CN108129555B - 特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证 - Google Patents

特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证 Download PDF

Info

Publication number
CN108129555B
CN108129555B CN201710811434.3A CN201710811434A CN108129555B CN 108129555 B CN108129555 B CN 108129555B CN 201710811434 A CN201710811434 A CN 201710811434A CN 108129555 B CN108129555 B CN 108129555B
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
gly
ala
glu
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710811434.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108129555A (zh
Inventor
崔胜�
高小攀
牟志霞
秦博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pathogen Biology of CAMS
Original Assignee
Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pathogen Biology of CAMS filed Critical Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority to CN201710811434.3A priority Critical patent/CN108129555B/zh
Publication of CN108129555A publication Critical patent/CN108129555A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108129555B publication Critical patent/CN108129555B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一类特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证。本发明首先保护一种多肽，为序列表的序列3所示的多肽或序列表的序列4所示的多肽。编码所述多肽的基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护所述多肽的应用：结合细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白；富集细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白；检测细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白。本发明提供的功能短肽可以与效应蛋白竞争性结合免疫蛋白，从而破坏TplE‑TplEi互作，从而促使效应蛋白裂解细菌自身的的细胞膜引发细菌自我死亡，这将是一个最有力的以T6SS效应蛋白为靶点的新型抗菌策略，为临床耐药菌株的治疗提供新方向。

Description

特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设 计及其抗菌活性的验证
技术领域
本发明涉及特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白(TplEi)的多肽的设计及其抗菌活性的验证，具体来说，本发明基于蛋白质三维结构设计靶向细菌六型分泌***效应蛋白-免疫蛋白(TplE-TplEi)相互作用的多肽，发现其具有抗菌活性，具有抗感染药物研发前景。
背景技术
二十世纪以来，致病细菌引发的传染病仍然是全球公共卫生的重大威胁。抗生素的滥用不断加剧着多耐药和泛耐药菌株的出现，尤其近些年来发现对多粘菌素产生抗性基因MCR-1的发现，更为致病细菌的防治带来了前所未有的挑战。铜绿假单胞菌是临床耐药菌中最为典型的代表，其广泛存在于自然界中，可通过环境污染、交叉感染、内源性感染和医源性感染等途径传播，是引发肺炎和手术感染的重要院内感染菌，特别是免疫功能低下患者和ICU病人。此外，铜绿假单胞菌也是囊性纤维化(cystic fibrosis)病人呼吸道感染和慢性阻塞性病人的诱。目前铜绿假单胞菌已经成为医院感染的重要条件致病菌，约占我国医院感染病例数的11.1％-24.5％，居第2-3位。而在全球范围内，铜绿假单胞菌感染已经跃为首位。而这些感染病例中绝大数是由多耐药(MDR)和泛耐药(XDR)铜绿假单胞菌引起,多耐药(MDR)和泛耐药(XDR)铜绿假单胞菌已经对抗生素最后一道防线-多粘菌素产生耐药。因此，设计和研发新型抗感染药物迫在眉睫。
目前，多种新型的抗生素替代物正在研发中，比如，Kenneth Shatzkes和其同事在老鼠动物模型中利用捕食细菌来杀死肺炎球菌。噬菌体治疗因其高度的特异性也备受关注，针对铜绿假单胞菌的噬菌体已被鉴定并应用。此外，抗菌肽(AMP)和金属离子也在研发中。治疗铜绿假单胞菌感染的最常用的方法是抗生素和噬菌体治疗。然而，噬菌体抗体的出现和药物抗性等加剧使这些治疗手段的失效。抗毒力的策略(Antivirulence strategies)是最近提出的抗感染药物研发新思路。通过干扰细菌分泌***，抑制细菌毒力能够解除致病细菌的“武装”使其丧失毒力同时又不直接杀死细菌。由于这种抑菌策略不直接危及细菌生存，因而具有较小的选择压力，能够延缓耐药突变的出现，引发国际相关领域极大关注。
细菌的分泌***是一类能够帮助细菌向宿主细胞或异己细菌输送毒力效应蛋白的一种高度特异化、横跨多层细菌被膜的生物大分子复合体。目前在细菌中已经发现7种分泌***(T1SS-T7SS)。细菌Ⅵ型分泌***(T6SS)是最近才被发现和描述的一种细菌分泌***，广泛存在于致病性革兰氏阴性菌中，通过分泌效应毒素蛋白介导了细菌间、细菌与宿主间的相互作用，在细菌的存活以及致病中发挥着重要作用。T6SS通常包括13-25个蛋白构成的核心组件或若干个辅助组件，这些蛋白按功能可分为结构蛋白、效应蛋白、调节蛋白和分子伴侣蛋白。效应蛋白作为T6SS发挥功能的终端产物，直接参与了细菌间的竞争和宿主的致病性。因此，T6SS及其效应蛋白是药物设计的理想靶标。在过去的几年中，T6SS分泌***的效应蛋白陆续被鉴定出来。最早被发现分泌到细胞外的是T6SS的结构组件VgrG和Hcp，VgrG通过交联真核宿主的肌动蛋白引发感染。随后，降解细菌细胞壁的效应蛋白(Tae/Tge)、降解细胞膜的效应蛋白(Tle)、降解核酸的效应蛋白等陆续被报道出来。有趣的是，为了使自身细胞免受这些效应蛋白的毒害，T6SS+细菌同时表达与各种效应分子相对应的同种免疫蛋白或抗毒蛋白(cognate immunity protein)来中和毒素效应蛋白的作用，这种毒力效应蛋白和免疫蛋白对(E-I pair)使得拥有T6SS的细菌在与其他细菌竞争中保持了优势。研究发现，铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌***毒力效应蛋白TplE作为跨界毒力因子直接参与了细菌种间的竞争和宿主ER装置的自噬作用，其自身通过表达免疫蛋白(抗毒蛋白)TplEi中和TplE毒性从而阻止***行为。
发明内容
本发明的目的是设计一种与六型分泌***免疫蛋白TplEi蛋白特异结合的、具有抗菌活性的多肽。
本发明首先保护一类多肽，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)或(a8)：
(a1)序列表的序列3所示的多肽；
(a2)将(a1)进行1-5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与其具有相同功能的由其衍生的多肽；
(a3)序列表的序列4所示的多肽；
(a4)在(a1)或(a3)的N端或/和C端连接标签得到的多肽；
(a5)在(a1)或(a3)的N端连接信号肽得到的多肽；
(a6)序列表的序列11第1至57位氨基酸残基组成的多肽；
(a7)在(a1)或(a3)的N端连接信号肽且C端连接标签得到的多肽；
(a8)序列表的序列11所示的多肽。
编码所述多肽的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)：
(b1)编码区如序列表的序列10第70-171位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列10第70-159位核苷酸所示的DNA分子；
(b3)编码区如序列表的序列10第1-171位核苷酸所示的DNA分子；
(b4)编码区如序列表的序列10所示的DNA分子；
(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列杂交且编所述多肽的DNA分子；
(b6)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述多肽的DNA分子。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述多肽的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)或(c5)或(c6)：
(c1)结合细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白；
(c2)制备用于结合细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白的产品；
(c3)富集细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白；
(c4)制备用于富集细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白的产品；
(c5)检测细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白；
(c6)制备用于检测细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白的产品。
本发明还保护所述多肽的应用，为如下(d1)或(d2)：
(d1)与细菌Ⅵ型分泌***中的毒素蛋白竞争性结合免疫蛋白；
(d2)制备用于与细菌Ⅵ型分泌***中的毒素蛋白竞争性结合免疫蛋白的产品。
本发明还保护所述多肽的应用，为如下(f1)或(f2)：
(f1)解除细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白对毒素蛋白诱发的细菌死亡的抑制作用；
(f1)制备用于解除细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白对毒素蛋白诱发的细菌死亡的抑制作用的产品。
本发明还保护所述多肽的应用，为如下(g1)或(g2)：
(g1)促进具有细菌Ⅵ型分泌***的细菌的死亡；
(g1)制备用于促进具有细菌Ⅵ型分泌***的细菌的死亡的产品。
所述具有细菌Ⅵ型分泌***的细菌具体可为铜绿假单胞菌。
以上任一所述毒素蛋白为TplE蛋白，具体为如下(h1)、(h2)、(h3)、(h4)、(h5)或(h6)：
(h1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(h2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；
(h3)来源于铜绿假单胞菌且与序列1所示蛋白质具有90％以上同一性的蛋白质；
(h4)在(h1)的N端或/和C端连接标签得到的多肽；
(h5)在(h1)的N端连接信号肽得到的多肽；
(h6)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
以上任一所述免疫蛋白为TplEi蛋白，具体为如下(j1)、(j2)、(j3)、(j4)、(j5)或(j6)：
(j1)由序列表中序列2第26-380位氨基酸残基组成的蛋白质；
(j2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(j3)将(j1)或(j2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；
(j4)来源于铜绿假单胞菌且与(j1)或(j2)具有90％以上同一性的蛋白质；
(j5)在(j1)或(j2)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质；
(j6)在(j1)或(j2)的N端连接信号肽得到的蛋白质。
随着细菌耐药性的逐渐增强，发展新型抗感染药物迫在眉睫。六型分泌***(T6SS)其通过分泌毒力蛋白参与了原核细胞和真核细胞的感染，在生态***平衡和人类健康方面起着重要作用。铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌***的效应蛋白TplE通过靶向竞争者细菌细胞膜引发其死亡，而其自身通过表达抗毒蛋白TplEi中和TplE毒性从而阻止***行为。
本发明提供的功能短肽可以与效应蛋白(TplE蛋白)竞争性结合免疫蛋白(TplEi蛋白)，从而破坏TplE-TplEi互作，从而促使效应蛋白裂解细菌自身的的细胞膜引发细菌自我死亡，这将是一个最有力的以T6SS效应蛋白为靶点的新型抗菌策略，将为设计新型抗感染药物提供最为直接的药物筛选平台和后期药物应用开发提供强有力科技支撑，为临床耐药菌株的治疗提供新方向。
附图说明
图1为A肽与His6-TplEi的亲和力检测结果。
图2为B肽与His6-TplEi的亲和力检测结果。
图3为实施例3的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
TplE蛋白即效应蛋白，又称毒素蛋白。铜绿假单胞菌来源的TplE蛋白如序列表的序列1所示。TplEi蛋白即免疫蛋白，又称抗毒蛋白。铜绿假单胞菌来源的TplEi蛋白如序列表的序列2所示，其信号肽为第1至25位，成熟肽为第26至380位。
petDUET-1载体：Novagen公司。大肠杆菌Rosetta(DE3)：Novagen公司。pET-28a(+)载体：Novagen公司。pET-26b(+)载体：Novagen公司。大肠杆菌BL21：Novagen公司。
实施例1、功能短肽的发现
1、采用petDUET-1载体为出发质粒构建重组质粒。重组质粒中，第一个开放阅读框表达N端具有His6标签的TplEi成熟肽，第二个开放阅读框表达TplE蛋白。
2、将步骤1构建的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌。
3、培养步骤2得到的重组菌，培养过程中进行IPTG诱导，然后依次进行如下步骤：菌体破碎取上清、镍柱纯化、离子交换层析、Superose 6分子筛层析，得到TplE-TplEi复合物。
4、取步骤3得到的TplE-TplEi复合物，加入枯草杆菌蛋白酶进行原位酶解消化结晶，然后获取晶体并进行结构解析。
5、根据结构解析的结果制备多肽并进行功能验证，最终发现了两个功能短肽，分别命名为A肽和B肽。
A肽的氨基酸序列(序列表的序列3)：DDLFASIGALWTWAWRGPKARQELLKAEQVEVDD。
B肽的氨基酸序列(序列表的序列4)：DDLFASIGALWTWAWRGPKARQELLKAEQ。
实施例2、功能短肽对TplEi蛋白的亲和力
功能短肽与TplEi蛋白进行体外结合实验，确定功能短肽的亲和力。功能短肽的高亲和力是用于开发新型抗感染药物的第一步。
一、制备功能短肽
人工合成A肽。
人工合成B肽。
二、制备TplEi蛋白
1、将序列表的序列5第64-1131位核苷酸所示的双链DNA分子***pET-28a(+)载体的NdeI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒。经测序验证，重组质粒中具有序列表的序列5所示的开放阅读框，表达N端具有His6标签的TplEi成熟肽。
2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌。
3、将步骤2得到的重组菌接种至含50mg/L卡那霉素和50mg/L氯霉素的液体LB培养基，37℃、180rpm振荡培养至OD600nm值约为1.2。
4、完成步骤3后，将整个培养体系冰浴放置半小时，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mmol/L，然后18℃、180rpm振荡培养18小时。
5、完成步骤4后，4000rpm离心15min，收集菌体，用裂解液悬浮后在冰上进行超声破碎(功率600W，每工作5s停5s，99次)，然后15000rpm离心30min，收集上清液，将上清液进行0.45微米滤膜过滤，收集滤液。
裂解液：含2M NaCl、12mM imidazole、0.1％β-巯基乙醇、1mM PMSF，余量为pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液。
6、Ni柱纯化
3ml镍离子亲和层析柱：QIAGEN。
纯化过程：①用10倍柱体积的平衡液平衡柱子；②上样步骤5得到的滤液；③用10倍柱体积的洗涤液洗涤柱子，以去除杂蛋白；④用15ml洗脱液洗脱柱子，收集过柱后溶液。
平衡液：含2M NaCl、12mM imidazole，余量为pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液。
洗涤液(pH7.5)：含150mMNaCl、50mM Tris、12mM咪唑，余量为水。
洗脱液(pH7.5)：含75mM NaCl、50mM Tris、250mM咪唑、0.1％β-巯基乙醇，余量为水。
将过柱后溶液进行0.45微米滤膜过滤，收集滤液。
7、阳离子交换层析纯化
AKTA explore***。
5ml Hitrap SP HP层析柱：GE HEALTHCARE。
纯化过程：①用5个柱体积的buffer A平衡柱子；②上样步骤6得到的滤液；③用buffer A和buffer B进行线性梯度洗脱，实时监测280nm的紫外值，收集洗脱峰(整个洗脱过程，仅出现一个明显的洗脱峰)对应的过柱后溶液。
buffer A(pH7.5)：含50mM Tris、75mM NaCl、1mM DTT，余量为水。
buffer B(pH7.5)：含50mM Tris、1M NaCl、1mM DTT，余量为水。
将过柱后溶液采用截留分子量为10KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到蛋白浓缩液。
8、分子筛层析纯化
24ml Superose 6柱层析柱：GE HEALTHCARE。
纯化过程：①用1个柱体积的分子筛缓冲液平衡柱子；②上样步骤7得到蛋白浓缩液；③用分子筛缓冲液进行洗脱，实时监测280nm的紫外值，收集洗脱峰(整个洗脱过程，仅出现一个明显的洗脱峰)对应的过柱后溶液。
分子筛缓冲液(pH7.0)：含150mMNaCl、20mMTris，余量为水。
将过柱后溶液采用截留分子量为10KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到蛋白浓缩液，即为含有N端具有His6标签的TplEi成熟肽的溶液，命名为His6-TplEi溶液。N端具有His6标签的TplEi成熟肽用His6-TplEi表示。
His6-TplEi溶液中，His6-TplEi的浓度为10mg/ml(以总蛋白浓度计)。
三、亲和力检测
采用MicroCal iTC200微量热等温滴定量热仪进行体外ITC实验。制备A肽溶液，A肽浓度为1-2mM。制备B肽溶液，B肽浓度为1-2mM。制备His6-TplEi溶液的稀释液，稀释液的蛋白浓度为0.03-0.04mM。制备各个溶液和稀释液采用的溶剂均为如下：含20mM Tris-HCl、100mM NaCl，余量为水，pH＝8.0。使用18针连续进样，每针2微升。间隔120秒，数据最后使用ORGIIN进行处理。
A肽与His6-TplEi的亲和力检测结果见图1。kd＝125nM。
B肽与His6-TplEi的亲和力检测结果见图2。kd＝478nM。
实施例3、功能短肽通过激活TplE蛋白引发细菌的自我死亡
一、构建重组质粒
1、将序列表的序列6所示的双链DNA分子***pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-TplE。经测序验证，重组质粒pET26b-TplE中具有序列表的序列6所示的开放阅读框。序列表的序列6所示的DNA分子编码序列表的序列7所示的蛋白质。序列表的序列7中，第1-23位氨基酸残基组成信号肽(促使蛋白分泌到周质空间)，第24-592位氨基酸残基组成TplE蛋白。
2、将序列表的序列8所示的双链DNA分子***pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-TplE-TplEi。经测序验证，重组质粒pET26b-TplE-TplEi中具有序列表的序列8所示的开放阅读框。序列表的序列8所示的DNA分子编码序列表的序列9所示的蛋白质。序列表的序列9中，第1-23位氨基酸残基组成信号肽(促使蛋白分泌到周质空间)，第24-592位氨基酸残基组成TplE蛋白，第593-972位氨基酸残基组成TplEi蛋白。
3、将序列表的序列10第1-171位核苷酸所示的双链DNA分子***pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-A。经测序验证，重组质粒pET26b-A中具有序列表的序列10所示的开放阅读框。序列表的序列10所示的DNA分子编码序列表的序列11所示的蛋白质。序列表的序列11中，第1-23位氨基酸残基组成信号肽(促使蛋白分泌到周质空间)，第24-57位氨基酸残基组成A肽。
4、将序列表的序列12第1-171位核苷酸所示的双链DNA分子***pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-K100E。经测序验证，重组质粒pET26b-K100E中具有序列表的序列12所示的开放阅读框。
5、将序列表的序列13第1-171位核苷酸所示的DNA分子***pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-W92A。经测序验证，重组质粒pET26b-W92A中具有序列表的序列13所示的开放阅读框。
二、细菌培养试验
第一组：将pET-26b(+)载体导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
第二组：将重组质粒pET26b-TplE导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
第三组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
第四组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和pET-26b(+)载体共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
第五组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和重组质粒pET26b-A共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
第六组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和重组质粒pET26b-W92A共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
第七组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和重组质粒pET26b-K100E共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
第八组：将pET-26b(+)载体和重组质粒pET26b-A共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
结果见图3。图3中，每一组自左至右，依次为菌液、菌液的10倍稀释液、菌液的100倍稀释液、菌液的103倍稀释液、菌液的104倍稀释液和菌液的105倍稀释液。与第一组相比，第二组的重组菌存活数量显著降低，即TplE蛋白诱导细菌发生了死亡。与第二组相比，第三组的重组菌存活数量显著增加，即TplEi蛋白对TplE蛋白诱导细菌死亡具有抑制作用。与第四组相比，第五组重组菌存活数量显著降低，即A肽通过与TplE蛋白竞争性结合TplEi蛋白，解除了TplEi蛋白对TplE蛋白诱导细菌死亡的抑制作用，TplE蛋白得以释放发挥毒性作用，细菌死亡。与第五组相比，第六组以及第七组的重组菌存活数量显著增加，即将A肽进行点突变后，其相应的作用效果显著降低。第八组的结果表明，A肽本身对细菌基本不存在致死作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证
<130> GNCYX171704
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 569
<212> PRT
<213> P.Aeruginosa
<400> 1
Met Ser Ser Glu Pro Leu Glu Pro Asn Gln Asp Val Ile Ile Pro Arg
1 5 10 15
Ser Arg Asp Ser Leu Gly Arg Pro Val Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg
20 25 30
Thr Asp Asn Gln Ser Glu Lys Val Ala Leu Ile Arg Gln Thr Ala Pro
35 40 45
Leu Pro Val Ile Phe Ile Pro Gly Ile Met Gly Thr Asn Leu Arg Asn
50 55 60
Lys Ala Asp Lys Ser Glu Val Trp Arg Pro Pro Asn Gly Leu Trp Pro
65 70 75 80
Met Asp Asp Leu Phe Ala Ser Ile Gly Ala Leu Trp Thr Trp Ala Trp
85 90 95
Arg Gly Pro Lys Ala Arg Gln Glu Leu Leu Lys Ala Glu Gln Val Glu
100 105 110
Val Asp Asp Gln Gly Thr Ile Asp Val Gly Gln Ser Gly Leu Ser Glu
115 120 125
Glu Ala Ala Arg Leu Arg Gly Trp Gly Lys Val Met Arg Ser Ala Tyr
130 135 140
Asn Pro Val Met Gly Leu Met Glu Arg Arg Leu Asp Asn Ile Val Ser
145 150 155 160
Arg Arg Glu Leu Gln Ala Trp Trp Asn Asp Glu Ala Leu Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Asp Gln Gly Glu Glu Gln Gly Lys Val Gly Pro Ile Asp Glu Glu
180 185 190
Glu Leu Leu Arg Ala Ser Arg Tyr Gln Phe Asp Val Trp Cys Ala Gly
195 200 205
Tyr Asn Trp Leu Gln Ser Asn Arg Gln Ser Ala Leu Asp Val Arg Asp
210 215 220
Tyr Ile Glu Asn Thr Val Leu Pro Phe Tyr Gln Lys Glu Cys Gly Leu
225 230 235 240
Asp Pro Glu Gln Met Arg Arg Met Lys Val Ile Leu Val Thr His Ser
245 250 255
Met Gly Gly Leu Val Ala Arg Ala Leu Thr Gln Leu His Gly Tyr Glu
260 265 270
Arg Val Leu Gly Val Val His Gly Val Gln Pro Ala Thr Gly Ser Ser
275 280 285
Thr Ile Tyr His His Met Arg Cys Gly Tyr Glu Gly Ile Ala Gln Val
290 295 300
Val Leu Gly Arg Asn Ala Gly Glu Val Thr Ala Ile Val Ala Asn Ser
305 310 315 320
Ala Gly Ala Leu Glu Leu Ala Pro Ser Ala Glu Tyr Arg Glu Gly Arg
325 330 335
Pro Trp Leu Phe Leu Cys Asp Ala Gln Gly Gln Val Leu Lys Asp Ile
340 345 350
Asp Gly Lys Pro Arg Ala Tyr Pro Gln Asn Gln Asp Pro Tyr Glu Glu
355 360 365
Ile Tyr Lys Asn Thr Thr Trp Tyr Gly Leu Val Pro Glu Gln Asn Ser
370 375 380
Gln Tyr Leu Asp Met Ser Asp Lys Lys Glu Gly Leu Arg Val Gly Pro
385 390 395 400
Arg Asp Asn Phe Glu Asp Leu Ile Asp Ser Ile Ala Asn Phe His Gly
405 410 415
Glu Leu Ser Ala Ala Gly Tyr His Ser Glu Thr Tyr Ala His Tyr Gly
420 425 430
Ala Asp Asp Ser Arg His Ser Trp Arg Asp Leu Ile Trp Lys Gly Asp
435 440 445
Pro Thr Pro Leu Glu Thr Pro Gly Ala Thr Leu Asn Asp Asp Glu Asn
450 455 460
Gly Thr Tyr Asn Ser Trp Phe Arg Arg Gly Leu Pro Thr Ile Val Gln
465 470 475 480
Gly Pro Leu Glu Thr Gly Asn Pro Leu Asp Ala Ser Gly Ser Gly Gly
485 490 495
Asp Glu Thr Val Pro Thr Asp Ser Gly Gln Ala Pro Ala Leu Ala Gly
500 505 510
Val Lys Ala Ser Phe Arg His Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gln Ala Asn
515 520 525
Thr Lys Arg Gly Tyr Glu His Gln Glu Ser Tyr Asn Asp Ala Arg Ala
530 535 540
Gln Trp Ala Ala Leu Tyr Gly Val Ile Lys Ile Thr Gln Leu Ala Asp
545 550 555 560
Trp His Pro Asn Asp Lys Gly Gly Thr
565
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> P.Aeruginosa
<400> 2
Met Met His Pro Arg Arg Leu Leu Ala Val Leu Gly Val Val Val Leu
1 5 10 15
Thr Ser Met Thr Ser Cys Thr Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ser Ser Ser
20 25 30
Met Asp Lys Thr Gly Trp Ile Thr His Cys Phe Gly Arg Phe Leu Ile
35 40 45
Asp Leu Pro Pro Asp Ala Val Ile Asn Ala Gly Tyr Tyr Leu Trp Gly
50 55 60
Asp Arg Ile Glu Tyr Leu Asp Asp Lys Pro Thr Glu Leu Ala Ala Arg
65 70 75 80
Val Asp Arg Leu Glu Gln Glu Trp Arg Thr Gln Arg His Lys Ser Lys
85 90 95
Gly Asn Met Phe Leu Arg Lys Ile Asp Phe Gly Asn Glu Ser Val Gly
100 105 110
Leu Leu Ser Trp Ser Ser Glu Val Ala Ser Lys Thr Tyr Leu Leu Asp
115 120 125
Thr Tyr Val Thr Ser Lys Pro Thr Trp His Val Tyr Arg Trp Lys Gly
130 135 140
Lys Val Ser Val Asp Arg Glu Gln His Ala Val Glu Ile Ser Arg Ala
145 150 155 160
Leu Ala Arg Asn Leu Arg Ser Arg Ala Pro Lys Glu Ile Pro Ser Glu
165 170 175
Pro Gly Phe Cys Ile Asp His Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ser Phe Gln
180 185 190
Val Glu Arg Phe Gly Val Gly Val Thr Phe Pro Glu His Pro Gly Ala
195 200 205
Arg Phe Glu Phe Arg Ser Ser Thr Gly Ala Glu Leu Asn Ser Leu Leu
210 215 220
Glu Arg Val Asp Gly Phe Val Gln Asn Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly
225 230 235 240
Met Glu Thr Leu Arg Lys Gly Lys His Pro Val Gly Ser Leu Pro Gly
245 250 255
Glu Glu Tyr Leu Val Ala Gly Ser Asp Lys Gly Gln Arg Gly Tyr Thr
260 265 270
Phe Met Trp Glu Val Gln Gly Lys Glu Glu Ser Leu Thr Glu Pro Asn
275 280 285
Leu Thr Ala Gly Leu Ala Val Leu Glu Arg Ser Asn Glu Asn Gly Lys
290 295 300
Pro Pro Pro Pro Ala Phe Lys Ser Asp Lys Glu Ala Leu Glu Leu Trp
305 310 315 320
Asp Thr Ile Val Asp Ser Ile Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser Ser Pro
325 330 335
Arg Gly Gly Asn Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Lys Pro Ala Thr Pro
340 345 350
Gly Gly Gln Thr Leu Gly Asp His Tyr Val Tyr Glu Glu Phe Leu Ser
355 360 365
Ser Leu Lys Pro Lys Asp Ser Trp Leu Asp Asp Leu
370 375 380
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Asp Asp Leu Phe Ala Ser Ile Gly Ala Leu Trp Thr Trp Ala Trp Arg
1 5 10 15
Gly Pro Lys Ala Arg Gln Glu Leu Leu Lys Ala Glu Gln Val Glu Val
20 25 30
Asp Asp
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Asp Asp Leu Phe Ala Ser Ile Gly Ala Leu Trp Thr Trp Ala Trp Arg
1 5 10 15
Gly Pro Lys Ala Arg Gln Glu Leu Leu Lys Ala Glu Gln
20 25
<210> 5
<211> 1131
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgtcttctt ctcggagctc ttccatggac aagaccggat ggattactca ttgctttggt 120
cgctttctga ttgatctgcc acctgacgcg gtaatcaatg ccggatacta cctatgggga 180
gacagaattg agtacttaga tgataaacct accgaactgg cagccagggt tgatcgtctt 240
gaacaagagt ggaggactca gagacataaa tccaaaggta acatgtttct tcgtaaaatt 300
gactttggca atgaatcagt aggtttattg tcttggtctt cagaggttgc ctctaaaacc 360
tatttattgg atacctatgt tacatctaag cctacgtggc atgtctatcg ttggaaaggg 420
aaagtttcgg tagacagaga gcaacatgct gtggagatat ctagggcttt agctcgaaat 480
ctacgttctc gcgcgccaaa agaaatcccc agcgagccgg gcttttgcat cgaccacgct 540
tatattgcag gggatagttt tcaagtggag aggtttggag tgggagtcac tttccctgag 600
caccccggcg cgcgctttga attccgctcc tccacgggag ctgagctaaa cagccttctt 660
gagcgagtcg acggcttcgt gcaaaacatg ctctccacgt ttgcaggtat ggaaacatta 720
agaaaaggaa agcatcctgt cgggagcctt cccggagagg agtatctggt tgcgggaagc 780
gataaggggc agcgcggcta taccttcatg tgggaggttc aaggcaagga ggaatcgcta 840
accgagccca atcttactgc gggactggcg gtactggaac gcagcaatga aaacggtaaa 900
ccaccgcccc ctgccttcaa atcggataaa gaagcattgg aactgtggga caccattgtc 960
gattcgattc gcgtgcgccc gacgtcttca tcgccacgtg gcggaaatgc cggtccttcc 1020
cctgctccga aacccgctac gcctggcggc caaacgctcg gtgatcacta tgtctatgag 1080
gaattcctct ccagcctgaa gccaaaagac agctggctgg acgacctata g 1131
<210> 6
<211> 1779
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggccatga tgagcagcga accgctcgag ccgaatcagg atgtgatcat ccctcgctct 120
cgcgacagtc tgggacggcc tgtctacaag gcgcagttga cccgtaccga caaccagagc 180
gaaaaggtgg cactgattcg gcagaccgct cccctgccgg tgatcttcat tccggggatc 240
atgggaacca acctgcgcaa caaggcagat aaaagcgagg tctggaggcc gccgaatggt 300
ctgtggccca tggatgacct gtttgcctcc atcggtgcgt tgtggacttg ggcctggagg 360
ggtccaaagg cccgtcagga gctcctgaag gctgagcaag tagaagtcga tgaccagggt 420
acgatcgatg tcggtcaatc tggtttgtcc gaagaagctg cccgcctgcg cggctggggc 480
aaggtcatgc gcagtgcgta taacccggtc atgggattaa tggagaggcg actggataac 540
atcgtcagcc ggcgggaact ccaggcatgg tggaatgacg aagccctctc tcctcctgga 600
gatcagggtg aggagcaggg aaaggttggg ccgatcgatg aagaggaatt gctcagggcc 660
agccgatacc agttcgatgt ctggtgcgcc ggctataact ggctacagtc caaccggcag 720
tcggcgctgg atgtacgcga ctatatcgag aataccgtgt tgcctttcta ccaaaaggag 780
tgcggtctcg atcccgagca gatgagacgt atgaaggtca ttctggtcac ccattcgatg 840
ggagggctgg tggctcgcgc cctgacgcag ttgcacggct atgagcgcgt attgggggtg 900
gtgcatggcg tacaacctgc gacaggttcc tcgaccatct accatcatat gcgctgtggc 960
tatgaaggta tcgcacaggt cgtgctgggg cgaaatgccg gtgaagtgac agccattgtc 1020
gccaattcgg ccggcgcgct ggaattggcc cctagcgcgg aataccggga agggcgtccc 1080
tggctgtttc tatgcgacgc gcaggggcag gtgctcaagg atatcgatgg aaagcctcgg 1140
gcttatccgc agaatcagga cccttatgaa gagatataca agaacactac gtggtatgga 1200
ttggtgcctg agcaaaattc acaatatctg gacatgtcag acaaaaaaga aggtttaaga 1260
gttggccccc gtgataactt tgaagacttg atagatagca ttgctaattt tcatggtgaa 1320
ttatcagcag caggatatca ctcagagacc tatgcccatt acggagctga cgatagccgc 1380
catagttggc gcgacctgat ctggaagggt gaccctaccc ctctggagac ccccggtgcc 1440
acactcaacg acgatgagaa cggcacttac aacagttggt tccgccgggg cttgcccacc 1500
atagtgcagg gtccgctgga gacgggaaat cctctggacg cttccggtag cggaggtgac 1560
gaaacggtac cgaccgactc cggccaggcg cctgccctgg cgggcgtcaa ggccagcttt 1620
cggcatggca gcaagggcaa gggacaggcc aataccaaac ggggctatga gcaccaggag 1680
agttacaacg atgctcgtgc tcaatgggca gcgctatatg gggtgatcaa aatcacccag 1740
ttggcggatt ggcatcctaa tgacaaagga gggacatga 1779
<210> 7
<211> 592
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 7
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Met Ser Ser Glu Pro Leu Glu Pro Asn
20 25 30
Gln Asp Val Ile Ile Pro Arg Ser Arg Asp Ser Leu Gly Arg Pro Val
35 40 45
Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Thr Asp Asn Gln Ser Glu Lys Val Ala
50 55 60
Leu Ile Arg Gln Thr Ala Pro Leu Pro Val Ile Phe Ile Pro Gly Ile
65 70 75 80
Met Gly Thr Asn Leu Arg Asn Lys Ala Asp Lys Ser Glu Val Trp Arg
85 90 95
Pro Pro Asn Gly Leu Trp Pro Met Asp Asp Leu Phe Ala Ser Ile Gly
100 105 110
Ala Leu Trp Thr Trp Ala Trp Arg Gly Pro Lys Ala Arg Gln Glu Leu
115 120 125
Leu Lys Ala Glu Gln Val Glu Val Asp Asp Gln Gly Thr Ile Asp Val
130 135 140
Gly Gln Ser Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Arg Leu Arg Gly Trp Gly
145 150 155 160
Lys Val Met Arg Ser Ala Tyr Asn Pro Val Met Gly Leu Met Glu Arg
165 170 175
Arg Leu Asp Asn Ile Val Ser Arg Arg Glu Leu Gln Ala Trp Trp Asn
180 185 190
Asp Glu Ala Leu Ser Pro Pro Gly Asp Gln Gly Glu Glu Gln Gly Lys
195 200 205
Val Gly Pro Ile Asp Glu Glu Glu Leu Leu Arg Ala Ser Arg Tyr Gln
210 215 220
Phe Asp Val Trp Cys Ala Gly Tyr Asn Trp Leu Gln Ser Asn Arg Gln
225 230 235 240
Ser Ala Leu Asp Val Arg Asp Tyr Ile Glu Asn Thr Val Leu Pro Phe
245 250 255
Tyr Gln Lys Glu Cys Gly Leu Asp Pro Glu Gln Met Arg Arg Met Lys
260 265 270
Val Ile Leu Val Thr His Ser Met Gly Gly Leu Val Ala Arg Ala Leu
275 280 285
Thr Gln Leu His Gly Tyr Glu Arg Val Leu Gly Val Val His Gly Val
290 295 300
Gln Pro Ala Thr Gly Ser Ser Thr Ile Tyr His His Met Arg Cys Gly
305 310 315 320
Tyr Glu Gly Ile Ala Gln Val Val Leu Gly Arg Asn Ala Gly Glu Val
325 330 335
Thr Ala Ile Val Ala Asn Ser Ala Gly Ala Leu Glu Leu Ala Pro Ser
340 345 350
Ala Glu Tyr Arg Glu Gly Arg Pro Trp Leu Phe Leu Cys Asp Ala Gln
355 360 365
Gly Gln Val Leu Lys Asp Ile Asp Gly Lys Pro Arg Ala Tyr Pro Gln
370 375 380
Asn Gln Asp Pro Tyr Glu Glu Ile Tyr Lys Asn Thr Thr Trp Tyr Gly
385 390 395 400
Leu Val Pro Glu Gln Asn Ser Gln Tyr Leu Asp Met Ser Asp Lys Lys
405 410 415
Glu Gly Leu Arg Val Gly Pro Arg Asp Asn Phe Glu Asp Leu Ile Asp
420 425 430
Ser Ile Ala Asn Phe His Gly Glu Leu Ser Ala Ala Gly Tyr His Ser
435 440 445
Glu Thr Tyr Ala His Tyr Gly Ala Asp Asp Ser Arg His Ser Trp Arg
450 455 460
Asp Leu Ile Trp Lys Gly Asp Pro Thr Pro Leu Glu Thr Pro Gly Ala
465 470 475 480
Thr Leu Asn Asp Asp Glu Asn Gly Thr Tyr Asn Ser Trp Phe Arg Arg
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Ile Val Gln Gly Pro Leu Glu Thr Gly Asn Pro Leu
500 505 510
Asp Ala Ser Gly Ser Gly Gly Asp Glu Thr Val Pro Thr Asp Ser Gly
515 520 525
Gln Ala Pro Ala Leu Ala Gly Val Lys Ala Ser Phe Arg His Gly Ser
530 535 540
Lys Gly Lys Gly Gln Ala Asn Thr Lys Arg Gly Tyr Glu His Gln Glu
545 550 555 560
Ser Tyr Asn Asp Ala Arg Ala Gln Trp Ala Ala Leu Tyr Gly Val Ile
565 570 575
Lys Ile Thr Gln Leu Ala Asp Trp His Pro Asn Asp Lys Gly Gly Thr
580 585 590
<210> 8
<211> 2919
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggccatga tgagcagcga accgctcgag ccgaatcagg atgtgatcat ccctcgctct 120
cgcgacagtc tgggacggcc tgtctacaag gcgcagttga cccgtaccga caaccagagc 180
gaaaaggtgg cactgattcg gcagaccgct cccctgccgg tgatcttcat tccggggatc 240
atgggaacca acctgcgcaa caaggcagat aaaagcgagg tctggaggcc gccgaatggt 300
ctgtggccca tggatgacct gtttgcctcc atcggtgcgt tgtggacttg ggcctggagg 360
ggtccaaagg cccgtcagga gctcctgaag gctgagcaag tagaagtcga tgaccagggt 420
acgatcgatg tcggtcaatc tggtttgtcc gaagaagctg cccgcctgcg cggctggggc 480
aaggtcatgc gcagtgcgta taacccggtc atgggattaa tggagaggcg actggataac 540
atcgtcagcc ggcgggaact ccaggcatgg tggaatgacg aagccctctc tcctcctgga 600
gatcagggtg aggagcaggg aaaggttggg ccgatcgatg aagaggaatt gctcagggcc 660
agccgatacc agttcgatgt ctggtgcgcc ggctataact ggctacagtc caaccggcag 720
tcggcgctgg atgtacgcga ctatatcgag aataccgtgt tgcctttcta ccaaaaggag 780
tgcggtctcg atcccgagca gatgagacgt atgaaggtca ttctggtcac ccattcgatg 840
ggagggctgg tggctcgcgc cctgacgcag ttgcacggct atgagcgcgt attgggggtg 900
gtgcatggcg tacaacctgc gacaggttcc tcgaccatct accatcatat gcgctgtggc 960
tatgaaggta tcgcacaggt cgtgctgggg cgaaatgccg gtgaagtgac agccattgtc 1020
gccaattcgg ccggcgcgct ggaattggcc cctagcgcgg aataccggga agggcgtccc 1080
tggctgtttc tatgcgacgc gcaggggcag gtgctcaagg atatcgatgg aaagcctcgg 1140
gcttatccgc agaatcagga cccttatgaa gagatataca agaacactac gtggtatgga 1200
ttggtgcctg agcaaaattc acaatatctg gacatgtcag acaaaaaaga aggtttaaga 1260
gttggccccc gtgataactt tgaagacttg atagatagca ttgctaattt tcatggtgaa 1320
ttatcagcag caggatatca ctcagagacc tatgcccatt acggagctga cgatagccgc 1380
catagttggc gcgacctgat ctggaagggt gaccctaccc ctctggagac ccccggtgcc 1440
acactcaacg acgatgagaa cggcacttac aacagttggt tccgccgggg cttgcccacc 1500
atagtgcagg gtccgctgga gacgggaaat cctctggacg cttccggtag cggaggtgac 1560
gaaacggtac cgaccgactc cggccaggcg cctgccctgg cgggcgtcaa ggccagcttt 1620
cggcatggca gcaagggcaa gggacaggcc aataccaaac ggggctatga gcaccaggag 1680
agttacaacg atgctcgtgc tcaatgggca gcgctatatg gggtgatcaa aatcacccag 1740
ttggcggatt ggcatcctaa tgacaaagga gggacaatga tgcatccccg tcggttgctt 1800
gctgtacttg gagtggtggt cttgaccagc atgaccagtt gcacttcgtt ttcttcttct 1860
cggagctctt ccatggacaa gaccggatgg attactcatt gctttggtcg ctttctgatt 1920
gatctgccac ctgacgcggt aatcaatgcc ggatactacc tatggggaga cagaattgag 1980
tacttagatg ataaacctac cgaactggca gccagggttg atcgtcttga acaagagtgg 2040
aggactcaga gacataaatc caaaggtaac atgtttcttc gtaaaattga ctttggcaat 2100
gaatcagtag gtttattgtc ttggtcttca gaggttgcct ctaaaaccta tttattggat 2160
acctatgtta catctaagcc tacgtggcat gtctatcgtt ggaaagggaa agtttcggta 2220
gacagagagc aacatgctgt ggagatatct agggctttag ctcgaaatct acgttctcgc 2280
gcgccaaaag aaatccccag cgagccgggc ttttgcatcg accacgctta tattgcaggg 2340
gatagttttc aagtggagag gtttggagtg ggagtcactt tccctgagca ccccggcgcg 2400
cgctttgaat tccgctcctc cacgggagct gagctaaaca gccttcttga gcgagtcgac 2460
ggcttcgtgc aaaacatgct ctccacgttt gcaggtatgg aaacattaag aaaaggaaag 2520
catcctgtcg ggagccttcc cggagaggag tatctggttg cgggaagcga taaggggcag 2580
cgcggctata ccttcatgtg ggaggttcaa ggcaaggagg aatcgctaac cgagcccaat 2640
cttactgcgg gactggcggt actggaacgc agcaatgaaa acggtaaacc accgccccct 2700
gccttcaaat cggataaaga agcattggaa ctgtgggaca ccattgtcga ttcgattcgc 2760
gtgcgcccga cgtcttcatc gccacgtggc ggaaatgccg gtccttcccc tgctccgaaa 2820
cccgctacgc ctggcggcca aacgctcggt gatcactatg tctatgagga attcctctcc 2880
agcctgaagc caaaagacag ctggctggac gacctatag 2919
<210> 9
<211> 972
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 9
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Met Ser Ser Glu Pro Leu Glu Pro Asn
20 25 30
Gln Asp Val Ile Ile Pro Arg Ser Arg Asp Ser Leu Gly Arg Pro Val
35 40 45
Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Thr Asp Asn Gln Ser Glu Lys Val Ala
50 55 60
Leu Ile Arg Gln Thr Ala Pro Leu Pro Val Ile Phe Ile Pro Gly Ile
65 70 75 80
Met Gly Thr Asn Leu Arg Asn Lys Ala Asp Lys Ser Glu Val Trp Arg
85 90 95
Pro Pro Asn Gly Leu Trp Pro Met Asp Asp Leu Phe Ala Ser Ile Gly
100 105 110
Ala Leu Trp Thr Trp Ala Trp Arg Gly Pro Lys Ala Arg Gln Glu Leu
115 120 125
Leu Lys Ala Glu Gln Val Glu Val Asp Asp Gln Gly Thr Ile Asp Val
130 135 140
Gly Gln Ser Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Arg Leu Arg Gly Trp Gly
145 150 155 160
Lys Val Met Arg Ser Ala Tyr Asn Pro Val Met Gly Leu Met Glu Arg
165 170 175
Arg Leu Asp Asn Ile Val Ser Arg Arg Glu Leu Gln Ala Trp Trp Asn
180 185 190
Asp Glu Ala Leu Ser Pro Pro Gly Asp Gln Gly Glu Glu Gln Gly Lys
195 200 205
Val Gly Pro Ile Asp Glu Glu Glu Leu Leu Arg Ala Ser Arg Tyr Gln
210 215 220
Phe Asp Val Trp Cys Ala Gly Tyr Asn Trp Leu Gln Ser Asn Arg Gln
225 230 235 240
Ser Ala Leu Asp Val Arg Asp Tyr Ile Glu Asn Thr Val Leu Pro Phe
245 250 255
Tyr Gln Lys Glu Cys Gly Leu Asp Pro Glu Gln Met Arg Arg Met Lys
260 265 270
Val Ile Leu Val Thr His Ser Met Gly Gly Leu Val Ala Arg Ala Leu
275 280 285
Thr Gln Leu His Gly Tyr Glu Arg Val Leu Gly Val Val His Gly Val
290 295 300
Gln Pro Ala Thr Gly Ser Ser Thr Ile Tyr His His Met Arg Cys Gly
305 310 315 320
Tyr Glu Gly Ile Ala Gln Val Val Leu Gly Arg Asn Ala Gly Glu Val
325 330 335
Thr Ala Ile Val Ala Asn Ser Ala Gly Ala Leu Glu Leu Ala Pro Ser
340 345 350
Ala Glu Tyr Arg Glu Gly Arg Pro Trp Leu Phe Leu Cys Asp Ala Gln
355 360 365
Gly Gln Val Leu Lys Asp Ile Asp Gly Lys Pro Arg Ala Tyr Pro Gln
370 375 380
Asn Gln Asp Pro Tyr Glu Glu Ile Tyr Lys Asn Thr Thr Trp Tyr Gly
385 390 395 400
Leu Val Pro Glu Gln Asn Ser Gln Tyr Leu Asp Met Ser Asp Lys Lys
405 410 415
Glu Gly Leu Arg Val Gly Pro Arg Asp Asn Phe Glu Asp Leu Ile Asp
420 425 430
Ser Ile Ala Asn Phe His Gly Glu Leu Ser Ala Ala Gly Tyr His Ser
435 440 445
Glu Thr Tyr Ala His Tyr Gly Ala Asp Asp Ser Arg His Ser Trp Arg
450 455 460
Asp Leu Ile Trp Lys Gly Asp Pro Thr Pro Leu Glu Thr Pro Gly Ala
465 470 475 480
Thr Leu Asn Asp Asp Glu Asn Gly Thr Tyr Asn Ser Trp Phe Arg Arg
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Ile Val Gln Gly Pro Leu Glu Thr Gly Asn Pro Leu
500 505 510
Asp Ala Ser Gly Ser Gly Gly Asp Glu Thr Val Pro Thr Asp Ser Gly
515 520 525
Gln Ala Pro Ala Leu Ala Gly Val Lys Ala Ser Phe Arg His Gly Ser
530 535 540
Lys Gly Lys Gly Gln Ala Asn Thr Lys Arg Gly Tyr Glu His Gln Glu
545 550 555 560
Ser Tyr Asn Asp Ala Arg Ala Gln Trp Ala Ala Leu Tyr Gly Val Ile
565 570 575
Lys Ile Thr Gln Leu Ala Asp Trp His Pro Asn Asp Lys Gly Gly Thr
580 585 590
Met Met His Pro Arg Arg Leu Leu Ala Val Leu Gly Val Val Val Leu
595 600 605
Thr Ser Met Thr Ser Cys Thr Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ser Ser Ser
610 615 620
Met Asp Lys Thr Gly Trp Ile Thr His Cys Phe Gly Arg Phe Leu Ile
625 630 635 640
Asp Leu Pro Pro Asp Ala Val Ile Asn Ala Gly Tyr Tyr Leu Trp Gly
645 650 655
Asp Arg Ile Glu Tyr Leu Asp Asp Lys Pro Thr Glu Leu Ala Ala Arg
660 665 670
Val Asp Arg Leu Glu Gln Glu Trp Arg Thr Gln Arg His Lys Ser Lys
675 680 685
Gly Asn Met Phe Leu Arg Lys Ile Asp Phe Gly Asn Glu Ser Val Gly
690 695 700
Leu Leu Ser Trp Ser Ser Glu Val Ala Ser Lys Thr Tyr Leu Leu Asp
705 710 715 720
Thr Tyr Val Thr Ser Lys Pro Thr Trp His Val Tyr Arg Trp Lys Gly
725 730 735
Lys Val Ser Val Asp Arg Glu Gln His Ala Val Glu Ile Ser Arg Ala
740 745 750
Leu Ala Arg Asn Leu Arg Ser Arg Ala Pro Lys Glu Ile Pro Ser Glu
755 760 765
Pro Gly Phe Cys Ile Asp His Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ser Phe Gln
770 775 780
Val Glu Arg Phe Gly Val Gly Val Thr Phe Pro Glu His Pro Gly Ala
785 790 795 800
Arg Phe Glu Phe Arg Ser Ser Thr Gly Ala Glu Leu Asn Ser Leu Leu
805 810 815
Glu Arg Val Asp Gly Phe Val Gln Asn Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly
820 825 830
Met Glu Thr Leu Arg Lys Gly Lys His Pro Val Gly Ser Leu Pro Gly
835 840 845
Glu Glu Tyr Leu Val Ala Gly Ser Asp Lys Gly Gln Arg Gly Tyr Thr
850 855 860
Phe Met Trp Glu Val Gln Gly Lys Glu Glu Ser Leu Thr Glu Pro Asn
865 870 875 880
Leu Thr Ala Gly Leu Ala Val Leu Glu Arg Ser Asn Glu Asn Gly Lys
885 890 895
Pro Pro Pro Pro Ala Phe Lys Ser Asp Lys Glu Ala Leu Glu Leu Trp
900 905 910
Asp Thr Ile Val Asp Ser Ile Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser Ser Pro
915 920 925
Arg Gly Gly Asn Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Lys Pro Ala Thr Pro
930 935 940
Gly Gly Gln Thr Leu Gly Asp His Tyr Val Tyr Glu Glu Phe Leu Ser
945 950 955 960
Ser Leu Lys Pro Lys Asp Ser Trp Leu Asp Asp Leu
965 970
<210> 10
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggccatgg atgacctgtt tgcctccatc ggtgcgttgt ggacttgggc ctggaggggt 120
ccaaaggccc gtcaggagct cctgaaggct gagcaagtag aagtcgatga cctcgagcac 180
caccaccacc accactga 198
<210> 11
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 11
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Asp Asp Leu Phe Ala Ser Ile Gly Ala
20 25 30
Leu Trp Thr Trp Ala Trp Arg Gly Pro Lys Ala Arg Gln Glu Leu Leu
35 40 45
Lys Ala Glu Gln Val Glu Val Asp Asp Leu Glu His His His His His
50 55 60
His
65
<210> 12
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggccatgg atgatctgtt tgccagcatt ggcgcactgt ggacctgggc atggcgtggt 120
ccggaagcac gtcaggaact gctgaaagcc gaacaggtgg aagtggatga cctcgagcac 180
caccaccacc accactga 198
<210> 13
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggccatgg atgatctgtt tgccagcatt ggtgcactgg caacctgggc atggcgtggt 120
ccgaaagccc gtcaggaact gctgaaagcc gaacaggtgg aagtggatga tctcgagcac 180
caccaccacc accactga 198

Claims (8)

1.一种多肽，为如下(a1)、(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)或(a8)：
(a1)序列表的序列3所示的多肽；
(a3)序列表的序列4所示的多肽；
(a4)在(a1)或(a3)的N端或/和C端连接标签得到的多肽；
(a5)在(a1)或(a3)的N端连接信号肽得到的多肽；
(a6)序列表的序列11第1至57位氨基酸残基组成的多肽；
(a7)在(a1)或(a3)的N端连接信号肽且C端连接标签得到的多肽；
(a8)序列表的序列11所示的多肽。
2.编码权利要求1所述多肽的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区如序列表的序列10第70-171位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列10第70-159位核苷酸所示的DNA分子；
(b3)编码区如序列表的序列10第1-171位核苷酸所示的DNA分子；
(b4)编码区如序列表的序列10所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述多肽的应用，为如下(c2)或(c4)或(c6)：
(c2)制备用于结合细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白的产品；
(c4)制备用于富集细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白的产品；
(c6)制备用于检测细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白的产品。
6.权利要求1所述多肽的应用，为如下：制备用于与细菌Ⅵ型分泌***中的毒素蛋白竞争性结合免疫蛋白的产品。
7.权利要求1所述多肽的应用，为如下：制备用于解除细菌Ⅵ型分泌***中的免疫蛋白对毒素蛋白诱发的细菌死亡的抑制作用的产品。
8.权利要求1所述多肽的应用，为如下：制备用于促进具有细菌Ⅵ型分泌***的细菌的死亡的产品。
CN201710811434.3A 2017-09-11 2017-09-11 特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证 Active CN108129555B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710811434.3A CN108129555B (zh) 2017-09-11 2017-09-11 特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710811434.3A CN108129555B (zh) 2017-09-11 2017-09-11 特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108129555A CN108129555A (zh) 2018-06-08
CN108129555B true CN108129555B (zh) 2020-04-28

Family

ID=62388460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710811434.3A Active CN108129555B (zh) 2017-09-11 2017-09-11 特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108129555B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109400675B (zh) * 2018-11-27 2020-06-16 仲恺农业工程学院 抗菌肽、抗菌药物以及制备方法
CN109517046B (zh) * 2018-11-28 2021-09-14 福建师范大学 一种基于外膜蛋白生成机制的抗菌多肽及其应用
CN109825464B (zh) * 2019-01-17 2021-06-15 浙江海洋大学 敲除t6ss-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗
CN114540377B (zh) * 2022-02-17 2023-11-17 中国科学院水生生物研究所 柱状黄杆菌vi型分泌***效应分子及其免疫蛋白及应用
CN114940707B (zh) * 2022-04-19 2023-07-18 中国医学科学院病原生物学研究所 Rae1-Nup98特异性结合多肽及其应用
CN116785422B (zh) * 2023-06-25 2024-05-28 中国医学科学院病原生物学研究所 含有新型冠状病毒联合抗原的麻疹减毒疫苗及其拯救方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101897951A (zh) * 2009-05-31 2010-12-01 中国人民解放军第二军医大学 一种新型抗炎分子drp的抗炎作用、实施方法及用途
ES2749349T3 (es) * 2011-11-07 2020-03-19 Medimmune Llc Proteínas de unión multiespecíficas y multivalentes y usos de las mismas
CN106814124A (zh) * 2015-11-30 2017-06-09 上海交通大学 一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的***及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108129555A (zh) 2018-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108129555B (zh) 特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌***免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证
Erbs et al. Peptidoglycan and muropeptides from pathogens Agrobacterium and Xanthomonas elicit plant innate immunity: structure and activity
Mygind et al. Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus
Song et al. Contact-independent killing mediated by a T6SS effector with intrinsic cell-entry properties
US10745450B2 (en) Peptides and uses thereof
Beckmann et al. Detection of the Wolbachia-encoded DNA binding protein, HU beta, in mosquito gonads
Macharia et al. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants
Grafskaia et al. Discovery of novel antimicrobial peptides: A transcriptomic study of the sea anemone Cnidopus japonicus
Yu et al. Identification, eukaryotic expression and structure & function characterizations of β-defensin like homologues from Pelodiscus sinensis
CA2183665A1 (en) Apidaecin-type peptide antibiotics with improved activities and/or different antibacterial spectrum
Wang et al. Identification of the 14-3-3 β/α-A protein as a novel maternal peptidoglycan-binding protein that protects embryos of zebrafish against bacterial infections
RU2316595C1 (ru) Способ получения антимикробного пептида ареницина
Wang et al. Identification of a key functional region in harpins from Xanthomonas that suppresses protein aggregation and mediates harpin expression in E. coli
US20110318782A1 (en) Microbial Expression of Tobacco Osmotin for Biocidal and Medical Applications
RU2580031C2 (ru) ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pET-His8-TrxL-Acip1, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АЦИПЕНСИНА-1 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА
CN114088946A (zh) 转录调控因子WalR和MgrA的亚硝基化修饰在治疗金黄色葡萄球菌感染中的应用
CN108864273B (zh) 一种模拟人源性抗菌肽及其制备方法
Li et al. On-resin cleavage of bacterially expressed fusion proteins for purification of active recombinant peptides SK-29, KR-20, LL-29, and LL-23 from human sweat or skin
CN106811526B (zh) 一种拟穴青蟹抗病性状的cSNP分子标记检测试剂盒及检测方法
Mohamed et al. Molecular Characterization, Heterologous Expression and Antimicrobial Activity of Phaseolus vulgaris L. Defensin Peptide (Pv-Def) against various Human MDR Pathogens
CN109180786B (zh) 用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段
CN115850427B (zh) 芋螺双α螺旋抗菌肽、其制备方法及其应用
CN114344450B (zh) 一种牙鲆补体成分C3a蛋白的应用
Dolashki et al. Antimicrobial compounds from the mucus of garden snail Cornu aspersa
Moore Identifying the lethal factor protein secreted by Staphylococcus aureus treatment with SK-03-92 drug

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant