CN105829348B - 蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法 - Google Patents

蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105829348B
CN105829348B CN201480056879.XA CN201480056879A CN105829348B CN 105829348 B CN105829348 B CN 105829348B CN 201480056879 A CN201480056879 A CN 201480056879A CN 105829348 B CN105829348 B CN 105829348B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
domain
amino acid
double mutant
bap
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480056879.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105829348A (zh
Inventor
神谷典穗
松叶恭一
永井贤治
林浩之辅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyushu University NUC
Hitachi Ltd
Original Assignee
Kyushu University NUC
Hitachi Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyushu University NUC, Hitachi Ltd filed Critical Kyushu University NUC
Publication of CN105829348A publication Critical patent/CN105829348A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105829348B publication Critical patent/CN105829348B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种蛋白质检测用融合蛋白，其为使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个蛋白质结构域与将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成Gly且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153G/D330N、将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成His且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153H/D330N、或将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体K328R/D330N融合而得的。

Description

蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法
技术领域
本发明涉及蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法。
背景技术
生物试样中存在各种蛋白质，作为用于对特定蛋白质进行检测、定量的方法，已知有ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酶联免疫分析)等。
ELISA是使用酶标记抗体利用抗原抗体反应定量地检测试样中所含的抗原等特定蛋白质的方法，是免疫检查等中通用的方法之一。ELISA中，已知的是直接吸附法、三明治法、竞争法等。
例如，使针对吸附于固相表面的目标物质(抗原)的一抗通过抗原抗体反应进行结合。洗去未反应的一抗后，添加带有酶标记的标记二抗，再次通过抗原抗体反应进行结合。在其中洗去未反应的标记二抗、添加显色底物时，与抗原的量成比例地引起显色反应。通过吸光光度计等对所生成的显色物质的吸光度进行测定，由使用已知浓度的标准品制作的标准曲线能够对抗原的量进行定量。
但是，这样的方法中，对于与目标物质(抗原)特异性结合的一抗，需要与其特异性结合的标记二抗，在检测多种目标物质(抗原)时，需要准备分别与多种一抗特异性结合的标记二抗，通用性差。
一直以来，作为蛋白质检测用的酶，已知有碱性磷酸酶，其中，广泛使用的是CIAP(Calf Intestine Alkaline Phosphatase，小牛肠碱性磷酸酶)。CIAP是由牛的小肠纯化而得的，一直被广泛地使用，近年来，通过基因重组而制作的CIAP也有售。但是，前者生产成本高，难以保持稳定的品质。此外，后者的情况下，为了降低生产成本而用酵母等表达进行生产，但是大多情况下发生糖链的过度附加、背景、粘性等问题。此外，CIAP虽然活性高，但稳定性、特别是热稳定性差，难以长期维持活性，无法用于需要加热的基因相关应用。进而，稀释时其活性也会降低，因此在长时间、以低浓度使用的实际应用中，无法充分发挥其高活性特性。
BAP(Bacterial Alkaline Phosphatase，细菌碱性磷酸酶)虽然稳定性高，但其活性与CIAP相比仅为数十分之一左右，活性低，因此几乎不被用于蛋白质检测中。
另一方面，存在如下方法：使用通过化学反应使碱性磷酸酶等酶和G蛋白结合而得的酶标记G蛋白，来代替标记二抗。G蛋白是来自链球菌的细胞壁的蛋白质，具有与几乎所有哺乳动物的IgG发生结合的性质。若使用这样的酶标记G蛋白，则能够与多种免疫种(免疫種)的一抗结合，即使在对多种目标物质(抗原)进行检测的情况下，也可以不准备与各物质分别特异性结合的抗体，通用性高。
但是，使用用碱性磷酸酶等酶标记的酶标记G蛋白的方法存在检测灵敏度低的问题。此外，也存在热稳定性差的种类，有时会在处理中失活。
非专利文献1记载了：制作使G蛋白(SpG)的C1结构域结合于海萤荧光素酶的N末端的融合蛋白，但没有抗体结合能力，与在两者间***了连接子(リンカー)GGGGS的蛋白结果相同。
非专利文献2记载了G蛋白的基因序列、氨基酸序列、结构、各结构域的功能等。
非专利文献3记载了对BAP的特定位置的氨基酸残基进行了置换的双重突变体、例如D153G/D330N、D153H/D330N等，对活性、稳定性、最适pH、底物、金属离子的亲和性和活性进行了考察。
专利文献1中记载了对BAP的特定位置的氨基酸残基进行了置换的突变体D153G、K328R及双重突变体V99A/K328R，记载了用于三明治ELISA、竞争法等用途。
专利文献2中记载了BAP的第329位、第330位、第153位/第328位的突变体，并记载了进行与抗原的融合蛋白的制作和竞争ELISA。
专利文献3中记载了K328R等BAP突变体，记载了与抗体进行化学结合进行ELISA。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第3560972号公报
专利文献2:日本特开平9-098780号公报
专利文献3:日本专利第2620416号公报
非专利文献
非专利文献1:Engineering of functional chimeric protein G-Vargulaluciferase,ANALYTICAL BIOCHEMISTRY,249(2),pp.147-152(1997)
非专利文献2:Expression and purification of a truncated recombinantstreptococcal protein G,Biochem J.,267(1),pp.171-177(1990)
非专利文献3:Improving Escherichia coli Alkaline Phosphatase Efficacyby Additional Mutations inside and outside the Catalytic Pocket.,Chembiochem.,2,pp.517-523,(2001)
发明内容
发明要解决的课题
本发明在于，提供一种通用性高、检测灵敏度高、且稳定性高的蛋白质检测用融合蛋白及使用其的蛋白质检测方法。
用于解决课题的手段
本发明为一种蛋白质检测用融合蛋白，其为使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成Gly且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153G/D330N、将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成His且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153H/D330N、或将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体K328R/D330N融合而成的。
此外，前述蛋白质检测用融合蛋白中，前述蛋白质结构域优选A蛋白的B结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域结合而成的结构域。
此外，本发明为一种蛋白质检测方法，使前述蛋白质检测用融合蛋白和对象物中存在的蛋白质直接或间接结合，对所结合的前述蛋白质检测用融合蛋白的碱性磷酸酶部分作为标记部分进行检测。
发明效果
本发明中，通过使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的双重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、或K328R/D330N融合，从而能够提供一种通用性高、检测灵敏度高、且稳定性高的蛋白质检测用融合蛋白及使用其的蛋白质检测方法。
附图说明
图1为表示本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白的一例的结构的示意图。
图2为表示实施例1中的、pG-D153G/D330N(pG结合位点：N末端)的表达量的图(2SLN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-D153G/D330N的泳动位置)。
图3为表示实施例1中的、pG-D153G/D330N(pG结合位点：N末端)的表达量的图(TMN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-D153G/D330N的泳动位置)。
图4为表示实施例1中的、pG-D153H/D330N(pG结合位点：N末端)的表达量的图(2SLN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-D153H/D330N的泳动位置)。
图5为表示实施例1中的、pG-D153H/D330N(pG结合位点：N末端)的表达量的图(TMN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-D153H/D330N的泳动位置)。
图6为表示实施例1中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端)的表达量的图(2SLN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位置)。
图7为表示实施例1中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端)的表达量的图(TMN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位置)。
图8为表示实施例1中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端)的表达量的图(2SLN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位置)。
图9为表示实施例1中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端)的表达量的图(TMN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位置)。
图10为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白(pG-D153G/D330N)的纯化的图(载体：pBIC4、pBIC7、pBIC8、培养基：2SLN、箭头表示pG-D153G/D330N的泳动位置)。
图11为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白(pG-D153G/D330N)的纯化的图(载体：pBIC4、pBIC7、pBIC8、培养基：TMN、箭头表示pG-D153G/D330N的泳动位置)。
图12为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白(pG-D153H/D330N)的纯化的图(载体：pBIC7、pBIC8、培养基：2SLN、箭头表示pG-D153H/D330N的泳动位置)。
图13为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白(pG-D153H/D330N)的纯化的图(载体：pBIC7、pBIC8、培养基：TMN、箭头表示pG-D153H/D330N的泳动位置)。
图14为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白(pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端))的纯化的图(载体：pBIC4、pBIC8、培养基：2SLN、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位置)。
图15为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白(pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端))的纯化的图(载体：pBIC4、pBIC8、培养基：TMN、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位置)。
图16为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白(pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端))的纯化的图(载体：pBIC2、pBIC3、pBIC1、培养基：2SLN、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位置)。
图17为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白(pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端))的纯化的图(载体：pBIC1、pBIC3、培养基：TMN、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位置)。
图18为表示实施例3中的、pG-D153G/D330N及pG-D153H/D330N纯化标准品(Fr.1)的ALP活性的图(45℃下测定、图中数值为9个重复测定的平均值±标准偏差)。
图19为表示实施例3中的、pG-K328R/D330N纯化标准品(Fr.1)的ALP活性的图(45℃下测定、图中数值为9个重复测定的平均值±标准偏差)。
图20为表示实施例3中的、pG-D153G/D330N(pG结合位点：N末端)的蛋白印迹结果的图。
图21为表示实施例3中的、pG-D153H/D330N(pG结合位点：N末端)的蛋白印迹结果的图。
图22为表示实施例3中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端)的蛋白印迹结果的图。
图23为表示实施例3中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端)的蛋白印迹结果的图。
图24为表示pG-BAP突变体(D153G/D330N)的氨基酸序列的图。
图25为表示pG-BAP突变体(D153H/D330N)的氨基酸序列的图。
图26为表示pG-BAP突变体(K328R/D330N(pG结合位点：N末端))的氨基酸序列的图。
图27为表示pG-BAP突变体(K328R/D330N(pG结合位点：C末端))的氨基酸序列的图。
图28为表示pBIC载体图谱的图(在分泌信号的下游直接***了目标基因。启动子：来自于桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis)的P22、P2蛋白质基因的5’序列、Rep：质粒自我复制相关蛋白、Ori：质粒复制起点、Nmr：新霉素耐性基因)。
具体实施方式
以下说明本发明的实施方式。本实施方式是用于实施本发明的一个例子，本发明不受本实施方式限定。
本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白是使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的双重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、或K328R/D330N融合而成的。
作为与检测对象蛋白直接或间接结合的蛋白质结构域，本发明人等着眼于G蛋白。G蛋白是来自于链球菌的细胞壁的蛋白，具有与几乎所有哺乳动物的IgG发生结合的性质。研究将该G蛋白用碱性磷酸酶标记后能否作为标记二抗等的替代物来利用。
此外，作为与检测灵敏度及稳定性有关的酶标记、即碱性磷酸酶，本发明人等着眼于大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位或第328位的氨基酸残基与活性有关、第330位的氨基酸残基与稳定性有关这一点，选出大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的双重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、及K328R/D330N。BAP的双重突变体D153G/D330N及D153H/D330N与此前常用的CIAP相比稳定性高、与BAP(Wild type，野生型)相比活性高。
这里，BAP的双重突变体D153G/D330N是将BAP的第153位的氨基酸残基Asp置换成Gly且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的突变体，D153H/D330N是将BAP的第153位的氨基酸残基Asp置换成His且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的突变体，K328R/D330N是将BAP的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的突变体。
本发明人等进行了深入研究，发现通过使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与BAP的双重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、或K328R/D330N融合，可获得通用性高、检测灵敏度高、且稳定性高的蛋白质检测用融合蛋白。
作为蛋白质结构域，只要包含作为G蛋白的IgG结合结构域的C1结构域、C2结构域及C3结构域中的至少一个即可，没有特别限制，从不易从抗体脱离等观点出发，优选包含G蛋白的C2结构域和G蛋白的C3结构域进行连结的结构域。此外，从G蛋白对抗体等的反应性提高等观点出发，优选包含A蛋白的E结构域、A蛋白的D结构域、A蛋白的A结构域、A蛋白的B结构域、A蛋白的C结构域中的至少一个，更优选包含A蛋白的B结构域。特别优选A蛋白的B结构域、G蛋白的C2结构域和G蛋白的C3结构域结合而成的结构域。
既可以是使G蛋白的C2结构域与融合型碱性磷酸酶的C末端侧融合而成的产物，也可以是使其与N末端侧融合而成的产物。从表达稳定性等观点出发，优选使G蛋白的C2结构域与融合型碱性磷酸酶的N末端侧融合而成的产物。
本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白可以具有His标签等标签，所述His标签是标签肽的一种，由6个左右的连续的组氨酸(His)残基构成。
图1示意性示出本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白的一个例子的结构。本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白例如是：在BAP的双重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、或K328R/D330N的N末端侧结合有A蛋白的B结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域、且在BAP的双重突变体的C末端侧附加有His标签的蛋白；在BAP的双重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、或K328R/D330N的C末端侧结合有A蛋白的B结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域、且在G蛋白结构域的C末端侧附加有His标签的蛋白。
本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白可以通过基因工程手法、以使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与BAP的双重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、或K328R/D330N融合而成的融合蛋白形式来表达而获得。此外，此时还可以对G蛋白结构域或BAP的双重突变体的N末端侧或C末端侧赋予His标签等标签。
融合蛋白的纯化可以利用附加于N末端或C末端的纯化用肽标签(例如，(His)6-tag(六组氨酸标签))通过凝胶过滤色谱、固定化金属离子亲和色谱等来进行。
融合蛋白的氨基酸序列的确认可以通过对编码该蛋白的质粒载体的基因序列进行DNA测序来进行确认。融合蛋白的纯化的确认可以用SDS-PAGE等来进行。
根据本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白，能够对几乎所有动物种类的一抗进行检测。本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白的检测灵敏度比现有的标记G蛋白高、稳定性也高。此外，检测灵敏度与现有的标记二抗相同或更高，通用性高。若使用本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白，则能够与多种免疫种的(一次)抗体结合，可以不针对每个免疫种准备二抗，通用性高。
该蛋白质检测用融合蛋白是来自于细菌的蛋白质，不存在翻译后修饰的问题，可以用微生物的表达体系进行制作。此外，若利用分泌表达体系，则能够高效率地进行生产。与对来自动物的蛋白进行提取、纯化或用动物细胞对来自动物的蛋白进行表达、生产的情况相比，能够更廉价地进行制造。
来自于动物的CIAP等含有糖链。据称，糖链是吸附于测定容器、膜等的原因之一，有时会产生高背景。但是，BAP的双重突变体由于不存在作为高背景的原因的糖链修饰，因此不易产生在来自于动物的酶中可见的由背景及高粘性导致的操作问题等。
酶部分与BAP相比活性高，与CIAP相比稳定性优异，在高温下也具有一定程度的耐性，因此还可以用于必须进行温度处理的基因检测(杂交)等的灵敏度的提高中。此外，与现有的pG-CIAP相比，能够以高灵敏度检测蛋白质。
＜蛋白质检测方法＞
本实施方式的蛋白质检测方法是使前述蛋白质检测用融合蛋白与存在于对象物中的蛋白质直接或间接结合、对所结合的蛋白质检测用融合蛋白的碱性磷酸酶部分作为标记部分进行检测的方法。
本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法可以用于例如蛋白印迹、ELISA、免疫沉降、免疫组化(免疫染色)等基础研究领域、病理检查领域等。
实施例
以下列举实施例及比较例对本发明进行更具体、详细的说明，但本发明不受以下实施例限定。需要说明的是，下述实施例中，室温是指20～25℃下ある。
[实施例1]
在Brevibacillus表达载体中***pG-BAP突变体的基因片段，进行表达载体的构建。完成了表达载体的构建后，实施转化及规定时间的培养，将培养上清和菌体分离后，确认培养上清中所含的目标蛋白的生产量。
＜材料及试验方法＞
1.表达载体(质粒)
使用了Brevibacillus的分泌表达暗示各目标蛋白的最适的蛋白质合成速度及分泌信号可能是不同的。因此，使用了将2种启动子(pBIC1、pBIC2、pBIC3、pBIC4：P22启动子(序列号9)、pBIC5、pBIC6、pBIC7、pBIC8：P2启动子(序列号10))及4种的分泌信号(pBIC1、pBIC5：序列号11、pBIC2、pBIC6：序列号12、pBIC3、pBIC7：序列号13、pBIC4、pBIC8：序列号14)组合的共计8种表达用载体(参照图28)。
使用的载体：pBIC1～pBIC8[HIGETA SYOYU有限公司提供]
2.表达载体的构建
在pG-BAP突变体的基因片段(pG-D153G/D330N、pG-D153H/D330N及pG-K328R/D330N)向表达用载体的***中，利用了无需酶处理的简便质粒构建法、即BIC法(Brevibacillus In vivo Cloning)。BIC法中，将在编码目标蛋白的基因的两端附加有与直链状表达载体的两末端相同的15bp的序列的DNA与载体混合，导入感受态细胞。在菌体内发生同源重组反应，形成表达质粒。对8种载体中的能够构建载体、能够获得目标蛋白表达用的载体的载体实施下述的表达试验。
3.分泌表达用宿主
桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)HPD31-SP3株[HIGETA SYOYU有限公司提供]
4.Brevibacillus的转化(DNA导入)
将短芽孢杆菌HPD31-SP3株用MT培养基(添加有20mM MgCl2的TM培养基(参照表1))在37℃下振荡培养至对数增殖期，通过离心分离收集菌体。然后，悬浮在50mM Tris-HCl(pH7.5)中，通过离心分离收集菌体后，再悬浮于50mM Tris-HCl(pH8.5)，37℃下振荡60分钟。对所振荡的悬浊液500μL进行离心分离而收集菌体，加入2ng/μL的表达载体DNA溶液5μL和0.5M NaSO3/70mM磷酸缓冲液(pH6.3)50μL的混合液，悬浊，静置5分钟后，添加40％PEG6000/70mM磷酸缓冲液(pH6.3)150μL，用涡旋混合器搅拌、悬浊。
[表1]
表1
TM培养基
葡萄糖 10g/L
植物蛋白胨 10g/L
Ehrlich鲣鱼提取物 5g/L
粉末酵母提取物S 2g/L
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 10mg/L
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 10mg/L
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1mg/L
(调整至pH7.0)
5.转化体的筛选
对进行了转化的菌体通过离心分离而收集菌体，悬浮于1mL的TM培养基，37℃下振荡60分钟。然后，涂抹于TMN(在TM培养基中添加有10μg/mL的新霉素的琼脂培养基)，37℃培养30小时，对转化体进行筛选。
6.转化体的培养
将3mL的TMN培养基、及2SLN培养基(在2SL培养基(参照表2)中添加50μg/mL的新霉素)分装到直径16mm的试管，接种前项中筛选出的单一菌落。在30℃、120rpm的条件下进行48小时的振荡培养。
[表2]
表2
2SL培养基
葡萄糖 20g/L
Bacto大豆蛋白胨 40g/L
Bacto酵母提取物 5g/L
MgSO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 100mg/L
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 10mg/L
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 10mg/L
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1mg/L
7.菌体和培养上清的分离
进行离心分离(5000g、5分钟)将菌体和培养上清分离。使培养上清通过0.22μm的过滤灭菌用过滤器，将菌体去除。
8.表达确认
在培养上清中添加等量的2×样品缓冲液，100℃下变性5分钟后，供于SDS-PAGE，进行了各样品中的生产蛋白质的大小确认、及表达生产量的推定、比较。
<结果>
1.菌体内及培养上清中的表达确认
·pG-D153G/D330N(pG结合位点：N末端)
对于pG-D153G/D330N，对2种载体及4种信号肽的共8种组合中能够获得表达质粒的4种实施了表达试验。在2SLN培养基(培养上清)的情况下，pBIC4、pBIC7及pBIC8可确认到高水平的表达量，各个重复间也几乎没有差异，显示其在进行稳定的表达。获知：在TMN培养基中，除了表达量比2SLN培养基多以外也为同样的倾向，对于pBIC6而言，两种培养基中都几乎不生产目标蛋白(图2、3)。pG-D153G/D330N的氨基酸序列如图24及序列号1所示，DNA序列如序列号2所示。
·pG-D153H/D330N(pG结合位点：N末端)
获得了5种表达载体的pG-D153H/D330N的情况下，在2SLN及TMN两培养基中可见高表达的是pBIC7及pBIC8，具有在TMN培养基中表达量多的倾向。也未确认到各个重复间的偏差，因此暗示了显示稳定的表达的可能性。在pBIC1、pBIC5及pBIC6中，几乎未确认到pG-D153H/D330N的表达(图4、5)。pG-D153H/D330N的氨基酸序列示于图25及序列号3，DNA序列示于序列号4。
需要说明的是，pG-D153G/D330N、pG-D153H/D330N两者的表达量都多，由SDS-PAGE的条带强度可以期待g/L水平的生产量。
·pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端)
pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端)的情况下，获得的4种表达载体中生产目标蛋白的是pBIC4及pBIC8。任一者在各个重复间的偏差小、显示出稳定的表达，从培养基种类来看，可确认到pBIC8在TMN培养基中表达量相对地多的倾向(图6、7)。pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端)的氨基酸序列如图26及序列号5所示，DNA序列如序列号6所示。
·pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端)
C末端结合有pG的K328R/D330N的情况下，所获得的3种表达载体(pBIC1、pBIC2、pBIC3)的结果是：在2SLN培养基中各载体均确认到目标蛋白的生产，在TMN培养基中，pBIC2的生产量显著少。我们认为：将N末端结合有pG的情况与C末端结合有pG的情况相比，确认到生产的表达载体在目标蛋白条带强度方面没有较大差异。但是，结合在C末端的表达载体在3个重复的试验中不能同等地生产，暗示与结合在N末端的表达载体相比蛋白质表达可能缺乏稳定性(图8、9)。pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端)的氨基酸序列如图27及序列号7所示，DNA序列如序列号8所示。
[实施例2]
在用Brevi bacillus表达的BAP突变体中，如上所述组氨酸标签(H6tag)附加在C末端，可以用Ni-NTA柱比较简便地进行纯化。本实施例中，从培养上清获得纯化标准品。
＜材料及试验方法＞
1.目标蛋白的纯化
使用作为Ni-NTA柱的一种的His SpinTrap Kit(28-9321-71/GE Healthcare)进行简单纯化。纯化操作按照所附的处理说明书进行，使用300～600μL的培养上清，将柱结合时的培养上清的咪唑浓度、以及结合(洗涤)缓冲液的咪唑浓度设为40mM、洗脱缓冲液的咪唑浓度设为500mM。此外，将培养上清加到柱中后，进行3次洗涤，实施2次酶洗脱，将洗脱级分分别设为级分1、2(Fr.1、Fr.2)。
2.脱盐及浓缩
纯化的突变体酶液含有高浓度的咪唑，进行了预讨论，结果确认对酶活性有不良影响，因此为除去咪唑而实施脱盐、进行溶剂交换而交换为保存缓冲液(下述)。该操作中，使用了凝胶过滤法(Zeba Desalt Spin Columns、89890/Thermo Scientific)、或超滤法(Amicon Ultra Centrifugal Filters、10K membrane、UFC501024/Millipore)。溶剂交换后的纯化标准品通过超滤(同上)而浓缩4～5倍左右，4℃下保存。
保存缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、1mM MgCl2、20μM ZnCl2
3.纯度确认及蛋白质定量
获得的纯化标准品通过SDS-PAGE法确认了纯度。凝胶使用了Mini-PROTEAN(注册商标)TGX(商标)预制胶(456-1036/Bio-Rad)。电泳后的凝胶通过用纯水洗涤、CBB染色(Quick-CBB PLUS、178-00551/和光纯药)而使蛋白质条带可视化。
蛋白质定量通过Micro BCA法(BCA Protein Assay Reagent Kit、23227/ThermoScientific)进行。将规定量的纯化标准品和检测试剂等量混合后，在60℃下处理1小时，冷却，然后测定OD562。使用BSA(Bovine Serum Albumin)作为标准蛋白质制作标准曲线，求出蛋白质含量。
＜结果＞
1.利用Ni-NTA柱进行的纯化
·pG-D153G/D330N(pG结合位点：N末端)
对于表达试验中表达量多的pG-D153G/D330N中的载体及培养基的组合，由培养上清使用Ni-NTA柱进行了简单纯化(图10、11)。供试的任一组合(pBIC4、pBIC7、pBIC8)的纯化级分中，杂蛋白均被几乎完全除去，能够获得高纯度的纯化标准品。
·pG-D153H/D330N
在pG-D153H/D330N的情况下，在2SLN培养基及TMN培养基两者中，pBIC7及pBIC8的组合也能够纯化出高纯度的标准品。此外，纯化标准品的分子量也与pG-D153G/D330N为同样的结果(图12、13)。
·pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端)
使用2SLN培养基时，pBIC4能够利用Ni-NTA柱进行纯化，能够获得高纯度的纯化标准品。但是，pBIC8的柱未结合级分中仅存在少量蛋白质，在此后的柱洗涤中也同样。即使使用具有高浓度咪唑的洗脱缓冲液也几乎无法获得，暗示蛋白质牢固吸附于Ni-NTA柱，可能无法回收(图14)。TMN培养基的情况下，pBIC4、pBIC8两者都能够纯化出目标蛋白(图15)。仅仅在使用2SLN培养基的情况下pBIC8吸附于柱的原因目前尚未阐明。
·pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端)
对于pG-K328R/D330N(pG结合位置：C末端)也同样地对确认了蛋白质表达量的情况实施了简单纯化(图16、17)。2SLN培养基的情况下，pBIC1、pBIC2及pBIC3能够获得纯化标准品，此外，TMN培养基的情况下，pBIC1、pBIC3能够获得纯化标准品。
[实施例3]
对纯化获得的各标准品的酶部分、及抗体结合蛋白部分实际是否能发挥功能进行了确认，为了研究能否用作蛋白质检测试剂，以市售的试剂作为对照，实施了碱性磷酸酶(ALP)活性测定和蛋白印迹中的检测灵敏度的比较。
＜材料及试验方法＞
1.ALP活性测定
将酶标准品用酶稀释缓冲液稀释为规定浓度，在96孔微孔板的各孔中添加5μL。然后，添加底物(p-NPP：对硝基苯磷酸盐、149-02342/和光纯药)溶液95μL，使用酶标仪(SH-9000Lab/コロナ电气)对底物的去磷酸化所引起的吸光度变化(OD410)每隔20～30sec测定，测定18次。测定温度设为45℃。酶的比活性(μmol p-NP/mg protein/sec)利用已知浓度的酶产物(p-NP：对硝基苯酚、299-58641/和光纯药)的标准曲线而求出。需要说明的是，酶的稀释及底物、酶产物的溶解、稀释中使用了下述缓冲液，底物溶液的p-NPP浓度设为1mM。作为比较对照，使用了用酵母表达的来自牛小肠的ALP即CIAP(AP highly active rec.EIA级,CR,03 535 452/Roche)、及PLAP(Placental Alkaline Phosphatase、P3895/Sigma)。
酶稀释缓冲液：100mM DEA-HCl(pH9.5)、1mM MgCl2
底物、酶产物稀释、溶解缓冲液：1M DEA-HCl(pH9.5)、1mM MgCl2
2.基于蛋白印迹的检测灵敏度研究
抗原使用了作为血清蛋白的来自于人的转铁蛋白(Calbiochem/616419)。用2×样品缓冲液制作了10ng～3pg/15μL的稀释系列，每个泳道上样15μL，进行SDS-PAGE。制作了转印有相同稀释系列的转铁蛋白的Hybond P(PVDF)膜，进行抗原抗体反应后，对检测灵敏度进行了比较。详细步骤以及比较对照中使用的试剂如以下所示。
样品缓冲液(2×)：62.5mM Tris-HCl(pH6.8)、2％SDS、25％甘油、0.01％BPB(Bromophenol blue、029-02912/Wako)、10％巯基乙醇(M3148/Sigma)
SDS-PAGE(200V恒定电压条件、30min)
凝胶：Mini-PROTEAN TGX凝胶10％(Bio-Rad/456-1035)
泳动缓冲液：25mM Tris-HCl(pH8.3)、192mM甘氨酸、0.1％SDS
↓
印迹(200mA恒定电流条件、40min)
膜：Hybond P膜(GE医疗/RPN2020F)
转印缓冲液：25mM Tris-HCl(pH8.3)、192mM甘氨酸、20％甲醇
↓
膜洗涤(TBS、3min×2次)
TBS(20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2.68mM KCl)
↓
封闭(5％Skim Milk Powder(198-10605/Wako)/TBST、室温、搅拌、60min)
TBST(0.1％Tween20/TBS)
↓
膜洗涤(TBST、5min×3次)
↓
一抗反应(室温、搅拌、60min)
抗体：兔抗人转铁蛋白抗体(DAKO/A0061)1/2,000稀释(4.3μg/mL TBST)
↓
膜洗涤(TBST、5min×4次)
↓
pG-碱性磷酸酶反应(室温、搅拌、60min)
pG-BAP突变体纯化标准品使用Fr.1
处理浓度：0.5μg/mL TBST
↓
膜洗涤(TBST、5min×4次)
↓
发光检测
每隔150秒获得图像，直至7,200秒为止。
测定器：ChemiDoc XRS+(170-8265J1PC/Bio-Rad)
发光底物：CDP-Star Ready-to-use(Roche/12041677001)
比较对照试剂
pG-CIAP(Protein G Alkaline Phosphatase Conjugated、PG00-05/Rockland)
＜结果＞
1.ALP活性
图18示出pG-D153G/D330N及pG-D153H/D330N(pG结合位置均为N末端)的ALP活性测定结果。测定值的偏差稍大，但pG-D153G/D330N的比活性为350～450μmol p-NP/mgprot./min，存在TMN培养基情况下比活性较高的倾向。
另一方面，pG-D153H/D330N的比活性为50μmol p-NP/mg prot./min左右，与pG-D153G/D330N相比，该值是显著低的。
图19示出pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端及C末端)的活性测定结果。虽然确认到N末端结合时活性值的大小，但N末端、C末端的情况下其比活性均为200μmol/mgprotein/min左右，我们认为两者间没有大差异。
由以上结果可知，所制作的pG-BAP突变体的ALP活性从高到低分别为：
pG-D153G/D330N＞pG-K328R/D330N＞pG-D153H/D330N
2.基于蛋白印迹的检测灵敏度
使用纯化标准品(Fr.1)进行蛋白印迹并进行了发光检测，结果如图20～23所示。pG-D153G/D330N除了pBIC8(2SLN培养基)以外均能够检测3～10pg的转铁蛋白。作为对照的pG-CIAP为100pg左右，因此暗示了pG-D153G/D330N的检测灵敏度可能高10～30倍(图20)。另一方面，pG-D153H/D330N的检测灵敏度为30～100pg，与市售的pG-CIAP没有大差异，可认为其低酶活性被反映到检测灵敏度中(图21)。pG-K328R/D330N的情况下，比pG-D153G/D330N稍差，但N末端结合有pG、C末端结合有pG的情况下检测灵敏度均为10pg左右，暗示可能比作为对照的pG-CIAP高10倍左右(图22、23)。
基于以上结果可知，由Brevi bacillus分泌表达的目标蛋白保持了抗体结合活性、ALP活性。此外获知，在蛋白印迹这一实际应用中，此次供试的pG-D153G/D330N及pG-K328R/D330N与市售的现有产品相比显示出高检测灵敏度，作为蛋白质检测试剂是有用的。
在K328R/D330N的情况下，无论是N末端还是C末端结合，在ALP活性、蛋白印迹两者中都几乎没有性能差异。
在D153G/D330N、D153H/D330N的情况下，仅研究了pG的结合位点为N末端的情况，但这些变异位点为磷酸、Mg2+及Zn2+的结合位点附近，即使是pG的结合位点为C末端而使立体结构改变，也不会妨碍pG的抗体结合活性，在性能方面获得同等结果的可能性高。
在K328R/D330N的情况下，表达生产的稳定性方面是N末端的情况更为优异。我们认为，原因之一是C末端结合有pG时载体难以在宿主内稳定地保持。

Claims (3)

1.一种蛋白质检测用融合蛋白，其特征在于，是仅由A蛋白的B结构域、来自链球菌细胞壁的G蛋白的C2结构域、来自链球菌细胞壁的G蛋白的C3结构域这3种结构域键合而成的蛋白质结构域的A蛋白的B结构域与双重突变体D153G/D330N的C末端侧或N末端侧、双重突变体D153H/D330N的C末端侧或N末端侧、或者双重突变体K328R/D330N的C末端侧或N末端侧融合而成的，
所述双重突变体D153G/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第153位的氨基酸残基Asp置换成Gly、且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体，
所述双重突变体D153H/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第153位的氨基酸残基Asp置换成His、且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体，
所述双重突变体K328R/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg、且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体。
2.一种非诊断目的的蛋白质检测方法，其特征在于，
使权利要求1所述的蛋白质检测用融合蛋白与对象物中存在的蛋白质直接或间接结合，对所结合的所述蛋白质检测用融合蛋白的碱性磷酸酶部分作为标记部分进行检测。
3.权利要求1所述的蛋白质检测用融合蛋白在制备用于检测对象物中存在的蛋白质的检测剂中的用途，其中权利要求1所述的蛋白质检测用融合蛋白用于与对象物中存在的蛋白质直接或间接结合，所结合的所述蛋白质检测用融合蛋白的碱性磷酸酶部分作为标记部分。
CN201480056879.XA 2013-10-18 2014-10-06 蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法 Active CN105829348B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-217048 2013-10-18
JP2013217048A JP5866715B2 (ja) 2013-10-18 2013-10-18 タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法
PCT/JP2014/077274 WO2015056659A1 (ja) 2013-10-18 2014-10-06 タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105829348A CN105829348A (zh) 2016-08-03
CN105829348B true CN105829348B (zh) 2019-12-06

Family

ID=52828103

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480056879.XA Active CN105829348B (zh) 2013-10-18 2014-10-06 蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9976129B2 (zh)
EP (1) EP3059250A4 (zh)
JP (1) JP5866715B2 (zh)
CN (1) CN105829348B (zh)
WO (1) WO2015056659A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6732368B2 (ja) * 2016-01-12 2020-07-29 東ソー株式会社 アルカリホスファターゼ及びその製造方法
EP3737750B1 (en) 2018-01-09 2024-06-05 Theriva Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of neurodevelopmental disorders
CA3094173A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Synthetic Biologics, Inc. Intestinal alkaline phosphatase formulations
EP3773686B1 (en) 2018-03-20 2023-06-07 Theriva Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of radiation disorders
CN110511282A (zh) * 2019-08-27 2019-11-29 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种用于抗体酶标的双功能蛋白spg-alp及其elisa检测试剂盒
CN110615846B (zh) * 2019-08-27 2022-05-17 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其ELISA试剂盒
CN110511284A (zh) * 2019-08-27 2019-11-29 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种用于抗体酶标的双功能蛋白spg-alp
CN114262714B (zh) * 2021-12-01 2022-08-30 陕西脉元生物科技有限公司 一种富集蛋白、构建方法和应用以及基于其快速检测抗体的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0998780A (ja) * 1995-06-29 1997-04-15 Commiss Energ Atom 修飾された細菌アルカリ性ホスファターゼ及びその用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69127482T2 (de) 1990-02-07 1998-03-19 Abbott Lab Alkalische Phosphatase mit verbesserter spezifischer Aktivität zur Verwendung in Indikatorreagenzien
CA2138382C (en) 1992-07-07 2006-01-17 Wlodzimierz Mandecki Alkaline phosphatase enzymes having improved specific activity for use in indicator reagents
EP2003144A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-17 Institut Pasteur Method for the diagnosis or the screening of an arbovirus infection, reagents useful in said method and their applications
JP6080040B2 (ja) * 2012-11-20 2017-02-15 国立大学法人九州大学 タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0998780A (ja) * 1995-06-29 1997-04-15 Commiss Energ Atom 修飾された細菌アルカリ性ホスファターゼ及びその用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015056659A1 (ja) 2015-04-23
JP5866715B2 (ja) 2016-02-17
JP2015078161A (ja) 2015-04-23
US9976129B2 (en) 2018-05-22
EP3059250A4 (en) 2017-04-05
US20160355791A1 (en) 2016-12-08
EP3059250A1 (en) 2016-08-24
CN105829348A (zh) 2016-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105829348B (zh) 蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法
US11667679B2 (en) Streptavidin muteins and methods of using them
CN105968204B (zh) 一种抗***特异性膜抗原的单域重链抗体
US7960312B2 (en) Method and agent for immobilizing protein via protein bound to silicon oxide-containing substance
Zhang et al. Identification of serum N-acetylmuramoyl-l-alanine amidase as liver peptidoglycan recognition protein 2
CN110376384B (zh) 检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的elisa检测试剂盒
KR20190066027A (ko) 진단 분석에 사용하기 위한 단백질 항원으로서 rep 단백질
WO2010007724A1 (ja) ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド
JP2008255046A (ja) 融合タンパク質、これを用いた抗体捕捉担体および抗原検出法
Ghaedmohammadi et al. The first report on the sortase-mediated display of bioactive protein A from Staphylococcus aureus (SpA) on the surface of the vegetative form of Bacillus subtilis
CN110114676B (zh) 肾素浓度的免疫学测定方法
KR101864375B1 (ko) 바이오 실리카를 이용한 물질의 검출, 분리 또는 정제
CN111925425B (zh) 甲胎蛋白特异性结合多肽及应用
AU2007329171A1 (en) Protein particles
JPH06172400A (ja) 診断試験系における一定の融合パートナーおよび可変抗原部分から成る組換え融合タンパク質での画定されたコーティング
CN113702639A (zh) 产气荚膜梭菌β2毒素抗体的间接ELISA方法
CN112979767B (zh) 检测牛支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用
CN111499702B (zh) 一种马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒及检测方法
CN115772220B (zh) 针对人白介素-1β的兔单克隆抗体及其制备方法和应用
Jember Molecular cloning, expression and purification of recombinant VHH proteins expressed in E. coli
KR101775401B1 (ko) 재조합 단일사슬 항체를 포함하는 다중 미생물 검출용 조성물
JP5810514B2 (ja) タグペプチド
EP4217372A1 (en) Engineered binding proteins for recognition of bacteria
Falk et al. Targeted protein pullout from human tissue samples using competitive elution
CN114184780A (zh) 免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莱克多巴胺的方法及其单链抗体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant