CN102803511A - 用于影响肿瘤细胞生长、迁移和侵袭的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本文中公开了miR-221和miR-222下调PTEN和TIMP3肿瘤阻抑子，从而导致TRAIL抗性。本发明提供了与该发现相关的研究、诊断和治疗工具及方法。在本文中具体地描述了用于具有TRAIL抗性的人肝细胞癌和非小细胞肺癌的诊断、预后和治疗。

Description

用于影响肿瘤细胞生长、迁移和侵袭的材料和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年11月23日提交的美国临时申请No.61/263,655的权益，其公开内容通过引用并入本文。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明是在无任何政府资助下进行的，政府在本发明中不具有权利。
发明领域
本发明总体涉及分子生物学领域。更具体地，其涉及癌症相关技术。本发明的某些方面包括与miR221和miR222相关的诊断、治疗和预后的应用。特别地在本文中论述了肝癌和肺癌的诊断、治疗和预后。
本发明部分基于如下发现：
●肝细胞生长因子对肝细胞生长因子受体(MET)的结合上调
●细胞外信号调节的激酶(ERK1/2)和Jun N-末端激酶(JNK)的磷酸化，这继而上调
●Jun的转录激活，这继而上调
●非编码microRNA(miR-221和miR-222)的表达,这继而调节
●磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)以及金属蛋白酶3的组织抑制剂(TIMP3)的表达，这继而
●赋予对肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)-诱导的细胞死亡的抗性，并增强肺癌和肝癌细胞的致肿瘤性。
本发明提供了使用从本发现产生的知识的研究工具、诊断方法以及治疗方法和组合物。本发明在产业上适用于使肿瘤细胞对药物诱导的诱导致敏以及还有抑制肿瘤细胞存活、增殖和侵袭能力的目的。
发明背景
尽管在早期检测和标准治疗上取得进展，但非小细胞肺癌(NSCLC)和肝细胞癌(HCC)通常在晚期才得以诊断并且具有不良预后。促进细胞凋亡是药物开发的可能目标。TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)目前正在临床试验中进行测试；然而许多肿瘤包括NSCLC和HCC对TRAIL的抗性代表了对其临床应用的障碍。
miRNA是可阻断mRNA翻译和/或负面调节其稳定性的19–25nt的小非编码RNA。目前，已在人细胞中鉴定了500多种不同的miRNA，并且证据表明miRNA水平的调节与许多细胞类型和组织的生长和分化相关。失调的miRNA表达与实体和造血***恶性肿瘤(hematopoietic malignancy)相关，并且有证据表明一些miRNA可用作癌基因或肿瘤抑制基因。miR-221和miR-222是其中脱调控程度最高的牵涉癌症的miRNA。它们的表达在多种实体瘤中被高度上调，包括甲状腺癌、肝细胞癌和黑色素瘤细胞。升高的miR-221和miR-222的表达与几种癌细胞系的增殖、细胞凋亡和迁移具有因果联系。然而，在一般的癌细胞，特别是在NSCLC和HCC中介导miR-221和miR-222的功能的分子机制在本发明之前在很大程度上是未知的。
PTEN是人癌症的肿瘤阻抑子和细胞生长及细胞凋亡的调节剂。在功能上，PTEN将细胞质中的磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)转化成磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)，从而直接拮抗PI3激酶(PI3K)的活性。PTEN失活导致PI3K/AKT途径的组成型激活，以及随后蛋白质合成、细胞周期进程、迁移和存活的增加。此外，许多研究已证明PTEN的蛋白磷酸酶活性通过几个途径抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活。PTEN与多个药物抗性包括针对TRAIL的抗性的发生相关。AKT的组成型激活促成不同类型肿瘤包括肺和肝癌中细胞的迁移和侵袭。
TIMP3是一组称为基质金属蛋白酶(MMP)的蛋白质的成员。MMP是参与正常生理过程例如胚胎发育、组织和骨重塑、伤口愈合以及血管生成中细胞外基质(ECM)的分解的锌蛋白酶的家族。在细胞外基质内，金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)(其中存在4个家族成员(TIMP1至4))通过以1:1的化学计量与活性位点结合而抑制MMP的活性。TIMP3在血管平滑肌细胞和黑色素瘤细胞系中的过表达抑制侵袭和促进凋亡细胞死亡。已报导TIMP3诱导引发者(initiator)胱天蛋白酶-8和-9的激活。TIMP3与血管生成和肿瘤形成相关。
MET，也称为c-Met，是肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(scatterfactor)(SF)的膜受体。MET通常由上皮来源的细胞表达，然而HGF的表达限制于间质来源的细胞。当HGF刺激时，MET刺激癌细胞的侵袭性生长并且增强它们的转移潜能，主要通过ERK1/2和JNK的增加的磷酸化。
磷酸化的JNK激活癌蛋白质c-Jun，已知其与其伴侣c-Fos以同二聚体或异二聚体的形式形成激活物蛋白-1(AP-1)转录因子。HGF/SF及其受体MET的异常表达通常与多种人恶性肿瘤的不良预后相关。由于其对于恶性肿瘤细胞的特异性毒性的原因，TRAIL的重组形式是基于细胞凋亡的抗肿瘤剂。然而，许多人癌细胞仍然抗TRAIL诱导的细胞凋亡，但这种抗性的机制还不清楚。
发明概述
本发明提供了改变细胞的TRAIL表达模式的方法，包括抑制能够表达c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN和TIMP3的细胞的c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN或TIMP3，和观察TRAIL表达模式的改变。
还提供了改变细胞的TRAIL表达模式的方法，包括过表达能够表达c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN和TIMP3的细胞的c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN或TIMP3，以及观察TRAIL表达模式的改变。
还提供了鉴定细胞样品的TRAIL表达模式的方法，包括鉴定细胞样品的至少两种核酸的表达水平，其中所述至少两种核酸选自：miR-221和miR-222以及c-Jun；miR-221和miR-222以及PTEN；miR-221、miR-222和TIMP3；miR-221和miR-222、c-Jun和PTEN；miR-221和miR-222、PTEN和TIMP3；以及miR-221和miR-222、c-Jun和TIMP3。
还提供了改变TRAIL抗性细胞的基因表达的方法，包括抑制还表达至少一种选自：c-Jun、PTEN和TIMP3的核酸的细胞中的miR-221和miR-222。
还提供了改变TRAIL抗性细胞中的基因表达的方法，包括在还表达至少一种选自：c-Jun、PTEN和TIMP3的核酸的细胞中过表达miR-221和miR-222。
还提供了鉴定具有核酸表达抑制的测试细胞的方法，包括将至少一种测试细胞与反义miR-221和miR-222接触，和观察选自：PTEN和TIMP3的核酸的表达的增加。
还提供了预测经诊断患有癌症的患者的临床结果的方法，包括检测获自患者的癌细胞样品的miR-221和miR-222的表达水平和选自c-Jun、PTEN和TIMP3的至少一种核酸的表达水平，其中相对于对照而言，肿瘤样品中miR-221和miR-222的水平升高至1.5倍或更高与PTEN或TIMP3表达的水平降低至2/3或更低的组合预测了存活的减少，或其中相对于对照而言，肿瘤样品中miR-221和miR-222的水平升高至1.5倍或更高与c-Jun表达水平升高至1.5倍或更高的组合预测了存活的减少。
此外，本发明还提供了抑制表达miR-221和miR-222以及PTEN的肿瘤细胞中的PTEN表达的下调的方法，包括抑制表达miR-221和miR-222以及PTEN的肿瘤细胞中的miR-221和miR-222活性，和观察PTEN下调的抑制。优选的是如下所述的方法，其中通过反义miR-221和miR-222抑制所述miR-221和miR-222的活性，虽然其中通过TRAIL敏感性观察PTEN表达下调的抑制的方法也是优选的，其中通过PTEN转录分析观察PTEN表达下调的抑制的方法同样是优选的。
在其它实施方案中，提供了鉴定用于治疗TRAIL抗性癌症的治疗剂的方法，包括体外筛选候选试剂以选择减少TRAIL抗性癌细胞中的miR-221和miR-222的表达和增加PTEN的表达的试剂，从而鉴定用于治疗TRAIL抗性癌症的试剂。
还提供了治疗具有TRAIL抗性肿瘤的细胞的哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用能够抑制PTEN表达的下调的治疗剂，所述哺乳动物具有TRAIL抗性肿瘤细胞，如通过miR-221和miR-222的水平升高至1.5倍或更高与PTEN表达水平降低至2/3或更低的组合所鉴定的。
还提供了用于鉴定测试细胞中PTEN的miR-221和miR-222上调的试剂盒，包括miR-221和miR-222的至少一种分子鉴定物和PTEN的至少一种分子鉴定物，其中所述分子鉴定物选自探针、引物、抗体或小分子。
在本文中的任何方法中，优选方法利用选自：癌细胞、ITRAIL抗性癌细胞、非小细胞肺癌细胞和HCC的细胞。
在本发明的另一个方面，提供了改变能够表达TIMP3以及miR-221和miR-222的细胞中的TIMP3表达的调节的方法，包括改变表达TIMP3和表达miR-221和miR-222的细胞中的miR-221和miR-222活性，和观察TIMP3表达的改变。
还提供了抑制能够表达TIMP3的细胞中的TIMP3表达的方法，包括在也表达TIMP3的细胞中过表达miR-221和miR-222，和观察TIMP3表达的抑制。
还提供了鉴定具有TIMP3表达抑制的细胞的方法，包括将测试细胞与反义miR-221及miR-222接触，和观察TIMP3表达的增加。
还提供了鉴定TRAIL抗性细胞的方法，包括鉴定测试细胞样品是否包含miR-221和miR-222核酸和TIMP3核酸。
还提供了鉴定用于治疗TRAIL抗性癌症的治疗剂的方法，包括体外筛选候选试剂以选择减少TRAIL抗性癌细胞中的miR-221和miR-222的表达并且增加TIMP3的表达的试剂，从而鉴定用于治疗TRAIL抗性癌症的试剂。
还提供了预测经诊断患有癌症的患有的临床结果的方法，包括检测获自患者的癌细胞样品的miR-221、miR-222和TIMP3表达的水平，其中相对于对照而言，肿瘤样品中miR-221和miR-222的水平升高至1.5倍或更高与TIMP3表达的水平降低至2/3或更低的组合预测存活的降低。
还提供了治疗具有TRAIL抗性肿瘤细胞的哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用能够抑制TIMP3表达的下调的治疗剂，所述哺乳动物具有TRAIL抗性肿瘤细胞，如通过miR-221和miR-222的水平升高至1.5倍或更高与TIMP3的表达水平降低至2/3或更低的组合所鉴定。
还提供了用于鉴定测试细胞中TIMP3的miR-221及miR-222上调的试剂盒，包括miR-221和miR-222的至少一种分子鉴定物和TIMP3的至少一种分子鉴定物，其中所述分子鉴定物选自：探针、引物、抗体或小分子。
还提供了优选方法，其中所述细胞选自癌细胞、TRAIL抗性细胞、非小细胞肺癌和肝细胞癌细胞。
还提供了抑制表达miR-221、miR-222和TIMP3的肿瘤细胞中的TIMP3的下调的方法，包括抑制表达miR-221、miR-222和TIMP3的肿瘤细胞中的miR-221和miR-222活性，和观察TIMP3下调的抑制。优选的是这样的方法：其中所述miR-221和miR-222的活性通过反义miR-221和miR-222抑制，或其中通过TRAIL敏感性观察TIMP3表达下调的抑制，或其中通过TIMP3翻译分析来观察TIMP3表达下调的抑制。
根据下列参考附图进行的几个实施方案的详细描述，本公开内容的上述和其它性质及有利方面将变得更显然。
附图说明
专利或申请文件可包括一张或多张彩色附图和/一张或多张照片。具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开案的拷贝在提出请求和支付必要费用后可由专利局提供。
图1A-1H.PTEN和TIMP3为miR-221和miR-222的靶；
图1A.PTEN和TIMP33’UTR包含一个预测的miR-221和miR-222结合位点。在图1A中显示了miR-221及222与PTEN和TIMP33’UTR的种子区域(seed region)的比对。靶向诱变的位点以红色标示。(图1A按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 26-29和26、30、28和31)。
图1B.在增强miR-221和miR-222的表达后MEG01细胞的qRT-PCR。
图1C.PTEN和TIMP33’UTR为miR-221和miR-222的靶。将包含野生型(直方图的左侧)或突变的(直方图的右侧)PTEN和TIMP33’UTR的pGL3-PTEN和pGL3-TIMP3荧光素酶构建体转染入MEG01细胞。针对转染对照标准化萤火虫荧光素酶表达的相对抑制。进行3次报道分子测定，结果基本上一致。
图1D.增强miR-221和miR-222的表达后的H460细胞的qRT-PCR。
图1E.miR-221和miR-222增强的表达降低H460 NSCLC的PTEN和TIMP3蛋白的内源水平。用无规miR或miR-221或miR-222转染H460细胞，进行72小时。利用western印迹法测定PTEN和TIMP3的表达。通过使用抗-β-肌动蛋白抗体获得上样对照。
图1F.显示抗-miR转染后Calu-1细胞中的miR-221及222下调的qRT-PCR。
图1G.显示通过使用抗-miR-221和miR-222下调miR-221和miR-222后PTEN和TIMP3的表达的Western印迹。抗-miR-221和-222能够增加Calu-1细胞系的PTEN和TIMP3表达。
图1H.在H460细胞中的miR-221和miR-222增强的表达后PTEN和TIMP3mRNA的qRT-PCR。PTEN但非TIMP3mRNA被miR-221和miR-222下调。数据表示为SD。
图2A-2B.NSCLC和HCC中PTEN和TIMP3的表达与miR-221和miR-222的表达呈反相关。
图2A.使用15μg NSCLC的总RNA和10μg HCC细胞中的总RNA通过northern印迹分析miR-221和-222的表达水平。使用从不同的NSCLC和HCC的分离的总蛋白质提取物(50μg)进行抗-PTEN和TIMP3的Western印迹分析。
图2B.通过如“补充实验方法”部分所述从不同NSCLC和HCC提取RNA进行miR-221和222和PTEN mRNA的qRT-PCR。miR-221和miR-222与所有不同NSCLC和HCC细胞中的PTEN mRNA表达呈反相关。数据表示为SD。
图3A-3L.PTEN和TIMP3在体外和体内为HCC的miR-221和miR-222的直接靶。
图3A.显示miR-221和miR-222过表达或下调后Sk-Hep1和Snu-387细胞中的PTEN和TIMP3的表达的Western印迹。miR-221和miR-222能够下调Sk-Hep1的PTEN和TIMP3表达；相反地，抗-miR-221和miR-222能够增加Snu-387细胞中的PTEN和TIMP3表达。
图3B.关于22个肺癌患者和10个正常肺组织的qRT-PCR。通过使用皮尔逊相关系数(r)和各自的p-值在统计学上计算正常组的10个受试者和肿瘤组的22个受试者的miR-221/222与PTEN mRNA之间的相关性，在p0.05下全都是显著的。皮尔逊相关性显示正常和肿瘤样品的miR-221、-222与PTEN mRNA之间的反相关性。
图3C.关于肝细胞癌和正常肝组织样品的IHC和ISH。肝癌和相邻正常/硬化肝组织中的miR-221/222(蓝色)与PTEN/TIMP3(红色)表达呈反相关。通过原位杂交，然后进行PTEN和TIMP3的免疫组织化学来分析这些组织的miR-221和miR-222表达。肝癌细胞大量表达miR-221/222并且极少表达PTEN或TIMP3(图3G、3H、3K、3L)，而相邻非恶性肿瘤肝大量表达PTEN或TIMP3并且极少具有可检测的miR-221/222(图3A、3B、3E、3F)。在其miR-221/222和TIMP3的表达都显著的肝细胞癌的情况下，表达miR-221(大箭头，图3K；TIMP3由图3L中的箭头描述)的癌细胞与表达TIMP3的细胞(图3K，小箭头)不同。图3C-3I、3H及3E；3D-3J；在肝中不表达的miR-302用作阴性对照。分析了80个人的HCC。比例尺寸表示25m。
图4A-4E.miR-221和miR-222通过靶向PTEN和TIMP3诱导NSCLC和HCC的TRAIL抗性。
图4A.关于5种不同HCC的增殖测定。将细胞与Super-Killer-TRAIL(400ng/ml)一起温育24小时，如补充方法中所述，评估存活率。具有低miR-221和-222表达的Huh7、HepG2和Sk-Hep1与高度表达miR-221/222的PLC/PLF-5和Snu-387相比较，对TRAIL诱导的细胞凋亡更敏感。以一式三份重复4个独立实验的平均SD。
图4B.miR-221/222增强的表达和PTEN或TIMP3下调后Sk-Hep1细胞的细胞死亡效应。用对照miR或用pre-miR-221-222转染细胞。转染后24小时，用Super-Killer TRAIL处理细胞24小时。利用Annexin-FITC或(图4C)利用胱天蛋白酶-Glo 3/7试剂盒估计细胞凋亡。在miR-221/222过表达或PTEN和TIMP3下调后TRAIL抗性增强。
图4D.miR-221/222对细胞死亡的作用。用对照siRNA或对照miR或用100nmol的PTEN和TIMP3siRNA转染H460细胞。从感染48小时后，用Super-Killer TRAIL处理细胞24小时。通过胱天蛋白酶3/7活性(图4E)或Annexin-V评估细胞凋亡。PTEN和TIMP3下调后凋亡细胞的百分比下降。误差棒表示SD。通过t检验，*p<0.05，＊＊p<0.001。
图5A-5G.抗-miR-221和miR-222通过抑制AKT途径使NSCLC和HCC的TRAIL抗性无效。
(图5A-5C)miR-221/222增强的表达后H460细胞的Western印迹。miR-221和miR-222增强的表达诱导AKT/ERK途径和金属肽酶的激活。
图5B.miR-221和miR-222被抗-miR-221/222敲低后Snu-387细胞的Western印迹。AKT途径的抑制显示为miR-221和miR-222下调的结果。
图5D-5E.PTEN或TIMP3敲低后的Western印迹。Erk磷酸化和PAK1激活都是PTEN和TIMP3依赖性的。AKT途径的激活是PTEN依赖性的，而TIMP3沉默诱导金属肽酶的表达。
图5F-5G.抗-miR和API2/曲西立滨对AKT途径的抑制对细胞死亡的作用。用抗-miR221/222转染Calu-1和Snu-387细胞72h小时，或用API2/曲西立滨处理细胞48小时。miR-221和miR-222的下调和/或Akt途径的抑制诱导Calu-1和Snu-387细胞系的细胞凋亡百分比的增加，如通过胱天蛋白酶3/7活性所评估。误差棒表示SD。通过t检验，＊＊p<0.001。
图6A-6D.miR-221和miR-222的异位表达影响H460的细胞周期分布和迁移/侵袭能力。
图6A.利用无规pre-miR、miR-221和miR-222、无规siRNA、siRNA PTEN转染的H460细胞的流式细胞分布(Flow cytometricdistributions)。转染的H460细胞显示：作为PTEN下调的结果，G1的减少和S和G2-M期的相应增加。
图6B-6C.miR-221和miR-222调节H460细胞的细胞迁移能力。如“实验方法”中所述进行迁移测定。
图6D.miR-221和miR-222影响H460和Sk-Hep1细胞的侵袭能力。直方图报告了在用阴性对照miRNA、miR-221、miR-222、siPTEN和siTIMP3转染后，侵袭通过Matrigel涂覆的膜的细胞的百分比。进行单因素方差分析(ANOVA)以测试侵袭值的平均值之间的差异。将薛费氏多重比较法(Scheffe’multiple-comparison method)用于测试每一对平均值之间的差异。在无规miR对miR-221和miR-222、PTEN和TIMP3转染的H460细胞之间发现显著差异(p-值0.001)。使用Bonferroni和Sidak法获得了相同的结果。误差棒表示SD。通过t检验，*p<0.001。比例尺表示25m。放大倍数对于所有图框都是相同的。
图7A-7M.MET癌基因调节miR-221和miR-222的激活。
(图7A-7B-7C).在用miR对照和siRNA MET转染后，Calu-1、Snu-387和GTL16中miR-221和miR-222的相对表达水平。MET敲低后，miR-221和miR-222的表达减少。
图7D-7E-7F.siRNA MET转染后Calu-1、Snu-387和GTL16细胞的Western印迹分析。MET的敲低降低miR-221和miR-222的表达水平，在所有不同细胞系中产生PTEN和TIMP3的上调。用4μM的MET抑制剂SU11274再处理GTL16细胞24小时。MET抑制增加miR-221和miR-222的靶的表达水平。
图7G-7H-7I.通过使用2种不同的跨越miR-221/222转录起始位点的扩增子鉴定c-Jun(AP-1)相互作用区域。利用来自H460c-Jun阴性细胞、Calu-1和Snu-387c-Jun阳性细胞的染色质进行ChIP分析。BS=结合位点。
图7J.利用茴香霉素(10M)处理30分钟后，Huh7细胞中的miR-221和miR-222的qRT-PCR。茴香霉素诱导miR-221和miR-222的上调。
图7K.茴香霉素在Huh7细胞中诱导c-Jun的激活以及PTEN和TIMP3的下调。使用抗-PTEN和抗-TIMP3抗体通过western印迹分析总裂解物。误差棒表示SD。
图8.MET通过AP-1(c-Jun)转录因子诱导miR-221和miR-222的激活。已报导了这样的模型，在所述模型中，生长因子决定c-Met的激活，这继而通过AP-1并从而通过miR-221和miR-222的上调，产生PTEN和TIMP3的下调和随后细胞凋亡抗性、细胞迁移和侵袭。
图9A-9H.肺癌和相邻良性组织的miR-221/222和PTEN/TIMP3的IHC和ISH。
miR-221/222(蓝色)与PTEN/TIMP3(红色)表达在肺癌和相邻正常肺组织中呈反相关。如“补充实验方法”中所述，通过原位杂交分析这些组织中的miR-221和miR-222的表达，然后通过免疫组织化学分析PTEN和TIMP3的表达。大部分癌细胞对于miR-221和miR-222呈阳性并且对于PTEN(图9F-9G)和TIMP3(图9I-9J)呈阴性。相反地，正常细胞对于miR-221/222(图9A-9B-9D-9E)呈阴性并且对于PTEN和TIMP3呈阳性。注意，在几种癌症中(图9I和9J)，miR-221/222的表达通过TIMP3的表达来证明；然而miRNA的表达在癌细胞中是明显的并且TIMP3的表达在促***增生型组织的周围细胞中是明显的。
图9C-9H.H&E-小箭头miR-221-222，大箭头TIMP3。分析了92个人肺癌。
图9K-9L.肺的miRNA-221/222表达和组织学的相关性。miR-221和-222在肺的鳞状细胞癌中显示等同的分布模式。图9K显示正在浸润相邻纤维变性肺组织的肿瘤细胞巢(nests of tumor cell)中的强信号(大箭头)。注意，信号显示癌细胞中基于细胞质和核膜的定位(图9L，更高的放大倍数)。相比之下，只有极少良性细胞在相邻纤维变性组织(小箭头)中表达miR-222，所述相邻纤维变性组织被癌细胞侵入。比例尺表示25m。
图10A-10B.miR-221和miR-222上调或PTEN/TIMP3敲低后HepG2和Huh7细胞中的胱天蛋白酶3/7活性。为了进行胱天蛋白酶3/7活性检测，将细胞培养在96孔板中，用100nM miR-221和miR-222转染所述细胞72小时。转染后48小时，用400ng/ml的TRAIL处理细胞24小时，按照制造商的说明书使用胱天蛋白酶-Glo 3/7测定试剂盒进行分析。在miR-221和miR-222增强的表达或PTEN/TIMP3下调后，HepG2和Huh7细胞变得抗TRAIL诱导的细胞凋亡。数据表示为±SD。
图11A-11C.TIMP3的过表达诱导Calu-1TRAIL抗性细胞的细胞凋亡。
图11A.PTEN、TIMP3和PTEN/TIMP3上调后Calu-1细胞的胱天蛋白酶3/7活性。将细胞培养在96孔板中，用PTEN、TIMP3或两者转染所述细胞72小时。转染后48小时，用400ng/ml的TRAIL处理细胞24小时，按照制造商的说明书使用胱天蛋白酶-Glo 3/7测定试剂盒进行分析。在PTEN、TIMP3或PTEN/TIMP3过表达后，Calu-1细胞变得对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感。
图11B.PTEN和TIMP3对细胞死亡的作用。用PTEN和TIMP3质粒转染Calu-1细胞。转染后48小时，用400ng/ml的Super-KillerTRAIL处理细胞24小时。通过Annexin-V评估细胞凋亡。凋亡细胞的百分比在PTEN和TIMP3上调后增加。
图11C.TIMP3过表达后Calu-1细胞的Western印迹。将50微克的总提取物加载至SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上，用指明的抗体对膜进行印迹。TIMP3的过表达激活外部和内部细胞凋亡途径。误差棒表示SD。通过t检验，＊p<0.001。
图12A12G.PTEN和TIMP3沉默在体内对H460细胞的致瘤性的作用。
图12A-12B.显示shPTEN和shTIMP3稳定转染后H460异种移植物的PTEN和TIMP3表达的Western印迹。注射后35天，处死小鼠，通过western印迹分析肿瘤。
图12C-12D.在裸小鼠注射后35天，在利用媒介物(PBS)或TRAIL处理后，sh对照、shPTEN和shTIMP3的H460细胞中的肿瘤移植物尺寸的比较。PTEN和TIMP3的敲低在体内增加TRAIL抗性。图像显示来自每一个类别的5个肿瘤的平均大小的肿瘤。
图12E-12F-12G.利用以sh对照、sh PTEN和shTIMP3稳定转染的H460细胞注射的裸小鼠的植入的肿瘤的生长曲线。数据表示为SD。＊p 0.001。
图13A-13B.miR-221和miR-222的异位表达影响Sk-Hep1细胞的细胞周期分布和迁移/侵袭能力。
图13A.用空载体、miR-221和miR-222、siRNA PTEN转染的Sk-Hep1细胞的流式细胞分布。报告3个独立实验的平均值。
图13B.miR-221和miR-222调节Sk-Hep1细胞的细胞迁移能力。将具有8-μm多孔膜的Transwell***小室用于测定。转染后，用PBS洗涤细胞，将150,000个细胞添加至顶部小室中的无血清培养基中。底部小室充满含有10%FBS的培养基。为了定量迁移的细胞，使用棉签(cotton-tipped swab)除去顶部小室上的细胞，将迁移的细胞固定在PBS,25%戊二醛中，然后使用结晶紫染色。对4个随机视野进行计数。比例尺表示25m。放大倍数对于所有图框都是相同的。
图14A-14B.2’-O-me-抗-mR-221&222减弱Calu-1和Snu-387细胞的细胞迁移和侵袭能力。
图14A.将具有8μm多孔膜的Transwell***小室用于测定。转染后，用PBS洗涤细胞，将50,000个细胞添加至顶部小室中的无血清培养基中。底部小室充满含有10%FBS的培养基。为了定量迁移的细胞，使用棉签除去顶部小室上的细胞，将迁移的细胞固定在PBS,25%戊二醛中，然后使用结晶紫染色。对5个随机视野进行计数。miR-2221及222敲低减少Calu-1和Snu-387细胞的迁移。
图14B.miR-221和miR-222影响Calu-1和Snu-387细胞的侵袭能力。直方图报告用阴性对照miRNA、抗-miR-221或抗-miR-222转染后，侵袭通过Matrigel涂覆的膜的细胞的百分比。数据表示为3个独立测定的±SD。比例尺表示25m。
图15A-15F.c-Jun结合决定其激活的miR-221/222启动子。
图15A.在通过使用MET抑制剂SU11274进行MET抑制后，GTL-16细胞的qRT-PCR。与未处理的细胞相比较，miR-221&222被下调约40%。
图15B.4个不同细胞系的c-Jun和c Fos的表达水平。将50μg的总裂解物加载至12%聚丙烯酰胺凝胶上。Calu-1和Snu-387显示高c-Jun表达，Huh7显示低表达水平，在H460中，c-Jun表达不存在。c-Fos表达水平在Calu-1细胞中非常高，在所有其它细胞系中较低。
图15C.MET、c-Jun和c-Fos下调后，Calu-1细胞的qRT-PCR。在10μl PCR中使用总共5ng的RNA。使用来自合成lin-4miRNA的标准曲线将TaqMan ΔCT值转变成绝对拷贝数。数据表示为与U44和U48rRNA相比较的不同miR的相对表达。miR-221和miR-222在MET和c-Jun但非c-Fos被siRNA敲低后下调，这表明c-Jun是负责miR-221和miR-222激活的转录因子。
图15D-15E.在用具有miR-221和miR-222启动子的不同位点(-150、-600、-1000)的报告质粒和siRNA MET、siRNA c-Jun、siRNAc-Fos共转染后Calu-1细胞的荧光素酶测定。MET和c-Jun siRNA但非c-Fos siRNA能够降低miR-221和miR-222荧光素酶活性。
图15F.c-Met和c-Jun沉默后的Western印迹。MET敲低减少JNK1/2的磷酸化。c-Jun沉默产生增加的PTEN和TIMP3的表达。数据表示为±SD。
图16A-16H.PTEN、TIMP3和MET共标记。对72个肺肿瘤样品进行IHC和ISH。
图16A.单独的c-Met的IHC(棕色)。
图16B.单独的TIMP3(红色)。
图16C.肺癌中的c-Met/TIMP3共标记。
图16D.通过苏木素复染(Hematoxylin Counterstain)显示的细胞核。c-Met仅在癌细胞(大箭头)中表达，而TIMP3在周围的良性细胞(小箭头)中表达。注意，当c-MET存在时，TIMP3不存在，并且反之亦然。
图16E.c-Met(红色)和TIMP3(棕色)在肝细胞癌(分析了60个肿瘤样品)中的共定位。注意，肿瘤细胞表达c-Met并且TIMP3表达不明显。图框还显示癌症的苏木素染色特征，特征在于促***增生型间质中的多个侵入巢(invasive nest)。
图16F.利用配色***(Nuance system)分析相同视野，荧光红代表c-Met，荧光黄代表TIMP3，荧光绿代表被c-Met和TIMP3共标记的细胞。很明显，没有癌细胞被c-Met和TIMP3共标记。
图16G.c-Met和PTEN在肺癌中的共定位。c-Met染色(红色)显示c-Met在癌细胞中的常见细胞膜模式(大箭头)。与其相邻的是间质，良性成纤维细胞和巨噬细胞表达PTEN(棕色-小箭头)但不表达cMET。
图16H.H&E-比例尺表示25m。放大倍数对于所有图框都是相同的。
图17A-17E.MET沉默减少Calu-1和Snu-387细胞的细胞迁移和侵袭并且在体内增强TRAIL敏感性。
图17A.将具有8-μm多孔膜的Transwell***小室用于迁移测定。在用PBS洗涤转染细胞后，将50000个细胞添加至顶部小室中的无血清培养基中。底部小室充满包含10%FBS的培养基。为了定量迁移的细胞，通过使用棉签除去顶部小室上的细胞，将迁移的细胞固定在PBS,25%戊二醛中，然后使用结晶紫染色。对5个随机视野进行计数。
图17B.MET影响Calu-1和Snu-387细胞的侵袭能力。直方图报告用siRNA阴性对照或siRNA MET转染后侵入通过Matrigel涂覆的膜的细胞的百分比。数据表示为3个独立测定的平均值±标准误差。
图17C.显示shMET稳定转染后Calu-1异种移植物的MET表达的Western印迹。注射后35天，处死小鼠，通过western印迹分析肿瘤。
图17D-17E.利用以sh对照和shMET稳定转染的Calu-1细胞注射的裸小鼠的植入的肿瘤的生长曲线。数据表示为SD。＊p 0.01。比例尺表示25m。放大倍数对于所有图框都相同。
序列表
本申请包含已通过EFS-web提交并且通过引用整体并入本文的序列表。2010年11月22日创建的ASCII拷贝称为604_51413_SEQLIST_OSU-10076.txt，大小为7,374字节。
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发明详述
本发明提供了miR-221和miR-222的激活至少部分受MET癌基因和c-Jun转录因子调节，并且这继而下调PTEN和TIMP3。
MET信号转导的激活是在肝癌和肺癌发展中观察到的常见遗传事件。AP-1是二聚碱性区域-亮氨酸拉链蛋白的复合物，属于Jun(c-Jun、JunB、JunD)、Fos(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)、Maf和ATF亚家族。c-Jun是其组中效力最高的转录激活子，其转录活性被JunB减弱以及有时被其拮抗。不能同源二聚化的Fos蛋白与Jun蛋白形成稳定的异二聚体，从而增强它们的DNA结合活性。
本发明人着眼于这两个AP-1亚家族，特别地着眼于c-Jun和c-Fos，虽然他们通过生物信息学研究(TESS数据库)发现ATF-1和JunD也可以是参与miR-221和miR-222激活的潜在转录因子。本发明显示：c-Jun而非c-Fos参与miR-221和miR-222激活以及c-Jun在miR-221/222启动子区域具有一个结合位点。AP-1的诱导主要由JNK级联介导。
通过使用茴香霉素，激活JNK级联的抗生素，本发明人发现：作为c-Jun磷酸化的结果，Huh7肝癌细胞的miR-221/222表达增加。有趣地，当本发明人在无血清培养基中生长Huh7细胞时，他们未观察到miR-221和miR-222或PTEN和TIMP3的表达水平的任何变化，从而显示MET激活对于miR-221和miR-222转录调节和随后的细胞迁移具有重要意义。
为了解决该问题，本发明人研究了MET沉默后Calu-1和Snu-387细胞的迁移和侵袭。两种细胞系的迁移和侵袭能力在MET癌基因沉默后下降(图17A-17B)。
此外，其中通过使用shMET质粒(图17C)使c-Met沉默的Calu-1细胞的异种移植物模型显示，用Calu-1 shMET细胞注射的小鼠与用sh对照注射的小鼠相比较，对TRAIL诱导的细胞凋亡更敏感(图17D-17E)。因此，与对照肿瘤相比较，MET在体内不仅赋予超过对照肿瘤的肿瘤生长有利方面而且还赋予超过对照肿瘤的对TRAIL诱导的细胞凋亡的抗性。因此，MET癌基因调节miR-221和miR-222的水平，从而通过c-Jun转录因子和JNK激活调节细胞侵袭和迁移(图8)。
综合起来，这些数据强调了miR-221和miR-222籍以促进肿瘤发生和转移的机制，其中涉及MET。因此靶向MET受体和/或miR-221和miR-222以使NSCLC和HCC对TRAIL诱导的细胞凋亡致敏而且防止和抑制肺癌和肝细胞癌的方法包括在本发明中。
在本发明中，存在在一大组NSCLC和HCC衍生的细胞系中介导miR-221和miR-222的调节的已鉴定的主要mRNA靶和信号转导途径。体外和体内实验显示NSCLC和HCC中miR-221和miR-222的升高的水平与PTEN和TIMP3下调相关，从而表明这两种microRNA是这些类型的癌症的PTEN和TIMP3的下调的诱因。
本发明人检查了miR-221和miR-222及其靶对细胞存活和TRIL抗性的作用。有趣地，本发明人发现在miR-221/222增强的表达或PTEN和TIMP3的下调后，TRAIL敏感性NSCLC和HCC细胞变得抗TRAIL诱导的细胞凋亡，虽然PTEN的下调比TIMP3的下调略微更有效。
本发明提供了影响miR-221和miR222表达的方法，因为现已证明miR-221和miR-222表达是TRAIL抗性的NSCLC和HCC细胞的“前提”。重要地，基于miR-221/222表达水平的肿瘤分层(tumorstratification)可在NSCLC和HCC的治疗中用作预测TRAIL敏感性或TRAIL抗性的诊断工具。
本发明还公开了miR-221和miR-222阻断PTEN表达，从而导致AKT途径的激活，这显示miR-221和miR-222通过靶向PTEN/AKT途径在细胞生长和侵袭中起着重要作用。在这一点上，细胞周期分析证明细胞生长的增加与G1至S的转换密切相关，这与PTEN以及还有p27kip1(G1/S细胞周期检查点的已知调节剂和PTEN的下游效应物)的调节一致。
过表达miR-221和miR-222的NSCLC和HCC细胞不仅抗TRAIL而且它们与表达较低水平的miR-221和miR-222的细胞相比还显示较迁移和侵袭能力的增强。
此外，本文中还显示miR-221和miR-222通过直接抑制PTEN和TIMP3表达和抑制牵涉AKT和ERK磷酸化的下游途径以及激活MMP-3和MMP-9来促进细胞迁移、侵袭和生长。
此外，H460肿瘤异种移植物中PTEN和TIMP3的丢失在体内不仅赋予超过对照肿瘤的肿瘤生长有利方面而且还赋予超过对照肿瘤的对TRAIL诱导的细胞凋亡的抗性。有趣地，TIMP3敲低肿瘤比对照肿瘤形成更多的血管，突显了其在血管生成和肿瘤形成中的作用。
miR-221和miR-222在体外和体内作为NSCLC和HCC的肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的重要调节剂的鉴定为这些miRNA在肝癌和肺癌发生以及肿瘤行为中的作用提供了见解。
检查了miR-221和miR-222及其靶对细胞存活和TRAIL抗性的作用。有趣地，在miR-221/222增强的表达或PTEN和TIMP3下调后，TRAIL-敏感性NSCLC和HCC细胞变得对TRAIL诱导的细胞凋亡具有抗性，虽然PTEN的下调比TIMP3的下调略微更有效。这表明miR-221及222的过表达是TRAIL抗性的NSCLC和HCC细胞的“前提”。
重要地，基于miR-221/222表达水平的肿瘤分层可以在NSCLC和HCC的治疗中用作预测TRAIL-敏感性或TRAIL抗性的预后工具。
缩写
DNA    脱氧核糖核酸
HCC    肝细胞癌
IL    白细胞介素
ISH  原位杂交
miR  MicroRNA
miRNA  MicroRNA
mRNA  信使RNA
PCR    聚合酶链式反应
pre-miRNA  前体microRNA
qRT-PCR定量逆转录酶聚合酶链式反应
RNA    核糖核酸
siRNA小干扰RNA
snRNA小核RNA
SVM    支持向量机(Support vector machine)
术语
应当理解，上述一般描述和下列详细描述都仅仅是示例性的和解释性的，并且无意限定本教导的范围。在本申请中，除非另外明确地指出，否则单数的使用包括复数。
权利要求和/或说明书中单词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”与术语“包含”结合的使用可表示“一个”，但其还与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含意一致。
同样地，“包含”、“含有”和“包括”以及这些根词的修饰例如但不限于“包括”、“包含的”和“包括”的使用无意是限定的。术语“和/或”意指之前和之后的术语可合在一起或分开。为了举例说明的目的，但非作为限定，“X和/或Y”可表示“X”或“Y”或“X和Y”。
应理解，miRNA来源于基因组序列或基因。在这方面，术语“基因”用于简单地指编码给定的miRNA的前体miRNA的基因组序列。然而，本发明的实施方案可包括参与其表达的miRNA的基因组序列，例如启动子或其它调控序列。
术语“miRNA”通常是指单链分子，但在特定的实施方案中，本发明中使用的分子还可包括这样的区域或另外的链，所述区域或另外的链与相同单链分子的另一个区域或另一个核酸部分地(整个链长度的10至50%的互补)、大体上(超过整个链长度的50%但低于100%的互补)或完全互补。因此，核酸可包括分子，所述分子包含一个或多个互补或自身互补链或包含分子的特定序列的“互补物”。例如，前体miRNA可具有自身互补区，其为至多100%互补的miRNA，本发明的探针可与其靶具有至少60、65、70、75、80、85、90、95或100%的互补性。
如本文中所用，术语“其组合”是指在该术语前所列的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意指包括：A、B、C、AB、AC、BC或ABC的至少一个，并且如果顺序在特定上下文中是重要的话，还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。
除非另外指出，否则按照常规使用使用技术术语。分子生物学中的常用术语的定义可以见于Benjamin Lewin,Genes V,由OxfordUniversity Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.),MolecularBiology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
为了帮助综述本公开内容的各个实施方案，提供特定术语的下列解释：
辅助治疗(Adjunctive therapy)：与主要治疗一起使用以改善主要治疗的效果的治疗。例如，经诊断患有HCC的患者可经历肝切除术(作为主要治疗)以及反义miR-221和miR-222治疗(作为辅助治疗)。
候选者：如本文中所用，治疗的“候选者”是具有TRAIL抗性的TRAIL表达模式的患者。
临床结果：是指在疾病或障碍例如HCC的治疗后或在治疗不存在的情况下患者的健康状态。临床结果包括但不限于直至死亡的时间长度的增加、直至死亡的时间长度的减少、存活机会的增加、死亡、存活、无疾病存活、慢性疾病、转移、晚期或侵袭性疾病、疾病复发、死亡的风险的增加以及对治疗的有利或不良反应。
对照：“对照”是指用于与实验样品例如获自患有TRAIL抗性的癌症的患者的肿瘤样品比较的样品或标准物。在一些实施方案中，对照是获自健康患者的肝样品或获自经诊断患有HCC的患者的非癌细胞组织样品。在一些实施方案中，对照是病历对照(historical control)或标准值(即，先前测试的对照样品或代表基线或正常值的组，例如非癌性组织中的Trail表达模式水平)。
细胞因子：由许多影响其它细胞的行为的造血和非造血细胞产生的蛋白质。细胞因子对于先天性和适应性免疫应答都是非常重要的。
存活的减少：如本文中所用，“存活的减少”是指在患者死亡之前时间长度的减少，或患者的死亡风险的增加。
检测表达的水平：例如，“检测miR-221和miR-222表达的水平”是指定量存在于样品中的miR-221和miR-222的量。检测miR-221和miR-222或任何microRNA的表达可使用本领域中已知的或本文中描述的任何方法例如利用qRT-PCR来实现。检测miR-221和miR-222的表达包括检测miR-221和miR-222的成熟形式或与miR-221和miR-222表达相关联的前体形式的表达。通常，miRNA检测法包括例如利用RT-PCR的序列特异性检测。miR-221和miR-222特异性引物和探针可使用前体以及成熟miR-221和miR-222核酸序列来设计，所述序列在本领域是公知的并且包括不改变序列的功能的修饰。
肝细胞癌(HCC)：HCC是通常在具有因病毒性肝炎、肝毒素或肝硬化(通常由酒精中毒引起的)导致的炎症性肝的患者中发生的肝的原发性恶性肿瘤。
MicroRNA(miRNA，miR)：调节基因表达的单链RNA分子。MicroRNA在长度上通常为21-23个核苷酸。McroRNA从被称为pri-miRNA的初级转录物加工成称为前体(pre)-miRNA的短茎-环结构，最终被加工成功能性成熟microRNA。成熟microRNA分子与一个或多个信使RNA分子部分互补，并且其主要功能是下调基因表达。MicroRNA通过RNAi途径调节基因表达。
miR-221和miR-222表达：如本文中所用，“低miR-221和miR-222表达”和“高miR-miR-221和miR-222表达”是指在样品例如健康或HCC肝样品中发现的miR-221和miR-222的水平的相对术语。在一些实施方案中，低和高miR-221和miR-222表达通过比较一组非癌性肝样品和HCC肝样品的miR-221和miR-222水平来确定。随后可基于样品的miR-221和miR-222的表达是高于(高)还是低于(低)平均值或中位miR-221和miR-222表达水平来将低和高表达赋予每一个样品。对于单个样品，可通过将样品与已知具有高或低表达的对照或参照样品比较，或通过与标准值比较来确定高或低miR-221和miR-222表达。低和高miR-221和miR-222表达可包括miR-221和miR-222的前体或成熟形式或这两种形式的表达。
患者：如本文中所用，术语“患者”包括人和非人动物。进行治疗的优选患者是人。“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
药学上可接受的媒介物：本公开内容中使用的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)，描述了适用于一种或多种治疗性化合物、分子或试剂的药物递送的组合物和制剂。
通常，载体的性质将取决于将应用的具体施用模式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射液体，所述液体包含药学上和生理上可接受的液体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水葡萄糖、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规非毒性固体载体可包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体外，待施用的药物组合物可包含少量非毒性辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸盐或山梨醇酐单月桂酸酯(sorbitan monolaurate)。
预防、治疗或缓解疾病：“预防”疾病(例如HCC)是指抑制疾病的完全发生。“治疗”是指在疾病或病理状况已开始发生后缓解其体征或症状的治疗性干预。“缓解”是指疾病的体征或症状的数目或严重度的减轻。
筛选：如本文中所用，“筛选”是指用于评估和鉴定影响TRAIL表达模式的候选试剂的方法。在一些情况下，筛选包括将候选试剂(例如抗体、小分子或细胞因子)与TRAIL抗性癌细胞接触和测试所述试剂对TRAIL表达模式的影响。microRNA的表达可使用本领域内已知的和本文中描述的许多技术中的任一种，例如通过微阵列分析或通过qRT-PCR来进行定量。
小分子：这样的分子，通常具有小于约1000道尔顿，或在一些实施方案中，小于约500道尔顿的分子量，其中所述分子能够调节靶分子的活性至一定可测量的程度。
治疗性的：包括诊断和治疗的通用词。
治疗剂：当适当地给受试者施用时能够诱导期望的治疗或预防效果的化合物、小分子或其它组合物，例如反义化合物、抗体、蛋白酶抑制剂、激素、趋化因子或细胞因子。例如，TRAIL抗性癌细胞的治疗剂包括阻止或抑制TRAIL抗性癌细胞的发展或转移的试剂。如本文中所用，“候选试剂”是被选择用以筛选以确定其是否可用作TRAIL抗性的癌细胞的治疗剂的化合物。在一些实施方案中，如果所述试剂可转化来自TRAIL抗性癌细胞的细胞，所述候选试剂被鉴定为治疗剂。“温育”包括用于试剂与细胞或组织接触的充足量的时间。“接触”包括将以固体或液体形式存在的试剂与细胞或组织一起温育。利用试剂“处理”细胞或组织包括将所述试剂与细胞或组织接触或一起温育。
治疗有效量：足以在用试剂处理的受试者或细胞中获得期望的效果的指定的药物或治疗剂的量。例如，这可以是减少miR-221和miR-222以及c-Jun的表达或减少miR-221和miR-222的表达并增加PTEN和/或TIMP3，从而预防、治疗或缓解患者的TRAIL抗性的癌细胞的治疗剂的量。所述试剂的有效量将取决于几个因素，包括但不限于被治疗的受试者或细胞以及治疗性组合物的施用方式。
TRAIL表达模式：细胞、细胞培养物或组织样品中的4个基因、包括c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN和TIMP3的相当的表达水平。
TRAIL抗性的TRAIL表达模式：为其中与对照相比较，c-Jun以及miR-221和miR-222的表达高并且PTEN和TIMP3的表达低的TRAIL表达模式。
TRAIL抗性癌细胞、TRAIL抗性癌症、TRAIL抗性肿瘤细胞或肿瘤等：当用TRAIL攻击时，与对照相比较未观察到或几乎未观察到响应于TRAIL的细胞凋亡的细胞(体外、原位、体内)。该定义不需要每一个假定的TRAIL抗性细胞的TRAIL攻击测试满足所述定义；相反地，取样、染色、表型或遗传标志鉴定、已知的TRAIL状态或TRAIL抗性的任何其它暗示在本定义的含义之内。
TRAIL敏感性TRAIL表达模式：为其中与对照相比较，c-Jun以及miR-221和miR-222的表达低并且PTEN和TIMP3的表达高的TRAIL表达模式。
肿瘤、赘生物(neoplasia)、恶性肿瘤或癌症：细胞的异常和不受控制的生长的结果。赘生物、恶性肿瘤、癌症和肿瘤通常可互换使用并且是指因过度细胞***导致的组织或细胞的异常生长。个体的肿瘤的量为可测量为肿瘤的数目、体积或重量的“肿瘤负荷”。不转移的肿瘤被称为“良性的”。侵袭周围组织和/或可转移的肿瘤被称为“恶性的”。
肿瘤-结节-转移(Tumor-Node-Metastasis)(TNM)：恶性肿瘤的TNM分类是用于描述患者身体的癌症的程度的癌症分期***。T描述原发性肿瘤的大小以及其是否已侵入附近组织；N描述了被牵涉的任何淋巴节；以及M描述转移。TNM由国际抗癌联盟(InternationalUnion Against Cancer)发展和维持以在用于分类癌症的扩散程度的一个全球公认的标准上达成一致。TNM分类也由美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)和国际妇产科学联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics)使用。
在一些实施方案中，对照是获自相同患者的非癌性组织样品。在其它实施方案中，对照是获自健康受试者例如健康肝供体的肝样品。在另一个实例中，对照是从历史值计算的标准。可根据本领域已知的任何方法获得肿瘤样品和非癌性组织样品。例如，可从已经历肝切除术的HCC患者获自肿瘤和非癌性样品，或它们可通过使用皮下针头提取，通过显微解剖或通过激光捕获获得。对照(非癌性)样品可以例如从尸体器官供体或从健康肝供体获得。
在一些实施方案中，筛选包括将候选试剂与细胞接触。细胞可以是获自患者的原代细胞，或细胞可以是永生化或转化的细胞。
候选试剂可以是任何类型的试剂例如蛋白质、肽、小分子、抗体或核酸。在一些实施方案中，候选试剂是细胞因子。在一些实施方案中，候选试剂是小分子。筛选包括高通量筛选和筛选单一或小组候选试剂。
检测RNA表达的方法
前体microRNA(pre-miRNA)和成熟miRNA的序列是例如通过miRBase数据库公共可获得的，可通过Sanger研究所(参见Griffiths-Jones等人,Nucleic Acids Res.36:D154-D158,2008；Griffiths-Jones等人,Nucleic Acids Res.34:D140-D144,2006；和Griffiths-Jones,Nucleic Acids Res.32：D109-D111,2004)在线获得。
RNA表达的检测和定量可通过本领域技术人员公知的(参见，例如，美国专利申请公开案No.2006/0211000和2007/0299030，通过引用并入本文)和下列描述的许多方法的任一方法来实现。通过使用RNA家族成员的已知序列，适当时，可设计用于下述检测方法的特异性探针和引物。
在一些情况下，RNA检测法要求从样品例如细胞或组织样品分离核酸。核酸，包括RNA，具体地miRNA，可使用本领域已知的任何适当的技术来分离，例如，基于酚的提取是用于RNA分离的常用方法。基于酚的试剂包含用于细胞和组织破坏以及随后将RNA与污染物分离的变性剂和RNA酶抑制剂的组合。基于酚的分离法可回收10至200个核苷酸范围内的RNA种类(例如，前体和成熟miRNA、5S和5.8S核糖体RNA(rRNA)和U1小核RNA(snRNA))。此外，提取方法例如使用TRIZOLTM或TRI REAGENTTM的提取法可纯化所有RNA(大的和小的)，并且是用于从生物样品分离总RNA的高效方法，所述总RNA包含miRNA和小干扰RNA(siRNA)。
微阵列
微阵列是核酸、蛋白质、小分子、细胞或其它物质的微型有序的阵列，其使得能够平行分析复杂的生物化学样品。DNA微阵列由称为捕获探针的不同核酸探针组成，所述探针被化学连接至固体基质，所述固体基质可以是微芯片、载玻片或微球体大小的珠子。可以将微阵列例如用于同时测量大量信使RNA(mRNA)和/或miRNA的表达水平。
可使用多种技术，包括利用尖细的针(fine-pointed pin)打印至载玻片上，使用预制的遮蔽物进行光刻、使用动态微镜装置(dynamicmicromirror device)进行光刻、喷墨打印或在微电极阵列上进行电化学来制作微阵列。
miRNA的微阵列分析，例如(虽然这些方法可以以改进的形式用于任何RNA分析)可根据本领域已知的任何方法来实现(参见，例如，PCT公开案WO 2008/054828；Ye等人,Nat.Med.9(4):416-423,2003；Calin等人，N.Engl.J.Med.353(17):1793-1801,2005，将所述每一个公开案和文献通过引用并入本文)。在一个实例中，从细胞或组织样品提取RNA，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从总RNA按大小选择小RNA(18-26个核苷酸的RNA)。将寡核苷酸接头连接至小RNA的5'和3'末端，将所得的连接产物用作RT-PCR反应的模板，使用10个扩增循环。有义PCR引物具有连接至其5'末端的荧光基团，从而荧光标记PCR产物的有义链。将PCR产物变性，随后将其与微阵列杂交。PCR产物，称为靶核酸(其与阵列上的相应miRNA捕获探针序列互补)将通过碱基配对与其上固定有捕获探针的点杂交。当使用微阵列激光扫描仪激发时，所述点将发荧光。随后使用许多阳性和阴性对照以及阵列数据标准化法，就特定miRNA的拷贝数估计每一个点的荧光强度，这可产生特定miRNA的表达水平的评估。
在备选方法中，直接使用从细胞或组织样品提取的包含小RNA级分(包括miRNA)的总RNA而无需小RNA的大小选择，以及标记的3'末端，使用T4RNA连接酶和荧光标记的短RNA接头。通过在30°C温育2小时，然后在80°C下进行5分钟热灭活T4 RNA连接酶来标记RNA样品。与阵列上的相应的miRNA捕获探针序列互补的荧光标记的miRNA通过碱基配对与其上固定有捕获探针的点杂交。如上所述进行微阵列扫描和数据处理。
可以利用几种类型所使用的微阵列，包括斑点寡核苷酸微阵列(spotted oligonucleotide microarray)、预制寡核苷酸微阵列(pre-fabricated oligonucleotide microarray)和斑点长寡核苷酸阵列(spotted long oligonucleotide array)。在斑点寡核苷酸微阵列中，捕获探针为与miRNA序列互补的寡核苷酸。通常将该类型的阵列与用两种不同荧光团标记的来自待比较的两个样品(例如非癌性组织和HCC肝组织)的经大小选择的小RNA的扩增PCR产物杂交。或者，从两个样品提取包含小RNA级分(包括miRNA)的总RNA，直接使用所述总RNA而无需小RNA的大小选择，以及标记的3'末端，使用T4RNA连接酶和利用两种不同荧光团标记的短RNA接头。可混合样品，将其与一个单一微阵列杂交，随后扫描微阵列，从而在一个测定中使上调和下调的miRNA基因可视化。
在预制寡核苷酸微阵列或单通道微阵列中，设计探针以匹配已知或预测的miRNA的序列。存在商购可得的覆盖完整基因组的设计(例如，来自Affymetrix或Agilent)。此类微阵列评估基因表达的绝对值，从而两种状况的比较需要使用两个独立的微阵列。
斑点长寡核苷酸阵列由50至70聚体的寡核苷酸捕获探针组成，通过喷墨或自动化打印产生。短寡核苷酸阵列由20-25聚体寡核苷酸探针组成，通过光刻合成(Affymetrix)或通过自动化打印产生。
定量RT-PCR
定量RT-PCR(qRT-PCR)是用于快速测量聚合酶链式反应的产物的量的聚合酶链式反应的改进。qRT-PCR通常用于确定基因序列例如miR是否存在于样品中，以及样品中的拷贝数(如果其存在的话)的目的。可测定核酸分子、包括miRNA的表达的PCR的任何方法落在本公开内容的范围内。存在本领域已知的qRT-PCR法的几个变型，下面描述其中的3个。
用于定量聚合酶链式反应的方法包括但不限于通过琼脂糖凝胶电泳，SYBR绿(双链DNA染料)的使用和荧光报道分子探针的使用。后两者可进行实时分析。
对于琼脂糖凝胶电泳，利用已知浓度的相似大小片段的靶DNA制备未知样品和已知样品以用于扩增。在相同条件下(优选使用相同引物，或至少具有相似退火温度的引物)运行两个反应，进行相同的时间长度。将琼脂糖凝胶电泳用于将反应产物与其原始DNA和剩余引物分离。测量已知和未知样品的相对量以测定未知的量。
SYBR绿染料的使用比琼脂糖凝胶法更精确，并且可产生实时结果。DNA结合染料结合所有新合成的双链DNA，测量荧光强度的增加，从而使得能够测定初始浓度。然而，SYBR绿将标记所有双链DNA，包括任何不希望的PCR产物以及引物二聚体，从而导致潜在的复杂性和人工假像。常规地制备反应物，加入荧光双链DNA染料。运行反应，监测荧光的水平(染料仅当与双链DNA结合时才发荧光)。通过参考标准样品或标准曲线，可测定PCR中的双链DNA浓度。
荧光报道分子探针法使用基于序列特异性核酸的探针，以仅定量所述探针序列而非所有双链DNA。其通常利用在相邻位置上具有荧光报道分子和猝灭剂的基于DNA探针(所谓的双标记探针)来进行。报道分子与猝灭剂的紧密相邻阻止其荧光；只有在探针断裂的情况下才可检测到荧光。该方法依赖于参与的聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性。
通过添加双标记探针制备实时定量PCR反应物。当双链DNA模板变性时，探针能够结合模板DNA的目标区域中的其互补序列。当将PCR反应混合物加热以激活聚合酶时，聚合酶开始合成引发的单链模板DNA的互补链。随着聚合继续，其到达与其互补序列结合的探针，随后因聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性而被水解，从而将荧光报道分子与猝灭分子分开。这导致荧光的增加，其被检测。在实时PCR反应的热循环过程中，监测荧光(如从每一个PCR水解的杂交的双标记探针释放的)的增加，这使得能够精确地测定终DNA的量，从而使得能够测定初始DNA的量。
原位杂交
原位杂交(ISH)将核酸杂交的技术应用和扩展至单细胞水平，并且与细胞化学、免疫细胞化学和免疫组织化学的领域组合，允许维持形态学和鉴定待维持和鉴定的细胞标记，以及使得能够将序列定位至群体例如组织和血液样品中的特定细胞。ISH是一种类型的杂交，其使用互补核酸来将一种或多种特定核酸序列定位在一部分组织或组织切片中(原位)，或者，如果组织足够小，定位在整个组织中(整装ISH(whole mount ISH))。RNA ISH可用于测定组织的表达模式，例如miRNA的表达。
处理样品细胞或组织以增加它们的通透性以允许探针例如miRNA-特异性探针进入细胞。将探针添加至处理的细胞，从而使得在适当的温度下杂交，洗去过量的探针。用放射性、荧光或抗原性标签标记互补探针以便可使用放射自显影术、荧光显微镜检查或免疫测定来测定组织中探针的定位和量。样品可以是本文中描述的任何样品，例如非癌性或HCC肝样品。因为miR-26家族成员的序列是已知的，因此可相应地设计miR-26探针以便探针特异性结合miR-26。
原位PCR
原位PCR是在ISH之前靶核酸序列的基于PCR的扩增。为了检测RNA，引入细胞内逆转录步骤以在原位PCR之前从RNA模板产生互补DNA。这使得能够检测低拷贝的RNA序列。
在原位PCR之前，固定细胞或组织样品，对其进行透化以保持形态学并且允许PCR试剂与待扩增的细胞内序列接触。接着在悬浮液中保持的完整细胞中或直接在细胞离心制剂(cytocentrifuge preparation)中或载玻片上的组织切片中进行靶序列的PCR扩增。在前一个方法中，使用常规热循环仪对悬浮在PCR反应混合物中的固定细胞进行热循环。在PCR后，将细胞离心分离至载玻片上，通过ISH或免疫组织化学使细胞内PCR产物可视。通过在盖玻片下用PCR混合物覆盖样品而在载玻片上进行原位PCR，随后密封盖玻片以防止反应混合物的蒸发。通过将载玻片直接放置于常规或专门设计的热循环仪的加热块的顶部或通过使用热循环炉实现热循环。
通常利用两个不同技术：间接原位PCR(利用PCR产物特异性探针通过ISH进行的)或直接原位PCR(通过直接检测标记核苷酸(例如地高辛-11-dUTP、荧光素-dUTP、3H-CTP或生物素-16-dUTP，所述标记核苷酸在热循环过程中已被掺入PCR产物)而不用ISH进行的)之一实现细胞内PCR产物的检测。
miR-221和miR-222以及c-Jun、PTEN和TIMP3用作预后的预测标志和用于鉴定用于治疗TRAIL抗性癌细胞的治疗剂的用途。
本文中公开了miR-221和miR-222、c-Jun、PTEN和TIMP3的表达模式是TRAIL抗性患者的存活预后的预测物。具有与来自相同受试者或来自健康受试者的非癌性组织相比较的高miR-221和miR-222以及c-Jun表达连同低PTEN和TIMP3表达的TRAIL抗性癌细胞样品(例如，组织活检样品)预测存活的减少。因此，肿瘤的TRAIL抗性表达模式状态可用作TRAIL抗性癌症患者的预后的临床工具。
在一些实施方案中，直接将本文中的标志物在TRAIL抗性肿瘤样品中的表达水平与来自相同患者的周围非癌性组织的TRAIL抗性表达模式相比较。
在其它实施方案中，将肿瘤样品的TRAIL抗性表达模式与获自健康受试者例如肝供体的肝样品的TRAIL抗性表达模式相比较。在一些情况下，用作对照样品的非癌性组织获自尸体。在其它实施方案中，将肿瘤样品的TRAIL抗性表达模式与基于病历值的标准水平相比较。例如，可基于获自受试者组群的非癌性肝组织样品的平均TRAIL抗性表达模式设置标准。例如，受试者的组群可以是临床试验招募的一组HCC患者。受试者的组群还可以是一组尸体器官供体。
发现相对于对照的HCC肿瘤样品中的TRAIL抗性表达模式的发现表示患者的不良预后和将患者鉴定为专科疗法(specialized therapy)的良好候选者。如本文中所用，“不良预后”通常是指存活的减少或换句话说，死亡风险的增加或直至死亡的时间的减少。不良预后还可指疾病的严重度的增加，例如癌症至其它器官的扩散(转移)的增加。在一个实施方案中，当各个标志物显示相对于对照表达增加1.5倍或减少2/3时，发现TRAIL抗性表达模式。在其它实施方案中，TRAIL抗性表达模式通过与对照相比较TRAIL抗性表达模式的标志物增加至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍或至少4倍或减少1/2、2/5、1/3、2/7或1/4来表示。
具有拥有TRAIL敏感性表达模式的TRAIL抗性肿瘤的患者具有更好的存活概率的发现表明：减少c-Jun、miR-221和miR-222表达并且增加PTEN和TIMP3表达的化合物可用作用于治疗TRAIL抗性肿瘤的治疗剂。
因此，本文中提供了鉴定用于治疗TRAIL抗性癌细胞的治疗剂的方法，包括体外筛选候选试剂以选择促进从TRAIL抗性的TRAIL表达模式至TRAIL敏感性TRAIL表达模式的转化的试剂。在一些实施方案中，筛选包括将候选试剂与TRAIL抗性癌细胞接触和检测TRAIL表达模式的任何改变。TRAIL抗性癌细胞可以是获自患者的原代细胞，获自患者的永生化或转化的细胞，或细胞可以是商购可得的永生化细胞系，例如但不限于MHCC97、HepG2、Hep3B或SNU-423细胞。
在用候选试剂治疗后向TRAIL敏感性表达模式的转化将所述试剂鉴定为用于治疗TRAIL抗性癌症的治疗剂。筛选候选试剂以鉴定用于治疗疾病的候选试剂的方法在本领域是公知的。检测RNA和蛋白质的表达水平的方法在本领域中是公知的并且描述于本文中，例如，但不限于微阵列分析、RT-PCR(包括qRT-PCR)、原位杂交、原位PCR和Northern印迹分析。在一个实施方案中，筛选包括高通量筛选。在另一个实施方案中，单个地筛选候选试剂。
候选试剂可以是任何类型的分子，例如但不限于核酸分子、蛋白质、肽、抗体、脂质、小分子、化学品、细胞因子、趋化因子、激素或可直接或间接改变TRAIL表达模式的任何其它类型的分子。在一些实施方案中，候选试剂可以是在NFκB/IL-6信号转导途径中起作用的分子。在其它实施方案中，候选试剂是在IL-10、STAT3或干扰素可诱导因子的信号转导网络中起作用的分子。在一个实施方案中，候选试剂是细胞因子。在另一个实施方案中，候选试剂是小分子。
本文中还描述了用于表征TRAIL抗性癌症的方法，其中TRAIL抗性癌症的至少一个特征选自下列一项或多项：TRAIL抗性癌症的存在或不存在；TRAIL抗性癌症的诊断；TRAIL抗性癌症的预后；治疗结果预测；治疗结果监测；TRAIL抗性癌症对治疗的适合性，例如TRAIL抗性癌症对化学疗法治疗和/或放射疗法治疗的适合性；TRAIL抗性癌症对激素治疗的适合性；TRAIL抗性癌症对通过侵入性手术去除的适合性；TRAIL抗性癌症对组合辅助治疗的适合性。
本文中还描述了用于检测TRAIL抗性癌症的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种包含c-Jun和miR-221和miR-222或miR-221和miR-222和PTEN和/或TIMP3的检测探针。试剂盒可以以寡核苷酸阵列的形式存在或包括寡核苷酸阵列。
本文中还描述了用于确定TRAIL抗性癌症患者对治疗的适合性的方法，包括：i)从患有TRAIL抗性癌症的患者分离至少一个组织样品；和ii)进行至少一个组织样品的表征和/或利用检测探针以鉴定TRAIL表达模式；iii)基于步骤ii)中鉴定的至少一个特征，诊断患者的生理状态；iv)基于步骤iii)中获得的诊断，确定患者是否从TRAIL抗性癌症的治疗获益。
在某些实施方案中，癌症的至少一个特征选自下列一项或多项：癌症的存在或不存在；癌症的类型；癌症的来源；癌症的诊断；癌症的预后；治疗结果预测；治疗结果监测；癌症对治疗的适合性，例如癌症对化学疗法治疗和/或放射疗法治疗的适合性；癌症对激素治疗的适合性；癌症对通过侵入性手术去除的适合性；癌症对组合辅助治疗的适合性。
本文中还描述了用于确定癌症对于治疗的适合性的方法，其中癌症的至少一个特征是癌症对治疗的适合性，例如癌症对化学疗法治疗和/或放射疗法治疗的适合性；癌症对激素治疗的适合性；癌症对通过侵入性手术去除的适合性；癌症对组合辅助治疗的适合性。
本文中还描述了用于确定癌症患者的可能预后的方法，包括：i)从患有癌症的患者分离至少一个组织样品；和ii)表征至少一个组织样品以鉴定TRAIL表达模式；其中所述特征允许确定癌症患者的可能预后。
提供下列实施例以举例说明某些特定的特征和/或实施方案。这些实施例不应当解释为将公开内容限定于所述的特定特征或实施方案。
实施例
实施例I：miR-221和miR-222直接靶向PTEN和TIMP33’UTR。
为了鉴定假定的miR-221和miR-222靶，进行了生物信息学研究(Targetscan,Pictar,RNhybrid)。在候选靶中，人PTEN的3’-UTR(核苷酸200-207，NM_000314)和人TIMP3的3’-UTR(核苷酸2443-2449，NM_000362)包含与hsa-miR-221和miR-222的种子序列匹配的区域(图1A)。为了确定PTEN和TIMP3是否是miR-221和miR-222的直接靶，将包含miR-221/222结合位点的PTEN和TIMP33’UTR克隆在荧光素酶开放阅读框的下游。将此类报道分子构建体用于转染MEG01细胞，所述细胞表达极低水平的miR-221和miR-222(图1B)并且是可高度转染的(Freson等人，2005)。通过qRT-PCR确认的转染后此类miR的增加的表达(图1B)显著影响荧光素酶的表达，测量为相对荧光活性(图1C)。相反地，当通过使用具有PTEN和TIMP3mRNA的3’UTR的质粒(其中miR-221和miR-222的结合位点被定点诱变失活)进行荧光素酶测定时，观察到miR-221和miR-222抑制效应的一致降低(图1C)。为了确定这些microRNA是否影响PTEN和TIMP3在H460细胞环境中的表达，分析了miR-221和miR-222在H460细胞中的异位表达的后果。利用qRT-PCR(图1D)确认转染后这些miR的增加的表达，随后利用Western印迹(图1E)分析对PTEN和TIMP3的内源水平的作用；与用无规pre-miR转染的H460细胞相比较，miR-221和miR-222的过表达显著降低PTEN和TIMP3的内源水平。相反地，具有高水平内源miR-221和miR-222的Calu-1-肺衍生的细胞中2’-O-me-抗-miR-221和2’-O-me-抗-miR-222对miR-221和miR-222的敲低(利用qRT-PCR(图1F)验证)升高了PTEN和TIMP3的蛋白质水平(图1G)。吸引人地，通过定量RT–PCR，发现PTEN但非TIMP3mRNA水平在miR-221和miR-222转染的细胞中被强烈降低(图1H)，从而表明miR-221和miR-222诱导PTENmRNA的降解，然而TIMP3仅在翻译水平上受此类microRNA调节。因此PTEN和TIMP33’UTR是miR-221和miR-222的直接靶。
实施例II：NSCLC和HCC中miR-221和miR-222与PTEN和TIMP3的表达反相关
通过一大组的原发性NSCLC和HCC的Northern印迹评估与正常对应物相比较的miR-221和miR-222的内源水平。miR-221和miR-222表达在正常肺和肝细胞中几乎检测不到，但在大部分肿瘤细胞系中高度表达(图2A)。此外，如通过Western印迹所评估的，在大多数分析的细胞系中发现miR-221和miR-222RNA表达与PTEN和TIMP3蛋白质表达之间的反相关，这也被qRT-PCR确认(图2B)。未测试TIMP3mRNA表达水平，因为在增强的miR-221和miR-222表达后未观察到TIMP3mRNA的下调(图1H)。这些结果表明miR-221和miR-222的高表达是用于负调节NSCLC和HCC中的PTEN和TIMP3的机制之一。
为了验证这些microRNA是否也在HCC中影响PTEN和TIMP3的内源水平，进行了表达低水平的miR-221和miR-222的Sk-Hep1细胞系的miR-221和miR-222的异位表达的作用的分析。如图3A中所示，PTEN和TIMP3蛋白在miR-221和miR-222过表达后在Sk-Hep1细胞中降低。相反地，表达高水平的内源miR-221和miR-222的Snu-387细胞中2’-O-me-抗-miR-221和2’-O-me-抗-miR-222对miR-221和miR-222的敲低升高PTEN和TIMP3的蛋白质水平(图3A)。
由于已注意到：miR-221和miR-222下调NSCLC和HCC衍生的细胞培养物中的PTEN和TIMP3表达，因此研究了体内调节。为了回答该问题，通过qRT-PCR研究了与正常人肺组织样品相比较，原代肺肿瘤样品的PTEN mRNA和miR-221&222表达。miR-221和miR-222在正常人肺样品几乎检测不到，并且在所有分析的肿瘤样品中高度表达。在检查的22个原发性肺肿瘤中，事实上全部都展示PTEN的下调以及miR-221和miR-222的过表达(图3B)。这些数据进一步支持PTEN在体内也是miR-221和miR-222的直接靶。
为了证实这些发现，通过使用5’-地高辛-标记的LNA探针在肝癌和正常肝组织上进行了原位杂交分析，然后对PTEN和TIMP3进行免疫组织化学分析(图3C)。miR-221/222与PTEN/TIMP3表达在肝癌和相邻正常/硬变肝组织中反相关。肝癌细胞显示miR-221/222的高表达和极低表达的PTEN或TIMP3(图3CG-H-K-L)，而相邻非恶性肝表达丰富的PTEN和TIMP3并且极少显示可检测的miR-221/222信号(图3CA-B-E-F)。miR-221/222与PTEN/TIMP3表达在肺癌和相邻正常肺组织也呈反相关(图9)。大部分癌细胞对于miR-221和miR-222呈阳性并且对于PTEN(图9F-9G)和TIMP3(图9I-9J)呈阴性。在图9I-9J中，miRNA表达在癌细胞中是明显的并且TIMP3表达在周围细胞中是明显的。在正在浸润相邻纤维变性的肺组织的肿瘤细胞巢中发现强miR-222信号(大箭头)(图9K-9L)。
实施例III.miR-221和miR-222通过靶向PTEN和TIMP3诱导NSCLC和HCC的TRAIL抗性
研究了miR-221和miR-222和/或PTEN-TIMP3沉默对NSCLC和HCC的细胞存活和TRAIL抗性的作用。首先对5个HCC衍生的细胞系进行增殖测定，其中有3个(HepG2、Sk-Hep1和Huh 7)具有低miR-221-222表达；2个(PLC/PRF-5和Snu-387)具有高miR-221-222表达水平(图4A)。将细胞暴露于TRAIL 24小时，随后使用MTT测定评估细胞增殖。有趣地，表达低水平的miR-221和miR-222的细胞经历TRAIL诱导的细胞死亡，显示了极低的增殖率，然而过表达miR-221和miR-222的细胞当暴露于可溶性TRAIL时未显示敏感性(图4A)。
此外，对TRAIL敏感性细胞系Sk-Hep1细胞(图4B-4C)、HepG2和Huh7(图10A-10B)进行的Annexin-FITC和胱天蛋白酶3/7测定显示：在miR-221和miR-222过表达后以及通过PTEN和TIMP3siRNA进行PTEN和TIMP3沉默后，TRAIL抗性增加约30-40%。TRAIL敏感性H460细胞在PTEN和TIMP3敲低后也变得对TRAIL诱导的细胞凋亡更具抗性，如通过胱天蛋白酶3/7活性(图4D)和Annexin-FITC测定(图4E)所测定的，虽然PTEN沉默比TIMP3更有效。
此外，为了进一步评估这些靶对TRAIL诱导的细胞凋亡的贡献，将PTEN和TIMP3序列克隆在pCruz-HA质粒(Santa Cruz)中并且用于转染Calu-1TRAIL抗性细胞。Calu-1细胞在PTEN和TIMP3单独或组合地恢复后变得对TRAIL诱导的细胞凋亡更敏感，如通过胱天蛋白酶3/7活性(图4D)和Annexin-FITC染色(图11A-11B)所测定的。为了进一步研究TIMP3在TRAIL诱导的细胞凋亡中的作用，在Calu-1细胞系中过表达TIMP3后，利用western印迹测试胱天蛋白酶-3、-8、-9、多聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)和一些参与TRAIL信号转导途径的分子的表达(图11C)。有趣地，观察到PARP和胱天蛋白酶级联的激活，如通过切割的片段的出现所评估的。此外，Mcl-1表达被下调然而细胞色素c表达增加(图11C)。
综合起来，这些结果表明TIMP3参与外部和内部细胞凋亡途径并且突显了其在TRAIL诱导的细胞凋亡中的作用。在于Snu-387细胞中恢复TIMP3后获得了相同的结果(数据未显示)。
此外，在于H460细胞中增强miR-221和miR-222的表达后或于Snu-387中进行miR-221/222沉默后，实现了一些参与PI3K/AKT途径的蛋白质的表达和/或激活达到。如图5A中所示，在Snu-387细胞中，PI3K、AKT及其磷酸化底物磷酸化糖原合酶激酶3的表达水平被miR-221和miR-222的异位表达升高，并且，相反地，被miR-221和miR-222的敲低降低，从而表明miR-221和miR-222靶向PTEN/AKT途径(图5B)。
进一步研究了此类蛋白质的激活和表达水平。发现与用对照miR转染的H460细胞相比较，ERK磷酸化和PAK1表达增加(图5C)。有趣地，作为TIMP3下调的可能结果，还发现增加的金属肽酶3和金属肽酶9的表达(图5A-5C)。为了测试先前蛋白质的激活是否是PTEN和/或TIMP3依赖性的，在H460细胞中沉默PTEN和TIMP3。如图5D和E中显示的，ERK和PAK1的激活都是PTEN和TIMP3依赖性的，而AKT磷酸化是PTEN依赖性的并且MMP3和MMP9在TIMP3敲低后被上调。
最后，研究了AKT的抑制，因为其与其是否使miR-221&222诱导的细胞存活和TRAIL抗性无效相关。用2’-O-甲基(2’-O-me)-抗-miR-221和miR-222寡核苷酸转染Calu-1和Snu-387。将用2’-O-me-无规miR转染的细胞用作对照。阻断miR-221和miR-222的表达明显地使此类细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感，如通过胱天蛋白酶3/7测定估量的(图5F-5G)。此外，在使用或不使用TRAIL的情况下，用特异性AKT抑制剂API-2/曲西立滨处理Calu-1和Snu-387细胞。如图5F和5G中显示的，API-2消除了miR 221&222激活的AKT并且显著地抑制miR-221和miR-222诱导的细胞存活和TRAIL抗性。
然后，为了直接比较具有和不具有PTEN和TIMP3的肿瘤的生长，将被设计用以敲低基因表达的短发夹RNA(shRNA)构建体用于沉默H460细胞的PTEN和TIMP3。将编码不导致任何已知细胞mRNA的特异性降解的无规shRNA序列的shRNA质粒用作对照。通过将H460PTEN和TIMP3敲低细胞植入裸小鼠的右背面来体内评估PTEN和TIMP3破坏对肿瘤生长和TRAIL抗性的作用。在此之后5天，开始TRAIL处理，此时肺癌已建立。PTEN和TIMP3丢失(图12A)在体内不仅赋予超过对照肿瘤的显著肿瘤生长有利方面而且还赋予超过对照肿瘤的对TRAIL诱导的细胞凋亡的抗性(图124B-12C-12D-2E-12F-12G)。
总之，PTEN和TIMP3是TRAIL抗性中的重要靶并且在NSCLC和HCC细胞的致瘤性中起着重要作用。
实施例IV.miR-221和miR-222对PTEN和TIMP3的下调诱导NSCLC和HCC细胞的迁移和侵袭性
为了直接测试miR-221/222在肿瘤发生中的功能作用，在H460和Sk-Hep1细胞中过表达这两个microRNA，或沉默PTEN和TIMP3。随后，通过细胞周期分析，miR-221和miR-222以及PTEN siRNA转染的H460细胞显示G1的减少以及S和G2-M期的相应增加(图6A)。在72小时的转染后，分析显示通过miR-221和miR-222或PTEN敲低诱导的DNA合成的更早发生，同时伴随着G1细胞的更快速减少，这促成了增殖有利方面(图6A)。在Sk-Hep1细胞中观察到了相同的改变(图13A)。
然后，本发明人分析了miR-221和miR-222的过表达对NSCLC和HCC细胞的细胞迁移和侵袭的作用。有趣地，观察到在miR-221和miR-222过表达后以及PTEN和TIMP3下调后，H460和Sk-Hep1(图113B)细胞的迁移(图6B-6C)和侵袭(图6D)能力的显著增强。相反地，当通过利用2’-O-me-抗-miR-221和miR-222的转染下调miR-221和miR-222时，观察到Calu-1和Snu-387细胞的细胞迁移和侵袭的减少(图14A-14B)。
实施例V.MET通过AP-1转录因子控制miR-221和miR-222的激活
通过在Calu-1和Snu-387细胞以及在胃细胞系(GTL16)(先前报导其因DNA扩增而过表达MET癌基因(Giordano等人，1989))中使用siRNA来沉默MET。首先，利用qRT-PCR评估miR-221&222的表达水平。在MET敲低后，miR-221和miR-222的表达在所有分析的细胞系中被下调(图7A-7B-7C)。通过用MET抑制剂SU11274处理CTL16细胞获得了相同结果(图15A)。
其次，通过免疫染色，在MET下调或抑制后观察到增加的PTEN和TIMP3表达水平，这表明MET参与miR-221和miR-222激活(图7D-7E-7F)。
然后，通过生物信息学研究(TESS  数据库：http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)，发现经预测结合和转录激活miR-221/222启动子的参与MET途径的唯一转录因子为AP-1。AP-1是属于Jun和Fos亚家族的二聚碱性区域-亮氨酸拉链蛋白。c-Jun是其组中效力最高的转录激活物。
为了鉴定哪个因子属于参与miR-221/222的转录激活的AP-1家族，研究了4个不同细胞系(H460、Calu-1、Huh7和Snu-387)中miR-221和miR-222的表达与c-Jun和c-Fos蛋白质水平之间的关系(图S7B)。用MET siRNA、c-Jun siRNA或c-Fos siRNA共转染高度表达c-Jun和c-Fos的Calu-1。随后的qRT-PCR扩增显示MET和c-Jun下调，但非c-Fos敲低，产生miR-221和miR-222表达水平的约~45-50%的下降，如与阴性对照相比较的(图S7C)。
为了进一步确认这些结果，进行荧光素酶测定。在先前的工作中，本发明人发现miR-221和miR-222被转录成单一种类的2.1kb RNA并且转录受位于离miR-222发夹结构的5’末端-150bp/50bp的上游序列调控。为了确定先前鉴定的miR-221和miR-222启动子区域是否受MET/AP1影响，通过使用包含跨越+3至-150、+3至-600、+3至-1000(+1位置对应于miR-222发夹的5’末端)(图7G)进入pGL3basic载体的片段的报导基因质粒进行荧光素酶测定，所述pGL3basic载体具有启动子-较少荧光毒酶基因(Di Leva等人，未发表的数据)。将pGL3b、-150、-600和-1000pGL3b与MET siRNA、c-Jun siRNA或c-Fos siRNA共转染入Calu-1细胞(图15D-15E)。
随后的荧光素酶测定显示MET和c-Jun下调产生与通过利用pGL3b空载体的转染测定的基线活性相比较~45%的荧光素酶活性的下降；本发明人在c-Fos siRNA转染后未观察到荧光素酶活性的降低(图15D-15E)。
这些数据表明c-Jun而非c-Fos是参与MET途径的转录因子，负责NSCLC和HCC细胞的miR-221和miR-222的激活。
由于启动子区域对c-Jun调节起反应，因此为了验证c-Jun对miR-221和miR-222启动子的直接结合，进行了染色质免疫沉淀(ChIP)测定。首先，通过生物信息学分析，发现只有一个AP-1假定的结合位点位于premiR-222-5’末端的上游~130bp。通过考虑预测的AP-1结合位点，分析了总共2个染色质区域(图7G)：一个跨越AP-1结合位点，第二个作为阴性对照位于pre-miR-222-5’末端的上游~1700nt，其中本发明人未发现AP-1的任何预测的结合位点。c-Jun阳性Calu-1和Snu-387细胞的ChIP测定显示在与启动子接近的ChIP分析的区域2上显著的AP-1结合(图7H-7I)。在c-Jun阴性H460细胞中未观察到染色质被c-Jun ChIP富集，从而验证了ChIP测定的特异性。
最后，用茴香霉素(能够激活JNK激酶的抗生素)处理显示低水平的miR-221&222的Huh7细胞，从而检查AP-1、miR-221和miR-222以及PTEN-TIMP3表达水平。在通过茴香霉素激活c-Jun(图7M)后，miR-221和-222表达增加(miR-221=80%，miR-222=40%)，如通过qRT-PCR确认的(图7L)，然而PTEN和TIMP3的表达水平急剧下降(图7M)。为了进一步证明JNK是c-Met和c-Jun之间的中间信号转导因子并且c-Jun敲低导致增加的PTEN和TIMP3表达，研究了Calu-1细胞的c-Met和c-Jun，分别分析JNK1/2磷酸化以及PTEN和TIMP3的表达。如图S7F中显示的，MET的敲低减少JNK1/2的磷酸化，而c-Jun沉默增加PTEN/TIMP3表达，其为miR-221和miR-222下调的结果。
为了研究MET与PTEN/TIMP3之间在体内是否存在直接关系，对肺癌和肝癌以及正常样品进行免疫组织化学分析。共标记MET/PTEN和MET/TIMP3显示PTEN和TIMP3仅在正常细胞中大量表达，其中MET不存在，而c-Met只在癌细胞中表达(图16)。这些数据确认了MET至少部分地通过JNK、AP-1和特别地c-Jun转录因子参与miR-221和222的调节。
实施例VI.实验方法
荧光素酶测定
使用下列引物PCR扩增人PTEN和TIMP3基因的3’UTR：PTEN Fw 5'-TCT AGA GAC TCT GAT CCA GAG AAT GAA CC-3'[SEQ ID No:1]和PTEN Rw 5'-TCT AGA GTT GCC ACA AGTGCA AAG GGG TAG GAT GTG-3'[SEQ ID No:2]；TIMP3Fw5’-TCT AGA CTG GGC AAA GAA GGG TCT TTC GCA AAG C-3’[SEQ ID No:3]和TIMP3Rw 5’TCT AGA TTC CAA TAG GGAGGA GGC TGG AGG AGT CTC-3’[SEQ ID No:4]并且将其克隆在pGL3对照载体(Promega)的虫荧光素酶终止密码子的下游，从而产生p3’UTR-PTEN和p3’UTR-TIMP3质粒。
将这些构建体用于通过反转PCR产生p3’-UTRmut-PTEN质粒-引物：Fw：5'-GTT GAA AAA AGG TTG GGG GCG GGT GTCATG TAT ATA C-3[SEQ ID No:5]；Rw：5'-GTA TAT ACA TGACAC CCG CCC CCA ACC TTT TTT CAA C-3'[SEQ ID No:6]；p3’-UTRmut-TIMP3质粒-引物：Fw：5'-GTA TAA TTT AAA ATCATT GGG CGG CGG GAG ACA CTT CTG TAT TTC-3'[SEQ IDNo:7]；Rw：5'-GAA ATA CAG AAG TGT CTC CCG CCG CCCAAT GAT TTT AAA TTA TAC-3'[SEQ ID No:8]。
通过使用Lipofectamine  2000(Invitrogen)，利用1μg 的p3’UTR-PTEN或p3’UTR-TIMP3以及p3’UTRmut-PTEN或p3’UTRTIMP3质粒和1μg虫荧光素酶表达构建体pRL-TK(Promega)共转染MeG01细胞。转染后24小时收获细胞，按照制造商的说明书利用双重荧光素酶测定法(Dual Luciferase Assay)(Promega)进行测定。以一式三份进行3个独立实验。
肺癌和肝癌样品和细胞系
在俄亥俄州立大学医学中心(Columbus,OH)收集总共32个快速冷冻的正常肺组织和恶性肿瘤肺组织(19个男性和13个女性，年龄中位数70.0，范围：55-82)和60个快速冷冻的正常肝组织和60个恶性肿瘤肝组织。其它72个癌症和正常(24)肺组织购自US Biomax,Inc。按照由俄亥俄州立大学机构审查委员会批准的方案获得所有人组织。
体内实验
根据机构的指导方针进行动物研究。通过使用shPTEN和TIMP3质粒(Santa Cruz)稳定地转染NCI-H460细胞；用shMET稳定转染Calu-1细胞。在于嘌呤霉素中选择10天后，将5x106(H460)或7x106(Calu-1)个活细胞皮下注射入6周龄雄性裸小鼠(CharlesRiverBreeding Laboratories,Wilmington,MA)的右肋。通过每天静脉内注射TRAIL/Apo2(10mg/kg/d)或媒介物(PBS)进行2个5天的周期，从肿瘤细胞接种后5天(H460异种移植物)或10天(Calu-1异种移植物)开始处理。利用数字测径器每5天测量肿瘤尺寸。通过测量长度(l)和宽度(w)和计算体积(V=lw2/2)来测定肿瘤体积。注射后35天，处死小鼠，通过PTEN、TIMP3和MET表达的western印迹分析肿瘤样品。通过使用Student t检验评估对照与处理的动物之间的统计显著性。在俄亥俄州立大学的动物管理和使用委员会的批准后进行动物实验。
统计分析
将Student t检验和单因素方差分析用于测定显著性。所有误差棒代表平均值的标准误差。计算皮尔逊相关系数以测试正常组相对于肿瘤组的miR-221/222与PTEN之间的关联性。通过计算P-值评估的所有测试的统计显著性都小于0.05。
Western印迹分析
用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(0.15mM NaCl,0.05mM Tris-HCl,pH 7.5,1%Triton,0.1%SDS,0.1%脱氧胆酸钠和1%NonidetP40)提取NSCLC和HCC细胞的总蛋白质。使用微型凝胶装置(mini-gel apparatus)(Bio-Rad Laboratories)将样品提取物(50μg)在7.5–12%SDS–聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上进行分离，将其转移至Hybond-C extra硝酸纤维素。用含有0.05%Tween 20的Tris缓冲盐溶液中的5%脱脂奶粉封闭膜1小时，用一抗温育过夜，然后洗涤，用二抗温育，通过化学发光使其可视。使用下列一抗：抗-PTEN,抗-c-Jun、抗-p-c-Jun、抗-Fos、抗-p-JNK、抗-MMP3、抗-Mcl-1(SantaCruz)、抗-TIMP3(Millipore)、抗-PI3K(BD Biosciences)、抗-ERK、抗-磷酸ERK、抗-AKT、抗-p-AKT、抗-GSK3b、抗-p-GSK3b(Ser9)、抗-PAK1、抗-胱天蛋白酶-8、-3和-9、抗-PARP、抗-细胞色素c(Cellsignaling)和抗-MMP9、抗-FADD(Abcam)、抗-肌动蛋白抗体(Sigma)。使用第二抗-兔或抗-小鼠免疫球蛋白G(IgG)抗体过氧化物酶缀合物(C hemicon)。
荧光素酶测定
扩增在miR-222/-221的上游含有假定的调控区(从+1至-150nt,+1至-600,+1至-1000(+1位置对应于miR-222发夹的5’末端)的DNA片段，将其克隆在pGL3basic(Promega)中。使用1.0ng pGL3basic空载体或含有上述基因组片段的pGL3、200ng的虫荧光素酶表达构建体pRL-TK(Promega)和MET、c-Jun、c-Fos siRNA，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染Meg01细胞。48小时后，裂解4种细胞，按照制造商的说明书使用双重荧光素酶测定法(DualLuciferase Assay)(Promega)进行测定。以一式三份进行3个独立实验。用于克隆的引物如下：-1000pGL3b  Forw：5`gctagccctagccaccttatcgaaaatagcattcc 3`[SEQ ID No:9]；-600pGL3bForw：5`gctagcctgacatgctagtgagcacctgc 3`[SEQ ID No:10]；-150pGL3b Forw：5`gctagcccagaggttgtttaaaattacgta 3`[SEQ ID No:11]；miR-222pGL3b Rev：5`ctcgagagctgggtgatcctttgccttctg 3`[SEQ IDNo:12]。
实时PCR
使用标准TaqMan PCR试剂盒方案在Applied Biosystems7900HT Sequence Detection***(Applied Biosystems)上进行实时PCR。10μl PCR反应物包括0.67μl RT产物、1μl TaqMan通用PCR标准混合物(Master Mix)(Applied Biosystems)、0.2mM TaqMan探针、1.5mM正向引物和0.7mM反向引物。将反应物在95°C于96孔板中温育10分钟，然后进行40个循环：在95°C进行15秒和在60°C进行1分钟。以一式三份运行所有反应。将阈值循环(CT)确定为荧光通过固定阈值所经历的分数循环数(fractional cycle number)。将用于基因表达的相对定量的比较CT法(Applied Biosystems)用于测定miRNA的表达水平。Y轴代表2(-CT)或不同miR的相对表达。计算相对于U44和U48rRNA的miR表达，将其乘以104。对于每一个数据点以一式三份进行实验，使用软件(Bio-Rad)进行数据分析。
RNA提取和Northern印迹
按照制商的说明书利用TRIzol溶液(Invitrogen)提取总RNA，使用Agilent BioAnalizer 2100(Agilent,Palo Alto,CA,USA)评估RNA的完整性。如由Calin等人，2002所述进行Northern印迹。用作探针的寡核苷酸是成熟miRNA(miRNA登记)的互补序列：
miR-221,5’-GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3’[SEQ IDNo:13],
miR222,5’GAGACCCAGTAGCCAGATGTAGCT-3’[SEQ IDNo:14]。
miRNA表达的反义抑制
通过Fidelity合成2’-O-甲基(2’-O-me)寡核糖核苷酸。2’-O-me-抗-miR-221和2’-O-me-抗-miR-222的序列如下：
5'-gaaacccagcagacaauguagcu[SEQ ID No:15]和
5'-gagacccagtagccagatgtagct[SEQ ID No:16]。
2’-O-me-GFP miR(5'-aaggcaagcugacccugaagu[SEQ ID No:17])用作对照。细胞在6孔板(1.7×106/孔)生长24小时，使用lipofectamine2000，以100nmoli/L/孔的2’-O-me-寡核糖核苷酸进行转染。转染后72小时提取RNA和蛋白质。
细胞死亡和细胞增殖定量
将细胞以一式三份涂铺在96孔板中，在37°C于5%CO2培养箱中进行温育。将Super-Killer TRAIL(Alexis Biochemicals)以400ng/ml使用24-48小时。按照制造商的方案，利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)-Cell Titer 96 AQueous One Solution CellProliferation Assay(Promega)检查细胞存活性。通过将20μl MTT添加至每一个孔中来检测具有代谢活性的细胞。在1小时的温育后，在Multilabel计数器(Bio-Rad Laboratories)中分析板。使用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒，然后进行流式细胞术分析和胱天蛋白酶3/7活性来评估细胞凋亡。以1.8x106个细胞/100mm培养皿接种细胞，将其在10%FBS/RPMI中生长过夜，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，随后用400ng/ml TRAIL处理24小时。温育后，用冷PBS洗涤细胞，通过胰蛋白酶处理从板取出细胞。用冷PBS洗涤重悬浮的细胞，按照制剂商的说明书(Roche Applied Science)，用缀合有FITC的annexin V抗体进行染色。随后将细胞(5×105/样品)经历流式细胞术分析。如所描述的(Garofalo等人，2007)进行流式细胞术分析。用TRAIL处理的H460细胞的级分被采用为凋亡细胞群体。针对在相应的未处理的对照中发现的本底水平修正指明的细胞凋亡的百分比。假定方差相同，使用两样品t检验进行统计分析，并且基于双尾检验计算P值。为了检测胱天蛋白酶3/7活性，将细胞培养在96孔板中，用400ng/ml TRAIL处理，按照制造商的说明书使用胱天蛋白酶-Glo3/7Assay试剂盒(Promega)进行分析。连续变量表示为平均值±标准差(s.d.)。
染色质免疫沉淀
如由de Belle等人，2000所描述的(具有稍许改进)进行染色质免疫沉淀。将来自H460、Calu-1和Snu-387细胞系的细胞(5x106)于37°C在1%甲醛中固定10分钟。用冰冷的1PBS洗涤细胞，于1xPBS+蛋白酶抑制剂中刮取细胞，通过离心收集细胞。随后超声处理重悬浮于细胞裂解缓冲液[50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10mmol/L EDTA和1%SDS]+蛋白酶抑制剂中的细胞沉淀。使用5g抗-c-Jun抗体(SantaCruz)或使用兔多克隆IgG对照(Zymed)免疫沉淀DNA-蛋白质复合物。
通过加热利用蛋白酶K在65°C逆转免疫沉淀的染色质的交联，过夜进行；然后利用MinElute Reaction Cleanup柱(Qiagen)纯化DNA，将其重悬浮于水中。将纯化的染色质经历PCR，使用2%琼脂糖通过凝胶电泳分析产物。使用下列引物：
区域1F：5`GATGTGGAGAATAGATACCTTTGAG 3`[SEQ IDNo:18]
区域1R：5`GGCACTGCCTACAAACCAGAGCATA3`[SEQ IDNo:19]
区域2F：5`GTCACTCAGTCAGTATCTGTTGGA 3`[SEQ IDNo:20]
区域2R：5`GTGTGTAATTCAAGGTAAAGTTTTC3`[SEQ IDNo:21]
抗-PTEN和抗-TIMP3siRNA转染
将细胞培养至80%的汇合，使用Lipofectamine 2000，利用100nM抗-PTEN或利用100nM抗-TIMP3SMARTpool siRNA或对照siRNA(Dharmacon)、经设计用以敲低基因表达的4种靶特异性20–25ntsiRNA的混合物瞬时转染所述细胞。
***固定的石蜡包埋的组织切片的原位杂交的miRNA锁核酸。
使用先前公开的方案(Nuovo等人，2009)对脱蜡的人肺和肝组织进行原位杂交(ISH)，包括在胃蛋白酶(1.3mg/ml)中消化30分钟。包含6个分散的锁核酸(LNA)修饰碱基的探针的序列(地高辛缀合至5’末端)为：
miR-221,5’-GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT  [SEQ  IDNo:13],
miR222,5’GAGACCCAGTAGCCAGATGTAGCT  [SEQ  IDNo:14]。
将探针混合物和组织miRNA在60°C共变性5分钟，然后在37°C杂交过夜，在4°C于0.2X SSC和2%牛血清白蛋白中进行低严格度洗涤，进行10分钟。由于碱性磷酸酶对色原氮蓝四唑和溴-氯-吲哚磷酸(NBT/BCIP)的作用而看见探针-靶复合物。阴性对照包括应当在这样的组织中产生阴性结果的探针的使用。不使用复染色，以帮助PTEN、TIMP3和MET蛋白的共标记。在miRNA的原位杂交后，如先前所描述的(Nuovo等人，2009)，使用对于PTEN(1:800，细胞条件化30分钟)、TIMP3(1:1300，细胞条件化30分钟)和MET(1:20，细胞条件化30分钟)的最佳条件对载玻片进行免疫组织化学分析。为了进行免疫组织化学，本发明人使用了来自Ventana Medical System的Ultrasensitive Universal Fast Red***。本发明人使用了正常肝和肺组织作为这些蛋白质的对照。随后分析表达PTEN、TIMP3以及miR-221和miR-222的肿瘤细胞的百分比，强调各个靶(miR-221或-222以及PTEN或TIMP3)的共定位。
材料
用于细胞培养的培养基、血清和抗生素来自Life Technologies,Inc.(Grand Island,NY,USA)。蛋白质电泳试剂来自Bio-RadLaboratories(Richmond,VA,USA)，western印迹和ECL试剂来自GE Healthcare(Piscataway,NJ,USA)。所有其它化学品来自Sigma(StLouis,MO,USA)。
肺癌和肝癌样品以及细胞系
将人Calu-1和A549细胞系生长在含有10%热灭活的胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺和100Uml-1青霉素–链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基中。将Hel299、H460、A459、H1975、H1299、H1573、H23、PLCRF15、SNU-387、Snu-423、Snu-475细胞系生长在含有10%热灭活的FBS和2mM L-谷氨酰胺和100Uml-1青霉素–链霉素的RPMI中。将Sk-hep1、Hep-G2、HepG2C3A、Hep3B、Huh7生长在补充有10%热灭活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和100Uml-1青霉素–链霉素的MEM中。将正常肝细胞生长在补充有10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、1%的肝细胞生长添加物(HGS)和100Uml-1青霉素–链霉素的肝细胞生长培养基(Sciencell)中。
迁移测定
将具有8-μm多孔膜(Greiner bio-one)的Transwell***小室用于测定。用PBS洗涤细胞3次，将其添加至顶部小室中的无血清培养基中。底部小室充满含有10%FBS的培养基。将细胞在37°C于5%CO2潮湿培养箱中温育24小时。为了定量迁移的细胞，通过使用棉签除去顶部小室上的细胞，将迁移的细胞固定在PBS,25%戊二醛中，然后使用结晶紫染色进行染色，在相差显微镜下使其可视，然后进行照相。将结晶紫染色的细胞再次溶解在醋酸和甲醇(1:1)中，在595nm测量吸光度。结果为3个独立实验的平均值±S.D。
侵袭性测定
以一式三份将H460和SK-Hep-1细胞置于具有含有8-μm孔的膜(BD Biosciences)的BD Falcon HTS FluoroBlok***物的顶部小室中的300L的无血清达尔伯克改良伊格尔培养基中。将***物置于含有达尔伯克改良伊格尔培养基和胎牛血清(10%)(作为化学引诱物)的24孔板的底部小室孔内。用8g/mL的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的钙黄绿素-AM(Molecular Probes,Eugene,OR)在37℃标记通过膜的孔至底部小室的细胞，进行30分钟。使用荧光计在485nm和激发波长和530nm的发射波长定量迁移的细胞的荧光，将其表示为任意荧光单位。数据表示为4个独立测定的平均值±标准误差。
PTEN和TIMP3质粒
按照制造商的说明书，通过使用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen)从H460细胞的RNA获得PTEN和TIMP3cDNA。通过使用下列引物扩增PCR片段：
NotI-TIMP3-HA：5`gcggccgcatgaccccttggctcgggctcatcgtgct 3`[SEQ ID No:22]
BglII-TIMP3-HA：5`agatctcagggtctggcgctcaggggtctgt 3`[SEQ IDNo:23]
NotI-PTEN-HA：5`gcggccgcatgacagccatcatcaaagagatcgttag 3`[SEQ ID No:24]
XbaI-PTEN-HA：5`tctagaggtgttttatccctcttgataaaaaaaaattca 3`[SEQ ID No:25]，
随后将其克隆入用NotI-XbaI(PTEN)或NotI-BglII(TIMP3)消化后的pCRUZ-HA(Santa Cruz)。通过测序控制所有载体。
靶分析
通过使用这些特定程序：Targetscan1、Pictar2和RNhybrid3.1http://www.targetscan.org/2 http://pictar.bio.nyu.edu/3http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/进行生物信息学分析。
实施例VII：治疗在HCC肿瘤样品中显示TRAIL敏感性TRAIL表达模式的患者的HCC的方法
本实施例描述了选择和治疗可能具有有利的对TRAIL治疗的反应的HCC患者的方法(作为疗法)。
对于一些HCC患者，TRAIL疗法可延长存活时间(Sun等人，J.Cancer Res.Clin.Oncol.132(7):458-465,2006)。然而，有益地是在开始治疗之前鉴定最可能从从TRAIL疗法受益的患者。
本文中现已公开在肿瘤样品中相对于对照(例如获自相同患者的非癌性肝组织)表达TRAIL敏感性TRAIL表达模式的HCC患者的预后在利用TRAIL治疗后得到显著地改善。相反地，在肿瘤样品中表达TRAIL抗性的TRAIL表达模式的患者在TRAIL治疗后不显示存活的显著增加，从而不是这样的辅助治疗的良好候选者。
经诊断患有HCC的患者首先经历肝切除术以意欲治愈。HCC肿瘤和非癌性组织样品获自从患者切除的肝组织的部分。随后使用本领域公知的用于提取小RNA的任何适当的方法例如通过使用TRIZOLTM从组织样品分离RNA。随后使用特异于c-Jun以及miR-221和miR-222(任选地与PTEN和/或TIMP3结合)的引物，将纯化的RNA经历RT-PCR。还可在不使用c-Jun的情况下，使用miR-221和miR-222以及PTEN和/或TIMP3运行所述测定。运行此类测定以测定肿瘤和非癌性组织的相关RNA的表达水平。如果相对于非癌性组织在肿瘤组织中发现了TRAIL敏感性表达模式，则所述患者为进行TRAIL辅助治疗的候选者。
因此，按照本领域已知的方法利用治疗有效量的TRAILα治疗患者。取决于许多因素例如患者的健康状态和HCC的分期，TRAIL的剂量和给药方案可变化。通常地，在一段时间内以多剂施用TRAIL。
实施例VIII：用于具有低miR-26表达的HCC患者的替代治疗法
本实施例描述了在不存在肝切除术的情况下治疗经诊断患有HCC的患者的方法。为了确定经诊断患有HCC的患者是否是进行TRAIL治疗的良好候选者，从未曾经历肝切除术的患者获得HCC肿瘤样品以及非癌性肝组织样品。可按照本领域已知的任何方法获得组织样品。例如，可通过使用皮下针头进行活组织检查法以取出想要的组织来获得组织样品。
然后使用本领域公知的用于提取小RNA的任何适当的方法例如通过使用TRIZOLTM从组织样品分离RNA。随后使用特异于miR-26的引物，将纯化的RNA经历RT-PCR，以测定肿瘤和非癌性组织的miR-26的表达水平。如果相对于非癌性组织在肿瘤组织中发现TRAIL敏感性TRAIL表达模式，则所述患者是进行治疗的候选者。
因此，按照本领域已知的方法利用治疗有效量的治疗剂治疗患者。取决于许多因素例如患者的健康状态和HCC的分期，TRAIL的剂量和给药方案可变化。通常地，在一段时间内以多剂施用TRAIL。
实施例IV：治疗在HCC肿瘤样品中显示TRAIL抗性的TRAIL表达模式的患者的HCC的方法
本实施例描述了如果患者在HCC肿瘤中显示TRAIL抗性的TRAIL表达模式，治疗经诊断患有HCC的患者的方法。
经诊断患有HCC的患者首先经历肝切除术以意欲治愈。HCC肿瘤和非癌性组织样品获自从患者切除的肝组织的部分。随后使用本领域公知的用于提取小RNA的任何适当的方法例如通过使用TRIZOLTM从组织样品分离RNA。随后使用特异于miR-26的引物，将纯化的RNA经历RT-PCR，以测定肿瘤和非癌性组织的miR-26的表达水平。如果相对于非癌性组织在肿瘤组织中发现TRAIL抗性的TRAIL表达模式，则所述患者可能不会有利地响应TRAIL辅助治疗。因此，患者不接受TRAIL治疗，但考虑进行其它治疗模式以转化成TRAIL敏感性。或者，监控患者的疾病复发的术后体征。
实施例IX：诊断HCC患者的方法
在一个特定的方面，在本文中提供了诊断受试者是否患有肝细胞癌(HCC)或处于发生肝细胞癌的风险中的方法。所述方法一般包括测量来自受试者的测试样品的TRAIL表达模式和确定测试样品的TRAIL表达模式相对于对照样品的TRAIL表达模式的水平是否偏离，偏离则表示受试者患有HCC或处于发生HCC的风险中。在某些实施方案中，使用Northern印迹分析测量至少一种基因产物的水平。同样地，在某些实施方案中，测试样品的至少一种基因产物的水平低于对照样品的相应miR基因产物的水平，和/或测试样品的至少一种miR基因产物的水平高于对照样品的相应miR基因产物的水平。
实施例X：测量miR基因产物
可通过从获自受试者的测试样品逆转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸来测量至少一种miR基因产物的水平；将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱；和将测试样品的杂交谱与从对照样品产生的杂交谱相比较。至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有HCC或处于发生HCC的风险中。
实施例XI：诊断和治疗应用
在另一个方面，本文中提供了治疗受试者的HCC的方法，其中相对于从对照样品产生的信号，至少一种miRNA的信号脱调控(例如，被下调和/或被上调)。
本文中还提供了通过如下步骤诊断受试者是否患有与受试者的一个或多个不利预后标志相关的HCC或处于发生其的风险中的方法：从获自受试者的测试样品逆转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱；和将测试样品的杂交谱与从对照样品产生的杂交谱相比较。信号的改变表示受试者患有癌症或处于发生癌症的风险中。
本文中还提供了用于治疗受试者的HCC的方法，所述受试者患有其中TRAIL表达模式基因的至少两种基因产物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞被下调或上调的HCC。当至少两种基因产物在癌细胞中被下调时，所述方法包括给受试者施用有效量的至少两种分离的基因产物，以便抑制受试者的癌细胞的增殖。当两种或更多种基因产物在癌细胞中被上调时，所述方法包括给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一种基因产物的表达的化合物，以便抑制受试者的癌细胞的增殖。本文中还提供了治疗受试者的HCC的方法，包括：测定HCC细胞相对于对照细胞的至少两种TRAIL表达基因产物的量；和通过给受试者施用有效量的至少两种基因产物(如果癌细胞中表达的所述基因产物的量少于对照细胞中表达的所述基因产物的量的话)；或通过给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少两种基因产物的表达的化合物(如果癌细胞中表达的基因产物的量高于对照细胞中表达的基因产物的量的话)来改变HCC细胞中表达的基因产物的量，以便抑制受试者的癌细胞的增殖。
实施例XII：组合物
本文中还提供了用于治疗TRAIL抗性癌症的药物组合物，其包含至少两种分离的TRAIL表达模式基因产物和药学上可接受的载体。在具体实施方案中，药物组合物包含对应于在HCC细胞中相对于适当的对照细胞被下调的基因产物的基因产物。
在另一个具体的实施方案中，药物组合物包含至少一种表达调节剂(例如，抑制剂)化合物和药学上可接受的载体。
本文中还提供了包含至少一种表达调节剂化合物的药物组合物，所述表达调节剂化合物特异于在HCC细胞中相对于适当的对照细胞被上调或下调的基因产物。
实施例XIII：试剂盒
可将本文中描述的任何组合物包括在试剂盒中。在非限制性实例中，将用于分离miRNA、标记miRNA和/或使用阵列评估miRNA群体的试剂包括在试剂盒中。试剂盒还可包括用于产生或合成miRNA探针的试剂。试剂盒从而可在适当的容器装置中包含用于通过掺入标记的核苷酸或未标记的核苷酸(随后被标记)而标记miRNA的酶。其还可包括一种或多种缓冲液，例如反应缓冲液、标记缓冲液、洗涤缓冲液或杂交缓冲液、用于制备miRNA探针的化合物和用于分离miRNA的化合物。其它试剂盒可包括用于制备核酸阵列的组分，所述组分包含与miRNA互补的寡核苷酸，从而可包括例如固体支持物。
对于任何试剂盒实施方案，包括阵列，可存在这样的核酸分子，所述核酸分子包含与本文中的任何序列的全部或部分具有同一性或与其互补的序列。
可以在含水介质中或以冻干形式包装试剂盒的组分。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置，可将组分放入，优选适当地等分入所述容器装置中。当试剂盒中存在超过1种组分时(可将标记试剂和标记物包装在一起)，试剂盒通常还包含第二、第三或其它额外的容器，可将其它组分分别放入所述容器中。然而，可在小瓶中包含组分的不同组合。本发明的试剂盒通常还包括用于将核酸和任何其它试剂容器包含在密闭物(closeconfinement)中以用于销售的装置。此类容器可包括可将期望的小瓶保留在其中的注射或吹塑塑料容器。
当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水溶液，无菌水溶液是一种优选溶液。可包括在试剂盒中的其它溶液是参与从混合样品分离和/或富集miRNA的溶液。
然而，可以以干燥粉末的形式提供试剂盒的组分。当以干燥粉末提供试剂和/或组分时，可通过添加适当的溶剂重建粉末。预期溶剂还可在另一个容器装置中提供。试剂盒还可包括帮助分离标记的miRNA的组分。其还可包括保护或维持miRNA或保护其免受降解的组分。组分可以是不含RNAse的或保护免受RNAse分解。
同样地，试剂盒通常可在适当的装置中包括用于每一种单一试剂或溶液的不同容器。试剂盒还可包括使用试剂盒组分以及使用未包括在试剂盒中的任何其它试剂的使用说明书。说明书可包括可执行的变型。考虑到此类试剂是本发明的试剂盒的实施方案。同样地，试剂盒不限于上文中鉴定的特定项目，其可包括用于操作或表征miRNA的任何试剂。
还考虑到miRNA阵列的情境中论述的任何实施方案更一般地可用于本发明的筛选或表征方法或试剂盒。换句话说，描述什么可包含在特定阵列中的任何实施方案可更一般地于miRNA表征的情境中实施并且本身不必包括阵列。
还考虑到任何试剂盒、阵列或其它检测技术或工具或任何方法可包括任何此类miRNA表征。同样地，还考虑到可在本发明的方法中利用或或不利用阵列形式来执行在miRNA阵列的情境中论述的任何实施方案；换句话说，可以按照本领域技术人员已知的任何技术，在本发明的任何方法中筛选或评估miRNA阵列中的任何miRNA。阵列形式不是待执行的筛选和诊断方法所必需的。
本发明人还在本文中考虑到了用于使用miRNA阵列进行治疗、预后或诊断应用易激此类用途的试剂盒。试剂盒可包括miRNA阵列，以及关于标准化或规范化阵列上的miRNA的miRNA特征谱的信息。同样地，在某些实施方案中，可在试剂盒中包括对照RNA或DNA。对照RNA可以是可用于标记和/或阵列分析的阳性对照的miRNA。
已在本文中广泛地和一般性地描述本教导的方法和试剂盒。落在一般性公开内容内的每一个更窄的种类和子类分组也形成本教导的一部分。这包括本教导的一般描述，前提或负性限制是从属中除去任何主题，无论去除的材料是否在本文中被明确地引述。
实施例XIV：阵列制备和筛选
本文中还提供了miRNA阵列的制备和用途，所述阵列是核酸分子(探针)的有序大阵列或微阵列，所述核酸分子(探针)与多个miRNA分子或前体miRNA分子完全或部分互补或与其具有同一性，并且被置于空间上分开的架构中的支持物材料上。大阵列通常是成片的硝酸纤维素或尼龙，其中点染探针。微阵列更密集地排列核酸探针以便至多10,000个核酸分子能合适地安装在通常1至4平方厘米的区域。
可通过将核酸分子例如基因、寡核苷酸等点在基质上或在基质上原位构建寡核苷酸序列来制作微阵列。可以以至多约30个非同一的核酸分子/平方厘米或更高的高密度基质模式，例如至多约100或甚至1000/平方厘米的高密度基质模式应用所点的或所构建的核酸分子。微阵列通常使用涂覆的玻璃作为固体支持物，与过滤阵列的基于硝酸纤维素的材料不同。通过具有miRNA互补核酸样品的有序阵列，可追踪每一个样品的位置并且将其与原始样品联系起来。
其中多种不同的核酸探针稳定地与固体支持物表面结合的多种不同的阵列装置对于本领域技术人员来说是已知的。用于阵列的有用基质包括尼龙、玻璃和硅。阵列可在许多不同方面，包括平均探针长度、探针的序列或类型、探针与阵列表面之间的键的性质(例如共价或非共价的)等方面不同。除探针检测miRNA外，就任何参数而言，本文中描述的标记和筛选方法以及阵列不限于其效用；因此，可将方法和组合物与多种不同类型的miRNA阵列一起使用。
鉴于我们的发明的原理可用于的许多可能的实施方案，应当承认举例说明的实施方案仅是本发明的优选实施例并且不应当被当作对本发明的范围的限制。相反地，本发明的范围由下列权利要求界定。因此我们要求落在这些权利要求的范围和精神内的所有实施方案作为我们的发明。
Figure IDA00001807052300021
Figure IDA00001807052300041
Figure IDA00001807052300051

Claims (28)

1.一种改变细胞中的TRAIL表达模式的方法，包括抑制能够表达c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN和TIMP3的细胞中的c-Jun、miR-221和miR-222以及PTEN或TIMP3，和观察TRAIL表达模式的改变。
2.一种改变细胞中的TRAIL表达模式的方法，包括在能够表达c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN和TIMP3的细胞中过表达c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN或TIMP3，和观察TRAIL表达模式的改变。
3.一种鉴定细胞样品中的TRAIL表达模式的方法，包括鉴定细胞样品中的至少两种核酸的表达水平，其中所述至少两种核酸选自：miR-221和miR-222和c-Jun；miR-221和miR-222和PTEN；miR-221、miR-222和TIMP3；miR-221和miR-222、c-Jun和PTEN；miR-221和miR-222、PTEN和TIMP3；以及，miR-221和miR-222、c-Jun和TIMP3。
4.一种改变TRAIL抗性细胞中的基因表达的方法，包括抑制也表达至少一种选自：c-Jun、PTEN和TIMP3的核酸的细胞中的miR-221和miR-222。
5.一种改变TRAIL抗性细胞中的基因表达的方法，包括在也表达至少一种选自：c-Jun、PTEN和TIMP3的核酸的细胞中过表达miR-221和miR-222。
6.一种鉴定具有核酸表达抑制的测试细胞的方法，包括将至少一种测试细胞与反义miR-221和miR-222接触，和观察选自PTEN和TIMP3的核酸的表达的增加。
7.一种预测经诊断患有癌症的患者的临床结果的方法，包括检测获自所述患者的癌细胞样品中的miR-221和miR-222的表达水平和至少一种选自c-Jun、PTEN和TIMP3的核酸的表达水平，其中，相对于对照而言，肿瘤样品中miR-221和miR-222的水平升高至1.5倍或更高与PTEN或TIMP3的表达水平下降至2/3或更低的组合预测了存活的减少，或其中，相对于对照而言，肿瘤样品中miR-221和miR-222的水平升高至1.5倍或更高与c-Jun的表达水平升高至1.5倍或更高的组合预测了存活的减少。
8.一种抑制表达miR-221和miR-222和PTEN的肿瘤细胞中的PTEN表达的下调的方法，包括抑制表达miR-221和miR-222和PTEN的肿瘤细胞中的miR-221和miR-222活性，和观察PTEN下调的抑制。
9.权利要求8的方法，其中通过反义miR-221和miR-222抑制所述miR-221和miR-222的活性。
10.权利要求8的方法，其中通过TRAIL敏感性观察PTEN表达下调的抑制。
11.权利要求8的方法，其中通过PTEN转录分析观察PTEN表达下调的抑制。
12.一种鉴定用于治疗TRAIL抗性癌症的治疗剂的方法，包括体外筛选候选试剂以选择在TRAIL抗性癌细胞中减少miR-221和miR-222的表达和增加PTEN的表达的试剂，从而鉴定用于治疗TRAIL抗性癌症的试剂。
13.一种治疗具有TRAIL抗性肿瘤细胞的哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用能够抑制PTEN表达的下调的治疗剂，所述哺乳动物具有TRAIL抗性肿瘤细胞，如通过miR-221和miR-222的水平升高至1.5倍或更高与PTEN表达水平降低至2/3或更低的组合所鉴定的。
14.一种用于鉴定测试细胞中的PTEN的miR-221和miR-222上调的试剂盒，包括miR-221和miR-222的至少一种分子鉴定物和PTEN的至少一种分子鉴定物，其中所述分子鉴定物选自：探针、引物、抗体或小分子。
15.上述权利要求的任一项的方法，其中所述细胞选自：癌细胞、TRAIL抗性癌细胞、非小细胞肺癌细胞和肝细胞癌细胞。
16.一种改变能够表达TIMP3和miR-221和miR-222的细胞中的TIMP3表达的调节的方法，包括改变表达TIMP3和表达miR-221和miR-222的细胞中的miR-221和miR-222活性，和观察TIMP3的表达的改变。
17.一种抑制能够表达TIMP3的细胞中的TIMP3表达的方法，包括在也表达TIMP3的细胞中过表达miR-221和miR-222，和观察TIMP3的表达的抑制。
18.一种鉴定具有TIMP3表达的抑制的细胞的方法，包括将测试细胞与反义miR-221和miR-222接触，和观察TIMP3表达的增加。
19.一种鉴定TRAIL抗性细胞的方法，包括鉴定测试细胞样品是否包含miR-221和miR-222核酸以及TIMP3核酸。
20.一种鉴定用于治疗TRAIL抗性癌症的治疗剂的方法，包括体外筛选候选试剂以选择在TRAIL抗性癌细胞中减少miR-221和miR-222的表达和增加TIMP3的表达的试剂，从而鉴定用于治疗TRAIL抗性癌症的试剂。
21.一种预测经诊断患有癌症的患者的临床结果的方法，包括检测获自所述患者的癌细胞样品中的miR-221、miR-222和TIMP3的表达水平，其中相对于对照而言，肿瘤样品中miR-221和miR-222的水平升高至1.5倍或更高与TIMP3表达水平降至2/3或更低的组合预测了存活的减少。
22.一种治疗具有TRAIL抗性肿瘤细胞的哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用能够抑制TIMP3表达的下调的治疗剂，所述哺乳动物具有TRAIL抗性肿瘤细胞，如通过miR-221和miR-222的表达升高至1.5倍或更高与TIMP3表达的水平降低至2/3或更低的组合所鉴定。
23.一种用于鉴定测试细胞中的TIMP3的miR-221和miR-222上调的试剂盒，包括miR-221和miR-222的至少一种分子鉴定物和TIMP3的至少一种分子鉴定物，其中所述分子鉴定物选自：探针、引物、抗体或小分子。
24.上述权利要求的任一项的方法，其中所述细胞选自：癌细胞、TRAIL抗性癌细胞、非小细胞肺癌细胞和肝细胞癌细胞。
25.一种抑制表达miR-221、miR-222和TIMP3的肿瘤细胞中的TIMP3表达的下调的方法，包括抑制表达miR-221、miR-222和TIMP3的肿瘤细胞中的miR-221和miR-222活性，和观察TIMP3的下调的抑制。
26.权利要求25的方法，其中通过反义miR-221和miR-222抑制所述miR-221和miR-222活性。
27.权利要求25的方法，其中通过TRAIL敏感性观察TIMP3表达的下调的抑制。
28.权利要求25的方法，其中通过TIMP3翻译分析观察TIMP3表达的下调的抑制。
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