JP2015525209A - 脂質ナノ粒子組成物と、それを作製する方法、及びそれを使用する方法 - Google Patents

Abstract

脂質ナノ粒子製剤と、それを作製する方法、及びそれを使用する方法を開示する。

Description

関連出願
[0001] 本出願は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願６１／６５０，７２９（２０１２年５月２３日出願）及び米国仮特許出願６１／７８４，８９２（２０１３年３月１４日出願）に対する優先権を主張する。

連邦政府支援研究に関する陳述
[0002] 本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された認可番号：Ｒ０１ＣＡ１３５２４３、ＤＫ０８８０７６、及びＣＡ１５２９６９の下での政府支援でなされた。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。

配列表
[0003] 本出願は、ＥＦＳ−ウェブより提出されて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１３年５月２２日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、604_54848_SEQ_LIST_OSU-2013-246.txt と名付けられて、大きさは３，４９０バイトである。

技術分野
[0004] 本開示は、限定されないが、核酸（ＮＡ）が含まれる、治療用組成物の送達に使用可能な脂質ナノ粒子（ＬＮ）に関する。

[0005] リポソームは、親水性分子を水性コアの内側で運ぶか又は疎水性分子をその脂質二重層（複数）の内側で運ぶことが可能な、１以上の脂質二重層より構成される小胞である。本明細書に使用するように、「脂質ナノ粒子」（ＬＮ）は、サブミクロン範囲の脂質ベースの粒子について記載するための一般的な用語である。ＬＮは、リポソームの構造特性を有すること、及び／又は代わりの非二重層タイプの構造を有することが可能である。ＬＮによる全身経路を介した薬物送達には、いくつかの生理学的障壁を克服することが求められる。ＬＮの循環からのクリアランスは、細網内皮系（ＲＥＳ）が原因である。この血管構造から逃れて標的細胞に達すると、ＬＮは、典型的にはエンドサイトーシスによって取り込まれて、酸性エンドソーム状況内での分解に先立って、薬物を細胞質へ放出しなければならない。

[0006] 特に、ｓｉＲＮＡや他の治療用オリゴヌクレオチドが含まれるような核酸（ＮＡ）の送達は、重大な技術課題であって、その臨床転用（clinical translation）の潜在可能性を制限してきた。

[0007] 効率的な送達担体の開発は、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）治療薬の臨床転用の鍵である。ＬＮ製剤には、（１）薬物を酵素分解より防護する；（２）毛細血管内皮を横断する；（３）過度の免疫活性化も標的外の細胞毒性も引き起こさずに標的細胞型へ特異的に到達する；（４）エンドサイトーシスとエンドソーム放出を促進する；及び（５）コロイド安定性と長い貯蔵寿命がある安定した製剤を生成することが可能であるべきことが望まれている。

[0008] 本発明で提供するのは、治療用オリゴヌクレオチドを高い効率で被包して、有効な送達のための物理学的及び生物学的な判定基準を満たすことができる脂質ナノ粒子である。ある態様において、脂質ナノ粒子は、三級アミンヘッド基のあるカチオン性脂質と四級アミンヘッド基のあるカチオン性脂質との組合せを含む。ある態様において、脂質ナノ粒子は、脂質に加えて、グラミシジンのような低分子ペプチドを含む。ある態様において、脂質ナノ粒子は、プロテイナーゼＫのような、ＲＮＡ分解酵素若しくはＤＮＡ分解酵素分解剤を含む。これらの態様の組合せがさらに提供される。四級及び三級アミン−カチオン性脂質（ＱＴソーム）、グラミシジン（Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤ）（ＳＰＬＮ−Ｇ）、及び／又はプロテイナーゼＫ（ＰｒＫソーム）の組合せの取込みは、脂質ナノ粒子製剤のトランスフェクション効率を高める。

[0009] 第一の側面において、本発明で提供するのは、三級アミン−カチオン性脂質と四級アミン−カチオン性脂質の組合せを含んでなる脂質ナノ粒子である。ある態様において、三級アミン−カチオン性脂質は、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＣ−ＣＨＯＬ、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミン、又はこれらの組合せより選択される。ある態様において、四級アミン−カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、又はこれらの組合せより選択される。ある態様において、三級アミン−カチオン性脂質の濃度は、全脂質含量の５０．０モルパーセント未満である。ある態様において、四級アミン−カチオン性脂質の濃度は、全脂質含量の２０．０モルパーセント未満である。特別な態様において、脂質ナノ粒子は、脂質のＤＯＤＭＡ及びＤＯＴＭＡを４５：０、５：４０、１５：３０、２２．５：２２．５、３０：１５、又は４０：５より選択されるモル比で含む。ある態様において、脂質ナノ粒子は、脂質のＤＭＨＤＡ及びＤＯＴＡＰを９０：１０、７０：３０、５０：５０、３０：７０、又は１０：９０より選択されるモル比で含む。

[0010] ある態様において、脂質ナノ粒子は、核酸、タンパク質、多糖、脂質、放射活性物質、治療薬剤、プロドラッグ、栄養補給剤、バイオマーカー、又はこれらの組合せより選択される分子を被包する。ある態様において、被包化分子は、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せより選択される核酸を含む。ある態様において、治療薬剤又はヌクレオチドの被包率は、２０％以上である。

[0011] ある態様において、脂質ナノ粒子は、カチオン性ポリマーをさらに含む。特別な態様において、カチオン性ポリマーは、スペルミン、ジスペルミン、トリスペルミン、テトラスペルミン、オリゴスペルミン、テルミン、スペルミジン、ジスペルミジン、トリスペルミジン、オリゴスペルミジン、プトレシン、ポリリジン、ポリアルギニン、分岐鎖又は直鎖型のポリエチレンイミン、及びポリアリルアミンからなる群より選択される。

[0012] ある態様において、脂質ナノ粒子は、膜融合性ペプチドをさらに含む。

[0013] ある態様において、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。

[0014] 別の広い側面において、本発明で提供するのは、３００ｎｍ未満の直径を有してペプチドを含んでなる脂質ナノ粒子である。ある態様において、ペプチドは、グラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＳ；ＪＴＳ−１；プロテイナーゼＫ（ＰｒＫ）；トリコロビン−ＸＩＩａ；狂犬病ウイルス糖タンパク質；インターロイキン−１β；ＨＩＶ−Ｔａｔ；単純ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質；及びこれらの組合せより選択される。ある態様において、該ペプチドは、抗生物質を含む。特別な態様において、抗生物質は、グラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＳより選択される。特別な態様において、ペプチドは、本質的に脂質化ＪＴＳ−１膜融合性ペプチドからなる。特別な態様において、脂質化ＪＴＳ−１膜融合性ペプチドは、全製剤の約０〜約３０モルパーセントで存在する。

[0015] ある態様において、脂質ナノ粒子は、プロテイナーゼＫをさらに含む。プロテイナーゼＫは、全製剤の約０〜約３０モルパーセントで存在し得る。

[0016] ある態様において、脂質ナノ粒子は、核酸、タンパク質、多糖、脂質、放射活性物質、治療薬剤、プロドラッグ、栄養補給剤、バイオマーカー、又はこれらの組合せより選択される分子を被包する。ある態様において、被包化分子は、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せより選択される核酸を含む。

[0017] 別の広い側面において、本発明で提供するのは、ＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤を含んでなる脂質ナノ粒子である。ある態様において、ＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤は、本質的にプロテイナーゼＫからなる。ある態様において、ナノ粒子は、核酸、タンパク質、多糖、脂質、放射活性物質、治療薬剤、プロドラッグ、栄養補給剤、バイオマーカー、又はこれらの組合せより選択される分子を被包する。特別な態様において、被包化分子は、ｐＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せより選択されるオリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。

[0018] 別の広い側面において、本発明で提供するのは、３００ｎｍ未満の直径を有して、三級アミン−カチオン性ヘッド基と四級アミン−カチオン性ヘッド基の混合物；抗生物質；及びＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤の２以上の組合せを含んでなる脂質ナノ粒子である。ある態様において、ＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤は、本質的にプロテイナーゼＫからなる。ある態様において、抗生物質は、グラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＳを含む。

[0019] 本明細書に記載する脂質ナノ粒子製剤のいずれも、ポリエチレングリコール−脂質コンジュゲートを含んでよい。ある態様において、ポリエチレングリコール−脂質コンジュゲートは、ポリソルベート８０、ＴＰＧＳ、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＧより選択される。ある態様において、ポリエチレングリコール−脂質は、約１０．０モルパーセント未満の濃度で存在する。ある態様において、脂質ナノ粒子は、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミンをさらに含む。特別な態様において、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミンは、製剤の約６０．０モルパーセント未満の濃度で存在する。

[0020] ある態様において、脂質ナノ粒子は、標的細胞又は標的分子へ結合することが可能なリガンドをさらに含む。ある態様において、リガンドは、抗体又は抗体断片である。特別な態様において、リガンドは、ｃＲＧＤ、ガラトース含有部分、トランスフェリン、葉酸塩、低密度リポタンパク質、又は表皮増殖因子より選択される。

[0021] 別の広い側面において、本発明で提供するのは、本明細書に記載するような脂質ナノ粒子と医薬的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物である。ある態様において、医薬組成物は、経口的に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、又は経皮的に投与される、ある態様において、医薬組成物は、経口投与錠剤、無菌溶液剤、無菌懸濁液剤、凍結乾燥散剤、又は坐剤として調製される。

[0022] 別の広い側面において、本発明で提供するのは、癌又は感染症を診断するか又は治療する方法である。本発明は、本明細書に記載するような医薬組成物の有効量をその必要な患者へ投与することを含む。

[0023] 図１：ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞におけるルシフェラーゼ発現の下方調節。ルシフェラーゼ発現性細胞を、三級アミン（ＤＯＤＭＡ、ＤＭＡ）及び四級アミン（ＤＯＴＭＡ、ＴＭＡ）、（ＱＴソーム）の数種の異なる組合せを含んでなるＬＮによって送達されるルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡで処理した。リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏ２０００）を陽性対照として使用する。ルシフェラーゼ活性は、未処理細胞に対する百分率として表される。 [0024] 図２：ＱＴソーム中のＧ３１３９による、ＫＢ細胞におけるＢｃｌ−２発現の下方調節。様々な量のＤＭＨＤＡを含有するＱＴソームについて評価した。Ｌｉｐｏ２０００を陽性対照として使用する。アクチンに対するＢｃｌ−２ ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量して、ここでは、未処理ＫＢ細胞をｍＲＮＡ発現のベースラインとして役立てた。 [0025] 図３：ｃ−ｍｙｂと１５：１のＮ：Ｐで縮合したＳＰＬＮ−Ｇのゼータ電位。 [0026] 図４：０％及び２０％の血清条件下にＳＰＬＮ−Ｇで処理したＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の生存度。細胞生存度は、未処理ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の平均生存度に対する百分率として表される。 [0027] 図５：ＳＰＬＮ−Ｇを使用して送達されたルシフェラーゼ−ｓｉＲＮＡによる、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞におけるルシフェラーゼ発現の下方調節。リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏ２０００）を陽性対照として使用する。ルシフェラーゼ活性は、未処理細胞に対する百分率として表される。 [0028] 図６：Ｇ３１３９（Ｂｃｌ−２に対するＡＳＯ）をロードしたＳＰＬＮ−Ｇを使用する、ＭＣＦ−７細胞におけるＢｃｌ−２発現の下方調節。Ｌｉｐｏ２０００を陽性対照として使用する。アクチンに対するＢｃｌ−２ ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量して、ここでは、未処理ＭＣＦ−７細胞をｍＲＮＡ発現のベースラインとして役立てた。 [0029] 図７：Ｇ３１３９（Ｂｃｌ−２に対するＡＳＯ）をロードしたＳＰＬＮ−Ｇを使用する、ＫＢ細胞におけるＢｃｌ−２発現の下方調節。Ｌｉｐｏ２０００を陽性対照として使用する。アクチンに対するＢｃｌ−２ ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量して、ここでは、未処理ＫＢ細胞をｍＲＮＡ発現のベースラインとして役立てた。 [0030] 図８：ＳＰＬＮ−Ｇのサイズ及びゼータ電位に対するラクトシル化の効果。これらは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）を介して肝臓細胞と肝癌細胞を標的とする。 [0031] 図９：ルシフェラーゼ発現性ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞における、ルシフェラーゼアッセイによる、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）標的化とＳＰＬＮ−Ｇ中のグラミシジンの評価。ルシフェラーゼ活性は、未処理細胞に対する百分率として表される。 [0032] 図１０：共焦点顕微鏡法によるＳＰＬＮ−Ｇの細胞トラフィッキング。ＤＡＰＩ（青色）を使用して、細胞の核を染色した。ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（赤色）を使用して、ｓｉＲＮＡの内部化を追跡した。重なり部分は、高百分率のｓｉＲＮＡが細胞質へ送達されることを示す。 [0033] 図１１：フローサイトメトリーによる、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡを被包する非標的指向性ＳＰＬＮ−Ｇとラクトシル化ＳＰＬＮ−Ｇ（Ｌａｃ−ＳＰＬＮ−Ｇ）の細胞内取込み。 [0034] 図１２：ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞における、Ｌａｃ−ＳＰＬＮ−Ｇ−抗ｍｉＲ−１５５によるｍｉＲ−１５５の下方調節。スクランブル（scrambled）対照ｍｉＲＮＡ（ＳＣ）を陰性対照として使用した。ＲＮＵ６Ｂに対するｍｉＲ−１５５発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量して、ここでは、未処理ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞をｍＲＮＡ発現のベースラインとして役立てた。 [0035] 図１３：Ｌａｃ−ＳＰＬＮ−Ｇ−ｓｉＲＮＡ複合体の様々な脂質対ｓｉＲＮＡ（ｗ／ｗ）比でのゲル移動度シフト分析。 [0036] 図１４：ＬＯＲ−１２８４（リボヌクレオチドレダクターゼＲＮＲ Ｒ２サブユニットを標的とするｓｉＲＮＡ、Dharmacon より購入）を担うＰｒＫソームを使用する、ＫＢ細胞におけるＲＮＲ Ｒ２発現の下方調節。アクチンに対するＲＮＲ Ｒ２ ｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量して、ここでは、未処理ＫＢ細胞をｍＲＮＡ発現のベースラインとして役立てた。 [0037] 図１５Ａ〜Ｂ：様々な血清条件中のＰｒＫソームでの、ＲＮＲ Ｒ２発現レベルの下方調節。図１５Ａは、無血清を示し；図１５Ｂは、５％ ＦＢＳを示す。 [0037] 図１５Ａ〜Ｂ：様々な血清条件中のＰｒＫソームでの、ＲＮＲ Ｒ２発現レベルの下方調節。図面１５Ａは、無血清を示し；図面１５Ｂは、５％ ＦＢＳを示す。 図１５Ｃは、１０％ ＦＢＳを示す。アクチンに対するＲＮＲ Ｒ２ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量して、ここでは未処理ＫＢ細胞をｍＲＮＡ発現のベースラインとして役立てた。 [0038] 図１６：ＰｒＫの有り及び無しでの脂質ナノ粒子の比較細胞生存度試験。細胞生存度は、未処理ＫＢ細胞の平均生存度に対する百分率として表される。 [0039] 図１７：ＬＯＲ−１２８４ ｓｉＲＮＡの血漿中の安定性試験。ＰｒＫソーム製剤をマウス血漿中で７２時間にわたってインキュベートして、残存するｓｉＲＮＡの相対量をゲル電気泳動法によって可視化した。 [0040] 図１８：１：０．３（ｗ／ｗ）のｓｉＲＮＡ：ＰｒＫを含有するＰｒＫソームの温度依存性のゼータ電位。 [0041] 図１９：１０％ ＦＢＳ培地中のＰｒＫソームによって送達されるＬＯＲ−１２８４ ｓｉＲＮＡによるＲＮＲ Ｒ２下方調節の温度依存性の効力。アクチンに対するＲＮＲ Ｒ２ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量して、ここでは未処理ＫＢ細胞をｍＲＮＡ発現のベースラインとして役立てた。 [0042] 図２０：ＱＴソームの作用機序。 [0043] 図２１：ＳＰＬＮ−Ｇの図示。 [0044] 図２２：プロテイナーゼＫコーティングは、血清に存在するＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素よりオリゴヌクレオチドを防護する。 [0045] 図２３：ＪＴＳ−１膜融合性ペプチドのあるＳＰＬＮ−ＪとプロテイナーゼＫコーティングのあるＬＮの図解。 [0046] 図２４：ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞における、抗ｍｉＲ−２２１をロードしたＳＰＬＮ−Ｇ２０によるｐ２７／ｋｉｐ１ ｍＲＮＡの上方調節。このことは、ＳＰＬＮ−Ｇ２０が抗ｍｉＲの送達に有効な担体であることを示す。Ｐ２７／Ｋｉｐ１は、ｍｉＲ−２２１の標的である。この上方調節は、ｍｉＲ−２２１機能の阻害を示す。 [0047] 図２５：ＢＴ−５４９細胞のｐ２７／Ｋｉｐ１におけるＳＰＬＮ−Ｇ２０トランスフェクション。 [0048] 図２６：ＢＴ−５４９細胞のＥＲαにおけるＳＰＬＮ−Ｇ２０トランスフェクション。 [0049] 図２７：Ｌａｃ−ＤＯＰＥ（青色）、ＤＯＰＥ（赤色）、及びラクトビオン酸（緑色）のＦＴＩＲスペクトル。 [0050] 図２８Ａ〜Ｂ：Ｌａｃ−ＧＬＮの特性決定：図２８Ａは、様々な度合いのラクトシル化でのＧＬＮの粒径及びゼータ電位を示す。それぞれの値は、５回の測定値の平均±ＳＤを表した。図２８Ｂは、抗ｍｉＲ−１５５−Ｌａｃ−ＧＬＮのＴＥＭによる形態を示す。スケールバーは、１００ｎｍを表す。 [0050] 図２８Ａ〜Ｂ：Ｌａｃ−ＧＬＮの特性決定：図２８Ａは、様々な度合いのラクトシル化でのＧＬＮの粒径及びゼータ電位を示す。それぞれの値は、５回の測定値の平均±ＳＤを表した。図２８Ｂは、抗ｍｉＲ−１５５−Ｌａｃ−ＧＬＮのＴＥＭによる形態を示す。スケールバーは、１００ｎｍを表す。 [0051] 図２９Ａ〜２９Ｂ：Ｌａｃ−ＧＬＮの特性決定：図２９Ａ）Ｌａｃ−ＧＬＢのコロイド安定性。Ｌａｃ−ＧＬＮ−抗ｍｉＲ−１５５を４℃又は２５℃で保存して、粒径を経時的に測定した。結果は、３回の別々の実験の平均値である。エラーバーは、標準偏差を表す。図２９Ｂ）抗ｍｉＲ−１５５−Ｌａｃ−ＧＬＮの血清安定性。抗ｍｉＲ−１５５単独又は抗ｍｉＲ−１５５−Ｌａｃ−ＧＬＮを５０％ ＦＢＳと３７℃で０時間、４時間、及び１２時間混合した。次いで、試料をゲル電気泳動で分析した。 [0051] 図２９Ａ〜２９Ｂ：Ｌａｃ−ＧＬＮの特性決定：図２９Ａ）Ｌａｃ−ＧＬＢのコロイド安定性。Ｌａｃ−ＧＬＮ−抗ｍｉＲ−１５５を４℃又は２５℃で保存して、粒径を経時的に測定した。結果は、３回の別々の実験の平均値である。エラーバーは、標準偏差を表す。図２９Ｂ）抗ｍｉＲ−１５５−Ｌａｃ−ＧＬＮの血清安定性。抗ｍｉＲ−１５５単独又は抗ｍｉＲ−１５５−Ｌａｃ−ＧＬＮを５０％ ＦＢＳと３７℃で０時間、４時間、及び１２時間混合した。次いで、試料をゲル電気泳動で分析した。 [0052] 図３０：抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮと抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮの物理化学特性。数値は、平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。 [0053] 図３１：共焦点顕微鏡法によって決定されるような、ＨｅｐＧ２細胞における、Ｃｙ３−抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮと他の対照製剤の細胞内取込み。 [0054] 図３２Ａ〜Ｃ：ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＧＬＮ、又は２０ｍＭラクトース及び１％ ＢＳＡと共にプレインキュベートしたＬａｃ−ＧＬＮでＨｅｐＧ２細胞を処理した。蛍光シグナルを FACSCalibur フローサイトメーターで測定した。図３２Ａは、ＧＬＮ又はＬａｃ−ＧＬＮで処理したＨｅｐＧ２細胞を示す。図３２Ｂと図３２Ｃは、２０ｍＭラクトース及び１％ ＢＳＡでのプレインキュベーションのＬａｃ−ＧＬＮとＧＬＮに対する効果をそれぞれ示す。Ｘ軸が蛍光強度を示してＹ軸が細胞数を示すヒストグラムにおいて結果を示す。 [0054] 図３２Ａ〜Ｃ：ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＧＬＮ、又は２０ｍＭラクトース及び１％ ＢＳＡと共にプレインキュベートしたＬａｃ−ＧＬＮでＨｅｐＧ２細胞を処理した。蛍光シグナルを FACSCalibur フローサイトメーターで測定した。図３２Ａは、ＧＬＮ又はＬａｃ−ＧＬＮで処理したＨｅｐＧ２細胞を示す。図３２Ｂと図３２Ｃは、２０ｍＭラクトース及び１％ ＢＳＡでのプレインキュベーションのＬａｃ−ＧＬＮとＧＬＮに対する効果をそれぞれ示す。Ｘ軸が蛍光強度を示してＹ軸が細胞数を示すヒストグラムにおいて結果を示す。 [0054] 図３２Ａ〜Ｃ：ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＧＬＮ、又は２０ｍＭラクトース及び１％ ＢＳＡと共にプレインキュベートしたＬａｃ−ＧＬＮでＨｅｐＧ２細胞を処理した。蛍光シグナルを FACSCalibur フローサイトメーターで測定した。図３２Ａは、ＧＬＮ又はＬａｃ−ＧＬＮで処理したＨｅｐＧ２細胞を示す。図３２Ｂと図３２Ｃは、２０ｍＭラクトース及び１％ ＢＳＡでのプレインキュベーションのＬａｃ−ＧＬＮとＧＬＮに対する効果をそれぞれ示す。Ｘ軸が蛍光強度を示してＹ軸が細胞数を示すヒストグラムにおいて結果を示す。 [0055] 図３３Ａ〜３３Ｃ：Ｌａｃ−ＧＬＮと他の製剤のin vitro送達。図３３Ａ）Ｌｕｃｉ−ｓｉＲＮＡ含有Ｌａｃ−ＧＬＮと他の対照製剤のin vitro送達。ＳＫ−ＨＥＰ−１−細胞をｌｕｃｉ−ｓｉＲＮＡ含有Ｌａｃ−ＧＬＮで、１００ｎＭの濃度で４時間トランスフェクトして、トランスフェクション後４８時間でルシフェラーゼ遺伝子発現を評価した。結果は、４回の反復試験の平均である。エラーバーは、標準偏差を表す。図３３Ｂ）ＭＴＳ分析からのＬａｃ−ＧＬＮの細胞毒性。結果は、平均±ＳＤを表す。図３３Ｃ）抗ｍｉＲ−１５５を含有するＬａｃ−ＧＬＮ製剤と対照製剤のin vitro送達。ＨｅｐＧ２細胞を抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮで、１００ｎＭの濃度で４時間トランスフェクトして、トランスフェクション後４８時間でｍｉＲ−１５５発現を評価した。結果は、３回の反復試験の平均である。エラーバーは、標準偏差を表す。 [0055] 図３３Ａ〜３３Ｃ：Ｌａｃ−ＧＬＮと他の製剤のin vitro送達。図３３Ａ）Ｌｕｃｉ−ｓｉＲＮＡ含有Ｌａｃ−ＧＬＮと他の対照製剤のin vitro送達。ＳＫ−ＨＥＰ−１−細胞をｌｕｃｉ−ｓｉＲＮＡ含有Ｌａｃ−ＧＬＮで、１００ｎＭの濃度で４時間トランスフェクトして、トランスフェクション後４８時間でルシフェラーゼ遺伝子発現を評価した。結果は、４回の反復試験の平均である。エラーバーは、標準偏差を表す。図３３Ｂ）ＭＴＳ分析からのＬａｃ−ＧＬＮの細胞毒性。結果は、平均±ＳＤを表す。図３３Ｃ）抗ｍｉＲ−１５５を含有するＬａｃ−ＧＬＮ製剤と対照製剤のin vitro送達。ＨｅｐＧ２細胞を抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮで、１００ｎＭの濃度で４時間トランスフェクトして、トランスフェクション後４８時間でｍｉＲ−１５５発現を評価した。結果は、３回の反復試験の平均である。エラーバーは、標準偏差を表す。 [0055] 図３３Ａ〜３３Ｃ：Ｌａｃ−ＧＬＮと他の製剤のin vitro送達。図３３Ａ）Ｌｕｃｉ−ｓｉＲＮＡ含有Ｌａｃ−ＧＬＮと他の対照製剤のin vitro送達。ＳＫ−ＨＥＰ−１−細胞をｌｕｃｉ−ｓｉＲＮＡ含有Ｌａｃ−ＧＬＮで、１００ｎＭの濃度で４時間トランスフェクトして、トランスフェクション後４８時間でルシフェラーゼ遺伝子発現を評価した。結果は、４回の反復試験の平均である。エラーバーは、標準偏差を表す。図３３Ｂ）ＭＴＳ分析からのＬａｃ−ＧＬＮの細胞毒性。結果は、平均±ＳＤを表す。図３３Ｃ）抗ｍｉＲ−１５５を含有するＬａｃ−ＧＬＮ製剤と対照製剤のin vitro送達。ＨｅｐＧ２細胞を抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮで、１００ｎＭの濃度で４時間トランスフェクトして、トランスフェクション後４８時間でｍｉＲ−１５５発現を評価した。結果は、３回の反復試験の平均である。エラーバーは、標準偏差を表す。 [0056] 図３４Ａ〜Ｂ：ｍｉＲ−１５５及び標的遺伝子の発現に対する、異なる濃度の抗ｍｉＲ−１５５処理のin vitro評価。図３４Ａは、ｍｉＲ−１５５発現に対する、異なる濃度の抗ｍｉＲ−１５５処理の評価を示す。１００ｎＭ又は２００ｎＭの抗ｍｉＲ−１５５含有リポフェクタミン２０００及びＬａｃ−ＧＬＮでＨｅｐＧ２細胞を４時間トランスフェクトして、トランスフェクション後４８時間でｍｉＲ−１５５発現を評価した。数値は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。図３４Ｂは、ｍｉＲ−１５５標的化遺伝子の発現の評価を示す。１００ｎＭ及び２００ｎＭの抗ｍｉＲ−１５５を含有する陽性対照又はＬａｃ−ＧＬＮでＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクトして４８時間後にＣ／ＥＢＰβ及びＦＯＸＰ３の遺伝子発現を評価した。結果は、３回の反復試験の平均である。エラーバーは、標準偏差を表す。 [0056] 図３４Ａ〜Ｂ：ｍｉＲ−１５５及び標的遺伝子の発現に対する、異なる濃度の抗ｍｉＲ−１５５処理のin vitro評価。図３４Ａは、ｍｉＲ−１５５発現に対する、異なる濃度の抗ｍｉＲ−１５５処理の評価を示す。１００ｎＭ又は２００ｎＭの抗ｍｉＲ−１５５含有リポフェクタミン２０００及びＬａｃ−ＧＬＮでＨｅｐＧ２細胞を４時間トランスフェクトして、トランスフェクション後４８時間でｍｉＲ−１５５発現を評価した。数値は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。図３４Ｂは、ｍｉＲ−１５５標的化遺伝子の発現の評価を示す。１００ｎＭ及び２００ｎＭの抗ｍｉＲ−１５５を含有する陽性対照又はＬａｃ−ＧＬＮでＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクトして４８時間後にＣ／ＥＢＰβ及びＦＯＸＰ３の遺伝子発現を評価した。結果は、３回の反復試験の平均である。エラーバーは、標準偏差を表す。 [0057] 図３５Ａ〜３５Ｂ：Ｃｙ５−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ及びＬａｃ−ＧＬＮの組織分布。Ｃｙ５−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ又はＬａｃ−ＧＬＮの静脈内投与から４時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスより心臓、肺、脾臓、腎臓、及び肝臓を採取した。Ｃｙ５蛍光シグナルをＩＶＩＳ造影システムによって測定した。 [0057] 図３５Ａ〜３５Ｂ：Ｃｙ５−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ及びＬａｃ−ＧＬＮの組織分布。Ｃｙ５−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ又はＬａｃ−ＧＬＮの静脈内投与から４時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスより心臓、肺、脾臓、腎臓、及び肝臓を採取した。Ｃｙ５蛍光シグナルをＩＶＩＳ造影システムによって測定した。 [0058] 図３６Ａ及び３６Ｂ：肝臓と他の臓器におけるＣｙ３−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ及びＬａｃ−ＧＬＮの共焦点顕微鏡法。図３６Ａは、Ｃｙ３−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ又はＬａｃ−ＧＬＮの静脈内投与から４時間後にＣ５７Ｂｌ／６マウスより採取した肝臓、肺、及び脾臓を示す。Ｃｙｅ３蛍光シグナルをオリンパスＦＶ１０００フィルター共焦点顕微鏡（Filter Confocal Microscope）上で可視化した。図３６Ａにおいて、赤色の矢印と黄色の矢印は、肝細胞とクッパー細胞によるＣｙ４−抗ｍｉＲ−１５５の取込みをそれぞれ示す。 [0058] 図３６Ａ及び３６Ｂ：肝臓と他の臓器におけるＣｙ３−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ及びＬａｃ−ＧＬＮの共焦点顕微鏡法。図３６Ａは、Ｃｙ３−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ又はＬａｃ−ＧＬＮの静脈内投与から４時間後にＣ５７Ｂｌ／６マウスより採取した肝臓、肺、及び脾臓を示す。Ｃｙｅ３蛍光シグナルをオリンパスＦＶ１０００フィルター共焦点顕微鏡（Filter Confocal Microscope）上で可視化した。図３６Ａにおいて、赤色の矢印と黄色の矢印は、肝細胞とクッパー細胞によるＣｙ４−抗ｍｉＲ−１５５の取込みをそれぞれ示す。 [0059] 図３７Ａ〜Ｃ：ｍｉＲ−１５５及び標的遺伝子の発現に対する抗ｍｉＲ−１５５処理の生体内（in vivo）評価。１．５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮ製剤と対照製剤でＣ５７ＢＬ／６マウスを処理した。静脈内投与の４時間後、肝臓組織を採取して、ＲＮＡを抽出した。それぞれの数値は、３回の測定値の平均±ＳＤを表す。図３７Ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析されたｍｉＲ−１５５の発現を示す。図３７Ｂ及び３７Ｃは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析された、ｍｉＲ−１５５の下流標的であるＣ／ＥＢＰβ及びＦＯＸＰ３の発現を示す。それぞれの数値は、３回の測定値の平均±ＳＤを表す。 [0059] 図３７Ａ〜Ｃ：ｍｉＲ−１５５及び標的遺伝子の発現に対する抗ｍｉＲ−１５５処理の生体内（in vivo）評価。１．５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮ製剤と対照製剤でＣ５７ＢＬ／６マウスを処理した。静脈内投与の４時間後、肝臓組織を採取して、ＲＮＡを抽出した。それぞれの数値は、３回の測定値の平均±ＳＤを表す。図３７Ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析されたｍｉＲ−１５５の発現を示す。図３７Ｂ及び３７Ｃは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析された、ｍｉＲ−１５５の下流標的であるＣ／ＥＢＰβ及びＦＯＸＰ３の発現を示す。それぞれの数値は、３回の測定値の平均±ＳＤを表す。 [0059] 図３７Ａ〜Ｃ：ｍｉＲ−１５５及び標的遺伝子の発現に対する抗ｍｉＲ−１５５処理の生体内（in vivo）評価。１．５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮ製剤と対照製剤でＣ５７ＢＬ／６マウスを処理した。静脈内投与の４時間後、肝臓組織を採取して、ＲＮＡを抽出した。それぞれの数値は、３回の測定値の平均±ＳＤを表す。図３７Ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析されたｍｉＲ−１５５の発現を示す。図３７Ｂ及び３７Ｃは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析された、ｍｉＲ−１５５の下流標的であるＣ／ＥＢＰβ及びＦＯＸＰ３の発現を示す。それぞれの数値は、３回の測定値の平均±ＳＤを表す。

[0060] 本明細書では、脂質ナノ粒子の文脈で様々な態様を記載する。当業者は、以下の詳細な態様の記載が例示に他ならず、限定的であることを決して意図しないことを理解されよう。本開示の利益を享けるような当業者には、他の態様が自ずと容易に示唆されよう。本明細書での「態様」、「側面」又は「実施例」への言及は、そのように記載される本発明の態様に特別な特徴、構造、又は特性が含まれる場合があっても、その特別な特徴、構造、又は特性がどの態様にも必ず含まれるわけではないことを示す。さらに、「１つの態様において」という句の反復使用は、同じ態様へ言及する場合があるとしても、必ずしも同じ態様へ言及するわけでない。

[0061] 本明細書に記載する実行又は方法の定番の特徴をすべて示して記載するわけではない。当然ながら、そのような実際の実行の開発においては、応用及び事業に関連した制約の遵守といった、開発者の具体的な目標を達成するために数多くの実行特異的な決定がなされて、これらの具体的な目標は、実行ごとに、そして開発者ごとに異なると理解されよう。さらに、そのような開発努力は複雑で時間がかかるかもしれないが、それでも本開示の利益を享ける当業者にとっては、定番の作業になると理解されよう。

[0062] 一般的な記載
[0063] 遺伝子発現を促進するか又は阻害するために核酸（ＮＡ）ベース治療薬が開発されている。遺伝子中の突然変異とｍｉＲＮＡプロフィール中の変化が癌や他の疾患の根本原因であると考えられているので、ＮＡベースの薬剤は、根本的な病因に直接作用して、治療ポテンシャルを最大にする可能性がある。ＮＡベース治療薬の非限定的な例には：プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、ミミック（模倣体）、抗ｍｉＲ／アンタゴｍｉＲ／ｍｉＲ阻害剤、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が含まれる。本明細書に記載するナノ粒子組成物の開発まで、ＮＡベース治療薬の臨床転用は、ＮＡをその細胞内標的へ輸送することが特に難題であること、そしてＮＡが相対的に不安定で血清や細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすいことから、その実行においていくつかの障害（obstacles）に直面した。さらに、ＮＡの高い陰電荷は細胞膜を通過するその輸送を不可能にして、さらに有用性を制限した。

[0064] 本明細書に記載するＬＮは、慣用の治療用化合物とＮＡベース治療薬の両方の送達に有用な基盤を提供する。ＬＮを使用して製剤化される薬物は、亢進された透過性及び保持（ＥＰＲ）効果により、増加した血液循環時間や固形腫瘍の部位での増加した蓄積といった、望ましい生体内薬物動態（ＰＫ）特性を提供する。さらに、ある態様において、ＬＮは、血清タンパク質によるＬＮのオプソニン化と生じるＲＥＳ媒介性の取込みを抑制するためにポリエチレングリコールで表面コートしてよい、及び／又は標的指向性の薬物送達を提供するために細胞特異的リガンドでコートしてよい。

[0065] 全身性の送達のために、ＬＮのゼータ電位は、過度に陽性でも陰性でもないことが望ましい。高い陽電荷があるＬＮは、非標的の細胞、組織、及び循環血漿タンパク質と非特異的に相互作用する傾向があって、細胞毒性を引き起こす場合がある。あるいは、高い陰電荷があるＬＮは、それ自体が陰電荷であるＮＡを有効に取り込むことができないので、迅速なＲＥＳ媒介性のクリアランスを誘発して、治療効力を低下させる場合がある。生体内の薬物及び遺伝子送達には、中性〜中位の電荷があるＬＮが最も適している。

[0066] 本発明で提供するのは、トランスフェクション活性が改善された脂質ナノ粒子（ＬＮ）である。この脂質ナノ粒子は、脂質膜の内側で疎水性分子を分配しても、水性コアの内側で水溶性の粒子又は分子を被包してもよい。ある態様において、ＬＮ製剤は、脂質の混合物を含み、これには、一般的には帯電脂質と中性脂質が含まれて、さらにＰＥＧ化脂質及び／又はコレステロールが含まれてもよい。本開示のＬＮ製剤は、四級アミンと三級アミンの組合せ、グラミシジン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＳ）のようなペプチド、又はプロテイナーゼＫのようなＲＮＡ分解酵素若しくはＤＮＡ分解酵素−分解剤を含んでよい。ある態様において、脂質ナノ粒子は、四級アミンヘッド基のあるカチオン性脂質と三級アミンヘッド基のあるカチオン性脂質を組み合わせることによって産生される。ある態様において、脂質ナノ粒子は、低分子ペプチド性の脂質ナノ粒子（ＳＰＬＮ）であって、グラミシジン又はＪＴＳ１のようなペプチドを含む。ある態様において、脂質ナノ粒子は、プロテイナーゼＫでコートされ、それにより血清の存在下でのトランスフェクションが高められる。容易に参照できるように、グラミシンを含んでなるＳＰＬＮを本明細書ではＳＰＬＮ−Ｇと呼び、ＪＴＳ−１ペプチドを含んでなるＳＰＬＮを本明細書ではＳＰＬＮ−Ｊと呼んで、プロテイナーゼＫを含んでなる脂質ナノ粒子を本明細書ではＰｒＫソームと呼ぶ。これらの異なる態様の組合せがさらに提供される。ＬＮは、３００ｎｍ未満の直径を有するか、特別な態様では、約５０ｎｍと約２００ｎｍの間の直径を有する。これらのＬＮは、特に全身投与の間に見出される高血清条件の下で、亢進されたトランスフェクションと低下した細胞毒性を示す。このＬＮは、広範囲の現行の治療薬剤及びシステム、血清安定性、及び標的指向性の送達に、高いトランスフェクション効率で適用可能である。

[0067] 本明細書に使用する「脂質ナノ粒子」という用語は、１以上の脂質成分によって形成されるあらゆる小胞を意味する。本明細書に記載するＬＮ製剤には、カチオン性脂質を含めてよい。カチオン性脂質とは、どの生理学的ｐＨでも正味の陽電荷を担う脂質である。この陽電荷は、ＡＳＯのような陰電荷の治療薬との静電相互作用を介した会合に使用される。

[0068] 好適なカチオン性脂質には、限定されないが、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド塩（ＤＤＡＢ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンクロリド（ＤＬ−ＥＰＣ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；カチオン性修飾基へコンジュゲートした中性脂質；並びにこれらの組合せが含まれる。加えて、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（販売元：ギブコ／ＢＲＬ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（販売元：ギブコ／ＭＲＬ）、ｓｉＰＯＲＴ ＮＥＯＦＸ（登録商標）（販売元：アプライド・バイオシステムズ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（販売元：プロメガ）、及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（販売元：Bio-Rad Laboratories 社）といった、入手可能な製品中の多くのカチオン性脂質も使用し得る。当業者は、さらに多くのカチオン性脂質が当該ＬＮ製剤における包含に適していることを認められよう。本開示のカチオン性脂質は、製剤中の脂質の約０〜約８０．０モルパーセントに及ぶ濃度で、又は製剤の約５．０〜約５０．０モルパーセントに及ぶ濃度で存在してよい。

[0069] ある態様において、今回開示されるＬＮ製剤には、アニオン性脂質も含まれてよい。アニオン性脂質とは、生理学的なｐＨで正味の陰電荷を担う脂質である。これらのアニオン性脂質は、カチオン性脂質と組み合わされるとき、ＬＮの全体の表面電荷を低下させて、ＬＮ二重層構造のｐＨ依存性の破壊を導き、酸性ｐＨで非ラメラ相を誘発することによってヌクレオチド放出を促進するか又は細胞膜との融合を誘発するのに有用である。

[0070] 好適なアニオン性脂質の例には、限定されないが、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸のような脂肪酸；コレステリルヘミスクシネート；１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ジエーテルＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ナトリウム塩）；１−ヘキサデカノイル，２−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカジジエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）；ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）；及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）；中性脂質へコンジュゲートしたアニオン性修飾基；並びにこれらの組合せが含まれる。本開示のアニオン性脂質は、製剤の約６０．０モルパーセントまでの濃度で、又は製剤の約５．０〜約２５．０モルパーセントの濃度で存在する。

[0071] ある態様では、帯電したＬＮがトランスフェクションに有利であるが、細胞毒性やＲＥＳ媒介性の取込みといった標的外の効果が起こり得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性分子を脂質アンカーへコンジュゲートさせて、本明細書に記載するＬＮに含めて、ＬＮ凝集や膜との相互作用を抑えることができる。親水性ポリマーは、脂質成分へ共有結合させても、架橋剤を使用してアミンのような官能基へコンジュゲートさせてもよい。

[0072] 親水性ポリマーの好適なコンジュゲートには、限定されないが、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）；ポリソルベート８０；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）；Ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネート（ＴＰＧＳ）；ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２０００）；及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００）が含まれる。親水性ポリマーは、製剤の約０〜約１５．０モルパーセントに及ぶ濃度で、又は製剤の約５．０〜約１０．０モルパーセントに及ぶ濃度で存在してよい。使用するＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間であるか、又は約１００Ｄａ〜約２，０００Ｄａである。

[0073] 本明細書に記載するＬＮは、中性及び／又は両親媒性の脂質をヘルパー脂質としてさらに含んでよい。これらの脂質は、製剤を安定にする、生体内での消失を抑える、又はトランスフェクション効率を高めるために使用される。ＬＮは、溶解安定性（lyostability）及び低温安定性（cryostability）を促進するために、限定されないが、グルコース、ソルビトール、スクロース、マルトース、トレハロース、ラクトース、セルビオース、ラフィノース、マルトトリオース、デキストラン、又はこれらの組合せのような糖類の溶液中で製剤化してよい。

[0074] 中性脂質は、生理学的なｐＨで０の正味電荷を有する。本明細書に開示するどのＬＮ製剤にも、数種の中性脂質の１つ又は組合せを含めてよい。

[0075] 好適な中性脂質には、限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、ジアシルグリセロール、グリコシル化ジアシルグリセロール、プレノール、リソソーム型ＰＬＡ２基質、Ｎ−アシルグリシン、並びにこれらの組合せが含まれる。

[0076] 他の好適な脂質には、限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、及びリソホスファチジルエタノールアミン；コレステロール、デモステロール、シトステロール、チモステロール、ジオスゲニン、ラノステノール、スチグマステロール、ラソステロール、及びデヒドロエピアンドロステロンのようなステロール類；及びスフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド、グリコスフィンゴ脂質、ホスホスフィンゴ脂質、フィトスフィンゴシンのようなスフィンゴ脂質；並びにこれらの組合せが含まれる。

[0077] 本明細書に記載するＬＮ製剤は、膜融合を促進するために、膜融合性脂質又は膜融合性コーティング剤をさらに含んでよい。好適な膜融合性脂質の例には、限定されないが、グリセリルモノオレエート、オレイン酸、パルミトレイン酸、ホスファチジン酸、ホスホイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ_２）、並びにこれらの組合せが含まれる。

[0078] 本明細書に記載するＬＮ製剤は、カチオン性脂質をさらに含んでよい。このような脂質のヘッド基は、本質的に、一級、二級、三級、又は四級アミンであり得る。ある態様において、ＬＮは、三級アミンと四級アミンの混合物を含む。

[0079] 好適な三級アミノ脂質には、限定されないが、ＤＯＤＡＰ；ＤＯＤＭＡ；Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミン（ＤＭＨＤＡ）；及びＤＣ−ＣＨＯＬが含まれる。好適な四級アミノ脂質には、限定されないが、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、及びＤＤＡＢが含まれる。多数のアミノ脂質の組合せ、特に三級カチオン性脂質と四級カチオン性脂質の組合せは、治療薬剤のＬＮ送達にとって有益である。カチオン性脂質は、組み合わせて約６０モルパーセントまでの濃度で存在してよい。

[0080] 本明細書に記載するＬＮ製剤は、カチオン性ポリマー又はカチオン性ポリマーのコンジュゲートをさらに含んでよい。カチオン性ポリマー又はそのコンジュゲートは、単独で使用しても、脂質ナノ担体と組み合わせて使用してもよい。

[0081] 好適なカチオン性ポリマーには、限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）；スペルミン；スペルミジン；ポリ（Ｌ−リジン）；ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー；ポリプロピレンイミンデンドリマー；ポリ（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）；キトサン；トリス（２−アミノエチル）アミンとそのメチル化誘導体；並びにこれらの組合せが含まれる。ポリマー送達系の実行には、鎖の長さと枝分かれが重要な考慮事項である。ＰＥＩ（ＭＷ２５，０００）のような高分子量ポリマーは、トランスフェクション剤として使用されるが、細胞毒性に悩まされる。低分子量ＰＥＩ（ＭＷ６００）は、細胞毒性を引き起こさないが、核酸との安定した縮合を促進する能力が無いことにより限界がある。

[0082] 今回開示したＬＮ製剤の中へアニオン性ポリマーも取り込んでよい。好適なアニオン性ポリマーには、限定されないが、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）；ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）；アルギン酸塩；デキストラン；キサンタン；誘導化ポリマー；並びにこれらの組合せが含まれる。

[0083] ある態様において、ＬＮ製剤には、ポリマーのコンジュゲートが含まれる。このコンジュゲートは、標的化剤、親油性部分、ペプチド、タンパク質、又は全体の治療効力を高める他の分子へ架橋連結してよい。

[0084] 好適な架橋剤には、限定されないが、３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）；３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル（ＤＴＢＰ）；ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）；ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）；１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）；Ｎ’−Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）；Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’スルホネート（ウッドワード［Woodward's］試薬Ｋ）；並びにこれらの組合せが含まれる。

[0085] ＬＮ製剤は、ペプチド及び／又はタンパク質をさらに含んでよい。ペプチドとタンパク質、特に細菌及びウイルスに由来して抗生剤として使用されるものは、膜透過に役立つ場合がある。このペプチド又はタンパク質は、脂質と直接混合しても、共有結合させても、架橋剤で脂質部分へコンジュゲートさせてもよい。

[0086] 好適なペプチド及びタンパク質には、限定されないが、グラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＳ；ＨＡ２；ＪＴＳ−１；プロテイナーゼＫ（ＰｒＫ）；トリコロビン−ＸＩＩａ（ＴＶ−ＸＩＩａ）；狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）；インターロイキン−１β；ＨＩＶ−Ｔａｔ；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ２２タンパク質；並びにこれらの組合せが含まれる。ある態様において、ＪＴＳ−１及び／又はグラミシジンは、約０〜約４０モルパーセントで使用される。ある態様では、ＰｒＫのＬＮ表面コーティングのために、約０〜約３０モルパーセントの濃度のＰｒＫがオリゴヌクレオチドとの直接混合又はヘキサデシルイソシアネートへのコンジュゲーションによって適用される。

[0087] ＬＮへ標的化剤を加えると、受動的な標的化アプローチに優って高められる効力が提供される。標的化には、限定されないが、細胞表面受容体に対するリガンド又は抗体、ペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ホルモン、ビタミン、抗体、抗体断片、プロドラッグ、並びにこれらの部分のコンジュゲート又は組合せといった特定の標的化部分の取込みが関与する。

[0088] ある態様において、標的化効率の最大化には、標的化剤の被包化よりむしろ、適正な標的化部分でＬＮを表面コーティングすることが含まれる。この方法により、細胞表面受容体との相互作用が最適化される。

[0089] 標的化剤は、合成の間にＬＮ中へ直接取り込んでも、後続の工程で加えてもよいと理解されたい。ＬＮ中への取込みの適正な手段を決定するのは、治療応用の仕様（specifications）（例、分解可能な連結）だけでなく、標的化部分上の官能基である。親油性領域を有さない標的化部分は、ＬＮの脂質二重層の中へ直に挿入し得ないので、挿入の前に脂質への事前コンジュゲーションを必要とするか又はＬＮとの静電複合体を生成しなければならない。

[0090] また、ある状況下では、標的化リガンドが親油性アンカーへ直接結合することができない。これらの状況では、その相互作用を促進するために、架橋剤の形態をした分子ブリッジを利用してよい。ある態様では、固定化された（anchored）標的化部分の立体障害により企図される生理学的な標的との十分な相互作用が妨げられるならば、架橋剤を使用することが有利である。加えて、標的化部分がある配向下でのみ機能的である（例、モノクローナル抗体）ならば、架橋剤を介した脂質アンカーへの連結が有益である。ある態様では、標的化剤をＬＮへ連結するのに、他のバイオコンジュゲーションの方法を使用してよい。製剤の生体内での蓄積と関連する細胞毒性を防ぐには、還元可能又は加水分解可能な連結を適用してよい。

[0091] 本開示のＬＮを合成するには、様々なＬＮ調製法が適している。例えば、エタノール希釈、凍結融解、薄膜水和、音波処理、押し出し、高圧均質化、界面活性剤透析、顕微溶液化、タンジェンシャルフロー透析濾過、濾過滅菌、及び／又は凍結乾燥を利用してよい。加えて、ＬＮのサイズを減少させるには、いくつかの方法を利用し得る。例えば、Avestin Emulsiflex Ｃ５（登録商標）デバイスのような脂質均質化に適したどのデバイスでも均質化を実行してよい。適正な孔径（０．０５〜０．２μｍ）のポリカーボネート膜を使用する Lipex Biomembrane押出機で押出しを実行してよい。試料内のサイズ変動を最小にするには、多数の粒径縮小サイクルを実行し得る。次いで、生じるＬＮを Sepharose CL4B のようなサイズ排除カラムに通過させるか又はタンジェンシャルフロー透析濾過によって処理して、ＬＮを精製し得る。

[0092] 本明細書に記載するＬＮのどの態様にも、その調製法においてエタノールをさらに含めてよい。ＬＮ製剤における約３０〜５０％のエタノールの取込みは、脂質二重層を不安定にして、カチオン性脂質のような帯電部分とアニオン性のＡＳＯ及びｓｉＲＮＡとの間の静電相互作用を促進する。高濃度エタノール溶液において調製されたＬＮは、投与前に希釈される。あるいは、透析又は透析濾過によってエタノールを除去してよく、これにより非被包化ＮＡも除去される。

[0093] ある態様では、ＬＮを滅菌することが望ましい。このことは、プレ濾過の有無でＬＮを０．２又は０．２２μｍの滅菌フィルターに通過させることによって達成し得る。

[0094] ＬＮの物理学的な特性決定は、多くの方法を介して行うことができる。動的光散乱法（ＤＬＳ）又は原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して、平均直径とその標準偏差を定量することができる。ある態様では、ＬＮが約２００ｎｍの直径を有することが特に望ましい。ゼータ電位計を介したゼータ電位の測定は、粒子の相対安定性を決定するのに有用である。動的光散乱分析もゼータ電位分析も、脱イオン水又は適正な緩衝溶液に希釈した試料で実行し得る。低温透過型電子顕微鏡法（クライオ−ＴＥＭ）と走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して、ＬＮの詳細な形態を決定することができる。

[0095] 本明細書に記載するＬＮは、冷却下で数ヶ月間安定である。合成と投与の間で延長された期間が求められるＬＮは、標準手順を使用して凍結乾燥させてよい。製剤の完全性を維持するには、凍結に先立って、ＬＮ懸濁液へ１０％スクロースのような凍結防止物質を加えてよい。長期安定性には、凍結乾燥負荷したＬＮ製剤が推奨される。

[0096] 四級及び三級アミン−カチオン性脂質（ＱＴソーム）
[0097] このＬＮの物理特性は、有窓性の腫瘍血管構造において亢進された透過性及び保持（ＥＰＲ）を促進するが、慣用のＬＮ製剤では、エンドソームからの脱出が依然として課題である。この目的を達成するために、核酸の複合化のために陽荷電の四級又は三級アミンベースのカチオン性脂質を含んでなる脂質ナノ粒子を開発した。四級アミンベースのカチオン性脂質は、永続的な陽電荷を担って、核酸との安定した静電複合体を生成することが可能である。しかしながら、三級アミン−カチオン性脂質は、条件付きでイオン化可能であって、その陽電荷は、大部分がｐＨによって調節される。本発明で提供するのは、四級アミン−カチオン性脂質と三級アミン−カチオン性脂質の組合せ（ＱＴソーム）を含んでなるＬＮであって、これは、治療薬剤がエンドソームの内側でＬＮより放出され得る機序を提供する。ＱＴソームは、条件付きでイオン化可能であって、エンドソームの酸性条件下で、脂質二重層の破壊とオリゴヌクレオチドのエンドソーム放出を促進する。四級アミン−カチオン性脂質は、永続的に帯電していて、脂質とオリゴヌクレオチドの間の強い相互作用を確実にして、それによって安定性を確実にする。三級カチオン性脂質と四級カチオン性脂質の組合せは、それぞれの脂質群が個別ではあり得ない最適のｐＨ応答プロフィールを提供する。ＱＴソームは、細胞をトランスフェクトする場合に、通常のカチオン性リポソームより有効である。

[0098] ＱＴソームは、標準のカチオン性脂質製剤より大きなトランスフェクション活性を明示する。四級アミン−カチオン性脂質と三級アミン−カチオン性脂質の間の均衡を微調整することで、核酸の細胞質への正確な制御放出が可能になる。特別な態様では、特別な放出パラメータの使用により、核酸ベース治療薬の活性を最大化し得る技術が提供される。例えば、三級アミン−カチオン性脂質は、単独で使用されるとき、ｐＨ依存性のイオン化プロフィールを示す。単一の脂質分子種ではＬＮ電荷特性の所望される制御レベルをもたらさない場合があるので、三級アミン−カチオン性脂質と四級アミン−カチオン性脂質の組合せを使用することにより、そのような組合せのｓｉＲＮＡ送達における有意に改善された活性をもたらすことができる。

[0099] 図１は、三級カチオン性脂質と四級カチオン性脂質の組合せの相対的なルシフェラーゼ発現を図示する。５：４０のＱ対Ｔアミン−カチオン性脂質比では、ルシフェラーゼ発現性ＨＣＣ細胞において、ルシフェラーゼのｓｉＲＮＡトランスフェクションについて８５％強の下方調節が示されている。図２０は、ＱＴソームの作用機序を図示する。ｐＨ７．４の下で、四級アミン−カチオン性脂質（ＱＡ−ＣＬ）は、「＋」電荷を維持して、安定性をもたらす。ｐＨ５．５下では、ＱＡ−ＣＬと三級アミン−カチオン性脂質（ＴＡ−ＣＬ）はともに帯電して、エンドソーム膜相互作用／破壊を促進する。

[00100] 低分子ペプチド性の脂質ナノ粒子（ＳＰＬＮ）
[00101] 本発明でさらに提供するのは、低分子ペプチド性の脂質ナノ粒子（ＳＰＬＮ）であるＬＮである。ある態様において、ＳＰＬＮは、抗生物質のグラミシジンを含む。本明細書に記載するのは、これまでトランスフェクション剤として検討されてこなかったグラミシジンのいくつかの変異体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）である。これらのグラミシジンサブタイプは、保存されたペプチド配列をグラミシジンＳと共有するが、グラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、グラミシジンＳが環状構造を形成するのに対し、βヘリックス構造を形成する。故に、グラミシジンＡ〜Ｄは、グラミシジンＳとは異なる。グラミシジン類は二量体化してイオノフォアを形成して膜融合を促進するが、それによりエンドソームとＬＮの脂質二重層の不安定化が促進される。従って、グラミシジンを含んでなるＳＰＬＮは、核酸ベース治療薬において理想的である。グラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＳのＬＮ中への取込みは、ＡＳＯとｓｉＲＮＡの細胞トランスフェクション効率を有意に高める。

[00102] ある態様では、グラミシジンを利用するＳＰＬＮをＳＰＬＮ−Ｇと指定して、製剤中のグラミシジンのモル百分率に相当する数を続ける。図２１は、ＳＰＬＮ−Ｇを図示する。

[00103] グラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＳを脂質ナノ粒子製剤へ組み合わせることによって、血清の存在下でのＡＳＯ及びｓｉＲＮＡ製剤のトランスフェクション効率が高められる。グラミシジンは、エンドソーム膜二重層のＯＤＮへの易透化に役立つ。対照的に、リポフェクタミン^ＴＭ２０００のようなトランスフェクション剤は、血清の存在下では顕著に減少したトランスフェクション活性を示す。図５に示すように、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡのあるＳＰＬＮ−Ｇは、ＨＣＣ細胞において血清の存在下で、低い細胞毒性と、トランスフェクション剤のリポフェクタミン２０００（ＬＦ）より大きなトランスフェクション活性を明示する。血清の存在下でトランスフェクション活性の低下を示さない脂質ナノ粒子製剤は、血清条件が実際の患者中の条件を最もよく模倣するので有利であり、それによって臨床試験へのより良好な転用を容易にする。

[00104] 本発明でさらに提供するのは、脂質化ＪＴＳ−１膜融合性ペプチドを取り込んでいるＳＰＬＮである。これらのＳＰＬＮ−Ｊ粒子は、高いトランスフェクション活性を示して、ＪＴＳ−１のコイルからヘリックスへのｐＨ依存性のコンホメーション変化によって始動される、高い膜融合活性を有する。

[00105] プロテイナーゼＫ（ＰＲＫ）（ＰＲＫソーム）
[00106] ヌクレオチドの投与後の血清中での分解は、脂質又はポリマー担体が関与するものであっても、核酸ベース治療薬にとって不断の懸案事項である。ヌクレオチドを分解に対してよりよく防護するために、しばしば、骨格や塩基対の修飾といった、ヌクレオチドへの改変が実行される。しかしながら、これらの修飾は、薬物の低下した活性又は標的外の活性をもたらす場合がある。この問題を克服するために、本発明で提供するのは、ＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤を含んでなる脂質ナノ粒子製剤である。特別な態様において、ＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤は、プロテイナーゼＫ（ＰｒＫ）である。このプロテイナーゼＫコーティングは、血清に存在するＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素よりオリゴヌクレオチドを防護する。これを図２３に図示する。プロテイナーゼＫは、プロテイナーゼＫの無い脂質ナノ粒子よりよくｓｉＲＮＡを防護することができる。プロテイナーゼＫの包含は、ＫＢ細胞において有意な細胞毒性を伴わずに、血清の存在下でトランスフェクション効率を高める。ＰｒＫソームは、きわめて多用途性であって、天然オリゴヌクレオチドと化学修飾オリゴヌクレオチドの両方へ適用可能である。

[00107] 本明細書に記載するＬＮのどの態様へもプロテイナーゼＫコーティングを取り込むことができる。非限定的な例を挙げると、図２４は、プロテイナーゼＫコーティングのあるＳＰＬＮ−Ｊを図示する。

[00108] 応用例
[00109] 応用に依存して、本明細書に開示する脂質ナノ粒子は、核酸との相互作用の増加、血清安定性の増加、ＲＥＳ媒介性の取込みの低下、標的指向性の送達、又はエンドソーム内部でのｐＨ感受性の放出といった特性に有利になるように設計してよい。ＬＮ製剤の多様な性質の故に、特別な治療目標を達成するには、本発明で提供するいくつかの方法のいずれも適用してよい。具体的な目標に応じるために、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ＰＥＧ−脂質、中性脂質、膜融合性脂質、アミノ脂質、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー、ポリマーコンジュゲート、ペプチド、標的化部分、並びにこれらの組合せを適用してよい。

[00110] 本明細書に記載する脂質ナノ粒子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ、及びアンチセンスＯＤＮのようなオリゴヌクレオチド（ＯＮ）治療薬の治療用送達の基盤として使用することができる。これらの治療薬は、様々な種類の癌、白血病、ウイルス感染症、及び他の疾患といった多種多様な疾患を管理するのに有用である。例えば、環状ＲＧＤ、葉酸塩、トランスフェリン、又は抗体といった標的化部分は、標的指向性の薬物送達を可能にすることによって、活性を大いに高める。数多くの腫瘍は、その細胞表面に受容体を過剰発現する。好適な標的化部分の非限定的な例には、トランスフェリン（Ｔｆ）、葉酸塩、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、及び表皮増殖因子が含まれる。加えて、α−ｖ−β−３インテグリン及び前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のような腫瘍血管内皮マーカーは、標的指向性ＬＮの標的として貴重である。ある態様では、約３００ｎｍ以下の直径を測定してゼータ電位が５０ｍＶ未満である粒子を有して、被包化効率が２０．０％より高いＬＮ製剤がＮＡ送達に有用である。

[00111] 本明細書に記載するＬＮ製剤の単独での態様又は互いと組み合わせた態様の実行は、現行の脂質ナノ粒子設計パラダイムとの相乗効果がある。

[00112] 本明細書に記載するＬＮと併用して、広範囲の治療薬剤を使用し得る。そのような治療薬剤の非限定的な例には、抗新生物剤、抗感染症薬、局所麻酔薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、血管新生阻害剤、β−アドレナリン作動性遮断薬、カルシウムチャネル拮抗薬、降圧剤、抗うつ薬、抗痙攣薬、抗細菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗寄生虫薬、コルチコステロイド、ホルモン、ホルモン拮抗薬、免疫調節剤、神経伝達物質拮抗薬、抗糖尿病剤、抗てんかん薬、止血薬、抗過緊張薬、抗緑内障剤、免疫調節性サイトカイン、鎮静剤、ケモカイン、ビタミン、毒素、麻薬、造影剤、及びこれらの組合せが含まれる。

[00113] 本開示のＬＮ製剤には、核酸ベース治療薬剤がきわめて適用可能である。そのような核酸ベース治療薬剤の例には、限定されないが、ｐＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡ、ＡＳＯ、及びこれらの組合せが含まれる。血清ヌクレアーゼから防護して治療薬剤を安定化させるために、置換基の核酸及び／又はホスホジエステルリンカーに対する修飾をなすことができる。そのような修飾には、限定されないが、骨格修飾（例、ホスホチオエート連結）；２’修飾（例、２’−Ｏ−メチル置換塩基）；双性イオン修飾（６’−アミノヘキシ修飾ＯＤＮ）；親油性部分（例、脂肪酸、コレステロール、又はコレステロール誘導体）の付加；並びにこれらの組合せが含まれる。この修飾された配列には、本明細書に開示するＬＮ製剤との相乗効果がある。例えば、ＯＤＮへの３’−コレステロールの付加は、それがなければ単に静電相互作用によって結合している系に親油性の相互作用を加えることによって、ＬＮ複合体へ安定性を供給する。加えて、この親油性の付加は、ＯＤＮを細胞膜の外葉へ局在化させることによって細胞透過を促進する。グラミシジン又はＪＴＳ−１のようなペプチドを適用することは、その膜融合特性により該製剤の細胞透過をさらに促進する。あるいは、プロテイナーゼＫのような酵素の追加は、ＯＤＮが分解に抵抗することをさらに支援する可能性がある。

[00114] 治療上の適用に依拠して、本明細書に記載するＬＮは、以下の方法によって投与され得る：経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、経皮、腫瘍内、動脈内、全身、又は対流強化送達。特別な態様において、ＬＮは、静脈内に、筋肉内に、皮下に、又は腫瘍内に送達される。異なるか又は類似のＬＮでの後続の投薬は、代わりの投与経路を使用して行ってよい。

[00115] 本開示の医薬組成物は、本明細書に開示する脂質ナノ粒子製剤及び／又は追加薬剤の有効量を、医薬的に許容される担体に溶解又は分散されて含む。「医薬的」又は「薬理学的に許容される」という句は、例えば、ヒトのような動物へ投与されるときに、有害反応、アレルギー反応、又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物に関連する。少なくとも１つの化合物又は追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製法（preparation）は、当業者には、本開示に照らして、参照により本明細書に組み込まれる「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」2003 に例示されるように、公知であろう。さらに、動物（例、ヒト）への投与では、ＦＤＡ生物製剤基準局（FDA Office of Biological Standards）によって要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を製剤が満たすべきであることが理解されよう。

[00116] 本明細書に開示する組成物は、それが固体、液体、又はエアゾールの形態で投与されるか、そしてそれが注射のような投与経路のために無菌性である必要があるかどうかに依拠して、異なるタイプの担体を含む場合がある。本明細書に開示する組成物は、静脈内に、皮内に、経皮的に、髄腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、筋肉内に、皮下に、粘膜より、子宮内に、経口的に、局所的に、局部的に、吸入により（例、エアゾール吸入）、注射によって、注入によって、持続点滴によって、標的細胞を浸す局所灌流によって直接的に、カテーテルにより、洗浄液により、クリーム剤において、脂質組成物（例、リポソーム剤）において、又は当業者に公知であるような他の方法又は上記のあらゆる組合せによって、投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」2003 を参照のこと）。

[00117] 動物又はヒト患者へ投与される、本明細書に開示する組成物の実際の投与量は、体重又は体表面積、病態の重症度、治療される疾患の種類、過去又は現行の治療介入、患者の突発性疾患、及び投与経路といった身体的因子及び生理学的因子によって決定することができる。投与量と投与経路に依拠して、好ましい投与量及び／又は有効量の投与回数は、被験者の応答に従って変動してよい。投与の任に当たる医療実施者は、ともかくも、組成物中の有効成分（複数）の濃度と個別の被験者に適した用量（複数）を決定するものである。

[00118] ある態様において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の態様において、活性化合物は、単位重量の約２％〜約７５％の間、又は例えば約２５％〜約６０％の間と、その中の導き得るあらゆる範囲を含み得る。当然ながら、それぞれの治療上有用な組成物中の活性化合物（複数）の量は、該化合物のどの所与の単位用量においても好適な投与量が得られるようなやり方で調製してよい。このような医薬製剤を調製する当業者には、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命といった因子、並びに他の薬理学的な考慮事項が熟慮されるものであり、それ故に、多様な投与量と治療レジメンが望ましい場合がある。

[00119] 他の非限定的な例において、用量はまた、各投与につき約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重又はそれ以上までと、その中の導き得るあらゆる範囲を含み得る。本明細書に収載した数字から導き得る範囲の非限定的な例では、上記に記載した数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、等の範囲を投与することができる。

[00120] ある態様では、本明細書の組成物及び／又は追加薬剤を製剤化して、消化経路より投与する。消化経路には、組成物が消化管と直接接触する、すべての可能な投与経路が含まれる。具体的には、本明細書に開示する医薬組成物は、経口的に、頬内に、直腸に、又は舌下に投与してよい。従って、これらの組成物は、不活性希釈剤とともに、又は吸収可能な食用の担体とともに製剤化してよい。

[00121] さらなる態様では、本明細書に記載する組成物を非経口経路より投与してよい。本明細書に使用するように、「非経口」という用語には、消化管を迂回する経路が含まれる。具体的には、本明細書に開示する医薬組成物は、例えば、限定されないが、静脈内に、皮内に、筋肉内に、動脈内に、髄腔内に、皮下に、又は腹腔内に投与してよい（米国特許第６，７５３，５１４号、６，６１３，３０８号、５，４６６，４６８号、５，５４３，１５８号；５，６４１，５１５号；及び５，３９９，３６３号は、その全体において参照により本明細書にそれぞれ具体的に組み込まれる）。

[00122] 遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として本明細書に開示される組成物の溶液剤は、好適にもヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と混合して、水中で調製され得る。分散液剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物において、そして油剤において調製され得る。通常の保存及び使用の条件の下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。注射可能な使用に適した医薬形態には、無菌水溶液剤又は分散液剤と、注射可能な無菌水溶液剤又は分散液剤の即時調製用の無菌散剤が含まれる（米国特許第５，４６６，４６８号、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。すべての事例において、この形態は、無菌でなければならず、容易に注射し得る程度に流動的でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（即ち、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、等）、これらの好適な混合物、及び／又は植物油剤を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散の場合に求められる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適正な流動性を維持してよい。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、等）によってもたらすことができる。多くの事例では、等張剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムクロリドを含めることが好ましいであろう。例えば、アルミニウムモノステアレート又はゼラチンのような吸収遅延剤の組成物における使用によって、注射可能な組成物の延長吸収をもたらすことができる。

[00123] 水溶液剤における非経口投与では、例えば、その溶液剤は、必要であれば好適に緩衝化すべきであって、液体希釈剤は、十分な生理食塩水又はブドウ糖で最初に等張にすべきである。この特別な水溶液剤は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内の投与に特に適している。これに関連して、当業者には、本開示に照らして、利用し得る無菌水性媒体が公知であろう。例えば、１回の投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液剤に溶かして、１０００ｍｌの皮下注入液剤へ加えても、提案された注入部位に注射してもよい（例えば、「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」15版、1035-1038頁と 1570-1580頁を参照のこと）。投与量のいくらかの変動は、治療される被験者の状態に依存して、必然的に生じるものである。投与の責任者は、ともかくも、個々の被験者に適した用量を決定するものである。さらに、ヒトへの投与では、ＦＤＡ生物製剤基準局によって要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を製剤が満たすべきである。

[00124] 無菌注射溶液剤は、所要量の組成物を上記に列挙した様々な他の成分を含む適正な溶媒に取り込んで、必要に応じて濾過滅菌を続けることによって調製する。一般に、分散液剤は、様々な無菌組成物を、基本の分散媒体と上記に列挙したものより求められる他の成分を含有する無菌担体の中へ取り込むことによって調製する。無菌注射溶液剤の調製用の無菌散剤の場合、いくつかの調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥の技術であって、これにより、すでに滅菌濾過したその溶液より、有効成分＋所望の追加成分の散剤が入手される。粉末化した組成物は、安定化剤を伴うか又は伴わずに、例えば、水又は無菌溶液剤のような液体担体と組み合わせる。

[00125] 他の態様において、組成物は、様々なその他の経路による投与、例えば、局所（即ち、経皮）投与、粘膜投与（鼻腔内、膣内、等）及び／又は吸入による投与のために製剤化され得る。

[00126] 局所投与用の医薬組成物には、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、又は散剤のような投薬適用のために製剤化される組成物を含めてよい。軟膏剤には、局所適用のための油性、吸着性、乳剤性、及び水溶性の基剤組成物がすべて含まれるが、一方、クリーム剤とローション剤は、乳剤性基剤だけが含まれる組成物である。局所投与される医薬品は、皮膚を通過する有効成分の吸着を促進する浸透エンハンサーを含有してよい。好適な浸透エンハンサーには、グリセリン、アルコール類、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、及びラウロカプラムが含まれる。局所適用のための組成物に可能な基剤には、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、及びワセリンだけでなく、他の好適な吸収性、乳剤性、又は水溶性の軟膏基剤が含まれる。局所製剤には、組成物を保存して均質な混合物を提供するために、必要に応じて、乳化剤、ゲル化剤、及び抗微生物保存剤も含めてよい。組成物の経皮投与は、「パッチ剤」の使用も含んでよい。例えば、パッチ剤は、１以上の組成物を所定の速度で、一定の時間帯にわたって連続したやり方で供給し得る。

[00127] ある態様において、組成物は、点眼剤、鼻腔スプレー剤、吸入、及び／又は他のエアゾール送達担体によって送達してよい。米国特許第５，７５６，３５３号及び５，８０４，２１２号（その全体が参照により本明細書にそれぞれ具体的に組み込まれる）には、組成物を点鼻エアゾールスプレー剤より肺へ直接的に送達するための方法が記載されている。同様に、鼻腔微粒子樹脂（Takenaga et al., 1998）とリソホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）を使用する薬物の送達も製薬技術の分野でよく知られていて、本明細書に記載する組成物を送達するのに利用し得る。同様に、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）には、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックス剤の形態での経粘膜薬物送達が記載されていて、本明細書に記載する組成物を送達するのに利用し得る。

[00128] 本明細書に開示する組成物は、エアゾール剤により送達し得ることがさらに想定される。「エアゾール剤」という用語は、微細化した固体又は液体粒子が液化又は加圧された気体推進薬に分散しているコロイド系を意味する。典型的な吸入用エアゾール剤は、液体推進薬又は液体推進薬と好適な溶媒の混合物中の有効成分の懸濁液剤からなる。好適な推進薬には、炭化水素類と炭化水素エーテル類が含まれる。好適な容器は、推進薬の圧力要件に従って変わるものである。エアゾール剤の投与は、被験者の年齢、体重、並びに症状の重症度及び応答に従って変わるものである。

[00129] 実施例
[00130] 本発明のいくつかの態様を本明細書の「実施例」において明確にする。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例解のためにのみ示されると理解されたい。上記の考察とこれらの実施例より、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができて、その精神及び範囲より逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修飾を行って、それを様々な使用法及び状況へ適用することができる。

[00131] 実施例１
[00132] 脂質を１００％エタノールに溶かすことによって、脂質ストック溶液を作製した。脂質はいずれも Avanti Polar Lipids（アメリカ）又はシグマ・アルドリッチ（アメリカ）より入手して、さらに精製せずに使用した。１．０ｍＬバイアルにおいて脂質（卵ホスファチジルコリン：コレステロール：ＴＰＧＳ，１５：３５：５）を様々な濃度の三級（ＤＯＤＭＡ）アミン及び四級（ＤＯＴＭＡ）アミン（４５：０，５：４０，１５：３０，２２．５：２２．５，３０：１５，４０：５，４５：０；ＤＯＤＭＡ：ＤＯＴＭＡ）と合わせた。追加のエタノールを加えて、１８０μＬの容量とした。次いで、これを４２０μＬの１０ｍＭクエン酸緩衝液と合わせて、３０％エタノールの最終濃度とした。この製剤を SILENCER ホタルルシフェラーゼ（ＧＬ２＋ＧＬ３）ｓｉＲＮＡ（Invitrogen）と１５：１のアミン対リン酸（Ｎ：Ｐ）比で合わせた。製剤をそのまま１５分間インキュベートした後に無血清ＤＭＥＭ（ギブコ）で希釈して、全量３００μＬとした。リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を陽性対照として使用して、同量のｓｉＲＮＡと同じＮ：Ｐで合わせて、同一の全量まで希釈した。

[00133] ＤＭＥＭ培地において５％ ＣＯ_２雰囲気下に３７℃で増殖させた、ルシフェラーゼ発現性ＳＫ−ＨＥＰ−１（肝細胞癌）細胞を、トランスフェクションに先立つ２４時間前に、９６ウェルプレート中にウェルにつき２ｘ１０^４個の細胞密度で蒔いた。細胞をほぼ８０％の集密度まで増殖させて、血清含有培地を取り出した。細胞を７０μＬのトランスフェクション培地でトランスフェクトして、４時間処理した。実験は、同一４検体で実施した。処理が完了した後で、細胞を１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、血清含有ＤＭＥＭを戻した。処理が完了してから４８時間後、製造業者の説明書に従ってルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ）によって、細胞についてルシフェラーゼ発現を分析した。この結果を図１に示す。最も有効なトランスフェクション活性を示したのは、ルシフェラーゼ発現において８５％を超えるノックダウンを示した、５％ ＤＯＴＭＡと４０％ ＤＯＤＭＡを含有する製剤である。

[00134] 実施例２
[00135] 脂質を１００％エタノールに溶かすことによって、脂質ストック溶液を作製した。脂質はいずれも Avanti Polar Lipids（アメリカ）又はシグマ・アルドリッチ（アメリカ）より入手して、さらに精製せずに使用した。１．０ｍＬバイアルにおいて脂質（卵ホスファチジルコリン：コレステロール：ＴＰＧＳ，１５：３５：５）を様々な濃度の三級（ＤＯＤＭＡ）アミン及び四級（ＤＯＴＭＡ）アミン（９０：１０、７０：３０、５０：５０、３０：７０、１０：９０；ＤＭＨＤＡ：ＤＯＴＭＡ）と合わせた。追加のエタノールを加えて、１８０μＬの容量とした。次いで、これを４２０μＬの１０ｍＭクエン酸緩衝液と合わせて、３０％エタノールの最終濃度とした。この製剤をＧ３１３９（Genasense）ＯＤＮと１５：１のアミン対リン酸比（Ｎ：Ｐ）で合わせた。製剤をそのまま１５分間インキュベートした後に無血清ＲＰＭＩ １６４０（Mediatech）で全量３００μＬまで希釈した。リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を陽性対照として使用して、同量のＯＤＮと同じＮ：Ｐで合わせて、同一の全量まで希釈した。

[00136] ＲＰＭＩ １６４０培地において５％ ＣＯ_２雰囲気下に３７℃で増殖させたＫＢ（ヒーラの亜系）細胞を、トランスフェクションに先立つ２４時間前に、９６ウェルプレート中にウェルにつき２ｘ１０^４個の細胞密度で蒔いた。細胞をほぼ８０％の集密度まで増殖させて、血清含有培地を取り出した。細胞を７０μＬのトランスフェクション培地でトランスフェクトして、４時間処理した。実験は、同一４検体で実施した。処理が完了した後で、細胞を１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、血清含有ＲＰＭＩ １６４０を戻した。処理が完了してから４８時間後、細胞についてＢｃｌ−２下方調節を分析した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、アクチンに対するＢｃｌ−２の下方調節を評価した。図２に示すように、ＤＭＨＤＡ／ＤＯＴＡＰ（９０／１０のモル比）を含有する製剤でのトランスフェクションは、非トランスフェクト細胞に比較して、Ｂｃｌ−２発現の７５％より大きい下方調節をもたらした。リポフェクタミン^ＴＭ、ＤＭＨＤＡ単独、及びＤＯＴＡＰ単独を対照として役立てた。代わりの比でのＤＭＨＤＡ／ＤＯＴＡＰの製剤は、より低率のトランスフェクション効率を示した。

[00137] 実施例３
[00138] 様々なＳＰＬＮ−Ｇ製剤について、トランスフェクション効率を分析した：ＳＰＬＮ−Ｇ５０（４０：５：５０：５のモル比でのＤＭＨＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＧＲＡＭ、ＴＰＧＳ）、ＳＰＬＮ−Ｇ３５（４０：５：３５：１５：５のモル比でのＤＭＨＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＧＲＡＭ、ＤＯＰＥ、ＴＰＧＳ）、ＳＰＬＮ−Ｇ３０（４０：５：３０：２０：５のモル比でのＤＭＨＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＧＲＡＭ、ＤＯＰＥ、ＴＰＧＳ）、ＳＰＬＮ−Ｇ２０（４０：５：２０：３０：５のモル比でのＤＭＨＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＧＲＡＭ、ＤＯＰＥ、ＴＰＧＳ）、ＳＰＬＮ−Ｇ１０（４０：５：１０：４０：５のモル比でのＤＭＨＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＧＲＡＭ、ＤＯＰＥ、ＴＰＧＳＳ）、及びＳＰＬＮ−Ｇ０（４０：５：５０：５のモル比でのＤＭＨＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＴＰＧＳ）。いずれの脂質も Avanti Polar Lipids（アメリカ）又はシグマ・アルドリッチ（アメリカ）より購入して、さらに精製せずに使用した。脂質とペプチドをエタノールに溶かして、適正な比で合わせて、ＬＮを生成した。追加のエタノールとクエン酸緩衝液を加えて、３０％の最終エタノール含量とした。この２．０ｍｇ／ｍＬのＬＮ溶液をｓｉＲＮＡ又はＯＤＮと１５：１のＮ：Ｐで合わせてそのまま室温で１５分間反応させてから、さらに希釈した。この製剤の粒径は、１００〜３００ｎｍの間に及んだ。脱イオン水で希釈してｃ−ｍｙｂ ＯＤＮと合わせたこの製剤のゼータ電位測定値（図３）は、グラミシジン含有製剤では、５〜１５ｍＶの間に及ぶゼータ電位を示した。これは、３５ｍＶを超えるゼータ電位を示した陽性対照のリポフェクタミン２０００と対照的である。

[00139] １０％ ＦＢＳと１％ストレプトマイシン／ペニシリンを補充したＤＭＥＭ培地（ギブコ）において５％ ＣＯ_２雰囲気下に３７℃で培養したＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を集密になるまで増殖させて、９６ウェルプレートにおいてウェルにつき２ｘ１０^４個の細胞密度で蒔いた。ホタルルシフェラーゼ（ＧＬ２＋ＧＬ３）ｓｉＲＮＡをこの製剤と１５：１のＮ：Ｐで合わせた。製剤をそのまま脂質製剤と室温で１５分間合わせた後で、ＤＭＥＭで希釈した。トランスフェクション効率を無血清条件と２０％血清条件の両方で検査した。培養基を取り出して、ウェルにつき７０μＬのトランスフェクション培地と交換した。細胞を４時間処理した後で、１Ｘ ＰＢＳで３回洗浄した。４８時間の処理後、細胞生存度（図４）とルシフェラーゼ発現（図５）についてＭＴＳアッセイとルシフェラーゼアッセイキットによってそれぞれ分析した。３５％以下のグラミシジンを含有する製剤は、高血清トランスフェクション条件の下で、リポフェクタミン２０００より低い細胞毒性とより高いトランスフェクション効率を明示した。

[00140] ＭＣＦ−７（ＥＲ陽性乳癌）細胞において、ＯＤＮ Ｇ３１３９によるＢｃｌ−２の下方調節を検討した。２０％血清の存在下でトランスフェクションを起こした。ＲＴ−ＰＣＲ（図６）を使用して、アクチンに対するＢｃｌ−２の下方調節を評価した。ＳＬＮ−Ｇ２０は、リポフェクタミン２０００に比べて、有意なＢｃｌ−２の下方調節を明示した。このことは、図７に見られるように、同一検体（ｎ＝３）でのＫＢ細胞において再現された。

[00141] 実施例４
[00142] ＥＤＣ／ＮＨＳ（１：５：１０：５、ＤＯＰＥ：ＬＡ：ＥＤＣ：ＮＨＳ）を使用してラクトビオン酸をＤＯＰＥと架橋連結させることによって、ラクトシル化ＤＯＰＥ（Ｌ−ＤＯＰＥ）を生成した。脂質とペプチド（４５：５：５：１０：２８：２：１０のモル比でのＤＯＤＡＰ：ＤＯＴＡＰ：Ｌ−ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ：グラミシジン）を１Ｘ ＰＢＳ中で合わせた。Ｌ−ＤＯＰＥ（ＤＯＰＥの代用）及び／又はグラミシジンを用いて、他の対照製剤を完成させた。この製剤化ＬＮの粒径（図８）は、５０ｎｍと１５０ｎｍの間へ低下した。この製剤は、３０日間にわたってコロイド安定性を示した。このＬＮのゼータ電位（図８）は、−１０ｍＶと１０ｍＶの間に及んだ。ＯＤＮローディング効率の検討により、７５％を超える濃縮が明らかになった。

[00143] ルシフェラーゼアッセイを使用して、ルシフェラーゼ発現性ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞におけるＬＬＮの標的化効率を決定した。１０％ ＦＢＳと１％ストレプトマイシン／ペニシリンを補充したＤＭＥＭ培地（ギブコ）において５％ ＣＯ_２雰囲気下に３７℃で培養したＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を集密になるまで増殖させて、９６ウェルプレートにおいてウェルにつき２ｘ１０^４個の細胞密度で蒔いた。ホタルルシフェラーゼ（ＧＬ２＋ＧＬ３）ｓｉＲＮＡをこの製剤と１０：１のＮ：Ｐで合わせた。製剤をそのまま脂質製剤と室温で１０分間合わせた後で、ＤＭＥＭで希釈した。トランスフェクション効率を無血清、１０％、及び２０％血清の条件で検査した。培養基を取り出して、ウェルにつき７０μＬのトランスフェクション培地（ｓｉＲＮＡ １００ｎＭ）と交換した。細胞を４時間処理した後で、１Ｘ ＰＢＳで３回洗浄した。４８時間の処理後、ルシフェラーゼ発現（図９）についてルシフェラーゼアッセイキットによって分析した。グラミシジンだけでなくＡＳＧＲも含有する製剤は、いずれかのＬＮ修飾単独の製剤よりも高いトランスフェクション効率を示した。

[00144] ＬＬＮの取込みについて蛍光顕微鏡法（図１０）とフローサイトメトリー（図１１）によって分析した。ＤＡＰＩ核染色法を肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞へ適用し、細胞内取込みを示すために、ｃｙ３−標識化オリゴヌクレオチドを加えた。蛍光画像によって実証されるように、ｓｉＲＮＡ及びＯＤＮの細胞の細胞質への有効な送達には、ＡＳＧＲの標的化が必要である。フローサイトメトリーデータは、標的指向性のＬＬＮと非標的指向性のＬＬＮの間でほぼ３．３倍の差があることを示し、標的指向性の送達の利点をさらに実証した。ＬＮ−アンタゴｍｉｒ製剤によるｍｉＲ−１５５の下方調節についてＲＴ−ＰＣＲによって評価した（図１２）。ＲＮＵ６Ｂに比べて、ｍｉＲ−１５５の約６０％の下方調節が達成された。１００ｎＭの抗ｍｉＲ−１５５を使用した。

[00145] 実施例５
[00146] 脂質（６０：３５：５のモル比でのＤＤＡＢ、ＣＨＯＬ、Ｔｗｅｅｎ８０）を１００％エタノールに溶かした。この溶液の１００μＬを９００μＬの１Ｘ ＰＢＳに希釈した。ゲル移動度シフト分析（図１３）のためにＬＮを様々なｗ／ｗ比でＬＯＲ−１２８４（Dharmacon より購入したｓｉＲＮＡ）（０．１μｇ）と合わせた。１：８（ｓｉＲＮＡ：ＬＮ）で遅滞が生じた。下方調節試験のためにＬＮを０．１μＭ ｓｉＲＮＡと合わせた。ＬＮ−ｓｉＲＮＡ ＬＯＲ−１２８１製剤によるＲＮＲ Ｒ２の下方調節について、対照としてのアクチンと１：２０及び１：３０（ｓｉＲＮＡ：ＬＮ）のｗ／ｗ比を使用するＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＲＰＭＩ １６４０培地において５％ ＣＯ_２雰囲気下に３７℃で増殖させたＫＢ細胞を、トランスフェクションに先立つ２４時間前に、６ウェルプレートにおいてウェルにつき３．０ｘ１０^５個の細胞密度で蒔いた。細胞をほぼ８０％の集密度まで増殖させて、血清含有培地を取り出した。細胞を１０００μＬのトランスフェクション培地でトランスフェクトして、４時間処理した。１０％血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地の存在下でトランスフェクションが生じた。実験は、同一３検体で実施した。処理が完了した後で、細胞を１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、血清含有ＲＰＭＩ １６４０を戻した。処理が完了してから４８時間後、細胞について、アクチンをハウスキーピング遺伝子とするＲＴ−ＰＣＲによって、ＲＮＲ Ｒ２発現レベルを分析した。結果を図１４に示す。１：３０（ｓｉＲＮＡ：ＬＮ）の製剤で、有意な下方調節が生じた。

[00147] 先の工程のＬＮ（１：３０，ｓｉＲＮＡ：ＬＮ）を、ＬＯＲ−１２８４とプレ混合した様々な量のＰｒＫと室温で１５分間合わせた。ＲＰＭＩ １６４０培地において５％ ＣＯ_２雰囲気下に３７℃で増殖させたＫＢ（マウス癌）細胞を、トランスフェクションに先立つ２４時間前に、６ウェルプレートにおいてウェルにつき３．０ｘ１０^５個の細胞密度で蒔いた。細胞をほぼ８０％の集密度まで増殖させて、血清含有培地を取り出した。細胞を１０００μＬのトランスフェクション培地でトランスフェクトして、４時間処理した。０％、５％、及び１０％血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地の存在下でトランスフェクションが生じた。実験は、同一３検体で実施した。処理が完了した後で、細胞を１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、血清含有ＲＰＭＩ １６４０を戻した。処理が完了してから４８時間後、細胞について、アクチンをハウスキーピング遺伝子とするＲＴ−ＰＣＲによって、ＲＮＲ Ｒ２発現レベルを分析した。結果を図１５に示す。血清含有培地では、０．３：１のＬＮ−ＰｒＫ：ｓｉＲＮＡのＬＯＲ−１２８１製剤が、ＰｒＫ無しの製剤と比較して、有意な下方調節を示した。１０％血清含有培地での同じトランスフェクション変数の下で細胞生存度試験も行った。ＬＮもＰｒＫ−ＬＮもこの処理レベルで有意な毒性を示さなかった（図１６）。ＰｒＫ−ｓｉＲＮＡ複合体の血清中の保護効果について、ＬＮ−ｓｉＲＮＡとＰｒＫ−ＬＮ−ｓｉＲＮＡ複合体を新鮮なマウス血漿においてインキュベートすることによって検討した（図１７）。製剤中のＰｒＫの包含は、非保護化製剤に優る有意な保護活性を３日間にわたって示した。

[00148] さらなる試験により、ＰｒＫ−ＬＮへの温度効果を検討した。ＰｒＫ、ＬＯＲ−１２８４、及びＬＮを０．３：１：３０の重量比で激しく撹拌しながら合わせて、４℃、１８℃、３７℃、及び５５℃の温度で維持した。生成した複合体のゼータ電位（図１８）を測定した。１８℃と３７℃で混合した複合体は、４℃と５５℃で混合したものよりずっと高いゼータ電位を有した。様々な温度で生成した複合体について、in vitroの活性を検査した。ＲＰＭＩ １６４０培地において５％ ＣＯ_２雰囲気下に３７℃で増殖させたＫＢ細胞を、トランスフェクションに先立つ２４時間前に、９６ウェルプレートにおいてウェルにつき３．０ｘ１０^５個の細胞密度で蒔いた。細胞をほぼ８０％の集密度まで増殖させて、血清含有培地を取り出した。細胞を１０００μＬのトランスフェクション培地でトランスフェクトして、４時間処理した。１０％血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地の存在下でトランスフェクションが生じた。実験は、同一２検体で実施した。処理が完了した後で、細胞を１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、血清含有ＲＰＭＩ １６４０を戻した。処理が完了してから４８時間後、細胞について、アクチンをハウスキーピング遺伝子とするＲＴ−ＰＣＲによって、ＲＮＲ Ｒ２発現レベルを分析した。結果を図１９に示す。より高い温度（３７℃及び５５℃）で複合した製剤は、より低い温度で生成した製剤に比べて、トランスフェクション効率のわずかな増加を示した。

[00149] 実施例６
[00150] ＳＰＬＮ−Ｇ２０について、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中への抗ｍｉＲ送達を試験した。ＳＰＬＮ−Ｇ２０を上記のように調製した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（トリプルネガティブ乳癌）細胞を、トランスフェクションに先立つ２４時間前に、６ウェルプレートにおいて、１％ペニシリン／ストレプトマイシンと１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中２ｘ１０^４個／ｃｍ^２の細胞密度で蒔いた。ＳＰＬＮ−Ｇ２０を抗ｍｉＲ−２２１と合わせて、ｍｉＲ−２２１の下流標的であるｐ２７／Ｋｉｐ１（腫瘍サプレッサー）を上方調節するその能力を評価した。抗ｍｉＲ−２２１の配列は、以下の通りであった：５’−ｇ_ｓａ_ｓａａｃｃｃａｇｃａｇａｃａａｕｇｕ_ｓａ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｕ−Ｃｈｏｌ−３’［配列番号１］。この配列には、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性に役立つ２’−Ｏ−メチル−修飾化オリゴヌクレオチド（小文字）とホスホロチオエート連結（ｓ下付き文字）が含まれた。さらに、疎水性部分（コレステロール（Ｃｈｏｌ））の３’端への付加部分を加えて、脂質ナノ粒子製剤との会合をさらに促進した。２０％血清の存在下にＳＰＬＮ−Ｇ２０を５０、１００、及び２５０ｎＭの抗ｍｉＲ−２２１とともに使用してＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をトランスフェクトした。処理をそのまま４時間進行させて、この時点でトランスフェクション培地を取り出して、新鮮な培地（１０％ ＦＢＳを補充した）と交換した。細胞をそのままさらに４４時間増殖させた後で、ＲＴ−ＰＣＲを開始した。細胞からのＲＮＡを TRIzol 試薬（Life Technologies）によって抽出して、製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III First-Strang Synthesis System（Life Technologies）によって、ｃＤＮＡを産生した。次いで、ＳＹＢＲグリーン（Life Technologies）とｐ２７／ｋｉｐ１用のプライマー（Alpha DNA）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。

[00151] フォワード：５’ＣＧＴＧＣＧＡＧＴＧＴＣＴＡＡＣＧＧ−３’［配列番号２］、
[00152] リバース：５’−ＣＧＧＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＣ−３’［配列番号３］）。

[00153] β−アクチン（フォワード：５’−ＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＧ−３’［配列番号４］、
[00154] リバース：５’−ＣＴＣＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣ−３’）［配列番号５］を対照として使用した。図２４に見られるように、ｍＲＮＡは、ＳＰＬＮ−Ｇ／抗ｍｉＲ−２２１の処理により、用量依存的なやり方で数倍上方調節された。

[00155] 実施例７
[00156] ＤＭＨＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＧＲＡＭ、ＤＯＰＥ、ＴＰＧＳより４０：５：２０：３０：５のモル比で構成されるＳＰＬＮ−Ｇ２０バージョン１（ＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ１）を先に記載のように調製した。ＤＭＨＤＡとＤＯＰＥをＤＯＤＡＰとＳｏｙ ＰＣ（ＳＰＣ）にそれぞれ置き換えて、ＳＰＬＮ−Ｇ２０の第二バージョン（ＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ２）も産生した。ＤＯＤＡＰも三級アミンであって、トランスフェクションにおいては、ＤＭＨＤＡよりよく特性決定されている。この態様において、ヘルパー脂質をＳＰＣに交換する選択を行ったのは、ＤＯＰＥベースの製剤が血清タンパク質との相互作用により低下した生体内活性を概して示すからである。最終組成は、４０：５：２０：３０：５（ＤＯＤＡＰ：ＤＯＴＡＰ：ＧＲＡＭ：ＳＰＣ：ＴＰＧＳ）のモル比で設定した。いずれの脂質も Avanti Polar Lipids（アメリカ）又はシグマ・アルドリッチ（アメリカ）より購入して、さらに精製せずに使用した。脂質とペプチドをエタノールに溶かして、適正な比で合わせた。追加のエタノールとクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を加えて、３０％の最終エタノール含量とした。この時点で、この２．０ｍｇ／ｍＬの脂質ナノ粒子溶液を抗ｍｉＲと１５：１のＮ：Ｐで合わせて、浴中で５分間音波処理して、そのまま室温で１５分間、静電複合体を生成させた後で、さらに希釈した。この製剤の粒径は、１００〜２００ｎｍの間に及んだ。

[00157] 抗ｍｉＲ−２２１をＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ１とＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ２と１５：１のＮ：Ｐで合わせた。ＢＴ−５４９（トリプルネガティブ乳癌細胞系）について、ｍｉＲ−２２１の下流標的であるｐ２７／ｋｉｐ１（アポトーシス調節に関与する遺伝子）及びエストロゲン受容体アルファ（ＥＲα、エストロゲン受容体の発現と、それによりホルモンベース療法への感作の原因となる遺伝子）の上方調節を検査した。細胞を、トランスフェクションに先立つ２４時間前に、６ウェルプレートにおいて、５％ ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technologies）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養基中２ｘ１０^４個／ｃｍ^２の細胞密度で蒔いた。トランスフェクションの時点で、培養基を２０％血清含有培地と交換した。２０％血清を使用して、生体内の高血清条件を模倣した。細胞を適正な対照で、又は２５０ｎＭの抗ｍｉＲ−２２１ロードＳＰＬＮ−Ｇベース製剤で、３７℃で４時間トランスフェクトした。この処理時間の最後に、細胞を１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄した。細胞そのまま４４時間増殖させた後で、ＲＴ−ＰＣＲを開始した。細胞からのＲＮＡを TRIzol 試薬（Life Technologies）によって抽出して、製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III First-Strang Synthesis System（Life Technologies）によって、ｃＤＮＡを産生した。次いで、ＳＹＢＲグリーン（Life Technologies）と、ｐ２７／ｋｉｐ１用のプライマーとエストロゲン受容体α用のプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。β−アクチンを参照遺伝子として使用した。図２５に明示するように、「抗ｍｉＲ−２２１無し」がほとんど活性を示さなかったのに対し、ＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ１とＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ２は、それぞれ約１．７５倍と約２．５倍のｐ２７／Ｋｉｐ１の上方調節を示した。図２６に見られるように、ＥＲα発現についても同様の結果が観測された。ＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ１がＥＲαをほぼ３倍上方調節した一方で、ＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ２はＥＲαを５倍以上上方調節した。これらのデータは、生体内の抗ｍｉＲ送達にとって、ＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ２が特に有用なナノ担体であることを示す。

[00158] 実施例８
[00159] ラクトビオン酸（ＬＡ）より構成され、ガラクトース部分を担って、リン脂質へ連結される親油性アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）標的化リガンドを合成して、抗ｍｉＲ−１５５の肝臓特異的な送達のためにＬＮへ取り込んだ。抗ｍｉＲのエンドソーム放出を容易にするために、そのＬＮ中へグラミシジンＡも取り込んだ。本明細書では、この製剤をラクトシル化グラミシジンベースのＬＮ（Ｌａｃ−ＧＬＮ）と呼ぶ。ＨｅｐＧ２細胞において、そしてマウスにおいて、肝細胞標的化について評価した。物理化学的性質、細胞内取込み、in vitro及び生体内での送達効率について検討した。

[00160] １，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）とＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、Avanti Polar Lipids（アラバマ州アラバスター）より購入し；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールとメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ−ＰＥＧ）は、NOF America Corporation（ミネソタ州エリジアン）より購入し；１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、Thermo Scientific（イリノイ州ロックフォード）より購入した。モノメトキシポリエチレングリコール２０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、GenzymePharmaceuticals（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手した。コレステロール、ラクトビオン酸、グラミシジンＡ、及び他の試薬は、いずれもシグマ・アルドリッチ（ミズーリ州セントルイス）より購入して、さらに精製しなかった。ホタルルシフェラーゼ（ＧＬ２＋ＧＬ３）ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃｉ−ｓｉＲＮＡ）（ＡＭ４６２９）、陰性スクランブル対照（ＡＭ１７０１０）、及びリポフェクタミン２０００は、Invitrogen（ニューヨーク州グランドアイランド）より購入した。

[00161] 抗ｍｉＲ−１５５（配列：５’−Ａ^＊Ｃ^＊ＣＣＣＵＡＵＣＡＣＧＡＵＵＡＧＣＡＵＵ^＊Ａ^＊Ａ−３’（配列番号６）、ホスホロチオエート連結（^＊）と２’−Ｏ−メチルを含有する）、Ｃｙ３標識化抗ｍｉＲ−１５５（Ｃｙ３−抗ｍｉＲ−１５５）、及びＣｙ５．５標識化抗ｍｉＲ−１５５（Ｃｙ５．５−抗ｍｉＲ−１５５）は、Alpha DNA（モントリオール、カナダ）によって合成された。ｍｉＲ−１５５（００２６２３）及びＲＮＵ６Ｂ（００１０９３）のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ用のＴａｑｍａｎキットは、アプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州カールスバッド）より購入した。

[00162] ラクトビオン酸をＥＤＣによって活性化してそのＮＨＳエステルへ変換してから、これをＤＯＰＥと反応させて、ｎ−ラクトビオニル−ＤＯＰＥ（Ｌａｃ−ＤＯＰＥ）を得た。この生成物をＮｅｘｕｓ ４７０ ＦＴＩＲ分光計（Thermo Scientific，イリノイ州ロックフォード）でのフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法によって特性決定した。Ｌａｃ−ＧＬＮは、エタノールインジェクション法によって調製した。ＤＯＤＡＰ、Ｌａｃ−ＤＯＰＥ、ＤＯＰＥ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びグラミシジンＡより５０：１０：２８：２：１０のモル比で構成される脂質混合物をエタノールに溶かして、ＲＮＡ分解酵素及びＤＮＡ分解酵素フリーのＨＥＰＥＳ緩衝化溶液（２０ｍＭ，ｐＨ７．４）へ速やかに注入した。生じる脂質ナノ粒子を音波洗浄器によって２分間音波処理して、ＲＮＡ分解酵素及びＤＮＡ分解酵素フリーの水に対して室温で４時間透析して、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）１０，０００ Dalton Float-A-Lyzer（Spectrum Laboratories 社、カリフォルニア州ランコ・ドミングス）を使用してエタノールを除去した。

[00163] 抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮは、ＲＮＡ分解酵素及びＤＮＡ分解酵素フリーＨＥＰＥＳ緩衝液に溶かした同容量の抗ｍｉＲ−１５５をＬａｃ−ＧＬＮへ加えて、１０秒間の短いボルテックス操作（vortexing）と室温で１０分間のインキュベーションを続けることによって調製した。脂質：抗ｍｉＲの重量比は１０：１に固定して、抗ｍｉＲ−１５５の濃度は、１ｍｇ／ｋｇであった。生じるナノ粒子を、０．２２μｍフィルター（Fisher Scientific，ペンシルベニア州ピッツバーグ）を使用して滅菌した。同じ方法によって対照製剤を調製した。

[00164] 抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮの粒径は、モデル３７０ ＮＩＣＯＭＰサブミクロン粒径分析計（NICOMP，カリフォルニア州サンタバーバラ）での動的光散乱法によって体積加重分布モードで定量した。粒子を細胞培養基に分散させた。Ｌａｃ−ＧＬＮの形態は、FEI Tecnai G2 Bio TWIN 透過型電子顕微鏡（FEI Company，オレゴン州、アメリカ）によって検査した。試料を上記のように調製して、その試料の１滴を分析用の穿孔カーボングリッド上にて酢酸ウラニルで１分間ネガティブ染色した。Gatan 791 MultiScan CCS カメラを使用して画像を記録して、デジタル・マイクログラフ（Degital Micrograph）３．１ソフトウェアパッケージによって処理した。

[00165] ZetaPALS ゼータ電位分析計（Brookhaven Instruments 社、ニューヨーク州ホルツビル）を使用して、抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮの表面電荷を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液において検査した。Ｌａｃ−ＧＬＮの被包化効率をＱｕａｎｔ−ｉＴ^ＴＭＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡキット（Invitrogen，ニューヨーク州グランドアイランド）によって製造業者のプロトコルに従って定量して、発光分光計（ＫＳ ５４Ｂ，パーキンエルマー、イギリス）を４８０ｎｍの励起と５２０ｎｍの発光で使用して、蛍光強度（ＦＩ）を定量した。被包化効率を算出した。

[00166] 抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮのコロイド安定性は、４℃又は２５℃で３０日間の保存期間にわたるその粒径の変化をモニターすることによって決定した。血清安定性試験を使用して、抗ｍｉＲを血清ヌクレアーゼ分解より防護するＬａｃ−ＧＬＮの能力について検討した。抗ｍｉＲ−１５５−ｌａｃ−ＧＬＮとフリーの抗ｍｉＲ−１５５を５０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）へ曝露して、３７℃で様々な時間帯の間インキュベートした。次いで、各試料のアリコートを臭化エチジウム含有１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上へロードした。

[00167] ヒトＨＣＣ細胞系のＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞とＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地において、３７℃及び５％ ＣＯ_２で培養した。

[00168] Ｌｕｃｉ−ｓｉＲＮＡトランスフェクションでは、４８ウェルプレートにおいて、ルシフェラーゼを安定的に発現する２ｘ１０^４個のＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞をウェルにつき８００μｌの培養基に蒔いて、そのまま５％ ＣＯ_２雰囲気下に３７℃で一晩増殖させた。翌日、この培養基を、０％、１０％、及び２０％のＦＢＳを含有する培地と交換して、Ｌｕｃｉ−ｓｉＲＮＡ含有Ｌａｃ−ＧＬＮと様々な対照製剤（１００ｎＭ）で細胞を４時間トランスフェクトした。トランスフェクションの後で、培地を１０％ ＦＢＳを含有する新鮮な培地と交換して、トランスフェクション後４８時間で細胞をＰＢＳで洗浄して、ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ、ウィスコンシン州マジソン）を製造業者の説明書に従って使用して、細胞溶解液中のルシフェラーゼ活性を定量した。簡潔に言えば、ＢＣＡアッセイキット（ピアス、イリノイ州ロックフォード）を使用して各ウェルのタンパク質の総量を定量して、タンパク質の総量に対する正規化によってルシフェラーゼ活性を決定した。次いで、ルシフェラーゼの下方調節を未処理陰性対照に比較した相対値として計算した。

[00169] 抗ｍｉＲ−１５５トランスフェクションでは、ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートにおいて２ｍｌの培養基とともにウェルにつき２ｘ１０^５個の細胞で蒔いて、５％ ＣＯ_２雰囲気下に３７℃で一晩インキュベートした。次いで、培養基を新鮮な培地と交換して、リポフェクタミン２０００、Ｌａｃ−ＧＬＮ、及び対照製剤を使用して細胞を１００ｎＭの抗ｍｉＲ−１５５でトランスフェクトして、４時間後に、この培地を新鮮な培地と交換した。細胞を３７℃でさらに４８時間インキュベートしてから、ｍｉＲ−１５５とその標的遺伝子の発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって定量した。陽性対照として、リポフェクタミン２０００を使用してＬｕｃ−ｓｉＲＮＡと抗ｍｉＲ−１５５でトランスフェクトした細胞を製造業者のプロトコルに従って実施した。未処理細胞とエンプティ（empty）Ｌａｃ−ＧＬＮを陰性対照として使用した。

[00170] Ｌａｃ−ＧＬＮの細胞毒性は、ＭＴＳアッセイ（プロメガ、ウィスコンシン州マジソン）によって評価した。ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートにおいてウェルにつき１ｘ１０^４個の細胞密度で蒔いた。一晩のインキュベーションの後で、細胞をエンプティＬａｃ−ＧＬＮ、陰性対照ＲＮＡ単独、抗ｍｉＲ−１５５単独、陰性対照ＲＮＡ含有Ｌａｃ−ＧＬＮ、及び抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮで、１００ｎＭのＲＮＡ濃度で２４時間処理した。次いで、各ウェルへＭＴＳ試薬（２０μＬ）を加えて、細胞をさらに２時間インキュベートした。Multiskan Ascent 自動プレートリーダーを使用して、各ウェルの４９０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定した。未処理細胞を対照として使用して、１００％の生存度と規定した。この未処理細胞の百分率として細胞生存度を計算した。

[00171] 蛍光性のＣｙ３−抗ｍｉＲ−１５５をＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトすることによってＬａｃ−ＧＬＮの細胞内取込みの分析を実施して、共焦点顕微鏡法とフローサイトメトリーによって評価した。共焦点顕微鏡法では、各ウェルの底に無菌カバーガラスを含有する６ウェルプレート（Fisher Scientific，１２−５４５−８２，ペンシルベニア州ピッツバーグ）にウェルにつき２ｘ１０^５個のＨｅｐＧ２細胞を蒔いて、そのまま一晩増殖させた。次いで、細胞を１００ｎＭのＣｙ３−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＧＬＮ、及びＬａｃ−ＧＬＮ（２０ｍＭラクトースと１％ ＢＳＡを含む）で、３７℃で１時間処理して、ＰＢＳで５回の洗浄工程を続けた。細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定して、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Invitrogen，ニューヨーク州グランドアイランド）とＡｌｅｘａ−４８８ファロイジン（Invitrogen，ニューヨーク州グランドアイランド）で、それぞれ室温で１０分間染色した。次いで、細胞付きのカバーガラスをそのプレートから取り外して、通常のスライドガラスでカバーした。共焦点分析をオリンパスＦＶ１０００フォルター共焦点顕微鏡（オリンパス光学、東京、日本）で実施した。

[00172] フローサイトメトリー分析では、２ｘ１０^５個のＨｅｐＧ２細胞を１００ｎＭのＣｙ３−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＧＬＮ、ＧＬＮ（２０ｍＭラクトースと１％ ＢＳＡを含む）、及びＬａｃ−ＧＬＮ（２０ｍＭラクトースと１％ ＢＳＡを含む）で、３７℃で１時間処理した。０．２５％トリプシンを使用して細胞を懸濁させ、ＰＢＳで５回洗浄して、４％パラホルムアルデヒドで固定した。ベクトン・ディキンソン FACScalibur フローサイトメーター（ニュージャージー州フランクリンレイクス）で蛍光強度を測定して、各試料につき全部で１０，０００回のイベントを回収した。

[00173] トランスフェクトされた細胞又は組織の抽出液由来の全ＲＮＡを TriZol 試薬（Invitrogen，ニューヨーク州グランドアイランド）によって単離して、標準プロトコルに従って精製した。ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用してｍｉＲ−１５５のｃＤＮＡを合成して、このｃＤＮＡを増幅して、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡキット（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して定量した。第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Invitrogen，ニューヨーク州グランドアイランド）を使用してＣ／ＥＢＰβ及びＦＯＸＰ３のｃＤＮＡを合成して、生じるｃＤＮＡを増幅して、ＳＹＢＲグリーン法（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して定量した。

[00174] プライマー・エクスプレス・プログラム（アプライド・バイオシステムズ）によってプライマーを設計した：
[00175] Ｃ／ＥＢＰβ：
[00176] フォワード：５’−ＡＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧ−３’［配列番号７］、
[00177] リバース：５’−ＴＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＧＣＡＧＧＧＴＧＣ−３’［配列番号８］；
[00178] ＦＯＸＰ３：
[00179] フォワード：５’−ＡＡＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣ−３’［配列番号９］、
[00180] リバース：５’−ＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＴＧＴＧ−３’［配列番号１０］；及び
[00181] ＧＡＰＤＨ：
[00182] フォワード：５’−ＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＴＴＴ−３［配列番号１１］、
[00183] リバース：５’−ＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’［配列番号１２］）。

[00184] Ｃ／ＥＢＰβ及びＦＯＸＰ３のレベルをＧＡＰＤＨのそれに対して正規化する一方で、ｍｉＲ−１５５のレベルは、ＲＵＮ６Ｂのそれに対して正規化した。２^−ΔＣＴアプローチを使用して、それらの発現を計算した。

[00185] 蛍光性Ｃｙ３−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ及びＬａｃ−ＧＬＮを共焦点顕微鏡法分析に使用した。雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣｙ３−抗ｍｉＲ−１５５（５０μｇ）含有ＧＬＮ及びＬａｃ−ＧＬＮを全量２００μｌの注射液で静脈内に投与した。４時間後、マウスを犠牲にして組織を回収した。採取した組織を４％パラホルムアルデヒド中に６時間固定して、３０％スクロースに４℃で一晩浸漬した。次いで、組織をブロックホルダーへ移し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．凍結培地（Fisher Scientific，ペンシルベニア州ピッツバーグ）で包埋して、液体窒素中で凍らせた。組織試料を組織切片作成用に処理して、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Invitrogen，ニューヨーク州グランドアイランド）とＡｌｅｘａ−４８８ファロイジン（Invitrogen，ニューヨーク州グランドアイランド）で、それぞれ室温で１０分間染色した。オリンパスＦＶ１０００フォルター共焦点顕微鏡（オリンパス光学、東京、日本）を使用して、蛍光画像を捉えた。

[00186] 異なる組織中の生体内取込みをＩＶＩＳ造影法によって測定するために、蛍光性Ｃｙ５−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮ及びＬａｃ−ＧＬＮを使用した。この実験には、上記に記載したのと同じ処理を適用した。組織全体を採取して、４％パラホルムアルデヒド中に６時間固定して、３０％スクロースに４℃で１２時間浸した。Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ−２００生体内光造影システム（Caliper Life Sciences，マサチューセッツ州ホプキントン）を使用して、組織全体のＣｙ５蛍光シグナルを測定した。

[00187] 雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ陰性対照ＲＮＡ又は抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮと他の対照を１．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射によって投与した。投与後４８時間で、マウスに麻酔をして、肝臓組織を採取して、液体窒素で直ちに凍らせた。ＲＮＡ抽出とＲＴ−ＰＣＲを先の節に記載したように実施した。

[00188] 結果を平均±標準偏差として報告して、それぞれの実験では少なくとも同一３検体を実施した。群間の比較は、２群ではスチューデントのｔ検定によって、多群ではＡＮＯＶＡによって解析した。ｐ値が＜０．０５である場合に結果を統計学的に有意とみなした。すべての統計解析は、マイクロソフトＥｘｃｅｌ ２００３ソフトウェアによって実施した。

[00189] ＦＴＩＲを使用して、コンジュゲートの生成を確認した。図２７は、Ｌａｃ−ＤＯＰＥ、ＤＯＰＥ、及びラクトビオン酸のＦＴＩＲスペクトルである。ｌａｃ−ＤＯＰＥの吸収ピークは、１６６０ｃｍ^−１と１５４０ｃｍ^−１の青色にあって、アミド結合形成を示す。

[00190] 様々なモル百分率のＬａｃ−ＤＯＰＥを含むＧＬＮの粒径とゼータ電位について評価して、この特性決定を図３９Ａ〜Ｂと図４１Ａ〜Ｂに示す。製剤中１０％ Ｌａｃ−ＤＯＰＥが最適の組成であって、７２．６６ｎｍの平均直径と３．４９ｍＶのゼータ電位を有した。この組成物を以下の実験用の送達担体として選択して、Ｌａｃ−ＧＬＮと名付けた。Ｌａｃ−ＧＬＮのサイズと形態についてＴＥＭによってさらに検証した。図３０Ｂ中の画像は、直径が１００ｍｍ未満であるＬａｃ−ＧＬＮの球形と一様なサイズ分布を示し、これはＤＬＳによって得られたデータと一致していた。

[00191] オリゴヌクレオチドを濃縮する粒子の能力より被包化効率を計算した。図３０に示すように、Ｌａｃ−ＧＬＮの被包化効率は、＞８５％であった。粒径の経時的な変化をモニターすることによって、コロイド安定性を決定した。図２９Ｃに示すように、Ｌａｃ−ＧＬＮの平均直径は、４℃で３０日の期間にわたって不変なままであったが、２５℃での保存下では、平均直径の有意な増加を観測した。

[00192] 抗ｍｉＲを防護するＬａｃ−ＧＬＮの能力について、血清安定性検査によって評価した。この検査では、フリーの抗ｍｉＲと抗ｍｉＲ−１５５−Ｌａｃ−ＧＬＮをＦＢＳと混合して、３７℃で異なる期間の間、培養した。図３１Ｂに示すように、フリーの抗ｍｉＲ−１５５が４時間以内の血清インキュベーションで完全に分解された（digested）のに対して、Ｌａｃ−ＧＬＮは、抗ｍｉＲ−１５５をヌクレアーゼ分解より１２時間まで防護することができた。この結果は、Ｌａｃ−ＧＬＮの良好な血清安定性を実証した。

[00193] 送達効率は、最初に、ＨＣＣ細胞特異的な取込みにおけるＧＬＮとＬａｃ−ＧＬＮの性能を比較することによって検証した。その表面にＡＳＧＲの高発現があるＨｅｐＧ２細胞を、Ｃｙ３−抗ｍｉＲ−１５５含有非標的指向性ＧＬＮとＡＳＧＲ−標的指向性Ｌａｃ−ＧＬＮで処理した。２０ｍＭラクトースと１％ ＢＳＡでのプレインキュベーションを適用して、ＡＳＧＲ媒介性の取込みと非特異的な取込みをそれぞれ阻止した。共焦点顕微鏡法によって細胞を評価した。図２９に示すように、Ｌａｃ−ＧＬＮで処理した細胞は、非標的指向性ＧＬＮで処理したで処理されたものより有意に強い蛍光シグナルを示した。この取込みの亢進は、ブロッキング剤で前処理された細胞において抑制されたので、Ｌａｃ−ＧＬＮの細胞内取込みがＡＳＧＲ特異的であることを実証した。この結果は、Ｌａｃ−ＧＬＮの成功裡のＡＳＧＲ標的化を示した。

[00194] ＧＬＮとＬａｃ−ＧＬＮの細胞内取込みについて、フローサイトメトリーによってさらに定量化した。図３０Ａに示すように、ＨｅｐＧ２細胞において、Ｌａｃ−ＧＬＮの取込みは、非標的指向性ＧＬＮのそれより約３．５８倍高かった。この蛍光シグナルは、ＧＬＮ前処理細胞において、２０ｍＭラクトースと１％ ＢＳＡで有意に低下せず、ＨＣＣ細胞によるＧＬＮの非特異的な取込みを示した（図３０Ｃ）。しかしながら、ブロッキング剤の非存在下では、ＧＬＮ処理細胞とＬａｃ−ＧＬＮ処理細胞の間で取込みが同等であるのに対し、ブロッキング剤とともにプレインキュベートされた細胞では、Ｌａｃ−ＧＬＮの取込みが３．５１倍抑制された（図３０Ｂ）。この結果により、ＡＳＧＲ−標的指向性の送達によりＨＣＣ細胞における細胞内取込みが改善されることがさらに確認された。

[00195] ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを安定的に発現するＨＣＣ ＳＫ−Ｈｅｐ１細胞を使用して、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡのサイレンシング（silencing）能力について分析することによって、異なる担体のトランスフェクション効率と、標的化リガンド、グラミシジンＡ、及び血清が含まれる様々な因子のトランスフェクション効率に対する効果を判定した。図３２Ａは、ＦＢＳフリー培地において、Ｌａｃ−ＬＮ処理群でのルシフェラーゼの発現（７８．９５％）がＬＮ処理群（９６．３５％）でのそれと比べて有意に少ないことを示し、ＡＳＧＲ−標的指向性戦略の利点が確認された。しかしながら、２０％ ＦＢＳを含有する培地は、このトランスフェクション効率に６％しか影響を及ぼさなかった。市販のリポフェクタミン２０００での処理は、ＬＮ処理群に近い、ルシフェラーゼ発現の７．８４％低下を引き起こして、このトランスフェクションは、高濃度での血清によって強く阻害された。さらに、競合剤としてのグラミシジンＡの濃度を高める効果について分析した。驚くべきことに、Ｌａｃ−ＧＬＮ処理群では、５％のグラミシジンＡも１０％のグラミシジンＡも、トランスフェクションの間、ＦＢＳの存在によって影響を受けなかった。この知見は、トランスフェクション活性が血清の存在に影響された、これまでに報告された研究結果と対照的であった。ＨｅｐＧ２細胞においても同様の結果が得られた（データ示さず）。従って、このＬａｃ−ＧＬＮ製剤は、臨床状況での生体内送達では血清が主たる障壁であったので、有利であった。

[00196] この担体のさらなるin vitro及び生体内送達における応用について評価するために、初めに、その細胞毒性をＨＣＣ細胞で検討した。ＨｅｐＧ２細胞を等量のエンプティＬａｃ−ＧＬＮ、陰性対照ＲＮＡ単独、抗ｍｉＲ−１５５単独、陰性対照ＲＮＡ−Ｌａｃ−ＧＬＮ、及び抗ｍｉＲ−１５５−Ｌａｃ−ＧＬＮで処理した。図３３Ｂに示すように、処理細胞と未処理細胞の間で細胞生存度における有意な変化を観測しなかった。この結果は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬａｃ−ＧＬＮの低い細胞毒性を明らかにした。

[00197] 次に、ｍｉＲ−１５５とその下流標的の発現に対する、抗ｍｉＲ−１５５を含有するＬａｃ−ＧＬＮの効果をＨｅｐＧ２細胞において評価した。細胞を抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮと他の対照製剤で４時間処理して、ｍｉＲ−１５５とその標的化遺伝子の発現をトランスフェクションから４８時間後にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。図３３Ｃは、未処理群に対する、異なる処理群由来のｍｉＲ−１５５発現レベルを示す。リポフェクタミン２０００で処理した陽性対照は、未処理群の９２．４％のｍｉＲ−１５５発現を有した。加えて、ＬＮ、ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＬＮ、及びＬａｃ−ＧＬＮ処理群は、リポフェクタミン２０００処理群のそれと同様のｍｉＲ−１５５発現レベルを明示して、これらの群の間の差は、わずかであった。陽性対照とＬａｃ−ＧＬＮ処理群の間のｍｉＲ−１５５発現におけるわずかな差に基づいて、二倍の抗ｍｉＲ−１５５濃度を適用して、ｍｉＲ−１５５の下方調節が抗ｍｉＲ−１５５濃度依存性であるかどうかを検証した。図３４Ａに示すように、抗ｍｉＲ−１５５の濃度を１００ｎＭから２００ｎＭへ二倍にしたとき、リポフェクタミン２０００処理群におけるｍｉＲ−１５５発現は、９２．４％から８９．５％へ変化した。この２つの処理群間の差は、依然として統計学的には有意でなかった。Ｌａｃ−ＧＬＮ処理群においても同様の傾向が観測され、ここではｍｉＲ−１５５の発現が１００ｎＭと２００ｎＭの抗ｍｉＲ−１５５処理においてそれぞれ８７．２％と８２．９％であった。上記のことは、ｍｉＲ−１５５の発現が抗ｍｉＲ−１５５の濃度に依存せず、抗ｍｉＲ−１５５の送達がｍｉＲ−１５５の分解をもたらさないことを示した。

[00198] 送達効率についてさらに検証するために、ｍｉＲ−１５５標的化遺伝子のＣ／ＥＢＰβ及びＦＯＸＰ３の発現を評価した。この結果を図３４Ｂに要約する。ｍｉＲ−１５５の定常的な発現（図３２Ａ）とは対照的に、Ｌａｃ−ＧＬＮ １００ｎＭ抗ｍｉＲ−１５５処理群においては、Ｃ／ＥＢＰβの発現とＦＯＸＰ３の発現がそれぞれ１６．１倍と４．１倍増加していた。リポフェクタミン２０００でトランスフェクトした細胞では、Ｃ／ＥＢＰβの発現とＦＯＸＰ３の発現のそれぞれわずかに１．４倍と１．９倍の増加が観測された。さらに、抗ｍｉＲ−１５５濃度を二倍にすると、Ｃ／ＥＢＰβとＦＯＸＰ３の発現の向上した上方調節をもたらし、ｍｉＲ−１５５標的化遺伝子の発現が抗ｍｉＲ−１５５濃度に依存することを明瞭に示した。従って、抗ｍｉＲ−１５５の送達は、間違いなく、ｍｉＲ−１５５の分解よりは、その機能阻害をもたらしたのである。要約すると、これらの結果は、抗ｍｉＲ送達における、市販の薬剤を上回るＬａｃ−ＧＬＮの優位性を示している。

[00199] Ｌａｃ−ＧＬＮの生体内送達の効率及び組織特異性について評価するために、Ｃｙ５−抗ｍｉＲ−１５５含有ＧＬＮとＣｙ５−抗ｍｉＲ−１５５含有Ｌａｃ−ＧＬＮを１．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、組織分布試験を実施した。４時間後、臓器を採取して、蛍光シグナルを比較した。図３５に示すように、マウスに非標的指向性ＧＬＮを注射した場合、蛍光シグナルを明示する主要臓器は、肺、脾臓、及び肝臓であった。対照的に、マウスをＬａｃ−ＧＬＮで処理した場合、最大の蛍光シグナルが肝臓に蓄積して、脾臓と腎臓にはごく弱いシグナルがあって、肺には検出可能なシグナルが無かった。これらの結果は、Ｌａｃ−ＧＬＮによるＣｙ５−抗ｍｉＲ−１５５の送達が肝臓特異的であること、そしてＬａｃ−ＧＬＮが標的外の取込みを最少化することができて、それによって全体の送達効率を向上させたことを示す。

[00200] 肝臓と他の臓器に対して共焦点顕微鏡法を実施して、ＧＬＮとＬａｃ−ＧＬＮの間の送達効率についてさらに評価した。肝細胞以外に、肝臓は、常在性マクロファージとして知られる、クッパー細胞の大集団も含有する。図３６Ａに示すように、非標的指向性ＧＬＮ−Ｃｙ５−抗ｍｉＲ−１５５で処理された肝臓では、蛍光シグナルの取込みが主にクッパー細胞によってなされたのに対し、マウスをＬａｃ−ＧＬＮで処理した場合、蛍光シグナルのより大きな集団が肝臓のクッパー細胞よりも肝細胞によって取り込まれた。

[00201] 蛍光シグナルの肺と脾臓における分布についても検証して、Ｌａｃ−ＧＬＮ送達を評価した。図３６Ｂに示すように、Ｌａｃ−ＧＬＮ処理マウス中の肺と脾臓に蓄積する蛍光シグナルは、ＧＬＮ処理マウス中のそれより少なくて、Ｌａｃ−ＧＬＮの肝臓への送達の高い特異性を示した。

[00202] 次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス肝臓におけるＬａｃ−ＧＬＮ−抗ｍｉＲ−１５５の送達効率を検討した。この目的のために、リポフェクタミン２０００、ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＬＮ、又はＬａｃ−ＧＬＮにおいて製剤化した１．５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−１５５の単回用量を尾静脈よりマウスに注射した。陰性対照として、エンプティＬａｃ−ＧＬＮ、陰性対照ＲＮＡ含有Ｌａｃ−ＧＬＮ、又はフリー抗ｍｉＲ−１５５の注射を使用した。投与から４８時間後にマウスを犠牲にして、肝臓を採取した。ｍｉＲ−１５５とその標的であるＣ／ＥＢＰβの発現について、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。図３７Ａは、ｍｉＲ−１５５の発現を図解する。注目されるように、陰性対照群では、ｍｉＲ−１５５レベルが変化しなかった。リポフェクタミン２０００とＬａｃ−ＧＬＮを使用して抗ｍｉＲ−１５５を送達した場合、非トランスフェクト対照と比較して、ｍｉＲ−１５５発現のそれぞれ１３％と２０％のわずかな減少が観測された。さらに、ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＬＮ、及びＬａｃ−ＧＬＮ間の差は、有意でなかった。ところが、Ｃ／ＥＢＰβ発現によって反映される送達効率は、ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＬＮ、及びＬａｃ−ＧＬＮ処理群で、未処理群に比較して、それぞれその発現の２．８倍、３．７倍、及び６．９倍の増加によって実証されるように、これらの群の間でかなり異なっていた（図３７Ｂ）。陰性対照群では有意な変化が観測されず、リポフェクタミン２０００処理群では、１．４倍のＣ／ＥＢＰβの上方調節を示しただけである。加えて、別のｍｉＲ−１５５標的遺伝子であるＦＯＸＰ３の発現も、ＧＬＮ、Ｌａｃ−ＬＮ、及びＬａｃ−ＧＬＮ処理群において、それぞれ１．１倍、１．２倍、及び２．１倍増加した（図３７Ｃ）。上記のデータは、Ｌａｃ−ＧＬＮによる送達効率の改善を実証して、in vitro実験の結果（図３４）と一致する。

[00203] 実施例９
[00204] ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートを合成した。ｃＲＧＤｆＣとＰＥＧ−ＤＳＰＥ−マレイミドを、チオエーテル連結を生じる−ＳＨ及び−マレイミド反応によりコンジュゲートさせた。この反応の間に使用したｃＲＧＤｆＣとＰＥＧ−ＰＳＰＥ−マレイミドのモル比は、１．５：１であった。ｃＲＧＤｆＣとＰＥＧ−ＤＳＰＥ−マレイミドを５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）緩衝液にそれぞれ溶かした。このｃＲＧＤｆＣ溶液とＰＥＧ−ＤＳＰＥ溶液を合わせて、撹拌しながら室温で６時間反応させた。生成物をＰＤ−１０カラムでのゲル濾過によって精製して、未反応／過剰のｃＲＧＤｆＣを生成物より除去した。スケールアップの反応では、このゲル濾過法をＧＰＣ、ＭＷＣＯ２０００膜を使用する透析、又はタンジェンシャルフロー透析濾過に置き換えることができる。生成物は、長期安定性のために凍結又は凍結乾燥させることができる。生成物の純度は、ＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳによって確認した。規格として、最小のｃＲＧＤｆＣコンジュゲーションレベル（例、８０％）と遊離ペプチド含量（例、＜１％）を設定することができる。生成物中のｃＲＧＤｆＣ含量は、ＢＣＡタンパク質アッセイによって定量することができる。

[00205] 本明細書に開示した製剤及び方法のいくつかの態様を上記の実施例において明確化した。これらの実施例は、本発明の特別な態様を示すものではあるが、例解のためにのみ示されることを理解されたい。上記の考察とこれらの実施例より、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認することができて、その精神及び範囲より逸脱することなく、様々な変更及び修飾を加えて、本明細書に記載される組成物及び方法を様々な使用法及び状況へ適用することができる。本開示の本質的な範囲より逸脱することなく、様々な変更をなし得て、その要素に均等物を代用し得る。加えて、本開示の教示内容に対して、その本質的な範囲より逸脱することなく、特別な状況又は材料を適用するために、多くの修飾を行うことができる。

Claims (89)

1. 三級アミンベースのカチオン性脂質と四級アミンベースのカチオン性脂質の組合せを含んでなる脂質ナノ粒子。
2. 三級アミン−カチオン性脂質が、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＣ−ＣＨＯＬ、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミン、又はこれらの組合せより選択される、請求項１の脂質ナノ粒子。
3. 四級アミン−カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、又はこれらの組合せより選択される、請求項１の脂質ナノ粒子。
4. 三級アミン−カチオン性脂質の濃度が全脂質含量の６０．０モルパーセント未満である、請求項１の脂質ナノ粒子。
5. 四級アミン−カチオン性脂質の濃度が全脂質含量の２０．０モルパーセント未満である、請求項１の脂質ナノ粒子。
6. 核酸、タンパク質、多糖、脂質、放射活性物質、治療薬剤、プロドラッグ、栄養補給剤、バイオマーカー、又はこれらの組合せより選択される分子を被包する、請求項１の脂質ナノ粒子。
7. 被包化分子が、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せより選択される核酸を含む、請求項６の脂質ナノ粒子。
8. カチオン性ポリマーをさらに含んでなる、請求項１の脂質ナノ粒子。
9. カチオン性ポリマーが：スペルミン、ジスペルミン、トリスペルミン、テトラスペルミン、オリゴスペルミン、テルミン、スペルミジン、ジスペルミジン、トリスペルミジン、オリゴスペルミジン、プトレシン、ポリリジン、ポリアルギニン、分岐鎖又は直鎖型のポリエチレンイミン、及びポリアリルアミンからなる群より選択される、請求項８の脂質ナノ粒子。
10. 膜融合性（fusogenic）ペプチドをさらに含んでなる、請求項１の脂質ナノ粒子。
11. 治療薬剤又はヌクレオチドの被包率が２０％以上である、請求項６の脂質ナノ粒子。
12. ３００ｎｍ未満の直径を有する、請求項１の脂質ナノ粒子。
13. 脂質のＤＯＤＭＡ及びＤＯＴＭＡを４５：０、５：４０、１５：３０、２２．５：２２．５、３０：１５、又は４０：５より選択されるモル比で含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
14. 脂質のＤＭＨＤＡ及びＤＯＴＡＰを９０：１０、７０：３０、５０：５０、３０：７０、又は１０：９０より選択されるモル比で含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
15. ３００ｎｍ未満の直径を有してペプチドを含んでなる、脂質ナノ粒子。
16. ペプチドが、グラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＳ；ＪＴＳ−１；プロテイナーゼＫ（ＰｒＫ）；トリコロビン−ＸＩＩａ；狂犬病ウイルス糖タンパク質；インターロイキン−１β；ＨＩＶ−Ｔａｔ；単純ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質；及びこれらの組合せより選択される、請求項１５の脂質ナノ粒子。
17. ペプチドが抗生物質を含む、請求項１５の脂質ナノ粒子。
18. 抗生物質がグラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＳより選択される、請求項１７の脂質ナノ粒子。
19. ペプチドが本質的に脂質化ＪＴＳ−１膜融合性ペプチドからなる、請求項１５の脂質ナノ粒子。
20. 脂質化ＪＴＳ−１膜融合性ペプチドが全製剤の約０〜約３０モルパーセントで存在する、請求項１９の脂質ナノ粒子。
21. プロテイナーゼＫをさらに含んでなる、請求項１５の脂質ナノ粒子。
22. プロテイナーゼＫが全製剤の約０〜約３０モルパーセントで存在する、請求項１５の脂質ナノ粒子。
23. 核酸、タンパク質、多糖、脂質、放射活性物質、治療薬剤、プロドラッグ、栄養補給剤、バイオマーカー、又はこれらの組合せより選択される分子を被包する、請求項１５の脂質ナノ粒子。
24. 被包化分子が、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡｓ、ｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せより選択される核酸を含む、請求項２３の脂質ナノ粒子。
25. ＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤を含んでなる脂質ナノ粒子。
26. ＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤が本質的にプロテイナーゼＫからなる、請求項２５の脂質ナノ粒子。
27. 核酸、タンパク質、多糖、脂質、放射活性物質、治療薬剤、プロドラッグ、栄養補給剤、バイオマーカー、又はこれらの組合せより選択される分子を被包する、請求項２５の脂質ナノ粒子。
28. 被包化分子が、ｐＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せより選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項２７の脂質ナノ粒子。
29. ３００ｎｍ未満の直径を有する、請求項２５の脂質ナノ粒子。
30. ３００ｎｍ未満の直径を有して：
    三級アミン−カチオン性ヘッド基と四級アミン−カチオン性ヘッド基の混合物；
    抗生物質；又は
    ＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤
    の２以上の組合せを含んでなる、脂質ナノ粒子。
31. ＤＮＡ分解酵素若しくはＲＮＡ分解酵素分解剤が本質的にプロテイナーゼＫからなる、請求項３０の脂質ナノ粒子。
32. 抗生物質がグラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＳを含む、請求項３０の脂質ナノ粒子。
33. ポリエチレングリコール−脂質コンジュゲートをさらに含んでなる、請求項１、１５又は２５の脂質ナノ粒子。
34. ポリエチレングリコール−脂質コンジュゲートが、ポリソルベート８０、ＴＰＧＳ、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＧより選択される、請求項３３の脂質ナノ粒子。
35. ポリエチレングリコール−脂質が約１０．０モルパーセント未満の濃度で存在する、請求項３３の脂質ナノ粒子。
36. Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミンをさらに含んでなる、請求項３３の脂質ナノ粒子。
37. Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミンが製剤の約６０．０モルパーセント未満の濃度で存在する、請求項３６の脂質ナノ粒子。
38. 標的細胞又は標的分子へ結合することが可能なリガンドをさらに含んでなる、請求項３６の脂質ナノ粒子。
39. リガンドが抗体又は抗体断片である、請求項３８の脂質ナノ粒子。
40. リガンドが、ｃＲＧＤ、ガラトース含有部分、トランスフェリン、葉酸塩、低密度リポタンパク質、又は表皮増殖因子より選択される、請求項３９の脂質ナノ粒子。
41. 請求項１、１５又は２５の脂質ナノ粒子と医薬的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物。
42. 経口的に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、又は経皮的に投与される、請求項４１の医薬組成物。
43. 経口投与錠剤として調製される、請求項４１の医薬組成物。
44. 無菌溶液剤として調製される、請求項４１の医薬組成物。
45. 無菌懸濁液剤として調製される、請求項４１の医薬組成物。
46. 凍結乾燥散剤として調製される、請求項４１の医薬組成物。
47. 坐剤として調製される、請求項４１の医薬組成物。
48. 癌又は感染症を診断するか又は治療する方法であって、請求項４１の医薬組成物の有効量をその必要な患者へ投与することを含んでなる、前記方法。
49. 核酸、化学療法剤、及びこれらの組合せより選択される少なくとも１つの分子を被包する、請求項１、１５又は２５の脂質ナノ粒子。
50. 被包化分子が、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びこれらの組合せより選択される核酸を含む、請求項４９の脂質ナノ粒子。
51. 被包化分子が、抗新生物剤、抗感染症薬、局所麻酔薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、血管新生阻害剤、β−アドレナリン作動性遮断薬、カルシウムチャネル拮抗薬、降圧剤、抗うつ薬、抗痙攣薬、抗細菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗寄生虫薬、コルチコステロイド、ホルモン、ホルモン拮抗薬、免疫調節剤、神経伝達物質拮抗薬、抗糖尿病剤、抗てんかん薬、止血薬、抗過緊張薬、抗緑内障剤、免疫調節性サイトカイン、鎮静剤、ケモカイン、ビタミン、毒素、麻薬、造影剤、及びこれらの組合せより選択される治療薬剤を含む、請求項４９の脂質ナノ粒子。
52. 被包化分子が核酸治療薬剤を含む、請求項４９の脂質ナノ粒子。
53. 核酸治療薬剤が、ｐＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡ、ＡＳＯ、及びこれらの組合せより選択される、請求項５２の脂質ナノ粒子。
54. 核酸治療薬剤が、置換基ＮＡ塩基単位への修飾、及び／又はリボース２’位を修飾すること又はホスホジエステルリンカーを置換することによって安定化される、請求項５２の脂質ナノ粒子。
55. 約３００ｎｍ未満の直径を有する、請求項１、１５又は２５の脂質ナノ粒子。
56. 約２００ｎｍ未満の直径を有する、請求項１、１５又は２５の脂質ナノ粒子。
57. ポリマーがその脂質の外部表面へ直結合を介するか又はリンカーを介して結合する、請求項１、１５又は２５の脂質ナノ粒子。
58. 少なくとも約４０％の分子の被包化効率を有する、請求項１６の脂質ナノ粒子。
59. ポリエチレングリコール−コンジュゲート脂質がさらに含まれる、請求項１、１５又は２５の脂質ナノ粒子。
60. ポリエチレングリコール−コンジュゲート脂質が、ポリソルベート８０、ＴＰＧＳ、及びｍＰＥＧ−ＤＳＰＥの１以上を含む、請求項５９の脂質ナノ粒子。
61. ポリエチレングリコール−コンジュゲート脂質が約１５．０モルパーセント未満の濃度で存在する、請求項２７の脂質ナノ粒子。
62. 標的細胞又は標的分子へ結合することが可能なリガンドをさらに含んでなる、請求項１、１５又は２５の脂質ナノ粒子。
63. リガンドが抗体又は抗体断片である、請求項６２の脂質ナノ粒子。
64. リガンドが、ｃＲＧＤ、ガラトース含有部分、トランスフェリン、葉酸塩、低密度リポタンパク質、又は表皮増殖因子より選択される、請求項６２の脂質ナノ粒子。
65. 請求項１、１５又は２５の脂質ナノ粒子と医薬的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物。
66. 経口的に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、又は経皮的に投与される、請求項６５の医薬組成物。
67. 経口投与錠剤、吸入剤、又は坐剤として調製される、請求項６５の医薬組成物。
68. 無菌溶液剤、無菌懸濁液剤、又は凍結乾燥散剤として調製される、請求項６５の医薬組成物。
69. 抗ｍｉＲ−２２１とＳＰＬＮ−Ｇ２０を含んでなり、ここでＳＰＬＮ−Ｇ２０は、ＤＭＨＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＧＲＡＭ、ＤＯＰＥ、及びＴＰＧＳを４０：５：２０：３０：５のモル比で含む、脂質ナノ粒子。
70. 抗ｍｉＲ−２２１が配列：５’−ｇ_ｓａ_ｓａａｃｃｃａｇｃａｇａｃａａｕｇｕ_ｓａ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｕ−Ｃｈｏｌ−３’（配列番号１）を有する、請求項６９の脂質ナノ粒子。
71. オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性を高めるために２’−Ｏ−メチル−修飾化オリゴヌクレオチド（小文字）とホスホロチオエート連結（下付きのｓ）が配列に含まれる、請求項７０の脂質ナノ粒子。
72. 抗ｍｉＲ−２２１が複合した脂質ナノ粒子を含んでなる組成物。
73. 脂質ナノ粒子がＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ１とＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ２を含み、ここでＳＰＬＮ−Ｇ２０バージョン１（ＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ１）は、ＤＭＨＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＧＲＡＭ、ＤＯＰＥ、及びＴＰＧＳを４０：５：２０：３０：５のモル比で含み、そしてここでＳＰＬＮ−Ｇ２０（ＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ２）は、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＧＲＡＭ、ＳｏｙＰＣ（ＳＰＣ）、及びＴＰＧＳを４０：５：２０：３０：５のモル比で含む、請求項７２の組成物。
74. 脂質ナノ粒子がＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ１とＳＰＬＮ−Ｇ２０ｖ２を１５：１のＮ：Ｐで含む、請求項７３の組成物。
75. 請求項６９、７０、７１、７２、７３又は７４の脂質ナノ粒子の有効量を投与することを含んでなる、乳癌を有するか又は有することが疑われる被験者を治療する方法。
76. 乳癌に罹患している被験者において癌抑制効果を提供する方法であって、ここでｍｉＲ−２２１発現レベルは、対照被験者に比べて症例被験者の癌細胞においてより高く、請求項６９、７０、７１、７２、７３、又は７４の組成物の有効量を該被験者へ投与することを含んでなる、前記方法。
77. 脂質ナノ粒子がｍｉＲ−２２１発現を下方調節する、請求項７６の方法。
78. 乳癌がトリプルネガティブ乳癌を含む、請求項７６の方法。
79. 被験者がヒトである、請求項７８の方法。
80. 脂質ナノ粒子と複合した抗ｍｉＲ−１５５を含んでなる組成物。
81. 脂質ナノ粒子がＬａｃ−ＧＬＮを含み、ここでＬａｃ−ＧＬＮは、ラクトビオン酸（ＬＡ）から構成され、ガラクトース部分を担い、そしてリン脂質へ連結する親油性アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）標的化リガンドを含む、請求項８０の組成物。
82. 脂質ナノ粒子中へ取り込まれたグラミシジンＡがさらに含まれる、請求項８０又は８１の組成物。
83. ＤＯＤＡＰ、Ｌａｃ−ＤＯＰＥ、ＤＯＰＥ、ＤＭＧ−ＰＥＧ、及びグラミシジンＡを５０：１０：２８：２：１０のモル比で含んでなる、請求項８２の組成物。
84. 抗ｍｉＲ−１５５が配列：５’−Ａ^＊Ｃ^＊ＣＣＣＵＡＵＣＡＣＧＡＵＵＡＧＣＡＵＵ^＊Ａ^＊Ａ−３’（配列番号６）を有する、請求項８０の組成物。
85. 配列がホスホロチオエート連結（^＊）と２’−Ｏ−メチルを含有する、請求項８４の組成物。
86. 請求項８０、８１、８２、８３、８４、又は８５の脂質ナノ粒子の有効量を投与することを含んでなる、肝臓癌を有するか又は有することが疑われる被験者を治療する方法。
87. 肝臓癌に罹患している被験者において癌抑制効果を提供する方法であって、ここでｍｉＲ−１５５発現レベルは、対照被験者に比べて症例被験者の癌細胞においてより高く、請求項８０、８１、８２、８３、８４、又は８５の脂質ナノ粒子の有効量を該被験者へ投与することを含んでなる、前記方法。
88. 脂質ナノ粒子がＣ／ＥＢＰβ遺伝子とＦＯＸＰ３遺伝子を下方調節する、請求項８７の方法。
89. 被験者がヒトである、請求項８６、８７、又は８８の方法。