JP2014533928A - 癌を処置するためのrna操作t細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2011年9月16日に出願された米国特許仮出願第61/535,608号に係る優先権を主張する。米国特許仮出願第61/535,608号の内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
造血幹細胞移植(SCT)を受けた患者において移植片対白血病(GVL)の影響が明らかにされており、このことは急性リンパ芽球性白血病(ALL)が細胞性免疫を介した経路によって制御される可能性があることを示唆しているが、ALLに対するドナーリンパ球注入の効力が比較的乏しいことは白血病細胞の免疫原性が低いことを示唆している。低い腫瘍免疫原性を克服することができ、かつSCTを含む、高リスクで再発性の疾患を処置するのに用いられる標準的なアプローチより毒性の低いALL処置に有効な可能性を秘めている新たな方法を追求する必要がある(Horowitz, et al., 1990, Blood 75(3):555-562; Mehta, 1993, Leuk Lymphoma 10(6):427-432)。
本発明は、患者を処置するための有効な療法を提供するために、癌患者に由来する自己由来T細胞をRNAで操作することができるという発見に関する。RNA操作T細胞は、癌処置のための融通のきくプラットフォームを可能にする、養子細胞移入用の新規のアプローチを提供する。場合によっては、レトロウイルス操作T細胞およびレンチウイルス操作T細胞の使用を補完するものとしてRNA操作T細胞を使用することができる。RNA操作T細胞の使用は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる可能性があるウイルスベクターの使用の付随する安全上の懸念なく、強力な活性化ドメインを発現するように操作されたT細胞の治療指数を高めることができる。
特に定義のない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な任意の方法および材料を本発明の試験のための実施において使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書において説明する。本発明の説明および主張において、以下の専門用語が用いられる。
本願全体を通じて、本発明の様々な局面を範囲の形で提示することができる。範囲の形での説明は単なる便宜および簡略のためのものであり、本発明の範囲に対する融通の利かない限定として解釈してはならないことが理解されるはずである。従って、範囲の説明は、可能性のある全ての部分範囲(subrange)ならびにその範囲内にある個々の数値を具体的に開示したとみなされるはずである。例えば、1〜6などの範囲の説明は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、ならびにその範囲内にある個々の数値、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したとみなされるはずである。これは範囲の幅に関係なく適用される。
本発明は、細胞におけるCAR発現のためにウイルスを使用する別の戦略を提供する。本発明は、細胞にトランスフェクトされ、細胞内で一過的に発現される、CARをコードするRNAに関する。細胞におけるCARの一過的な非組込み型発現は、細胞におけるCARの恒久的な組込み型発現に関連した懸念を和らげる。従って、本発明は、細胞におけるCAR発現を可逆的にすることができる、さらなるCARベースの療法を提供する。細胞におけるCAR発現のこのような逆転は、特定の臨床状況ではCARの非可逆的発現より望ましい場合がある。従って、本発明は、特定の臨床状況においてCARの恒久的発現より優れた、特定の望ましい利点を提供する。
本発明は、細胞に直接トランスフェクトすることができるRNA構築物を含む。トランスフェクションにおいて使用するためのmRNAを作製するための方法は、特別に設計されたプライマーを用いてテンプレートをインビトロ転写(IVT)した後にポリ(A)を付加して、3'非翻訳配列および5'非翻訳配列(「UTR」)、5'キャップおよび/または配列内リボソーム進入部位(IRES)、発現させようとする遺伝子、ならびにポリ(A)テール、典型的に長さが50〜2000塩基のポリ(A)テールを含有する構築物を生成することを伴う。このように生成されたRNAは様々な種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。
細胞外ドメインは、リガンド結合および/またはシグナル伝達と関連する任意の多種多様な細胞外ドメインまたは分泌タンパク質から得ることができる。1つの態様において、細胞外ドメインはIg重鎖からなり、次に、このIg重鎖はCH1およびヒンジ領域の存在によってIg軽鎖と共有結合していてもよく、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインの存在によって他のIg重鎖/軽鎖複合体と共有結合していてもよい。後者の場合、キメラ構築物とつなぎ合わされた重鎖/軽鎖複合体は、キメラ構築物の抗体特異性とは異なる特異性を有する抗体を構成してもよい。抗体の機能、望ましい構造、およびシグナル伝達に応じて、鎖全体が用いられてもよく、切断された鎖が用いられてもよい。切断された鎖の場合、CH1、CH2、またはCH3ドメインの全てまたは一部が除去されてもよく、ヒンジ領域の全てまたは一部が除去されてもよい。
膜貫通ドメインに関して、RNA CARのテンプレートは、CARの細胞外ドメインと融合された膜貫通ドメインを含むように設計することができる。1つの態様において、天然でCAR内のドメインの1つと結合している膜貫通ドメインが用いられる。場合によっては、膜貫通ドメインと、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするように、膜貫通ドメインを選択し、アミノ酸置換によって改変することができる。
本発明のCARの細胞質ドメインまたはそうでなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが配置されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化した機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性でもよく、サイトカイン分泌を含むヘルパー活性でもよい。従って、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化した機能を細胞が果たすように指示するタンパク質部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合において、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分が用いられる程度まで、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、このような切断された部分が完全な鎖の代わりに用いられてもよい。従って、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断された部分を含むことが意図される。
本発明のインビトロで転写されたRNA CARを生成するための方法が本明細書において開示される。1つの態様において、インビトロで転写されたRNA CARは、一過的なトランスフェクションの1つとして細胞に導入することができる。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生じたテンプレートを用いたインビトロ転写によって生成される。適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを用いたPCRによって、任意の供給源に由来する関心対象のDNAをインビトロmRNA合成用のテンプレートに直接変換することができる。DNA供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、または他の任意の適切なDNA供給源でもよい。インビトロ転写用の望ましいテンプレートは本発明のCARである。例えば、RNA CARのテンプレートは、抗腫瘍抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外ドメイン;膜貫通ドメイン;およびCD3-ζのシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。1つの態様において、テンプレートは、SEQ ID NO 6〜24からなる群より選択される配列を含むヌクレオチド配列を含む。
インビトロで転写されたmRNA CARを、異なるタイプの真核細胞に、ならびにカプセル化された、結合した、または裸のmRNAの担体または無細胞局所送達もしくは全身送達としてトランスフェクト細胞を用いて組織および生物全体に送達することができる。使用される方法は、一過的発現が必要とされる、または一過的発現で十分な任意の目的の方法でよい。
拡大および遺伝子組換えの前にT細胞供給源が対象から得られる。「対象」という用語は、免疫応答を誘発することができる生物(例えば、哺乳動物)を含むことが意図される。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種が含まれる。T細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多数の供給源から入手することができる。本発明のある特定の態様において、当技術分野において利用可能な任意の数のT細胞株を使用することができる。本発明のある特定の態様において、当業者に公知の任意の数の技法、例えば、Ficoll(商標)分離を用いて対象から収集された血液ユニットからT細胞を得ることができる。1つの好ましい態様において、個体の循環血液からの細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス製品は、典型的に、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。1つの態様において、血漿画分を除去するために、および後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために、アフェレーシスによって収集された細胞は洗浄されてもよい。本発明の1つの態様において、細胞はリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄される。別の態様では、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよく、全てではないが多くの二価カチオンを欠いてもよい。またもや驚いたことに、カルシウムの非存在下での初期活性化工程は活性化を増大させる。当業者であれば、洗浄工程は、当業者に公知の方法によって、例えば、半自動「フロースルー」遠心機(例えば、Cobe 2991 cell processor, Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)を用いて製造業者の説明書に従って達成され得ることを容易に理解するだろう。洗浄後、細胞は、例えば、CaフリーMgフリーPBS、PlasmaLyte A、または緩衝液を含む、もしくは緩衝液を含まない他の食塩水などの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁されてもよい。または、アフェレーシス試料の望ましくない成分は除去されてもよく、細胞は培養培地に直接、再懸濁されてもよい。
T細胞のトランスフェクションの前に、一般的に、例えば、米国特許第6,352,694号;同第6,534,055号;同第6,905,680号;同第6,692,964号;同第5,858,358号;同第6,887,466号;同第6,905,681号;同第7,144,575号;同第7,067,318号;同第7,172,869号;同第7,232,566号;同第7,175,843号;同第5,883,223号;同第6,905,874号;同第6,797,514号;同第6,867,041号;および米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を用いて、細胞を活性化および拡大することができる。
例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗CD3抗体またはその抗原結合断片であり、補助刺激シグナルを提供する薬剤は抗CD28抗体またはその抗原結合断片である。両薬剤とも等モル量で同じビーズに同時に固定化される。1つの態様において、CD4+T細胞拡大およびT細胞増殖のためにビーズに結合した1:1の比の各抗体が用いられる。本発明のある特定の局面において、1:1の比を用いて観察された拡大と比較してT細胞拡大の増加が観察されるような、ビーズに結合した抗CD3:CD28抗体の比が用いられる。1つの特定の態様において、1:1の比を用いて観察された拡大と比較して約1〜約3倍の増加が観察される。1つの態様において、ビーズに結合したCD3:CD28抗体の比は100:1〜1:100およびその間の全ての整数値である。本発明の1つの局面において、抗CD3抗体より多くの抗CD28抗体が粒子に結合される、すなわち、CD3:CD28の比は1未満である。本発明のある特定の態様において、ビーズに結合した抗CD28抗体:抗CD3抗体の比は2:1より大きい。1つの特定の態様において、ビーズに結合した1:100 CD3:CD28抗体比が用いられる。別の態様において、ビーズに結合した1:75 CD3:CD28抗体比が用いられる。さらなる態様において、ビーズに結合した1:50 CD3:CD28抗体比が用いられる。別の態様において、ビーズに結合した1:30 CD3:CD28抗体比が用いられる。1つの好ましい態様において、ビーズに結合した1:10 CD3:CD28抗体比が用いられる。別の態様において、ビーズに結合した1:3 CD3:CD28抗体比が用いられる。さらに別の態様において、ビーズに結合した3:1 CD3:CD28抗体比が用いられる。
本発明は、T細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)を一過的に発現するように遺伝子組換えされ、RNA操作T細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される細胞療法の一種を含む。注入された細胞はレシピエントの中にある腫瘍細胞を死滅することができる。いかなる特定の理論にも拘束されないが、RNA操作T細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は能動的免疫応答でもよく、受動的免疫応答でもよい。この応答は、CAR T19細胞などのRNA操作T細胞を用いた養子免疫治療アプローチの一部になり得る。
本発明は以下の実験例を参照することによってさらに詳述される。これらの実施例は例示のためだけに提供され、他で特定しない限り限定することが意図されない。従って、本発明は以下の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ、本明細書において提供される開示の結果として明らかになる任意のおよび全てのバリエーションを包含すると解釈すべきである。
遺伝子導入によってTリンパ球抗原特異性を再指向(redirecting)させると、養子免疫治療用の多数の腫瘍反応性Tリンパ球を得ることができる。しかしながら、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞の臨床適用ではウイルスベクター製造に関連した安全上の懸念がある場合がある。組込みに関連した安全上の懸念なくRNAエレクトロポレーションによってTリンパ球を遺伝子組換えすることができると考えられている。養子免疫治療用の安全なプラットフォームを確立するために、高レベルのトランスジーン発現を実現するようにRNAインビトロ転写用ベクターバックボーンを最適化した。エレクトロポレーションして1週間後まで、RNAをエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞のCAR発現および機能が検出された。本明細書において示された結果から、RNA CARをエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞を複数回注射することによって、NOD/scid/γc(-/-)マウスにある大きな血管化した側腹部中皮腫腫瘍の退縮が媒介されたことが証明される。抗メソテリンCAR mRNAをエレクトロポレーション処理によって導入した自己由来ヒトT細胞を複数回注射することによって、インビボで>50日成長している既存の腹腔内ヒト由来腫瘍を処置した時も劇的な腫瘍縮小が生じた。
CAR用のインビトロ転写mRNAベクターの構築
メソテリン(ss1)およびCD19に特異的なCAR(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5; Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64)を、プライマーss1F(cctaagcttaccgccatggccttaccagtgac; SEQ ID NO:1)、CD19F(cctaagcttaccgccatggccttaccagtgaccgcc; SEQ ID NO:2)、およびzetaR(cctgcggccgc ttagcgagggggcagggcc; SEQ ID NO:3)を用いてPCR増幅した。pGEM-GFP.64A(Zhao et al., 2006, Mol Ther 13:151-9)のGFPを置換することによってPCR産物をpGEM.64Aベースのベクターにサブクローニングして、pGEM.64Aベースのss1ベクターおよびCD19ベクターを生成した。5' 非翻訳領域または3'非翻訳領域(UTR)およびさらに長いポリ(A)を構築物に付加するために、pGEM.ss1.bbz.64AベクターまたはpGEM-CD19.bbz.64Aベクターの中にある64ポリ(A)配列を、PCRによって合成された150ポリ(A)配列(150A)を含む、または含まないβグロブリンに由来する3'UTRの2つの反復(2bgUTR)によって置換し、配列決定によってさらに確認した。しかしながら、pGEMベースのベクターでは選択用にアンピシリンを使用し、これは、GMP製造および後の臨床適用のためのFDA規制ガイダンスと一致しない。従って、UTRを有するCAR cDNAをpDrive(Qiagen)に導入した。pDrive(Qiagen)は選択用にカナマイシンも使用する。最初に、pGEMベクターからHindIII消化およびNdeI消化(フィルイン平滑末端)によってss1.bbz.2bgUTR.150AまたはCD19.bbz.2bgUTR.150Aを切断し、KpnIおよびNotI(フィルイン平滑末端)によってpDriveにサブクローニングした。pDrive.ss1.bbz.2bgUTR.150AおよびpDrive.CD19.bbz.2bgUTR.150Aを作製するために、正しい方向を有するインサートを配列決定によって確認した。考えられる臨床使用のためのベクターを完成させるために2つの工程があった。1)pDriveベクター内のアンピシリン耐性遺伝子をAhdIおよびBciVIによる二重消化によって欠失させた。2)CD19.bbzおよびss1.bbzの中にある内部オープンリーディングフレームを変異誘発PCRによって欠失させて、pD-A.19.OF.2bg.150A(SEQ ID NO:5)およびpD-A.ss1.OF.2bg.150A(SEQ ID NO:4)を生成した。
RNAの質、量、および費用を比較するために、3種類のRNA IVTシステム:通常キャップ(RC)類似体7-メチルGpppGを使用するmMESSAGE mMACHINE(登録商標)T7キット(Ambion, Inc);アンチリバースキャップ類似体(ARCA、7-メチル(3'-O-メチル)GpppG)m7G(5')ppp(5')G)を用いてIVT RNAを生じるmMESSAGE mMACHINE(登録商標)T7 Ultra(Ambion, Inc)、ならびにキャッピング酵素(CE)および2'-O-メチルトランスフェラーゼキャッピング酵素を用いてCap1 IVT RNA(Epicentre)を生じるmScript(商標)RNA System(Epicentre, Madison, WI)を使用した。RCは40%までのキャッピング効率で組み込まれるのに対して、ARCAはキャッピング効力を80%まで高め、CEシステムは100%までのキャッピング効率をもたらすことができる。様々なIVT RNA産物をRNeasy Mini Kit(Qiagen、Inc., Valencia, CA)を用いて精製し、精製RNAを1〜2mg/mlでRNアーゼフリー水に溶出させた。
内部ORFのないCARオープンリーディングフレーム(ORF)を含有する規制機関に準拠したプラスミドDNAベクターを作製するために、前記のように、UTRおよびポリ(A)配列を有するCAR cDNA用のDNAインサートをpGEMベースのベクターから、カナマイシン選択マーカーを含有するpDriveベクターにサブクローニングして、pdrive.19bbz(CD19-bbz用)およびpDrive.ss1bbz(ss1-bbz用)を作製した。CAR ORF内に入れ子になっている内部ORFから翻訳される、可能性のある異常タンパク質を排除するために、CD19-bbzおよびss1-bbzの中にあるサイズが60bpより大きな全ての内部ORFを変異誘発PCRによって変異させた。従って、19-bbz用およびss1-bbz用にそれぞれ、内部ORFを含まないpD-A.19.OFおよびpD-A.ss1.OFを作製した。親ORFを含有するss1-bbz RNAを、SEQ ID NO:6を含むヌクレオチド配列から転写させた。内部ORFを含まないss1-bbz構築物を、SEQ ID NO:8を含むヌクレオチド配列から転写させた。親ORFを含有するss1-bbz RNAを、SEQ ID NO:7を含むヌクレオチド配列から転写させた。内部ORFを含まないCD19-bbz構築物を、SEQ ID NO:9を含むヌクレオチド配列から転写させた。
匿名の健常ドナーによって提供されたリンパ球およびT細胞を水簸(elutriation)によって精製した。一部の実験では、同じ患者に由来する凍結保存したT細胞および腫瘍細胞を使用した。「患者108」には悪性中皮腫があった。初期臨床試験の一環として、この患者は白血球アフェレーシスを受け、彼の悪性胸水から腫瘍細胞が作製された。記載(Levine et al., 1997, J Immunol 159:5921-30)のように、CD3/CD28ビーズ(Invitrogen)の添加および1サイクルの刺激によってT細胞を活性化した。図5に示した実験のために、患者108のT細胞を、4-1BBLを発現する放射線照射済み人工抗原提示細胞で刺激し、記載(Suhoski et al., 2007, Mol Ther 15:981-8)のように抗CD3モノクローナル抗体(mAb)OKT3およびCD28 mAb 9.3を添加した。ビーズ刺激後に、T細胞を10%FCSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシン(R10)を含むRPMI 1640に入れて0.8x106〜1x106細胞/mLの密度で維持した。
培養10日目に、活性化T細胞を収集し、エレクトロポレーション処理した。2種類のエレクトロポレーションシステム:BTX CM830(Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)およびMaxcyte(Maxcyte Inc, Rockville, MD, USA)を使用した。BTX EM830を用いたエレクトロポレーションの場合、エレクトロポレーションに供された刺激済みT細胞をOPTI-MEM(Invitrogen)で3回洗浄し、1〜3x108/mlの最終濃度でOPTI-MEMに再懸濁した。その後に、0.1〜0.2mlの細胞を10μg/0.1ml T細胞のIVT RNAと混合し(または示したように混合し)、2mmキュベット(Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)に入れてエレクトロポレーション処理した。Maxcyteを用いたエレクトロポレーションの場合、OC-400処理チャンバー(Maxcyte Inc, Rockville, MD, USA)と内臓プログラムを用いて説明書マニュアルに従った。
細胞をFACs緩衝液(PBS+0.1%アジ化ナトリウムおよび0.4%BSA)で洗浄および懸濁した。ビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスF(ab)2抗体(抗Fab, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)をチューブに添加し、細胞を4℃で25分間インキュベートし、2回洗浄した。次いで、細胞をフィコエリトリン標識ストレプトアビジン(BD Pharmingen, San Diego, CA)で染色した。
標的細胞を洗浄し、106細胞/mLでR10に懸濁した。10万個のそれぞれの標的細胞タイプを96ウェル丸底プレート(Corning)の2個のウェルにそれぞれ添加した。エフェクターT細胞培養物を洗浄し、106細胞/mLでR10に懸濁した。96ウェルプレートの示されたウェルの中で10万個のエフェクターT細胞を標的細胞と組み合わせた。さらに、T細胞のみを含有するウェルを調製した。プレートを37℃で18〜20時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取し、標準的な方法を用いたELISAアッセイ(Pierce, Rockford, IL)に供した。
細胞を、1:1のE:T(105個のエフェクター:105個の標的)で160μlの完全RPMI培地が入っている96ウェルプレートに入れてプレーティングした。20μlのフィコエリトリン標識抗CD107a Ab(BD Pharmingen, San Diego, CA)を添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートした後に、Golgi Stopを添加し、さらに2.5時間インキュベートした。2.5時間後に、10μlのFITC-抗CD8およびAPC-抗CD3を添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、試料をFACS緩衝液で1回洗浄した。フローサイトメトリー取得をBD FacsCalibur(BD Biosciences)を用いて行い、分析をFlowJo(Treestar Inc, Ashland, OR)を用いて行った。
わずかに変更を加えたバージョンのフローサイトメトリー細胞傷害アッセイを使用した(Cao et al., 2010 Cytometry Part A 77:534-45)。このアッセイでは、負の対照細胞の生存率に対して標的細胞の生存率を比較することによって標的細胞の細胞傷害性を測定する。負の対照細胞および標的細胞をエフェクターT細胞と同じチューブ内で組み合わせる。記載(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5; Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64)のように、親K562細胞にヒトCD19またはメソテリンを形質導入することによって標的細胞を調製した。この実験では、CD19-CAR T細胞およびメソ-CAR T細胞の細胞溶解作用を、両標的細胞(K562-CD19またはK562-メソ)の混合物を用いて試験した。K562-メソを1.5x106細胞/mLの濃度でR10培地に懸濁し、蛍光色素CellTracker(商標)Orange CMRA(Invitrogen)を5μMの濃度で添加した。細胞を混合し、次いで、37℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、R10に懸濁した。次に、K562-メソを37℃で60分間インキュベートした。次いで、細胞を2回洗浄し、R10に懸濁した。K562-CD19を1x106細胞/mLでPBS+0.1%BSAに懸濁した。この細胞懸濁液に、蛍光色素カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)(Invitrogen)を1μMの濃度で添加した。細胞を37℃で10分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞懸濁液の体積に等しい体積のFBSを添加することによって標識反応を止め、細胞をRTで2分間インキュベートした。細胞を洗浄し、R10に懸濁した。培養を、以下のT細胞:標的細胞比:10:1、3:1、および1:1で96ウェル培養プレート内で2回繰り返して設定した。標的細胞は、常に、0.1ml中、10,000個のK562-メソであった。それぞれの培養は、104個のK562-CD19負の対照細胞も含んだ。さらに、K562-CD19+K562-メソ細胞のみを含有する培養を設定した。培養物を37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション直後に、7-AAD(7-アミノアクチマイシンD)(BD Pharmingen)を製造業者により推奨されたように添加し、フローサイトメトリー取得をBD Calibur(BD Biosciences)を用いて行った。分析物を7AAD陰性(生)細胞でゲーティングし、それぞれのT細胞+標的細胞培養についてK562-CD19生細胞およびK562-メソ生細胞のパーセントを求めた。K562-メソのパーセント生存率は、K562-メソ生細胞のパーセントをK562-CD19対照生細胞のパーセントで割ることによって求めた。K562-メソの補正済みパーセント生存率は、それぞれのT細胞+標的細胞培養物におけるK562-メソのパーセント生存率を、エフェクターT細胞を含まず、K562-メソ標的細胞およびK562-CD19対照細胞しか含有しないチューブにおけるパーセントK562-メソ標的細胞:パーセントK562-メソ負の対照細胞の比で割ることによって計算した。この補正は、出発細胞数のばらつきおよび自発的標的細胞死を説明するのに必要であった。細胞傷害性は、K562-メソのパーセント細胞傷害性=100-K562-メソの補正済みパーセント生存率として計算した。全てのエフェクター:標的比について、細胞傷害性を2回繰り返して求め、結果を平均した。
以前に述べられたように若干の変更を加えて(Teachey et al., 2006, Blood 107:1149-55; Teachey et al., 2008, Blood 112:2020-3)、研究を行った。簡単に述べると、6〜10週齢のNOD-SCID-γc-/-(NSG)マウスをJackson Laboratory(Bar Harbor, ME)から入手したか、または承認を受けた実験動物委員会(institutional animal care and use committee)(IACUC)プロトコールの下、組織内で飼育し、病原体フリーの条件下で維持した。以前に述べられたように(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5)、患者108に由来するM108ヒト中皮腫の派生物を使用し、5x106個の細胞を用いて側腹部腫瘍を樹立した。レンチウイルスベクターを用いてM108腫瘍細胞をホタルルシフェラーゼも発現するように操作して、M108-Luc細胞株を得た。8x106個の生存しているM108-Lucを動物に腹腔内(IP)注射した。腫瘍成長を、側腹部腫瘍の場合はカリパス測定を用いてサイズによって、IP腫瘍の場合はバイオルミネセンスイメージングおよび体重によってモニタリングした。
腫瘍成長をBLIによってモニタリングした。麻酔したマウスを、Xenogen SpectrumシステムおよびLiving Image v3.2ソフトウェアを用いて画像化した。マウスに、15mg/mLの濃度で滅菌PBSに懸濁した150mg/kg体重のD-ルシフェリン(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)(100μLのルシフェリン溶液/10gのマウス体重)をIP注射した。M108-Lucの以前の滴定から、光子放射ピークまでの時間は5分であり、ピーク放出は6〜10分間続くことが示された。それぞれの動物を単独で(光子定量の場合)または5匹までのマウスの群(表示目的の場合)において前後うつぶせになった位置にしてルシフェリン注射後同じ相対的な時点(6分)で画像化した。直線スケールの中域(600〜60000カウント)に達するまで、または最大露出設定(f/stop 1、大きなビニング(binning)、および1〜2秒)に達するまで、データを収集し、次いで、それぞれの画像を露出時間、f/stop、ビニング、および動物サイズについて規準化するために、photon/秒/cm2/ステラジアンに変換した。解剖学的局在性のために、光強度を表す疑似カラー地図をグレースケール体表参照画像の上に重ね合わせた。データ表示のために、ルシフェラーゼ含有細胞のないマウスを最大設定で画像化し、3.6x105p/s/cm2/srの平均値を得た。
分析は、STATAバージョン10(StataCorp)またはPrism4(GraphPad Software)を用いて行った。インビトロデータは2回の繰り返しの平均を表し、マン・ホイットニー検定を介して平均を比較した。複数の群間で比較するために、クラスカル・ワリス分析を、個々の群を比較するダン(Dunn)多重比較検定を用いて行った。複数の曲線を比較するために生存曲線をログランク検定とボンフェローニ補正を用いて比較した。
CD3ζ、CD28、および4-1BB活性化ドメインの組み合わせを有する抗メソテリンss1 scFv CARはレンチウイルスベクター技術を用いて導入された時に、T細胞において高度にかつ安定して発現されることが以前に報告されている(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5)。以前に述べられたように(Levine et al., 1997, J Immunol 159:5921-30)、ヒトT細胞を10日間、活性化し、細胞が静止に近い状態に戻った時に、以前に述べられたシグナル伝達部分組み合わせと共にss1 scFvをコードするRNAをエレクトロポレーション処理によって導入した。CD3ζのみを有するCAR(ss1-z)をエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞が最も高いトランスジーン発現を示し、それに続いてss1-28z(CD28+CD3ζ)およびss1-bbz(4-1BB+CD3ζ)発現のレベルがほぼ等しかったので、トランスジーン発現レベルは均一でないことが見出された(図6)。いくつかの前臨床段階および初期段階の臨床試験において、補助刺激ドメインを含有する「第二世代」CARがウイルスベクターシステムと共に発現された時に優れているように思われたので(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5; Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64; Zhao et al., 2009, J Immunol 183:5563-74; Zhong et al., 2009, Mol Ther 18:413-20)、「第一世代」ss1-z CARの発現を最適しないということになった。逆に、第二世代ss1-bbzおよびCD19-bbz CARがレンチウイルスベクター技術を用いた臨床試験において試験されているので、RNAエレクトロポレーションを用いたさらなる最適化のために選択した。
βグロブリンに由来する3'非翻訳領域(UTR)の2つの反復および長いポリ(A)配列の組込みによる非コード領域の構造改変は、RNAでトランスフェクトされた樹状細胞のRNA安定性、翻訳効率、および機能を向上させることが示されている(Holtkamp et al., 2006, Blood 108:4009-17)。しかしながら、これらの戦略は、RNAをエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞において体系的に評価されたことがない。このアプローチがヒトTリンパ球に適用されるかどうか試験するために、5'UTR(SP163)または3'UTR[図1Aに示したような、ヒトβ-グロビンに由来する3'UTRの少なくとも2つの反復(2bgUTR)または延長されたポリ(A)(150A)配列]を添加することによってIVTベクター(pGEM-ss1bbz.64A)を改変した。SP163翻訳エンハンサーは血管内皮増殖因子遺伝子の5'UTRに由来し、プロモーター単独と比較して発現レベルを2〜5倍増大させると報告されている(Stein et al., 1998, Mol Cell Biol 18:3112-9)。これらの構築物から作製したRNAを刺激済みT細胞にエレクトロポレーション処理によって導入した。図1Bに示したように、64ポリ(A)トラクトを含有する基本IVT構築物と比較して、β-グロブリンに由来する3'UTR(2bgUTR)および長いポリ(A)(150A)テールを付加すると、特に、これらを組み合わせた時に(2bgUTR.150A)、トランスジーン発現が向上した。対照的に、ss1-bbzの5'末端にSP163配列を組み込むとトランスジーン発現が抑制された。これは、SP163配列を付加した時のキャッピング効率の低下によるものかもしれない。
mRNA分子末端に位置する5'キャップは、5'→5'三リン酸結合を介してmRNAにつながったグアニンヌクレオチドからなる。cap0および1(Banerjee, 1980, Microbiol Rev 44:175-205)を含む、いくつかのキャップ構造が述べられている。トランスジーンおよびポリ(A)テール構築物に5'キャップ構造を組み込むために、いくつかの方法が用いられている。市販のシステムは、キャッピングされたmRNAを生じるために同時転写アプローチまたは酵素的アプローチを用いてcap0または1を組み込む。翻訳効率が向上するように最適化するために、および様々なキャッピングシステムの費用がかなり高いために、このプロセスは重要である。異なるキャッピングシステムを用いて作製したRNAを刺激済みT細胞にエレクトロポレーション処理によって導入し、トランスジーン発現をフローサイトメトリーによってモニタリングした(図2Aおよび2B)。結果から、アンチリバースキャップ類似体(ARCA)によってキャッピングされたRNAをエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞のトランスジーン発現は、4時間で、通常キャップ(RC)類似体によってキャッピングされたRNAより3倍高いことが分かった。図2Bに示したようにエレクトロポレーション後5日目にT細胞の>50%がCARを依然として発現していたので、ARCAによってキャッピングされたRNAのトランスジーン持続性も改善された。
親CAR配列を有するプラスミドまたは内部ORFフリーCAR配列を有するプラスミドから調製したRNAをT細胞にエレクトロポレーション処理によって導入した。エレクトロポレーションして20時間後に、内部ORFフリーRNAをエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞からのトランスジーン発現は、親配列を有するRNAをエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞と同等であることが見出された(図8)。しかしながら、cap1および延長されたポリ(A)をIVT RNAに組み込むCEシステムを用いて内部ORFフリーpD-A.ss1.OFまたはpD-A.19.OF RNAから作製した臨床用RNAをエレクトロポレーション処理によって導入した活性化T細胞において、CAR発現の大幅な延長が観察された(図3)。図3Cに示したようにメソRNA CARおよびCD19 RNA CARの両方について、RNAエレクトロポレーション後、7日間と長期間にわたって最適化IVT RNAのトランスジーン発現を検出することができた。
最初に、予め樹立された大きな腫瘍を有するマウスにおける最適化RNA CAR発現T細胞の治療能力を評価するためにパイロット実験を行った。以前に述べられたように(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5)、NSGマウスにおいてメソテリン陽性腫瘍を樹立した。腫瘍を接種して66日後に、ss1-bbz RNA CARをエレクトロポレーション処理によって導入した10x106〜15x106個の健常ドナー由来T細胞を2週間にわたって週2回、腫瘍内注射した。週2回投与計画は、図3に示したインビトロ発現データに基づいた。図4Aから分かるように、ss1 RNAをエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞で処置したマウスでは腫瘍は退縮したのに対して、マウス対照群では進行性の腫瘍成長が観察された。98日目にマウスを屠殺した時、T細胞をエレクトロポレーション処理によって導入したマウスの全てにおいて腫瘍サイズは食塩水で処置したマウスよりかなり小さかった(図10)。これらの結果は、RNA操作T細胞の複数回注射の治療能力を示している。しかしながら、RNA操作T細胞は、レンチウイルスによって形質導入されたT細胞を用いた同じ腫瘍モデルほど効力はない。レンチウイルスによって形質導入したT細胞を用いた同じ腫瘍モデルでは、2回のT細胞腫瘍内注射によって、ほとんどのマウスを治癒することができた(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5)。
前記の研究から、RNA操作T細胞を週2回注射することによって、進行した側腹部腫瘍およびi.p.腫瘍を制御することができ、CD19 RNA CARを発現するT細胞が有効でなかったので、阻害はCAR特異性に依存することが分かる。しかしながら、これらの実験におけるT細胞は健常ドナーに由来し、腫瘍に対して同種異系であった。同種異系抗腫瘍効果がRNA CAR T細胞の反復長期投与を用いて観察されたので、M108腫瘍が得られた患者に由来する自己由来末梢血単核球を使用した。T細胞を刺激し、GMPグレードのRNAを用いてエレクトロポレーション処理した。図11の図に図示したように、30匹のNSGマウスを3つのi.p.処置群に無作為化した。0日目にマウスにM108-Luc(i.p.)を接種し、ss1-bbzもしくはCD19-bbz RNA CAR T細胞または食塩水対照で処置し、腫瘍量を、示したように連続BLIおよび体重によってモニタリングした。56日目に身体検査時の腹水の発見および高いBLIシグナルに基づいて腫瘍が進行した時、療法を開始した。ss1-bbz RNA CAR T細胞をエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞で処置した群では腫瘍量は劇的に低減したのに対して、CD19-bbz RNA CAR T細胞または食塩水で処置した対照マウスでは腫瘍は成長し続けた(図5Aおよび5C)。T細胞が腫瘍に対して自己由来である、この設定でさえも、依然として中程度のCD19 CAR治療効果があった。これらのマウスにB細胞がないことを考慮すると、このことがCD19 scFv CARと関連していることはまずないので、RNAバックボーンが原因である可能性がある。しかしながら、最初の6回のT細胞投与の後、画像化によって、ss1 CARマウスにおける腫瘍バイオルミネセンス変化の平均(39%)がCD19 CAR(244%)および食塩水マウス(237%;P<0.001)と比較して低いことが明らかになった。ss1 CARマウスにおけるT細胞注射後の50%生存期間中央値(73日)はCD19 CAR(62日)および食塩水マウス(36日;図5B)と比較して有意に長かった(P<0.05)。最初の6回の投与を与えた後、ss1 RNA CARマウスにおける総体重の変化の平均(1.62g)は、CD19 CAR(6.21g)および食塩水マウス(11.4g;P<0.001;図5C)と比較して低かった。ss1 CARマウスの一部において画像化によって疾患の安定および「治癒」さえも観察されたが、最終的には腫瘍は再発した。さらに8回の投与の処置を与えたのにもかかわらず、ss1 CARマウスにおいて腫瘍進行が観察された。従って、ss1-bbz RNA CAR T細胞を反復注射することによって、播種性進行腫瘍に対する生存利益を得ることができる。連続した療法にもかかわらず腫瘍が再発した機構は調査中である。
これらの実験の目的は、エレクトロポレーション処理によって導入したRNA CARを発現する活性化T細胞の治療能力を確かめることであった。本明細書において示された結果から、mRNA CARは、新しい標的を評価するための、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターより安全かつ経済的だと期待されるプラットフォームを提供することが分かる。もし毒性が発生したら、RNA CAR T細胞の注射を終わらせることができ、毒性は急速に弱まると予想されるだろう。しかしながら、RNA CAR T細胞は、特に、中皮腫などの区画化された腫瘍において、かなりの治療可能性を秘めている。RNA CAR T細胞は、レトロウイルスCARおよびレンチウイルスCARを用いて現在開発されている療法を補完すると予想される。
組込み型ウイルスベクターによって作製された安定発現CARを有する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は有効であり、潜在的な長期持続性を有するが、代替の療法は、一過的に発現するCARを使用する療法であり、この場合、望ましい標的(例えば、CD19)に対するCARをコードする最適化インビトロ転写RNAがT細胞にエレクトロポレーション処理によって導入される。本明細書において示された結果から、エレクトロポレーションによって最適化mRNAが導入された抗CD19 CAR発現T細胞は、強力かつ特異的なCD19標的細胞のキラー(killer)であることが証明される。異種移植白血病を有する免疫不全マウスに与えたCD19 RNA CAR T細胞は疾患部位に迅速に移動し、有意な標的特異的溶解活性を保持した。予期せずに、CD19 RNA CAR T細胞の単回注射によって投与後1日以内に疾患負荷量が低減し、その結果、高悪性度白血病異種移植片モデルにおいて生存期間が有意に延びた。RNA CARの表面発現を滴定し、それによって、潜在的に調整可能なレベルのエフェクター機能、例えば、サイトカイン放出および細胞傷害性を有するT細胞を得ることができる。RNA CARは、遺伝毒性を受けるはずがない遺伝子工学アプローチであり、費用と手間がかかる安定発現系に進む前にCAR設計を迅速に最適化するためのプラットフォームを提供する。
インビトロ転写(IVT)ベクターの構築およびRNAエレクトロポレーション
CD19およびメソテリン(メソ)に標的化された、4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを有するCAR(それぞれ、19-BBzおよびss1-BBz)は以前に述べられている(Milone, et al.,2009, Mol Ther 17(8):1453-1464; Carpenito et al.,2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106(9):3360-3365)。pGEM-GFP.64A(Zhao, et al.,2006, Mol Ther 13(1):151-159)に由来するGFPを、HindIIIおよびNotIを用いた制限酵素消化PCR産物で置換することによって、PCR産物をpGEM.64Aベースベクターにサブクローニングして、pGEM-ss1.bbz.64AおよびpGEM-CD19bbz.64Aを得た。同様に、CD28シグナル伝達ドメインを用いて第三世代バージョンのCARを構築した。置換されたCAR cDNAを直接配列決定によって確認し、RNA IVTの前にSpeI消化によって直線化した。mScript RNAシステム(Epicentre, Madison, WI)を用いて、キャッピングされたIVT RNAを作製した。IVT RNAをRNeasy Mini Kit(Qiagen, Inc., Valencia, CA)を用いて精製し、精製RNAを1〜2mg/mlでRNアーゼフリー水に溶出させた。記載のように(Carpenito et al.,2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106(9):3360-3365)、ヒトT細胞をCD3/CD28ビーズによって刺激した。刺激済みT細胞をOPTI-MEMで3回洗浄し、1〜3x108/mlの最終濃度でOPTI-MEMに再懸濁した後に、エレクトロポレーションを行った。その後に、刺激済みT細胞を(示したように)10μg/0.1ml T細胞のIVT RNAと混合し、2mmキュベット(Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)に入れて、ECM830 Electro Square Wave Porator (Harvard Apparatus BTX)を用いてエレクトロポレーション処理した。トランスフェクション後の生存率は50〜80%であり、全ての場合において、注射用の生存T細胞のCAR発現は使用時に>99%であった。輸送実験のために、mRNAトランスフェクション前にT細胞にホタルルシフェラーゼレンチウイルス構築物を安定して形質導入した。
以前に述べられたように(Imai et al., 2004, Leukemia 18(4): 676-684; Milone, et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-1464)、EF-1αプロモーターの転写制御下で様々なCARをコードするレンチウイルスベクターを作製した。CAR配列の前に、eGFP配列またはホタルルシフェラーゼ(FFluc)に続いて、FMDVに由来する2Aリボソームスキッピング(ribosomal skipping)配列がインフレームであるCAR発現レンチウイルスベクターも作製した。これらのベクターは、1本のRNA転写物からのGFPまたはFFlucおよびCARの二重発現を可能にする。全ての構築物を配列決定によって検証した。
細胞を洗浄し、FACS緩衝液(0.1%アジ化ナトリウムおよび0.4%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝食塩水(PBS))に懸濁した。細胞をビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスF(ab)2抗体(抗Fab, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)と4℃で25分間インキュベートし、次いで、FACS緩衝液で2回洗浄した。次いで、細胞をフィコエリトリン標識ストレプトアビジン(BD Pharmingen, San Diego, CA)で染色した。フローサイトメトリー取得をBD FacsCalibur(BD Biosciences)を用いて行い、分析をFlowJo(Treestar Inc, Ashland, OR)を用いて行った。
標的細胞を洗浄し、106細胞/mLでC10(10%ウシ胎児血清(FCS), Invitrogenを添加したRPMI1640)に懸濁した。それぞれのタイプの105個の標的細胞を96ウェル丸底プレート(Corning)の2個のウェルにそれぞれ添加した。エフェクターT細胞培養物を洗浄し、106細胞/mLでC10に懸濁した。96ウェルプレートの示されたウェルの中で105個のエフェクターT細胞を標的細胞と組み合わせた。さらに、T細胞のみを含有するウェルを調製した。プレートを37℃で18〜20時間インキュベートした。インキュベーション後、上清に対してELISAアッセイを製造業者の説明書(Pierce, Rockford, IL)を用いて行った。50マイクロリットルの培養上清を2回繰り返して試験し、結果をpg/mlで報告した。
細胞を、1:1のエフェクター:標的(E:T)(105個のエフェクター:105個の標的)で、160μlのC10培地が入っている平底96ウェルプレートに入れてプレーティングした。CD107aのバックグラウンドレベルを評価するために、対照は標的細胞を含まないウェルを含んだ。20μlのフィコエリトリン標識抗CD107a Ab(BD Pharmingen, San Diego, CA)を添加し、プレートを穏やかに攪拌し、37℃で1時間インキュベートした。Golgi Stop溶液を添加し、プレートをさらに2.5時間インキュベートした。次いで、細胞を10μlのFITC-抗CD8およびAPC-抗CD3(BD Pharmingen, San Diego, CA)で染色し、洗浄した。フローサイトメトリー取得をBD FacsCalibur(BD Biosciences)を用いて行い、分析をFlowJo(Treestar Inc, Ashland, OR)を用いて行った。
わずかに変更を加えたバージョンのフローサイトメトリー細胞傷害アッセイを使用した(Hermans et al.,2004, J Immunol Methods 285(1):25-40)。このアッセイでは、エフェクター細胞と同じチューブ内で標的細胞の生存率を負の対照細胞の生存率と比較することによって標的細胞の細胞傷害性を測定する。本明細書に記載の実験では、標的細胞は、ヒトCD19を発現するK562細胞(K562-CD19)であり、負の対照細胞は、メソテリンを発現するK562細胞(K562-メソ)であった。K562-メソを蛍光色素5-(および-6)-(((4-クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)テトラメチルローダミン(CMTMR)で標識した。(Invitrogen)K562-CD19細胞をカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識した。(Invitrogen)培養は2つ同じものを、96ウェル培養プレート内で104個のCD19+標的細胞および104個のメソ+対照細胞を用いて以下のT細胞:標的細胞比:10:1、3:1、および1:1で用意した。K562-CD19およびK562-メソを両方とも標的細胞として使用し、CFSEで標識する一部の実験では、CD19陰性ミエローマ細胞株NSOを負の対照としてCMRAで標識した。培養物を37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション直後に、7-AAD(7-アミノアクチマイシンD)(BD Pharmingen)を製造業者により推奨されたように添加した。分析物を7AAD陰性(生)細胞でゲーティングし、それぞれのT細胞+標的細胞培養物についてK562-CD19生細胞およびK562-メソ生細胞のパーセントを求めた。それぞれの培養物について、K562-CD19のパーセント生存率は、K562-CD19生細胞のパーセントをK562-メソ対照生細胞のパーセントで割ることによって求めた。K562-CD19の補正済みパーセント生存率は、それぞれのT細胞+標的細胞培養物におけるK562-CD19のパーセント生存率を、エフェクターT細胞を含まず、K562-CD19標的細胞およびK562-メソ負の対照細胞しか含有しないチューブにおけるパーセントK562-CD19標的細胞:パーセントK562-メソ負の対照細胞の比で割ることによって計算した。この補正は、出発細胞数のばらつきおよび自発的標的細胞死を説明するのに必要であった。細胞傷害性を100-(K562-CD19の補正済みパーセント生存率)として計算した。全てのエフェクター:標的比について、細胞傷害性を2回繰り返して求め、結果を平均した。
以前に述べられたように若干の変更を加えて(Teachey, et al.,2006, Blood 107(3): 1149-1155 Teachey, et al.,2008, Blood 112(5): 2020-2023)、研究を行った。簡単に述べると、6〜10週齢のNOD-SCID-γc-/-(NSG)マウスをJackson Laboratory(Bar Harbor, ME)から入手したか、または承認を受けた実験動物委員会(institutional animal care and use committee)(IACUC)プロトコールの下、組織内で飼育し、病原体フリーの条件下で維持した。CD19+ ヒト ALL Nalm-6株をAmerican Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)から入手した。動物の尾静脈に、0.2mLの滅菌PBSに溶解した106個のNalm-6生細胞を注射した。Nalm-6注射の7日後に、5x106、1x107、または2.5x107個の細胞を0.2mLの体積の滅菌PBSに溶解してT細胞を尾静脈に注射した。放置しておけば、この用量のNalm-6によって、22〜25日でNSGマウスにおいて致死性の白血病が確実に発生する。以前の実験から、大腿骨髄における信頼性の高く、最も早い疾患検出(>0.1%)は注射して7日後であることが証明された。従って、この時点が治療介入のために選択され、バイオルミネセンス疾患と相関付けられた。動物を、>10%重量減少、毛の消失、下痢、または結膜炎により証明されるように移植片対宿主病および他の毒性の徴候について、ならびに白血病に関連する後肢麻痺について綿密にモニタリングした。末梢血を眼窩後採血によって入手し、ALLの存在およびT細胞生着を、製造業者の説明書に記載のようにBD Trucount(BD Biosciences)チューブを用いてフローサイトメトリーによって確かめた。CD19、CD20、CD4、CD3、CD10、および/またはCD8の発現(必要に応じて)が、蛍光色素に結合したモノクローナル抗体(BD Biosciences)による染色によって検出された。CD19またはSS1 scFv CARの発現が、(マウス由来scFvに特異的な)ヤギ抗マウスIgG血清に由来するビオチン化F(ab')2断片(Jackson ImmunoResearch)の後に、ストレプトアビジン-PE(BD Biosciences/Pharmingen)を用いた染色を用いて検出された。
麻酔したマウスを、Xenogen SpectrumシステムおよびLiving Image v4.0ソフトウェアを用いて画像化した。マウスに150mg/kg体重のD-ルシフェリン(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)を腹腔内注射した。ホタルルシフェラーゼベクターが形質導入されたNalm-6およびヒトT細胞の以前の滴定から、光子放射ピークまでの時間は5分であり、ピーク放出は6〜10分間続くことが示された。それぞれの動物を単独で(光子定量の場合)または5匹までのマウスの群(表示目的の場合)において、前後うつぶせになった位置にしてルシフェリン注射後同じ相対的な時点(6分)で画像化した。直線スケールの中域(600〜60000カウント)に達するまで、または最大露出設定(f/stop 1、大きなビニング、および120秒)に達するまでデータを収集し、次いで、それぞれの画像を露出時間、f/stop、ビニング、および動物サイズについて規準化するためにphoton/秒/cm2/ステラジアンに変換した。解剖学的局在性のために、光強度を表す疑似カラー地図をグレースケール体表参照画像の上に重ね合わせた。データ表示のために、ルシフェラーゼ含有細胞のないマウスを最大設定で画像化し、3.6x105p/s/cm2/srの平均値を得た。典型的に、ルシフェラーゼ含有Nalm-6のあるマウスは、光量子束が5x1011p/s/cm2/srに達した時に白血病で瀕死になり、6桁の検出範囲が生じた。同様に、腫瘍部位へのT細胞の輸送を検出するために、および宿主マウスにおける導入されたT細胞の拡大を評価するために、ルシフェラーゼを発現するバージョンの様々なCARを使用した。
Nalm-6およびK562親細胞株をATCC(Manassas, VA)から入手し、短いタンデム反復分析(Masters, et al., 2001, Proc Natl Acad Sci U S A 98(14):8012-8017)によって遺伝子型を同定した。同一性を確保するために、6ヶ月ごとに、またはCD19もしくはルシフェラーゼ形質導入などの任意の遺伝子組換えの後に細胞株を検証した。
分析は、STATAバージョン10 (Statacorp, College Station, Texas) または Prism 4(Graphpad Software, La Jolla, CA)を用いて行った。インビトロデータは2回の繰り返しの平均を表し、マン・ホイットニー検定を介して平均を比較した。複数の群間で比較するために、個々の群を比較するダン(Dunn)多重比較検定を用いてクラスカル・ワリス分析を行った。複数のデータセットを比較するために、生存曲線をログランク検定とボンフェローニ補正を用いて比較した。
mRNAでトランスフェクトされたCAR+CTL(RNA CAR)の発現および細胞溶解活性の持続性をインビトロで評価した。高い表面発現がインビトロで6日間、持続した後に、10日までにベースライン非発現細胞に向かっていった(図1Aおよびデータ示さず)。この延長された高いトランスジーン持続性は、mRNAトランスフェクション後の表面抗原発現のピークおよび期間の大部分の報告とは異なる(Birkholz et al., 2009, Gene Ther 16(5):596-604; Rabinovich, et al., 2009, Hum Gene Ther 20(1):51-61; Yoon, et al., 2009, Cancer Gene Ther 16(6):489-497; Li, et al., 2010, Cancer Gene Ther 17(3):147-154)。これは、おそらく、最適化IVTベクターおよびRNA生成(データ示さず)が原因である。同時に、インビトロでのCAR発現T細胞の細胞傷害能力を、フローサイトメトリーベースの殺傷アッセイを用いて評価した。E:T比2:1で50%を超える標的細胞の特異的溶解が1〜4日目に認められた。細胞傷害活性は5〜6日目に低下したが、CAR表面発現が2〜3log低減しても、ある程度の溶解活性が観察され、モックトランスフェクト細胞のバックグラウンド溶解を大幅に超えていた(図12B)。発現されたトランスジーンのMFIの低下と同時に特異的溶解活性は低下したが、エレクトロポレーションの6日後に、E:T比20:1でエレクトロポレーション処理されていない対照を上回る有意な溶解活性(p<0.05)が観察された。
レトロウイルス遺伝子導入によって操作されたCAR T細胞を投与した後の重篤な有害事象の最近の報告(Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy 18(4):666-668; Morgan, et al., 2010, Mol Ther 18(4):843-851)から、予め決定された表面発現レベルでCARを発現するためのプラットフォーム、または自己限定的な発現(例えば、RNA)を確実なものにするプラットフォームが望ましい場合があることが示唆される。mRNA用量を滴定することによって、MFIによってRNA CAR表面発現の約100倍のばらつきが観察された(図13A)。表面MFIのばらつきにもかかわらず、発現の低下率(パーセントで表した)は似ている(図13B)。RNA CAR+T細胞は、エレクトロポレーション後1日目に、類似した溶解活性(図13C、左パネル)およびIFN-γ分泌(図13D)を示す。IL-2分泌も試験した。このことは、異なる方法を用いた最近の報告(James, et al., 2010, The Journal of Immunology 184(8):4284)と一致する。しかしながら、3日目までに用量依存的な溶解活性低下が観察された。この場合、少ないRNA用量の効果は1日目の効果と比較して低いが、3日目に高用量(40μgおよび20μg)の溶解プロファイルは、それぞれのE:T比において1日目と似ている。このことから、初期表面発現はインプットRNAと比例するように思われ、溶解活性の時間および程度を決定できることが示唆される。これは、効果の期間、場合によってはサイトカイン放出の期間の制御において有用であるかもしれないが、まだ研究されていない。
RNA CAR発現を1週間まで証明した前記のインビトロデータに基づいて、異種移植片マウスモデルにおいて、mRNAでトランスフェクトされたCAR+T細胞の細胞溶解機能を48時間後に評価した。107個の19-BBzまたは抗メソ(SS1)-BBz RNA CAR+T細胞を注入する7日前に、NSGマウスの尾静脈にCD19+ALL Nalm-6株を接種した(図14)。T細胞を注入して48時間後にマウスを屠殺し、負の選択プロトコールを用いてT細胞を末梢血、脾臓、大腿骨髄、および腹膜洗浄液から回収および濃縮した。インビボ増殖し、CD19+Nalm-6標的に曝露して48時間後でも、CARを発現するT細胞を末梢血、脾臓、および腹膜において依然として検出することができた。表面抗CD19 CAR発現は、インビトロでコンパニオン(companion)対照培養T細胞より適度に少ない(図14A)。コグネイトメソテリン代用(surrogate)抗原を発現する標的に曝露されたことのないメソ-BBz CAR T細胞もこれらの区画から回収された。この時点で、脾臓に由来する全CAR陽性集団はCD19については75%(回収された全ヒトCD3+細胞に対するパーセント)、メソテリンについては68%であった。そのため、バイオルミネセンスに基づいてCD19 CAR CTLが拡大しており(図15)、メソテリンCAR CTLは拡大していないが、増殖中のCD19 CAR CTLはCAR+子孫を産生しているように思われる。CARによって媒介される増殖がCAR陰性子孫をもたらしているのであれば、CD19 CAR陽性細胞のパーセントは、増殖していないメソテリンCAR CTLのパーセントより少なくなるはずである。この時点で、どちらの構築物もヒトCD3+細胞は大腿骨髄からほとんど回収されなかった。これは、1つには、骨髄の接近不可能な領域(椎体、頭蓋冠)全体にT細胞が薄く分布したことが原因である可能性が高い。CARを染色するのに使用したヤギ抗マウスIgG血清は多くの骨髄前駆細胞とも交差反応し、その結果、この区画の評価において高いバックグラウンドが生じた。
RNA CAR CTLの潜在的なインビボ効力を評価するために、動物を前記のように処置したが、腫瘍接種後7日目に単回高用量のT細胞(2.5x107)を与えた。受容体発現は数日まで自己限定的であるので、CARによって動かされる細胞拡大が同様に制限され、高腫瘍量において効力を証明するのに高い細胞出発用量が必要とされる可能性があると仮定することによって、107個の細胞の代わりに2.5x107個の用量を選択した。レトロウイルスを用いて安定して形質導入されたCD19 CAR+T細胞を用いた前臨床モデルでは、同様のモデルにおいて3〜4x107個の総T細胞を用いた3回または4回の別個の注射計画が用いられている(Shaffer, et al., 2011, Blood 117(16):4304-14; Brentjens et al., 2007, Clin Cancer Res 13(18 Pt 1):5426-5435)。驚いたことに、注射後24時間と早い段階でバイオルミネセンスシグナルの2log低減が観察された。この低減は、ある期間にわたって持続した(p<0.01、図5A)。CTLが侵入しない貯蔵庫(reservoir)の証拠もなくバイオルミネセンスシグナルは全体的に低減したが(図16B)、シグナルは検出不可能なレベルに一度も達しなかった。このことから、完全に除去されなかったことが分かる。注目すべきことに、二次元ヒートマップではCNS疾患と他の部位を見分けることができず、そのため、脳、頭蓋、脊椎、および頚椎のエクスビボ画像化を行った。エクスビボ画像化から、この時点(5日目)でCNSはあまり関与していないように見えることが明らかになった。逆に、頭蓋冠/頭蓋底および椎体は白血病と関連があり、このため、マウスの頭部および背中の上にヒートマップが得られた。このことは、光学イメージングによって評価された免疫不全マウスにおけるヒト造血細胞の初期移動の他の報告と一致する(Kalchenko, et al.,2006, J Biomed Opt 11(5):050507)。
最近の臨床試験からの結果は、レトロウイルスベクターを用いて導入されたCARによる改善された臨床結果を示している(Pule, et al.,2008、Nat Med 14(11):1264-1270; Till, et al.,2008, Blood 112(6):2261-2271)。最近の記事では、より安全なCARの必要性が議論されている(Buning et al., 2010, Human Gene Therapy 21(9):1039-42; Heslop, 2010, Molecular Therapy 18(4):661-662)。本明細書に記載のデータは、ますます効力が高まってきているシグナル伝達ドメインを含有するCARを用いた、治療可能時間域を延ばす可能性を秘めたプラットフォームの開発について述べている。本明細書において示された発見は、前臨床モデルにおいて播種性白血病に対するRNA CAR+CTLの治療効果を証明した初めてのものである。
このプロトコールにおける治験薬は、キメラ抗メソテリン免疫受容体scFvでトランスフェクトされた自己由来T細胞である。安全性を最大にするために、この試験では、メソテリンCAR mRNAをエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞を使用する。代表的なCAR mRNAは、pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150Aプラスミド(図19を参照されたい)またはpD-A.19.OF.2bg.150A(図20を参照されたい)のインビトロ転写によって作製することができる。本明細書の他の場所で議論されたように、CAR mRNAを使用すると、ほんの限られた発現期間が可能になる。副作用が認められた場合、mRNA CARの発現が数日に限定されるのでT細胞注入を終わらせ、毒性は急速に弱めることができる。従って、副作用は一過的かつ管理可能である。
プラスミド
最終プラスミド構築物の誘導は、中間プラスミドへのクローニングを伴う多段階プロセスであった。2つの異なるプラスミドを用いて、ss1.bbz断片をクローニングした。最初に、メソテリンscFv断片(ss1)が、トランスレーショナルリサーチプログラム(Translational Research Program)(TRP)研究室によってDr.Pastan(Chowdhury et al.,1998)の以前に公表された構築物からクローニングされた。以前に述べられたpELNS.CD19-BB-ζプラスミド(Milone et al.,2009)から、ヒトCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインと41BBおよびCD3ζ配列をPCRによってクローニングした。最初に、ss1.bbz断片をpGEM.GFP.64Aベクターにクローニングした。トランスジーン発現を向上させるために、2つの3'UTRβグロビン反復および150bpのポリ(A)配列(pGEM.GFP.64Aの中にある64ポリ(A)配列を置換する)を付加することによって、このベクターを改変した(Holtkamp 2006)。臨床使用のためのGMPに準拠したプラスミドを、pGEMに由来するss1.bbz.2bgUTR.150A断片をpDriveベクターにサブクローニングすることによって得た。pDriveクローニングベクター(Qiagen)は、UAハイブリダイゼーションによるPCR産物の高効率クローニング用に設計されている。これを用いると、組換えクローンのアンピシリン選択およびカナマイシン選択が両方とも可能になり、ユニバーサル配列決定プライマー部位ならびにインビトロ転写用のT7プロモーターおよびSP6プロモーターが付いている。最初に、HindIIIおよびNdeI(フィルイン平滑末端)によってpGEMベクターからss1.bbz.2bgUTR.150Aを切断し、KpnIおよびNotI(フィルイン平滑末端)によって切断したpDriveにサブクローニングした。正しい方向を有するインサートを配列確認して、pDrive.ss1.bbz.2bgUTR.150Aを作製した。AhdIおよびBciVIを用いた二重消化によってpDriveベクターの中にあるアンピシリン耐性遺伝子を欠失させた。CAR ORF内にある内部オープンリーディングフレーム(ORF)から翻訳される、可能性のある異常タンパク質を排除するために、サイズが60bpより大きな全ての内部ORFを変異誘発PCRによって変異させたのに対して、ss1 CARのORFは完全な状態で維持した。結果として生じたプラスミドをpD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150Aと名付けた。
最終pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150A構築物を、CVPF SOP 1188に従ってOneShot TOP10 Chemically Competent E Coli細胞(Invitrogen)に導入した。マスター細胞バンクを作製し、TCEF SOP 1190に記載のように細胞の安全性、純度、および同一性を試験した。
1バッチとして調製した10mgまでのプラスミドDNAを、SOP 1191に従って、2つの1.25リットル100μg/mlカナマイシン含有LB培地からQIAfilter Plasmid Giga DNA単離キットを用いて作製した。1回につき1mgのDNAをSpeI制限酵素で37℃で一晩、直線化した。直線化をゲル電気泳動によって確認した後に、Qiagen Plasmid Maxi Kitを用いてラージスケール精製を行った。DNA出荷基準には、外観、濃度純度、無菌性、および直線化のゲル確認が含まれる。
翻訳効率を試験するために、本明細書の他の場所に記載のように多数の異なる市販のシステムからRNAを作製した。同時転写システムと比較して、mScript mRNAシステムは実質的に100%の転写物キャッピング、100%正しいキャップ方向を提供し、翻訳効率を高める可能性のあるCap1翻訳ブースティング(boosting)構造を組み込むので選択された。キットの試験成績書(Certificate of Analysis)が付いているmScript(商標)mRNA Systemの特注ロットが提供された。RNAをRNeasy Maxiキット(Qiagen)を用いて単離した。インビトロで転写されたRNAを1mg/mLの濃度で0.5mLのアリコートで凍結保存した。mRNA変性緩衝液(Invitrogen, Carlsbad, CA)に入れて70℃で15分間変性した後にRNAの質および量を1%アガロースゲル電気泳動によって分析し、UV分光光度法(OD260/280)によって定量した。機能特徴付けの一環として、このmRNAをエレクトロポレーション処理によって導入したT細胞のトランスジーン発現の評価も行った。
CaridianBCT Elutraによる向流遠心水簸を介して単球を枯渇させることによって白血球搬出産物からCD3+T細胞を濃縮した。CaridianBCT Elutraでは使い捨ての閉鎖系ディスポーザブルセットを使用する。0日目に、T細胞製造プロセスを、抗CD3/CD28モノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いた活性化から開始し、静置組織培養バッグの中で拡大を開始する。5日目に、さらなる拡大が必要であれば細胞をWAVEバイオリアクターに移すことができる。培養の終わりに、細胞を磁気ビーズから枯渇させ、洗浄し、Haemonetics Cell Saverシステムを用いて濃縮する。翌朝エレクトロポレーションするために、採取後のT細胞を37℃で一晩インキュベートする。細胞を洗浄し、エレクトロポレーション緩衝液(Maxcyte)に再懸濁し、Maxcyteプロセシングアセンブリにロードする。細胞にss1 RNAをエレクトロポレーション処理によって導入し、4時間回復させ、次いで、注入可能な凍結保存培地に溶解して処方する。
エレクトロポレーションの4時間後にss1 CAR T細胞を凍結保存し、T細胞製造後、3ヶ月以内に解凍および投与する。約30日間、-130℃以下で凍結保存したss1 CAR T細胞のメソテリンscFv発現は97.4%であり、凍結保存時(96.9%)とほぼ同一であることが証明されている。他の凍結保存されたT細胞製品は少なくとも6ヶ月間、安定している。トリパンブルーカウントに基づく解凍後の生存率は98.7%と比較して75.2%であった。発現データから、最終製品は、試験のために保管されている間に安定しており、さらなる投与のためのセンチネルバイアルは70%の生存率および>20%のCAR発現という出荷基準を満たさなければならないことが示唆される。凍結保存の3ヶ月後、6ヶ月後、9ヶ月後、および12ヶ月後にss1 CAR T細胞のさらなるバイアルを解凍し、さらなる製品安定性データを得るために生存率およびトランスジーン発現を試験する。
・注入を、免疫抑制患者のための対策を用いてCTRCにある隔離室で行う。
・プロトコールコーディネーターまたは看護師が、トランスフェクトされたT細胞の1つまたは2つのバッグを水で濡らした氷の上に載せてペンシルバニアホスピタル大学(University of Pennsylvania Hospital)の臨床細胞・ワクチン製造施設(CVPF)から治験薬サービス(Investigational Drug Services)(IDS)に運ぶ。
・IDSは、説明責任のために製品の到着を記録し、臨床試験コーディネーターによって提供された患者名および識別子を確認し、IDS記録の中に維持するために、バッグに貼られている穴の開いた二部構成のラベルから一方のラベルを引きはがす。プロトコールコーディネーターまたは看護師が、トランスフェクトされたT細胞をIDSからCTRCにいる対象のベッドサイドに運ぶ。
・CVPFスタッフの一員が、トランスフェクトされたT細胞をIDSから運んだ直後に、対象のベッドサイドにある37℃ウォーターバスに入れて解凍する。CAR T細胞製品が、傷のあるバッグもしくは液漏れしているバッグの中に入っているように見えたら、または別の方法で損なわれているように見えたら、CAR T細胞製品を注入してはならず、以下に定めたようにCVPFに戻さなければならない。
・解凍後約10〜15分以内にCTRC看護師が細胞を冷やしながら対象に注入する。三方コック付き18ゲージラテックスフリーY型血液セットに通して、トランスフェクトされたT細胞(約100mLの体積)を迅速に静脈内注入する。重力注入(gravity infusion)により投薬を行う。重力による注入速度が遅すぎるのであれば、コックを介して、トランスフェクトされたT細胞製剤を50mL注射器に吸い出し、必要な速度で手作業で注入する。凍っている凝集塊をバッグ内に放置してはならない。
・注入前に、2人の人物が、対象の立ち会いのもとで、それぞれバックに貼ってあるラベルの情報を独立して確かめ、情報が参加者と正しく一致していることを確認する。
・トランスフェクトされたT細胞を注入している間および注入した後に患者をモニタリングする。投薬の直前および注入が完了した後、2時間にわたって15分ごとに血圧、心拍、呼吸数、およびパルスオキシメトリーを入手および記録する。緊急事態のためにクラッシュカートを用意しなければならない。
・注入して3時間後に症状が現れず、対象のバイタルサインが正常なままであれば、症状が発症したら病院に戻るように説明して対象を帰宅させる。バイタルサインの測定が安定しなければ、対象のバイタルサインが安定するまで、または医師が患者を退院させるまで約15分ごとにバイタルサインを入手し続ける。対象が帰っても安全だと医師がみなすまで帰らないように対象に求める。
・形質導入されたCIRT細胞数のベースライン測定のために、形質導入されたCAR T細胞投薬が完了した後、60分(±5分)以内に血液試料を入手する。
・血液検査および追跡調査のために24時間でCTRCに戻るように対象を指示する。
このプロトコールは、メソテリンに特異的なRNA CAR T細胞のIV注射を試験するために設計された。IV ROAによる計画された9回までの注射の忍容性を確かめた後に、対象にRNA CAR T細胞x2をIT投与する。進行性疾患の非存在下では、約6〜8週間間隔で忍容性によりIVおよびIT RNA CAR T細胞のサイクルを繰り返す。この患者からの結果は、これに続く、完全に展開した第I相概念実証(proof of concept)プロトコールの開発の指針となる。
患者または双子のドナーは処置前に標準的な白血球アフェレーシススクリーニングを受ける。IT T細胞の場合、100ml静脈切開によって、製造に十分なリンパ球が得られることがある。T細胞IV投与の場合、約1x109個以上のT細胞を収集するために7〜12リットルのアフェレーシスが必要な場合がある。静脈へのアクセスが十分でない対象には、アフェレーシスで使用するためにカテーテルを一時的に留置してもよい。このカテーテルをアフェレーシス前に挿入し、アフェレーシス手順が完了したら取り外す。ベースラインイムノアッセイのために末梢試料を採取する。FDA遡及調査要件および研究のためにベースライン血液白血球も入手および凍結保存する。
試験薬剤を投薬する前の週に、患者は、インターバルヒストリー(interval history)検査および身体検査、併用薬物療法の調査、ECOGパフォーマンスステータス、AEスクリーニングを受ける。投薬前、2週間以内に以下:EKGおよびCXR(漿膜炎のベースラインスクリーニング)、CBC、化学検査(LFT)、CEAおよびCA-19-9を行わなければならない。
T細胞は臨床細胞・ワクチン製造施設(CVPF)において調製され、注入細胞についてFDAにより定められた出荷基準(例えば、細胞純度、無菌性、発熱性など)が満たされるまで出荷されない。
投与のために適宜、1つまたは2つのバッグに入っているT細胞を、新鮮な場合はコールドパック(cold pack)に載せて、凍結保存されている場合はドライアイスに載せてCTRCにいる対象のベッドサイドに輸送する。細胞を、三方コックの付いた18ゲージまたは同等のラテックスフリーY型血液セットに通して約10〜20ml/分の流速の急速静脈内注入によって与える。細胞が解凍するまでバッグを優しくマッサージする。凍っている凝集塊を容器内に放置してはならない。注入期間は約15分である。それぞれの注入バッグに、以下:「自己由来/同系使用のみ(FOR AUTOLOGOUS/SYNGENEIC USE ONLY)」を記載したラベルを貼る。さらに、ラベルには、対象のイニシャル、誕生日、および試験番号などの少なくとも2つの特有の識別子がある。注入前に、2人の人物が、対象の立ち会いのもとで、この情報を全て独立して確かめ、情報が参加者と正しく一致していることを確認する。T細胞製品が、傷のあるバッグもしくは液漏れしているバッグの中に入っているように見えたら、または別の方法で損なわれているように見えたら、T細胞製品を注入してはならない。
・併用薬物療法を調査する。
・T細胞をコールドパックに載せて臨床細胞・ワクチン製造施設(CVPF)から患者のベッドサイドに運ぶ。
・注入をCTRCで行う。
・凍結されている場合は、自己由来T細胞を患者対象のベッドサイドにある37℃ウォーターバスに入れて解凍する。解凍後、約10〜40分以内に細胞を注入する。T細胞(凍結保存されている場合は約50〜100mLの体積、新鮮な場合は100〜300mL)を、三方コックの付いた18ゲージまたは同等のラテックスフリーY型血液セットに通して約10/分の流速の静脈内に注入する。重力注入により投薬を行う。重力による注入速度が遅すぎるのであれば、コックを介して、自己由来T細胞製剤を50mL注射器に吸い出し、必要な速度で手作業で注入してもよい。
・投薬の直前および注入が開始した後、2時間にわたって15分ごとに血圧、心拍、呼吸数、パルスオキシメトリーを入手および記録する。緊急事態のためにクラッシュカートを用意しなければならない。
・注入されたT細胞の数のベースライン測定のために、T細胞投薬が完了した後、15分(±5分)以内に血液試料を入手する。
・注射して1時間後に症状が現れず、患者対象のバイタルサインが正常なままであれば、患者対象を帰宅させる。バイタルサインの測定が安定しなければ、患者対象のバイタルサインが安定するまで、または医師が患者を退院させるまで約15分ごとにバイタルサインを入手し続ける。
・初回注入の後、一晩観察するために患者を収容する。qod M-W-Fに基づいて注入を行い、忍容性が確かめられたら、可能な限り外来で対象に注入を行う。SOEに従って血液検査および追跡調査のために24時間で戻るように対象を指示する。
T細胞注入後の副作用には、一過性の発熱、悪寒、疲労、および/または悪心が含まれる。注入前に、対象に経口によりアセトアミノフェン650mgを前投薬し、経口またはIVにより塩酸ジフェンヒドラミン25〜50mgを前投薬した後に、T細胞を注入することが推奨される。これらの薬物療法を必要に応じて6時間ごとに繰り返してもよい。患者に発熱があり、アセトアミノフェンによって軽減しないことが続くのであれば、1コースの非ステロイド抗炎症薬物療法が処方されてもよい。命を脅かす緊急事態を除いて、いかなる時でも、患者にはヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン(Solu-Medrol)、またはデキサメタゾン(Decadron)などの全身コルチコステロイドを与えないことが推奨される。なぜなら、これにはT細胞に対して副作用があり得るからである。急性注入反応にコルチコステロイドが必要とされるのであれば、ヒドロコルチゾン100mgの初回投与が推奨される。IT注射の場合、患者には、注射疼痛のための麻酔薬の他に前投薬を日常的に与えない。
試験薬剤を注射する前に、患者のECOGパフォーマンスステータス、AEスクリーニング、CBC、およびLFTを検査する。この目的は、T細胞を3週間にわたって週3回、すなわち、MWF投与することである。例えば、医学的合併症の介入または休日によって計画が変更する可能性が高い。忍容性により週3回注射することを目標にして、計画された注入を必要に応じて調整する。
超音波誘導または侵襲放射線学(invasive radiology)により推奨される他の画像化を用いてT細胞を腫瘍病変部に注入する。患者に抗不安薬(すなわち、アチバン)を前投薬してもよく、意識下鎮静の状態で注射してもよい。局所麻酔のために、処置の少なくとも30分間前に患者の注射部位に2.5〜5.0グラムのリドカイン/プリロカインクリーム(EMLA)を塗布してもよい。注射しようとする皮膚の領域をベタジンで清浄にし、その後に、さらに多くのリドカイン(1%)を皮膚および皮下組織に注射し、腫瘍周辺部から中心領域に注射しようと腫瘍および腫瘍周囲領域にT細胞を浸潤させる。
進行性疾患の非存在下では、連続6〜8週間のサイクルでIT T細胞注入およびIV T細胞注入を行うことができる。もしCAR T細胞に対する体液性免疫応答が発生したら全身(IV)T細胞注射を続けるのを止める。しかしながら、疾患進行の非存在下では、患者は忍容性により活動性疾患部位にIT T細胞注射を毎月受け続けることができる。
GD2は、神経芽細胞腫およびメラノーマを含む神経外胚葉由来の腫瘍表面に発現しているジシアロガングリオシドである。GD2に腫瘍特異性があるために、RNA CARを発現する遺伝子組換えCTLを標的化するためにGD2を使用することができる。本明細書において示されたデータから、GD2 scFvを含むCARをコードするIVT RNAをエレクトロポレーション処理によって導入したCTL(scFvはGD2に結合する)はGD2発現腫瘍を効果的に検出および処置することが証明される。
cMetは、非小細胞癌(NSCLC)癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳癌、頭頚部癌、結腸癌、および腎臓癌を含む非常に多くのタイプの癌に見出される受容体型チロシンキナーゼである。従って、本明細書において示されたように、cMetを標的とするIVT RNA CARを開発できることは様々な種類の癌を処置するのに有用だと分かるだろう。
RNA CARを用いた複数回の動物腫瘍処置実験に基づいて、処置して数日後に、レンチ-CD19z T細胞およびCD19 RNA T細胞はいずれも同様の処置効力を示すことが見出された。CD19 RNA CAR T細胞は対照T細胞または食塩水処置マウスより有意に少ない腫瘍量(1〜2log少ないBLI)を示したが、CD19 CARをコードするレンチウイルスほど効果的に腫瘍を取り除かない(図39)。追加のT細胞注射(2回目および3回目)は、継続的な腫瘍抑制を示したレンチ-CD19Z T細胞処置マウスと比較して、さらなる処置利益を付け加えるようには見えない(図39)。複数回のT細胞注射の処置効力は、単回投与T細胞注射を用いた前の実験と同等である。このことは、再注射されたT細胞の処置効力の欠如が観察されたことは、1回目のT細胞注射から拡大された非機能的T細胞が既に存在することが原因であり得ることを示している。本明細書において示されたように、新たなT細胞注射の前に非機能的T細胞を除去することによって、RNA CAR T細胞の複数回注射の処置が向上するかどうかを調べた。
Claims (62)
- 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、補助刺激シグナル伝達領域、およびCD3-ζのシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含む、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNA。
- 細胞外ドメインが抗原結合部分を含む、請求項1記載のRNA。
- 抗原結合部分が腫瘍抗原に結合する、請求項2記載のRNA。
- 腫瘍抗原が、脳腫瘍、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、リンパ腫、白血病、肺癌、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、皮膚癌、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮癌、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される癌に関連する抗原である、請求項3記載のRNA。
- pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:4の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項1記載のRNA。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:8からなる群より選択される配列を含む、請求項1記載のRNA。
- pD-A.19.OF.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:5の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項1記載のRNA。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、およびSEQ ID NO:24からなる群より選択される配列を含む、請求項1記載のRNA。
- pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:28の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項1記載のRNA。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、およびSEQ ID NO:13からなる群より選択される配列を含む、請求項1記載のRNA。
- pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150Aであり、SEQ ID NO:27の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項1記載のRNA。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:18からなる群より選択される配列を含む、請求項1記載のRNA。
- 補助刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される補助刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項1記載のRNA。
- 核酸配列が、約150アデノシン塩基を含むポリ(A)テールを含む、請求項1記載のRNA。
- 核酸配列が、ヒトβグロブリンに由来する3'UTRの少なくとも1つの反復を含む3'UTRを含む、請求項1記載のRNA。
- 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、補助刺激シグナル伝達領域、およびCD3-ζのシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含むインビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む、T細胞。
- 細胞外ドメインが抗原結合部分を含む、請求項16記載のT細胞。
- 抗原結合部分が腫瘍抗原に結合する、請求項17のT細胞。
- 腫瘍抗原が、脳腫瘍、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、リンパ腫、白血病、肺癌、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、皮膚癌、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮癌、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される癌に関連する抗原である、請求項18記載のT細胞。
- RNAが、pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:4の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項16記載のT細胞。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:8からなる群より選択される配列を含む、請求項16記載のT細胞。
- RNAが、pD-A.19.OF.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:5の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項16記載のT細胞。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:24からなる群より選択される配列を含む、請求項16記載のT細胞。
- RNAが、pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:28の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項16記載のT細胞。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、およびSEQ ID NO:13からなる群より選択される配列を含む、請求項16記載のT細胞。
- RNAが、pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150Aであり、SEQ ID NO:27の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項16記載のT細胞。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:18からなる群より選択される配列を含む、請求項16記載のT細胞。
- 補助刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される補助刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項16記載のT細胞。
- 核酸配列が、約150アデノシン塩基を含むポリ(A)テールを含む、請求項16記載のT細胞。
- 核酸配列が、ヒトβグロブリンに由来する3'UTRの少なくとも1つの反復を含む3'UTRを含む、請求項16記載のT細胞。
- インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAをT細胞に導入する工程を含む、外因性RNAを一過的に発現するRNA操作T細胞の集団を作製する方法であって、該RNAが、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、補助刺激シグナル伝達領域、およびCD3-ζのシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含む、方法。
- 細胞外ドメインが抗原結合部分を含む、請求項31記載の方法。
- 抗原結合部分が腫瘍抗原に結合する、請求項32記載の方法。
- 腫瘍抗原が、脳腫瘍、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、リンパ腫、白血病、肺癌、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、皮膚癌、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮癌、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される癌に関連する抗原である、請求項33記載の方法。
- RNAが、pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:4の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項31記載の方法。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:8からなる群より選択される配列を含む、請求項31記載の方法。
- RNAが、pD-A.19.OF.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:5の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項31記載の方法。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、およびSEQ ID NO:24からなる群より選択される配列を含む、請求項31記載の方法。
- RNAが、pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:28の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項31記載の方法。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、およびSEQ ID NO:13からなる群より選択される配列を含む、請求項31記載の方法。
- RNAが、pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150Aであり、SEQ ID NO:27の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項31記載の方法。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:18からなる群より選択される配列を含む、請求項31記載の方法。
- 補助刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される補助刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項31記載の方法。
- 核酸配列が、約150アデノシン塩基を含むポリ(A)テールを含む、請求項31記載の方法。
- 核酸配列が、ヒトβグロブリンに由来する3'UTRの少なくとも1つの反復を含む3'UTRを含む、請求項31記載の方法。
- 外因性RNAを一過的に発現するように操作されたT細胞を患者に投与する工程を含む、癌患者を処置する方法であって、該RNAが、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、補助刺激シグナル伝達領域、およびCD3-ζのシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含む、方法。
- 細胞外ドメインが抗原結合部分を含む、請求項46記載の方法。
- 抗原結合部分が腫瘍抗原に結合する、請求項47記載の方法。
- 腫瘍抗原が、脳腫瘍、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、リンパ腫、白血病、肺癌、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、皮膚癌、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮癌、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される癌に関連する抗原である、請求項48記載の方法。
- T細胞の投与を繰り返す工程を含む、請求項46記載の方法。
- 患者に化学療法剤を投与する工程を含む、請求項46記載の方法。
- RNAが、pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:4の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項46記載の方法。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:8からなる群より選択される配列を含む、請求項46記載の方法。
- RNAが、pD-A.19.OF.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:5の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項46記載の方法。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、およびSEQ ID NO:24からなる群より選択される配列を含む、請求項46記載の方法。
- RNAが、pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150Aであり、SEQ ID NO:28の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項46記載の方法。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、およびSEQ ID NO:13からなる群より選択される配列を含む、請求項46記載の方法。
- RNAが、pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150Aであり、SEQ ID NO:27の核酸配列を含むインビトロ転写ベクターから転写される、請求項46記載の方法。
- RNAが転写されるDNAが、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:18からなる群より選択される配列を含む、請求項46記載の方法。
- 補助刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される補助刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項46記載の方法。
- 核酸配列が、150アデノシン塩基を含むポリ(A)テールを含む、請求項46記載の方法。
- 核酸配列が、ヒトβグロブリンに由来する3'UTRの少なくとも1つの反復を含む3'UTRを含む、請求項46記載の方法。
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