CN112979767B

CN112979767B - 检测牛支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112979767B
Application number: CN202110171271.3A
Authority: CN
Inventors: 李书光; 刘吉山; 沈志强; 肖跃强; 曲光刚; 杨立芳; 赵家磊
Original assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Current assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112979767A

Abstract

本申请公开了一种检测牛支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用。所述抗原组合物包括第一抗原，所述第一抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列。所述抗原组合物还包括第二抗原，所述第二抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列。以本发明的抗原组合物做为ELISA法的包被抗原，对国内牛支原体流行血清型的检出率明显高于现有的进口试剂盒。

Description

检测牛支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，检测牛支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

2015-2019年，流行病学调查显示牛支原体病在国内发病率越来越高，能导致奶牛和肉牛发病，并对部分牛场造成严重的经济损失。牛支原体可以导致牛的关节炎、肺炎和流产等多种疾病，目前在国内多以肺炎的形式出现。

牛支原体与无乳支原体、产碱支原体、丝状支原体丝状亚种山羊亚种、丝状支原体丝状亚种等存在部分共有的抗原蛋白，尤其与无乳支原体在可变表面脂蛋白(Variablesurface lipoproteins(Vsps)是一组具有黏附功能的膜蛋白，在牛支原体对宿主细胞的黏附中起关键作用，这些功能的发挥可能依赖于Vsps的C端抗原决定簇和黏附结构)上存在高度同源。共有的抗原蛋白造成牛支原体与上述支原体的抗血清存在一定的交叉凝集现象，造成临床血清抗体诊断的误判。现有的进口或者国产检测试剂盒，在检测国内流行株的血清抗体时，存在灵敏度不够的情况。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测牛支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用。

一方面，本申请提供了一种用于特异性检测牛支原体抗体的抗原组合物，包括第一抗原，

所述第一抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列、或与SEQ ID No.1所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上且功能与SEQ ID No.1所示序列相同或相近的序列。

在上述抗原组合物中，还包括第二抗原，所述第二抗原的氨基酸序列包括SEQ IDNo.2所示序列，或与SEQ ID No.2所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上且功能与SEQ ID No.2所示序列相同或相近的序列；

优选的，所述第一抗原和所述第二抗原的质量比为1：(1-20)，优选，1：(1-10)，更优选，1：(2-7)，更优选，1：(3-5)。

另一方面，本申请提供了一种多核苷酸，其能够编码以上所述牛支原体抗体的抗原组合物。

在上述多核苷酸中，编码所述第一抗原的多核苷酸序列包括SEQ ID No.3所示序列，或与SEQ ID No.3所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上的序列，或以上序列的互补序列，

编码所述第二抗原的多核苷酸序列包括SEQ ID No.4所示序列，或与SEQ ID No.4所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上的序列，或以上序列的互补序列。

另一方面，本申请还提供了含有以上任一所述多核苷酸的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞。

另一方面，本申请还保护以上任一所述抗原组合物、所述抗原、所述多核苷酸、或所述表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞在制备牛支原体检测产品中的应用，

优选的，所述牛支原体检测的方法为ELISA法，也可为其它方法如免疫胶体金法，

优选的，所述牛支原体检测的靶标为牛支原体抗体，所述牛支原体抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体，更优选的，所述多克隆抗体来自动物体液，更优选，所述多克隆抗体来自动物血液，更优选，血清。

另一方面，本申请还提供了一种特异性检测牛支原体抗体的ELISA试剂盒，包括包被抗原，所述包被抗原为以上任一所述抗原组合物或所述第一抗原。

在上述试剂盒中，当所述包被抗原为所述第一抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.5-3.5μg/ml，优选，1.5-2.5μg/ml，更优选，2.0μg/ml；

当所述抗原组合物包括所述第一抗原和所述第二抗原时，

所述包被抗原中所述第一抗原的包被浓度为0.5-1.5μg/ml，更优选，0.8-1.2μg/ml，更优选，1.0μg/ml，

所述包被抗原中所述第二抗原的包被浓度为2.0-6.0μg/ml，更优选，3.0-5.0μg/ml，更优选，4.0μg/ml。

在上述试剂盒中，还包括用于固定所述包被抗原的固相载体(一般为聚苯乙烯、或聚氯乙烯材质，如试纸条中的PVC板或ELISA板的反应孔的内壁等)、和/或酶标二抗(所述二抗为葡萄球菌A蛋白或免疫血清IgG，所述免疫血清IgG为免疫球蛋白，所述免疫球蛋白可为兔抗牛IgG、羊抗牛IgG、和/或鼠抗牛IgG；所述酶标二抗使用的标记酶可为辣根过氧化物酶)、和/或包被缓冲液、和/或样品稀释液、和/或封闭液、和/或阳性对照、和/或阴性对照、和/或显色液(TMB)、和/或终止液。

另一方面，本申请还保护以上任一所述抗原组合物、所述第一抗原、所述多核苷酸、所述表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞、或所述试剂盒在特异性检测牛支原体中的应用，

优选的，所述特异性检测牛支原体的方法为ELISA法，也可为其它方法如免疫胶体金法，

优选的，所述特异性检测牛支原体的靶标为牛支原体抗体，所述牛支原体抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体，更优选的，所述多克隆抗体包括动物血清。

另一方面，本申请还提供一种特异性检测牛支原体抗体的方法，包括使以上任一所述抗原组合物或所述第一抗原与待测样品中的抗体接触的步骤，优选的，所述待测样品来自动物的体液，更优选，血液，更优选，血清；

优选的，所述检测的方法包括ELISA，也可为其它方法如免疫胶体金法。

本发明的有益效果：

本发明在研究国内外牛支原体全基因组序列的基础上，筛选到2个可变表面脂蛋白，按照计算机预测分析和免疫学相结合的方法，使其按照一定比例混合，可以有效平衡反应原性和敏感性，达到其作为ELISA检测抗原的要求。以本发明的抗原组合物做为ELISA法的包被抗原，对国内牛支原体流行血清型的检出率明显高于现有的进口试剂盒。

附图说明

图1为原核表达的4979.1蛋白的SDS电泳图及western-blot图，其中，M为蛋白Marker，1为超声破碎沉淀，2为超声破碎上清，3为1的western-blot。

图2为原核表达的0148.1蛋白的SDS电泳图及western-blot图，其中，M为蛋白Marker，1为超声破碎上清，2为超声破碎沉淀，3为2的western-blot。

图3为原核表达的2700.1蛋白的SDS电泳图及western-blot图，其中，M为蛋白Marker，1为超声破碎上清，2为超声破碎沉淀，3为2的western-blot。

图4为三种抗原蛋白的反应原性分析结果。

图5为三种抗原组合的反应原性分析结果。

具体实施方式

实施例1、牛支原体特异性抗原蛋白的获得

1.1牛支原体不同毒株全基因序列的获得

从美国国立生物技术信息中心(NCBI)中找到33株具有代表性的牛支原体(Mycoplasma bovis)全基因序列，本实验室分离的牛支原体(文献“山东首例牛支原体病的诊治报告，李书光等，家畜生态学报，2017，38(2)：64-66”1.4中分离得到，以下记为“牛支原体山东株”)，经过公司测序获得其全基因序列。

1.2抗原蛋白的计算机预测分析

使用在线生物学软件PSORTb、Vaxign 2Beta、BLASTp等分析不同牛支原体毒株的蛋白定位、跨膜区、抗原参数和同源性比对，得到如下候选牛支原体特异性抗原蛋白4979.1、0148.1、2700.1。

1.3候选牛支原体特异性抗原蛋白的密码子优化和表达载体的构建

使用DNAstar软件分析候选牛支原体特异性抗原蛋白是否含有TGA的密码子，将TGA的密码子修改为TGG后，进一步使用在线的密码子优化软件进行密码子的优化、密码子使用频率分析、大肠杆菌表达适应性参数预测等，优化后的基因序列合成并连接至载体PET-32A获得重组载体以表达相应的候选牛支原体特异性抗原蛋白。

优化后的候选牛支原体特异性抗原蛋白的序列信息如下：

4979.1可变表面脂蛋白：其氨基酸序列(285aa，SEQ ID No.1)如下；

MKKSKFLLLTTLSPIISLPFLSASCITGEKADNKMEKDIKINENTDEKNSSETMNDKQKQNKSSIDSKMEEKADKDSSKSEEGKSMENEHADEKNSSETMNDKQKQNKSSIDSKMEEKADKDSSKSEEGKSMENEHADEKNSSETMNDKQKQDSGTNSDQKDQDSKTNGSSNEPIRPSESAQSDMQIENSEINTYLDEFNEYVKEASLLKEKKEGTEKAKELLDKNPELEKAVKTLSAFHEHLKSGLEKIKKLIEKDIKNPGSELLDTLKEYVKYRKEIQNAIKN；

4979.1可变表面脂蛋白的优化后的基因序列(855bp，SEQ ID No.4)如下：

ATGAAAAAGTCAAAATTTTTGCTATTAACAACTTTGTCTCCGATCATCAGCCTTCCGTTTCTGTCGGCCAGCTGCATTACCGGTGAAAAGGCGGATAATAAAATGGAGAAAGACATTAAGATCAATGAGAACACCGATGAAAAAAACAGCTCCGAGACGATGAATGATAAGCAGAAGCAAAACAAGAGCTCGATCGACAGCAAAATGGAGGAAAAAGCTGATAAGGACAGCAGTAAGTCCGAGGAGGGCAAATCCATGGAAAACGAACATGCTGATGAGAAAAACTCCTCCGAGACCATGAACGACAAACAAAAACAAAACAAAAGCTCGATTGACAGCAAGATGGAGGAGAAAGCGGACAAGGACTCTTCCAAATCTGAAGAGGGCAAATCCATGGAAAACGAGCACGCCGACGAAAAGAACAGCTCAGAAACCATGAATGATAAGCAAAAGCAAGATAGCGGCACCAATAGCGATCAGAAGGACCAGGATAGCAAAACGAATGGTAGCAGCAACGAACCGATTCGCCCAAGCGAAAGCGCGCAGAGCGACATGCAGATCGAAAATTCTGAGATTAACACCTATCTGGATGAATTCAACGAGTACGTGAAGGAAGCAAGCCTGCTCAAAGAGAAGAAAGAGGGCACGGAAAAGGCGAAAGAGTTGCTGGACAAAAACCCGGAACTGGAAAAAGCGGTTAAAACCCTGTCTGCGTTCCACGAACATCTGAAGTCTGGTCTGGAGAAAATCAAAAAGCTGATTGAAAAGGACATCAAGAACCCGGGTTCGGAGCTGTTGGACACCTTAAAGGAGTACGTCAAGTATCGTAAAGAGATCCAGAATGCAATTAAGAAC；

0148.1可变表面脂蛋白：其氨基酸序列(265aa，SEQ ID No.2)如下：

MKKSKFLLLGSVASLASIPFVAAKCGETKEEEKKKPEGDQKPGGDKNPGENKTPGENTDQGKNPGGDKNPGGDKNPGENTEPDKNPGGDKNPGENKTPEGNKTPEGNKTPEGNKTPGENKTPERNPEEGSTNNGIGWGENHLWGKDEDDLEKSKQESDEAEREGEDSEAESEKGSDTESSKKDKGSDTESSKKDKDPKTESSTKAKDPETQSGKPVVKPMVRVTENTSENSKVKKVDKYWDGVTPEDKKKAIESGKFWAEHWELE；

0148.1可变表面脂蛋白的优化后的基因序列(795bp，SEQ ID No.5)如下：

ATGAAAAAGTCAAAATTTCTATTATTGGGATCTGTGGCGAGCCTGGCATCGATCCCGTTCGTGGCGGCTAAGTGCGGTGAAACCAAAGAGGAGGAGAAAAAGAAGCCGGAGGGCGACCAGAAACCGGGTGGCGACAAGAACCCGGGCGAGAACAAGACCCCGGGCGAAAACACGGATCAAGGTAAAAATCCGGGGGGCGATAAAAACCCGGGCGGTGACAAGAACCCGGGCGAGAACACCGAGCCGGATAAGAATCCGGGCGGCGATAAGAATCCGGGTGAGAACAAAACTCCGGAAGGCAACAAAACCCCTGAGGGCAACAAGACGCCAGAGGGTAATAAGACTCCGGGCGAGAACAAGACCCCGGAGCGCAATCCGGAGGAGGGTAGCACGAATAATGGTATCGGTTGGGGTGAGAACCACCTGTGGGGGAAAGACGAGGATGATCTGGAGAAAAGCAAACAAGAATCAGACGAGGCCGAACGTGAAGGTGAAGACAGCGAAGCTGAATCGGAAAAAGGTTCCGACACCGAAAGTAGCAAGAAAGACAAGGGCAGCGACACGGAATCCAGCAAGAAGGACAAGGATCCGAAAACCGAGTCTTCTACCAAAGCGAAAGACCCGGAAACCCAGTCCGGTAAACCGGTGGTTAAACCCATGGTTCGTGTTACCGAGAACACCAGCGAAAACAGCAAGGTGAAAAAAGTCGATAAGTACTGGGATGGTGTTACCCCAGAAGATAAAAAGAAGGCGATTGAAAGCGGTAAGTTTTGGGCAGAACATTGGGAATTGGAA；

2700.1可变表面脂蛋白：其氨基酸序列(290aa，SEQ ID No.3)如下：

MKKSKFLILGSIASSSLLMIAASCDVKKKDVETSNSEKQDSKTNSQSNSGNQGSRPDSESNSGNQGSKINSQSNSGNQGSRPDSESNSEKQDSKTNSQSNSGNQGSRPDSESNSGNQGSKINSQSNSGNQGSRPDSESNSGNQGSKTDSESNSENQDSKTDGSRHESTTPSESTQNDIPTENYKIDDYLNRVKTYGKEANLLITLLAGAWTENYDELQKKYASLWPIVTEFFKLHEKIVSKFDEIKKEIEEFFGKPESKNNKLDNLLKQYEKSRDEIKDAIEVLKRLQKK；

2700.1蛋白的优化后的基因序列(870bp，SEQ ID No.6)如下；

ATGAAAAAGTCAAAATTTTTAATACTAGGAAGCATCGCCAGCAGCTCCCTGTTAATGATTGCGGCGTCTTGCGATGTTAAAAAGAAGGACGTGGAGACAAGCAACAGCGAGAAACAGGACTCGAAGACCAACTCGCAATCTAACTCCGGTAACCAGGGCTCTCGTCCGGACTCCGAGTCCAACTCCGGCAACCAAGGTTCGAAGATCAATAGCCAGAGTAACAGCGGCAACCAAGGTTCACGTCCGGACAGCGAGTCTAATAGCGAGAAACAAGACTCCAAGACCAATTCCCAAAGCAACTCCGGTAACCAGGGTAGCCGTCCGGACTCTGAGTCCAACAGCGGTAACCAGGGTAGCAAAATTAACTCCCAGAGCAATAGCGGCAACCAGGGTAGCCGCCCAGACTCTGAGAGCAACTCCGGTAACCAGGGCTCGAAGACCGACAGCGAGTCTAACAGCGAGAACCAAGACAGCAAGACTGACGGCAGCCGCCATGAATCTACGACCCCGAGCGAAAGTACCCAGAATGATATTCCGACCGAAAATTACAAGATCGATGATTATCTGAATCGTGTTAAAACGTACGGCAAAGAGGCAAATTTGCTCATTACCCTGTTGGCTGGCGCGTGGACCGAAAATTATGATGAACTGCAGAAAAAGTATGCGAGCCTTTGGCCGATTGTGACCGAGTTCTTCAAACTGCACGAAAAGATCGTCAGCAAGTTTGATGAAATTAAAAAGGAAATCGAGGAATTTTTCGGTAAACCGGAATCTAAGAACAACAAACTGGATAATCTGTTGAAGCAATACGAAAAAAGCAGAGATGAGATCAAAGATGCAATCGAAGTTCTGAAACGTCTGCAAAAAAAG。

1.4抗原蛋白的表达和纯化

将步骤1.3中的重组载体分别转入表达宿主菌BL21，挑取阳性菌落，接种含Kan抗生素的LB培养基，使用IPTG诱导、并使用商品化的HIS标签纯化，得到相应的抗原蛋白，经电泳检测，大小符合预期，结果如图1-3所示。

实施例2、不同牛支原体特异性抗原蛋白的反应原性分析

将实施例1步骤1.4得到的纯化后的抗原蛋白分别按照32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25μg/mL的包被浓度梯度包被ELISA板的反应孔。

使用牛支原体山东株的灭活培养物免疫新西兰家兔制备阳性血清，进行其反应原性的研究，以未免疫的新西兰白兔血清为阴性对照。

缓冲液的制备：

包被缓冲液(pH9.6碳酸盐缓冲液)：1.59g的碳酸钠，2.93g的碳酸氢钠，使用超纯水定容至1000ml，pH计确认其pH值为9.6，0.44μm膜过滤后备用。

洗涤缓冲液：称取8.0g氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，6.29g十二水磷酸氢二钠，超纯水定容至1000ml，加入0.5ml吐温-20，调节pH值为7.2，使用0.44μm的膜过滤后，保存备用。

封闭液：使用洗涤缓冲液配制0.8％的牛血清白蛋白，过滤除菌后作为封闭液。

样品稀释液：与封闭液相同。

阳性血清：纯化的蛋白免疫新西兰白兔制备。

阴性对照：未免疫抗原蛋白的健康新西兰白兔血清。

酶标二抗：HRP标记的葡萄球菌A蛋白，使用时用封闭液做1:5000的稀释使用。

终止液：1M的硫酸。

实验流程

1、使用包被缓冲液，将实施例1表达纯化备用的3个蛋白分别稀释至32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25μg/ml，按照每孔100μl加入ELISA反应板中，4℃过夜。

2、甩干弃掉包被缓冲液，每孔加入150μl洗涤缓冲液，震荡2min，甩干；重复洗涤3次。

3、加入封闭缓冲液，每孔200μl，封闭1小时。

4、使用洗涤缓冲液，每孔200μl，震荡2min，甩干；重复洗涤3次。

5、加入制备的阳性血清(使用封闭缓冲液1:100稀释)，每孔100μl，设置8个重复，37℃反应30min。

6、使用洗涤缓冲液，每孔200μl，震荡2min，甩干；重复洗涤3次。

7、加入使用封闭缓冲液1:5000稀释的酶标二抗，每孔100μl，37℃反应30min。

8、使用洗涤缓冲液，每孔200μl，震荡2min，甩干；重复洗涤3次。

9、加入TMB显色液，每孔100μl，室温避光反应15min。

10、加入终止液，每孔50μl，使用酶标仪测定OD450的数值。

结果：不同特异性包被抗原在不同包被浓度下的OD450值如表1、表2和表3所示。根据包被抗原浓度和OD450平均值，使用GraphPAD prism作图如图4所示。

表1、4979.1抗原蛋白的反应原性

表2、0148.1抗原蛋白的反应原性

表3、2700.1抗原蛋白的反应原性

结果表明，通过在图4中绘制OD450＝1.0的水平线，对应的4979.1、0148.1、2700.1三种抗原蛋白包被浓度分别为2、8、20μg/ml。

实施例3、牛支原体特异性抗原蛋白的反应特异性分析

按照实施例2的方法进行，不同之处在于：4979.1、0148.1和2700.1蛋白分别使用2μg/ml、8μg/ml和20μg/ml作为包被抗原进行ELISA板的包被；将蛋白制备的牛支原体兔源阳性血清替换为无乳支原体、产碱支原体、丝状支原体丝状亚种山羊亚种、或丝状支原体丝状亚种的阳性血清进行特异性的测定。

上述无乳支原体、产碱支原体、丝状支原体丝状亚种山羊亚种、或丝状支原体丝状亚种的阳性血清的制备方法如下：

无乳支原体(CVCC344)、产碱支原体(YX)、丝状支原体丝状亚种山羊亚种(CVCC3009)、或丝状支原体丝状亚种丝状亚种(CVCC378)均来源于山东省滨州畜牧兽医研究院重点开放实验室。分别使用上述4株支原体灭活培养物免疫新西兰白兔，制备相应的阳性血清抗体。

结果：如表4所示，使用无乳支原体、产碱支原体、丝状支原体丝状亚种山羊亚种、丝状支原体丝状亚种的阳性血清进行ELISA检测方法特异性的测定中，OD450数值均在0.182以下，牛支原体蛋白阳性血清OD450在0.958-1.158之间，说明实施例2中的3个候选抗原蛋白对无乳支原体、产碱支原体、丝状支原体丝状亚种山羊亚种和丝状支原体丝状亚种的阳性血清均无交叉反应，即能够特异性检测牛支原体的阳性血清。

表4、不同包被抗原的特异性检测结果

实施例4、不同牛支原体特异性抗原蛋白的组合与优化

一、不同牛支原体特异性抗原蛋白的组合配比确定

根据实施例2中各抗原蛋白的OD450值反应原性比较中，4989.1、0148.1和2700.0在OD450值为1时，包被浓度分别约为2、8、20μg/ml，因此设定4979.1与0148.1、4979.1与2700.1、0148.1与2700.1抗原蛋白的混合包被质量比分别为1:4、1:10、2:5。

二、牛支原体特异性抗原蛋白的组合的最佳包被浓度筛选

在步骤一中两两混合的抗原蛋白的总包被浓度分别设为20、10、5、2.5μg/ml的梯度按照实施例2的方法进行包被和ELISA检测，测定抗原组合的最佳包被浓度。结果如表5、表6、表7和图5所示。

表5、4979.1和0148.1抗原蛋白按1:4混合后的检测结果

表6、4979.1与2700.1抗原蛋白按1:10混合后的检测结果

表7、0148.1与2700.1抗原蛋白按2:5混合后的检测结果

结果表明，通过在图5中绘制OD450＝1.0的水平线，三个组合4979.1和0148.1、4979.1和2700.1、0148.1和2700.1的最适包被浓度分别为5、13、20μg/ml。其中，4979.1和0148.1的组合曲线合理，且最佳的浓度最低，为5μg/ml，便于后续成本的降低。

实施例5、盲样检测

1、使用实施例4中确定的4979.1和0148.1最佳包被抗原浓度5μg/ml，比例1:4混合，包被ELISA板。

2、使用商业化的牛支原体抗体检测试剂盒(加拿大Bovincheck公司生产，产品目录编号为201012)筛选到30份阴性临床样本用作临界值的确定。

3、每份步骤2的阴性临床样本(血清)1:100稀释后，做三个重复，按照实施例2中的ELISA流程，进行OD450值的测定，计算临界值＝OD450平均值(X)+3×标准方差(S)。当待测样本OD450平均值<临界值时，结果判定为阴性，当待测样本OD450平均值≥临界值时，结果判定为阳性。

4、以商业化的牛支原体抗体检测试剂盒(加拿大Bovincheck公司生产，产品目录编号为201012)为对照，使用步骤1的ELISA板按照实施例2中的ELISA流程，对临床301余份待测样品(牛血清)分别进行检测，结果如表8所示。

表8、盲样检测结果对比

试剂盒	阳性样本个数	阴性样本个数	阳性检出率
				对照	147	154	48.8％
步骤1	172	129	57.14％

表8结果表明，使用步骤1的ELISA板对牛支原体抗体的阳性检出率明显高于对照商品化试剂盒。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 检测牛支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用

<130> JN-CNP202125

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 285

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Lys Ser Lys Phe Leu Leu Leu Thr Thr Leu Ser Pro Ile Ile

1 5 10 15

Ser Leu Pro Phe Leu Ser Ala Ser Cys Ile Thr Gly Glu Lys Ala Asp

20 25 30

Asn Lys Met Glu Lys Asp Ile Lys Ile Asn Glu Asn Thr Asp Glu Lys

35 40 45

Asn Ser Ser Glu Thr Met Asn Asp Lys Gln Lys Gln Asn Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Asp Ser Lys Met Glu Glu Lys Ala Asp Lys Asp Ser Ser Lys Ser

65 70 75 80

Glu Glu Gly Lys Ser Met Glu Asn Glu His Ala Asp Glu Lys Asn Ser

85 90 95

Ser Glu Thr Met Asn Asp Lys Gln Lys Gln Asn Lys Ser Ser Ile Asp

100 105 110

Ser Lys Met Glu Glu Lys Ala Asp Lys Asp Ser Ser Lys Ser Glu Glu

115 120 125

Gly Lys Ser Met Glu Asn Glu His Ala Asp Glu Lys Asn Ser Ser Glu

130 135 140

Thr Met Asn Asp Lys Gln Lys Gln Asp Ser Gly Thr Asn Ser Asp Gln

145 150 155 160

Lys Asp Gln Asp Ser Lys Thr Asn Gly Ser Ser Asn Glu Pro Ile Arg

165 170 175

Pro Ser Glu Ser Ala Gln Ser Asp Met Gln Ile Glu Asn Ser Glu Ile

180 185 190

Asn Thr Tyr Leu Asp Glu Phe Asn Glu Tyr Val Lys Glu Ala Ser Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Lys Lys Glu Gly Thr Glu Lys Ala Lys Glu Leu Leu Asp

210 215 220

Lys Asn Pro Glu Leu Glu Lys Ala Val Lys Thr Leu Ser Ala Phe His

225 230 235 240

Glu His Leu Lys Ser Gly Leu Glu Lys Ile Lys Lys Leu Ile Glu Lys

245 250 255

Asp Ile Lys Asn Pro Gly Ser Glu Leu Leu Asp Thr Leu Lys Glu Tyr

260 265 270

Val Lys Tyr Arg Lys Glu Ile Gln Asn Ala Ile Lys Asn

275 280 285

<210> 2

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Lys Ser Lys Phe Leu Leu Leu Gly Ser Val Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Ser Ile Pro Phe Val Ala Ala Lys Cys Gly Glu Thr Lys Glu Glu Glu

20 25 30

Lys Lys Lys Pro Glu Gly Asp Gln Lys Pro Gly Gly Asp Lys Asn Pro

35 40 45

Gly Glu Asn Lys Thr Pro Gly Glu Asn Thr Asp Gln Gly Lys Asn Pro

50 55 60

Gly Gly Asp Lys Asn Pro Gly Gly Asp Lys Asn Pro Gly Glu Asn Thr

65 70 75 80

Glu Pro Asp Lys Asn Pro Gly Gly Asp Lys Asn Pro Gly Glu Asn Lys

85 90 95

Thr Pro Glu Gly Asn Lys Thr Pro Glu Gly Asn Lys Thr Pro Glu Gly

100 105 110

Asn Lys Thr Pro Gly Glu Asn Lys Thr Pro Glu Arg Asn Pro Glu Glu

115 120 125

Gly Ser Thr Asn Asn Gly Ile Gly Trp Gly Glu Asn His Leu Trp Gly

130 135 140

Lys Asp Glu Asp Asp Leu Glu Lys Ser Lys Gln Glu Ser Asp Glu Ala

145 150 155 160

Glu Arg Glu Gly Glu Asp Ser Glu Ala Glu Ser Glu Lys Gly Ser Asp

165 170 175

Thr Glu Ser Ser Lys Lys Asp Lys Gly Ser Asp Thr Glu Ser Ser Lys

180 185 190

Lys Asp Lys Asp Pro Lys Thr Glu Ser Ser Thr Lys Ala Lys Asp Pro

195 200 205

Glu Thr Gln Ser Gly Lys Pro Val Val Lys Pro Met Val Arg Val Thr

210 215 220

Glu Asn Thr Ser Glu Asn Ser Lys Val Lys Lys Val Asp Lys Tyr Trp

225 230 235 240

Asp Gly Val Thr Pro Glu Asp Lys Lys Lys Ala Ile Glu Ser Gly Lys

245 250 255

Phe Trp Ala Glu His Trp Glu Leu Glu

260 265

<210> 3

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Lys Lys Ser Lys Phe Leu Ile Leu Gly Ser Ile Ala Ser Ser Ser

1 5 10 15

Leu Leu Met Ile Ala Ala Ser Cys Asp Val Lys Lys Lys Asp Val Glu

20 25 30

Thr Ser Asn Ser Glu Lys Gln Asp Ser Lys Thr Asn Ser Gln Ser Asn

35 40 45

Ser Gly Asn Gln Gly Ser Arg Pro Asp Ser Glu Ser Asn Ser Gly Asn

50 55 60

Gln Gly Ser Lys Ile Asn Ser Gln Ser Asn Ser Gly Asn Gln Gly Ser

65 70 75 80

Arg Pro Asp Ser Glu Ser Asn Ser Glu Lys Gln Asp Ser Lys Thr Asn

85 90 95

Ser Gln Ser Asn Ser Gly Asn Gln Gly Ser Arg Pro Asp Ser Glu Ser

100 105 110

Asn Ser Gly Asn Gln Gly Ser Lys Ile Asn Ser Gln Ser Asn Ser Gly

115 120 125

Asn Gln Gly Ser Arg Pro Asp Ser Glu Ser Asn Ser Gly Asn Gln Gly

130 135 140

Ser Lys Thr Asp Ser Glu Ser Asn Ser Glu Asn Gln Asp Ser Lys Thr

145 150 155 160

Asp Gly Ser Arg His Glu Ser Thr Thr Pro Ser Glu Ser Thr Gln Asn

165 170 175

Asp Ile Pro Thr Glu Asn Tyr Lys Ile Asp Asp Tyr Leu Asn Arg Val

180 185 190

Lys Thr Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Leu Leu Ile Thr Leu Leu Ala Gly

195 200 205

Ala Trp Thr Glu Asn Tyr Asp Glu Leu Gln Lys Lys Tyr Ala Ser Leu

210 215 220

Trp Pro Ile Val Thr Glu Phe Phe Lys Leu His Glu Lys Ile Val Ser

225 230 235 240

Lys Phe Asp Glu Ile Lys Lys Glu Ile Glu Glu Phe Phe Gly Lys Pro

245 250 255

Glu Ser Lys Asn Asn Lys Leu Asp Asn Leu Leu Lys Gln Tyr Glu Lys

260 265 270

Ser Arg Asp Glu Ile Lys Asp Ala Ile Glu Val Leu Lys Arg Leu Gln

275 280 285

Lys Lys

290

<210> 4

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaaaagt caaaattttt gctattaaca actttgtctc cgatcatcag ccttccgttt 60

ctgtcggcca gctgcattac cggtgaaaag gcggataata aaatggagaa agacattaag 120

atcaatgaga acaccgatga aaaaaacagc tccgagacga tgaatgataa gcagaagcaa 180

aacaagagct cgatcgacag caaaatggag gaaaaagctg ataaggacag cagtaagtcc 240

gaggagggca aatccatgga aaacgaacat gctgatgaga aaaactcctc cgagaccatg 300

aacgacaaac aaaaacaaaa caaaagctcg attgacagca agatggagga gaaagcggac 360

aaggactctt ccaaatctga agagggcaaa tccatggaaa acgagcacgc cgacgaaaag 420

aacagctcag aaaccatgaa tgataagcaa aagcaagata gcggcaccaa tagcgatcag 480

aaggaccagg atagcaaaac gaatggtagc agcaacgaac cgattcgccc aagcgaaagc 540

gcgcagagcg acatgcagat cgaaaattct gagattaaca cctatctgga tgaattcaac 600

gagtacgtga aggaagcaag cctgctcaaa gagaagaaag agggcacgga aaaggcgaaa 660

gagttgctgg acaaaaaccc ggaactggaa aaagcggtta aaaccctgtc tgcgttccac 720

gaacatctga agtctggtct ggagaaaatc aaaaagctga ttgaaaagga catcaagaac 780

ccgggttcgg agctgttgga caccttaaag gagtacgtca agtatcgtaa agagatccag 840

aatgcaatta agaac 855

<210> 5

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaaaaagt caaaatttct attattggga tctgtggcga gcctggcatc gatcccgttc 60

gtggcggcta agtgcggtga aaccaaagag gaggagaaaa agaagccgga gggcgaccag 120

aaaccgggtg gcgacaagaa cccgggcgag aacaagaccc cgggcgaaaa cacggatcaa 180

ggtaaaaatc cggggggcga taaaaacccg ggcggtgaca agaacccggg cgagaacacc 240

gagccggata agaatccggg cggcgataag aatccgggtg agaacaaaac tccggaaggc 300

aacaaaaccc ctgagggcaa caagacgcca gagggtaata agactccggg cgagaacaag 360

accccggagc gcaatccgga ggagggtagc acgaataatg gtatcggttg gggtgagaac 420

cacctgtggg ggaaagacga ggatgatctg gagaaaagca aacaagaatc agacgaggcc 480

gaacgtgaag gtgaagacag cgaagctgaa tcggaaaaag gttccgacac cgaaagtagc 540

aagaaagaca agggcagcga cacggaatcc agcaagaagg acaaggatcc gaaaaccgag 600

tcttctacca aagcgaaaga cccggaaacc cagtccggta aaccggtggt taaacccatg 660

gttcgtgtta ccgagaacac cagcgaaaac agcaaggtga aaaaagtcga taagtactgg 720

gatggtgtta ccccagaaga taaaaagaag gcgattgaaa gcggtaagtt ttgggcagaa 780

cattgggaat tggaa 795

<210> 6

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaaaaagt caaaattttt aatactagga agcatcgcca gcagctccct gttaatgatt 60

gcggcgtctt gcgatgttaa aaagaaggac gtggagacaa gcaacagcga gaaacaggac 120

tcgaagacca actcgcaatc taactccggt aaccagggct ctcgtccgga ctccgagtcc 180

aactccggca accaaggttc gaagatcaat agccagagta acagcggcaa ccaaggttca 240

cgtccggaca gcgagtctaa tagcgagaaa caagactcca agaccaattc ccaaagcaac 300

tccggtaacc agggtagccg tccggactct gagtccaaca gcggtaacca gggtagcaaa 360

attaactccc agagcaatag cggcaaccag ggtagccgcc cagactctga gagcaactcc 420

ggtaaccagg gctcgaagac cgacagcgag tctaacagcg agaaccaaga cagcaagact 480

gacggcagcc gccatgaatc tacgaccccg agcgaaagta cccagaatga tattccgacc 540

gaaaattaca agatcgatga ttatctgaat cgtgttaaaa cgtacggcaa agaggcaaat 600

ttgctcatta ccctgttggc tggcgcgtgg accgaaaatt atgatgaact gcagaaaaag 660

tatgcgagcc tttggccgat tgtgaccgag ttcttcaaac tgcacgaaaa gatcgtcagc 720

aagtttgatg aaattaaaaa ggaaatcgag gaatttttcg gtaaaccgga atctaagaac 780

aacaaactgg ataatctgtt gaagcaatac gaaaaaagca gagatgagat caaagatgca 840

atcgaagttc tgaaacgtct gcaaaaaaag 870

Claims

1.一种用于特异性检测牛支原体抗体的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物包括第一抗原，所述第一抗原的氨基酸序列为SEQ ID No.1；

所述抗原组合物还包括第二抗原，所述第二抗原的氨基酸序列为SEQ ID No.2；

所述抗原组合物中所述第一抗原和所述第二抗原的质量比为1：（2-7）。

2.根据权利要求1所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物中所述第一抗原和所述第二抗原的质量比为1：（3-5）。

3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸能够编码权利要求1或2所述牛支原体抗体的抗原组合物。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码所述第一抗原的多核苷酸序列为SEQ ID No.3。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码所述第二抗原的多核苷酸序列为SEQ ID No.4。

6.含有权利要求3所述多核苷酸的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞。

7.权利要求1或2所述抗原组合物、权利要求3-5中任一所述多核苷酸、或权利要求6所述表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞在制备牛支原体检测产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述牛支原体检测的方法为ELISA法。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述牛支原体检测的靶标为牛支原体抗体，所述牛支原体抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体来自动物的体液。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体来自动物的血液。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体来自动物的血清。

13.一种特异性检测牛支原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被抗原，所述包被抗原为权利要求1或2所述抗原组合物。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于固定所述包被抗原的固相载体、和/或酶标二抗、和/或包被缓冲液、和/或样品稀释液、和/或封闭液、和/或阳性对照、和/或阴性对照、和/或显色液、和/或终止液。

15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗原中所述第一抗原的包被浓度为0.5-1.5μg/ml，所述包被抗原中所述第二抗原的包被浓度为2.0-6.0μg/ml。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗原中所述第一抗原的包被浓度为0.8-1.2μg/ml，所述包被抗原中所述第二抗原的包被浓度为3.0-5.0μg/ml。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗原中所述第一抗原的包被浓度为1.0μg/ml，所述包被抗原中所述第二抗原的包被浓度为4.0μg/ml。