JP2015526091A - 生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するための多孔性固体相及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
(b)前記(a)段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階とを含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法を提供する。
(a)生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
(b)前記(a)段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相に逆転写酵素(Reverse Transcriptase)を添加して逆転写酵素反応を行う段階と、
(c)前記逆転写酵素反応物を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階とを含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法を提供する。
(a)生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
(b)前記(a)段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と、
(c)前記増幅産物を検出する段階とを含む、生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法を提供する。
(a)生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
(b)前記(a)段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相に逆転写酵素(Reverse Transcriptase)を添加して逆転写酵素反応を行う段階と、
(c)前記逆転写酵素反応物を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と、
(d)前記増幅産物を検出する段階とを含む、生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法を提供する。
本発明の多孔性セラミックキューブを用いた遺伝体の吸着とRT-PCR/PCR鋳型としての活用模式図を図1に示した。本発明では、1立方ミリメートル(1mm3)のキューブ表面に孔隙の大きさが変わるように表1に記載された主成分を材料で製作温度を異にして14種のキューブを製作し、その多孔性セラミックキューブを拡大したものを図1Bに示した。キューブは多孔性であるので、孔隙よりも小さな物質を非選択的に吸収するが、孔隙の大きさを異にして(一般に高い温度でセラミックを製作する場合、孔隙が小さくなる)組織が破砕される際に出てくる様々な物質の中から所望のものを選択的に吸収、即ち孔隙の大きさによってPCR阻害物質を最大限排除できる孔隙の大きさで超微細ろ過(ulrafiltration)機能をキューブに付与することに目的がある。
青磁と白磁を含む7種類の陶器の切片をニッパ(nipper)で細かく破砕し、釉薬を含まない部位のうち、大きさが約1mm3の破片を選んで遺伝体の吸着材料として用いた。図2Aの5番の陶器の切片の場合、釉薬が塗布された部位によって黄色と灰色とに区分されたが、これらのそれぞれから得た黄土色の破片は5と、灰色の破片は6と表記した。Capsicum annuum CM334の唐辛子の葉にそれぞれの陶器の破片を乗せ、ピンVの扁平な頭部分で陶器の破片を軽く押圧してgDNAを吸収するようにした。唐辛子の毛茸と関連する分子マーカーを検定できるプライマプリミックスが添加されたPCRチューブにgDNAを吸収させたそれぞれの陶器の破片をチューブ当たり1個ずつ添加した。PCRプリミックスは、10pmolセンスプライマ(Tsca-F:AAACGCCATCATTCGTTTTC:配列番号1)0.5ul、10pmolアンチセンスプライマ(Tsca-R:CATGAAAGTTGACCCGAACA:配列番号2)0.5ul、4ulのrTaq-Mix、15ulのDWで構成され、PCR産物は94℃で3分間変性させた後(94℃/30秒、59℃/30秒、72℃/60秒)で35回増幅し、72℃/5分間反応させた後、EtBrを含む1%のアガロースゲル相で電気泳動して目的PCR産物の増幅有無を確認した。
表1に記載された酸化物を主成分として製造されたそれぞれの多孔性セラミックキューブの表面を電子顕微鏡(SEM)で拡大した写真を図3に示した。セラミック主成分及び製作温度によって表面と孔隙の大きさに差があるので、目的とする生物学的分子の吸収率を高めるためには、セラミックキューブの最適な孔隙の大きさ及び数を有するように製作して使用しなければならない。
酸化物材質の多孔性セラミックキューブの種類による生物学的分子の吸収効率を調べるために、CMVに感染した唐辛子の葉から分離した総RNAとCM334の唐辛子から分離したゲノムDNAをそれぞれのセラミックキューブで吸収させた後、これをRT-PCRとPCR用鋳型として用いた。CMVはRT-PCRプリミックス(RTamp1、Biocubesystem、Korea)にセンス(5’-TACATTGAGTCGAGTCATG-3’:配列番号6)及びアンチセンス(5’-TGGAATCAGACTGGGACA-3’:配列番号7)プライマをそれぞれ25pmolの濃度で添加し、50℃/20分、94℃/10分、(94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒)35回、72℃/5分間反応させた後、EtBrを含む1%のアガロースゲル相で電気泳動して目的PCR産物(670bp)の増幅有無を確認した(図4A)。gDNAの場合、カプシクム・アンヌームCM334(Capsicum annuum CM334)唐辛子の葉から分離した高濃度(100ug)のgDNAを多孔性セラミックキューブでそれぞれ吸収させ、PCRチューブ当たり1個ずつ添加した。PCRプリミックスは、10pmolセンスプライマ(Tsca-F:AAACGCCATCATTCGTTTTC:配列番号8)0.5ul、10pmolアンチセンスプライマ(Tsca-R:CATGAAAGTTGACCCGAACA:配列番号9)0.5ul、4ulのrTaq-Mix、15ulのDWで構成され、PCR産物は94℃で3分間変性させた後(94℃/30秒、59℃/30秒、72℃/60秒)で35回増幅し、72℃/5分間反応させた後、EtBrを含む1%のアガロースゲル相で電気泳動して目的PCR産物の増幅有無を確認した。ウイルスRNAの場合も4Aのように、14種セラミックキューブは何れも類似する結果を示した(図4A)。反面、精製されたgDNAを用いたPCR反応の効率は、キューブの材質と製作温度によって異なって現れた(図4B)。レーン1(Al2O3、1450℃)とレーン2(Al2O3、1550℃)では増幅量に大きな差がなく、低い温度で製作されたレーン3(Fe2O3、800℃)とレーン4(Fe2O3、850℃)では増幅が殆ど行われなかったが、高温で製作したレーン5(Fe2O3、900℃)では弱く増幅された。レーン6(LTCC、650℃)は増幅されなかったが、レーン7(LTCC、750℃)とレーン8(LTCC、850℃)では強く増幅された。レーン9(PbO、1000℃)とレーン11(PbO、1250℃)は増幅量が少ないが、レーン10(PbO、1150℃)は強く増幅された。レーン12(ZnO、800℃)とレーン14(ZnO、1000℃)は殆ど増幅されなかったが、レーン13(ZnO、900℃)は弱く増幅された。以上のような結果を総合してみると、キューブ材料と製作温度によってゲノムDNAの吸収率に差があり、レーン8(LTCC、850℃)、レーン11(PbO、1250℃)、レーン14(ZnO、1000℃)のように孔隙が殆どない構造では本実験で用いたPCR条件では検出されない程度に少ない量のゲノムDNAが吸収されることが判断された。
多孔性セラミックキューブの種類による生物学的分子の吸収効率を調べるために、CMVに感染した唐辛子の葉と精製したCMV粒子をそれぞれのセラミックキューブで吸収させた後、これをRT-PCRとPCR用鋳型として用いた。CMVはRT-PCRプリミックス(RTamp1、Biocubesystem、Korea)にCMV粒子対象特異的プライマセットインセンス(5’-TACATTGAGTCGAGTCATG-3’:配列番号10)及びアンチセンスプライマ(5’-TGGAATCAGACTGGGACA-3’:配列番号11)をそれぞれ20pmolの濃度で添加し、50℃/20分、94℃/10分、(94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒)35回、72℃/5分間反応させた後、EtBrを含む1%のアガロースゲル相で電気泳動して目的PCR産物(670bp)の増幅有無を確認した。精製したウイルスを多孔性セラミックキューブで吸収させたとき、PCR産物がより多く増幅されたが、両処理区間のPCR産物増幅の様相は類似している(図5)。
図5Aのレーン1、2は、主成分はAl2O3で同一であるが、製作温度は1450℃、1550℃であり、レーン3、4、5の主成分はFe2O3で同一であるが、製作温度は800℃、850℃、900℃でAl2O3及びFe2O3をそれぞれ1550℃及び900℃で製作した多孔性セラミックキューブを用いてDNAを分離させた場合、PCR効率が高く現れた。レーン6、7、8も主成分はLTCC(Low temperature co-fired ceramic)で同一であるが、製作温度は650℃、750℃、850℃であり、レーン6は全く増幅されていない結果を示し、レーン8が7よりも増幅がより効率よく行われることが明らかになった。
カプシクム・アンヌームsr10(Capsicum annuum sr10)唐辛子の葉上に多孔性セラミックキューブを1つ乗せ、ピンVの頭部分で押圧してそれぞれのキューブでgDNAを吸収させ、これをPCRチューブ当たり1個ずつ添加した。PCR反応液は2X PCRプリミックス(gDamp1、Biocubesystem、Korea)10ulに10pmolセンスプライマ(Primer 10-F:5’-TGGCTTATCGAAGGAGCCAT-3’:配列番号12)0.5ul、10pmolアンチセンスプライマ(Primer 10-R:5’-AGATGAAACCAAAGCCTCCA-3’:配列番号13)0.5ul、gDNAが吸収された1個のキューブ、9ulのDWを添加して準備し、陽性対照区ではキューブの代わりに精製したgDNA(20ng/ul)2ulと7ulのDWを添加して準備した。PCR産物は、94℃で3分間変性させた後、94℃/30秒、58℃/30秒、72℃/60秒で35回、72℃/5分間反応させて増幅し、EtBrを含む1%のアガロースゲル相で電気泳動して目的PCR産物の増幅有無を確認した。その結果、レーン5(Fe2O3、900℃)、レーン8(LTCC、850℃)、レーン9(PbO、1000℃)、10(PbO、1150℃)及びレーン14(ZnO、1000℃)は増幅が効率よく行われ、レーン6(LTCC、650℃)、レーン7(LTCC、750℃)及びレーン8(LTCC、850)とレーン12(ZnO、800℃)、レーン13(ZnO、900℃)及びレーン14(ZnO、1000℃)は、製作温度によって増幅効率が明確に区別された(図6)。
(1)LTCC多孔性セラミックキューブの製作温度がPCR増幅に及ぼす影響
反復実験の結果、ZnOよりもLTCC材料で製作温度によるgDNA増幅の差は明確に現れた(図6参照)。製作温度によるgDNAの増幅効率をより綿密に調べるために、LTCC多孔性セラミックキューブ5種(30〜34)を新たに製作した。製作温度は650〜850℃で50℃間隔で製作した(30(LTCC、650℃)、31(LTCC、700℃)、32(LTCC、750℃)、33(LTCC、800℃)、34(LTCC、850℃))。この際に用いたプライマは、センスプライマ(Primer 10-F:5’-TGGCTTATCGAAGGAGCCAT-3’:配列番号12)、アンチセンスプライマ(Primer 10-R:5’-AGATGAAACCAAAGCCTCCA-3’:配列番号13)とセンスプライマ(Primer 146-F:5’-AGAAGAAAGAGGAGGCTCCA-3’:配列番号14)、アンチセンスプライマ(Primer 146-R:5’-TGGAAGCCTTTGAGGGATCT-3’:配列番号15)の2種類を用いた。PCR産物は94℃で3分間変性させた後、94℃/30秒、58℃/30秒、72℃/60秒で35回、72℃/5分間反応させて増幅し、EtBrを含む1%のアガロースゲル相で電気泳動して目的PCR産物の増幅有無を確認した(図7)。
製作温度によるキューブの特性を調べるために、5種のLTCC多孔性セラミックキューブを製作し、これらの表面(図8A〜E)と内部(図8F〜J)の切断面、物質吸収能力及びろ過能力をSEMとTEMでそれぞれ調べた。キューブの表面(図8A〜E)と内部(図8F〜J)の切断面の製造温度が増加するほど滑らかな傾向を示した。両場合ともポアサイズはum水準ではほぼ類似し、温度が高いほどポア数が減少する傾向を示した。
ポア数が減少するということは、分子吸収量が少なくなるものと理解できるが、より明確な資料を得るために、製作温度が異なるLTCC多孔性セラミックキューブの物質吸収能力とろ過能力を人為的に製作した金ナノ粒子(平均直径が40nm)とポリスチレン粒子(平均サイズ直径が2um、5um、38〜45um、Beads&Micro、Korea)の混合液を用いて調べた。直径が異なる前記2種類の物質の混合液20ul当たり同一温度で製造した10個のキューブを浸漬し、マイクロピペットとフィルタペーパを用いて余液を完全に除去した。同一のチューブに滅菌水を10ul添加した後、65℃で30分間定置し、10秒間ボルテックスした後、残ったキューブの表面特性と洗浄液(washing)の粒子分布を観察した(SEMは5000倍、TEMは250倍)。
表面の粗さとポア数が生物学的分子(ここでは、gDNA)の吸収量にどれだけ影響を与えるかを調べた。DNAの増幅結果が最も良好な33(LTCC、800℃)キューブの表面を48時間と72時間研磨し、これらの表面特性とPCRの増幅効率を比較した。
CMV(Cucumber mosaic virus)とClYVV(Clover yellow vein potyvirus)をタバコ(N.benthamiana)に複合感染させてウイルスを増殖させた後、複合感染したタバコの葉上に多孔性セラミックキューブ(33、LTCC、800℃)を1つ乗せ、ピンVの頭部分で押圧してキューブで生物学的分子(ウイルス粒子又はウイルスintermidiate form)を吸収させた。鋳型が吸収されたキューブをPCRチューブ当たり1個ずつ添加し、RT-PCR反応液を分注した。各ウイルスを単独で検出する場合、RT-PCR反応液はRT-PCRプリミックス(RTamp1、Biocubesystem、Korea)に10pmolセンスプライマ1ul、10pmolアンチセンスプライマ1ul、鋳型が吸収された1個のキューブ、18ulのDWを添加して準備した。マルチプレックスRT-PCRでは該当ウイルスのプライマを前記のように添加した後、6ulのDWを添加して準備した。PCR産物は94℃で3分間変性させた後、52℃/20分、94℃/30秒、68℃/30秒、72℃/60秒で35回、72℃/5分間反応させて増幅し、EtBrを含む1%のアガロースゲル相で電気泳動して目的PCR産物の増幅有無を確認した。RT-PCRに用いたプライマはCMVの場合、DPU1センスプライマ(5’-CGTCGTGGTTCCCGCTCCG-3’:配列番号16)とDPd2アンチセンスプライマ(5’-AGCGCGCATCGCCGAAAGAT-3’:配列番号17)を用い、ClYVVの場合、2Fセンスプライマ(5’-TAAGAGAGGGGCACAGTGGA-3’:配列番号18)と2Rアンチセンスプライマ(5’-GCAACAGCACGGGTAACA-3’:配列番号19)を用いた。図12の結果により、これは多孔性セラミックキューブに吸収された鋳型として現在の反応液でマルチプレックスRT-PCRが十分に可能であることを意味した。
多孔性セラミックキューブは、吸収能力と共にろ過効果があると分析されたが、これを細菌培養液をキューブに吸収させ、これを鋳型として用いたとき、PCRが成功裏に行われるかによって確認した。BACコロニーを滅菌された楊枝で大腸菌培養用液体バッチ5mlに接種し、陽性対照区で15時間培養した大腸菌を、増殖液1ul、2ul、3ul、4ulを鋳型として用いた。ラップを実験台上に扁平に敷き、ラップ上に大腸菌培養液を10ulずつ分注した後、多孔性セラミックキューブ(34、LTCC、850℃)を1つ、2つ、3つ、4つそれぞれ入れて大腸菌を吸収させた。ピンVで大腸菌が吸収されたキューブを取り上げ、ピンVに付いた余液をティッシュで除去した後、それぞれのキューブをPCRチューブに入れ、PCR反応液を添加した。PCR反応液は、2X PCRプリミックス(gDamp1、Biocubesystem、Korea)10ulに10pmolセンスプライマ(Primer:5’-GTCAAATCTGAGGACGCTATGTCT-3’:配列番号20)1ul、10pmolアンチセンスプライマ(Primer:5’-CACTATAGAGAACTAGGTATGTCGTTG-3’:配列番号21)1ul、鋳型が吸収された1〜4個のキューブは、95℃で3分間変性させた後、95℃/30秒、58℃/30秒、72℃/60秒で30回、72℃/10分間反応させて増幅し、EtBrを含む1%のアガロースゲル相で電気泳動して目的PCR産物の増幅有無を確認した(図13)。培養液を直接PCR鋳型として用いたとき、添加した鋳型の量によってPCR増幅産物量が比例的に増加しなかった。反面、培養液が吸収された多孔性セラミックキューブ処理区ではPCR増幅産物の量が一定であった。これは1個の多孔性セラミックキューブに吸収された鋳型だけでも現在の反応液でPCR増幅が十分に発生したことを意味した。従って、細菌を鋳型とするPCR増幅にも多孔性セラミックキューブが成功裏に利用され得ることを意味した。
本発明では目的に応じて生物学的試料から生物学的分子を効率的に吸収させるために、図14のような構造が利用可能である。基本構造として孔隙のある正六面体、円柱、球又は直六面体が可能であり(図14A)、吸収力を高めるために内部に大きな孔隙を含む形態が可能である(図14B)。図14Aの構造では単に表面孔隙に遺伝体を選択的に吸収するが、図14Bの場合は、図14Aよりも吸収率を高めて吸収する遺伝体の量を多くする構造である。これはホール外壁の孔隙サイズが一定にならなければならず、ホールの機能は吸収力を高めると同時に、PCRプライマを予め入れて置いてPCR段階を短縮できる。これは後で初期鋳型の量を多く必要とするゲノムDNA用PCRに適している。
Claims (18)
- 生物学的試料に多孔性固体相を接触させて前記生物学的試料内に存在する生物学的分子を前記多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階を含む、
前記生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離する方法。 - 前記生物学的試料は、動物、植物、細菌又はカビ由来であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的分子は、DNA、RNA、dsRNA、microRNA、ウイロイド(viroid)、ウイルス、細菌、カビ又は微細藻類であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応は、cDNAの合成、PCR(Polymerase Chain Reaction)、マルチプレックス(multiplex)PCR又はRT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記多孔性固体相は、炭化セルロース類又は紙を粒子形態で丸めたもの、天然又は合成ゼオライト、ポリスチレン(polystylene)、ポリカーボネート(polycarbonate)、ポリプロピレン(polyprophylene)、多孔性金属粒子、多孔性ゴム、ガラス繊維を粒子形態で丸めた細工性ガラス、石灰、貝殻、陶器の切片及び酸化物材質のセラミックからなる群より選択される1つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記酸化物材質のセラミックの主成分は、Al2O3、Fe2O3、LTCC(Low temperature co-fired ceramic)、PbO又はZnOであることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記多孔性固体相は、正六面体、直六面体、球、円柱、棒状(bar type)、棒の片方の末端に溝がある棒状又は先端が尖っている棒状であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- (a)生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
(b)前記(a)段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と
を含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法。 - 前記核酸増幅反応は、PCR(Polymerase Chain Reaction)であることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- (a)生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
(b)前記(a)段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相に逆転写酵素(Reverse Transcriptase)を添加して逆転写酵素反応を行う段階と、
(c)前記逆転写酵素反応物を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と
を含む生物学的試料で標的配列を増幅する方法。 - (a)生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
(b)前記(a)段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と、
(c)前記増幅産物を検出する段階と
を含む、生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法。 - (a)生物学的試料に多孔性固体相を接触させて生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に吸収させる段階と、
(b)前記(a)段階の生物学的分子を吸収させた多孔性固体相に逆転写酵素(Reverse Transcriptase)を添加して逆転写酵素反応を行う段階と、
(c)前記逆転写酵素反応物を核酸増幅反応のための鋳型として添加し、標的プライマセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と、
(d)前記増幅産物を検出する段階と
を含む、生物学的試料内で標的配列の存否を迅速に確認する方法。 - 生物学的試料内に存在する生物学的分子を多孔性固体相の孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相と、標的プライマセットと、増幅反応を行うための試薬を含む、生物学的試料内で標的配列を増幅するための核酸増幅反応用キット。
- 前記増幅反応を行うための試薬は、逆転写酵素、DNA重合酵素、dNTPs及び緩衝溶液を含むことを特徴とする請求項13に記載のキット。
- 前記多孔性固体相は、炭化セルロース類、紙を粒子形態で丸めたもの、天然又は合成ゼオライト、ポリスチレン(polystylene)、ポリカーボネート(polycarbonate)、ポリプロピレン(polyprophylene)、多孔性金属粒子、多孔性ゴム、ガラス繊維を粒子形態で丸めた細工性ガラス、石灰、貝殻、陶器の切片及び酸化物材質のセラミックからなる群より選択される1つ以上であることを特徴とする請求項13に記載のキット。
- 生物学的試料内に存在する生物学的分子を孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含む、生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するためのキット。
- 生物学的試料内に存在する生物学的分子を孔隙に迅速に吸収させることができる多孔性固体相を含む、生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するための組成物。
- 前記多孔性固体相は、炭化セルロース類、紙を粒子形態で丸めたもの、天然又は合成ゼオライト、ポリスチレン(polystylene)、ポリカーボネート(polycarbonate)、ポリプロピレン(polyprophylene)、多孔性金属粒子、多孔性ゴム、ガラス繊維を粒子形態で丸めた細工性ガラス、石灰、貝殻、陶器の切片及び酸化物材質のセラミックからなる群より選択される1つ以上であることを特徴とする請求項17に記載の組成物。
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