JP2015519346A - アンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するための脂質ナノ粒子組成物 - Google Patents

Abstract

重合体に結合した巨大分子とターゲティング剤とを含む脂質ナノ粒子組成物が記載される。組成物は、治療剤を含みうる。治療剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）でありうる。例示的なＡＳＯは、Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するか、またはＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節する。また、重合体に結合した巨大分子と、Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するＡＳＯ、またはＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節するＡＳＯなどのＡＳＯである治療剤とを含む脂質ナノ粒子組成物も記載される。また、医薬処方物、脂質ナノ粒子を作製する方法、および、例えば、がんを処置するために脂質ナノ粒子を使用する方法も開示される。

Description

連邦政府の後援を受けた研究に関する言明
本発明は、米国国立保健研究所により供与された、助成金番号第Ｒ０１ ＣＡ１３５２４３号、同第ＤＫ０８８０７６号、および同第ＣＡ１５２９６９号の下にある政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている配列表を含有する。２０１３年５月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、４１８９０−３４９７１ｌ＿ＳＬ．ｔｘｔと称し、３，４０４バイトのサイズである。

本開示は、核酸および関連する化合物を送達するのに使用可能な脂質ナノ粒子について記載する。

関連出願
本出願は、それらの内容が参照により全体において本明細書に組み込まれている、２０１２年５月２３日に出願した米国特許仮出願第６１／６５０，７２９号明細書、および２０１３年３月１４日に出願した米国特許仮出願第６１／７８４，８９２号明細書の優先権を主張するものである。

ｓｉＲＮＡおよび他の治療的オリゴヌクレオチドの送達は、臨床トランスレーションへのそれらの潜在的可能性を制約してきた主要な技術的難題である。

リポソームとは、水性コア内に親水性分子を保有するか、またはその脂質二重層（複数可）内に疎水性分子を保有することが可能な１または複数の脂質二重層からなるベシクルである。脂質ナノ粒子（ＬＮ）とは、サブミクロン範囲の脂質ベースの粒子について記載する一般的な用語である。それらは、リポソームの構造的特徴を有する場合もあり、かつ／または代替的な非二重層型の構造を有する場合もある。全身経路を介するＬＮによる薬物送達は、いくつかの生理学的障壁を乗り越えることを要請する。網内系（ＲＥＳ）は、ＬＮの循環からのクリアランスの一因となりうる。血管系を脱し、標的細胞に到達すると、ＬＮは、エンドサイトーシスにより取り込まれることが典型的であり、酸性のエンドソーム条件下で分解される前に、薬物を細胞質に放出しなければならない。

ＬＮを調製する場合は、ゼータ電位または表面電荷の考慮が必要である。全身送達のためには、ＬＮのゼータ電位は、過度に正となったり、余りに負となったりするべきではないことが典型的である。大きな正の電荷を伴うＬＮは、標的細胞および循環する血漿タンパク質と非特異的に相互作用する傾向があり、細胞傷害作用を引き起こすこともある。あるいは、大きな負の電荷を伴うＬＮは、これもまた負に帯電している核酸を効果的に組み込むことができず、急速なＲＥＳを介するクリアランスを誘発することから、治療有効性を減殺する可能性がある。中性から中程度の電荷を伴うＬＮが、ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物送達および遺伝子送達には最適である。

ＬＮは、従来の治療化合物および核酸ベースの治療を送達するための有望なプラットフォームを構成する。ＬＮを使用して製剤化された薬物は、透過性および滞留の増強（ＥＰＲ）効果に起因する、血液循環時間の延長および充実性腫瘍の部位における蓄積の増大など、ｉｎ ｖｉｖｏにおける優れた薬物動態（ＰＫ）特性を特色としうることが多い。さらに、ＬＮは、ポリエチレングリコールで表面コーティングして、血清タンパク質によるＬＮのオプソニン化、および結果として生じるＲＥＳを介する取込みを低減することができる。ＬＮはまた、細胞特異的リガンドでコーティングして、ターゲティングされた薬物送達をもたらすこともできる。

過去数十年にわたり、核酸ベースの治療についての多大な関心が生じている。核酸ベースの治療は、核酸（ＮＡ）を導入して、遺伝子発現を促進または阻害することを前提として作動する。遺伝子内の突然変異およびｍｉＲＮＡプロファイル内の変化は、がんおよび他の疾患の根底的原因であると考えられるので、核酸ベースの薬剤には、根底的な病因に直接作用し、治療の潜在的可能性を最大化できる可能性がある。核酸ベースの治療のいくつかの例は、それらの各々が、本開示で使用される核酸という用語により包摂される、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）模倣体（または模倣剤）、抗ｍｉＲ／アンタゴｍｉＲ／ｍｉＲ阻害剤、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。核酸ベースの治療の臨床トランスレーションは、その実施において、いくつかの障害に直面している。核酸は比較的不安定であり、血清および細胞ヌクレアーゼによる分解を受けるので、核酸をそれらの細胞内標的に輸送することは、特に困難である。さらに、核酸の大きな負の電荷は、細胞膜を越える輸送を不可能とすることから、有用性が限定される。この問題に取り組むために、ウイルスベクターが開発されているが、大半は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫応答の活性化および宿主ゲノム内の望ましくない突然変異の誘導に起因して失敗している。非ウイルスベクターもまた広範に探索されているが、臨床治療の成功した結果をもたらすものは少数であり、さらなる改善が必要とされている。

従来、カチオン性ＬＮが、遺伝子送達のための非ウイルスベクターとして活用されている。場合によって、カチオン性脂質は、アニオン性脂質で置きかえるか、またはアニオン性脂質と組み合わせて使用する。カチオン性ＬＮの正の電荷は、負に帯電している核酸との静電相互作用を容易とする。アニオン性脂質は、カチオン性脂質と組み合わせることもでき、カチオン性重合体と組み合わせることもでき、これらは、核酸との相互作用を媒介する。これらは、エタノール希釈、凍結−融解、透析濾過、および薄膜水和など、当技術分野で公知の多様な技法により調製することができる。カチオン性成分に加えて、ＬＮは、ホスファチジルコリンなど、二重層を形成するリン脂質成分のほか、コレステロールを含むヘルパー脂質からなることが典型的である。ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などのヘルパー脂質は、二重層相を好まず、代わりに、標的部位における脂質二重層を破壊して、治療剤を放出する一助となる。ＰＥＧ化薬剤であるＤ−アルファトコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネート（ＴＰＧＳ）、またはｍＰＥＧ−ＤＳＰＥなどの安定化成分を添加して、処方物を安定化させ、ＬＮを、ＲＥＳを介する取込みから保護することができる。

米国特許第７，１２２，５２７号明細書 米国特許第７，２０５，２８３号明細書 米国特許第６，７５３，５１４号明細書 米国特許第６，６１３，３０８号明細書 米国特許第５，４６６，４６８号明細書 米国特許第５，５４３，１５８号明細書 米国特許第５，６４１，５１５号明細書 米国特許第５，３９９，３６３号明細書 米国特許第５，７５６，３５３号明細書 米国特許第５，８０４，２１２号明細書 米国特許第５，７２５，８７１号明細書 米国特許第５，７８０，０４５号明細書

Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２００３ "Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ" １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐａｇｅｓ １０３５−１０３８ ａｎｄ １５７０−１５８０ Ｔａｋｅｎａｇａ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．， ３５６ （２００８） ２９−３６

効率的な送達ビヒクルの開発は、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）治療剤の臨床トランスレーションの鍵である。理想的には、脂質ナノ粒子処方物は、（１）薬物を酵素的分解から保護すること；（２）毛細血管内皮を横断すること；（３）免疫原性または標的外の細胞傷害作用を引き起こすことなく標的細胞型に特異的に到達すること；（４）エンドサイトーシスおよびエンドソームの放出を促進すること；ならびに（５）コロイド状の安定性および長期にわたる保管寿命を伴う安定的な処方物を形成し得るべきである。

本明細書では、治療効果のあるオリゴヌクレオチドを効率よく封入し、効果的な送達のための物理的基準および生物学的基準を満たすことが可能な、脂質ナノ粒子が提示される。本発明では、ある種の実施形態は、Ａｋｔ−１に対する、５’ ｇｃｔｇｃａｔｇａｔｃｔｃｃｔｔｇｇｃｇ ３’（配列番号１）を含む配列を有する２０ｍｅｒのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである、ＲＸ−０２０１（Ａｒｃｈｅｘｉｎ（登録商標））、および／または「低酸素誘導因子−１アルファ」（ＨＩＦ−１α）の強力な阻害剤である、５’ ａａｔｇａｇｃｃａｃｃａｇｔｇｔｃｃａａ ３’（配列番号２）を含む配列を有する２０ｍｅｒのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである、ＲＸ−００４７を含有する、脂質ナノ粒子を含む。

特定の実施形態では、前記脂質ナノ粒子は、高カチオン化され、かつ／またはｐＨ応答性である、ＨＳＡ−重合体複合体を含む。ある種の実施形態では、ＨＳＡ−重合体複合体は、ＨＳＡ−ＰＥＨＡを含む。ある種の実施形態では、前記脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子処方物のトランスフェクション効率を向上させるために、高カチオン化されたアルブミン−重合体複合体（ＡＰＣ）を含む。

本明細書では、医薬組成物、脂質でコーティングされたアルブミンナノ粒子を作製する方法、およびがんまたは他の疾患を処置する方法もさらに提示される。

実施形態では、本発明は、重合体に結合した巨大分子とターゲティング剤とを含む脂質ナノ粒子組成物である。実施形態では、前記脂質ナノ粒子組成物はまた、核酸、タンパク質、多糖、脂質、放射性物質、治療剤、プロドラッグ、およびこれらの組合せなどの治療剤も含む。実施形態では、治療剤は、核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、ｐＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはこれらの組合せである。実施形態では、治療剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であって、Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するＡＳＯ；またはＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節するＡＳＯでありうる、ＡＳＯである。

本発明の実施形態はまた、重合体に結合した巨大分子と、Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するＡＳＯ、またはＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節するＡＳＯなどのＡＳＯである治療剤とを含む脂質ナノ粒子組成物も含む。

本発明の実施形態のうちのいずれかでは、重合体は、帯電させることができる、例えば、重合体は、正に帯電させることができる。本発明の実施形態では、巨大分子は、アルブミンを含む。例示的な実施形態では、重合体に結合した巨大分子は、アルブミン−ポリカチオン複合体である。結合は、例えば、架橋剤を介すこともできる。巨大分子または正に帯電した重合体は、例えば、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）、テトラエチレンヘキサミン、およびテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）でありうる。実施形態では、巨大分子は、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）を含み、重合体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。ＰＥＨＡ分子の、ＨＳＡ分子に対する比は、約１１：１でありうる。本発明の脂質ナノ粒子は、２つ以上の低分子量重合体の混合物を含みうる。脂質ナノ粒子は、例えば、約２５：７０：５のＤＯＴＡＰ：ＳＰＣ：ＴＰＧＳのモル比で、ＤＯＴＡＰ、ＳＰＣ、およびＴＰＧＳを含みうる。

ＡＳＯを含む実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ ｇｃｔｇｃａｔｇａｔｃｔｃｃｔｔｇｇｃｇ ３’（配列番号１）を含む配列を有し、ヒトＡｋｔ−１をコードする核酸分子をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節する化合物である。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ ａａｔｇａｇｃｃａｃｃａｇｔｇｔｃｃａａ ３’（配列番号２）を含む配列を有し、ヒトＨＩＦ−１をコードする核酸分子をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節する化合物である。脂質ナノ粒子組成物はまた、融合性ペプチドも含みうる。実施形態では、前記脂質ナノ粒子の粒子サイズは、約３００ｎｍ未満または約１５０ｎｍ未満である。

ターゲティング剤は、直接的な接続を介して、または架橋剤を介して、前記脂質ナノ粒子の外表面だけに結合させることができる。ターゲティング剤は、抗体または抗体断片でありうる。ターゲティング剤はまた、ｃＲＧＤペプチド、ガラクトース含有部分、トランスフェリン、葉酸、低密度リポタンパク質、および上皮成長因子でもありうる。例示的な実施形態では、ターゲティング剤は、ｃＲＧＤｆＣまたは葉酸である。ターゲティング剤は、葉酸−ＰＥＧ−ＣＨＥＭＳ（葉酸−ポリエチレングリコール−コレステリルヘミスクシネート）、葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（葉酸−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、またはｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（シクロ（ＲＧＤｆＣ）−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）などの複合体でありうる。

実施形態では、本発明は、上記で記載した脂質ナノ粒子組成物と、薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物である。医薬組成物は、滅菌溶液または滅菌懸濁液として調製することができる。

他の実施形態では、本発明は、脂質でコーティングされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）を作製する方法であって、ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体を合成するステップと、脂質の混合物を調製するステップと、前記脂質の混合物を、前記ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体に添加するステップと、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を、前記脂質の混合物および前記ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体に添加して、ＬＣＡＮ前駆体を得るステップとを含み、前記ＡＳＯは、Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するＡＳＯ；およびＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節するＡＳＯからなる群から選択される方法である。他の実施形態では、本発明は、脂質でコーティングされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）を作製する方法であって、ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体を合成するステップと、脂質の混合物を調製するステップと、ターゲティング剤および前記脂質の混合物を、前記ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体に添加するステップとを含む方法である。ターゲティング剤は、上記で記載したターゲティング剤のうちのいずれかでありうる。実施形態では、脂質の混合物は、例えば、ＤＯＴＡＰ、ｓｏｙＰＣ、ＴＰＧＳ、およびｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含み、ここで、ＤＯＴＡＰ：ｓｏｙＰＣ：ＴＰＧＳ：ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥのモル比は、約２５：７０：４：１である。他の実施形態では、前記脂質の混合物は、ＤＯＴＡＰ、ＳＰＣ、およびＴＰＧＳを、例えば、約２５：７０：５のモル比で含む。

本発明はまた、有効量の、本明細書で記載される医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することにより、がんまたは感染性疾患を診断または処置する方法でもある。処置されるがんは、例えば、脳腫瘍、膀胱がん、肺がん、乳がん、黒色腫、皮膚がん、表皮癌、結腸直腸がん、非ホジキンリンパ腫、子宮内膜がん、膵臓がん、腎臓（腎細胞）がん、前立腺がん、白血病、甲状腺がん、頭頸部がん、卵巣がん、肝細胞がん、子宮頸がん、肉腫、胃がん、多発性骨髄腫、リンパ腫、および消化器がん、および子宮がんでありうる。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、表皮癌、または膵臓がんである。

好ましい実施形態のさらなる目的および利点のほか、構造および機能は、後続する記載、図面、および非限定的な実施例を検討することにより明らかとなる。
Ｌ−ＲＸ−００４７およびｃＲＧＤ−Ｌ−ＲＸ−００４７で処置したときの、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内のＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ下方調節を例示する図である。 遊離ＲＸ−００４７、Ｌ−ＲＸ−００４７、およびＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７で処置したときの、ＫＢ細胞内のＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ発現を例示する図である。 ＬＣＡＮ−ＲＸ−０２０１で処置したときの、ＫＢ細胞内のＡｋｔ−１ ｍＲＮＡ下方調節を例示する図である。 ＬＣＡＮ−ＲＸ−０２０１で処置したときの、Ｐａｎｃ−１細胞内のＡｋｔ−１ ｍＲＮＡ下方調節を例示する図である。 ｉｎ ｖｉｖｏの、ＫＢ異種移植片腫瘍モデルにおける腫瘍阻害を例示する図である。マウス（群１つ当たり５匹ずつのマウス）に、３ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ、遊離ＲＸ−００４７、Ｌ−ＲＸ−００４７、またはＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７を、３日ごとに４回（Ｑ３Ｄ×４）静脈内注射した。腫瘍寸法は、キャリパーを伴う測定を介して３〜４日ごとに決定した。 ｉｎ ｖｉｖｏの、ＫＢ異種移植片腫瘍モデルにおけるＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ発現を例示する図である。マウス（群１つ当たり５匹ずつのマウス）に、３ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ、遊離ＲＸ−００４７、Ｌ−ＲＸ−００４７、またはＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７を、３日ごとに４回（Ｑ３Ｄ×４）静脈内注射した。ＨＩＦ−１α ｍＲＮＡの腫瘍内発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定した。 ＫＢ異種移植片腫瘍モデルにおいて、ＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７で処置したときの動物生存を例示する図である。マウス（群１つ当たり１０匹ずつのマウス）に、３ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ、遊離ＲＸ−００４７、またはＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７を、３日ごとに４回（Ｑ３Ｄ×４）静脈内注射した。

本明細書では、脂質ナノ粒子の文脈で、多様な実施形態が記載される。当業者は、実施形態の以下の詳細な記載は、例示的であるに過ぎないものであり、いかなる形であれ限定であることを意図するものではないことを理解する。本開示の利益を得る当業者には、他の実施形態も、たやすく示唆される。本明細書の「実施形態」、「態様」、または「実施例」に対する言及は、このように記載された本発明の実施形態は、特定の特色、構造、または特徴を含みうるが、あらゆる実施形態が、特定の特色、構造、または特徴を必ずしも含むものではないことを指し示す。さらに、「一実施形態では」という語句の繰り返しの使用は、その場合もありうるが、同じ実施形態を必ずしも指すわけではない。

明確さのためであるが、本明細書で記載される実施または工程の通例の特色の全てが示され、記載されるわけではない。任意のこのような現実の実施の開発では、適用、治療、および対象に関連する制約への準拠など、特殊な目標を達成するために、当然ながら、多数の実施特異的な決定がなされ、これらの特殊な目標は、１つの実施から別の実施に変化し、１人の使用者から別の使用者に変化することが察知されるであろう。さらに、このような開発の労苦は、複雑でかつ時間のかかるものでありうるが、にもかかわらず、本開示の利益を得る当業者には、ルーチンな作業となることもわかる。

本明細書では、トランスフェクション活性を改善した脂質ナノ粒子（ＬＮ）が提示される。脂質ナノ粒子は、疎水性分子を脂質膜内に分配する場合もあり、かつ／または水溶性の粒子を水性コア内に封入する場合もある。ＬＮ処方物は、単一の脂質を含む場合もあり、脂質の混合物を含む場合もあり、帯電した脂質および中性脂質を一般に含み、ＰＥＧ化脂質および／またはコレステロールをさらに任意選択で含む。本開示のＬＮ処方物は、アルブミン−重合体複合体を含みうる。ある種の実施形態では、脂質ナノ粒子は、高カチオン化されたアルブミン−ポリカチオン複合体（ＡＰＣ）を含む。ＬＮの直径は、３００ｎｍ未満、または約５０ｎｍ〜約２００ｎｍの間であることが典型的でありうる。本発明によるＬＮは、とりわけ、全身投与時に見出される高血清条件下で、トランスフェクションの増強および細胞傷害作用の低減など、１または複数の利点を呈示できる。ＬＮは、広範にわたる現行の治療剤および治療システムに適用可能であり、血清安定性、ターゲティングされた送達、および／またはトランスフェクション効率の向上を呈示できる。

本明細書で使用される「脂質ナノ粒子」という用語は、１または複数の脂質成分により形成される任意のベシクルを指す。本明細書で記載されるＬＮ処方物は、カチオン性脂質を含みうる。カチオン性脂質とは、任意の生理学的ｐＨで正味の正の電荷を保有する脂質である。正の電荷は、静電相互作用を介して、ＡＳＯなどの負に帯電した治療剤と会合させるために使用される。適切なカチオン性脂質は、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド塩（ＤＤＡＢ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンクロリド（ＤＬ−ＥＰＣ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＭＡ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；カチオン性修飾基に結合された中性脂質；およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。加えて、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ製）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ／ＭＲＬ製）、ｓｉＰＯＲＴ ＮＥＯＦＸ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）など、市販される調製物中の多数のカチオン性脂質も使用できるであろう。本発明ではまた、当技術分野で公知であるかまたはその後開発された他のカチオン性脂質も使用することができる。当業者は、多くのさらなるカチオン性脂質が、本発明のＬＮ処方物への組入れに適することを認識するであろう。本開示のカチオン性脂質は、処方物中の脂質のうちの約０から約６０．０モルパーセント、または処方物中の脂質のうちの約５．０から約５０．０モルパーセントの範囲の濃度で存在させることができる。本明細書で使用される「処方物」とは、脂質でコーティングされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）であって、本明細書で同定される、脂質ナノ粒子およびカチオン化されたアルブミン−重合体複合体であり、核酸を含有する脂質ナノ粒子および複合体を含むＬＣＡＮを指す。処方物はまた、存在する場合、ターゲティング剤も含む。

本明細書で開示されるＬＮ処方物は、アニオン性脂質を含みうる。アニオン性脂質とは、生理学的ｐＨで正味の負の電荷を保有する脂質である。これらの脂質は、カチオン性脂質と組み合わされると、ＬＮの全体的な表面電荷を低減し、ＬＮ二重層構造のｐＨ依存的な破壊を導入し、酸性のｐＨで非層状相を誘導することにより、ヌクレオチド放出を容易とするか、または細胞膜との融合を誘導するのに使用される。適切なアニオン性脂質の例は、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸などの脂肪酸；コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）；１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ジエーテルＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ナトリウム塩）；１−ヘキサデカノイル−２−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカジエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）；ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）；および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）；中性脂質に結合されたアニオン性修飾基；ならびにこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。本発明ではまた、当技術分野で公知であるかまたはその後開発された他のアニオン性脂質も使用することができる。本開示のアニオン性脂質は、処方物のうちの約０から約６０．０モルパーセント、または処方物のうちの約５．０から約２５．０モルパーセントの範囲の濃度で存在させる。

帯電したＬＮは、トランスフェクションに有利であるが、細胞傷害作用など、標的外の作用およびＲＥＳを介する取込みが生じうる。細胞傷害作用および／またはＲＥＳを介する取込みを和らげるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性分子を脂質アンカーに結合し、本明細書で記載されるＬＮに組み入れて、ＬＮ凝集または膜との相互作用を抑える。親水性重合体は、脂質成分に共有結合的に結合させることもでき、架橋剤を使用して、アミンなどの官能基に結合することもできる。結合および親水性重合体複合体に適する親水性重合体は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）；ポリソルベート８０；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）；Ｄ−アルファ−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネート（ＴＰＧＳ）；ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２０００）；およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００）を含むがこれらに限定されない。本発明ではまた、当技術分野で公知であるかまたはその後開発された他の親水性重合体および複合体も使用することができる。親水性重合体は、処方物のうちの約０から約１５．０モルパーセント、または処方物のうちの約５．０から約１０．０モルパーセントの範囲の濃度で存在させることができる。ＰＥＧなど、使用される親水性重合体の分子量は、約１００から約１０，０００Ｄａ、約１００から約５，０００Ｄａ、または約１００から約２，０００Ｄａでありうる。

本明細書で記載されるＬＮは、中性脂質および／または両親媒性脂質も、ヘルパー脂質としてさらに含みうる。これらの脂質は、処方物を安定化させるか、ｉｎ ｖｉｖｏにおける排出を低減するか、またはトランスフェクション効率を向上させるのに使用される。ＬＮは、グルコース、ソルビトール、スクロース、マルトース、トレハロース、ラクトース、セルビオース、ラフィノース、マルトトリオース、デキストラン、またはこれらの組合せなどであるがこれらに限定されない糖溶液中に製剤化して、凍結乾燥安定性および低温安定性を促進することができる。

生理学的ｐＨにおける中性脂質の正味の電荷はゼロである。いくつかの中性脂質のうちの１つまたは組合せを、任意の本明細書で開示されるＬＮ処方物に組み入れることができる。適切な中性脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、セラミド、セレブロシド、プロスタグラジン、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、ジアシルグリセロール、グリコシル化されたジアシルグリセロール、プレノール、リソソームＰＬＡ２基質、Ｎ−アシルグリシン、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。

他の適する脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、およびリゾホスファチジルエタノールアミン；コレステロール、デモステロール、シトステロール、チモステロール、ジオスゲニン、ラノステロール、スティグマステロール、ラトステロール、およびデヒドロエピアンドロステロンなどのステロール；ならびにスフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド、グリコスフィンゴ脂質、ホスホスフィンゴ脂質、フィトスフィンゴシンなどのスフィンゴ脂質；およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。

本明細書で記載されるＬＮ処方物は、膜融合を促進する融合性脂質または融合性コーティングもさらに含みうる。適切な融合性脂質の例は、グリセリルモノオレエート、オレイン酸、パルミトレイン酸、ホスファチジン酸、ホスホイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。本発明ではまた、当技術分野で公知であるかまたはその後開発された他の融合性脂質も使用することができる。

本明細書で記載されるＬＮ処方物は、カチオン性重合体またはカチオン性重合体の複合体もさらに含みうる。カチオン性重合体またはその複合体は、単独で使用することもでき、脂質ナノキャリアーと組み合わせて使用することもできる。適切なカチオン性重合体は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）；スペルミン；スペルミジン；ポリ（Ｌ−リシン）；ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー；ポリプロピレンイミンデンドリマー；ポリ（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）；キトサン；トリス（２−アミノエチル）アミン、およびそのメチル化誘導体；ならびにこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。本発明ではまた、当技術分野で公知であるかまたはその後開発された他のカチオン性重合体または複合体も使用することができる。鎖長および分枝は、重合体による送達系を実施するための検討事項である。約２５，０００の分子量を有するＰＥＩなどの高分子量重合体は、トランスフェクション剤として使用されるが、細胞傷害作用が不都合である。約６００の分子量を有するＰＥＩなどの低分子量重合体は、細胞傷害作用を引き起こす可能性はないが、核酸との安定的な縮合を容易とすることができないことに起因して使用が制限されうる。したがって、低分子量重合体の、アルブミンなど大型粒子への結合は、処方物中の細胞傷害作用を低下させながら、核酸縮合の活性を増大させる有用な方法である。

アニオン性重合体もまた、本明細書で開示されるＬＮ処方物に組み込むことができる。適切なアニオン性重合体は、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）；ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）；アルギネート；デキストラン；キサンタン；誘導体化された重合体；およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。本発明ではまた、当技術分野で公知であるかまたはその後開発された他のアニオン性重合体も使用することができる。

ある種の実施形態では、ＬＮ処方物は、重合体の複合体を含む。複合体は、全体的な治療有効性を増大させる、ターゲティング剤、親油性部分、ペプチド、タンパク質、または他の分子に架橋することができる。適切な架橋剤は、Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオネート（ＳＰＤＰ）；ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）；ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）；ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）；１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）；Ｎ’−Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）；Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’スルホネート（Ｗｏｏｄｗａｒｄ製の試薬Ｋ）；およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。

当技術分野で公知の方法を含む、ＬＮの多様な調製法は、本開示のＬＮを合成するのに適する。例えば、エタノール希釈、凍結−融解、薄膜水和、超音波処理、射出、高圧力ホモジナイゼーション、洗浄剤透析、顕微溶液化、接線流透析濾過、滅菌濾過、および／または凍結乾燥を活用することができる。加えて、いくつかの方法を援用して、ＬＮのサイズを減少させることもできる。例えば、Ａｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ５など、脂質ホモジナイゼーションに適する任意のデバイス上で、ホモジナイゼーションを実行することができる。ホモジナイズされたＬＮは、拡張されたホモジナイゼーションのための循環にリサイクルすることができる。適切な小孔サイズ（０．０５から０．２μｍ）のポリカーボネート膜を使用して、Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ射出器上で、射出を実行することができる。複数の粒子サイズ低減サイクルを実行して、試料内のサイズ変動を最小化し、所望のサイズを達成することができる。次いで、結果として得られるＬＮは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ内を流過させて過剰な試薬を除去することもでき、接線流透析濾過で処理することもできる。

本明細書で記載されるＬＮの任意の実施形態は、ＬＮ懸濁液中に、エタノールをさらに含みうる。ＬＮ処方物中に約１０〜４０％エタノールを組み込むことにより、脂質二重層を透過化する。脂質二重層の破壊は、ＡＳＯおよびｓｉＲＮＡなど、帯電部分との縮合の一助となる。このようにして調製されたＬＮは、投与前に希釈して、エタノールの存在に起因する細胞膜溶解の効果を低減する。あるいは、エタノールは、透析および透析濾過により除去することができ、これにより、封入されなかった核酸もまた除去される。

ＬＮは、滅菌処理することができる。これは、例えば、前濾過を伴うかまたは伴わずに、ＬＮに０．２または０．２２μｍ滅菌フィルター内を流過させることにより達成することができる。

ＬＮの物理的特徴付けは、多くの方法により実行することができる。動的光散乱（ＤＬＳ）または原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して、平均直径およびその標準偏差を決定することができる。ＬＮは２００ｎｍ未満の直径に収まることが理想的である。ゼータ電位計によるゼータ電位測定は、粒子の相対的安定性を決定するのに有用である。動的光散乱解析およびゼータ電位解析いずれも、脱塩水中または適切な緩衝溶液中の希釈試料に対して実行することができる。極低温透過電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）および走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して、ＬＮの詳細な形態を決定することができる。

本明細書で記載されるＬＮは、数カ月間にわたる冷凍下で安定的である。合成と投与との間に長期間を要請するＬＮは、標準的な手順を使用して凍結乾燥させることができる。凍結させる前に、１０％スクロースなどの凍結保護剤をＬＮ懸濁液に添加して、処方物の完全性を維持することができる。長期にわたる安定性のためには、凍結乾燥させてロードされたＬＮ処方物が推奨される。

ＡＰＣ
カチオン性脂質に加えて、カチオン性重合体も核酸送達系に有用である。単独のトランスフェクション剤としてのカチオン性重合体、およびＬＮと併せたカチオン性重合体の活用は、トランスフェクション効率に利益をもたらすことが多い。最もよく特徴付けられた重合体のトランスフェクション剤は、本明細書ではＰＥＩ２５Ｋと称する、分子量約２５ｋＤａの大型重合体である、高分子量ポリエチレンイミンである。ＰＥＩ２５Ｋは、ｐＤＮＡの細胞への送達において大きな成功を収めているが、細胞傷害作用によりその使用が制約されている。毒性がより小さい、約６００Ｄａの分子量を有する低分子量ＰＥＩもまた探索されているが、これは、核酸を縮合および送達する能力の減殺を示している。これに従い、本明細書では、高カチオン化されたアルブミン−重合体複合体（ＡＰＣ）が提示される。ＡＰＣは、ｐＤＮＡなどの薬剤を送達するのに単独で使用することもでき、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯなどの薬剤を送達するのに脂質ベースの処方物と組み合わせて使用することもできる。アルブミンもまた、その疎水性コアであって、コンフォメーショナル変化すると露出され、二重層破壊または膜融合を誘導できる、疎水性コアに起因するエンドソーム溶解活性を保有する。アルブミン−ＰＥＩ６００複合体は、ｐＨ変化に応答性のイオン化プロファイルを有する。エンドソームのｐＨでは、電荷密度が増大する。

一実施形態では、ＡＰＣをカチオン性脂質と組み合わせて、カチオン性脂質−ＡＰＣ−核酸ナノ粒子を構築する。別の実施形態では、ＡＰＣを、アニオン性脂質と組み合わせて、脂質−ＡＰＣ−核酸ナノ粒子を構築する。ある種の実施形態では、脂質ナノ粒子は、高カチオン化されたアルブミン−ポリカチオン複合体を含む。これらの脂質ナノ粒子は、さらなる細胞傷害作用を伴わずに、高いトランスフェクション効率を有する。

別の実施形態では、低分子量ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）を、架橋剤を介してヒト血清アルブミンに結合する結果として、本明細書ではまたＨＳＡ−ＰＥＨＡとも称する、高カチオン化されたｐＨ応答性ＡＰＣをもたらす。ＨＳＡ−ＰＥＨＡでは、ＰＥＨＡ対ＨＳＡ比は、１〜３０、好ましくは５〜２０、なおより好ましくは８〜１５の間、なおより好ましくは１０〜１２の間である。ナノ粒子に組み込まれたとき、結果として生じる、脂質ナノ粒子と、組み込まれた、ＨＳＡ−ＰＥＨＡなどの高カチオン化されたｐＨ応答性複合体とを含む処方物を、本明細書では脂質でコーティングされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）と称する。例示的なＬＣＡＮは、ＤＯＴＡＰ／ｓＰＣ／ＴＰＧＳ／ＨＳＡ−ＰＥＨＡからなる、脂質でコーティングされたアルブミンナノ粒子である。

ＬＣＡＮは、とりわけ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｐＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲ、および抗ｍｉＲなどのＮＡを送達するのに有用である。理論に束縛されることを望まないが、ＨＳＡ−ＰＥＨＡは、ナノ粒子の安定性および生物学的活性を改善すると考えられる。ある種の実施形態では、この処方物中の脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＳＰＣ、およびＴＰＧＳである。いくつかの実施形態では、ＤＯＴＡＰ：ＳＰＣ：ＴＰＧＳの比は、約２５：７０：５（ｍ／ｍ）である。例示的な実施形態では、全脂質対ＨＳＡ−ＰＥＨＡの重量比は、２０〜１の間、例えば、１５〜２の間、または１２．５〜２．５の間である。

ターゲティング剤
ターゲティング剤のＬＮへの添加は、受動的ターゲティング法を凌ぐ有効性の増大をもたらすことがある。ターゲティングは、リガンドもしくは抗体、細胞表面受容体、ペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ホルモン、ビタミン、抗体、抗体断片、プロドラッグ、および複合体、またはこれらの部分の組合せなどであるがこれらに限定されない、特異的なターゲティング部分の組込みを伴う。ターゲティング剤のいくつかの非限定的な例は、葉酸、ｃＲＧＤ（例えば、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）（ＲＧＤｆＣ））ペプチド、ガラクトース含有部分、トランスフェリン、ＥＰＰＴ１ペプチド、低密度リポタンパク質、上皮成長因子、および抗体を含む。ｃＲＧＤとは、ｃＲＧＤペプチドの任意の誘導体を指す場合もあり、ｃＲＧＤと関連する任意のペプチド、例えば、ｃＲＧＤｆＣ、ｃＲＧＤｆＫ、ｃＲＧＤｆＥなどを指す場合もある。例示的な実施形態では、ｃＲＧＤペプチドは、ｃＲＧＤｆＣ（シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ））である。いくつかの実施形態では、ターゲティング効率の最大化は、ＬＮを、ターゲティング剤を封入するのではなく、適切なターゲティング部分で表面コーティングすることにより達成することができる。この方法は、ＬＮの細胞表面受容体との相互作用を最適化できる。ターゲティング剤は、合成時にＬＮに直接組み込むこともでき、後続のステップで添加することもできる。ターゲティング部分上の官能基のほか、治療適用の仕様（例えば、分解可能な連結）は、ＬＮへの組込みの適切な手段を決定する一助となりうる。親油性領域を有さないターゲティング部分は、ＬＮの脂質二重層に直接に簡単には挿入することができず、挿入する前の脂質への事前の結合を必要とする場合もあり、ＬＮとの静電複合体を形成させる場合もある。ある種の状況下で、ターゲティングリガンドは、親油性アンカーへの直接的結合が可能でない場合もある。これらの状況では、架橋剤の形態の分子架橋を活用して、相互作用を容易とすることができる。アンカーされたターゲティング部分の立体障害が、意図される生理学的標的との十分な相互作用を妨げる状況下では、架橋剤は有用でありうる。加えて、ターゲティング部分が、ある種の方向付けの下でのみ機能的な場合（例えば、モノクローナル抗体）は、架橋剤を介する脂質アンカーへの連結も有益でありうる。生体共役反応（bioconjugation）の従来の方法を使用して、ターゲティング剤をＬＮに連結することができる。還元可能な連結または加水分解可能な連結を適用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおける処方物の蓄積および後続の細胞傷害作用を防止することができる。

本出願の例示的な実施形態では、ＲＧＤ（またはｃＲＧＤ）ターゲティング剤または葉酸ターゲティング剤は、ターゲティング複合体、例えば、葉酸−ＰＥＧ−ＣＨＥＭＳ（葉酸−ポリエチレングリコール−コレステリルヘミスクシネート）または葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（葉酸−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）またはｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（シクロ（ＲＧＤｆＣ）−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）として組み込む。いくつかのターゲティング複合体では、最小で５モル％の複合体は、ターゲティング剤を含有する。いくつかの実施形態では、複合体は、少なくとも約５０モル％、少なくとも約８０モル％、少なくとも約９０モル％、または少なくとも約９５モル％のターゲティング剤を含む。他の例示的な実施形態では、複合体は、約５０モル％、約８０モル％、約９０モル％、または約９５モル％のターゲティング剤を含む。例示的な実施形態では、全脂質中のターゲティング複合体のモルパーセントは、約０．０５から２０モル％、例えば、約０．５から５モル％である。

治療剤
広範な治療剤または診断剤を、本明細書で記載されるＬＮと共に使用することができる。このような治療剤および診断剤の非限定的な例は、核酸、タンパク質、多糖、脂質、放射性物質、治療剤、プロドラッグ、およびこれらの組合せを含む。治療剤は、抗新生物剤、抗感染剤、局部麻酔剤、抗アレルギー剤、抗貧血剤、血管新生阻害剤、ベータ−アドレナリン受容体遮断剤、カルシウムチャネルアンタゴニスト、血圧降下剤、抗うつ剤、抗けいれん剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗リウマチ剤、駆虫剤、抗寄生虫剤、コルチコステロイド、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、免疫調節剤、神経伝達物質アンタゴニスト、抗糖尿病剤、抗てんかん剤、止血剤、抗高張剤、抗緑内障剤、免疫調節性サイトカイン、鎮静剤、ケモカイン、ビタミン、毒素、麻薬、造影剤、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。

核酸ベースの治療剤は、本開示のＬＮ処方物に高度に適用可能である。このような核酸ベースの治療剤の例は、ｐＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。治療剤を血清ヌクレアーゼから保護し、治療剤を安定化させるために、核酸の置換基および／またはホスホジエステルリンカーの修飾を行うことができる。このような修飾は、骨格修飾（例えば、ホスホチオエート結合）；２’修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル置換された塩基）；両性イオン修飾（６’−アミノヘキシ修飾されたＯＤＮ）；親油性部分の添加（例えば、脂肪酸、コレステロール、またはコレステロール誘導体）；およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。

本発明の例示的な実施形態では、治療剤は、Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するＡＳＯである。オリゴヌクレオチド化合物は、Ａｋｔ−１をコードする１または複数の核酸と特異的にハイブリダイズするようにデザインする。このようなＡＳＯは、それらの内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている、特許文献１において開示されている。１つの例示的なＡＳＯであり、２０ｍｅｒのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであるＲＸ−０２０１（Ａｒｃｈｅｘｉｎ（登録商標））は、Ａｋｔ−１遺伝子の部位１，４７８における以下の配列：５’ ｃｇｃｃａａｇｇａｇａｔｃａｔｇｃａｇｃ ３（配列番号３）’を有するＡｋｔ−１遺伝子のコード領域内の部位をターゲティングする。ＲＸ−０２０１の骨格の配列は、この部位と相補的である。

別のＡＳＯであるＲＸ−０１９４は、Ａｋｔ−１遺伝子の部位１，２７１における以下の配列：５’ ａｇｔｇｇａｃｔｇｇｔｇｇｇｇｇｃｔｇｇ ３’（配列番号４）を有するＡｋｔ−１遺伝子上の部位をターゲティングする。ＲＸ−０１９４の骨格の配列は、この部位と相補的である。ＲＸ−０１９４のうちの２０ｍｅｒが由来する配列から上流および下流の５または１０ヌクレオチドを含むオリゴマーは、Ａｋｔ−１ ｍＲＮＡ発現の測定可能な阻害を示した。ＲＸ−０１９４およびＲＸ−０２０１の切断形はまた、がん細胞増殖の阻害も示した。上記の２つのＡＳＯに加えて、Ａｋｔ−１ ｍＲＮＡ発現を下方調節し、がん細胞系に細胞傷害効果を及ぼす、５つのさらなるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、
以下の配列：５’ ｃｔｇｔｃｔｇｔｃａｃｃａｇｃｔａｔｃｔ ３’（配列番号６）を有するＡｋｔ−１遺伝子の２１０１位で始まる部位とハイブリダイズ可能な５’ ａｇａｔａｇｃｔｇｇｔｇａｃａｇａｃａｇ ３’（配列番号５）を含むＲＸ−０６１６；
以下の配列：５’ ｃｃｔｃａｇａｔｇａｔｃｔｃｔｃｃａｃｇ ３’（配列番号８）を有するＡｋｔ−１遺伝子の２４７３位で始まる部位とハイブリダイズ可能な５’ ｃｇｔｇｇａｇａｇａｔｃａｔｃｔｇａｇｇ ３’（配列番号７）を含むＲＸ−０６２７；
以下の配列：５’ ｇｔａｇｃａｃｔｔｇａｃｃｔｔｔｔｃｇａ ３’（配列番号１０）を有するＡｋｔ−１遺伝子の２４９３位で始まる部位とハイブリダイズ可能な５’ ｔｃｇａａａａｇｇｔｃａａｇｔｇｃｔａｃ ３’（配列番号９）を含むＲＸ−０６２８；
以下の配列：５’ ｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃａｃｃａ ３’（配列番号１２）を有するＡｋｔ−１遺伝子の２６０３位で始まる部位とハイブリダイズ可能な５’ ｔｇｇｔｇｃａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｇ ３’（配列番号１１）を含むＲＸ−０６３２；および
以下の配列：５’ ｇｃｔａｇｇｃｃｃｇｃｇｃｔｃｇｃｇｃｃ ３’（配列番号１３）を有するＡｋｔ−１遺伝子の１７０位で始まる部位とハイブリダイズ可能な５’ ｇｇｃｇｃｇａｇｃｇｃｇｇｇｃｃｔａｇｃ ３’（配列番号２）を含むＲＸ−０６３８
を含む。

他の実施形態では、治療剤は、ＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節するＡＳＯである。オリゴヌクレオチド化合物は、ＨＩＦ−１をコードする１または複数の核酸と特異的にハイブリダイズするようにデザインする。このようなＡＳＯは、それらの内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている特許文献２において開示されている。例示的なＡＳＯであり、２０ｍｅｒのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、５’ ａａｔｇａｇｃｃａｃｃａｇｔｇｔｃｃａａ ３’（配列番号２）を含むＲＸ−００４７は、「低酸素誘導因子１アルファ」（ＨＩＦ−１α）の強力な阻害剤であり、ＨＩＦ−１遺伝子の部位２，７７２における以下の配列：５’ ｔｔｇｇａｃａｃｔｇｇｔｇｇｃｔｃａｔｔ ３’（配列番号１４）を有するＨＩＦ−１遺伝子上の部位をターゲティングする。ＲＸ−００４７の骨格の配列は、この部位と相補的である。本実施形態による別の例示的なＡＳＯであり、５’ ｇｇａｇｃｔａａｃａｔｃｔｃｃａａｇｔｃ ３’（配列番号１５）を含むＲＸ−０１４９は、ＨＩＦ−１遺伝子の部位１，９３６における以下の配列：５’ ｇａｃｔｔｇｇａｇａｔｇｔｔａｇｃｔｃｃ ３’（配列番号１６）を有するＨＩＦ−１遺伝子のコード領域内の部位をターゲティングする。ＲＸ−０１４９の骨格の配列は、この部位と相補的である。ＲＸ−００４７およびＲＸ−０１４９のうちの２０ｍｅｒが由来する配列から上流および下流の５または１０ヌクレオチドを含むオリゴマーは、ＨＩＦ−１ ｍＲＮＡ発現の測定可能な阻害およびがん細胞の増殖の阻害を示した。ＨＩＦ−１ ｍＲＮＡ発現のある程度の阻害を示したＲＸ−００４７およびＲＸ−０１４９の切断形はまた、がん細胞増殖の阻害も示した。

本発明は、オリゴヌクレオチド模倣剤を含むがこれらに限定されない、他のオリゴマーによるアンチセンス化合物も含む。アンチセンス化合物は、約１０から約３０ヌクレオ塩基、例えば、約２０ヌクレオ塩基（すなわち、約２０の連結されたヌクレオシド）を有するオリゴヌクレオチドを含みうる。当技術分野で公知である通り、ヌクレオシドとは、塩基−糖組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は通常、ヘテロ環塩基である。このようなヘテロ環塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドとは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合的に連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’ヒドロキシル部分、３’ヒドロキシル部分、または５’ヒドロキシル部分に連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成するとき、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いと共有結合的に連結して、直鎖状の重合体化合物を形成する。次は、この直鎖状の重合体構造のそれぞれの末端をさらに接合して環構造も形成できるが、開放された直鎖状の構造が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると一般に言及される。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な連結または骨格は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。

本発明のアンチセンス化合物は、ヒトを含む動物に投与されると、生物学的に活性の代謝物またはその残留物をもたらす（直接的にまたは間接的に）ことが可能な任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、または任意の他の化合物を包摂する。したがって、例えば、本開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的同等物へも引き寄せられる。

適用
適用に応じて、本明細書で開示される脂質ナノ粒子は、核酸との相互作用の増大、血清安定性の増大、ＲＥＳを介する取込みの低下、ターゲティングされた送達、またはエンドソーム内のｐＨ感受性の放出などの特徴に好適となるようにデザインすることができる。ＬＮ処方物の多様な性格のために、本明細書で提示されるいくつかの方法のうちのいずれか１つを適用して、特定の治療目的を達成することができる。カチオン性脂質、アニオン性脂質、ＰＥＧ−脂質、中性脂質、融合性脂質、カチオン性重合体、アニオン性重合体、重合体複合体、ペプチド、ターゲティング部分、およびこれらの組合せを適用して、特殊な目的を達することができる。

本明細書で記載される脂質ナノ粒子は、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などのオリゴヌクレオチド（ＯＮ）治療剤の治療的送達のためのプラットフォームとして使用することができる。この治療剤を使用して、多様な種類のがん、白血病、ウイルス感染、および他の疾患など、多種多様な疾患を管理できるであろう。本発明により処置可能な特定の疾患は、当然ながら、本発明のＬＮに組み込まれる治療剤に依存する。本発明は特に、核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの封入に適する。核酸、および、特に、アンチセンスヌクレオチドはとりわけ、腫瘍およびがんを処置するのに有用である。本発明により処置可能な腫瘍およびがんの例は、例えば、脳腫瘍、膀胱がん、肺がん、乳がん、黒色腫、皮膚がん、表皮癌、結腸直腸がん、非ホジキンリンパ腫、子宮内膜がん、膵臓がん、腎臓（腎細胞）がん、前立腺がん、白血病、甲状腺がん、頭頸部がん、卵巣がん、肝細胞がん、子宮頸がん、肉腫、胃がん、多発性骨髄腫、リンパ腫、および消化器がん、および子宮がんを含む。具体例は、表皮癌、膵臓がん、および乳がんを含む。

多数の腫瘍は、それらの細胞表面上の受容体を過剰発現させる。ｃＲＧＤペプチド、葉酸、トランスフェリン（Ｔｆ）、抗体低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および上皮成長因子などのターゲティング部分は、ターゲティングされた薬物送達を可能とすることにより、活性を大幅に増強することができる。多重ターゲティング系は、別の可能性であり、特定の標的細胞亜型を特定するのにさらに適用することができる。

本明細書で記載されるＬＮ処方物の、単独または互いと組み合わせた実施形態の実施は、脂質ナノ粒子デザインの現行のパラダイムと相乗作用する。

治療適用に応じて、本明細書で記載されるＬＮは、以下の方法：経口送達、非経口送達、静脈内送達、筋内送達、皮下送達、腹腔内送達、経皮送達、腫瘍内送達、動脈内送達、全身送達、または対流増強送達により投与することができる。特定の実施形態では、ＬＮは、静脈内送達、筋内送達、皮下送達、または腫瘍内送達される。異なるＬＮまたは類似のＬＮによる後続の投薬は、代替的な投与経路を使用して行うことができる。

本開示の医薬組成物は、薬学的に許容されるキャリアー中に溶存または分散させた、本明細書で開示される、有効量の脂質ナノ粒子処方物および／またはさらなる薬剤を含む。「医薬の」または「薬理学的に許容される」という語句は、例えば、ヒトなど、動物に投与されると、有害反応、アレルギー性反応、または他の望ましくない反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１により例示される通り、当業者には、少なくとも１つの化合物またはさらなる有効成分を含有する医薬組成物の調製は、本開示に照らして公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与では、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要請される無菌性基準、発熱性基準、一般的な安全性基準、および純度基準を満たすべきことが理解されるであろう。

本明細書で開示される組成物は、固体形態、液体形態、またはエアゾール形態で投与すべきであるのかどうか、および注射などの投与経路のために滅菌を必要とするのかどうかに応じて、異なる種類のキャリアーを含みうる。本明細書で開示される組成物は、当業者に公知である通り、吸入（例えば、エアゾール吸入）を介して、注射により、注入により、持続注入により、標的細胞を直接液浴させる局在化された潅流により、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームにより、脂質組成物（例えば、リポソーム）により、もしくは他の方法により、または前出の任意の組合せにより、静脈内投与、皮内投与、経皮投与、髄腔内投与、動脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、膣内投与、経直腸投与、局所投与、筋内投与、皮下投与、粘膜投与、子宮内投与、経口投与、局所投与、局部投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１を参照されたい）。

動物またはヒト患者に投与される、本明細書で開示される組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、処置される疾患の種類、既往の治療的介入または共時的な治療的介入、患者の特発性疾患、および投与経路などの物理的因子および生理学的因子により決定することができる。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および／または有効量の投与回数は、対象の応答に従い変化させることができる。いずれにせよ、投与の責任を担う医療従事者は、組成物中の有効成分（複数可）の濃度、および個々の対象に適する用量（複数可）を決定することになる。

ある種の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含みうる。他の実施形態では、活性化合物は、単位の重量の約２％から約７５％の間、または、例えば、約２５％から約６０％の間、およびそこにおいて導出される任意の範囲を含みうる。当然ながら、各治療的に有用な組成物中の活性化合物（複数可）の量は、任意の所与の単位用量の化合物中に適切な投与量が得られるように調製できる。可溶性、生体利用性、生物学的半減期、投与経路、製品保管寿命のほか、他の薬理学的検討事項などの因子を、このような医薬処方物の調製についての当業者は想定するであろうし、そのようなものとして、様々な投与量および処置計画が望まれうる。

他の非限定的な例では、用量はまた、投与１回当たりに体重１ｋｇ当たり約１マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約５マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約１０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約５０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約１００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約２００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約５００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約１ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約５ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約１０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約５０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約１００ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約２００ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約５００ミリグラムから体重１ｋｇ当たり約１０００ｍｇ以上、およびそこにおいて導出される任意の範囲も含みうる。本明細書で列挙される数から導出可能な範囲の非限定的な例では、上記で記載した数に基づき、体重１ｋｇ当たり約５ｍｇから体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５マイクログラムから体重１ｋｇ当たり約５００ミリグラムなどの範囲を投与することができる。

ある種の実施形態では、本明細書の組成物および／またはさらなる薬剤は、消化経路を介して投与されるように製剤化する。消化経路は、組成物を消化管と直接的に接触させる全ての可能な投与経路を含む。具体的には、本明細書で開示される医薬組成物は、経口投与、口腔内投与、経直腸投与、または舌下投与することができる。これらの組成物はそれ自体、不活性の賦形剤と共に製剤化することもでき、同化可能な可食性キャリアーと共に製剤化することもできる。

さらなる実施形態では、本明細書で記載される組成物は、非経口経路を介して投与することができる。本明細書で使用される「非経口」という用語は、消化管を迂回する経路を含む。具体的には、本明細書で開示される医薬組成物は、例えば、静脈内投与、皮内投与、筋内投与、動脈内投与、髄腔内投与、皮下投与、または腹腔内投与することができるがこれらに限定されない（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、および特許文献８は、各々が参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる）。

遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての本明細書で開示される組成物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液もまた、グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中、およびこれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止する保存剤を含有する。注射使用に適する医薬形態は、滅菌注射溶液または滅菌注射分散液を即席で調製するための滅菌水溶液または滅菌分散液および滅菌粉末を含む（参照によりその全体において本明細書に具体的に組み込まれる、特許文献５）。いずれの場合にも、形態は、滅菌されてなければならず、容易な注射可能性が存在する程度の流体でなければならない。それは、製造および保管の条件下で安定的でなければならず、細菌および真菌など、微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（すなわち、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適する混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合には要請される粒子サイズを維持することにより、かつ、界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの多様な抗菌剤および抗真菌剤により施すことができる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましかろう。注射可能組成物の吸収の延長は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなど、吸収を遅延させる薬剤を組成物中で使用することによりもたらすことができる。

水溶液による非経口投与のためには、例えば、必要な場合、溶液は適切に緩衝処理し、液体賦形剤はまず、十分な生理食塩液またはグルコースで等張性とすべきである。これらの特定の水溶液はとりわけ、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適する。当業者には、本開示に照らして、この関連で援用できる滅菌水性媒体が公知であろう。例えば、１回分の投与量を、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶存させ、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加することもでき、提起される注入の部位に注射することもできる（例えば、非特許文献２を参照されたい）。投与量のある程度の変動は、処置される対象の状態に応じて必然的に生じる。いずれにせよ、投与の責任を担う人員は、個々の対象に適する用量を決定することになる。さらに、ヒト投与では、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要請される無菌性基準、発熱性基準、一般的な安全性基準、および純度基準を満たすべきである。

滅菌注射溶液は、要請される量の組成物を、適切な溶媒中に、上記で列挙した多様な他の成分と共に、要請に応じて組み込んだ後、濾過滅菌を行うことにより調製する。一般に、分散液は、多様な滅菌処理された組成物を、基本分散媒および上記で列挙したものに由来する、要請される他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、いくつかの調製法は、そのあらかじめ滅菌濾過された溶液に由来する、有効成分に任意のさらなる所望の成分を加えた粉末をもたらす、真空乾燥法および凍結乾燥法である。粉末化された組成物を、例えば、安定化剤を伴うかまたは伴わない水または生理食塩溶液などの液体キャリアーと組み合わせる。

他の実施形態では、組成物は、多種多様な経路を介する投与、例えば、局所（すなわち、経皮）投与、粘膜投与（鼻腔内投与、膣内投与など）、および／または吸入を介する投与のために製剤化することができる。

局所投与のための医薬組成物は、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、または散剤などの薬用適用のために製剤化された組成物を含みうる。軟膏剤は、局所適用のための全ての油性、吸収、エマルジョン、および水溶性ベースの組成物を含むが、クリーム剤およびローション剤は、エマルジョン基剤だけを含む組成物である。局所投与される医薬は、皮膚を介する有効成分の吸収を容易とする透過増強剤を含有することもできる。適切な透過増強剤は、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、およびラウロカプラムを含む。局所適用のための組成物に可能な基剤は、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、およびワセリンのほか、任意の他の適する吸収基剤、エマルジョン基剤、または水溶性軟膏基剤を含む。局所調製物はまた、組成物を保護し、均一の混合物を提供するために、必要に応じて、乳化剤、ゲル化剤、および抗微生物保存剤も含みうる。組成物の経皮投与はまた、「貼付剤」の使用も含みうる。例えば、貼付剤は、１または複数の組成物を、所定の速度および持続的な様式で、一定の時間にわたり供給する。

ある種の実施形態では、組成物を、点眼液、鼻腔内スプレー剤、吸入送達ビヒクル、および／または他のエアゾール送達ビヒクルにより送達することができる。組成物を、経鼻エアゾールスプレー剤を介して、肺に直接送達するための方法は、特許文献９および特許文献１０（各々が参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる）において記載されている。同様に、薬学技術分野では、鼻腔内マイクロ粒子樹脂（非特許文献３）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（参照によりその全体において本明細書に具体的に組み込まれる特許文献１１）を使用する薬物の送達もまた周知であり、本明細書で記載される組成物を送達するのに援用できるであろう。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態の経粘膜薬物送達も、特許文献１２（参照によりその全体において本明細書に具体的に組み込まれる）において記載されており、本明細書で記載される組成物を送達するのに援用できるであろう。

本明細書で開示される組成物を、エアゾール剤を介して送達できることもさらに想定される。エアゾール剤という用語は、液化ガス推進剤中または高圧ガス推進剤中に分散させた、微粒化された固体粒子または液体粒子のコロイド状の系を指す。吸入のための典型的なエアゾール剤は、液体推進剤中または液体推進剤と適切な溶媒との混合物中の有効成分の懸濁液からなる。適切な推進剤は、炭化水素および炭化水素エーテルを含む。適切な容器は、推進剤の圧力要件に従い変化するであろう。エアゾール剤の投与は、対象の年齢、体重、ならびに症状の重症度および応答に従い変化するであろう。

［実施例１］
リポソーム処方物およびＬＣＡＮ処方物の調製
１．アンチセンスオリゴヌクレオチドのためのリポソーム処方物の調製および特徴付け
ＲＸ−００４７（Ｌ−ＲＸ−００４７）のためのリポソーム処方物は、エタノール拡散法により調製した。脂質組成物は、４５：５０：５のモル比のＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／ＴＰＧＳまたはＤＯＴＡＰ／ｓｏｙＰＣ／ＴＰＧＳであった。簡略には、脂質を、ＰＥＩ２Ｋ、すなわち、約２０００の分子量を有するＰＥＩを伴うかまたは伴わずに、エタノール中に溶解させた。脂質対ＰＥＩ２Ｋの比は、１２．５：１であった。ＲＸ−００４７は、クエン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ４）中に溶解させ、次いで、ボルテクシング下で、脂質溶液または脂質／ＰＥＩ２Ｋ溶液に添加して、４０％（ｖ／ｖ）のエタノール濃度でプレリポソームを自発的に形成させた。ＲＸ−００４７対脂質の重量比は、１２．５：１であった。次いで、ＭＷＣＯ １００００ Ｄａｌｔｏｎ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ測定器（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）を使用して、複合体を、クエン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ４）に対して、室温で２時間透析し、次いで、ＨＥＰＥＳで緩衝処理した生理食塩液（ＨＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して、室温で一晩透析して、遊離ＲＸ−００４７を除去した。

ＲＸ−００４７のための、葉酸でターゲティングされたリポソーム処方物（Ｆ−Ｌ−ＲＸ−００４７）は、上記で記載したのと同じ方法で調製した。リポソームは、４５／５０／４．５／０．５または４５／５０／４／１のモル比のＤＯＴＡＰ／ｓＰＣ／ＴＰＧＳ／Ｆ−ＰＥＧ−ＣＨＥＭＳから構成された。

ＲＸ−００４７のための、ＲＧＤでターゲティングされたリポソーム処方物（ｃＲＧＤ−Ｌ−ＲＸ−００４７）は、上記で記載したのと同じ方法で調製した。リポソームは、４５／５０／４．５／０．５または４５／５０／４／１のモル比のＤＯＴＡＰ／ｓＰＣ／ＴＰＧＳ／ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥから構成された。

２．ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体の合成
ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体は、ＨＳＡ上のカルボキシルを、ＥＤＣで活性化し、ＰＥＨＡ上のアミンとアミド結合を形成することにより合成した。合成時に使用したＨＳＡ：ＰＥＨＡ：ＥＤＣモル比は、１：１５００：２００（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。ＨＳＡ（２５％、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａから購入した）は、ＨＳＡを、ｐＨ８．０の５０ｍＭホウ酸緩衝液中または水中に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）−プロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で、大過剰量のＰＥＨＡと反応させることにより、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した）に結合した。簡略には、５ｇのＰＥＨＡ（ＭＷ２３２．３７、業務グレード）を、８０ｍＬのｄｄＨ₂Ｏ中に溶解させ、次いで、１Ｍ ＨＣｌを使用して、ｐＨ８．０に調整した。１ｇ（４ｍＬ）のＨＳＡ、次いで、５６２．５ｍｇの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ、ＤＭＳＯ中に溶解させた）を、撹拌下でＰＥＨＡ溶液中に添加した。反応は、室温で３〜４時間にわたり持続させた。ＨＳＡ−ＰＥＨＡ生成物を、４℃で、ＰＤ−１０脱塩カラム上のゲル膜クロマトグラフィーにより、またはＭＷＣＯ １０，０００ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ膜を使用する、ｄｄＨ₂Ｏ（再蒸留水）に対する透析により精製して、反応しなかったＰＥＨＡおよび副生成物を除去した。透析緩衝液は、透析サイクルの終了時である３時間の時点における、外部緩衝液中の標準的なニンヒドリンアッセイまたはトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アミンアッセイにより、ＰＥＨＡに由来するアミンが検出不能となるまで、３〜４時間ごとに置きかえた。合成のスケールアップのためには、透析手順を、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰｅｌｌｉｃｏｎカセットシステムまたはＳｐｅｃｔｒｏｐｏｒ中空糸システムを使用する接線流透析濾過で置きかえるべきである。この方法はまた、生成物を所望の濃度まで濃縮するのにも使用することができる。生成物は、０．２２μｍ滅菌フィルター内を、滅菌容器に流過させ、４℃で保管した。長期にわたる保管のためには、生成物を、−２０℃で保管することができる。生成物はまた、凍結乾燥させることもできる。

生成物タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイにより決定し、生成物中のＰＥＨＡ含量は、ＰＥＨＡベースの検量線を使用して、ＴＮＢＳアミン含量アッセイにより決定した。ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体の分子量は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＤＬＩ ＴＯＦ ＭＳ）により決定した。６６４０５．７５６のｍ／ｚを示す結果に基づくと、平均で１１のＰＥＨＡが各ＨＳＡに連結されていた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、複合体が、単一バンドとして泳動することを示し、ＨＳＡ−ＰＥＨＡ生成物中の分子間架橋の欠如を示した。

３．ｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体の合成
ｃＲＧＤｆＣ（シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ））と、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ−マレイミドとを、−ＳＨ反応および−マレイミド反応を介して結合し、チオエーテル結合を結果としてもたらした。反応時に使用したｃＲＧＤｆＣとＰＥＧ−ＰＳＰＥ−マレイミドとのモル比は、１．５：１であった。各々を５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝７．０）を含有するＰＢＳ緩衝液中に溶解させたｃＲＧＤｆＣ溶液およびＰＥＧ−ＤＳＰＥ溶液を組み合わせ、撹拌しながら、室温で６時間反応させた。生成物を、ＰＤ−１０カラム上のゲル濾過により精製して、反応しなかった／過剰なｃＲＧＤｆＣを生成物から除去した。反応のスケールアップのために、ゲル濾過は、ＧＰＣ、ＭＷＣＯ ２０００膜を使用する透析、または接線流透析濾過で置きかえることができる。生成物は、長期にわたる安定性のために、凍結させることもでき、凍結乾燥させることもできる。生成物純度は、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより確認した。最小のｃＲＧＤｆＣ結合レベル（例えば、８０％）および遊離ペプチド含量（例えば、＜１％）は、仕様として確立することができる。生成物中のｃＲＧＤｆＣ含量は、ＢＣＡタンパク質アッセイにより決定することができる。

４．葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体の合成
１０ｍｇの葉酸を、少量のトリエチルアミン（２０μｌ）を伴うＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）中に７ｍｇのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および２．８７ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と、葉酸／ＤＣＣ／ＮＨＳ＝１／１．５／１．１のモル比で、室温で３時間反応させた。反応混合物は、遠心分離して、副生成物であるジシクロヘキシル尿素を除去した。７７ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ−アミンは、少量のトリエチルアミン（２０μｌ）を伴うＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）中に溶解させ、次いで、上記で合成された葉酸−ＮＨＳと、１：１のモル比で、室温で３時間反応させた。葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを、１０倍容量アセトンを伴う沈殿により精製した。沈殿物は、遠心分離により回収し、次いで、真空下で乾燥させた。生成物は、ＭＷＣＯ ２０００膜を使用するｄｄＨ₂Ｏに対する透析によりさらに精製した後、凍結乾燥を施した。生成物純度は、ＨＰＬＣにより確認した。全てのＰＥＧ化された脂質および検出不能な遊離葉酸含量に対する最小の葉酸結合レベル（例えば、８０％）が、仕様として確立された。生成物中の葉酸含量は、３７１ｎｍのＵＶ分光分析またはＨＰＬＣにより決定した。

５．葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体の合成
葉酸−ＰＥＧ−ＣＨＥＭＳの合成は、葉酸−ＰＥＧ−アミンを、ＣＨＥＭＳ−ＮＨＳと反応させることにより実施した。葉酸−ＰＥＧ−アミンおよびＣＨＥＭＳ−ＮＨＳのいずれも、既に記載された（非特許文献４）方法により合成した。簡略には、葉酸−ＰＥＧ−ビス−アミンを合成するために、葉酸（２６．５ｍｇ）およびＰＥＧ−ビス−アミン（１６７．５ｍｇ）を、１ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解させた。次いで、８．６ｍｇのＮＨＳおよび１５．５ｍｇのＤＣＣを溶液に添加し、室温で一晩反応を進行させた。次いで、生成物である葉酸−ＰＥＧ−アミンを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。ＣＨＥＭＳ−ＮＨＳを合成するために、ＣＨＥＭＳ（１ｇ）を、テトラヒドロフラン中の４７５ｍｇ ＮＨＳおよび１．２５ｇ ＤＣＣと、室温で一晩にわたり反応させた。生成物であるＣＨＥＭＳ−ＮＨＳを、再結晶化により精製した。最後に、Ｆ−ＰＥＧ−ＣＨＥＭＳを合成するために、葉酸−ＰＥＧ−アミン（１３７ｍｇ、４０μｍｏｌ）およびＣＨＥＭＳ−ＮＨＳ（２９．２ｍｇ、５０μｍｏｌ）を、ＣＨＣｌ₃（５０ｍＬ）中に溶解させ、室温で一晩反応させた。次いで、溶媒（ＣＨＣｌ₃）を、回転蒸発により除去し、残留物を５０ｍＭ Ｎａ₂ＣＯ₃（１０ｍＬ）中で水和させて、Ｆ−ＰＥＧ−ＣＨＥＭＳミセルを形成した。次いで、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を１４ｋＤａとするＳｐｅｃｔｒｕｍ透析膜を使用して、ミセルを脱塩水に対して透析して、低分子量副生成物を除去した。次いで、生成物であるＦ−ＰＥＧ−ＣＨＥＭＳを、凍結乾燥により乾燥させ、７６．５％の収率で、黄色の粉末生成物（１３０ｍｇ）をもたらした。生成物の識別は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびＤＭＳＯ−ｄ₆中の¹Ｈ ＮＭＲにより確認した。

６．アンチセンスオリゴヌクレオチドのためのＬＣＡＮ処方物の調製および特徴付け
脂質でコーティングされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）は、エタノール希釈法により調製した。脂質である１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ダイズに由来するＬ−α−ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、およびＤ−アルファ−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネート（ＴＰＧＳ）（Ｅａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を、エタノール中に溶解させた。脂質は、２５：７０：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で組み合わせた。ＨＳＡ−ＰＥＨＡを、脂質溶液と、１２．５：３の重量比で混合した。アンチセンス組成物／全脂質／ＨＳＡ−ＰＥＨＡ重量比は、１：１０：３であった。簡略には、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）中のＨＳＡ−ＰＥＨＡと、ＥｔＯＨ中に溶解させた脂質とを、ボルテクシング下で混合し、結果として得られたＥｔＯＨ濃度は６０％であった。ＲＸ−００４７またはＲＸ−０２０１は、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）中に溶解させ、次いで、ボルテクシング下で、脂質およびＨＳＡ−ＰＥＨＡ溶液に添加して、４０％（ｖ／ｖ）のＥｔＯＨ濃度で、プレＬＣＡＮを自発的に形成させた。次いで、ＭＷＣＯ １００００ Ｄａｌｔｏｎ Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ透析管を使用して、複合体を、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）に対して、室温で２時間透析し、次いで、ＨＥＰＥＳで緩衝処理した生理食塩液（ＨＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して、室温で一晩透析して、遊離ＡＳＯを除去した。

ＬＣＡＮ処方物を２０倍まで濃縮し、次いで、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．４）で洗浄して、ＮａＣｌを除去した。生成物を所望の濃度まで希釈し、１０％スクロースを添加した。次いで、最終生成物を、０．４５μｍフィルターを介して濾過し、次いで、−７０℃で保管した。

７．アンチセンスオリゴヌクレオチドのための、ターゲティングされたＬＣＡＮ処方物の調製および特徴付け
ＲＧＤでターゲティングされたＬＣＡＮ処方物は、実施例５で記載したのと類似の方法で調製した。ＲＧＤでターゲティングされたＬＣＡＮ処方物のために、脂質は、２５：７０：４：１のモル比のＤＯＴＡＰ／ｓｏｙＰＣ／ＴＰＧＳ／ｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥからなり、アンチセンス組成物／全脂質／ＨＳＡ−ＰＥＨＡ重量比は、１：１０：３であった。ターゲティング剤を含有する脂質混合物は、ＤＯＴＡＰ、ｓｏｙＰＣ、ＴＰＧＳ、およびｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを、２５：７０．４：１の比で混合することにより作製した。６０％エタノール中の脂質混合物成分（溶液Ａ）を、２台のポンプおよびＹ字コネクターにより、２０％エタノール中の等容量のＨＳＡ−ＰＥＨＡ（溶液Ｂ）と組み合わせて、４０％エタノールによる溶液（溶液Ｃ）をもたらした。ＲＸ−０２０１（Ａｒｃｈｅｘｉｎ（登録商標））を、４０％エタノールを伴うＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）中に溶解させて、溶液Ｄを形成した。等容量の溶液Ｃと溶液Ｄとを、２台のポンプおよびＹ字コネクターにより組み合わせて、４０％エタノールによる溶液（溶液Ｅ）をもたらし、溶液Ｅを、撹拌下で、ｄｄＨ₂Ｏにより、４回、１０％エタノールまで希釈した。溶液Ｅに、等容量の０．５Ｍ ＮａＣｌを添加して、溶液（溶液Ｆ）中の２５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５％エタノール濃度をもたらした。ＲＧＤでターゲティングされたＬＣＡＮ生成物溶液Ｆを、ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ膜の接線流透析濾過により精製するが、これには、第１のステップとしての、溶液Ｆの、ＲＸ−０２０１濃縮物中に０．５ｍｇ／ｍＬまでの濃縮、第２のステップとしての、透過溶液中のＲＸ−０２０１濃度が１０μｇ／ｍＬを下回って降下するまでの、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対する透析、および最終ステップとしての、生成物の、ＲＸ−０２０１濃縮物中に２．５ｍｇ／ｍＬまでの濃縮が含まれる。生成物に、１／４容量の５０％スクロースを添加して、１０％スクロースによる溶液をもたらし、０．２２μｍ滅菌フィルターを介して濾過し、必要な場合は、前濾過を使用した。凍結乾燥のためには、滅菌条件下で、濾過された生成物（１０ｍＬ）を、５０ｍＬバイアル中に移し、２段階プログラム：保管棚を０℃まで冷却し、０．５℃／分で−４０℃まで冷却し、圧力を０．１２〜０．１６気圧まで低減し、−２５℃で３０時間にわたる初乾を施す段階。５℃／分で２５℃に加熱し、最長６時間にわたる真空乾燥を施す段階を使用して、凍結および凍結乾燥させた。最終のｃＲＧＤでターゲティングされたＬＣＡＮ生成物は、４℃で保管し、使用時に注射用水で再構成した。

葉酸−ＬＣＡＮ−ＲＸ−０２０１、ｃＲＧＤ−ＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７および葉酸−ＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７など、他のターゲティングされたＬＣＡＮ生成物も、上記で記載したのと同じ方法で調製した。

［実施例２］
リポソーム処方物およびＬＣＡＮ処方物の特徴付け
ＲＧＤでターゲティングされたリポソーム処方物は、４５／５０／４．５／０．５または４５／５０／４／１のモル比のＤＯＴＡＰ／ｓＰＣ／ＴＰＧＳ／ｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥからなった。粒子サイズおよびゼータ電位は、表１に示した。ｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ濃縮は、リポソーム粒子サイズおよびゼータ電位を変化させなかった。

ＬＣＡＮ生成物中の薬物ローディング効率は、表２に示す、ＯｌｉＧｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ定量化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により決定されるオリゴヌクレオチド濃度としての２ｍｇ／ｍＬであった。生成物中のオリゴヌクレオチドの回収パーセントは、６０から７６％であった。ＬＣＡＮ生成物の粒子サイズは、ＮＩＣＯＭＰ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）上で解析し、９２．７から１２４ｎｍの範囲であった。容量で重み付けしたガウス分布分析を使用して、平均粒子直径およびサイズ分布を決定した。ゼータ電位（ζ）は、ＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｈｉｒｅ、ＮＹ）上で決定した。全ての測定は、３連で実行した。ゼータ電位は、１４．５〜２９．４ｍＶの間であった。

［実施例３］
凍結融解安定性および凍結乾燥
リポソーム処方物の２つの異なるバッチを合成した。凍結−融解サイクルの前および後に、粒子サイズ、ゼータ電位、およびＲＸ−００４７含量を測定した。凍結乾燥させるために、５ｍＬ ＬＣＡＮ処方物を含有する各バイアルを、ＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥機内で凍結乾燥させた。完全な乾燥工程には、３段階：凍結、初乾、および再乾がある。再乾の後、バイアルを４℃で保管するか、または生成物をｄｄＨ₂Ｏで懸濁させて、粒子サイズ、ゼータ電位、および薬物含量を点検した。

４℃の安定性および凍結−融解安定性を査定した。表３に示す通り、粒子サイズおよびゼータ電位は、４℃で２週間保管した後でわずかに増大したが著明には増大しなかった。３回にわたる反復凍結−融解工程の後も、粒子サイズおよびゼータ電位は、凍結−融解の間、前、および後で著明には変化しなかった（表３）。

［実施例４］
生物学的試験
１．がん細胞内のリポソーム処方物およびＬＣＡＮ処方物によるｍＲＮＡ下方調節およびタンパク質下方調節
ＫＢ（ヒト表皮癌）、ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓）およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト***）細胞を、遺伝子下方調節研究に使用した。ＫＢ細胞を、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。ＰＡＮＣ−１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中で成長させた。細胞は、５％ＣＯ₂中３７℃の加湿インキュベータ内で維持した。

細胞は、ウェル１つ当たりの細胞２×１０⁵個の密度で、６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。３７℃で４時間、細胞に、Ｌ−ＲＸ−００４７またはＦ−Ｌ−ＲＸ−００４７またはｃＲＧＤｆＣ−Ｌ−ＲＸ−００４７をトランスフェクトした。受容体遮断研究のために、Ｆ−Ｌ−ＲＸ−００４７曝露時またはｃＲＧＤｆＣ−Ｌ−ＲＸ−００４７曝露時に、１００ｕＭの葉酸またはｃＲＧＤｆＣを、培地に添加した。トランスフェクション後、培地を、新鮮な成長培地で置きかえ、５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で４８時間、細胞をインキュベートした。次いで、細胞を回収し、ＨＩＦ−１α ｍＲＮＡレベルについては、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲで解析し、ＨＩＦ−１αタンパク質（核タンパク質）発現については、ウェスタンブロット解析で解析した。

Ｌ−ＲＸ−００４７またはｃＲＧＤｆＣ−Ｌ−ＲＸ−００４７の処置によるＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ下方調節は、０．２５μΜのＲＸ−００４７濃度のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定した（図１）。結果は、ｃＲＧＤｆＣ−Ｌ−ＲＸ−００４７が、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内のＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ発現を減少させることを示した。１．０％のｃＲＧＤｆＣを伴うｃＲＧＤｆＣ−Ｌ−ＲＸ−００４７は、ＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ下方調節の、０．５％ｃＲＧＤｆＣを伴うｃＲＧＤｆＣ−Ｌ−ＲＸ−００４７と比較した増大を示した。いずれのｃＲＧＤｆＣでターゲティングされたＲＸ−００４７処方物も、ＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ発現の、ターゲティングされていないＬ−ＲＸ−００４７と比較したより大きな減少もまた引き起こした。さらに、ＨＩＦ−１α下方調節効果は、１ｍＭのｃＲＤＧｆＣを添加することにより遮断された（図１）。これらの結果は、ｃＲＧＤｆＣ−Ｌ−ＲＸ−００４７が、ανβ３インテグリン受容体を介して、腫瘍細胞を選択的にターゲティングすることを示した。

ＬＣＡＮ処方物のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遺伝子ターゲティング効率は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定した。ＫＢ細胞内では、ＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７は、ＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ発現を、ＲＸ−００４７を０．５μΜのＲＸ−００４７濃度で含有するリポソーム処方物（Ｌ−ＲＸ−００４７）と比較して有意に減少させた（図２）。また、Ｌ−ＲＸ−００４７は、遊離ＲＸ−００４７、または対照群と比較して有意なＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ下方調節も示した。

ＲＸ−０２０１を含有するＬＣＡＮ処方物（ＬＣＡＮ−ＲＸ−０２０１）のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて遺伝子ターゲティング効率は、ＫＢ細胞内およびＰａｎｃ−１細胞で査定した。ＫＢ細胞内では、ＬＣＡＮ−ＲＸ−０２０１は、１μΜのＲＸ−０２０１濃度で、Ａｋｔ−１ ｍＲＮＡ発現を、ＬＣＡＮ対照と比較して有意に減少させた（図３）。同様にして、ＬＣＡＮ−ＲＸ−０２０１で処置されたＰａｎｃ−１細胞は、１μΜのＲＸ−０２０１濃度で、Ａｋｔ−１ ｍＲＮＡ発現の、ＬＣＡＮ対照または遊離ＲＸ−０２０１と比較した有意な減少を示した（図４）。

２．ＫＢ異種移植片腫瘍モデルにおけるＬ−ＲＸ−００４７およびＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療有効性
遊離ＲＸ−００４７、Ｌ−ＲＸ−００４７、およびＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７の治療有効性を、ＫＢ腫瘍異種移植片を保有する無胸腺ヌードマウスにおいて査定した。雌マウス（１８〜２２ｇ）に、４×１０⁶個のＫＢ細胞を皮下接種した。腫瘍が５０〜１００ｍｍ³の容量に到達したら、マウスを、４つの群（１群当たり５匹ずつのマウス）に無作為に割り付け、３ｍｇ／ｋｇの異なる処方物を、３日ごとに４回（Ｑ３Ｄ×４）静脈内注射した。腫瘍寸法は、キャリパーを伴う測定により決定し、腫瘍容量（ｍｍ³）は、容量＝０．５×（長さ×幅×高さ）により計算した。ＨＩＦ−１α下方調節を解析するために、マウスを、最後の処置の２４時間後に屠殺した。次いで、ＨＩＦ−１α遺伝子発現を解析するために、腫瘍を回収した。動物生存は、カプラン−マイヤー解析により査定した。

ＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７のｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子ターゲティング効率は、ＫＢ異種移植片腫瘍モデルにおいて査定した。図５において示す通り、３ｍｇ／ｋｇの用量の遊離ＲＸ−００４７は、腫瘍容量を、ＰＢＳ対照と比べてわずかに減少させるだけであり、差違は有意ではなかった。Ｌ−ＲＸ−００４７は、３ｍｇ／ｋｇの用量で、腫瘍成長を、ＰＢＳ対照または遊離ＲＸ−００４７と比較して有意に減少させた。これに対し、ＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７は、腫瘍成長を、Ｌ−ＲＸ−００４７より有意に減少させた。

ＫＢ異種移植片マウスにおいて、腫瘍組織内のＨＩＦ−１αの発現レベルが、３ｍｇ／ｋｇの用量のＬ−ＲＸ−００４７およびＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７により有意に下方調節され（図６）、ＬＣＡＮ処方物がはるかにより活性であったことは、これらのデータと一致する。

一方、動物生存は、カプラン−マイヤー解析により査定し、寿命の延長（ＩＬＳ、％）は、ＩＬＳ＝（処置されたマウスの平均生存時間／対照マウスの平均生存時間−１）×１００％により計算した。マウス（群１つ当たり１０匹ずつのマウス）に、３ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ、遊離ＲＸ−００４７、またはＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７を、３日ごとに４回（Ｑ３Ｄ×４）静脈内注射した。ＰＢＳ群、遊離ＲＸ−００４７群、またはＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７群の中央値生存時間（ＭｅＳＴ）は、それぞれ、１９、２６、および３７日間であった（図７）。ＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７の百分率ＩＬＳ値は、９４．７％である。さらに、マウス１０匹中２匹は、ＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７による処置後において完全に治癒した。これらの結果は、ＬＣＡＮ−ＲＸ−００４７が、単剤療法として強力な抗がん活性を有することを示した。

本明細書で開示される処方物および方法のある種の実施形態は、上記の実施例で規定されている。これらの実施例は、本発明の特定の実施形態を指し示すが、例示だけを目的として与えられることを理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本開示の本質的特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、多様な変化および改変を施して、本明細書で記載される組成物および方法を、多様な使用および条件に適合させることができる。多様な変化を施すことができ、本開示の本質的範囲から逸脱することなく、その要素を同等物で置換することができる。加えて、多くの改変を施して、特定の状況または材料を、その本質的範囲から逸脱することなく、本開示の教示に適合させることができる。

Claims (46)

1. 重合体に結合した巨大分子と、ターゲティング剤とを含むことを特徴とする脂質ナノ粒子組成物。
2. 重合体に結合した巨大分子と、
   アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む治療剤と、
   を含み、
   前記ＡＳＯは、
   Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するＡＳＯ、および、
   ＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節するＡＳＯ
   からなる群から選択される、
   ことを特徴とする脂質ナノ粒子組成物。
3. アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む治療剤をさらに含み、
   前記ＡＳＯは、
   Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するＡＳＯ、および
   ＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節するＡＳＯ
   からなる群から選択される、
   ことを特徴とする請求項１に記載の脂質ナノ粒子組成物。
4. 前記重合体は、帯電していることを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
5. 前記重合体は、正に帯電していることを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
6. 前記巨大分子は、アルブミンを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
7. 重合体に結合した前記巨大分子は、アルブミン−ポリカチオン複合体を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
8. 前記結合は、架橋剤を介することを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
9. 前記巨大分子は、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）を含み、前記重合体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
10. ＰＥＨＡ分子の、ＨＳＡ分子に対する比は、約１１：１であることを特徴とする請求項５に記載の脂質ナノ粒子組成物。
11. 前記正に帯電した重合体は、テトラエチレンヘキサミンを含むことを特徴とする請求項５に記載の脂質ナノ粒子組成物。
12. 前記正に帯電した重合体は、テトラエチレンペンタミンを含むことを特徴とする請求項５に記載の脂質ナノ粒子組成物。
13. 前記脂質ナノ粒子は、２つ以上の低分子量重合体の混合物を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
14. 前記脂質ナノ粒子は、ＤＯＴＡＰ、ＳＰＣ、およびＴＰＧＳを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
15. ＤＯＴＡＰ：ＳＰＣ：ＴＰＧＳのモル比は、約２５：７０：５であることを特徴とする請求項１４に記載の脂質ナノ粒子組成物。
16. 前記ナノ粒子は、核酸、タンパク質、多糖、脂質、放射性物質、治療剤、プロドラッグ、およびこれらの組合せからなる群から選択される治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の脂質ナノ粒子組成物。
17. 前記治療剤は、核酸であることを特徴とする請求項１４に記載の脂質ナノ粒子組成物。
18. 前記核酸は、ｐＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の脂質ナノ粒子組成物。
19. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ ｇｃｔｇｃａｔｇａｔｃｔｃｃｔｔｇｇｃｇ ３’（配列番号１）を含む配列を有し、ヒトＡｋｔ−１をコードする核酸分子をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節する化合物であることを特徴とする請求項２または１８に記載の脂質ナノ粒子組成物。
20. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ ａａｔｇａｇｃｃａｃｃａｇｔｇｔｃｃａａ ３’（配列番号２）を含む配列を有し、ヒトＨＩＦ−１をコードする核酸分子をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節する化合物であることを特徴とする請求項２または１８に記載の脂質ナノ粒子組成物。
21. 融合性ペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
22. 前記脂質ナノ粒子の粒子サイズは、約３００ｎｍ未満であることを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
23. 前記脂質ナノ粒子の粒子サイズは、約１５０ｎｍ未満であることを特徴とする請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
24. 前記ターゲティング剤は、前記脂質ナノ粒子の外表面に、直接的な接続を介して、または架橋剤を介して結合していることを特徴とする請求項１に記載の脂質ナノ粒子組成物。
25. 前記ターゲティング剤は、抗体または抗体断片を含むことを特徴とする請求項１に記載の脂質ナノ粒子組成物。
26. 前記ターゲティング剤は、ｃＲＧＤペプチド、ガラクトース含有部分、トランスフェリン、葉酸、低密度リポタンパク質、上皮成長因子、および抗体からなる群から選択される部分を含むことを特徴とする請求項１に記載の脂質ナノ粒子組成物。
27. 前記ターゲティング剤は、ｃＲＧＤｆＣまたは葉酸を含むことを特徴とする請求項２６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
28. 前記ターゲティング剤は、葉酸−ＰＥＧ−ＣＨＥＭＳ（葉酸−ポリエチレングリコール−コレステリルヘミスクシネート）、葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（葉酸−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、およびｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（シクロ（ＲＧＤｆＣ）−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）からなる群から選択される複合体を含むことを特徴とする請求項２７に記載の脂質ナノ粒子組成物。
29. 請求項１から２８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物と、薬学的に許容される添加剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
30. 滅菌溶液または滅菌懸濁液であることを特徴とする請求項２９に記載の医薬組成物。
31. 脂質でコーティングされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）を作製する方法であって、
    ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体を合成するステップと、
    脂質の混合物を調製するステップと、
    前記脂質の混合物を、前記ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体に添加するステップと、
    アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を、前記脂質の混合物および前記ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体に添加して、ＬＣＡＮ前駆体を得るステップと
    を含み、
    前記ＡＳＯは、Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するＡＳＯ、およびＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節するＡＳＯからなる群から選択される、
    ことを特徴とする方法。
32. 脂質でコーティングされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）を作製する方法であって、
    ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体を合成するステップと、
    脂質の混合物を調製するステップと、
    ターゲティング剤および前記脂質の混合物を、前記ＨＳＡ−ＰＥＨＡ複合体に添加するステップと
    を含むことを特徴とする方法。
33. 前記ターゲティング剤は、ｃＲＧＤペプチド、ガラクトース含有部分、トランスフェリン、葉酸、低密度リポタンパク質、上皮成長因子、および抗体からなる群から選択される部分を含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
34. 前記ターゲティング剤は、ｃＲＧＤｆＣまたは葉酸を含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
35. 前記ターゲティング剤は、葉酸−ＰＥＧ−ＣＨＥＭＳ（葉酸−ポリエチレングリコール−コレステリルヘミスクシネート）、葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（葉酸−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、およびｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（シクロ（ＲＧＤｆＣ）−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）からなる群から選択される複合体を含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
36. 前記脂質の混合物は、ＤＯＴＡＰ、ｓｏｙＰＣ、ＴＰＧＳ、およびｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
37. ＤＯＴＡＰ：ｓｏｙＰＣ：ＴＰＧＳ：ｃＲＧＤｆＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥのモル比は、約２５：７０：４：１であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
38. 前記脂質の混合物は、ＤＯＴＡＰ、ＳＰＣ、およびＴＰＧＳを含むことを特徴とする請求項３１または３２に記載の方法。
39. ＤＯＴＡＰ：ＳＰＣ：ＴＰＧＳのモル比は、約２５：７０：５であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
40. 治療剤を、前記脂質とターゲティング剤との混合物に添加するステップをさらに含み、前記治療剤は、ｐＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはこれらの組合せから選択される核酸であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
41. 前記治療剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含み、前記ＡＳＯは、Ａｋｔ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節するＡＳＯ、およびＨＩＦ−１をコードする核酸の一部をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節するＡＳＯからなる群から選択されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
42. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ ｇｃｔｇｃａｔｇａｔｃｔｃｃｔｔｇｇｃｇ ３’（配列番号１）を含む配列を有し、ヒトＡｋｔ−１をコードする核酸分子をターゲティングし、Ａｋｔ−１の発現を調節する化合物であることを特徴とする請求項３１または４１に記載の方法。
43. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ ａａｔｇａｇｃｃａｃｃａｇｔｇｔｃｃａａ ３’（配列番号２）を含む配列を有し、ヒトＨＩＦ−１をコードする核酸分子をターゲティングし、ＨＩＦ−１の発現を調節する化合物であることを特徴とする請求項３１または４１に記載の方法。
44. がんまたは感染性疾患を診断または処置する方法であって、有効量の、請求項２９に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
45. 前記がんは、脳腫瘍、膀胱がん、肺がん、乳がん、黒色腫、皮膚がん、表皮癌、結腸直腸がん、非ホジキンリンパ腫、子宮内膜がん、膵臓がん、腎臓（腎細胞）がん、前立腺がん、白血病、甲状腺がん、頭頸部がん、卵巣がん、肝細胞がん、子宮頸がん、肉腫、胃がん、多発性骨髄腫、リンパ腫、および消化器がん、および子宮がんからなる群から選択されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
46. 前記がんは、乳がん、表皮癌、および膵臓がんからなる群から選択されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。