JP2007325562A - 核酸抽出法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】洗浄回数とともに洗浄液量を増加させることによって、発生した泡を洗い流すことで、核酸抽出液中への不純物を減らす。さらに、最初の洗浄液量を減らすことで、最も通過時間が長い最初の洗浄液通過時間を短くすることで、目詰まりの可能性を低くする。さらに、ライセート液量よりも多くの洗浄液を使用することで、ライセート溶液から由来する核酸抽出液中への不純物の混入を減らす。さらに、ライセート液量よりも少ない洗浄液を用いることで、発生した泡を洗い流すことによって、核酸抽出液中への不純物の混入を減らす。
【選択図】なし
Description
(a)生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解させて核酸を溶出させる工程
(b)工程(a)で得られた核酸を溶出させた溶液に水溶性有機溶媒を加えることでライセート溶液を調製する工程
(c)工程(b)で得られたライセート溶液と固体材料とを接触させることで溶解液中の核酸を固体材料に吸着させる工程
(d)固体材料における抽出対象核酸以外の不純物を洗浄液を用いて洗浄する際に、洗浄工程を2回以上行い、先の洗浄における洗浄液面よりも後の洗浄における洗浄液面の方が高いことを特徴とする洗浄工程
(e)固体材料に吸着させた核酸を回収液を用いて脱着させる抽出工程
2.生体材料に対して溶解液を添加する前に、分散液を用いて生体材料を分散させることを特徴とする前項1に記載の核酸抽出法。
3.工程(a)において溶解液に0.1から10mol/lのカオトロピック塩を含むことを特徴とする前項1または2に記載の核酸抽出法。
4.工程(a)において溶解液に水溶性有機溶媒が50体積%以下含まれていることを特徴とする前項1〜3のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
5.水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノールまたはブタノールのいずれか一つもしくは混合物であることを特徴とする前項4に記載の核酸抽出法。
6.工程(a)において、溶解液に0.001〜30質量%の界面活性剤が含まれていることを特徴とする前項1〜5のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
7.工程(a)において、溶解液に緩衝液が含まれていることを特徴とする前項1〜6のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
8.工程(a)において、溶解液に消泡剤が含まれていることを特徴とする前項1〜7のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
9.工程(a)の後に、0.001〜30質量%の界面活性剤を含む溶液を添加することを特徴とする前項1〜8のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
10.工程(b)において核酸を含む溶解液に水溶性有機溶媒を10体積%から60体積%になるように加えて、ライセート溶液を調製することを特徴とする前項1〜9のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
11.前項1に記載の工程(a)または(b)の後の工程において、機械的往復運動を行うことを特徴とする前項1〜10のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
12.工程(c)において、表面が水酸基から構成されている固体材料を用いることを特徴とする前項1〜11のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
13.工程(c)において、固体材料がカートリッジに保持されている容器を用いることを特徴とする前項1〜12のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
14.工程(c)において、ライセート溶液を2つ以上の容器に分注することで抽出を行うことを特徴とする前項1〜13のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
15.工程(c)において、ライセート溶液をカートリッジに入れる際にライセート中の泡をカートリッジに入れないことを特徴とする前項1〜14のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
16.工程(c)において、ライセート溶液をカートリッジに入れる際に、カートリッジ内壁で浸漬するカートリッジ内面以外の内面にライセート溶液を付着させないことを特徴とする前項1〜15のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
17.工程(d)において、洗浄液中の水溶性有機溶媒の濃度を二種類用いることを特徴とする前項1〜16のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
18.工程(d)において、塩から構成された溶液を用いることを特徴とする前項1〜17のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
19.塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする前項1〜18のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
20.工程(d)において、洗浄液に消泡剤を含むことを特徴とする前項1〜19のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
21.工程(d)または(e)において、ライセート溶液、洗浄液及び回収液のうちの少なくともいずれか一つが、圧力変化もしくは遠心により固体材料と接触させる工程を含むことを特徴とする前項1〜20のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
22.容器、分散液、溶解液、洗浄液、回収液、核酸を結合させるための固体材料のうち少なくとも二つ以上を含む前項1〜21のいずれか1項に記載の核酸抽出法を行うためのキット。
(a)生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解させるとともに生体材料中に含まれている核酸を溶出させる工程(以下、「溶解工程」とも言う。)
(b)水溶性有機溶媒を加えることでライセート溶液を調製する工程(以下、「ライセート工程」とも言う。)
(c)ライセート溶液と固体材料とを接触させることで溶解液中に含まれている核酸を固体材料に吸着させる工程(以下、「吸着工程」とも言う。)
(d)固体材料を洗浄液で洗浄する工程(以下、「洗浄工程」とも言う。)
(e)回収液により固体材料から核酸を脱着させ、カートリッジ容器外に排出する工程(以下、「回収工程」とも言う。)
本発明の核酸抽出法では、工程(a)において生体材料から核酸を抽出する場合、予め生体材料を適当な分散液に分散させておくことが好ましい。特に、ペレット化した細胞を使用する場合には、分散性向上の観点から、分散液を用いることが好ましい。分散液を用いることにより、固体状態もしくはそれに近い状態の生体材料を分散させることで、溶解液添加時の生体材料溶解の均一化、均一化したことによる収量、通過時間などの安定性、ライセート溶液や洗浄液、回収液の通過時間短縮を行うことが出来る。
本発明の核酸抽出法では、工程(b)において、前記工程(a)によって調製した生体材料を溶解して核酸を溶出させた溶解液中に、水溶性有機溶媒を添加し、核酸吸着能を持った固体材料、例えば、表面に水酸基を有する固体材料と接触させる。この操作により、試料溶液中の核酸が表面に水酸基を有する有機高分子に吸着、多孔膜の場合はフイルター表面、細孔に捕捉および吸着する。
本発明の核酸抽出法では、工程(c)において、前記工程(b)で得られたライセート溶液と固体材料とを接触させ、溶解液中の核酸を固体材料に吸着させる。本発明に使用する固体材料は、1枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。また、複数枚使用する場合、固体材料は同一のものであってもよく、異なるものであってもよい。
本発明の核酸抽出法では、工程(d)において固体材料中の抽出対象核酸以外の不純物を洗浄液を用いて洗浄する。該洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコールを用いることができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n−イソプロパノール、ブタノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、n−プロパノールのいずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもいずれでもよい。これらアルコールは、複数種類を使用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。
本発明の核酸抽出法では、工程(e)において、回収液により固体材料から核酸を脱着させ、カートリッジ容器外に排出する。検体から調製した核酸混合物溶液の体積に対して、回収液の体積を調整してRNAの脱着を行うことができる。分離精製されたRNAを含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数10〜数100μlであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量のRNAを分離精製したい場合には回収液量は1μlから数10mlの範囲で変える事ができる。
凍結ペレットHL60(細胞数5×106個)に0.5M BisTris緩衝液(pH6.5)を30μl添加し、ピペッティングにより細胞を分散させた。溶解液としてLRC(富士写真フイルム株式会社製)を540μl加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを5回行った。CUTE MIXER CM−1000(EYELA製)を用いて攪拌処理(2,500rpm)を1分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノール(和光純薬工業株式会社製)を260μl加え、1分間CUTE MIXER CM−1000を用いて攪拌(2,500rpm)を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
凍結ペレットHL60(0.5×106個)に0.5M BisTris緩衝液(pH6.5)を30μl添加し、ピペッティングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を450μl加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを5回行った。CUTE MIXER CM−1000(EYELA製)を用いて攪拌処理(2,500rpm)を1分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
凍結ペレットHL60(5×106個)にPBSを20μl添加し、タッピングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を400μl加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを5回行った。CUTE MIXER CM−1000(EYELA製)を用いて攪拌処理(2,500rpm)を1分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノールを170μl加え、1分間CUTE MIXER CM−1000を用いて攪拌(2,500rpm)を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
凍結ペレットHL60(0.5×106個)に0.5M BisTris緩衝液(pH6.5)を30μl添加し、ピペッティングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を450μl加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを5回行った。CUTE MIXER CM−1000(EYELA製)を用いて攪拌処理(2,500rpm)を1分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノールを195μl加え、1分間CUTE MIXER CM−1000を用いて攪拌(2,500rpm)を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
凍結ペレットHL60(0.5×106個)に0.5M BisTris緩衝液(pH6.5)を30μ添加し、ピペッティングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を450μl加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを5回行った。CUTE MIXER CM−1000(EYELA製)を用いて攪拌処理(2,500rpm)を1分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノールを195μl加え、1分間CUTE MIXER CM−1000を用いて攪拌(2,500rpm)を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
凍結ペレットHL60(5×106個)にPBSを20μ添加し、タッピングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を400μl加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを5回行った。CUTE MIXER CM−1000(EYELA製)を用いて攪拌処理(2,500rpm)を1分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして特級エタノールを170μl加え、1分間CUTE MIXER CM−1000を用いて攪拌(2,500rpm)を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
その結果判明したRNAの収量と通過時間の関係を図1に示す。収量は、すべての場合で41〜46μg、ライセート溶液の通過時間は約30秒となりほぼ同一であったが、1回目の洗浄はNaCl濃度が1000mMの時に最も通過時間が短く、2回目の洗浄も13.5秒と最も短かった(図1)。NaClを100mM添加した場合には、通過時間は、洗浄液の1回目が10.7秒、洗浄液の2回目が22.5秒と、1000mMのNaCl溶液を添加した場合の方が、それぞれ、洗浄液の通過時間の最大値が、NaClを100mM加えた場合と比較して、1000mMのNaClを加えたほうが、洗浄液1、2ともに約40%通過時間が短くなり、通過時間の短縮には有効であることが分かった。
5%CO2の存在下、37℃にて3日間培養したHEK293(細胞数2.3×106個/3.5cmディッシュ)の培養液を吸い取り、1mlのPBSで洗浄、吸引した後、525μlのグアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液をディッシュに添加し、セルスクレイパーを用いて細胞を溶解するとともにディッシュ表面からはがしとった。この溶液を1.7mlのマイクロチューブに移した。CUTE MIXER CM−1000(EYELA製)を用いて攪拌処理(2,500rpm)を1分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノールを175μl加え、1分間CUTE MIXER CM−1000を用いて攪拌(2,500rpm)を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
Claims (22)
- 以下の工程を含む核酸抽出法。
(a)生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解させて核酸を溶出させる工程
(b)工程(a)で得られた核酸を溶出させた溶液に水溶性有機溶媒を加えることでライセート溶液を調製する工程
(c)工程(b)で得られたライセート溶液と固体材料とを接触させることで溶解液中の核酸を固体材料に吸着させる工程
(d)固体材料における抽出対象核酸以外の不純物を洗浄液を用いて洗浄する際に、洗浄工程を2回以上行い、先の洗浄における洗浄液面よりも後の洗浄における洗浄液面の方が高いことを特徴とする洗浄工程
(e)固体材料に吸着させた核酸を回収液を用いて脱着させる抽出工程 - 生体材料に対して溶解液を添加する前に、分散液を用いて生体材料を分散させることを特徴とする請求項1に記載の核酸抽出法。
- 工程(a)において溶解液に0.1から10mol/lのカオトロピック塩を含むことを特徴とする請求項1または2に記載の核酸抽出法。
- 工程(a)において溶解液に水溶性有機溶媒が50体積%以下含まれていることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノールまたはブタノールのいずれか一つもしくは混合物であることを特徴とする請求項4に記載の核酸抽出法。
- 工程(a)において、溶解液に0.001〜30質量%の界面活性剤が含まれていることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(a)において、溶解液に緩衝液が含まれていることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(a)において、溶解液に消泡剤が含まれていることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(a)の後に、0.001〜30質量%の界面活性剤を含む溶液を添加することを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(b)において核酸を含む溶解液に水溶性有機溶媒を10体積%から60体積%になるように加えて、ライセート溶液を調製することを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 請求項1に記載の工程(a)または(b)の後の工程において、機械的往復運動を行うことを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(c)において、表面が水酸基から構成されている固体材料を用いることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(c)において、固体材料がカートリッジに保持されている容器を用いることを特徴とする請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(c)において、ライセート溶液を2つ以上の容器に分注することで抽出を行うことを特徴とする請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(c)において、ライセート溶液をカートリッジに入れる際にライセート中の泡をカートリッジに入れないことを特徴とする請求項1〜14のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(c)において、ライセート溶液をカートリッジに入れる際に、カートリッジ内壁で浸漬するカートリッジ内面以外の内面にライセート溶液を付着させないことを特徴とする請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(d)において、洗浄液中の水溶性有機溶媒の濃度を二種類用いることを特徴とする請求項1〜16のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(d)において、塩から構成された溶液を用いることを特徴とする請求項1〜17のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(d)において、洗浄液に消泡剤を含むことを特徴とする請求項1〜19のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 工程(d)または(e)において、ライセート溶液、洗浄液及び回収液のうちの少なくともいずれか一つが、圧力変化もしくは遠心により固体材料と接触させる工程を含むことを特徴とする請求項1〜20のいずれか1項に記載の核酸抽出法。
- 容器、分散液、溶解液、洗浄液、回収液、核酸を結合させるための固体材料のうち少なくとも二つ以上を含む請求項1〜21のいずれか1項に記載の核酸抽出法を行うためのキット。
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