JP2015078161A - タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本実施形態に係るタンパク質の検出方法は、前記タンパク質検出用融合タンパク質と、対象物中に存在するタンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合しているタンパク質検出用融合タンパク質のアルカリホスファターゼ部分を標識部分として検出する方法である。
Brevibacillus発現ベクターにpG−BAP変異体の遺伝子断片を挿入し、発現ベクターの構築を行った。発現ベクターを構築できたものについては、形質転換および所定期間培養を実施し、培養上清と菌体を分離後、培養上清に含まれる目的タンパク質の生産量を確認した。
1.発現ベクター(プラスミド)
Brevibacillusを用いた分泌発現では、目的タンパク質ごとに最適なタンパク質の合成速度および分泌シグナルが異なる可能性が示唆されている。そこで、2種のプロモータ(pBIC1,pBIC2,pBIC3,pBIC4:P22プロモータ(配列番号9)、pBIC5,pBIC6,pBIC7,pBIC8:P2プロモータ(配列番号10))および4種の分泌シグナル(pBIC1,pBIC5:配列番号11、pBIC2,pBIC6:配列番号12、pBIC3,pBIC7:配列番号13、pBIC4,pBIC8:配列番号14)を組合せた、合計8種の発現用ベクターを使用した(図28参照)。
使用ベクター:pBIC1〜pBIC8[ヒゲタ醤油(株)提供]
pG−BAP変異体の遺伝子断片(pG−D153G/D330N、pG−D153H/D330NおよびpG−K328R/D330N)の発現用ベクターへの挿入には、酵素処理を必要としない簡便なプラスミド構築法であるBIC法(Brevibacillus In vivo Cloning)を利用した。BIC法では、目的タンパク質をコードする遺伝子の両端に、直鎖上の発現ベクターの両末端と相同な15bpの配列を付加したDNAをベクターと混合してコンピテントセルに導入する。菌体内で相同配列の組み換え反応が生じ、発現プラスミドが形成される。8種のベクターのうち、ベクター構築が可能であり、目的タンパク質発現用のベクターを取得できたものについては、下記の発現試験を実施した。
Brevibacillus choshinensis HPD31−SP3株[ヒゲタ醤油(株)提供]
Brevibacillus choshinensis HPD31−SP3株をMT培地(20mM MgCl2を添加したTM培地(表1参照))で37℃にて対数増殖期まで振盪培養し、遠心分離によって集菌した。次いで、50mM Tris−HCl(pH7.5)に懸濁し、遠心分離により集菌後、50mM Tris−HCl(pH8.5)に再懸濁し、37℃で60分間振盪した。振盪した懸濁液500μLの遠心分離を行って集菌し、2ng/μLの発現ベクターDNA溶液5μLと0.5M NaSO3/70mM リン酸バッファ(pH6.3)50μLの混合液を加え、懸濁して5分間静置後、40% PEG6000/70mM リン酸バッファ(pH6.3)を150μL添加して、ボルテックスにより撹拌、懸濁した。
形質転換を行った菌体は、遠心分離により集菌し、1mLのTM培地に懸濁し、37℃で60分間振盪した。次いで、TMN(TM培地に50μg/mLのネオマイシンを添加した寒天培地)に塗抹して、37℃、30時間培養し、形質転換体を選抜した。
3mLのTMN培地、および2SLN培地(2SL培地(表2参照)に50μg/mLのネオマイシンを添加)を16mm径の試験管に分注し、前項で選抜したシングルコロニーを植菌した。30℃、120rpmの条件で48時間振盪培養を行った。
遠心分離(5000g、5分間)を行って、菌体と培養上清を分離した。培養上清は0.22μmのろ過滅菌用フィルタを通して、菌体を除去した。
培養上清に等量の2×サンプルバッファを添加し、100℃で5分間変性した後、SDS−PAGEに供して、各サンプル中の生産タンパク質のサイズ確認、および発現生産量の推定、比較を行った。
1.菌体内および培養上清における発現確認
・pG−D153G/D330N(pG結合部位:N末端)
pG−D153G/D330Nについては、ベクター2種類およびシグナルペプチド4種類の計8種類の組合せのうち、発現プラスミドの取得が可能であった4種類について発現試験を実施した。2SLN培地(培養上清)の場合は、pBIC4、pBIC7およびpBIC8で高いレベルの発現量が認められ、連制間の差異もほとんどなく、安定的な発現がなされていることが示唆された。TMN培地でも発現量が2SLN培地より多くなること以外は、同様の傾向であったが、pBIC6では、両培地とも目的タンパク質は、ほとんど生産されていないことがわかった(図2,3)。pG−D153G/D330Nのアミノ酸配列を図24および配列番号1に、DNA配列を配列番号2に示す。
5種類の発現ベクターを取得したpG−D153H/D330Nの場合は2SLNおよびTMN両培地で高発現が認められたものは、pBIC7およびpBIC8であり、TMN培地の方が発現量が多い傾向であった。連制間のばらつきも認められないことから、安定した発現を示す可能性が示唆された。pBIC1、pBIC5およびpBIC6においては、ほとんどpG−D153H/D330Nの発現は認められなかった(図4,5)。pG−D153H/D330Nのアミノ酸配列を図25および配列番号3に、DNA配列を配列番号4に示す。
pG−K328R/D330N(pG結合部位:N末端)の場合は、取得した4種の発現ベクターのうち、目的タンパク質が生産されていたのはpBIC4およびpBIC8であった。いずれも連制間のバラツキは小さく、安定な発現を示しており、培地別にみると、pBIC8ではTMN培地で発現量が若干多い傾向が認められた(図6,7)。pG−K328R/D330N(pG結合部位:N末端)のアミノ酸配列を図26および配列番号5に、DNA配列を配列番号6に示す。
C末端にpGを結合したK328R/D330Nの場合、得られた発現ベクター3種(pBIC1、pBIC2、pBIC3)のうち、2SLN培地では、すべてのベクターで目的タンパク質の生産が認められたが、TMN培地では、pBIC2の生産量が著しく少ない結果が得られた。pGをN末端に結合したものとC末端結合したものを比べると、生産が認められたものについては、目的タンパク質バンドの強度に大きな差があるとは考えられない。しかし、C末端結合のものは、3連制の試験で同等に生産されたものがなく、N末端結合のものに比べるとタンパク質発現に安定性を欠く可能性が示唆された(図8,9)。pG−K328R/D330N(pG結合部位:C末端)のアミノ酸配列を図27および配列番号7に、DNA配列を配列番号8に示す。
ブレビバチルスにて発現させたBAP変異体には、上述のようにヒスチジンタグ(H6 tag)がC末端に付加されており、Ni−NTAカラムを用いて、比較的簡便に精製を行うことができる。本実施例においては、培養上清から精製標品を取得した。
1.目的タンパク質の精製
Ni−NTAカラムの一種であるHis SpinTrap Kit(28−9321−71/GE Healthcare)を用いて簡易精製を行った。精製操作は、添付の取扱説明書に準じたが、300〜600μLの培養上清を用い、カラム結合時の培養上清のイミダゾール濃度、そして結合(洗浄)バッファの同濃度は40mM、溶出バッファの同濃度は500mMとした。また、培養上清をカラムに添加後、洗浄を3回行い、酵素溶出を2回実施して、溶出画分をそれぞれフラクション1,2(Fr.1、Fr.2)とした。
精製された変異体酵素液には、高濃度のイミダゾールが含有しているが、予備検討の結果、酵素活性に悪影響を及ぼすことが判明したので、イミダゾールを除去するために脱塩し、保存バッファ(下記)への溶媒交換を実施した。この操作には、ゲルろ過法(Zeba Desalt Spin Columns、89890/Thermo Scientific)、または限外ろ過法(Amicon Ultra Centrifugal Filters、10K membrane、UFC501024/Millipore)を用いた。溶媒交換した精製標品は、限外ろ過(同上)により4〜5倍程度、濃縮を行い、4℃で保存した。
得られた精製標品は、SDS−PAGE法により純度を確認した。ゲルは、ミニプロティアン(登録商標) TGX(商標)プレキャストゲル(456−1036/Bio−Rad)を使用した。電気泳動後のゲルは、純水で洗浄し、CBB染色(Quick−CBB PLUS、178−00551/和光純薬)によりタンパク質バンドを可視化した。
1. Ni−NTAカラムによる精製
・pG−D153G/D330N(pG結合部位:N末端)
発現試験において発現量の多かったpG−D153G/D330Nにおけるベクターおよび培地の組合せについて培養上清からNi−NTAカラムを用いて簡易精製を行った(図10,11)。供試したいずれの組合せ(pBIC4、pBIC7、pBIC8)も精製画分においては、夾雑タンパク質がほぼ除去されており、高純度の精製標品を得ることが可能であった。
pG−D153H/D330Nの場合も2SLN培地およびTMN培地双方において、pBIC7およびpBIC8の組合せで高純度の標品を精製することが可能であった。また、精製標品の分子量についても、pG−D153G/D330Nと同様の結果であった(図12,13)。
2SLN培地を用いた場合、pBIC4についてはNi−NTAカラムによる精製が可能であり、純度の高い精製標品を得ることができた。しかしpBIC8については、カラム未結合画分に少量しかタンパク質が存在せず、その後のカラム洗浄においても同様であった。高濃度のイミダゾールを有する溶出バッファを用いてもほとんど出てこないことから、Ni−NTAカラムにタンパク質が強固に吸着されており回収不能となった可能性が示唆された(図14)。TMN培地の場合は、pBIC4、pBIC8双方とも目的タンパク質を精製することが可能であった(図15)。2SLN培地を用いた場合のみpBIC8がカラムに吸着する原因は、現状では不明である。
pG−K328R/D330N(pG結合位置:C末端)についても、同様にタンパク質発現量が認められたものについて簡易精製を実施した(図16,17)。2SLN培地では、pBIC1、pBIC2およびpBIC3、また、TMN培地では、pBIC1、pBIC3で精製標品を得ることができた。
精製した各標品の酵素部分、および抗体結合タンパク質部分が実際に機能するか確認し、タンパク質検出試薬として利用できるか検討を行うために、アルカリホスファターゼ(ALP)活性測定とウエスタンブロットにおける検出感度の比較を市販の試薬を対照として実施した。
1.ALP活性測定
酵素標品を酵素希釈バッファで所定濃度に希釈し、96穴マイクロプレートの各ウェルに5μL加えた。次いで、基質(p−NPP:p−ニトロフェニルホスフェート、149−02342/和光純薬)溶液を95μL添加し、基質の脱リン酸化により生じる吸光度変化(OD410)をマイクロプレートリーダー(SH−9000Lab/コロナ電気)を用いて、20〜30secごとに18回測定した。測定温度は、45℃とした。酵素の比活性(μmol p−NP/mg protein/sec)は、既知濃度の酵素産物(p−NP:p−ニトロフェノール、299−58641/和光純薬)の検量線を利用して求めた。なお、酵素の希釈、および基質、酵素産物の溶解、希釈には、下記のバッファを使用し、基質溶液のp−NPP濃度は、1mMとした。比較対照としては、ウシ小腸由来のALPであるCIAPを酵母発現させたもの(AP highly active rec. EIA Grade,CR,03 535 452/Roche)、およびPLAP(Placental Alkaline Phosphatase、P3895/Sigma)を使用した。
基質、酵素産物希釈、溶解バッファ:1M DEA−HCl(pH9.5)、1mM MgCl2
抗原には、血清タンパク質であるヒト由来のTransferrin(Calbiochem/616419)を使用した。2×サンプルバッファで10ng〜3pg/15μLとなるように希釈列を作製し、1レーンあたり15μLロードして、SDS−PAGEを行った。同じ希釈列のTransferrinが転写されたHybond P(PVDF)メンブレンを作製し、抗原抗体反応後、検出感度を比較した。詳しい手順および比較対照に用いた試薬を以下に示す。
ゲル:ミニプロティアンTGXゲル10%(Bio−Rad/456−1035)
泳動バッファ:25mM Tris−HCl(pH8.3)、192mM グリシン、0.1% SDS
↓
ブロッティング(200mA 定電流条件、40min)
メンブレン:Hybond Pメンブレン(GEヘルスケア/RPN2020F)
転写バッファ:25mM Tris−HCl(pH8.3)、192mM グリシン、20%メタノール
↓
メンブレン洗浄(TBS、3min ×2回)
TBS(20mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2.68mM KCl)
↓
ブロッキング(5% Skim Milk Powder(198−10605/Wako)/TBST、室温、撹拌、60min)
TBST(0.1% Tween20/TBS)
↓
メンブレン洗浄(TBST、5min×3回)
↓
1次抗体反応(室温、撹拌、60min)
抗体:Rabbit anti−human Transferrin antibody(DAKO/A0061) 1/2,000希釈 (4.3μg/mL TBST)
↓
メンブレン洗浄(TBST、5min×4回)
↓
pG−アルカリホスファターゼ反応(室温、撹拌、60min)
pG−BAP変異体精製標品、Fr.1を使用
処理濃度:0.5μg/mL TBST
↓
メンブレン洗浄(TBST、5min×4回)
↓
発光検出
7,200secまで150sec毎に画像取得。
測定器:Chemidoc XRS+(170−8265J1PC/Bio−Rad)
発光基質:CDP−Star Ready−to−use(Roche/12041677001)
pG−CIAP(Protein G Alkaline Phosphatase Conjugated、PG00−05/Rockland)
1.ALP活性
図18には、pG−D153G/D330NおよびpG−D153H/D330N(いずれもpG結合位置:N末端)のALP活性測定結果を示す。測定値のばらつきが若干、大きいが、pG−D153G/D330Nの比活性は、350〜450μmol p−NP/mg prot./minであり、TMN培地の方が比活性は、若干高い傾向にあった。
pG−D153G/D330N>pG−K328R/D330N>pG−D153H/D330N
精製標品(Fr.1)を用いたウエスタンブロットを行い、発光検出を行った結果を図20〜23に示す。pG−D153G/D330Nは、pBIC8(2SLN培地)を除いて3〜10pgのTransferrinを検出することが可能であった。対照のpG−CIAPは、100pg程度であることから、pG−D153G/D330Nの検出感度は、10〜30倍高い可能性が示唆された(図20)。一方、pG−D153H/D330Nの検出感度は、30〜100pgであり、市販のpG−CIAPと大きな差はなく、その低い酵素活性が検出感度に反映されているものと考えられた(図21)。pG−K328R/D330Nの場合は、pG−D153G/D330Nより若干、劣るが、pGをN末端、C末端に結合したもの双方とも10pg程度の検出感度であり、対照のpG−CIAPより10倍程度高い可能性が示唆された(図22,23)。
Claims (3)
- プロテインGのC1ドメイン、プロテインGのC2ドメインおよびプロテインGのC3ドメインのうち少なくとも1つを含むタンパク質ドメインと、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ(BAP)の153位のアミノ酸残基AspをGlyにより置換し、330位のアミノ酸残基AspをAsnにより置換した2重変異体D153G/D330N、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ(BAP)の153位のアミノ酸残基AspをHisにより置換し、330位のアミノ酸残基AspをAsnにより置換した2重変異体D153H/D330N、または大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ(BAP)の328位のアミノ酸残基LysをArgにより置換し、330位のアミノ酸残基AspをAsnにより置換した2重変異体K328R/D330Nとを融合したものであることを特徴とするタンパク質検出用融合タンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質検出用融合タンパク質であって、
前記タンパク質ドメインが、プロテインAのBドメイン、プロテインGのC2ドメインおよびプロテインGのC3ドメインが結合されたものであることを特徴とするタンパク質検出用融合タンパク質。 - タンパク質の検出方法であって、
請求項1または2に記載のタンパク質検出用融合タンパク質と、対象物中に存在するタンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合している前記タンパク質検出用融合タンパク質のアルカリホスファターゼ部分を標識部分として検出することを特徴とするタンパク質の検出方法。
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