El conocimiento adquirido sobre los mecanismos de accion de TNF a nivel de receptor ahora si abre nuevas estrategias con el objetivo de bloquear farmacologicamente uno de los receptores, resultando asi en mas efectos especificos potenciales.

Por ejemplo, la isquemia retinal es una complicacion de la diabetes cuando las neuronas retinales sufren una apoptosis inducida por TNF que provoca ceguera. Las retinas de los ratones knockout para TNFR2 muestran un aumento de la ap optosis, p ero las r etinas de los r atones knocko ut pa ra T NFR1 muestran u n des censo de l a apoptosis en comparacion con las de tipo salvaje (Fontaine et al., J. Neurosci., 2002, N° 22, RC216).

De forma similar, EAE es un modelo animal de esclerosis multiple (EM). Se caracteriza por una inflamacion inicial autoinmune dirigida contra la mielina. La reaccion especifica de mielina desaparece despues pero aparecen otros epitopos como antigenos a utoinmunes. Mientras que los ratones kn ock-out p ara TNF muestran una re accion inflamatoria inicial mas debil hacia la mielina, la reaccion inmune especifica de mielina no desaparece. En ratones knock-out para TNFR1, la reaccion inflamatoria inicial esta reducida igualmente, pero no desaparece, lo que indica que el TNFR2 es suficiente para mediar la funcion inmunosuprosora a largo plazo de TNF, mientras que la reaccion inflamatoria esta mediada por TNFR1 (Kassiotis G., Kollias G., J. Exp. Med., 2001, N° 193, p. 427-434; Kollias et al., Curr. Dir. Autoimmun., 2002, N° 5, p. 30 to 50; Owens et al., Nat. Med., 2001, N° 7, p. 161-166).

De forma similar, e n un modelo d e r aton de to xina (c uprizona) i ndujo, d esmielinizacion rev ersible d el SNC, pareciendose a las fases de desmielinizacion/ regeneracionde la esclerosis multiple (EM), habiendo evidencias de que el proceso de remielinizacion tras la retirada de la toxina depende de TNF yrequiere de forma selectiva la senalizacion d e T NFR2, dis parando la e xpansion de l progenitor de oli godendrocitos y la diferenciacion d e oligodendrocitos en laminas de mielina maduras (Arnett et al., Nat. Neurosci., 2001, N° 4, p. 1116-1122). Estos hallazgos de la dependencia de TNF en la dege neracion de oligodendrocitos refleja la situacion de humanos que padecen EM: En ensayos clinicos cuyo objetivo es un bloqueo completo de TNF en EM con una proteina de fusion de TNFR1-Fc, el bloqueo de TNF se asocio co n un agravamiento de la enfermedad en lugar de un beneficio terapeutico, lo cual esta de acuerdo con los resultados del modelo animal descrito anteriormente.

Ademas, por ejemplo las neuronas corticales de los ratones sucumben a la muerte excitotoxica tras la evidente activacion d el receptor NM DA medi ante el ne urotransmisor gl utamato. El glutam ato se lib era d esde el tej ido moribundo tras condiciones isquemicas (falta de oxigeno) como ocurre en las apoplejias. Los cultivos primarios de neuronas pueden resultar en completamente resistentes a la excitotoxicidad de una manera dependiente de TNFR2 involucrando a l a ruta PI3K - AK T - N F-KB. Por el contrar io, las senales de TNFR1 aumentan la muerte celular inducida por glutamato (Marchetti et al., J. Biol. Chem ., 2004, N° 279, p. 32869-32881), lo que indica un papel diferencial de TNFR1 y TNFR2 en el SNC.

Por lo tanto, en varios modelos de neurodegeneracion aguda y cronica, isquemia retinal, modelos de apoplejia y en esclerosis multiple, un bloque completo de TNF no presenta efectos terapeuticos aparentes pero en su lugar es directamente perjudicial o reduce la capacidad regenerativa del tejido afectado. De acuerdo con esto, el bloqueo especifico de TNFR1, el TNFR inflamatorio, y el mantenimiento de la funcion de TNFR2, presenta una aproximacion terapeutica prometedora para estas enfermedades.

De forma similar, tanto en artritis reumatoide (AR), como en la psoriasisy en otras enfermedades mas raras y hereditarias como el querubismo y el sindrome de fiebre periodica, asociados con la sobreexpresion de TNFR y TNFR1, respectivamente, el TNFR1 se considera o se ha identificado claramente como el receptor patologicamente relevante. Un papel diferencial de TNFR1 y 2 parece tambien ser evidente en la enfermedad de Crohn, en la que solo una fraccion de los pacientes respondes a una terapia contra el TNF, y en LES (Komata et al., Tissue Antigens, 1999, N° 53, p. 527-533), con resistencia al tratamiento y susceptibilidad por la enfermedad, respectivamente, correlacionandose ambos con mutaciones del TNFR2.

De acu erdo c on esto, si se utiliza u n ant icuerpo sel ectivo del rec eptor dirigi do co ntra T NFR1 representa u na alternativa para establecer estrategias anti TNF en estas enfermedades inflamatorias cronicas. Esto es de particular relevancia en pacientes que pasan a ser resistentes a reactivos anti TNF tras los ciclos de tratamiento repetitivos. Ademas, el bloqueo global y continuado del TNF esta asociado con una deficiencia funcional en la respuesta inmune innata y adaptativa, el riesgo de complicaciones debido a enfermedades infecciosas aumenta de forma considerable en estos pacientes. La interferencia selectiva con TNFR1 mantiene las respuestas de TNF mediante TNFR2, que sera beneficiosa para la competencia inmune general de los pacientes.

El apoyo a un bloqueo selectivo de TNFR1 como regimenterapeutico poderoso aparece en estudios previos de los inventores de la funcion in vitro y in vivo del anticuerpo monoclonal antagonista (mab) H398 de raton especifico para TNFR1 humano (Thoma et al., J. Exp. Med., 1990, N° 172, p. 1019-1023; Grell et al., Cell, 1995, N° 83, p. 793-802; Moosmayer et al., Ther. Immunol., 1995, N° 2, p. 3 1-40). Este anticuerpo murino y sus derivados recombinantes scFv de raton son capaces de neutralizar un amplio espectro de actividades de TNF in vitro a traves de la inhibicion competitiva de la union de TNF a TNFR1 humano; el mab mostro ser efectivo en la prevencion de sindrome de choque letal inducido por bacterias en babuinos, en el que H398 muestra reactividad cruzada con el TNFR1 de esta especie. La efi cacia terapeutica del a nticuerpo H398 en e nfermedades cronicas dependientes de T NF, no pue de evaluarse en ensayos clinicos debido al origen murino del anticuerpo, ya que es portador de riesgo de reacciones adversas graves hacia el anticuerpo de raton y/o el rapido desarrollo de una respuesta inmune tras los ciclos de tratamiento repetitivos.

Por lo tanto, existe una necesidad para nuevas sustancias que interactuen de forma efectiva y especifica con TNFR1 humano (huTNFR1) como antagonistas de TNF en un paciente y que tengan una respuesta inmunogenica reducida (es decir, tolerable) tras la administracion a seres humanos.

Asi, el problema tecnico subyacente a la presente invencion esproporcionar nuevos ligandos de huTNFR1 de baja inmunogenicidad como antagonistas de la accion de TNF adecuados para la aplicacion en seres humanos como una terapia para el tratamiento de una serie de trastornos mediados por TNF.

De acuerdo con la presente invencion, el problema anterior se resuelve proporcionando un ligando de huTNFR1 que comprende una construccion proteinacea que posee (i) una o mas secuencias de aminoacidos de origen humano capaz de reducir la respuesta inmunogenica de dicho ligando de huTNFR1 en humanos, y (ii) una o mas secuencias de aminoacidos de origen no humano capaces de unirse de forma selectiva a huTNFR1, en el que la construccion proteinacea comprende la secuencia de aminoacidos de acuerdo con Id. de Sec. N°: 7 como dominio variable de la cadena pesada (VH) y la secuencia de aminoacidos de acuerdo con Id. de Sec. N°: 8 como dominio variable de la cadena ligera (VL), o un fragmento de un anticuerpo humanizado, siendo el fragmento un scFv que comprende la secuencia de aminoacidos de acuerdo con Id. de Sec. N°: 9.

En este documento, el termino "ligando de huTNFR1" significa cualquier molecula o grupo de moleculas que pueden unirse de forma selectiva al receptor de TNF humano de tipo 1 (huTNFR1) y al mismo tiempo muestra una respuesta inmunogenica reducida cuando se administra a un ser h umano. Al unirse a huTNFR1, dicho ligando de huTNFR1 actua como un antagonista de TNF y de linfotoxina alfa (LTa) que son ligandos naturales entre otros de TNFR1.

El termino "huTNFR1" utilizado en este documento no solo esta relacionado con el receptor de TNF humano de tipo 1 como ta l, sino qu e tambien i ncluye cualquier porcion de l mismo, o c ualquier otro r eceptor q ue est a estructuralmente y/o funcionalmente relacionado con huTNFR1.

La e xpresion "respu esta i nmunogenica reduc ida" in dica una r espuesta inmu nogenica qu e es reduci da e n comparacion con la respuesta inmunogenica de un ligando de huTNFR1 que comprende exclusivamente secuencias de amin oacidos de origen no huma no. Ejempl os de ligandos d e h uTNFR1 que comprenden exclusivamente secuencias de aminoacidos de origen no humano incluye peptidos, proteinas y acidos nucleicos de origen mamifero no humano, como de origen de roedores, por ejemplo un anticuerpo murino.

La expresion "construccion proteinacea" utilizada en este documento no esta especificamente restringida y significa cualquier molecula o grupo de moleculas que contienen uno o mas enlaces peptidicos, preferiblemente secuencias de peptidos, yse une a huTNFR1 mientras muestra una respuesta inmunogenica reducida en seres humanos. La construccion proteinacea de acuerdo con la presente invencion puede comprender ademas acidos nucleicos y compuestos organicos e inorganicos, como azucares o acidos grasos. Ademas, la construccion proteinacea puede comprender un grupo de moleculas que estan asociadas independientemente mediante enlaces covalentes o no covalentes, como proteinasde fusion. Deacuerdo con otra realizacion de la presente invencion, la construccion proteinacea puede ademas acoplarse con moleculas adicionales, por ejemplo polietilenglicol o metoxi-polietilenglicol, es decir, puede estar PEGilado.

El ligando de huTNFR1 y/o la construccion proteinacea de acuerdo con la presente invencion puede producirse mediante cualquier metodo adecuado conocido por el experto en la materia, como por ejemplo mediante metodos recombinantes que implican la construccion de un plasmido adecuado o vector y la expresion en un microorganismo

o en cualquier organismo superior, o mediante la sintesis de peptidos automatizada, como la sintesis de peptidos en fase solida.

La expresion "secuencias d e ami noacidos de origen h umano" utiliz ada en este documento se refiere a las secuencias de aminoacidos que pueden encontrarse en el cuerpo humano. No obstante, la expresion no esta restringida unicamente a tales secuencias de aminoacidos que pueden encontrarseexactamente en el cuerpo humano pero tambien incluye aquellas secuencias de aminoacidos que poseen una similitud del 50% o mas con las secuencias d e amin oacidos humanos. L os ejem plos es pecificos d e l as secu encias de aminoacidos de origen humano son las secuencias de aminoacidos contenidas en un anticuerpo humano o un fragmento del mismo.

Ademas, la expresion "secuencias de aminoacidos de origen no humano" utilizada en este documento se refiere a cualquier secuencia de aminoacidos, que puede encontrarse en un animal no humano, como un mamifero distinto a un ser humano. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de origen no humano puede ser secuencia de un anticuerpo no humano, por ejemplo un anticuerpo murino.

En la construccion proteinacea de la presente invencion las ventajas de las secuencias de aminoacidos de origen humano, que reducen el riesgo de por ejemplo, inmunogenicidad en un paciente, se combina con la selectividad hacia huTNFR1 de secuencias de aminoacidos de origen no humano, como por ejemplo aquellas encontradas en el anticuerpo murino H398.

En el ligando de huTNFR1 tal como se ha definido anteriormente, la construccion proteinacea puede comprender entre otros u n fragmento d e un antic uerpo huma nizado, pudiendo se r un fragme nto ScF v que c omprende la secuencia de aminoacidos de acuerdo con Id. de Sec.N°: 9.

EIn general, el termino "anticuerpo" utilizado en este documento se refiere a cualquier clase de anticuerpo que pueda unirse a un antigeno, lo que incluye a los anticuerpos naturales, anticuerpos mutados y anticuerpos (semi)sinteticos, siempre que el anticuerpo permita una administracion a un ser humano con una respuesta inmunogenica reducida al mismo. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo es un antic uerpo humanizado obtenible mediante por ejemplo, tecnologia de acidos nucleicos recombinantes ("anticuerpo recombinante humanizado") o al menos un fragmento del mismo o una proteina recombinante similar a un anticuerpo. Como ejemplo, sin limitarse a este, un fragmento puede estar contenido en un anticuerpo como proteina recombinante como los diacuerpos, proteinas de fusion de scFv-Fc, y proteinas de fusion de scFv-CH3.

El anticuerpo, o al menos un fragmentodel mismo, o una proteina recombinante similar a un anticuerpo, puede contener una o mas mutaci ones o variaciones, como aminoacidos o acidos nucleicos anadidos, delecionados o sustituidos, siempre que no tengan un efecto negativo sobre la interaccion con huTNFR1. Ademas, el anticuerpo o al menos un fragmento del mismo, o una proteina recombinante similar a un anticuerpo, puede contener una o mas mutaciones o variaciones, como aminoacidos o acidos nucleicos anadidos, delecionados o sustituidos, que poseen un efecto positivo sobre la interaccion de huTNFR1 yque mejora la actividad antagonista de dicha molecula. En particular, dichas variantes mutadas poseen una mejor afinidad y/o una mejor actividad inhibidora.

En ge neral, el termino "frag mento" se r efiere a cu alquier porci on d e un antic uerpo tal como s e ha d efinido anteriormente siempre q ue posea l a ca pacidad de u nirse a l antig eno d eseado a traves de un antige no (monovalente) o dos antigenos (bivalente) a sitios de union (huTNFR1). Ademas, un fragmento generalmente puede comprender v arias porciones difer entes de dic ho ant icuerpo. Ejemplos d e fragmentos mo novalentes de un anticuerpo producido de forma proteolitica o recombinante incluye fragmento de union a antigeno (Fab), fragmento variable de cadena sencilla (scFv), fragmento variable (Fv), Fv estabilizado con puentes disulfuro (dsFv), cadena pesada del dominio variable de la inmunoglobulina (VH), cadena ligera del dominio variable de la inmunoglobulina (VL), regio nes determin antes de la comp lementariedad (CDR), y com binaciones d e las mismas. Ejempl os de fragmentos bivalentes procesados de forma proteolitica o recombinante de la presente invencion incluye diacuerpos F(ab)2, proteinas de fusion de scFv-Fc, y proteinas de fusion de scFv-CH3.

Por ejemplo, el anticuerpo o al menos un fragmento del mismo puede ser un anticuerpo humanizado o al menos un fragmento del mismo derivado del anticuerpo murino H398.

No existe limitacion a la tec nica de humanizacion del anticuerpo, siempre que el anticuerpo se una al antigeno deseado. Eje mplos d e h umanizacion in cluye, p ero si n limitars e a, injerto de r egiones d eterminantes de la complementariedad (injerto de CDR) (Jones et al. 1986, Nature 321, 522-525), injerto de residuos determinantes de la especificidad (injerto de SDR) (Kashmiri et al., 2005, Methods 36, 25-34), reestructuracion de dominios variables (Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 91, 969-973), seleccion basada en la estructura y humanizacion mediante injertos de CDR (Hwang et al., 2005, Methods 36, 35-42), y estrategias de desinmunizacion (Hellendorn et al., 2004, Cancer Cell International 4 (Sppl. I), 20).

La expresion "anticuerpo humanizado" utilizado en este documento se refiere a cualquier anticuerpo en que se utiliza el diseno de proteinas para reducir la cantidad de secuencia proteica extrana ("no humana") mediante intercambio por ejemplo, de regiones constantes de anticuerpo de roedores y/o estructuras de dominios variables o residuos estructurales con secuencias que se encuentran en anticuerpos humanos.

En u na rea lizacion es pecifica d e l a presente invencion, la construccion protei nacea del li gando de huT NFR1 anteriormente definido puedeser un anticuerpo humanizado, que contiene secuencias de aminoacidos de origen humano y la de origen no humano, es de roedores.

El termino "scFv" utilizado en este documento indica una fusion de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de cualquier inmunoglobulina, unidas mediante un enlazante, como por ejemplo un peptido compuesto por serina, glicina, o cualquier otro aminoacido natural o no natural.

En general el fragmento se selecciona a partir del grupo que consiste en una region Fab, un scFv, un derivado recombinante geneticamente disenado o procesado postraduccionalmente de dichos fragmentos, y un derivado quimicamente modificado de dichos fragmentos.

Tal como ya se ha definido anteriormente, el fragmento es un scFv que comprende la secuencia de aminoacidos de acuerdo con Id. de Sec. N°: 9.

En el ligando anteri ormente defin ido, la construcci on p roteinacea comprende las regi ones deter minantes de complementariedad (CDR) de Id. de Sec. N°: 1 a 6, que confieren la union a huTNFR1, en el que dichos CDR estan contenidos preferiblemente en una o mas secuencias de aminoacidos de origen no humano capaces unirse de forma

selectiva a huTNFR1 tal como se ha descrito en (ii) de la construccion proteinacea anterior.

Tal como se ha defin ido anteriormente, la construccion proteinacea puede comprender entre otros l a secuencia de aminoacidos de acuerdo con Id. de Sec. N°: 7 como domi nio variable de la cadena pesada (VH) yla secuencia de aminoacidos de acuerdo con Id. de Sec. N°: 8 como dominio variable de la cadena ligera (VL).

En aun otra realizacion de la presente invencion, el ligando anteriormente definido de huTNFR1 comprende una cola adicional que permite la interaccion especifica con un compuesto biologicamente aceptable. No existe una limitacion especifica respecto a la cola utilizable en la presente invencion, siempre que no tenga un impacto negativo o que sea tolerable en la union del ligando de huTNFR1 a huTNFR1 o en la respuesta inmunogenica cuando se administre a un ser humano. Ejemplos de colas adecuadas incluye cola de His, cola de Myc, cola de FLAG, cola de Strep, cola de Calmodulina, cola de GST, cola de MBP, y cola de S.

En otra r ealizacion d el ligando de huT NFR1 como se ha defi nido anteri ormente, la c onstruccion proteinacea comprende ademas uncompuesto biologicamente aceptable unido de forma no cov alente al mismo o unido de forma cova lente al mism o mediante c onjugacion quimi ca postra duccional o med iante tecn ologia de g enes recombinantes.

La expresion "compuesto biologicamente aceptable" utilizado en este documento no se restringe de forma especifica y se refiere a cualquier compuesto utilizable en un ambiente biologico, como en un or ganismo vivo, lo que incluye tambien la ac eptacion farm aceutica de d icho com puesto biol ogicamente acepta ble. Ejemplos d e compuesto s biologicamente aceptables de acuerdo con la presente invencion son, sin ninguna limitacion a los mismos, peptidos, proteinas, aci dos nucl eicos, carbohidratos, lipid os, asi como otros c ompuestos or ganicos e i norganicos. El compuesto biologicamente aceptable preferiblemente ejerce efectos positivos adicionales, por ejemplo propiedades bioquimicas/ b iofisicas me joradas, com o s olubilidad aumentada, esta bilidad pro longada, activi dad anta gonica mejorada, y propiedades farmacocineticas mejoradas, como aumento de la vid a media in vivo, a umento de la penetracion en tejidos, traspaso de la barrera hematoencefalica y toxicidad reducida.

De acuerdo con una realizacion especifica con el objetivo de mejorar las propiedades farmacocineticas del ligando de huTNFR1 anteriormente definido, el compuesto biologicamente aceptable se selecciona a partir d el grupo que consiste en proteinas sericas.

En otra realizacion del ligando de huTNFR1 tal como se ha definido anteriormente, el compuesto biologicamente aceptable es albumina. De acuerdo con una realizacion especifica, el compuesto biologicamente aceptable es albumina serica humana(HSA).

En otra realizacion del ligando de huTNFR1 tal como se ha definido anteriormente, el compuesto biologicamente aceptable comprende un dominio de union a albumina (por ejemplo, de bacterias), un peptido de union a albumina compuesto de aminoacidos naturales o no naturales, una omas cadenas acilo conactividad de union albumina, polietilenglicol o metoxi-polietilenglicol. En aun otra realizacion del ligando de huTNFR1 definido anteriormente, el compuesto bi ologicamente aceptable co mprende otro anticuer po o fragmento d el mismo es pecifico para un componente de proteina serica o un ligando natural o sintetico, que se une a un componente serico (por ejemplo, albumina).

En otra realizacion especifica cuyo objetivo es mejorar las propiedades farmacocineticas del ligando de huTNFR1 definido anteriormente, el c ompuesto bi ologicamente aceptable com prende otro anti cuerpo diri gido contra u na molecula de la superficie celular o componente de la matriz extracelular. Como ejemplo, se han utilizado anticuerpos anti-HIR (receptor de Insulina humana) o anti-TR (receptor de la transferrina) para el transporte activo mediante la barrera hemat oencefalica y la lib eracion d e compu estos en el cer ebro (Boad o et a l., 2007, Bioc onjug. Chem., publicacion electronica antes que la escrita).

En otra realizacion especifica cuyo objetivo es mejorar las la actividad funcional del ligando de huTNFR1 definido anteriormente, el compuesto biologicamente aceptable comprende un anticuerpo que se une a otro epitop o de TNFR1, diferente del reconocido por el ligando de huTNFR1 definido anteriormente, aumentando de esta manera la union general (avidez) y selectividad de este reactivo biespecifico.

De ac uerdo c on otra r ealizacion esp ecifica de l li gando de huTNFR1 como s e h a defi nido a nteriormente, l a construccion proteinacea comprende una proteina de fusion de acuerdo con Id. de Sec. N°: 10.

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a un acido nucleico que codifica un ligando de huTNFR1 definido anteriormente.

El acido nucleico de acuerdo con la presente invencion no esta restringido especificamente y puede contener DNA o RNA. El aci do nuc leico pu ede c omprender ad emas se cuencias q ue se utiliz an en proces os de detecci on o aislamiento, como por ejemplo marcajes fluorescentes o colas de His. El acido nucleico puede comprender ademas bloques de construccion artificiales como bloques de construccion artificiales de DNA, RNA o PNA. Ademas, el acido

nucleico de acuerdo con la presente invencion puede producirse de cualquier forma adecuada, como de forma recombinante o mediante sintesis quimica, como sintesis en fase solida.

Otro aspecto de la presente invencion esta relacionada con un vector que comprende la secuencia de acido nucleico como se ha definido anteriormente. El vector de la presente invencion no esta restringido especificamente siempre que pueda utilizarse en la transfeccion de una celula huesped adecuada y sea adecuada para la expresion genica heterologa.

Los metodos utilizados para construir vectores son bien conocidos por un experto en la materia y se describen en varias publicaciones. En particular, las tecnicas para construir vectores adecuados, lo que incluye una descripcion de los comp onentes funcion ales como prom otores, pote nciadores, sena les de termin acion y p oliadenilizacion, marcadores de seleccion, origenes de replicacion, senales de corte y empalme, y secuencia lider, se revisan con considerable detalle en (Sambrook et al., 1989) y en las referencias citadas en esta publicacion. Los vectores pueden incluir, sin n inguna limitacion, vectores plasmidicos, fagemidos, cosmidos, articificial/minicromosomas (por ejemplo, ACE), vectores MAR, o vectores virales c omo baculovirus, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus herpes simplex, retrovirus, bacteriofagos. Ejemplos de vectores adecuados para la expresion procariota incluye pAB1 (Kontermann et al., 1997). Los vectores de expresion eucariota contendran normalmente tambien secuencias procariotas que facilitan la propagacion del vector en bacterias como un origen de replicacion y genes de resistancia a antibioticos para la seleccion en bacterias. Una serie de vectores de expresion eucariota, que contienen sitios de clonacion en uno o mas polinucleotidos puede unirse de forma operativa, son bien conocidos en la materia y algunos estan disponibles comercialmente p or co mpanias c omo Stratagene, La J olla, CA ; Invitroge n, Carlsb ad, C A; Promega, Madison, WI; BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA; Lonza Biologics PLC, Slough, Berkshire, Inglaterra. Ejemplos de vectores eucariotas son pCDNA3, pSecTag, y pEE 6.4.

En una realizacion preferible, el vector de expresion comprende al menos una secuencia de acido nucleico que es una secuencia reguladora necesaria para la transcripcion y traduccion de secuencias de nucleotidos que codifican un peptido/ polipeptido/ proteina de interes.

Otro aspecto de la pr esente invencion esta relacionado con una celula huesped que contiene el acido nucleico anteriormente definido o el vector anteriormente definido. La celula huesped de la presente invencion no esta especificamente restrin gida e inc luye to das las ce lulas que pueden u tilizarse en la prod uccion d el li gando d e huTNFR1 y/o la construccion proteica o partes de la misma. Ejemplos de celulas huesped adecuadas para la presente invencion incluyen las celulas procariotas y celulas eucariotas, como levaduras, celulas vegetales, celulas de insect o y celul as de mamifero con o rigen de difer entes esp ecies y organismos completos no humanos transgenicos (plantas transgenicas, animales no humanos transgenicos). Ejemplos de celulas procariotas incluyen a

E. coli, TG1 y esp ecies d e Pseud omonas. Ejempl os de cel ulas a nimales i ncluyen las cel ulas de hamster, preferiblemente las cel ulas BHK2 1, BHK T K-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 y CHODG44, o derivadas/ progenie de cualquiera de tales lineas celulares. En otra realizacion de la presente invencion, las celulas huesped son celulas de mieloma murino, preferiblemente celulas NSO y Sp2/0 o deriv adas/ progenie de cualquiera de tales lineas celulares. Ejemplos de celulas de mamifero que pueden utilizarse para la expresion de ligandos de huTNFR1 de acuerdo con la presente invencion se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1: Lineas celulares de produccion eucariotas

LiNEA CELULAR NUMERO DE ORDEN NS0 ECACC N° 85110503 Sp2/0-Ag14 AT CC CRL-1581 BHK21 AT CC CCL-10 BHK TK-ECACC N° 85011423 HaK AT CC CCL-15 2254-62.2 (derivada de BHK-21) ATCC CRL-8544 CHO ECACC N° 8505302 CHO salvaje ECACC 00102307 CHO-K1 AT CCCCL-61 CHO-DUKX(= CHO duk-, CHO/dhfr-) ATCCCRL-9096 CHO-DUKX B11 AT CC CRL-9010 CHO-DG44 (Urlaub et al., 1983) CHO Pro-5 AT CC CRL-1781 V79 AT CC CCC-93 B14AF28-G3 AT CC CCL-14 HEK 293 AT CC CRL-1573 COS-7 AT CC CRL-1651 U266 AT CC TIB-196 HuNS1 AT CC CRL-8644 CHL ECACC N° 87111906

Las celulas huesped que se han establecido, adaptado y cultivado completamente bajo condiciones libres de suero son mas preferibles, y opcionalmente enmedios que esten libres de cualquier proteina/ peptido de origen animal. Los medi os di sponibles a ni vel comerci al, como el F12 de Ham (Sig ma, Deisen hofen, Alema nia), RPMI-1640 (Sigma), medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Sigma), medio esencial minimo (MEM; Sigma), medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invitrogen), medio CHO libre d e su ero (Sigma) y el med io CHO l ibre de pr oteinas (S igma) s on ejemplos d e so luciones de nutrientes apropiadas. Cualquiera de los medios puede suplementarse segun las necesidades con una gran variedad de compuestos, ejemplos de los cuales serian las hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, transferrina, factor de crecimiento epidermico y el factor de crecimiento parecido a la insulina), sales (como el cloruro sodico, calcio, magnesio, fosfato), ta mpones (como el HEPES), nucleosidos (como la adenosina y la timidina), glutamina, glucosa u otras fuentes de energia equivalentes, antibioticos y elementos traza. Puede incluirse cualquier otro suplemento necesario conocido por los expertos en la materia a concentraciones apropiadas. En la presente invencion, la u tilizacion de medio libre de s uero es pr eferible, pero tambien pueden utilizarse para el cultivo de celulas huesped medios suplementados con una cantidad adecuada de suero. Para la obte nciony seleccion de celulas modificadas geneticamente que expresan el gen seleccionable, se anade un agente de seleccion adecuado al medio de cultivo.

Ademas, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad efectiva a nivel terapeutico del ligando de huTNFR1 como se ha d escrito anteriormente,y opcionalmente uno o mas componentes adicionales seleccionados de entre el grupo que consiste en un transportador aceptable a nivel farmaceutico, sales aceptables a nivel farmaceutico, un agente auxiliar, un estabilizante, un diluyente y un solvente, o cualquier combinacion de los mismos.

De acuerdo con otra realizacion, la composicion farmaceutica que se ha definido anteriormente, puede utilizarse para el tratamiento de la artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y otras enfermedades inflamatorias cronic as y /o autoi nmunes, infecci ones virales o bacteri anas agudas fulmin antes, enfermedades metabolicas, enferme dades ne urodegenerativas agudas, enfer medades neurodegenerativas cron icas, preferiblemente seleccionadas de entre esclerosis multiple, enfermedad de Parkinson y Alzheimer, y enfermedades geneticas her editarias en l as que T NF/TNFR1 es el mediador ca usante d e la patolo gia, preferib lemente seleccionadas de entre el sindrome de la fiebre periodica, el querubismo y el cancer.

El ligando de huTNFR1 de la presente invencion tambien puede utilizarse en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de cualquier trastorno relacionado con el TNF, como los mencionados anteriormente.

Tambien se proporciona un metodo para el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad seleccionada de entre artritis r eumatoide, ps oriasis, Enfer medad d e Crohn, c olitis u lcerosa y otra s enferm edades i nflamatorias cronicas y /o autoi nmunes, infecci ones virales o bacterianas ag udas fulmin antes, enfermedades metabo licas, enfermedades neuro degenerativas a gudas, enferm edades neurodegenerativas croni cas, preferi blemente seleccionadas de entre esc lerosis mu ltiple, enfermed ad de Parkins on y Alzh eimer, y enferm edades ge neticas hereditarias en las que TNF/TNFR1 es el mediador causante de la patologia, preferiblemente seleccionadas de entre el sindrome de la fiebre periodica, el querubismo y el cancer, lo que comprende el paso de administrar una cantidad terapeuticamente efectiva del ligando de huTNFR1 definido anteriormente a un paciente con necesidad del mismo.

De acuerdo con la presente invencion, el ligando de huTNFR1 como se ha descr ito anteriormente puede utilizarse para el pr ocedimiento d e s eleccion guiada de acuerdo con e l esta do de la materia (Jes pers e t al., 199 4, Biotechnology) para el aislamiento de un anticuerpo especifico contra huTNFR1 funcionalmente equivalente a partir de bibliotecas genicas de inmunoglobulinas humanas, minimizando asi ademas la potencial inmunogenicidad de dicho reactivo.

Ademas, se proporciona un proceso para la produccion de un ligando de huTNFR1 con una respuesta inmunogenica reducida cuando se a dministra a un s er humano, que comprende los pasos de (a) pr oporcionar una construccion proteica como la que se ha definido anteriormente, (b) identificar una o mas secuencias de aminoacidos de origen humano capaces de unirse selectivamente a huTNFR1 mediante seleccion guiada, utilizando como molde una o mas de las s ecuencias d e amin oacidos d e dich a const ruccion de pr oteinas, en p articular las secue ncias d e aminoacidos de origen no humano, y (c) generar la construccion de dicho ligando que comprende al menos una o mas de las secuencias de aminoacidos identificadas en el paso (b).

Otro aspecto de la presente invencion esta relacionado con la utilizacion de un ligando de huTNFR1 que comprende una construccion de proteinas con (i) una o mas secuencias de aminoacidos de origen humano capaces de reducir la respuesta inmunogenica de dicho ligando de huTNFR1 en humanos, y (ii) una o mas secuencias de aminoacidos de origen no humano capaces de unirse selectivamente a huTNFR1, como molde para la seleccion guiada en la identificacion y construccion de otro ligando de huTNFR1 de baja inmunogenicidad que comprende las secuencias de aminoacidos que son esencialmente o unicamente de origen humano.

Las figuras muestran:

La F ig. 1 mu estra el al ineamiento de l as secuenc ias VH y VL d el anticuerpo m onoclonal muri no H39 8, las secuencias mas cercanas a las del VH de linea germinal humana (VH1-69 = 1-e = DP-88) y VL (A3 = DPK15), asi como las secuencias VH yVL humanizadas (IZI-06.1 VH, IZI-06.1 VL) generadas mediante injerto de CDR. Los aminoacidos que difieren entre el H398 y las secuencias de linea germinal humanas estan marcados con asteriscos. Las regiones marco (FR) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) estan indicadas.

La Fig. 2 muestra las secuencias de DNA de IZI-06.1 VH yIZI-06.1 VL con codones optimizados (carril superior) y los correspondientes aminoacidos (carril inferior); los caracteres en cursiva al inicio y al final de cada secuencia de aminoacidos no pertenecen a IZI-06.1 VH e IZI-06.1 VL y estan relacionados con las secuencias deaminoacidos utilizadas para el clonaje/ procesado y contienen las dianas de escision para ciertas enzimas de restriccion.

La Fig. 3 muestra las estructuras modelo superimpuestas del armazon de H398 Fv (gris claro) e IZI-06.1 Fv (gris oscuro). a) vista lateral de las dos estructuras modelo. b) vista superior de las regiones CDR H1-H3 y L1-L3. Los modelos se generaron con WAM (Whitelegg yRees, 2000; WAM - un algoritmo mejorado para realizar modelos de anticuerpos en la red. Prot. Eng. 13, 819-824). Las estructuras se visualizaron con pimol (DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA).

La Fig. 4 muestra una estrategia de clonaje para generar un vector bacteriano para la expresion de fragmentos Fab.

La Fig. 5a muestra un Western Blot sobre nitrocelulosa tras un SDS-PAGE utilizando un gel no reductor al 12 % tras la preparacion del IMAC (1). Deteccion mediante un anti-Fab humano - AP; tincion de AP de acuerdo con los procedimientos estandar; se aplicaron 15 !L de muestra en el gel. Abreviaturas: PP = extracto de periplasma, DL = flujo a traves del IMAC, W = fraccion de lavado, F = fraccion.

La Fig. 5b muestra una tincion de Coomassie de una purificacion con IMAC (1) tras un SDS-PAGE en un gel al 12%. La parte izquierda desde el marcador representaungel no reductory la parte derecha, un gel bajo condiciones reductoras. El volumen de muestra fue de 15 !L.

La Fig. 6 muestra una curva de saturacion de la union y la representacion de Scatchard derivada de la union del IZI06.1-Fab a l as celulas p ositivas para el re ceptor. Se ha sustraido la u nion no esp ecifica. Los dato s resultantes muestran que la union de IZI-06.1-Fab a TNFR1-Fas es saturable y especifica, con una afinidad aparente de KD = 0,778 nM.

La Fig. 7 muestra los analisis de citometria de flujo de fibroblastos embrionarios murinos que expresan de forma estable receptores quimericos que estan comprendidos por el dominio extracelular (ED) del TNFR1y el dominio citoplasmatico del receptor de muerte Fas, TNFR1-Fas (A) o receptores quimericos comprendidos por TNFR2-ED y Fas (TNFR2-Fas) (B), o receptores quimericos con una delecion del dominio rico en cisteina (CRD) 1 del TNFR1, fCRD1-TNFR1-Fas (C y D) o un mutante de intercambio de CRD1, comprendidos por una molecula de TNFR1-Fas que contiene la CRD1 de TNFR2, CRD1TNFR2-TNFR1-Fas (E y F). Estos transfectantes se incubaron en hielo durante dos hor as con 2.5 !g/ml de IZI-06.1-Fab (A - C, E, histogramas blancos), el anticuerpo especifico de TNFR1 mAb225 (D y F, histogramas blancos), el anticuerpo especifico de TNFR2 80M2 (B, histograma blanco+negrita) o que solo se trataron con anticuerpos secundarios como control (histogramas grises). El tampon de incubacion fue PBA (PBS + albumina seric a bov ina al 0, 05% + NaN 3 al 0,0 2%). La s celul as se i ncubaron c on anticu erpos secundarios marcados con FITC (80M2 ymAb225: de cabra anti-IgG murina; IZI-06.1 Fab: de cabra anti-cola de HIS) y las celulas se analizaron mediante citometria de flujo. Se visualizaron las celulas viables y se proporciona la intensidad total de fluorescencia (MnX) para cada anticuerpo. (Con = valores control).

La Fig. 8 muestra diagramas relacionados con la inhibicion del TNFR1 por IZI-06.1. Las celulas Kym I se sembraron un dia antes del tratamiento en una placa de 96 pocillos (10.000 celulas/pocillo en RPMI 1640 + FCS al 5%). Al dia siguiente las celulas se trataron con 100 ng/ml de huTNF en tres pasos de dilucion. El control fue la titulacion de PBS. Tras 16 horas, las celulas se analizaron mediante un ensayo de violeta cristal. La absorbancia de DO se midio a 550 nm. Los resultados se muestran como un porcentaje del control (celulas tratadas con PBS). Panel superior : 1,25 ng/ml de huTNF se estimo como u na dosis suficiente para inducir la toxicidad maxima. Panel inferior: Una cantidad constante de 1,25 ng/ml dehuTNF se aplico tras una preincubacion de 60min con 25 !g/ml de H398, H398-Fab o H398-Fab humanizado, todos diluidos en tres pasos. Tras 16 horas, las celulas se analizaron mediante el ensayo de violeta cristal. Se midio la absorbancia de DO a 550 nm. Los resulta dos se muestran como porcentaje del control.

La Fig. 9 muestra la composicion de la scFv IZI-06.1 en la configuracion VH-VL (a) y VL-VH (b) asi como una proteina de fusion scfv-albumina (c). Todas las construcciones contienen una secuencia lider N -terminal para la expresion soluble asi como una cola de hexahistidilo (His6) y en el caso de las moleculas scFv tambien una cola de myc. Las secuencias de union se muestran como barras negras.

El ligando de huTNFR1 de acuerdo con la presente invencion se une al TNFR1 humano con elevada especificidad, interaccionando con la CRD1 de su receptor. De forma inesperada, el ligando de huTNFR1 se une al TNFR1 con una afinidad muy elevada, que de forma ventajosa supera la del anticuerpo murino H398. Por lo tanto, el ligando del TNFR1 humano que se ha descrito anteriormente evita de forma muy eficiente la accion y bioactividad de los ligandos que aparecen en la naturaleza de TNFR1, TNF y LTa y es superior en su actividad antagonistica al anticuerpo H398 murino descrito previamente en la materia. Debido al contenido de secuencias de aminoacidos de origen humano este ligando es de una ventajosa baja inmunogenicidad. Por lo tanto, el li gando de huTNFR1 de la presente invencion permite el tratamiento de un paciente que padece un trastorno relacionado con el TNFR1 sin riesgo de reacciones adversas agudas frente al ligando y/o el rapido desarrollo de respuesta inmune, mientras al mismo tiempo se beneficia de una elevada selectividad y eficiencia de bloqueo de la secuencia de aminoacidos de origen no humano dirigidas contra el huTNFR1.

La presente invencion se ilustrara adicionalmente en los siguientes ejemplos, sin ninguna limitacion para esta.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generac ion in silico de un a ntagonista anti-receptor TNF1 basado en las secuencias del anticuerpo monoclonal murino H398 y secuencias genicas de Ig V de linea germinal humana

Las secuencias de aminoacidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del H398 y del dominio variable de la cadena ligera (VL) (Moosmayer et al., Ther. Immunol., 1995, N° 2, pags. 31-40) se utilizaron para buscar segmentos V de linea germinal humana similares utilizando la base de datos base V (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) asi como el IgBlast. Esta busqueda identifico varias secuencias VH de linea germinal (DP75, DP8, DP88) con una similitud global del 61,2-62,2% y varias secuencias VL de linea germinal (DPK15, DPK13, DPK27, DPK28) con una similitud del 8 0,0-81,0%. Las secu encias i dentificadas se alinearon co n las VH y VL d el H398 y se i dentificaron los aminoacidos criticos para la conformacion de las CDR, la interficie VH/VL asi como la zona Vernier como se han descrito (O'Brien S., Jones T ., Antibodyengineering, a lab manual, Springer, 2001, pags. 567-590; Lo B. K. C., Antibody en gineering, meth ods an d pr otocols, Hum ana Press, 200 4, pags. 13 5-159). L as regi ones C DR s e asignaron utilizando las definiciones de Kabat, Chothia, AbM y Contact (Martin A. C. R., Antibody engineering, a lab manual, Springer, 2001, pags. 422-439). Ademas, las clases canonicas de L1-L3 y H1-H2 se determinaron como las siguientes: L1-4, L2-1, L3-1, H1-1, H2-3 (Martin A. C. R., Antibody engineering, a lab manual, Springer, 2001, pags. 567-590). P ara el r eemplazo de las CDR, se defi nieron las CD R c omo l as sig uientes: ami noacidos L24-L34 (CDRL1), L46-L56 (CDRL2), L89-L97 (CDRL3), H26-H35 (CDRH1), H47-H65 (CDRH3) y H9 5-H102 (CDRH33). Como secuencias aceptoras humanas, se eligio el segmento de VH d e linea germinal VH1-69 (1-e, DP88) yel segmento de VL de linea germinal A3 (DPK15). Las seis CDR se insertaron en estos segmentos de linea germinal variables humanos (Fig. 1). Las secuencias unicas resultantes se denominaron IZI-06.1 VH (Id. de Sec. N° 7) y IZI

06.1 VL (Id. de Sec. N° 8), respectivamente.

Ejemplo 2: Sintesis de la secuencia de DNA de IZI-06.1 VH y IZI-06.1 VL

Se sintetizo el DNA con codones optimizados que codifica los dos dominios variables humanizados (IZI-06.1 VH, (Id. de Sec. N° 7), IZI-06.1 VL (Id. de Sec. N° 8)) mediante GeneArt (Regensburg, Alemania) anadiendo las dianas de clonaje apropiadas (Fig. 2).

Ejemplo 3: Estructuras modelo de los fragmentos Fv de H398 y IZI-06.1

Las estructuras modelo de los fragmentos Fv de H39 8 y IZI-06.1 Fv se ge neraron utilizando el servidor Web Antibody Modelling (WAM) (Whitelegg N. R. J., Rees A. R., Web. Prot. Eng., 2000, N° 13, pags. 819-824). Un alineamiento de l as d os e structuras mo delo reve la una e levada c oncordancia del es queleto proteico y l a conformacion de las cadenas laterales, lo que incluye las CDR, con la excepcion de CDRH3, que muestra una ligera distorsion (Fig. 3). Asi, la Asp96 d el extremo de la CD RH3 del mo delo H398 y del modelo IZI-06.1 se ha movi do aproximadamente 0,38 nm fuera de la region de union del antigeno.

Ejemplo 4: Clonaje de IZI-06.1 y construccion de un fragmento de Ig monovalente (formato Fab)

Los genes que codifican los dominios variables de las cadenas pesada y ligera (VH, VL) del anticuerpo IZI-06.1 se sintetizaron mediante GeneArt y se proporcionaron en un vector pP CR-Script (pPCR-Script-IZI-06.1-VH, pPCR Script-IZI-06.1-VL) que contenia las dianas de clonaje apropiadas. Para el clonaje del fragmento Fd (VH-CH1) (= construccion pAB1-IZI-06.1-Fd) se digirio el plasmido pPCR-Script-IZl-06.1-VH con las enzimas de restriccion Sfil y Xhol, y el fragmento resultante se clono en un vector pAB1-CH1 (que contenia el gen del dominio CH1 de la cadena pesada y1 de inmunoglobulina humana) digerido con las mismas enzimas. Para el clonaje de la cadena ligera (VL-CL) (= construccion pABI-IZI-06.1-L) se digirio el plasmido pPCR-Script-IZI-06.1-VL con las enzimas de restriccion Sfil y Ascl, y el fragmento resultante se clono en un vector pAB1-CH1 (que contenia el gen del dominio C? humano) digerido con las mismas enzimas. El gen de la cadena ligera que incluyendo el punto de union a ribosomas (RBS) codificado por el vector y la secuencia lider pelB se amplifico mediante PCR a partir del plasmido pA81-IZI-06.1-L

utilizando los cebadores A (5'-GAC CAT GAT TAC GCC AAG CTT TCC ACG GCA TGC AAA TTC-3') (Id. de Sec. N° 11) y B (5'-ACG ACG GCC AGT TCT AGA TTA ACA CT C TCC CCT GTT GAA-3') (Id. de Sec. N° 12). Con este paso se introducen las dianas HindIII y Xbal en los extremos 5' y 3', respectivamente. El producto de PCR se digirio con las enzimas de restriccion HindIII y XbaI y se clono en el plasmido pAB1-IZI-06.1-Fd digerido con las mismas enzimas. Esto resulta en un plasmido final de expresion bacteriana pAB1-IZI-06.1-Fab que codifica un fragmento Fab del anticuerpo IZI-06.1, lo que incluye una cola de hexahistidilo en el extremo C-terminal del fragmento Fd.

Ejemplo 5: Sistema de expresion

Vector:

pAB1 (Kontermann et al., 1997)

Celulas:

E.coli TG1 (Stratagene, La Jolla, U.S.A.)

Principio basico:

La expresion del Fab IZI-06.1 esta bajo control de PLac y esta inducida por IPTG de acuerdo con procedimientos estandar. La seleccion se consigue mediante la adicion de ampicilina (bla-Gen).

La secuencia lider peLB en N-terminal permite la e xpresion periplasmatica del producto genico diana, eliminandose esta ultima de la pr oteina diana a traves del procesado proteolitico en el periplasma. La proteina diana (IZI-06.1) se aisla como una pr oteina s oluble tras l a d esestabilizacion de la pared celular bacteriana con EDTA y lisozima. Las celulas bacterianas restantes se estabilizan osmoticamente como esferoblastos con tampon de sacarosa/ MgSO4 para evitar la lisis celular, y las celulas se separan mediante centrifugacion.

Expresion:

Procedimiento:

Cultivo en frascos en agitacion, por lotes.

Pre cultivo:

50 mL de medio LB mas 100 !g/mL de am picilina y glucosa al 1 %, se inoculo con un a un ica colo nia d e E.coli. Se inc ubo tod a la n oche a 3 0°C en un a plataforma giratoria (125 rpm).

Cultivo principal:

1 L de medio LB mas 100 !g/mL de ampicilina y glucosa al 0,1 %, se inoculo con 5 % (V/V) de pre cultivo. Se incubo a 30°C en una plataforma giratoria (125 rpm). A una DO600 (- 3 h de tiempo de incubacion) se indujo la expresion de proteina mediante la adicion de IPTG (concentracion final 1 mM). El tiempo de expresion fue de 3,5 h a 25°C.

Extraccion:

El cultivo se c entrifugo 10 min a 4000 g. L os botones se resusp endieron en 50 mL de tamp on de so lubilizacion de p eriplasma PPA (P PA: Tris-HCl 30 mM, EDTA 1 mM, Sacarosa al 2 0%). Se an adio lisozima 50 !g/mL y se in cubo la suspension durante 30 mi n en hi elo. Se e liminaron los esferoblastos mediante centrifugacion a 18.00 0 g. El sobren adante (extracto de periplasma) se dializo durante la noche con 200 x Vol. de PBS. El rendimiento tipico de este protocolo de expresion/ extraccion es de 1-2 mg de Fab IZI-06.1/L de cultivo.

Ejemplo 6: Purificacion

Principio basico: Un protocolo de purificacion en tres pasos con dos tandas de IMAC consecutivas seguidas p or cromatografia de exclusion por tam ano ( SEC). El IZ I-06.1 es portador de u na col a de myc-His en C-t erminal (veas e pAB1, estra tegia d e clonacion). El primer y se gundo p aso de p urificacion es med iante IMAC (cromatografia de afi nidad de ion meta lico i nmovilizado). Los resi duos de histidina dentro de la c ola de His se u nen especificamente a los i ones de Ni quelados en el ligando en una matriz de Sefarosa. El segundo paso de IMAC es para c oncentrar el pro ducto. Se rea lizo u na SEC d e fo rma semi-preparativa utilizando FPLC (Pharmacia, Alemania). Este paso separa de acuerdo con el PM relativo y permite la separacion de agregados de mayor PM de la proteina diana asi como prot einas de mayor ymenos PM y contaminantes no proteicos. De forma esp ecifica, la pr oteina di ana IZI-06.1 mal plegada y/o n o pr ocesada muestra un P M relativo ma yor en l a SE C y p uede s epararse d el producto bioactivo correctamente plegado.

IMAC (1):

Columna:

HiTrap 5 mL (Ni-Ion quelante) (Amersham Pharmacia).

Aplicacion:

4 x 50 mL extracto periplasmico (dializado).

Tasa de flujo:

0,5-1,0 mL/min.

Fraccion de lavado:

Tampon fosfato sodico 25 mM pH 8, 0; NaCl 0,5 M; I midazol 2 5 m M, 5 X

V(columna).

Elucion:

Tampon fosfato sodico 25 mM pH 8.0; NaCl 0,5 M; Imidazol 500 mM.

Fracciones:

8 x 3,5 mL IZI-06.1 eluye predominantemente en las fracciones 2 y 3 (Figs. 5a,

5b). Las fracciones 2-4 se juntaron y dializaron con 500 x Vol. de PBS. El

dializado resultante se concentro mediante un segundo paso de IMAC (IMAC 2).

IMAC (2):

Columna:

HiTrap 1 mL (Ni-Ion quelante) (Amersham Pharmacia).

Aplicacion:

2 x 3 mL fracciones dializadas a partir de IMAC (1) (2 tandas).

Tasa de flujo:

0,5-1,0 mU/min

Fraccion de lavado:

Tampon fosfato sodico 25 mM pH 8, 0; NaCl 0,5 M; I midazol 2 5 m M, 5 X

V(columna).

Elucion:

Tampon fosfato sodico 25 mM pH 8.0; NaCl 0,5 M; Imidazol 500 mM.

Fraccion:

8 x 1,0 mL

SEC/ FPLC:

columna:

Super dex 200 (Pharmacia)

Eluyente:

PBS (esteril filtrado)

Aplicacion:

200 !L de fraccion 2 o 3 a partir de IMAC(2)

Tasa de flujo:

0,25 mL/min

Fracciones:

N° 1-5: 1 mL, N° 5-35: 0,5mL

IZI-06.1 Fab esta presente principalmente en las fracciones 24/25 (Fab activo

mediante el bioensayo) y en pequenas cantidades en las fracciones 20/21 (Fab

menos activo, probablemente de forma predominante proteina mal plegada).

Ejemplo 7: Actividad funcional de IZI-06.1 Fab

Caracteristicas de union, determinacion de la afinidad de union mediante estudios de equilibrio de union:

Para la determinacion de la afinidad a TNFR1, se realizaron estudios de saturacion de union a 4°C con IZI- 06.1 Fab marcado de forma radioactiva. El anticuerpo se marco co n yodo 125 utilizando el metodo de la cloramina T. En resumen, 10 !g de proteina purificada se incuba en tampon fosfato (pH 7,4) a temperatura ambiente con 3,7 x 107 Becquerel de Na 125I junto con cloramina T. La reaccion se detiene con Na-disulfito y exceso de Nal y las proteinas marcadas se separan mediante filtracion en gel utilizando una columna PD10. (Pharmacia). Se recogieron fracciones de un mililitro. La proteina se eluyo en las fracciones 2y3, se detecto 125I libre en las fracciones 7 a 9. La concentracion de proteina resultante fu e d e 2,7 !g/ml y la ra dioactividad fu e d e 1 20.000 cpm/n g. El materi al bioactivo se determino mediante la incubacion de cantidades constantes de IZI-06.1 Fab marcado con cantidades crecientes de celulas de fibroblasto de raton que expresan TNFR1-Fas. La curva hiperbolica resultante se utilizo para ajustar una ecuacion de union de un sitio mediante regresion lineal yel valor de union maximo extrapolado (Bmax) representa el porcentaje de material bioactivo (aprox. 10%). Los datos de este analisis se utilizaron para calcular las concentraciones de anticuerpo aplicadas en los siguientes experimentos.

Para determinar la afinidad (valor KD) de IZI-06.1 Fab, se incubaron 200.000 celulas positivas para TNFR1-Fas en hielo durante tres horas con concentraciones crecientes de IZI-06.1 marcada (2,5 - 50 ng en un volumen total de 150 !l). Como tampon de union, se utilizo tampon fosfato salino + 2% suero fetal bovino + 0,02 % de NaN3. Se determino la union no especifica mediante la coincubacion de celulas con la concentracion correspondiente 180 veces superior de IZI-06.1 no marcado. La union de 125I-Fab se determino con un contador gamma ylos datos resultantes se utilizaron para ajustar una hiperbola de union de un sitio que contiene la constante de saturacion de la union KD:

Unido=(Bmax x �IZIFab�) / ��IZIFab� + KD)

La ca lidad de los datos s e eval uo al r ealizar una trans formacion p or a li nearizacion, tambi en c onocida c omo representacion de Scatchard. Los datos resultantes muestran que la union de IZI-06.1 a TNFR1 es saturabley especifica, con una afinidad aparente de KD = 0,778 nM.

Caracteristicas de union, selectividad de TNFR1 y mapeo de epitopos mediante intercambio/delecion del dominio de receptor y analisis de FACS:

Se utilizo un IZI-06.1-Fab positivo para la cola de His para determinar la especificidad de la union de TNFR1 o union de TNFR1-Fas, respectivamente asi como la caracterizacion del epitopo reconocido por el derivado de anticuerpo. La Figura 7A muestra un analisis de citometria de flujo por inmunofluorescencia indirecto. El IZI-06.1-Fab tine positivamente las celulas que expresan la quimera TNFR1-Fas en comparacion con el control negativo (reactivo de deteccion: anticuerpo especifico de His marcado con FITC. La i ntensidad comparablemente baja de la tinc ion en comparacion con el IF indirecto con mab225 especifico de TNFR1 (Fig. 7D) se sabe que es debido principalmente a los diferentes reactivos secundarios de deteccion utilizados (anticuerpo especificode deteccion de His-tag versus anticuerpo de deteccion anti Ig de raton). La union no especifica ocurre sobre las celulas que expresan TNFR2-Fas en comparacion con el Control negative, el anticuerpo 80M2 especifico de TNFR2 que sirve como control positivo (Fig. 7B). La tincion no especifica ocurre sobre una celula positiva para constrrucciones de TNFR1- Fas, en las que el dominio distal de membrana rico en cisteinas (CRD) 1 ha sido eliminado (Fig. 7C). Esta construccion, no obstante, se puede detectar facilmente mediante otro mab especifico de TNFR1, mab225 (Fig 7D). Ademas, no ocurre tincion especifica sobre una celula que expresa una construccion TNFR1-Fas funcional (competente de senales), en el que la membrana distal CR01 ha sido sustituida por la del TNFR2 (Fig. 7E). De nuevo, esta quimera de receptor se puede detectar facilmente mediante el mab225, conocido por unirse a TNFR1 fuera del CRD1. Los datos mostrados en la fig. 7C-F permiten por lo tanto concluir que IZI-06.1 reconoce el C-RD1 de TNFR1. Los inventores saben que CRD1 esta involucrado de forma critica en la union de TNF influyendo en la conformacion de CRD2, proporcionando este ultimo, ju nto con CRD3, uno de los sitios d e con tacto directos a lig ando ( datos no publicados por l os inventores).

Inhibicion de la accion de TNF:

Se analizo el IZI-06.1 Fab purificado para la actividad antagonista en un modelo de linea celular de rabdomiosarcoma humano Kym-1, que es altamente sensible a TNF (LD50 por debajo de 100 pg/ml de sTNF, sin necesidad de inhibicion de la sintesis de proteinas) yresponde a traves de ambos TNFR1 yTNFR2 (la ruta de senalizacion de este ultimo mostro previamente la induccion mediante la senalizacion endogena de NF-kB la expresion de TNF y la posterior senalizacion autotropica de la apoptosis de la membrana expresada por TNF mediante TNFR1; (Grell at al., EMBO J., 1999, N° 18, p. 3034-3043). La actividad antagonista de IZI-06.1 Fab se compara con mab H398 murino y se prepara enzimaticamente el Fab a partir de H398. La Figura 8 muestra el bloqueo eficiente y completo de TNF mediado por la accion citotoxica sobre las celulas Kym-1 mediante IZI-06.1 Fab, a concentraciones dos a cuatro veces inferiores si se comparan con Fab H398. El mab de longitud completa, tal como se esperaba de resultados anteriores, muestra u na mayor activ idad n eutralizadora en c omparacion c on los F abs monovalentes a concentraciones inferiores, probablemente debido a una tasa del reactivo divalente mas baja (mayor avidez). Es importante destacar que, el mab H398 no logra un bloqueo completo de la actividad de TNF en este ensayo in vitro tan sensible, debido a la conversion a partir de un antagonista en un agonista parcial a altas concentraciones. Esto se explica mediante el aumento dependiente de dosis en el entrecruzamiento de TNFR, formando asi de forma potencial complejos funcionales de senalizacion de TNFR independientes de ligando, (vease tambien Moosmayer et al., Ther. Immunol., 1995, N° 2, p. 31-30)

En resumen, de acuerdo con la presente invencion, una de las caracteristicas clave sorprendentes e inesperadas es que el antagonista IZI-06.1 Fab especifico de TNFR1 muestra un bloqueo superior de la actividad de TNFR1 en comparacion con un e xistente Fab murino de la misma e specificidad y es superior a un mab d e longitud completa debido a la completa falta de capacidad de entrecruzamientro de TNFR, es decir IZI-06.1 Fab carece de potencial intrinseco de senalizacion y por tanto un verdadero antagonista de TNFR1.

Ejemplo 8: Fv IZI-06.1 de cadena sencilla y derivados del mismo

Clonaje y expresion de scFv IZI-06.1 (VH-VL):

5 ScFv IZI-06.1 (VH-VL) esta gener ado medi ante u na c lonacion de d os pasos e n el vector fage mido pH EN2 introduciendo un enlazante de 15 residuos (GGGGSGGGGSGGSA�) (Id. de Sec. N°: 13) codificado en un vector asi como una secuencia lider pelB en N-terminal y una colamyc y cola hexahistidilo (His6) en C-terminal. Para la expresion soluble, la secuencia que codifica el scFv se obtiene mediante la digestion del plasmido de DNA pHEN2scFv IZI-06.1 (VH-VL) con las enzimas de restriccion Sfil y Notl y el clonaje del fragmento resultante en el vector de expresion pAB1 se digiere con las mismas enzimas. La expresion y purificacion se realiza como sigue: 2 L de 2xT�, 100 !g/mL de ampicilina, 0,1% de glucosa se inocula durante la noche con 20 ml de cultivo de TG1 transformado y se hace crecer hasta fase exponencial (DO600 =0,8) a 37°C. La expresion de proteinas se induce mediante la adicion de IPTG 1 mM y las bacterias se hacen crecer durante 3 h adicionales a TA. Las celulas se recogen mediante centrifugacion y se resuspenden en 100 ml de Tris-HCl 30mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, sacar osa al 20%. Tras la

15 adicion de 5 mg de lisozima, las celulas se incubaron durante 15-30 min sobre hielo. Tras la adicion de Mg2SO4 10 mM las celulas se centrifugaron a 10.000 g durante 30 min, 4°C. El sobrenadante se dializo con PBS y se cargo en una columna Ni-NTA (�iagen, Hilden, Alemania) equilibrada con tampon fosfato sodico 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM. Tras un paso de lavado (tampon fosfato sodico 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 35 mM) se eluyeron los fragmentos de anticuerpo recombinante con cola de His con tampon fosfato sodico 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 100 mM. Las fracciones de proteina se juntaron y dializaron con PBS. La concentracion de proteina se determino espectrofotometricamente y se calculo utilizando el valor e calculado de cada proteina.

Clonaje y expresion de una proteina de fusion scFv IZI-06.1-albumina:

25 Se genero una proteina de fusion de albumina con scFv IZI-06.1 (VH-VL) humano (Id. de Sec. N°: 10) mediante la clonacion d el DNA q ue c odifica scF v IZ I-06.1 (VH-VL) d e un pl asmido, pAB1 com o fragmento Sfil-Notl e n u n plasmido pSecTagA-HSA que contiene el cDNA que codifica la albumina humana. El plasmido de DNA se transfecto con L ipofectamina�2000 (Invitrog en, Ka rlsruhe, Al emania) e n cel ulas HEK29 3. Los transfectantes establ es se generaron me diante se leccion co n ze ocina (3 00 !g/ml). Las c elulas se e xpandieron y crecieron h asta u na confluencia del 90% en medio RPMI, FCS 5%. Para la produccion de proteina, las celulas se cultivaron en Opti-MEM (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) sustituyendo el medio cada 3 dias durante 3-4 veces. Los sobrenadantes se juntaron y las proteinas se concentraron mediante precipitacion con sulfato de amonio (saturacion del 60%), antes de cargar en una columna Ni-NTA (�iagen, Hilden, Alemania). La purificacion mediante IMAC se realizo tal como se ha descrito antes

35 Listado de secuencias

�110� Universit�t Stuttgart pfizenmaier, Klaus �120� Antagonistas selectivos de huTNFR1 �130� ninguno �160� 17 �170� PatentIn version 3.3 �210� 1 �211� 10

45 �212� PRT �213� Mus musculus �400� 1

�210� 2 �211� 20 �212� PRT �213� Mus Musculus �400� 2

55 �210� 3 �211� 6

�212� PRT �213� Mus Musculus �400� 3

�210� 4 �211� 18 �212� PRT

�213� Mus Musculus �400� 4

�210� 5 �211� 11 �212� PRT

15 �213� Mus Musculus �400� 5

�210� 6 �211� 9

20 �212� PRT �213� Mus Musculus �400� 6

�210� 7 25 �211� 115

�212� PRT

�213� Artificial

�220�

�223� IZI-06.1 VH - fragmento de anticuerpo humanizado 30 �400� 7

�210� 8 �211� 113 �212� PRT �213� Artificial �220�

�223� IZI-06.1 VL - fragmento de anticuerpo humanizado

�400� 8

10 �210� 9 �211� 288 �212� PRT �213� Artificial

15 �220� �223� scFv IZI-06.1 VH-VL - fragmento de anticuerpo humanizado �400� 9

�210� 10 �211� 867 �212� PRT �213� Artificial �220� �223� Proteina de fusion scFv IZI-06.1 HSA �400� 10

�211� 39

�212� DNA

�213� Artificial.

5

�220�

�223� Cebador A

�400� 11

gaccatgatt acgccaagct ttccacggca tgcaaattc 39

�210� 12

10

�211� 39

�212� DNA

�213� Artificial

�220�

�223� Cebador B

19

�400� 12 acgacggcca gttctagatt aacactctcc cctgttgaa 39 �210� 13 �211� 15 �212� PRAT �213� Artificial �220� �223� Residuos del enlazante

�400� 13

10 �210� 14 �211� 345 �212� DNA �213� Artificial

15 �220� �223� IZI-06.1 VH - fragmento de anticuerpo humanizado VH �400� 14

�210� 15 20 �211� 339

�212� DNA

�213� Artificial

�220�

�223� IZI-06.1 VL - fragmento de anticuerpo humanizado 25 �400� 15

�210� 16 �211� 867 �212� DNA

30 �213� Artificial �220� �223� scFv IZI-06.1 - fragmento de anticuerpo humanizado �400� 16

�210� 17 �211� 2604 �212� DNA �213� Artificial �220� �223� scFv IZI-06.1 HSA proteina de fusion �400� 17

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un ligando del huTNFR1 que comprende una construccion de proteinas con (i) una o mas secuencias de aminoacidos de origen humano capaces de reducir la respuesta inmunogenica de dicho ligando del huTNFR1 en humanos, y (ii) una o mas secuencias de aminoacidos de origen no humano capaces de unirse de forma selectiva al huTNFR1, en la que la construccion de proteinas comprende la secuencia de aminoacidos de acuerdo con el Id. de Sec. N° 7 como dominio variable de la cadena pesada (VH) y la secuencia de aminoacidos de acuerdo con el Id. de Sec. N° 8 como dominio variable de la cadena ligera (VL), o un fragmento de un anticuerpo humanizado, siendo el fragmento una scFv que comprende la secuencia de aminoacidos de acuerdo con el Id. de Sec. N° 9.

2. 2.

   El ligando de huTNFR1 de acuerdoconreivindicacion 1, que comprende una colaadicional que permite la interaccion especifica con un compuesto aceptable a nivel biologico.

3. 3.

   El ligando de huTNFR1 de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que la construccion de proteinas ademas comprende un compuesto aceptable a nivel biologico unido de forma no covalente o unido de forma covalente a esta mediante la conjugacion quimica post-traduccional o mediante tecnologia de DNA recombinante.

4. 4.

   El ligando de huTNFR1 de acuerdo con la reivindicacion 3, en la que el compuesto aceptable a nivel biologico se selecciona de entre el grupo que consiste en las proteinas sericas.

5. 5.

   El ligando de huTNFR1 de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en las q ue el compuesto aceptable a nivel biologico es la albumina.

6. 6.

   El ligando de huTNFR1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 5, en las que la construccion de proteinas comprende una proteina de fusion con albumina serica humana de acuerdo con el Id. de Sec. N° 10.

7. 7.

   Un acido nucleico que codifica el ligando del huTNFR1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a

8. 6.

9. 8.

   Un vector que comprende la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 7.

10. 9.

    Una celula huesped aislada que contiene el acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 7 o el vector de acuerdo con la reivindicacion 8.

11. 10.

    U na c omposicion farm aceutica q ue comprende u na ca ntidad efectiva a n ivel terap eutico d el l igando del huTNFR1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, y opcionalmente uno o mas componentes adicionales seleccionados de entre el grupo que consiste en un transportador aceptable a nivel farmaceutico, sales aceptables a nivel farmace utico, un a gente au xiliar, un estabilizante, un d iluyente y u n so lvente, o cua lquier combinacion de los mismos.

12. 11.

    La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 10 para el tratamiento de la artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y otras enfermedades inflamatorias cronicas y/o autoinmunes, infecciones virales o b acterianas agudas fu lminantes, e nfermedades m etabolicas, enfermedades neurodegenerativas agudas, enfermedades neurodegenerativas cronicas, preferiblemente seleccionadas de entre la esclerosis multiple, enfermedad de Parkinson y Alzheimer, enfermedades geneticas hereditarias en las que TNF/ TNFR1 es el medi ador patologico ca usante, preferi blemente se leccionadas de e ntre el sindrom e de la fi ebre periodica y el querubismo, y el cancer.

13. 12.

    Un proceso para la produccion de un ligando de huTNFR1 con una respuesta inmunogenica reducida cuando se administra a un ser humano, que comprende los pasos de (a) proporcionar una construccion de proteina como la que se ha d efinido en cu alquiera d e las reivin dicaciones de 1 a 6, (b) identific ar una o mas secuencias de aminoacidos d e orige n hum ano ca paces de un irse de fo rma selectiv a al huT NFR1 mediante sel eccion g uiada utilizando una o mas de las secuencias de aminoacidos de la construccion de proteina como matriz, y (c) construir el ligando que comprende al menos una o mas de las secuencias de aminoacidos identificadas en el paso (b).

14. 13.

    L a uti lizacion de un li gando de l h uTNFR1 qu e c omprende una c onstruccion de protein a d e acuerdo c on cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, como matriz para la seleccion guiada en la identificacion y construccion de otro ligando de huTNFR1 de baja inmunogenicidad que comprende solo secuencias de aminoacidos de origen humano.

    Figuras 7A a 7F