ES2749349T3 - Proteínas de unión multiespecíficas y multivalentes y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Una proteína que comprende: un brazo Fab que se une a un primer epítopo, un dominio de unión (BD) que se une a un segundo epítopo, y una región Fc que comprende dominios CH2 y CH3; en donde la proteína comprende una cadena pesada quimérica que comprende los siguientes dominios de polipéptidos, desde el extremo N al extremo C VH1-CH1-L1-BD-L2-Fc-L2-BD-L1-CH1-VH1; en donde VH1 comprende el dominio variable de la cadena pesada del Fab, CH1 comprende el dominio constante de la cadena pesada 1 del Fab, L1 comprende el primer polipéptido conector, BD comprende un scFv, L2 comprende el segundo polipéptido conector y Fc comprende un CH2 y un dominio CH3 y en donde la proteína es bivalente para unirse a cada uno de los epítopos primero y segundo, y en donde el L1 comprende la secuencia de aminoácidos EPKSCDKT (SEQ ID NO: 4) o EPKSCGKT (SEQ ID NO: 6) o EPKSC (SEQ ID NO: 38) y/o en donde el L2 comprende la secuencia de aminoácidos EPKSVDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 12) o DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 40).

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión multiespecíficas y multivalentes y usos de las mismas
Antecedentes
Muchas enfermedades son causadas por biomoléculas o están asociadas con ellas, y es útil desarrollar tratamientos de enfermedades, terapias, reactivos de diagnóstico y reactivos de investigación que se dirijan a biomoléculas y, opcionalmente, modulen sus actividades. Pueden desearse agentes, incluidos agentes terapéuticos, de diagnóstico e investigación, que se unan a más de un sitio, de modo que una sola molécula pueda unirse a múltiples regiones de la misma biomolécula diana, o bien a múltiples dianas diferentes. El enfoque descrito en el presente documento proporciona nuevas proteínas de unión bivalentes biespecíficas basadas en una estructura central única que puede adaptarse para generar proteínas de unión que se unan a epítopos adicionales (es decir, tienen especificidades adicionales), por ejemplo, proteínas de unión triespecíficas, proteínas de unión tetraspecíficas, proteínas de unión pentaspecíficas.
El documento WO 01/77342 A1 (Genentech Inc.) divulga un anticuerpo biespecífico tetravalente en donde la cadena pesada tiene la fórmula VH-CH1-enlace flexible-VH-CH1-bisagra-C2-C3.
El documento US 2003/082679 A1 (L. Sun et al.) divulga las secuencias enlazadoras de constructos de anticuerpos (ver Figura 2A, Figura 2B y Figura 2C).
D. Lu et al. (2002) J Immun Meth 267212-226 divulga un scFv directamente vinculado a la cadena pesada o ligera de un Fab. También se discute el uso de un enlazador flexible entre el scFv y el Fab y que los constructos Fab-scFv se pueden usar en el constructo de fragmentos de anticuerpos multivalentes y/o anticuerpos multivalentes de tamaño completo.
El documento WO 2009/018386 A1 (Medimmune LLC) divulga constructos de anticuerpos multivalentes multiespecíficos (scFv-)VH-CH1-bisagra-CH2-CH3 (-scFV).
El documento WO 01/90192 A2 (ImClone Systems Incorporated) divulga constructos de 2-Fab de Bs (scFv)4-lgG y Bs(scFv).
El documento US 2009/215992 A1 (Wu et al.) divulga un anticuerpo tetravalente biespecífico de doble dominio variable (DVD), que comprende el siguiente constructo de cadena pesada: VH(B)-enlazador-VH(A)-CH1-bisagra-CH2 -CH3 y el constructo de la cadena ligera VL(B)-enlazador-VH(A) CL.
El documento US 2010/172862 A1 (Correia et al.) se refiere a la fabricación de una composición estable que comprende anticuerpos estándar.
Resumen de la divulgación
La presente divulgación en general proporciona proteínas que se unen al menos a dos epítopos (por ejemplo, proteínas que son, al menos, biespecíficas y se unen a un primer epítopo y un segundo epítopo). Sin embargo, nótese que la divulgación también proporciona proteínas que, aunque monoespecíficas, exhiben tetravalencia para unirse a un epítopo (por ejemplo, una primera y una segunda unidad de enlace que se unen al mismo epítopo). En un aspecto, la divulgación proporciona proteína A, que comprende:
un brazo Fab que se une a un primer epítopo,
un dominio de unión (BD) que se une a un segundo epítopo, y
una región Fc que comprende dominios CH2 y CH3;
en donde la proteína comprende una cadena pesada quimérica que comprende los siguientes dominios de polipéptidos, desde el extremo N al extremo C VH1-CH1-L1 -BD-L2-Fc-L2-BD-L1 -CH1-VH1;
en donde VH1 comprende el dominio variable de la cadena pesada del Fab, CH1 comprende el dominio constante de la cadena pesada 1 del Fab, L1 comprende el primer polipéptido conector, BD comprende un scFv, L2 comprende el segundo polipéptido conector y Fc comprende un CH2 y un dominio CH3 y en donde la proteína es bivalente para unirse a cada uno de los epítopos primero y segundo, y en donde el L1 comprende la secuencia de aminoácidos EPKSCDKT (SEQ ID NO: 4) o EPKSCGKT (SEQ ID NO: 6) o EPKSC (SEQ ID NO: 38) y/o en donde el L2 comprende la secuencia de aminoácidos EPKSVDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 12) o DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 40).
En un aspecto, L1 comprende además una porción enlazadora que comprende un péptido Gly-Ser y/o L2 comprende además una porción enlazadora que comprende un péptido Gly-Ser.
En un aspecto, la región Fc del peptoide se selecciona del grupo que consiste en una región Fc de una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE e IgD.
En un aspecto, la región Fc:
a) comprende una región Fc variante; o
b) está aglicosilado o desglicosilado; o
c) tiene fucosilación reducida o está afucosilado; o
d) comprende una región Fc variante y está aglicosilada o desglicosilada; o
e) comprende una región Fc variante y tiene fucosilación reducida o está afucosilada.
En aspecto, el primer y el segundo epítopos unidos por la proteína son diferentes. En otro aspecto, el primer y el segundo epítopos son iguales.
En un aspecto, el brazo Fab y/o la región Fc de la proteína comprenden además al menos una unidad de enlace, opcionalmente en donde:
a) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la cadena pesada quimérica;
b) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la cadena ligera; c) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la cadena pesada, y al menos una unidad de enlace está interconectada al extremo N-terminal y/o C-terminal de la luz cadena; d) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y C-terminal de la cadena pesada, y/o al menos una unidad de enlace está interconectada al extremo N-terminal y C-terminal de la cadena ligera; o e) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y C-terminal de la cadena pesada, y al menos una unidad de enlace está interconectada al extremo N-terminal y C-terminal de la cadena ligera;
En un aspecto, al menos una unidad de enlace está interconectada al brazo Fab y/o Fc a través de un conector de polipéptido.
En un aspecto, el dominio de unión se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un anticuerpo de dominio único, un diacuerpo de cadena sencilla, un mimético de anticuerpo y un dominio variable de anticuerpo.
En un aspecto, cada unidad de enlace de la proteína se selecciona del grupo que consiste en un dominio Fab, un scFv, un anticuerpo de dominio único, un diacuerpo de cadena única, un mimético de anticuerpo, un dominio variable de anticuerpo y un dominio de unión al receptor. En un aspecto particular, el dominio de unión de la proteína comprende un scFv, en donde el scFv opcionalmente comprende un dominio VH, un conector polipeptídico y un dominio VL.
En un aspecto, la proteína comprende
a) un dominio Fab interconectado a través del L1 a un N-terminal del dominio VH del scFv y/o la región Fe está interconectada a través del L2 a un C-terminal del dominio VL del scFv; o
b) un dominio Fab interconectado a través del L1 a un N-terminal del dominio VL del scFv y/o la región Fe está interconectada a través del L2 a un C-terminal del dominio VH del scFv.
En un aspecto, el dominio VL del scFv tiene una cisteína en la posición Kabat 100 y/o el dominio VH del scFv tiene una cisteína en la posición Kabat 44.
En aspecto, las unidades de unión de la proteína se unen cada una a diferentes epítopos o en donde dos o más unidades de unión se unen cada una a los mismos epítopos.
En un aspecto, la proteína comprende además al menos una unidad de enlace que no se une al primer epítopo y al segundo epítopo.
En un aspecto, la proteína se une a un primer epítopo que se selecciona del grupo que consiste en EGFR, IGFR1, VEGF, angiopoyetina-2 (Ang2), exopolisacárido (Ps1) y Pseudomonas aeruginosa (PcrV).
En un aspecto, se proporciona una composición que comprende la proteína descrita anteriormente formulada en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína descrita anteriormente.
En un aspecto, se proporciona una célula huésped que comprende un vector que comprende el ácido nucleico descrito anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
Con el fin de ilustrar la divulgación, en los dibujos se muestran ciertos aspectos de la divulgación. Sin embargo, la divulgación no se limita a los arreglos e instrumentos precisos de los aspectos representados en los dibujos.
La figura 1 es un diagrama esquemático de un polipéptido biespecífico representativo bivalente para unirse a cada epítopo. Esta representación de un polipéptido biespecífico bivalente para la unión a cada epítopo se denomina en el presente documento biMab (porciones de anticuerpos que comprenden proteínas biespecíficas y bivalentes). Como se muestra, este biMab tiene dos unidades de unión, cada una de las cuales se une a un epítopo diferente. Las unidades de unión están etiquetadas en el lado derecho de la figura, pero cada una de las unidades de unión también están presentes en el lado izquierdo de la figura (por ejemplo, la molécula es bivalente para unirse a cada epítopo; la molécula es bilateralmente simétrica con respecto a las unidades de unión y las regiones de enlace/bisagra superior e inferior). Los epítopos biMab pueden ser del mismo o diferente antígeno diana; cuando se une la misma diana, las unidades de unión biMab se unen a regiones no superpuestas (es decir, epítopos diferentes, preferiblemente no superpuestos).
Las Figuras 2A-2C proporcionan secuencias de ADN representativas y secuencias de proteínas de dominios de cadena pesada quiméricos de un biMab representativo.
La Figura 2D proporciona una alineación de las secuencias de proteínas de una región bisagra de tipo salvaje y varias variaciones representativas de L1 y L2. El panel superior muestra secuencias L1 representativas, los dominios Ch1 y BD están encuadrados, la cisteína que hace que el puente disulfuro intercadena con la cadena ligera y el residuo de aspartato donde puede producirse una escisión indeseable se indiquen con flechas. El panel inferior muestra secuencias L2 representativas, los dominios BD y Ch2 están encuadrados, la inserción de serina opcional (hecha para introducir un sitio de restricción XhoI para la clonación direccional) y el residuo de aspartato donde puede producirse una escisión indeseable se indican con flechas. La eliminación del asparte indicado (por ejemplo, el uso de conectores que carecen de este residuo o que tienen una sustitución de aminoácidos en esta posición) puede reducir la escisión indeseable dentro de los conectores L1 y L2.
La Figura 3 proporciona la secuencia de proteínas de dos biMab representativos. Nótese que la secuencia de aminoácidos real no se proporciona para las siguientes porciones de la molécula: DOMINIO PESADO VARIABLE I; scFv VH dominio II; scFv VL dominio II. Estas porciones de la molécula comprenderán la secuencia de aminoácidos para la unidad de enlace particular utilizada. Las dos regiones de enlace/bisagra están subrayadas con la porción de bisagra atornillada.
La Figura 4A muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas para la porción de bisagra de la bisagra/enlazador superior (también denominado L1) de un biMab representativo, así como una representación esquemática de ese biMab. La secuencia de esta porción de bisagra se representa en el lado derecho del esquema y es EPKSCDKT (SEQ ID NO: 4). La secuencia de la parte del enlazador de la bisagra/enlazador superior (L1) no se muestra en el esquema.
La Figura 4B muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas para la porción de bisagra modificada de la bisagra/enlazador superior (también denominado L1) de un biMab representativo, así como una representación esquemática de ese biMab. La secuencia de esta porción de bisagra se representa en el lado derecho del esquema y es EPKSCGKT (SEQ ID NO: 6). El residuo (G) en esta bisagra superior modificada, que se ha modificado a partir de la secuencia normal de la bisagra superior IgG1 (véase también la secuencia en la Figura 4A), se muestra subrayado, en negrita y cursiva. La secuencia de la parte del enlazador de la bisagra/enlazador superior (L1) no se muestra en el esquema.
La Figura 4C muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas para la porción de bisagra corta de la bisagra superior/conector (también denominado L1) de un biMab representativo, así como una representación esquemática de ese biMab. La secuencia de esta porción de bisagra se representa en el lado derecho del esquema y es EPKSC (SEQ ID NO: 38). Los tres residuos de aminoácidos C-terminales de la bisagra superior IgG1 humana no están presentes en esta bisagra superior corta, que se ha modificado a partir de la secuencia normal de la bisagra superior IgG1 (véase también la secuencia en la Figura 4A). La secuencia de la parte del enlazador de la bisagra/enlazador superior (L1) no se muestra en el esquema.
La Figura 5A muestra las secuencias de ADN y proteínas tanto para el conector como para las porciones de bisagra del conector/bisagra inferior (también denominado L2) de un biMab representativo, así como una representación esquemática de ese biMab. La porción de enlace es un conector de poliglicina-serina y la porción de bisagra es una bisagra modificada. La secuencia de este enlazador/bisagra inferior se muestra en el lado derecho del esquema. El residuo (V) en esta bisagra modificada, que se ha modificado a partir de la secuencia de bisagra IgG1 normal (véase también la alineación en la Figura 2D), se muestra subrayado, en negrita y cursiva.
La Figura 5B muestra las secuencias de ADN y proteínas tanto para el conector como para las porciones de bisagra del conector/bisagra inferior de un biMab representativo (también denominado L2), así como una representación esquemática de ese biMab. La porción de enlace es un conector de poliglicina-serina y la porción de bisagra es una bisagra acortada. La secuencia de este enlazador/bisagra inferior se muestra en el lado derecho del esquema. Esta bisagra es una parte de la secuencia normal de la bisagra IgG1 (ver también la alineación en la Figura 2D).
La Figura 5C muestra las secuencias de ADN y proteínas tanto para el conector como para las porciones de bisagra del conector/bisagra inferior de un biMab representativo (también denominado L2), así como una representación esquemática de ese biMab. La porción de enlace es un conector de poliglicina-serina y la porción de bisagra también es una bisagra modificada acortada. La secuencia de este enlazador/bisagra inferior se muestra en el lado derecho del esquema. Esta bisagra es una parte de la secuencia normal de la bisagra IgG1 (ver también la alineación en la Figura 2D).
Las Figuras 6A-D muestran la secuencia de ADN, la secuencia de proteínas de las cadenas ligeras y pesadas de un biMab anti-EGFR/IGF1 R representativo (biMab-EI), y una representación esquemática de este biMab.
Las Figuras 7A-D muestran la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas de cadenas ligeras y pesadas de un biMab anti-VEGF/Ang2 representativo (biMab-VA), y una representación esquemática de este biMab.
Las Figuras 8A-D muestran la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas de cadenas ligeras y pesadas de un biMab anti-PcrV/Psl representativo (Bs4-V2L2-2C), y una representación esquemática de este biMab.
La Figura 9 muestra los niveles de expresión transitoria, en mg/L, de biMab representativos (por ejemplo, biMab-EI y biMab-VA) después de 10 días de expresión transitoria en 293 células.
La Figura 10 muestra cromatogramas de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) para biMab representativos (por ejemplo, BiMab-EI y biMab-VA) después de la purificación de proteína A y diálisis en histidina-HCl 25 mM pH 6. El cromatograma para biMab-EI se proporciona a la izquierda y el cromatograma para biMab-VA se proporciona a la derecha. El contenido monomérico (%) después de la purificación de proteína A y el tiempo de retención (minutos) se muestran esquemáticamente en la figura.
La Figura 11A muestra el termograma obtenido usando calorimetría diferencial de barrido para biMab-EI y proporciona una comparación con los anticuerpos convencionales parentales. Las temperaturas de transición correspondientes a los dominios biMab se muestran y se han identificado superponiendo las transiciones de fusión para los anticuerpos convencionales parentales (anticuerpo anti-EGFR (PaniX) y el anticuerpo anti-IGFIR (Dalo)). La temperatura de los picos y el anticuerpo se indican para cada traza.
La Figura 11B muestra el termograma obtenido usando calorimetría diferencial de barrido para biMab-VA y proporciona una comparación con los anticuerpos convencionales parentales. Se muestran las temperaturas de transición correspondientes a los dominios biMab (líneas negras) y se han identificado superponiendo las transiciones de fusión para los anticuerpos convencionales parentales (anticuerpo anti-VEGF (Ava) y anticuerpo anti-Ang2 (LC06)). La temperatura de los picos y el anticuerpo se indican para cada traza.
La Figura 12A representa los resultados de un ELISA en donde se mide la unión de biMab-EI, el mAb anti-EGFR convencional parental (PaniX) o el mAb anti-IGFIR convencional parental (Dalo). Los resultados en el panel de la izquierda muestran la unión al EGFR inmovilizado. Los resultados en el panel de la derecha muestran la unión al IGF1R inmovilizado.
La Figura 12B representa los resultados de un ELISA en donde se mide la unión de biMab-VA, el mAb anti-VEGF convencional parental (Ava) o el mAb anti-Ang2 convencional parental (LC06). Los resultados en el panel de la izquierda muestran la unión al VEGF-165 inmovilizado. Los resultados en el panel de la derecha muestran la unión a Ang2 inmovilizado.
Las Figuras 13A-B muestran la unión concurrente de biMab-EI a sus dianas EGFR e IGF1R según se determina usando BIAcore. Para los experimentos representados, biMab-EI se inmovilizó y sus respectivos ligandos se pasaron. La unión concurrente se observa mediante el aumento de la respuesta de unión (RU). La unión concurrente se observa independientemente de la secuencia de inyección de las dianas.
Las Figuras 14A-D muestran la unión concurrente de biMab-VA a sus dianas VEGF y Ang2 según se determina usando BIAcore. La molécula inmovilizada fue biMab-VA (paneles A y B), Ang2 (panel C) y VEGF (Panel D). La unión concurrente se observa mediante el aumento de la respuesta de unión (RU). La unión concurrente se observa independientemente de la secuencia de inyección de las dianas e independientemente de qué reactivo se inmovilizó en la superficie del sensor BIAcore.
La Figura 15 proporciona valores de KD para la unión a FcRn humano por biMab-EI, biMab-VA y el mAb anti-EGFR convencional parental usado en el constructo de biMab-EI. Los valores de KD se determinaron usando la unión de equilibrio BIAcore.
La Figura 16 representa los resultados del análisis ELISA en donde se analiza la unión al C1q humano por cada uno de biMab-EI, biMab-VA, el mAb anti-EGFR o BSA convencional parental.
La Figura 17 proporciona los resultados de un ensayo de destrucción celular que mide la viabilidad celular en respuesta a: biMab-EI, el mAb anti-EGFR convencional parental, el mAb anti-IGR1R convencional parental, una mezcla de los dos anticuerpos parentales convencionales anti-EGFR y anti-EGFR IGFIR utilizados en el constructo de biMab-EI, y un anticuerpo de control de isotipo.
La Figura 18A-B muestra la inhibición de la fosforilación de pTie2 (receptor natural de Ang2) (Figura 18A) y la inhibición de la fosforilación de pVEGFR2 (receptor natural de VEGF) por biMab-VA. Los anticuerpos parentales y los anticuerpos de control negativo se incluyeron en estos conjuntos de experimentos.
La Figura 19 muestra que biMab-EI y biMab-VA pueden concentrarse sin una pérdida significativa de monómero.
La Figura 20 es una representación esquemática de dos formatos de anticuerpos biespecíficos convencionales referidos como Bs2, Bs3 en los que un scFv está fusionado con el extremo amino de la región variable (Bs2) o el terminal carboxi de CH3 (Bs3) de una cadena pesada a través de un enlazador (por ejemplo, (G4S)2). A modo de comparación, se muestra un biMab de ejemplo de la presente invención que tiene un scFv insertado en la región de bisagra, unido por un conector en el terminal N y el terminal C del scFv (véase también la Figura 8). Se muestran dos constructos diferentes de Bs2, para Bs2-V2L2-2C el scFv W4-RAD se fusiona con el extremo amino del V2L2 VH (véase, SEQ ID NOS: 51 y 53 para la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada respectivamente, y SEQ ID NOS: 50 y 52 para las secuencias de nucleótidos correspondientes), para Bs2-W4-RAD-2C el V2L2 scFv se fusiona con el extremo amino terminal de W4-RAD VH (consulte SEQ ID NOS: 55 y 57 para la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada, respectivamente, y SEQ ID NOS: 54 y 56 para las secuencias de nucleótidos correspondientes). Para Bs3-V2L2-2C, el scFv de W4-RAD se fusiona con el terminal carboxi de CH3 (consulte SEQ ID NOS: 59 y 61 para la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada, respectivamente y SEQ ID NOS: 58 y 60 para las secuencias de nucleótidos correspondientes). Para el BiMab Bs4-V2L2-2C, el scFv W4-RAD se inserta en la región de la bisagra (Ver Figura 8 y SEQ ID NOS: 42 y 45 para la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada, respectivamente).
La figura 21 muestra que BS2-V2L2, BS3-V2L2 y BS4-V2L2 impidieron la lisis de los glóbulos rojos similar al control parental (V2L2). R347 se usó como control negativo.
La Figura 22 muestra un ensayo de opsonofagocitosis con cepa luminiscente de serogrupo O5 de P. aeruginosa (PAO1.lux), con diluciones del anticuerpo parental W4-RAD purificado; los anticuerpos biespecíficos Psl/PcrV Bs2-V2L2-2C, Bs3-V2L2-2C, Bs4-V2L2-2C. Los anticuerpos Bs2-V2L2-2C y Bs4-V2L2-2C mostraron una muerte similar en comparación con el anticuerpo W4-RAD parental, la muerte del anticuerpo Bs3-V2L2-2C disminuyó. R347 se utilizó como control negativo en todos los experimentos.
La Figura 23A-D muestra el estudio de supervivencia in vivo de ratones tratados con diferentes anticuerpos biespecíficos anti-Psl/anti-PcrV en un sistema modelo de neumonía aguda 6206. En todos los estudios, los ratones de control sucumbieron a la infección aproximadamente 30 a 48 horas después de la infección. Los estudios A-D se muestran en los paneles A-D, respectivamente. (A) Todos los animales Bs3-V2L2 sobrevivieron, junto con los que recibieron el control V2L2. Aproximadamente el 90% de los animales inmunizados con W4-RAD sobrevivieron. En contraste, aproximadamente el 50% de los animales Bs2-V2L2 sucumbieron a la infección en 120 horas. (B): Bs4-V2L2-2C tuvo mayor actividad en comparación con Bs2-V2L2 a 1.0 y 0.5 mg/kg. (C): Bs4-V2L2-2C parece tener una mayor actividad en comparación con Bs2-V2L2 a 1.0 mg/kg. (D): Bs4-V2L2-2C tuvo mayor actividad en comparación con Bs3-V2L2 a 0.5 mg/kg.
La Figura 24 muestra el porcentaje de protección contra la neumonía letal en ratones tratados con los anticuerpos parentales Bs2, Bs3, BiMab, solos y en combinación. Los ratones fueron tratados con diferentes dosis de anticuerpos que van desde 0.2 mg/kg a 15 mg/kg. El porcentaje de supervivencia se indica en la tabla con el número de animales para cada comparación indicado entre paréntesis.
La Figura 25 ilustra un biMab que lleva modificaciones específicas del sitio para puntos de unión de drogas o toxinas. Las modificaciones se muestran en el dominio Ch2 Fc del biMab solo con fines ilustrativos. Las modificaciones se pueden introducir en cualquier dominio de biMab o se pueden introducir en múltiples dominios de biMab. El fármaco o la toxina se pueden conjugar con el biMab utilizando métodos de conjugación mediados por proteínas o químicos. Los sitios de escisión de proteasas específicos del sitio se pueden diseñar dentro o alrededor de los conectores que conectan el fármaco o la toxina activa con el biMab si se necesita la liberación del fármaco o la toxina. Las unidades de unión del biMab modificado para la conjugación del fármaco específica del sitio están marcadas con las letras A y B. Este biMab modificado para la conjugación del fármaco específico del sitio es bivalente biespecífico para cada diana. Es de destacar que las dianas biMab pueden ser diferentes o pueden ser los mismos. Cuando las dianas son las mismas, las unidades de unión de biMab pueden unirse a regiones no superpuestas (por ejemplo, biespecíficas, bivalentes) o pueden unirse al mismo epítopo (por ejemplo, monoespecíficas, tetravalentes).
La Figura 26 ilustra unidades de unión multiespecíficas que se pueden generar utilizando la estructura "núcleo" biMab como base. Como se ilustra esquemáticamente, la estructura "núcleo" de biMab está hecha de unidades de unión A y B (véase también la Figura 1). Usando la estructura "núcleo" A+B, se pueden unir otras unidades de unión en cada extremo terminal de los polipéptidos que forman el "núcleo" A+B, específicamente en las posiciones C, D, E y F. Por lo tanto, usando el biMab núcleo como estructura base, unidades de unión triespecíficas (A+B+C; A+B+D; A+B+E; A+B+F); unidades de unión tetraspecíficas (A+B+C+D; A+B+C+E; A+B+C+F; A+B+D+E; A+B+D+F; A+B+E+F); unidades de unión pentaspecíficas (A+B+C+D+E; A+B+C+D+F; A+B+D+E+F); y se pueden generar unidades de unión hexaspecíficas (A+B+C+D+E+F). Como se indica en la tabla, todas las proteínas de unión son bivalentes para cada epítopo. Las unidades de unión B, C, D, E y F pueden ser cualquier unidad estructural de unión, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos (tales como scFv en cualquier orientación de dominio posible y con cualquier longitud y composición de enlazador); dominios de anticuerpos individuales (como VH o VL); miméticos de anticuerpos, tales como estructuras de polipéptidos que imitan la estructura de unión de un anticuerpo; dominios de proteínas, tales como mediadores inmunológicos (por ejemplo, citoquinas); dominios de unión a ligando; y toxinas macromoleculares. Las unidades de unión B, C, D, E y F se pueden unir usando métodos genéticos o por métodos de conjugación in vitro mediados por químicos o proteínas. El enlazador que conecta las unidades B, C, D, E y F puede ser, entre otros, repeticiones (GGGGS). Los sitios de escisión de proteasas específicos del sitio se pueden diseñar dentro o alrededor de los enlazadores si se necesita la liberación de las unidades B, C, D, E y F (véase, por ejemplo, la Figura 29). Las diversas unidades de unión (A, B, C, D, E y F) pueden unir epítopos de los mismos o diferentes antígenos diana; cuando se une la misma diana, las unidades de unión se unen a regiones no superpuestas (es decir, epítopos diferentes, preferiblemente no superpuestos). Se entenderá en base a las enseñanzas de la presente memoria que la valencia de cualquiera de las proteínas de unión anteriores puede aumentarse mediante la incorporación de unidades de unión que se unen al mismo epítopo. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, la adición de la misma unidad de enlace en C y D dará como resultado una molécula de unión que es bivalente para los diferentes epítopos unidos por A y B y será tetravalente para el epítopo unido por la unión unidades en C y D (que se unen al mismo epítopo).
La Figura 27 ilustra varias unidades de unión multiespecíficas que pueden generarse uniendo unidades scFv adicionales a la estructura "núcleo" biMab (indicada por el cuadro discontinuo) como se describe en la Figura 26. Unidades de unión triespecíficas A B F (TriMab1); A+B+C (TriMab2); A+B+E (TriMab3); y A+B+D (TriMab4) se ilustran en los paneles A, B, C y D, respectivamente. Las unidades de unión tetraespecíficas (A+B+C+D (TetraMab1) y A+B+D+E (TetraMab2) se ilustran en los paneles E y F, respectivamente. Unidades de unión específicas de penta A+B+C+D+E (PentaMab1); A+B+C+D+F (PentaMab2); y A+B+D+E+F PentaMab3) se ilustran en los paneles G, H e I, respectivamente. La unidad de enlace hexaspecífica A+B+C+D+E+F se ilustra en el Panel J.
La Figura 28 es un diagrama esquemático de un "núcleo" biMab extendido representativo que tiene dos unidades de unión en tándem, 2a y 2b (representadas aquí como scFvs) insertadas en la región bisagra de una IgG humana. Esta figura es solo para fines ilustrativos y no pretende limitar el número o tipo de unidades de unión que pueden insertarse en la bisagra. Las unidades de unión insertadas en la bisagra pueden ser cualquier unidad estructural de unión, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos (tales como scFv en cualquier orientación de dominio posible y con cualquier longitud y composición de enlazador); dominios de anticuerpos individuales (como VH o VL); miméticos de anticuerpos, tales como estructuras de polipéptidos que imitan la estructura de unión de un anticuerpo; dominios de proteínas, tales como mediadores inmunológicos (por ejemplo, citoquinas); dominios de unión a ligando; y toxinas macromoleculares. Los enlazadores intramoleculares y/o intermoleculares que conectan las unidades de unión presentes en la bisagra pueden ser, entre otros, repeticiones (GGGGS). Los sitios de escisión de proteasas específicos del sitio se pueden diseñar dentro o alrededor de los enlazadores si se necesita la liberación de las unidades B, C, D, E y F (véase, por ejemplo, la Figura 29). Cuando la unidad de enlace es un scFv, pueden estar presentes en cualquier orientación dada y pueden comprender mutaciones para cambiar las propiedades quimicofísicas de los dominios scFv. Las diversas unidades de unión pueden unir epítopos del mismo o diferentes antígenos diana; cuando se une la misma diana, las unidades de unión se unen a regiones no superpuestas (es decir, epítopos diferentes, preferiblemente no superpuestos). Se entenderá en base a las enseñanzas de la presente memoria que la valencia de cualquiera de las proteínas de unión anteriores puede aumentarse mediante la incorporación de unidades de unión que se unen al mismo epítopo. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, la adición de la misma unidad de enlace en 2a y 2b dará como resultado una molécula de unión que es bivalente para los diferentes epítopos unidos por las unidades de unión 1 y las unidades de unión 2a/2b y será tetravalente para el epítopo unido por las unidades de unión en 2a y 2b (que se unen al mismo epítopo).
La Figura 29 es un diagrama esquemático de un "núcleo" biMab representativo en donde la unidad de enlace 2 es un scFv que tiene un conector de polipéptido que comprende dos sitios de escisión de proteasa. El panel izquierdo representa la estructura antes de la escisión de la proteasa. El panel derecho representa la estructura del tratamiento posterior a la proteasa, que da como resultado la eliminación del conector presente entre VH2 y VL2 del scFv. La proteína resultante es un homodímero con puente disulfuro, que comprende un total de seis cadenas de polipéptidos separadas.
Descripción detallada
Antes de continuar describiendo la presente divulgación con más detalle, debe entenderse que esta divulgación no se limita a composiciones específicas o etapas del proceso, ya que pueden variar. Debe notarse que, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tiene el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia al que se refiere esta invención. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta invención.
Se puede hacer referencia a los aminoácidos en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
La numeración de aminoácidos en el dominio variable, la región determinante de complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo sigue, a menos que se indique lo contrario, la definición de Kabat como se establece en Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más correspondientes a un acortamiento o inserción en un FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción de un solo aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo FR de cadena pesada 82. La numeración de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante la alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar". La alineación máxima de los residuos del marco frecuentemente requiere la inserción de residuos "espaciadores" en el sistema de numeración, para ser usados en la región Fv. Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier número de sitio de Kabat dado puede variar de cadena de anticuerpo a cadena de anticuerpo debido a la interespecies o divergencia alélica.
Como se usa en el presente documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos", también conocidos como inmunoglobulinas, abarcan anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos fragmentos de unión a epítopos diferentes (por ejemplo, anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, Publicación PCT WO2009018386, Solicitud PCT No. PCT/US2012/045229), biMab, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único, dominio anticuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpos que exhiben la actividad biológica deseada (por ejemplo, la porción de unión a antígeno), Fvs unidos a disulfuro (dsFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti­ Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos de la invención), intracuerpos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen al menos un sitio de unión a antígeno. Los anticuerpos también incluyen fusiones de péptidos con anticuerpos o porciones de los mismos, tales como una proteína fusionada a un dominio Fc. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), subisotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o alotipo (por ejemplo, Gm, por ejemplo, G1 m(f, z, a o x), G2m(n), G3m(g, b o c), Am, Em y Km(1, 2 o 3)). Los anticuerpos pueden derivarse de cualquier mamífero, incluidos, entre otros, humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc., u otros animales como aves (por ejemplo, pollos).
A. Nuevas proteínas de unión biespecíficas
La adición de múltiples sitios de unión a una sola molécula de unión puede mejorar en gran medida las capacidades (por ejemplo, terapéutica, diagnóstica, etc.) de la molécula. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico puede unirse a más de una región de la misma biomolécula diana, lo que confiere una mayor especificidad que un polipéptido uniespecífico que se une a un solo epítopo en una diana. Alternativamente, un anticuerpo biespecífico puede unirse a múltiples biomoléculas diana, como las dianas que están presentes en un complejo, o las dianas para las que se desea el secuestro y/o agrupamiento. En un tercer escenario, el mismo anticuerpo biespecífico puede realizar funciones distintas en cualquier momento dado, dependiendo de la localización y/o expresión de sus moléculas diana.
En este documento se describen proteínas de unión novedosas. Configuraciones de ejemplo de estas nuevas proteínas de unión se denominan "biMab". En el presente documento se proporcionan representaciones esquemáticas de biMab de ejemplo, así como ejemplos específicos de biMab particulares. Más generalmente, un biMab es un polipéptido que contiene dos unidades de unión, cada una de las cuales se une a un epítopo (por ejemplo, la unidad de enlace 1 se une a un primer epítopo y la unidad de enlace 2 se une a un segundo epítopo). El biMab básico es bivalente para unirse a cada uno de los dos epítopos (por ejemplo, el polipéptido comprende dos unidades de unión 1 y dos unidades de unión 2). Por lo tanto, cuando las unidades de unión 1 y 2 se unen a diferentes epítopos, el biMab tiene la especificidad múltiple de un anticuerpo biespecífico convencional y la bivalencia de una molécula de anticuerpo convencional. Cuando las unidades de unión 1 y 2 se unen al mismo epítopo, el biMab tiene monoespecificidad de un anticuerpo convencional, pero es tetravalente. Además de las unidades de unión, biMab también incluyen polipéptidos enlazadores y una porción Fc. La presente divulgación también proporciona proteínas de unión que se unen a más de dos epítopos mediante la adición de unidades de unión adicionales a la estructura biMab "central" para generar proteínas de unión triespecíficas, tetraspecíficas, pentaspecíficas y hexaspecíficas que son bivalentes para cada epítopo (ver Figuras de ejemplo 26, 27 y 28). La presente divulgación proporciona proteínas de unión, tales como biMab, y proteínas de unión que comprenden un núcleo biMab. Las proteínas de unión de la descripción comprenden unidades de unión, polipéptidos enlazadores y una porción Fc, como se describe en el presente documento. La divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican tales biMab y métodos para producir y usar tales biMab. biMab, las proteínas de unión que comprenden un núcleo biMab, y las diversas porciones de biMab se describen con mayor detalle en el presente documento.
Un biMab, como se describe en el presente documento, comprende dos pares de cadenas pesadas y ligeras, en donde las cadenas pesada y ligera comprenden cada una región variable (por ejemplo, VL y VH), que juntas forman una primera unidad de enlace, y en donde las cadenas pesadas además comprenden una segunda unidad de enlace (por ejemplo, un scFv). Donde la primera y la segunda unidad de enlace se unen a diferentes epítopos, cada par de cadena pesada es biespecífico y los dos pares juntos son bivalentes para cada epítopo. Cuando las unidades de unión primera y segunda se unen al mismo epítopo, cada par de cadena ligera pesada es monoespecífico y los dos pares juntos son tetravalentes para el epítopo. En algunos aspectos, los dos pares de cadenas pesadas y ligeras son idénticos. En algunos aspectos, los dos pares de cadenas pesadas y ligeras no son idénticos.
Los dominios de los biMab pueden basarse en dominios de inmunoglobulina. Las moléculas de inmunoglobulina como los anticuerpos monoclonales (mAbs) se usan ampliamente como agentes de diagnóstico y terapéuticos, y los métodos para diseñar los fragmentos de unión de mAbs son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales, como todas las moléculas de inmunoglobulina, están formados por subunidades peptídicas. Un mAb típico o convencional comprende dos subunidades de cadena pesada y dos subunidades de cadena ligera. Cada cadena pesada de mAb contiene un dominio variable (VH) que contribuye a la unión al antígeno, y un dominio constante (CH) compuesto por tres o cuatro subregiones (Ch1, Ch2, Ch3, Ch4). Cada cadena ligera de mAb contiene un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). Hay dos isotipos de dominios constantes de cadena ligera, kappa (k) y lambda (A), que se encuentran en mamíferos. Los enlaces disulfuro unen cada dominio Ch1 a un dominio CL y unen dominios Ch2 entre sí. Se encuentran cinco tipos de cadenas pesadas (a, 5, £, y y M) en diferentes clases de anticuerpos (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM). Las cadenas pesadas de mAb tienen regiones de bisagra que confieren flexibilidad estructural y movilidad. Los biMab de la descripción pueden tener una estructura general similar a un anticuerpo convencional, pero se distinguen por la presencia de una unidad de enlace adicional ubicada entre una primera porción de unión a antígeno y una porción Fc. Por lo tanto, a diferencia de los anticuerpos convencionales que son bivalentes para unirse a un solo epítopo, los biMab son bivalentes para unirse a dos epítopos. Sin embargo, como se describe en el presente documento, los biMab aún mantienen numerosas propiedades deseables de los anticuerpos convencionales, como la capacidad de unirse a FcRn y la capacidad de unirse a los receptores C1q y Fcy (por ejemplo, indicativo de la capacidad de mediar la citotoxicidad dependiente del anticuerpo y del complemento).
Los fragmentos de mAb que contienen solo porciones seleccionadas de una molécula de mAb, como Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, fragmentos de sdAb, también se han utilizado como agentes de diagnóstico o terapéuticos. Además, los residuos específicos en los dominios variables se han alterado para mejorar la especificidad de unión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Otros residuos que no participan directamente en la unión al antígeno se han reemplazado para "humanizar" regiones de anticuerpos no humanos y reducir la inmunogenicidad del mAb.
Aunque los biMab difieren de los anticuerpos convencionales, por ejemplo, son bivalentes para unirse a dos epítopos diferentes (o tetravalentes para unirse a un solo epítopo), muchas de las porciones de biMab se derivan o son análogas a porciones de anticuerpos convencionales. Cualquier dominio y/o fragmento de mAb conocido en la técnica puede usarse en los biMab descritos en este documento. En particular, el biMab puede comprender fragmentos Fab y/o scFvs, o variantes de los mismos. Ejemplos de variantes no limitantes de scFvs incluyen, pero sin limitación, di-scFvs en tándem, tri-scFvs en tándem, diacuerpos y cuerpos tri(a). Por lo tanto, en ciertos aspectos, la divulgación proporciona un polipéptido bivalente y multiespecífico que comprende un Fab que se une a un primer epítopo (unidad de enlace 1), un scFv o una variante de un scFv que se une a un segundo epítopo (unidad de enlace 2), un Fc que comprende al menos los dominios Ch2 y Ch3, un enlazador de polipéptidos que interconecta la unidad de enlace uno con la unidad de enlace dos (L1; bisagra superior/enlazador), y un enlazador de polipéptidos que interconecta la unidad de enlace 2 al Fc (L2; enlazador/bisagra inferior).
La divulgación se refiere en general a nuevas proteínas de unión de la divulgación, de las cuales los biMab son un ejemplo ilustrativo. Ejemplos adicionales son proteínas de unión que comprenden un núcleo de biMab, así como una o más unidades de unión adicionales (véase, por ejemplo, Figura 27 y 28) y/o proteínas de unión que comprenden un núcleo de biMab extendido (véase, por ejemplo, Figura 29). Debe entenderse que cada vez que se describen biMab o características de biMab en el presente documento, dicha descripción se aplica generalmente a las nuevas proteínas de unión de la descripción, independientemente de si dichas proteínas de unión incluyen dos unidades de unión o más de dos unidades de unión. Por consiguiente, el término biMab es un ejemplo de proteínas de unión de la descripción y, cuando el contexto lo permite, cualquier referencia a biMab también puede usarse para describir proteínas de unión que comprenden un núcleo de biMab.
La figura 1 muestra un diagrama esquemático de un biMab de ejemplo de la presente divulgación. Como se muestra en la Figura 1, un aspecto de un biMab de la descripción comprende dos pares idénticos de cadena pesada y ligera, en donde cada par de cadena pesada es biespecífico y los dos pares idénticos son juntos bivalentes para cada epítopo. Cada par de cadenas ligeras pesadas comprende un dominio Fab que se une a un primer epítopo (unidad de enlace 1), un dominio de unión (BD) que se une a un segundo epítopo (unidad de enlace 2; representado como un scFv en la Figura 1), y una región Fc. Más específicamente, el biMab comprende dos cadenas pesadas quiméricas, cada una de las cuales comprende una región variable de cadena pesada (VH1), una región constante de cadena pesada (CH1), un primer enlazador de polipéptidos (bisagra/enlazador superior marcado en la Figura 1; también denominado en este documento como L1), un dominio de unión (BD), un segundo enlazador de polipéptidos (enlazador marcado/bisagra inferior en la Figura 1; también denominado en el presente documento L2) y una región Fc que comprende un dominio Ch2 y un dominio Ch3. El biMab de la descripción también comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos convencionales, cada una de las cuales comprende una región variable de cadena ligera (VL1) y una región constante de cadena ligera (CL). El dominio de unión (unidad de enlace 2) del biMab particular ilustrado en la Figura 1 es un scFv. Sin embargo, el dominio de unión de un biMab según diversos aspectos de la presente divulgación puede ser cualquier dominio de unión conocido en la técnica.
La figura 1 proporciona una representación esquemática útil de un biMab, también denominado en el presente documento un "núcleo" biMab. Las Figuras 2 y 3 proporcionan una descripción adicional de la cadena pesada de un biMab representativo. Se hace referencia a la cadena de polipéptidos, como se muestra en la Figura 1, que comprende: un dominio VH1, un dominio CH1, una bisagra/enlazador superior (también denominado en este documento L1 o un primer enlazador de polipéptidos), unidad de enlace 2 (como VL2 y VH2 de un scFv), un conector/bisagra inferior (también denominado en este documento como L2 o un segundo conector de polipéptido) y Fc (como un dominio Ch2 y Ch3). Debido a que esta cadena pesada puede incluir regiones tradicionales de cadena ligera, se denomina en el presente documento una cadena pesada quimérica. Un biMab comprende dos de tales cadenas pesadas quiméricas, y estas pueden ser iguales o diferentes. Nótese que el dominio de cadena pesada variable (VH) para la unidad de enlace 1 se denomina VH1. En ciertos aspectos, esta es una cadena pesada variable de un Fab que se une a un primer epítopo. De manera similar, el dominio de cadena ligera variable (VL) para la unidad de enlace 1 se denomina VL1. En ciertos aspectos, esta es una cadena ligera variable de un Fab que se une a un primer epítopo. En contraste, los dominios para la unidad de enlace dos se denotan con el número "2", como VH2 y VL2 para aspectos en los que la unidad de enlace 2 es un scFv que se une a un segundo epítopo.
La Figura 2 proporciona información de secuencia de ADN y aminoácidos para varios dominios usados en cadenas pesadas quiméricas biMab de ejemplo. Las porciones de la cadena pesada quimérica se presentan en las Figuras 2A-2C. En la parte superior de la Figura 2A, la secuencia de ADN y proteína de la región VH1 se muestra esquemáticamente. Para cualquier biMab particular, esta secuencia real correspondería al VH1 de la unidad de enlace particular uno, como el VH1 para un Fab particular. La Figura 2A proporciona entonces la secuencia de ADN y proteína para un dominio Ch1 de ejemplo y la región bisagra IgG1 humana completa. Esto es seguido por secuencias de ADN y aminoácidos para varias opciones de ejemplo para el conector de polipéptido 1 (L1) que interconecta el Fab y el BD en un biMab. L1 puede comprender una porción de bisagra y una porción de enlazador (bisagra/enlazador superior), y esto se representa en la Figura 2A. La Figura 2A muestra primero un ejemplo de una porción de bisagra de L1 (denotada como bisagra superior, en este caso bisagra superior de Ig 1 humana). Nótese que la Figura 2A representa tres posibles aspectos de una porción de bisagra para L1, denotada como bisagra superior de IgG1 humana o bisagra superior de IgG1 humana modificada. Estas porciones de bisagra difieren en que la porción de bisagra modificada contiene una sustitución de D a G inmediatamente después de la cisteína o carece de los residuos después de la cisteína. La Figura 2A luego representa la parte del enlazador de L1, aquí, un enlazador G4S. La porción de bisagra superior y la porción de unión juntas forman L1. Sin embargo, en ciertos aspectos, L1 incluye solo una porción de enlace o solo una porción de bisagra.
La Figura 2B representa esquemáticamente la secuencia de ADN y proteína de la unidad de enlace 2, aquí un scFv, que puede estar en orientación VH2-enlazador-VL2 o VL2-enlazador-VH2. Para cualquier biMab particular, esta secuencia correspondería, por ejemplo, a las secuencias VH2 y VL2 para la unidad de enlace particular 2, así como al enlazador apropiado para estos dominios VH2 y VL2. Se apreciará que las porciones de bisagra y enlace de L1 pueden repetirse, de modo que, por ejemplo, L1 comprende dos porciones de bisagra y dos porciones de enlace.
La secuencia de ADN y aminoácidos para un segundo conector de polipéptido de ejemplo (L2; también denominado conector/bisagra inferior) se representa en las Figuras 2A y 2B. La parte de enlace de L2 se proporciona en la parte inferior de la Figura 2B. Como se muestra, esta parte del enlazador es un enlazador G4S. La porción de bisagra de un L2 se representa en la parte inferior de la Figura 2B (nótese que esta porción de bisagra se representa como bisagra inferior o variante de bisagra). La Figura 2B proporciona tres aspectos para una porción de bisagra de L2, variante de bisagra de IgG1 humana y bisagra inferior de IgG1 humana. Una porción de bisagra inferior y una porción de enlace forman juntas L2 (también denominado enlace/bisagra inferior). Sin embargo, en ciertos aspectos, L2 incluye solo una porción de enlace o solo una porción de bisagra.
La Figura 2C proporciona la secuencia de ADN y aminoácidos para los dominios Fc Ch2 y Ch3. Los dominios Ch2 y Ch3 representados en la Figura 2B son de un IgG1, aunque podría generarse fácilmente un biMab usando el Fc de cualquier clase de Ig, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluidos IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Se apreciará que las porciones de bisagra y enlace de L2 pueden repetirse, de modo que, por ejemplo, L2 comprende dos porciones de bisagra y dos porciones de enlace.
Finalmente, la Figura 2D proporciona una alineación de las secuencias de proteínas de una región bisagra de tipo salvaje y varias variaciones representativas de L1 y L2. Se indica el aspartato donde puede ocurrir un evento de escisión indeseable. En ciertos aspectos, este aspartato no está presente en L1 y/o L2. En ciertos aspectos, el aspartato se reemplaza con otro residuo de aminoácido (por ejemplo, una glicina). En otros aspectos, el residuo de aspartato se elimina. También se representa una variación de L2 que comprende una inserción de aminoácidos (por ejemplo, serina). Esta inserción de aminoácidos se realizó para introducir un sitio de restricción (por ejemplo, XhoI) en la secuencia de ADN que codifica el conector. Se establece que los sitios de restricción deseados pueden incorporarse en cualquier conector presente en una proteína de unión de la invención, en particular para facilitar la clonación de dominios de unión.
La Figura 3 proporciona otra representación de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada quimérica para una representación esquemática de ejemplo de un biMab. Por supuesto, debe entenderse que la secuencia específica para el VH1 (dominio de cadena pesada variable 1 de la unidad de enlace 1) y la secuencia específica para el dominio de unión 2 (representada como un svFc en la orientación VH2-enlazador-VL2) no se proporcionan. Estas secuencias dependerán de las unidades de unión particulares que forman un biMab particular. Sin embargo, la posición relativa de las porciones de biMab entre sí se mantiene (por ejemplo, el formato biMab es el mismo, aunque las unidades de unión particulares varían).
En la Figura 3, L1 y L2 están subrayados y en cursiva, y las porciones de bisagra de L1 y L2 están en negrita. En el panel superior, la porción de bisagra de L1 corresponde a la bisagra superior de IgG1 humana, mientras que en el panel inferior la porción de bisagra de L1 corresponde a la bisagra superior de IgG1 humana modificada. En el panel superior, la porción de bisagra de L2 corresponde a la variante de bisagra inferior de IgG1 humana, mientras que en el panel inferior la porción de bisagra de L2 corresponde a la bisagra inferior de IgG1 humana. En cualquier caso, L1 interconecta la unidad de enlace 1 a la unidad de enlace 2, por ejemplo, interconectando el VH1 de la unidad de enlace 1 al VH2 de la unidad de enlace 2. L2 interconecta la unidad de enlace 2 a Fc, por ejemplo, interconectando el VL2 de enlace unidad 2 al dominio Ch2 de un Fc.
Se proporcionan representaciones esquemáticas adicionales de biMab representativos en las Figuras 4 y 5. Estas figuras representan la posición relativa en la molécula de las porciones de bisagra de L1 y L2. Por ejemplo, en las Figuras 4A-4C, se representa la posición relativa de la porción de bisagra de L1. L1 puede incluir además una porción de enlace, cuya secuencia no se muestra en la Figura 4A, 4B o 4C. Se proporcionan ejemplos de L1 que comprende además una porción de enlace en SEQ ID NO: 62, 63 y 64). Sin embargo, nótese que, cuando está presente, la porción de bisagra de L1 está interconectada directamente a la unidad de enlace 1 (por ejemplo, es contigua a una porción de la unidad de enlace 1) y la porción de enlace está interconectada directamente a la unidad de enlace 2 (por ejemplo, es contigua a una porción de la unidad de enlace 2). Debido a esta configuración, L1 también se conoce bisagra/enlazador superior. A modo de ejemplo adicional, las Figuras 5A-5C representan la posición relativa de la porción de bisagra de L2. L2 puede incluir además una porción de enlace, cuya secuencia no se muestra en la Figura 5A, 5B o 5C. Sin embargo, nótese que, cuando está presente, la porción de bisagra de L2 está interconectada directamente al dominio Fc (por ejemplo, es contigua a una porción de un dominio Fc) y la porción enlazadora está interconectada directamente a la unidad de enlace 2 (por ejemplo, está contigua a una porción de la unidad de enlace 2). Debido a esta configuración, L2 también se conoce como enlazador/bisagra inferior.
Después de haber descrito el formato global de biMab, también denominado en el presente documento el "núcleo" de biMab. Las diversas porciones y propiedades funcionales de ejemplo de biMab de la descripción se describen con mayor detalle a continuación. La divulgación contempla biMab que comprenden combinaciones de cualquiera de los aspectos, tales como aspectos que describen porciones de una molécula o características funcionales de una molécula, descritas anteriormente o a continuación.
1. Unidades vinculantes
Los biMab de la descripción comprenden al menos dos unidades de unión (unidad de enlace 1 y unidad de enlace 2). En ciertos aspectos, cada unidad de enlace se une a un epítopo diferente, ya sea epítopos diferentes ubicados en la misma molécula diana o epítopos en dianas diferentes. Debido a que cada unidad de enlace de un biMab está presente como un par (hay dos unidades de unión 1s y dos unidades de unión 2s) los biMab exhiben unión bivalente a cada epítopo. A partir de las enseñanzas de este documento, se entenderá que cuando cada unidad de enlace se une al mismo epítopo, un biMab exhibirá unión tetravalente al epítopo.
En ciertos aspectos, la primera unidad de enlace es un fragmento Fab, por ejemplo, un fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal convencional o un fragmento de unión a antígeno producido recombinantemente que comprende una cadena ligera variable (VL1), una cadena ligera constante (CL1), una cadena pesada variable (VH1) y una porción constante de cadena pesada (CH1). Opcionalmente, las cadenas ligeras y pesadas del Fab pueden interconectarse a través de uno o más enlaces disulfuro. El Fab se une a un primer epítopo.
En ciertos aspectos, el Fab se deriva o se basa en la secuencia de un anticuerpo monoclonal convencional, tal como un anticuerpo murino, humanizado o humano convencional. En ciertos aspectos, biMab que contiene el Fab derivado o basado en la secuencia de un anticuerpo monoclonal convencional retiene una o más actividades funcionales del anticuerpo convencional (por ejemplo, retiene al menos 80% o más (80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100%) de una actividad funcional). Por ejemplo, en ciertos aspectos, el biMab que contiene dicho Fab retiene una o más de la afinidad por el antígeno, la actividad inhibidora o la actividad de destrucción celular del anticuerpo convencional.
En ciertos aspectos, el Fab se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En ciertos aspectos, el Fab se une a IGFR1. En ciertos aspectos, el Fab se une a VEGF. En ciertos aspectos, el Fab se une a Ang2. En ciertos aspectos, el Fab se deriva o se basa en la secuencia de un anticuerpo monoclonal convencional que se une a cualquiera de EGFR, IGFR1, VEGF, Ang2, Psl o PcrV. Ejemplos de anticuerpos monoclonales convencionales incluyen panitumumab, dalotuzumab, bevacizumab, LC06, W4-RAD o V2L2. Por ejemplo, en ciertos aspectos, un biMab de la divulgación comprende un Fab como unidad de enlace uno, y este Fab comprende 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 CDR de panitumumab, dalotuzumab, bevacizumab o LC06.
En ciertos aspectos, el Fab comprende una porción de cadena ligera (VL1 y CL) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 20, 29 y 42. En ciertos aspectos, el Fab comprende una porción de cadena pesada (VH1 y Ch1) que comprende la secuencia de aminoácidos subrayada en las Figuras 6C, 7C u 8C como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 32 y 45. En ciertos aspectos, el Fab comprende una porción de cadena ligera variable (VL1) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 21 y una porción de cadena pesada variable (VH1) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 24. En ciertos aspectos, el Fab comprende una porción de cadena ligera variable (VL1) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 30 y una porción de cadena pesada variable (VH1) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 33. En ciertos aspectos, el Fab comprende una porción de cadena ligera variable (VL1) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 y una cadena pesada variable porción (VH1) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 46. En ciertos aspectos, el Fab está codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica la porción de la cadena ligera (VL1 y CL) y una secuencia de nucleótidos que codifica la porción de la cadena pesada ( VH1 y CH1), por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO: 19, 28, 41 y una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de ácido nucleico subrayada en las Figuras 6A, 7A u 8A como se establece en SEQ ID NO: 22, 29 o 44.
En ciertos aspectos, los biMab de la descripción comprenden la unidad de enlace 2 y la unidad de enlace dos comprende un dominio de unión que se une a un segundo epítopo. Los dominios de unión de acuerdo con la presente divulgación (también denominados "BD") incluyen, por ejemplo, regiones variables de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, scFv, diacuerpos de cadena única u otros dominios de unión conocidos en la técnica. Los dominios de unión también incluyen diacuerpos de cadena sencilla biespecíficos, o diacuerpos de cadena sencilla diseñados para unir dos epítopos distintos. También se incluyen moléculas similares a anticuerpos o miméticos de anticuerpos, por ejemplo, pero no se limitan a minicuerpos, maxicuerpos, oligómeros de dominio "A" (también conocidos como Avímeros) (Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nos. 2005/0164301, 2005/0048512 y 2004/017576), andamios de proteínas basados en Fn3 (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2003/0170753), repeticiones de Ankrin (también conocidas como DARpins), polipéptidos VASP, polipéptido pancreático aviar (aPP), tetranectina (basada en CTLD3), Affililin (basado en YB-cristalina/ubiquitina), Knottinas, dominios SH3, dominios PDZ, Tendamistat, Neocarzinostatin, dominios de proteína A, lipocalinas, transferrina y dominios Kunitz que se unen específicamente a epítopos. En un aspecto, los dominios de unión a epítopos útiles en el constructo de dominios de unión a epítopos multiespecíficos de la descripción se ejemplifican en los documentos WO 2009/058379 y WO 2011/130324.
Además, en ciertos aspectos, el BD comprende un dominio de unión a ligando de un receptor o un dominio de unión a receptor de un ligando. Por ejemplo, el BD comprende una porción de FGF que se une a FGFR, una porción de EGF que se une a EGFR, una porción de PDGF que se une a PDGFR. Alternativamente, el BD puede comprender una porción de FGFR que se une a FGF, una porción de EGFR que se une a EGF, una porción de PDGFR que se une a PDGF. Los dominios de unión respectivos de numerosos pares ligando/receptor son bien conocidos en la técnica y, por lo tanto, se pueden seleccionar y adaptar fácilmente para su uso en el formato biMab.
En ciertos aspectos, el dominio de unión es un scFv. Así, en ciertos aspectos, la unidad de enlace 2 comprende un scFv. Debe entenderse que un scFv abarca una cadena de polipéptidos que comprende un dominio de cadena pesada variable (VH) unido a un dominio de cadena ligera variable (VL) a través de un conector de polipéptido flexible. La Figura 1 muestra un esquema de un biMab de ejemplo, en donde el BD (aquí, representado como unidad de enlace 2) es un scFv y los dominios se designan como VL2 y VH2. En algunos aspectos, el conector polipeptídico entre VH2 y VL2 comprende un sitio de escisión de proteasa. La Figura 29 muestra un esquema de un "núcleo" biMab representativo antes y después de la escisión de la proteasa del conector de polipéptido de un dominio de unión a scFv.
Los dominios VH y VL del scFv pueden derivarse del mismo o de diferentes anticuerpos. En algunos aspectos, un VH o VL del scFv puede comprender una o más CDR que se unen a una diana de interés, mientras que la unidad estructural del dominio VH o VL se deriva de un anticuerpo diferente o es sintético. En algunos aspectos, el scFv comprende al menos una CDR de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo conocido en la técnica para unirse a una diana de interés. En algunos aspectos, el scFv comprende al menos dos CDR de un anticuerpo dado. En algunos aspectos, el scFv comprende al menos tres CDR de un anticuerpo dado. En algunos aspectos, el scFv comprende al menos cuatro CDR de un anticuerpo dado. En algunos aspectos, el scFv comprende al menos cinco CDR de un anticuerpo dado. En algunos aspectos, el scFv comprende al menos seis CDR de un anticuerpo dado.
Se pueden usar varias metodologías solas o en combinación para mejorar la estabilidad de un biMab que comprende una molécula scFv. Una metodología potencial que se puede usar, sola o en combinación con una o más de las otras metodologías descritas en el presente documento, es diseñar la longitud y/o composición del conector que conecta los dominios scFv para estabilizar la porción scFv.
Otra metodología potencial que puede usarse, sola o en combinación con una o más de las otras metodologías descritas en este documento, es mediante la introducción de al menos dos sustituciones de aminoácidos (también denominadas modificaciones o mutaciones) en el VH y/o dominios VL del scFv para promover la formación de enlaces disulfuro (véase, por ejemplo, Brinkmann et al., 1993, PNAS, 90: 7538-42; Zhu et al., 1997, Prot. Sci. 6: 781-8; Reiter et al., 1994, Biochem. 33: 5451-9; Reiter et al., 1996, Nature 14: 1239-45; Luo et al., 1995, J. Biochem. 118: 825-31; Young et al., 1995, FEBS Let. 377: 135-9; Glockshuber et al., 1990, Biochem. 29: 1362-7).
En ciertos aspectos, se introduce una mutación en cada uno de los dominios VH y VL del scFv para promover la formación de enlaces disulfuro entre cadenas entre los dominios VH y VL tras la expresión de un biMab que comprende un scFv. En otro aspecto, las dos mutaciones se introducen en el mismo dominio de la cadena. En cierto aspecto, las dos mutaciones se introducen en diferentes cadenas. En ciertos aspectos, se introducen múltiples pares de dos mutaciones para promover la formación de múltiples enlaces disulfuro. En ciertos aspectos, se introduce una cisteína para promover la formación de enlaces disulfuro. Ejemplos de aminoácidos que pueden mutar a cisteína incluyen los aminoácidos 43, 44, 45, 46, 47, 103, 104, 105 y 106 de VH2 y los aminoácidos 42, 43, 44, 45, 46, 98, 99, 100 y 101 de VL2. La numeración anterior se basa en la numeración de Kabat que identifica la posición relativa solo al VH2 y VL2 del scFv (y no relativo a la posición del aminoácido en la secuencia de longitud completa del biMab o SEQ ID NOS: proporcionado aquí). Las combinaciones de ejemplo de posiciones de aminoácidos que pueden mutar a residuos de cisteína incluyen: VH44-VL100, VH105-VL43, VH105-VL42, VH44-VL101, VH106-VL43, VH104-VL43, VH44-VL99, VH45-VL98, VH46-VL98, VH103-VL43, VH103-VL44 y VH103-VL45. En algunos aspectos, el aminoácido 44 de VH y el aminoácido 100 de VL están mutados a cisteínas.
Una metodología potencial adicional que puede usarse, sola o en combinación con una o más de las otras metodologías descritas en el presente documento, es seleccionar el orden de los dominios de scFv. En ciertos aspectos, la orientación del dominio VH con respecto al dominio VL está optimizada para la estabilidad. En ciertos aspectos, el scFv está en la orientación VH-enlazador-VL. En ciertos aspectos, el scFv está en la orientación VL-enlazador-VH. La orientación de los dominios en el scFv también determina cómo se interconecta el scFv con la porción Fab y la porción Fc del biMab. Esto se describe con más detalle a continuación en el contexto de los enlazadores de polipéptidos. En resumen sin embargo, dado que el BD, por ejemplo, un scFV, está interconectado al Fab por un enlazador de polipéptidos (L1) e interconectado al Fc por un enlazador de polipéptidos (L2), el orden de dominios determina qué porción del scFv está interconectado a L1 y qué porción de scFv está interconectada a L2.
Una metodología adicional que puede usarse, sola o en combinación con una o más de las metodologías descritas en el presente documento, es mediante la introducción de una o más mutaciones estabilizadoras mediante la mutación de uno o más residuos superficiales del scFv. En algunos aspectos, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis residuos están mutados en uno o ambos dominios VH y/o VL del scFv. En ciertos aspectos, los cambios se realizan solo en el dominio VH del scFv. En ciertos aspectos, los cambios se realizan solo en el dominio VL del scFv. En ciertos aspectos, se realizan cambios en los dominios VH y VL del scFv. Se puede hacer el mismo número de cambios en cada dominio o se puede hacer un número diferente de cambios en cada dominio. En ciertos aspectos, uno o más de los cambios es una sustitución conservadora de aminoácidos del residuo presente en el scFv original no modificado. En otros aspectos, uno o más de los cambios es una sustitución de aminoácidos no conservadora del residuo presente en el scFv original no modificado. Cuando se realizan sustituciones múltiples, en uno o en ambos dominios VH o VL del scFv, cada sustitución es independientemente una sustitución conservadora o no conservadora. En ciertos aspectos, todas las sustituciones son sustituciones conservadoras. En ciertos aspectos, todas las sustituciones no son conservadoras. En ciertos aspectos, al menos una de las sustituciones es conservadora. En ciertos aspectos, al menos una o las sustituciones no son conservadoras.
Sin embargo, una metodología adicional que puede usarse, sola o en combinación con una o más de las metodologías adicionales descritas en este documento, es mediante la introducción de una o más sustituciones mediante la mutación de uno o más residuos presentes en el dominio VH y/o VL de scFv para que coincida con el residuo más frecuente en dicha posición particular de una secuencia consenso del dominio VH y/o VL de anticuerpos conocidos. En ciertos aspectos, las sustituciones se introducen en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis posiciones en uno o ambos del dominio VH y/o el dominio VL del scFv. Se puede hacer el mismo número de cambios en cada dominio o se puede hacer un número diferente de cambios en cada dominio. En ciertos aspectos, uno o más de los cambios en la secuencia coinciden con los de un consenso dado es una sustitución conservadora de aminoácidos del residuo presente en la secuencia VH y/o VL no modificada. En otros aspectos, uno o más de los cambios representan una sustitución de aminoácidos no conservadora del residuo presente en la secuencia VH y/o VL no modificada. Cuando se realizan sustituciones múltiples, ya sea en uno o ambos del dominio VH o VL del scFv, cada sustitución es independientemente una sustitución conservadora o no conservadora. En ciertos aspectos, todas las sustituciones son sustituciones conservadoras. En ciertos aspectos, todas las sustituciones son sustituciones no conservadoras. En ciertos aspectos, al menos una de las sustituciones es conservadora. En ciertos aspectos, al menos una o las sustituciones no son conservadoras.
Debe observarse que cualquiera de las modificaciones descritas como útiles para modificar o estabilizar la porción scFv se puede aplicar para modificar la porción Fab. Por ejemplo, los dominios variables de la porción Fab de un biMab pueden modificarse para mejorar la estabilidad y la unión al antígeno. Además, la porción Fab o scFv se puede modificar para reducir la inmunogenicidad.
En ciertos aspectos, la unidad de enlace 2 (el BD) es un scFv, por ejemplo, un scFv derivado de un anticuerpo monoclonal convencional que comprende una cadena ligera variable (VL2) y una cadena pesada variable (VH2) interconectadas por un conector flexible, como un conector de glicina-serina. Opcionalmente, las cadenas ligeras y pesadas variables del scFv pueden interconectarse adicionalmente a través de uno o más enlaces disulfuro, y como se describió anteriormente, pueden incluir una o más mutaciones o variaciones. El scFv se une a un segundo epítopo. En ciertos aspectos, el segundo epítopo es diferente del primer epítopo unido por la unidad de enlace 1. En otros aspectos, el segundo epítopo es el mismo que el primer epítopo unido por la unidad de enlace 1. En ciertos aspectos, el scFv se deriva o se basa en la secuencia de un anticuerpo monoclonal convencional, tal como un anticuerpo murino, humanizado o humano convencional. En ciertos aspectos, biMab que contiene el scFv derivado de o basado en la secuencia de un anticuerpo monoclonal convencional retiene una o más actividades funcionales del anticuerpo convencional (por ejemplo, retiene al menos 80% o más (80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100%) de una actividad funcional). Por ejemplo, en ciertos aspectos, el biMab que contiene tal scFv retiene una o más de la afinidad por el antígeno, la actividad inhibidora o la actividad de destrucción celular del anticuerpo convencional.
En ciertos aspectos, el scFv se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En ciertos aspectos, el scFv se une a IGFR1. En ciertos aspectos, el scFv se une a VEGF. En ciertos aspectos, el scFv se une a Ang2. En ciertos aspectos, el scFv se deriva o se basa en la secuencia de un anticuerpo monoclonal convencional que se une a cualquiera de EGFR, IGFR1, VEGF, Ang2, Psl o PcrV. Ejemplos de anticuerpos monoclonales convencionales incluyen panitumumab, dalotuzumab, bevacizumab o LC06. Por ejemplo, en ciertos aspectos, un biMab de la descripción comprende un scFv como unidad de enlace dos, y este scFv comprende 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 CDR de panitumumab, dalotuzumab, bevacizumab o LC06.
En ciertos aspectos, el scFv comprende una porción de cadena ligera variable (VL2) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 26, 35 y 48. En ciertos aspectos, el scFv comprende una porción de cadena pesada variable (VH2) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 27, 36, 49. En ciertos aspectos, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ iD NO: 25, 34 y 47. Ver Figuras 6B, 6C, 7b , 7C, 8B y 8C.
La divulgación contempla que, en ciertos aspectos, un biMab de la divulgación comprende cualquiera de las unidades de unión 1 y la unidad de enlace 2 descritas en el presente documento, incluida cualquier combinación de una unidad de enlace 1 y una unidad de enlace 2 descrita en el presente documento. Por ejemplo, en ciertos aspectos, la divulgación proporciona un polipéptido que comprende un Fab que se une a una diana particular (por ejemplo, que se une a un epítopo en una diana particular), tal como un Fab que comprende una secuencia de aminoácidos particular o codificado por un particular secuencia de nucleótidos y/o un scFv que se une a una diana particular (por ejemplo, que se une a un epítopo en una diana particular), como un scFv que comprende una secuencia de aminoácidos particular o codificada por una secuencia de nucleótidos particular.
Como se describe en detalle anteriormente, la unidad de enlace 1 y la unidad de enlace 2 están interconectadas a través del polipéptido conector 1 (L1; también denominado articulación/articulación superior). En general, el enlace es a través de la cadena pesada quimérica del biMab, de modo que la interconexión es a través del dominio Ch1 de la cadena pesada de la unidad de enlace 1 (VH1, como VH1 de un Fab) y una porción de la unidad de enlace 2 (por ejemplo, si la unidad de enlace 2 es un scFv, la interconexión es a través del VH2 o VL2 del scFv). L1 puede variar en longitud y secuencia, y en este documento se describen configuraciones de ejemplo de L1. La divulgación contempla biMab que comprenden cualquier combinación de unidades de unión y polipéptidos enlazadores, incluida cualquier combinación de las unidades de unión específicas que se unen a la(s) diana(s) deseada(s) y los enlazadores de polipéptidos L1 y L2 específicos descritos en este documento.
2. Región Fc
Como se usa en el presente documento, "región Fc" abarca dominios derivados de la región constante de una inmunoglobulina, preferiblemente una inmunoglobulina humana, que incluye un fragmento, análogo, variante, mutante o derivado de la región constante. Las inmunoglobulinas adecuadas incluyen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y otras clases tales como IgA, IgD, IgE e IgM. La región Fc puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc alterada. La región Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio Ch2 y un dominio Ch3, y opcionalmente comprende un dominio Ch4. Los biMab de la divulgación incluyen una región Fc que comprende un dominio Ch2 y un dominio Ch3. En ciertos aspectos, un biMab de la descripción incluye un dominio Fc de la misma clase que las porciones de bisagra de uno o ambos de L1 o L2.
a. Regiones Fc alteradas
Las regiones Fc alteradas (también denominadas en el presente documento "regiones Fc variantes") pueden usarse para alterar la función efectora y/o la vida media de un biMab de la descripción. Se pueden hacer una o más alteraciones en la región Fc para cambiar las propiedades funcionales y/o farmacocinéticas de las moléculas. Dichas alteraciones pueden dar como resultado una disminución o aumento de la unión a C1q y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o de la unión a FcyR, para IgG, y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), o la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP). La presente divulgación abarca biMab en los que se han realizado cambios para ajustar la función efectora, ya sea mejorando o disminuyendo la función o proporcionando una función efectora deseada. En consecuencia, en un aspecto de la divulgación, los biMab comprenden una región Fc variante (es decir, regiones Fc que se han alterado como se discute a continuación). Los biMab que comprenden una región Fc variante también se denominan aquí "biMab variantes Fc". Como se usa en el presente documento, "nativo" se refiere a la secuencia parental no modificada y el biMab que comprende una región Fc nativa se denomina en el presente documento "biomab de Fc nativo". La variante de Fc biMab puede generarse mediante numerosos métodos bien conocidos por un experto en la materia. Ejemplos no limitantes incluyen aislar regiones codificantes de anticuerpos (por ejemplo, de hibridoma) y realizar una o más sustituciones deseadas en la región Fc. Alternativamente, la porción de unión a antígeno (por ejemplo, regiones variables) de un biMab puede subclonarse en un vector que codifica una región Fc variante. En un aspecto, la región Fc variante exhibe un nivel similar de función efectora inductora en comparación con la región Fc nativa. En otro aspecto, la región Fc variante exhibe una mayor inducción de la función efectora en comparación con la Fc nativa. En otro aspecto, la región Fc variante exhibe una menor inducción de la función efectora en comparación con la Fc nativa. Algunos aspectos específicos de las regiones Fc variantes se detallan a continuación. Los métodos para medir la función efectora son bien conocidos en la técnica.
En general, la función efectora se modifica a través de cambios en la región Fc, que incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de aminoácidos, adiciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos y cambios en las modificaciones postraducción a los aminoácidos Fc (por ejemplo, glicosilación). Los métodos descritos a continuación se pueden usar para ajustar la función efectora de un biMab de la descripción, una relación de las propiedades de unión de la región Fc para el FcR (por ejemplo, afinidad y especificidad), dando como resultado un biMab con las propiedades deseadas.
Se entiende que la región Fc como se usa en el presente documento incluye los polipéptidos que comprenden la región constante de una molécula de anticuerpo, excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante. Por lo tanto, Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG, y los últimos tres dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, y, opcionalmente, todo o una parte de la bisagra flexible N-terminal a estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y opcionalmente una porción de la bisagra inferior entre Cgamma1 (Cy1) y Cgamma2 (Cy2). Aunque los límites de la región Fc pueden variar, como se usa en el presente documento, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana comprende los residuos A231 en su terminal carboxilo, en donde la numeración está de acuerdo con el índice de la UE establecido en Kabat. Fc puede referirse a esta región de forma aislada, o esta región en el contexto de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fc. Se han observado polimorfismos en varias posiciones Fc diferentes, incluidas, entre otras, las posiciones 270, 272, 312, 315, 356 y 358 de IgG 1 numeradas por el índice de la UE y, por lo tanto, ligeras diferencias entre la secuencia presentada y las secuencias en la técnica anterior puede existir.
En un aspecto, la presente divulgación abarca biMab variantes de Fc que tienen propiedades de unión alteradas para un ligando de Fc (por ejemplo, un receptor de Fc, C1q) en relación con un biMab de Fc nativo. Ejemplos de propiedades de unión incluyen, pero no se limitan a, especificidad de unión, constante de disociación de equilibrio (Kd), tasas de disociación y asociación (kinactiva y kactiva respectivamente), afinidad y/o avidez de unión. En la técnica se sabe que la constante de disociación de equilibrio (Kd) se define como kinactiva/kactiva. En ciertos aspectos, un biMab que comprende una región variante Fc con un Kd bajo puede ser más deseable que un biMab con un Kd alto. Sin embargo, en algunos casos, el valor de kactiva o kinactiva puede ser más relevante que el valor de Kd. Un experto en la materia puede determinar qué parámetro cinético es más importante para una aplicación dada. Por ejemplo, una modificación que reduzca la unión a uno o más reguladores positivos (por ejemplo, FcyRIIIA) y/o una unión mejorada a un receptor inhibidor de Fc (por ejemplo, FcyRIIB) sería adecuada para reducir la actividad de ADCC. En consecuencia, la proporción de afinidades de unión (por ejemplo, la proporción de constantes de disociación de equilibrio (Kd)) para diferentes receptores puede indicar si la actividad ADCC de una variante de Fc biMab de la descripción se mejora o disminuye. Además, una modificación que reduce la unión a C1q sería adecuada para reducir o eliminar la actividad de los CDC.
En un aspecto, los biMab variantes de Fc exhiben una afinidad de unión alterada por uno o más receptores de Fc que incluyen, pero no se limitan a FcRn, FcyRI (CD64) incluyendo isoformas FcyRIA, FcyRIB y FcyRIC; FcyRII (CD32 incluyendo isoformas FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIC); y FcyRIII (CD16, incluidas las isoformas FcyRIIIA y FcyRIIIB) en comparación con un Fc biMab nativo.
En ciertos aspectos, una variante de Fc biMab ha aumentado la afinidad por un ligando de Fc. En otros aspectos, una variante de Fc biMab ha disminuido la afinidad por un ligando de Fc en relación con un Fc biMab nativo.
En un aspecto específico, una variante de Fc biMab ha mejorado la unión al receptor de Fc FcyRIIIA. En otro aspecto específico, una variante de Fc biMab ha mejorado la unión al receptor de Fc FcyRIIB. En un aspecto específico adicional, una variante de Fc biMab ha mejorado la unión a los receptores de Fc FcyRIIIA y FcyRIIB. En ciertos aspectos, los biMab variantes de Fc que tienen una unión mejorada a FcyRIIIA no tienen un aumento concomitante en la unión del receptor de FcyRIIB en comparación con un FM biMab nativo. En un aspecto específico, una variante de Fc biMab ha reducido la unión al receptor de Fc FcyRIIIA. En otro aspecto específico, una variante de Fc biMab ha reducido la unión al receptor de Fc FcyRIIB. En otro aspecto específico, y la variante Fc biMab ha mejorado la unión al receptor Fc FcRn. En otro aspecto específico más, una variante de Fc biMab que exhibe afinidad alterada por FcyRIIIA y/o FcyRIIB ha mejorado la unión al receptor de Fc FcRn. En otro aspecto específico más, una variante de Fc biMab que exhibe afinidad alterada por FcyRIIIA y/o FcyRIIB ha alterado la unión a C1q con respecto a un Fc biMab nativo.
En otro aspecto, los biMab variantes de Fc exhiben afinidades aumentadas o disminuidas a C1q con respecto a un biMab de Fc nativo. En otro aspecto específico más, una variante de Fc biMab que exhibe afinidad alterada por C1q ha mejorado la unión al receptor de Fc FcRn. En otro aspecto específico más, una variante de Fc biMab que muestra afinidad alterada por C1q ha alterado la unión a FcyRIIIA y/o FcyRIIB en relación con un Fc biMab nativo.
Es bien sabido en la técnica que los anticuerpos son capaces de dirigir el ataque y la destrucción del antígeno dirigido a través de múltiples procesos conocidos colectivamente en la técnica como funciones efectoras de anticuerpos. Uno de estos procesos, conocido como "citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en donde la lg secretada se une a los receptores gamma Fc (FcyR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, Natural Killer (NK) (células, neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente maten a la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos IgG específicos de alta afinidad dirigidos a la superficie de las células diana "arman" las células citotóxicas y son necesarios para tal destrucción. La lisis de la célula diana es extracelular, requiere contacto directo de célula a célula y no implica complemento. Otro proceso abarcado por el término función efectora es la citotoxicidad dependiente del complemento (en adelante denominada "CDC") que se refiere a un evento bioquímico de destrucción de células diana mediada por anticuerpos por el sistema del complemento. El sistema del complemento es un sistema complejo de proteínas que se encuentra en el plasma sanguíneo normal que se combina con anticuerpos para destruir bacterias patógenas y otras células extrañas. Aún otro proceso abarcado por el término función efectora es la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) que se refiere a una reacción mediada por células en donde las células citotóxicas inespecíficas que expresan uno o más ligandos efectores reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan fagocitosis de la célula diana.
Se contempla que los biMab variantes de Fc se caractericen por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de células efectoras mediadas por FcyR. En ciertos aspectos, los biMab variantes de Fc tienen propiedades de unión y funciones celulares efectoras similares en modelos in vivo (como los descritos y divulgados aquí) que los de ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente divulgación no excluye los biMab variantes de Fc que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos basados en in vitro pero exhiben el fenotipo deseado in vivo.
La vida media en suero de proteínas que comprenden regiones Fc puede aumentarse aumentando la afinidad de unión de la región Fc por FcRn. El término "semivida de anticuerpos" como se usa en el presente documento significa una propiedad farmacocinética de un anticuerpo que es una medida del tiempo de supervivencia medio de las moléculas de anticuerpo después de su administración. La vida media de los anticuerpos se puede expresar como el tiempo requerido para eliminar el 50 por ciento de una cantidad conocida de inmunoglobulina del cuerpo del paciente (u otro mamífero) o un compartimento específico del mismo, por ejemplo, medido en suero, es decir, la vida media circulante, o en otros tejidos. La vida media puede variar de una inmunoglobulina o clase de inmunoglobulina a otra. En general, un aumento en la vida media de anticuerpos (o biMab) da como resultado un aumento en el tiempo medio de residencia (MRT) en circulación para el biMab administrado.
El aumento de la vida media permite la reducción de la cantidad de fármaco administrada a un paciente, así como la reducción de la frecuencia de administración. Para aumentar la vida media en suero de un biMab, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el biMab (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,739,277, por ejemplo. Como se usa en el presente documento, el término "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG 1, lgG2, lgG3 o lgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG. Alternativamente, se pueden generar biMab de la descripción con semividas aumentadas modificando los residuos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el receptor Fc y el receptor FcRn (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,821,505 y 7,083,784; y el documento WO 09/058492). Además, la vida media de biMab de la descripción puede aumentarse mediante conjugación con PEG o albúmina mediante técnicas ampliamente utilizadas en la técnica.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona variantes de Fc, en donde la región Fc comprende una modificación (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 221,225, 228, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,243, 244, 245, 247, 250, 251, 252, 254, 255, 256, 257, 262, 263, 264, 265, 266 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 308, 313, 316, 318, 320, 322, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421,428, 433, 434, 435, 436, 440 y 443 numerados por el índice de la UE como se establece en Kabat. Opcionalmente, la región Fc puede comprender una modificación en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas por un experto en la materia (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 7,083,784; 7,317,091; 7,217,797; 7,276,585; 7,355,008; 2002/0147311; 2004/0002587; 2005/0215768; 2007/0135620; 2007/0224188; 2008/0089892; WO 94/29351; y WO 99/58572). Las posiciones de aminoácidos adicionales útiles y las sustituciones específicas se ejemplifican en las Tablas 2 y 6-10 de los documentos
US 6,737,056; las tablas presentadas en la Figura 41 del documento US 2006/024298; las tablas presentadas en las Figuras 5, 12 y 15 de US 2006/235208; las tablas presentadas en las Figuras 8, 9 y 10 del documento US 2006/0173170 y las tablas presentadas en las Figuras 8-10, 13 y 14 del documento WO 09/058492.
En un aspecto específico, la presente divulgación proporciona una variante Fc, en donde la región Fc comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 221K, 221Y, 225E, 225K, 225W, 228P, 234d , 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235E, 235F, 236E, 237L, 237M, 237P, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L, 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 250E, 250Q, 251F, 252L, 252Y, 254S, 254T, 255L, 256E, 256F, 256M, 257C, 257M, 257N, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265A, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267T, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 296G, 297S, 297D, 297E, 298A 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 308F, 313F,
1G, 331A, 1T, 332D, 4A, 334E,
Figure imgf000017_0001
8F, 433K,
Opcionalmente, la región Fc puede comprender sustituciones de aminoácidos adicionales y/o alternativas conocidas por un experto en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, las ejemplificadas en las Tablas 2 y 6-10 de los documentos US 6,737,056; las tablas presentadas en la Figura 41 del documento US 2006/024298; las tablas presentadas en las Figuras 5, 12 y 15 de US 2006/235208; las tablas presentadas en las Figuras 8, 9 y 10 del documento US 2006/0173170 y las tablas presentadas en las Figuras 8, 9 y 10 del documento WO 09/058492.
En un aspecto específico, la presente divulgación proporciona una variante Fc biMab, en donde la región Fc comprende al menos una modificación (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos) en una o más posiciones seleccionadas del grupo consistente en 228, 234, 235 y 331 numerados por el índice de la UE como se establece en Kabat. La posición 228 está subrayada en SEQ ID NO: 10 en la Figura 2A y las posiciones 234, 235 y 331 están subrayadas en SED ID NO: 16 en la Figura 2C. En un aspecto, la modificación es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 228P, 234F, 235E, 235F, 235Y y 331S numerados por el índice de la UE como se establece en Kabat.
En otro aspecto específico, la presente divulgación proporciona una variante Fc biMab, en donde la región Fc es una región Fc de IgG4 y comprende al menos una modificación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 228 y 235 numeradas por el Índice de la UE según lo establecido en Kabat. En otro aspecto específico más, la región Fc es una región Fc de IgG4 y los aminoácidos no naturales se seleccionan del grupo que consiste en 228P, 235E y 235Y numerados por el índice de la UE como se establece en Kabat.
En otro aspecto específico, la presente divulgación proporciona una variante Fc biMab, en donde la región Fc comprende al menos un aminoácido no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en
239, 330 y 332 numeradas por el índice de la UE tal como se establece en Kabat. Las posiciones 239, 330 y 332 se muestran en negrita y se duplican subrayadas en SEQ ID NO: 16 en la Figura 2C. En un aspecto, la modificación es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 239D, 330L, 330Y y 332E numerados por el índice de la UE como se establece en Kabat. Véase, Patente de los Estados Unidos número 7,317,091.
En un aspecto específico, la presente divulgación proporciona una variante Fc biMab, en donde la región Fc comprende al menos un aminoácido no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en
252, 254 y 256 numeradas por el índice de la UE como se establece en Kabat. Las posiciones 252, 254, 256 se muestran más grandes y onduladas subrayadas en SEQ ID NO: 16 en la Figura 2C. En un aspecto, la modificación es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E numerados por el índice de la
UE como se establece en Kabat. Véase, Patente de los Estados Unidos Número 7,083,784.
En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona una variante de Fc biMab, en donde la región Fc comprende un aminoácido no natural en la posición 428 numerada por el índice de la UE tal como se establece en Kabat. En un aspecto, la modificación en la posición 428 se selecciona del grupo que consiste en 428T, 428L, 428F y 428S numerados por el índice de la UE como se establece en Kabat. Véase, Patente de los Estados Unidos número 7,670,600. En otro aspecto, una variante de Fc biMab puede comprender además un aminoácido de origen no natural en la posición 434 numerada por el índice de la UE tal como se establece en Kabat. En un aspecto, la modificación en la posición 434 se selecciona del grupo que consiste en 434A, 434S y 434F numerados por el índice de la UE como se establece en Kabat. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona una variante de Fc biMab, en donde la región Fc comprende un aminoácido que no se produce naturalmente en las posiciones 428 y 434 numeradas por el índice de la UE tal como se establece en Kabat. En un aspecto específico, la región Fc comprende 428L, 434S. Véase, Patente de los Estados Unidos No 8,088,376. Las posiciones 428 y 434 están en negrita y subrayadas en SEQ ID NO: 18 en la Figura 2C.
En ciertos aspectos, las funciones efectoras provocadas por los anticuerpos IgG dependen en gran medida de la unidad estructural carbohidrato ligada a la región Fc de la proteína (Claudia Ferrara et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering 93: 851 -861). Por lo tanto, la glicosilación de la región Fc puede modificarse para aumentar o disminuir la función efectora (véase, por ejemplo, Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473; Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,602,684; 6,946,292; 7,064,191; 7,214,775; 7,393,683; 7,425,446; 7,504,256; Publicación de los Estados Unidos Nos. 2003/0157108; 2003/0003097; 2009/0010921; tecnología POTELLIGENT™ (Biowa, Inc. Princeton, NJ); tecnología de ingeniería de glicosilación GLYCOMAB™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza)). Por consiguiente, en un aspecto, las regiones Fc de biMab de la descripción comprenden glucosilación alterada de residuos de aminoácidos. En otro aspecto, la glucosilación alterada de los residuos de aminoácidos da como resultado una función efectora reducida. En otro aspecto, la glucosilación alterada de los residuos de aminoácidos da como resultado una función efectora incrementada. En un aspecto específico, la región Fc ha reducido la fucosilación. En otro aspecto, la región Fc está afucosilada (véanse, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2005/0226867). En un aspecto, estos biMab con función efectora aumentada, específicamente ADCC, se generan en células huésped (por ejemplo, células CHO, Lemna minor) diseñadas para producir polipéptidos altamente defucosilados con ADCC más de 100 veces mayor en comparación con el polipéptido producido por las células parentales (Mori et al., 2004, Biotechnol Bioeng 88: 901-908; Cox et al., 2006, Nat Biotechnol., 24: 1591 -7).
La adición de ácido siálico a los oligosacáridos en las moléculas de IgG puede mejorar su actividad antiinflamatoria y alterar su citotoxicidad (Keneko et al., Science, 2006, 313: 670-673; Scallon et al., Mol. Immuno. 2007 marzo; 44(7): 1524-34). Los estudios a los que se hace referencia anteriormente demuestran que las moléculas de IgG con mayor sialilación tienen propiedades antiinflamatorias, mientras que las moléculas de IgG con sialilación reducida tienen mayores propiedades inmunoestimuladoras (por ejemplo, aumentan la actividad de ADCC). Por lo tanto, un biMab puede modificarse con un perfil de sialilación apropiado para una aplicación particular (Publicación de los Estados Unidos No. 2009/0004179 y Publicación Internacional No. WO 2007/005786).
En un aspecto, las regiones Fc de biMab de la descripción comprenden un perfil de sialilación alterado en comparación con la región Fc nativa. En un aspecto, las regiones Fc de biMab de la descripción comprenden un perfil de sialilación incrementado en comparación con la región Fc nativa. En otro aspecto, las regiones Fc de biMab de la descripción comprenden un perfil de sialilación disminuido en comparación con la región Fc nativa.
En un aspecto, las variantes de Fc de la presente divulgación pueden combinarse con otras variantes de Fc conocidas, tales como las descritas en Ghetie et al., 1997, Nat Biotech. 15: 637-40; Duncan et al., 1988, Nature 332: 563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147: 2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29: 53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57: 1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92: 11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett. 44: 111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9: 115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54: 101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157: 4963-4969; Armor et al., 1999, Eur J Immunol 29: 2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164: 4178-4184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164: 1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200: 16-26; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166: 2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276: 6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82: 57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30: 487-490); Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165.745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 7,122,637; 7,183,387; 7,332,581; 7,335,742; 7,371,826; 6,821,505; 6,180,377; 7,317,091; 7,355.008; Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0002587; y Publicación de Patente Internacional WO 99/58572. Otras modificaciones y/o sustituciones y/o adiciones y/o eliminaciones del dominio Fc serán fácilmente evidentes para un experto en la materia.
Es notable que los polipéptidos presentados en el formato biMab que comprende un Fc nativo retienen la capacidad de unirse a FcRn y C1q y mediar ADCC, como se muestra en los ejemplos. Por lo tanto, en ciertos aspectos, un biMab conserva la capacidad de unirse a FcRn y/o C1q y/o uno o más receptores de Fcgamma (FcyRs). Por ejemplo, en ciertos aspectos, un biMab retiene al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la capacidad de unión FcRn y/o C1q y/o uno o más FcyR, en comparación con un anticuerpo convencional que se une a uno de los epítopos a los que se une el biMab. En ciertos aspectos, se genera un biMab a partir de los dominios de unión de uno o dos anticuerpos convencionales, y la comparación de la actividad se realiza con uno o ambos de esos anticuerpos convencionales.
Las regiones Fc alteradas también pueden usarse para generar heterodímeros de cadena pesada, dando como resultado biMab que comprenden dos pares diferentes de cadena pesada-ligera. Para facilitar la formación de heterodímeros, la interfaz entre un par de regiones Fc está diseñada para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. En ciertos aspectos, la interfaz comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, se genera una "protuberancia" al reemplazar una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) se crean en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, como los homodímeros. Las modificaciones de CH3 incluyen, por ejemplo, Y407V/T366S/L368A en una cadena pesada y T366W en la otra cadena pesada; S354C/T366W en una cadena pesada y Y349C/Y407V/T366S/L368A en la otra cadena pesada. Las modificaciones adicionales que resultan en una protuberancia en una cadena y una cavidad en la otra se describen en los documentos U.S. 7,183,076; y Merchant et al., 1998, Nat. Biotech 16: 677-681. Otras modificaciones que se pueden usar para generar heterodímeros incluyen, pero no se limitan a, las que alteran la polaridad de carga a través de la interfaz del dímero Fc de manera que la coexpresión de regiones Fc electrostáticamente emparejadas da como resultado heterodimerización. Las modificaciones que alteran la polaridad de la carga incluyen, entre otras, las presentadas en la Tabla 1 a continuación (véase también WO 2007/147901; Gunasekaran et al., 2010, JBC 285: 19637-46). Además, Davis et al. (2010, Prot. Eng. Design & Selection 23: 195-202) describen una plataforma Fc heterodimérica que utiliza regiones CH3 de dominio modificado por ingeniería genética (SEED) que son derivados de dominios humanos IgG e IgA CH3 (véase también WO 2007/110205)
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3. Glicosilación
Además de la capacidad de la glicosilación para alterar la función efectora de los polipéptidos, la glicosilación modificada en la región variable puede alterar la afinidad del anticuerpo (o biMab) por un antígeno diana. En un aspecto, se modifica el patrón de glicosilación en la región variable de los biMab presentes. Por ejemplo, se puede hacer un biMab aglicosilado (es decir, el biMab carece de glicosilación). La glicosilación puede alterarse, por ejemplo, para aumentar la afinidad del biMab por un antígeno diana. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia biMab. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación marco de la región variable para eliminar de ese modo la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede aumentar la afinidad del biMab por el antígeno. Tal enfoque se describe con más detalle en las Patentes estadounidenses Nos 5,714,350 y 6,350,861. También se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de un sitio de glicosilación presente en la región Fc (por ejemplo, Asparagine 297 de IgG). Además, los biMab aglicosilados pueden producirse en células bacterianas que carecen de la maquinaria de glicosilación necesaria.
4. Enlazadores de polipéptidos
Los enlazadores pueden usarse para unir dominios/regiones de la cadena pesada quimérica biMab en una molécula contigua. Como se describió anteriormente, un biMab incluye al menos dos polipéptidos enlazadores, L1 y L2. Además, un biMab puede incluir enlazadores adicionales, como un enlazador flexible que interconecta las cadenas pesadas y ligeras variables de un scFv. Además, un biMab puede incluir enlazadores adicionales, como un enlazador flexible que interconecta las cadenas pesadas y ligeras variables de un scFv y otros enlazadores que conectan otras unidades de unión a la estructura del núcleo biMab. En las Figuras 26-28 se representan ejemplos de unidades de unión adicionales conectadas a la estructura del núcleo biMab.
Un ejemplo representativo, no limitativo, de un enlazador es una cadena de polipéptidos que comprende al menos 4 residuos. Las porciones de dichos enlazadores pueden ser flexibles, hidrófilas y tener poca o ninguna estructura secundaria propia (porciones de enlazador o porciones de enlazador flexible). Los enlazadores de al menos 4 aminoácidos pueden usarse para unir dominios y/o regiones que se colocan cerca uno del otro después de que la molécula se haya ensamblado. También se pueden usar enlazadores más largos. Por lo tanto, los enlazadores pueden ser aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, residuos. Los enlazadores también pueden ser, por ejemplo, de aproximadamente 100-175 residuos. Cuando se usan múltiples enlazadores para interconectar porciones de la molécula, los enlazadores pueden ser iguales o diferentes (por ejemplo, la misma o diferente longitud y/o secuencia de aminoácidos).
Los enlazadores pueden ser enlazadores escindibles, que contienen al menos un enlace que puede escindirse selectivamente por un reactivo de escisión. Los enlazadores escindibles pueden usarse para facilitar la eliminación de toda o una parte de la secuencia del enlazador. Los enlazadores pueden diseñarse para contener sitios de escisión de proteasa, de modo que la escisión se produzca en el medio del enlazador o en al menos un extremo del enlazador. Por ejemplo, los sitios de trombina pueden diseñarse en cada uno de los dos extremos flanqueantes de un conector. Dependiendo del tipo de enlazador utilizado, la escisión también puede estar mediada por agentes como TCEP, TFA y DTT. Los enlazadores pueden diseñarse de modo que los reactivos de escisión eliminen todos los residuos del ligador del producto de escisión. Otros enlazadores no limitantes de ejemplo incluyen enlazadores de profármacos cuyos enlaces pueden escindirse selectivamente en condiciones in vivo, por ejemplo, en presencia de enzimas endógenas u otros factores endógenos, o simplemente en fluidos acuosos presentes en el cuerpo o en células del cuerpo. Cuando los biMab contienen más de un enlazador de polipéptidos, cada uno de los enlazadores puede ser diferente, o al menos uno de los enlazadores puede ser diferente de los demás. En algunos aspectos, un biMab comprende un enlazador escindible. En un aspecto específico, el biMab comprende un scFv, en donde el scFv comprende un conector escindible entre VH2 y VL2.
Los enlazadores facilitan la formación de la estructura deseada. Los enlazadores pueden comprender (Gly-Ser)n residuos, con algunos residuos de Glu o Lys dispersados por todas partes para aumentar la solubilidad. Alternativamente, o adicionalmente, los enlazadores pueden no comprender residuos de serina, tales enlazadores pueden ser preferibles cuando el enlazador está sujeto a la glicosilación ligada a O. En algunos aspectos, los enlazadores pueden contener residuos de cisteína, por ejemplo, si se usa la dimerización de enlazadores para llevar los dominios del biMab a su configuración plegada adecuadamente. En algunos aspectos, el biMab comprende al menos dos enlazadores de polipéptidos que unen dominios del polipéptido. En otros aspectos, el biMab comprende al menos tres enlazadores de polipéptidos. En otros aspectos, el biMab comprende cuatro o más enlazadores de polipéptidos.
En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende 1-50 residuos, 1-25 residuos, 25-50 residuos o 30-50 residuos. En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende una porción de una unidad estructural Fc. Por ejemplo, en algunos aspectos, el conector de polipéptido puede comprender una porción del dominio de bisagra de inmunoglobulina de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4. En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende una porción de un dominio bisagra de inmunoglobulina mutada de una IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4. En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende al menos 5, 7, 8 o 15 unidades estructurales de aminoácidos de una región/dominio de bisagra de inmunoglobulina de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4. En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende al menos 5, 7, 8 o 15 unidades estructurales de aminoácidos de una región/dominio de bisagra de inmunoglobulina modificada de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4.
El conector de polipéptido puede comprender todo, o una porción de una región bisagra que comprende naturalmente tres cisteínas. En ciertos aspectos, la región de bisagra seleccionada se trunca o se altera o sustituye de otro modo con respecto a la región de bisagra completa y/o natural de tal manera que solo quedan uno o dos de los residuos de cisteína. De manera similar, en ciertos otros aspectos, el conector de polipéptido puede comprender una porción mutada o alterada de otra manera de una región de bisagra en la cual el número de residuos de cisteína se reduce por sustitución o eliminación de aminoácidos, por ejemplo, una región de bisagra mutada o alterada que contiene cero, uno o dos residuos de cisteína como se describe en el presente documento.
Un dominio de bisagra mutado o alterado de otro modo puede derivarse o construirse a partir de (o usar) un dominio de bisagra de inmunoglobulina de tipo salvaje que contiene uno o más residuos de cisteína. En ciertos aspectos, una porción mutada o alterada de otra manera de una región bisagra puede contener cero o solo un residuo de cisteína, en donde la región bisagra mutada o alterada de otro modo es o ha sido derivada de una región bisagra de inmunoglobulina de tipo salvaje que contiene, respectivamente, uno o más o dos o más residuos de cisteína. En la porción mutada o alterada de otra manera de una región bisagra, los residuos de cisteína de la región bisagra de inmunoglobulina de tipo salvaje se eliminan o sustituyen preferiblemente con aminoácidos que son incapaces de formar un enlace disulfuro. En algunos aspectos, una parte mutada o alterada de una región bisagra se deriva o se ha derivado de una región bisagra de tipo salvaje de IgG humana, que puede incluir cualquiera de las cuatro subclases de isotipos de IgG humana, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende una porción de una región bisagra que comprende el residuo de cisteína que forma un enlace disulfuro con una cadena ligera de inmunoglobulina (residuo de la UE 220). En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende una porción alterada de una región bisagra que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo C220 de la UE. En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende la sustitución de aminoácidos C220V.
En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende una sustitución de aminoácidos que previene la autoescisión espontánea relacionada con la articulación. En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende una sustitución de aminoácidos en la posición en la posición D221 de la UE. En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende la sustitución de aminoácidos D221G. En algunos aspectos, el conector de polipéptido carece del aminoácido D221.
En algunos aspectos, el conector de polipéptido comprende o consiste en un conector de gly-ser. Como se usa en el presente documento, el término "conector de gly-ser" se refiere a un péptido que consiste en residuos de glicina y serina. Un enlazador gly-ser de ejemplo comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula (Gly4Ser)n, en donde n es un número entero positivo (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10). Un conector de gly-ser preferido es (Gly4Ser)2 y (Gly4Ser)4. Otro ejemplo de enlazador gly-ser es (Gly4Ser)3. En otros aspectos, dos o más enlazadores de gly-ser se incorporan en serie en un enlazador de polipéptidos. En algunos aspectos, el conector polipeptídico comprende al menos una porción de una región bisagra (por ejemplo, derivada de una molécula IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) y una serie de residuos de aminoácidos de gly-ser (por ejemplo, un conector de gly-ser como (Gly4Ser)n).
En ciertos aspectos, L1 y/o L2 incluyen tanto una porción de bisagra como una porción de enlace, tal como una porción de enlace que comprende un conector gly-ser. En otros aspectos, L1 y/o L2 incluyen solo una porción de bisagra o solo una porción enlazadora, tal como un enlazador gly-ser. En otros aspectos, L1 y L2 incluyen una porción de enlace de gly-ser. En ciertos aspectos, la porción de enlace de gly-ser de L1 y L2 tiene la misma longitud, mientras que, en otros aspectos, la porción de enlazador de gly-ser de L1 y L2 tiene diferentes longitudes. Cuando un biMab comprende un scFv, las cadenas pesadas y ligeras del scFv pueden estar conectadas por un conector flexible. Este enlazador flexible generalmente no incluye una porción de bisagra, sino que es un enlazador gly-ser u otro enlazador flexible. La longitud y la secuencia de aminoácidos de un enlazador flexible que interconecta dominios de un scFv se puede seleccionar y optimizar fácilmente.
En algunos aspectos, el enlazador de polipéptidos (particularmente L1 y/o L2) comprende un gly-ser o todos los enlazadores de glicol y una porción o porción modificada de un dominio de bisagra. En algunos aspectos, el conector de polipéptido (L1) que conecta el dominio Fab con el dominio de unión (BD; unidad de enlace 2) del biMab comprende la secuencia de aminoácidos EPKSCDKTGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 63) o EPKSCGKTGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 64) o EPKSCGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 65). En algunos aspectos, el conector de polipéptido (L2) que conecta el dominio de unión y el dominio de unión al dominio Fc del biMab comprende la secuencia de aminoácidos GGGGSGGGGSEPKSVDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 67) o GGGGSGGGGSCPPCP (SEQ ID NO: 69) o GGGGSGTPGGSDK ID NOS: 71).
Independientemente del conector de polipéptido utilizado para interconectar la unidad de enlace 1 a la unidad de enlace 2 y la unidad de enlace 2 a Fc (por ejemplo, L1 y L2), el biMab puede comprender opcionalmente conectores de polipéptido adicionales. Las longitudes y la secuencia de dichos enlazadores de polipéptidos adicionales se seleccionan independientemente. Por ejemplo, el biMab puede comprender además un conector de polipéptido flexible que interconecta las cadenas pesadas y ligeras variables de un scFv. Este conector de polipéptido flexible puede comprender un conector de gly-ser. Generalmente, este enlazador no incluye una porción de bisagra.
5. Configuración específica de biMab
Los biMab de la presente divulgación comprenden dos pares de cadenas ligeras pesadas. La secuencia de polipéptidos de la cadena pesada quimérica biMab puede comprender una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH1), una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio constante de cadena pesada de anticuerpo 1 (CH1), una secuencia de polipéptido que comprende un primer conector de polipéptido (L1), una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio de unión (BD1), una secuencia de polipéptidos que comprende un segundo conector de polipéptido (L2) y una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio Fc. En algunos aspectos, el dominio Fc comprende un dominio Ch2 y un dominio Ch3. Por lo tanto, una cadena pesada quimérica biMab puede comprender secuencias de polipéptidos en la siguiente orientación desde el extremo N al terminal C: VH1-Ch1 -L1 -BD-L2-Ch2-Ch3. La secuencia de polipéptidos de la cadena ligera biMab puede comprender un dominio variable de cadena ligera (VL1) y un dominio constante de cadena ligera (CL). Por lo tanto, una cadena ligera biMab puede comprender una secuencia de polipéptidos en la siguiente orientación desde el extremo N al terminal C: VL1-CL1. Nótese que VH1, VL1 y CL1 se usan para denotar porciones de la unidad de enlace 1 que se une al primer epítopo. BD se usa para denotar porciones de la unidad de enlace 2 que se une al segundo epítopo. En ciertos aspectos, una o más unidades de unión adicionales (por ejemplo, scFvs) están presentes en los extremos N-terminal y/o C-terminal del núcleo biMab, ver por ejemplo las Figuras 26 y 27. En otros aspectos, uno o más las unidades de unión (por ejemplo, scFvs) están presentes dentro de la bisagra. Por lo tanto, una cadena pesada biMab puede comprender un núcleo extendido y tener secuencias de polipéptidos en la siguiente orientación desde el extremo N al terminal C: VH1-Ch1-L1-(BDVL2-Ch2-Ch3 donde n>1. Un biMab de ejemplo que tiene un núcleo extendido se proporciona en la Figura 28.
En los aspectos donde el dominio de unión es un scFv, la cadena pesada quimérica biMab puede comprender una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH1), una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio constante de cadena pesada de anticuerpo 1 (CH1), una secuencia de polipéptidos que comprende un primer conector de polipéptidos (L1), una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio variable de cadena ligera de anticuerpos (VL2), una secuencia de polipéptidos que comprende un conector flexible, una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpos (VH2), un polipéptido secuencia que comprende un segundo conector de polipéptido (L2), y una secuencia de polipéptido que comprende un dominio Fc de anticuerpo. Por lo tanto, la cadena pesada quimérica de un biMab que comprende un scFv como BD puede comprender secuencias de polipéptidos en la siguiente orientación desde el extremo N al terminal C: VH1-CH1-L1-VL2-L3-VH2-L2-Fc. La cadena pesada quimérica es una cadena de polipéptidos que comprende una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de cada uno de los dominios de polipéptidos). Alternativamente, una cadena pesada quimérica de un biMab que comprende un scFv como dominio de unión puede comprender una secuencia de polipéptidos en la siguiente orientación desde el extremo N al terminal C: VH1-CH1-L1 -VH2-L3-VL2-L2-Fc. La cadena pesada quimérica es una cadena de polipéptidos que comprende una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de cada uno de los dominios de polipéptidos). Nótese que VH1, VL1 y CL1 se usan para denotar porciones de la unidad de enlace 1, con VH1 y VL1 que denotan esa porción que une el primer epítopo. VH2 y VL2 se usan para denotar porciones de la unidad de enlace 2 que se unen al segundo epítopo. En ciertos aspectos, dominios de unión scFv adicionales están presentes en los extremos N-terminal y/o C-terminal de los polipéptidos que forman el núcleo biMab, véase, por ejemplo, la Figura 26-27 (que representa el núcleo biMab que comprende además la unidad de enlace 3 y/o 4 y/o 5). En ciertos aspectos, más de un dominio de unión scFv está presente dentro del núcleo biMab, véase, por ejemplo, la Figura 28 (que representa un núcleo biMab extendido que comprende las unidades de unión 2a y 2b). Cada scFv adicional comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo denominada VH3, VH4, VH5, y una región variable de cadena ligera de anticuerpo correspondiente denominada VL3, VL4, VL5.
6. Etiquetas, conjugados y unidades estructurales
Los biMab de la descripción pueden conjugarse con marcadores para fines de diagnóstico y otros ensayos en los que pueden detectarse los biMab y/o sus dianas asociadas. Las etiquetas incluyen, sin limitación, un cromóforo, un fluoróforo, una proteína fluorescente, un colorante fosforescente, un colorante en tándem, una partícula, un hapteno, una enzima y un radioisótopo.
En ciertos aspectos, los biMab se conjugan con un fluoróforo. La elección del fluoróforo unido a los biMab determinará las propiedades de absorción y emisión de fluorescencia de los biMab conjugados. Las propiedades físicas de una etiqueta de fluoróforo que puede usarse para biMab y ligandos unidos a biMab incluyen, pero no se limitan a, características espectrales (absorción, emisión y cambio de Stokes), intensidad de fluorescencia, vida útil, polarización y tasa de foto-blanqueo, o combinación de los mismos. Todas estas propiedades físicas se pueden usar para distinguir un fluoróforo de otro y, por lo tanto, permitir el análisis multiplexado. Otras propiedades deseables del marcador fluorescente pueden incluir la permeabilidad celular y la baja toxicidad, por ejemplo, si el marcado del biMab se realiza en una célula o un organismo (por ejemplo, un animal vivo).
En ciertos aspectos, una enzima es una etiqueta y se conjuga con un biMab. Las enzimas son etiquetas deseables porque se puede obtener la amplificación de la señal detectable dando como resultado una mayor sensibilidad del ensayo. La enzima en sí misma no produce una respuesta detectable, pero funciona para descomponer un sustrato cuando es contactado por un sustrato apropiado de tal manera que el sustrato convertido produce una señal fluorescente, colorimétrica o luminiscente. Las enzimas amplifican la señal detectable porque una enzima en un reactivo marcador puede dar como resultado que múltiples sustratos se conviertan en una señal detectable. El sustrato enzimático se selecciona para producir el producto medible preferido, por ejemplo, colorimétrico, fluorescente o quimioluminiscente. Tales sustratos se usan ampliamente en la técnica y son bien conocidos por un experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, oxidorreductasas tales como peroxidasa de rábano picante y un sustrato tal como 3,3'-diaminobencidina (DAB); enzimas fosfatasa tales como una fosfatasa ácida, alcalina y un sustrato tal como fosfato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo (BCIP); glicosidasas, tales como beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa o beta-glucosidasa y un sustrato tal como 5-bromo-4-cloro-3-indolil beta-D-galactopiranósido (X-gal); enzimas adicionales incluyen hidrolasas tales como colinesterasas y peptidasas, oxidasas tales como glucosa oxidasa y citocromo oxidasas, y reductasas para las cuales se conocen sustratos adecuados.
Las enzimas y sus sustratos apropiados que producen quimioluminiscencia son adecuados para algunos ensayos. Estos incluyen, pero no se limitan a, formas naturales y recombinantes de luciferasas y aequorinas. Los sustratos productores de quimioluminiscencia para fosfatasas, glucosidasas y oxidasas tales como los que contienen dioxetanos estables, luminol, isoluminol y ésteres de acridinio son adicionalmente útiles.
En otro aspecto, haptenos tales como biotina, también se utilizan como marcadores. La biotina es útil porque puede funcionar en un sistema enzimático para amplificar aún más la señal detectable, y puede funcionar como una etiqueta para ser utilizada en la cromatografía de afinidad con fines de aislamiento. Para fines de detección, se usa un conjugado enzimático que tiene afinidad por la biotina, como la avidina-HRP. Posteriormente, se agrega un sustrato de peroxidasa para producir una señal detectable.
Los haptenos también incluyen hormonas, fármacos naturales y sintéticos, contaminantes, alérgenos, moléculas afectoras, factores de crecimiento, quimioquinas, citoquinas, linfocinas, aminoácidos, péptidos, intermedios químicos y nucleótidos.
En ciertos aspectos, las proteínas fluorescentes pueden conjugarse con los biMab como una etiqueta. Ejemplos de proteínas fluorescentes incluyen la proteína verde fluorescente (GFP) y las ficobiliproteínas y sus derivados. Las proteínas fluorescentes, especialmente la ficobiliproteína, son particularmente útiles para crear reactivos de marcado marcados con colorante en tándem. Estos colorantes en tándem comprenden una proteína fluorescente y un fluoróforo con el fin de obtener un cambio de Stokes más grande en donde los espectros de emisión se desplazan más lejos de la longitud de onda de los espectros de absorción de la proteína fluorescente.
En ciertos aspectos, la etiqueta es un isótopo radiactivo. Ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen, entre otros, yodo (121I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (111In, 112In, 113mIn, 115mIn), tecnecio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (135Xe), flúor (18F), 153Sm , 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105 Rh y 97Ru.
En algunos aspectos, los fármacos pueden conjugarse con los biMab. Por ejemplo, un biMab que comprende un scFv puede conjugarse con un fármaco citotóxico. En este ejemplo, el scFv puede unirse a un antígeno diana en una superficie celular, y el fármaco citotóxico se entrega a la célula. En algunos aspectos, el conjugado biMab se internaliza, lo que libera el fármaco citotóxico a la célula. Cualquier fármaco citotóxico conocido en la técnica puede conjugarse con un biMab. Algunos conjugados de anticuerpos ya están aprobados por la FDA o se encuentran actualmente en ensayos clínicos.
En ciertas características, los fármacos y otras moléculas pueden dirigirse a biMab mediante conjugación específica del sitio. Por ejemplo, los biMab pueden comprender dominios diseñados por cisteína (incluyendo cisteína(s) diseñadas en una unidad de enlace y/o dominio Fc), que dan como resultado grupos tiol libres para reacciones de conjugación. En ciertos aspectos, un biMab está diseñado para incorporar sitios de conjugación específicos. La Figura 225 es una representación esquemática de un biMab modificado para la conjugación de fármacos. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona una variante Fc biMab, en donde la región Fc comprende una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 239, 282, 289, 297, 312, 324, 330, 335, 337, 339, 356, 359, 361,383, 384, 398, 400, 440, 422 y 442, según el índice de la UE. En algunos aspectos, la región Fc comprende sustituciones en uno o más de los siguientes grupos de posiciones: a) 289 y 440; b) 330 y 440; c) 339 y 440; d) 359 y 440; e) 289 y 359; f) 330 y 359; g) 339 y 359; h) 289 y 339; i) 330 y 339; j) 289 y 330; k) 339 y 442; l) 289, 339 y 442; m) 289, 330 y 339; n) 330, 339 y 442; y o) 289, 330 y 442. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona un biMab, en donde el dominio CH1 del brazo Fab comprende una sustitución en una o más de las posiciones 131, 132, 134, 135, 136 y 139, según el índice de la UE. En un aspecto, la sustitución comprende una sustitución por un aminoácido elegido entre cisteína, lisina, tirosina, histidina, selenocisteína y selenometionina. En un aspecto específico, la sustitución es una cisteína. Los métodos para generar anticuerpos de ingeniería de cisteína estables se describen en los documentos U.S. 7,855,275, U.S. 20110033378 y WO 2011/005481.
7. Dianas de ejemplo
En algunos aspectos, los biMab se dirigen a pares específicos de moléculas (por ejemplo, la unidad de enlace 1 se une a uno de las dianas y la unidad de enlace 2 se une a la otra diana). Un biMab de la descripción puede ser capaz de unir pares de citoquinas seleccionadas de, por ejemplo, IL-1 a e IL-1 p ; IL-12 e IL-18; TNFa e IL-23; TNFa e IL-13; TNF e IL-18; TNF e IL-12; TNF e IL-1beta; TNF y MIF; TNF e IL-17; y TNF e IL-15; TNF y VEGF; VEGFR y EGFR; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-p; agonista de IL-13 y LHR; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; IL-13 y ADAM8; TNFa y PGE4; IL-13 y PED2; TNF y PEG2.
En ciertos aspectos, los biMab de la divulgación pueden ser capaces de unir pares de dianas seleccionadas de, por ejemplo, CD138 y CD20; CD138 y CD40; CD19 y CD20; CD20 y CD3; CD38 y CD138; CD38 y CD20; CD38 y CD40; CD40 y CD20; CD-8 e IL-6; CSPG y RGM A; CTLA4 y BTNO2; IGF1 e IGF2; IGF1/2 y ErbB2; IGFR y EGFR; ErbB2 y ErbB3; ErbB2 y CD64; IL-12 y TWEAK; IL-13 e IL-1 P; MAG y RGM A; NgR y RGM A; NogoA y RGM A; OMGp y RGM A; PDL-1 y CTLA4; RGM A y RGM B; Te38 y TNFa; TNFa y Blys; TNFa y CD-22; TNFa y CTLA-4; TNFa y GP130; TNFa e IL-12p40; y TNFa y ligando RANK.
En algunos aspectos, los biMab de la divulgación pueden ser capaces de unir una, dos o más citoquinas, proteínas relacionadas con citoquinas y receptores de citoquinas seleccionados entre, por ejemplo, BMP1, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6 , BMP8, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (aFGF), FGF2 (pFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNa1, IFNa2, IFNa4, IFNa5, IFNa6, IFNa7, IFNp1, IFNy, IFNw 1, FIL1, FIL1 (EPSILON), FIL1 (ZETA), IL1a, IL1 p, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA ( TNF-p), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (ligando OX40), TNFSF5 (ligando CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando CD27), TNFSF8 (ligando CD30), TNFSF9 (ligando 4-1BB), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (abril), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, FIGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (leptina), PTN, y THPO.
[[0127] En otros aspectos, los biMab de la descripción pueden ser capaces de unir una o más quimioquinas, receptores de quimioquinas y proteínas relacionadas con quimioquinas seleccionadas entre, por ejemplo, CCL1 (I-309), CCL2 (MCP-1/MCAF), CCL3 (MIP-1 a), CCL4 (MIP-1 b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-1 d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC/éxodo-2), CCL22 (MDC/STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CXCL1 (GRO1), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (I-TAC), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYD1), SCYE1, XCL1 (linfotactina), XCL2 (SCM-1b), BLR1 (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61), CCR1 (CKR1/HM145), CCR2 (mcp-1 RB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1), CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR)-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6 CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HIF1A, IL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2 y VHL.
En otros aspectos, los biMab de la descripción pueden ser capaces de unir uno o más antígenos de cáncer seleccionados entre, por ejemplo, 707-AP, ALK, a Fp , AKAP-4, ANHYDRASE IX, ART-4, B7H3, BAGE , b-cateninamutada, Bcr-abl, Bo RiS, Ca MEL, CAP-1, CASP-8, CDC27 mutada, CDK4 mutada, CEA, CT, CYCLIN B1, Cyp-B, CYP1B1, DAM-6/MAGE-B2, DAM-10/MAGE-B1, EGFRvlII, ELF2M, EPCAM, EPHA2, EPHA4, ERG, ETV6-AML1, FAP, FLUCOSYL, G250, GAGE, GD2, GD3, GLOBOH, GM1, GM3, GnT-V, Gp100, HAGE, HER2, HER3, HER4, HLA-A*0201 -R170I, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, HTERT, iCE, KIAA0205, LAGE, LCK, LDLR/FUT, LMP2, LUGUMAIN, MAD-CT1, MAD-CT2, MAGE, MAGE-A1, MAGE-A3, MART1, MC1R, MESOTHELIN, ML-IAP, MUC1, MUM-1, -2, -3, MYCN, NA17, NA88-A, NY-ESO-1, P15, p190 menor bcr-abl, P53, PAGE4, PAP, PAXS, PDGFR B, PLAC1, Pml/RARa, ÁCIDO POLISIÁLICO, PR1, PRAME, PSA, PSCA, PSMA, RAGE, RAS-MUTANT, RGS5, RHOC, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, SSX2, STN, SURVIVIN, TEL/AML1, TIE2, TPI mutado, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGFR2, WT 1 y XAGE1.
Otros biMab pueden ser capaces de unir proteínas de la superficie celular seleccionadas entre, por ejemplo, proteínas integrales de membrana que incluyen canales iónicos, bombas iónicas, receptores acoplados a proteínas G, proteínas estructurales, proteínas de adhesión tales como integrinas, transportadores, unidos a la membrana enzimas, proteínas involucradas en la acumulación y transducción de energía y proteínas ancladas a lípidos, incluyendo proteínas G y algunas quinasas ancladas a membrana. Los biMab también pueden ser capaces de unir enzimas como quinasas, proteasas, lipasas, fosfatasas, sintetasas de ácidos grasos, enzimas digestivas como pepsina, tripsina y quimotripsina, lisozima y polimerasas. El biMab también puede ser capaz de unirse a receptores tales como receptores de hormonas, receptores de linfoquinas, receptores de monocinas, receptores de factores de crecimiento, receptores acoplados a proteínas G y más.
En otros aspectos, los biMab de la descripción pueden ser capaces de unir uno o más agentes infecciosos (por ejemplo, bacterias, virus). Las bacterias infecciosas incluyen, entre otras, bacterias gram negativas y gram positivas. Las bacterias grampositivas incluyen, entre otras, especies de Pasteurella, especies de estafilococos y especies de estreptococos. Las bacterias Gram negativas incluyen, entre otras, Escherichia coli, especies de Pseudomonas y especies de Salmonella. Ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, entre otros: Helicobacter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaeróbicas), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, y Actinomyces israelli. Los virus incluyen, pero no se limitan a, enterovirus, rotavirus, adenovirus, virus de la hepatitis. Ejemplos específicos de virus que se han encontrado en humanos incluyen, entre otros: Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana (VIH); Picornaviridae (por ejemplo, virus de la poliomielitis, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de la parainfluenza, virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus sincicial respiratorio); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la influenza); Bungaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus de Nairo); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B); Parvoviridae (parvovirosis); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (VHS) 1 y 2, virus de varicela zoster, citomegalovirus (CMV)); Poxviridae (virus variola, virus vaccinia, virus DE la viruela); Iridoviridae (por ejemplo, virus de la peste porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de las encefalopatías espongiformes, el agente de la hepatitis delta, los agentes de la hepatitis no A, no B; Norwalk y virus relacionados y astrovirus).
En ciertos aspectos, un biMab de la descripción une dos epítopos diferentes en la misma diana (por ejemplo, la unidad de enlace 1 se une a un primer epítopo en una diana y la unidad de enlace 2 se une a un segundo epítopo en la misma diana).
En ciertos aspectos, un biMab de la descripción se une a EGFR e IGFR1. En ciertos aspectos, la unidad de enlace 1 se une al EGFR y la unidad de enlace 2 se une al IGFR1. En otros aspectos, la unidad de enlace 1 se une a IGFR1 y la unidad de enlace 2 se une a EGFR. En otros aspectos, un biMab de la divulgación se une a VEGF y Ang2. En ciertos aspectos, la unidad de enlace 1 se une a VEGF y la unidad de enlace 2 se une a Ang2. En otros aspectos, la unidad de enlace 1 se une a Ang2 y la unidad de enlace 2 se une a VEGF.
En algunos aspectos, la naturaleza multimérica de los biMab de la divulgación confiere la capacidad de dirigir etiquetas o productos terapéuticos a un tipo celular específico o diana molecular. Por ejemplo, un dominio funcional en un biMab puede unirse a una diana en la superficie de una célula, mientras que otro dominio funcional en el mismo biMab se une a un hapteno o agente de marcado útil para la detección. De manera similar, un dominio funcional puede unirse a una diana celular mientras que un segundo dominio funcional se une a una toxina. Debido a que ambas reacciones de unión están mediadas a través de una sola molécula, la toxina puede colocarse cerca de la diana celular, donde afecta una función citotóxica.
B. Moléculas de ácidos nucleicos que codifican biMab
La presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican biMab. Un aspecto de la divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los biMab de la divulgación. Una molécula de ácido nucleico puede codificar una cadena pesada y/o cadena ligera del biMab.
En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada del biMab es una molécula contigua de ácido nucleico que comprende una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VH1; una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 ; una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de unión (BD) que se une a un segundo epítopo; una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Fc, en donde la molécula de ácido nucleico comprende además al menos una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un conector de polipéptido. En algunos aspectos, una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio CH1 está unida a una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de unión (BD) a través de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer conector de polipéptido (L1 ) En algunos aspectos, una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de unión (BD) está unida a una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región Fc a través de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo conector polipeptídico (L2 ).
En algunos aspectos, el dominio de unión (BD) es un scFv, en donde la porción de ácido nucleico que codifica el scFv comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VL2 y una secuencia de nucleótidos que codifica un VH2, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VL2 está unido a la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VH2 a través de una secuencia de nucleótidos que codifica un conector de polipéptido flexible.
En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico contigua que codifica una cadena pesada del biMab comprende además una porción de ácido nucleico que codifica una unidad de enlace unida al extremo 5' de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VH1 y/o una porción de ácido nucleico que codifica una unidad de enlace unida al extremo 3' de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región Fc. En ciertos aspectos, una porción de ácido nucleico que codifica una unidad de enlace está unida a una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VH1 a través de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un conector polipeptídico. En ciertos otros aspectos, una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región Fc está unida a una porción de ácido nucleico que codifica una unidad de enlace a través de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un conector polipeptídico.
En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico codifica una cadena ligera del biMab. El ácido nucleico que codifica una cadena ligera del biMab puede comprender una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VL1, y una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio CL.
En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera del biMab comprende además una porción de ácido nucleico que codifica una unidad de enlace unida al extremo 5' de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VL1 y/o una porción de ácido nucleico que codifica una unidad de enlace unida al extremo 3' de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio CL. En ciertos aspectos, una porción de ácido nucleico que codifica una unidad de enlace está unida a una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VL1 a través de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un conector polipeptídico. En ciertos otros aspectos, una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio CL está unida a una porción de ácido nucleico que codifica una unidad de enlace a través de una porción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un conector polipeptídico. Otro aspecto de la divulgación proporciona un vector que comprende una molécula o moléculas de ácido nucleico como se describe en el presente documento, en donde el vector codifica un biMab como se describe en el presente documento.
Un aspecto adicional proporciona una célula huésped transformada con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico como se describe en el presente documento. En otro aspecto de la divulgación, se proporciona una célula huésped que comprende el vector que comprende moléculas de ácido nucleico como se describe en el presente documento. En un aspecto, la célula huésped puede comprender más de un vector.
La divulgación contempla moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier biMab de la divulgación, así como la cadena pesada ligera o quimérica de un biMab. Por ejemplo, la descripción contempla una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera de biMab (por ejemplo, VL1+CL de una unidad de enlace 1, tal como un Fab que se une a un primer epítopo) y/o una secuencia de nucleótidos que codifica un biMab cadena pesada quimérica (por ejemplo, VH1+CH1+L1+BD+L2+Fc). La divulgación contempla además moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier biMab de la divulgación que comprende además unidades de unión adicionales. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera biMab que comprende además una unidad de enlace adicional (por ejemplo, unidad de enlace 2+VL1+CL de una unidad de enlace 1) y/o una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada quimérica biMab que comprende además una unidad de enlace adicional (por ejemplo, unidad de enlace 4+VH1+CH1+L1+BD+L2+Fc).
C. Métodos para producir biMab
La presente divulgación proporciona métodos para producir biMab. En ciertos aspectos, los ácidos nucleicos recombinantes pueden estar operativamente unidos a una o más secuencias de nucleótidos reguladores en un constructo de expresión. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas pesadas quiméricas y ligeras biMab pueden clonarse en el mismo vector de expresión en cualquier orientación (por ejemplo, cadena ligera delante de la cadena pesada o viceversa) o pueden clonarse en dos vectores diferentes. Si la expresión se lleva a cabo utilizando un vector, los dos genes codificadores pueden tener sus propios elementos genéticos (por ejemplo, promotor, RBS, líder, stop, poliA, ect) o pueden clonarse con un solo conjunto de elementos genéticos, pero conectados con un elemento cistrón. Las secuencias de nucleótidos reguladoras generalmente serán apropiadas para una célula huésped utilizada para la expresión. Se conocen numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas en la técnica para una variedad de células huésped. Típicamente, dicha una o más secuencias de nucleótidos reguladores pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias líder o de señal, sitios de unión ribosómicos, secuencias de inicio y terminación transcripcionales, secuencias de inicio y terminación de traducción, y secuencias potenciadoras o activadoras. La divulgación contempla los promotores constitutivos o inducibles como se conocen en la técnica. Los promotores pueden ser promotores naturales o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Un constructo de expresión puede estar presente en una célula en un episoma, como un plásmido, o el constructo de expresión puede insertarse en un cromosoma.
En ciertos aspectos, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células huésped transformadas. Los genes marcadores seleccionables son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula huésped utilizada. En ciertos aspectos, esta descripción se refiere a un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido y está operativamente unida a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras son reconocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido codificado. En consecuencia, el término secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Ejemplos de secuencias reguladoras no limitantes se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Además, también se debe considerar el número de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, como los marcadores antibióticos.
La presente divulgación se refiere además a métodos para producir un biMab de la divulgación. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con uno o más vectores de expresión que codifican un biMab (por ejemplo, un solo vector que codifica la cadena pesada quimérica y la cadena ligera o dos vectores, uno que codifica la cadena pesada quimérica y otro que codifica la cadena ligera) ser cultivado en condiciones apropiadas para permitir que ocurra la expresión del polipéptido. El biMab puede secretarse y aislarse de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido. Alternativamente, el biMab puede ser retenido en el citoplasma o en una fracción de membrana y las células cosechadas, lisadas y la proteína aislada. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo celular son bien conocidos en la técnica. Los biMab se pueden aislar del medio de cultivo celular, células huésped, o ambos, utilizando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis y purificación de inmunoafinidad. En ciertos aspectos, el biMab está hecho como una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación.
Se puede producir un ácido nucleico recombinante ligando el gen clonado, o una porción del mismo, en un vector adecuado para la expresión en células procariotas, células eucariotas (levadura, ave, insecto o mamífero), o en ambas. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, como E. coli. En ciertos aspectos, los vectores de expresión de mamíferos contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamíferos adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, como pBR322, para facilitar la replicación y la selección de resistencia a fármacos tanto en células procariotas como eucariotas. Alternativamente, los derivados de virus como el virus del papiloma bovino (BPV-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) pueden usarse para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Los diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y la transformación de organismos huéspedes son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, así como para procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Capítulos 16 y 17. En algunos casos, puede ser deseable expresar el polipéptido recombinante mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Ejemplos de tales sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (como pAcUW1) y vectores derivados de pBlueBac (como el p-gal que contiene pBlueBac III).
Las técnicas para hacer genes de fusión son bien conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ácido nucleico que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se realiza de acuerdo con técnicas convencionales, empleando terminales con extremos romos o escalonados para la ligadura, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los terminales apropiados, relleno de extremos cohesivos como tratamiento apropiado de fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable y la ligadura enzimática. En otro aspecto, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a voladizos complementarios entre dos fragmentos de ácido nucleico consecutivos que posteriormente pueden ser recocidos para generar una secuencia de genes quiméricos (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
En algunos aspectos, un vector de expresión que expresa cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente puede usarse para expresar biMab en una célula huésped. Por ejemplo, un biMab puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando un sistema de expresión de baculovirus), levadura o células de mamífero. Los expertos en la materia conocen otras células huésped adecuadas.
Una vez que el vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales, las células transfectadas se cultivan luego mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo. Por lo tanto, la divulgación incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica biMab o fragmentos del mismo, unidos operativamente a un promotor heterólogo. En ciertos aspectos, tanto la cadena pesada quimérica como la cadena ligera se pueden coexpresar (del mismo o diferentes vectores) en la célula huésped para la expresión de todo el biMab. En ciertos aspectos, tanto las cadenas pesadas como las ligeras del biMab se expresan a partir de un único promotor. En ciertos aspectos, las cadenas pesadas y ligeras de biMab se expresan a partir de múltiples promotores. En ciertos aspectos, las cadenas pesadas y ligeras del biMab están codificadas en un solo vector. En ciertos aspectos, las cadenas pesadas y ligeras de biMab están codificadas en múltiples vectores.
Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión de anticuerpos recombinantes son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), incluidas, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células 293 de riñón epitelial humano y una serie de otras líneas celulares. Las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraducción de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del anticuerpo o parte del mismo expresado. Para este fin, pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado de la transcripción primaria, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células huésped de mamíferos incluyen, entre otras, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce endógenamente cualquier cadena de inmunoglobulina funcional), células SP20, CRL7O3O y HsS78Bst. En un aspecto, las líneas celulares humanas desarrolladas por la inmortalización de linfocitos humanos pueden usarse para producir de manera recombinante anticuerpos monoclonales. En un aspecto, la línea celular humana PER.C6. (Crucell, Países Bajos) puede usarse para producir recombinantemente anticuerpos monoclonales.
Las líneas celulares adicionales que pueden usarse como huéspedes para la expresión de anticuerpos recombinantes incluyen, pero no se limitan a, células de insecto (por ejemplo, Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) o células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, Pichia, US7326681; etc.), células vegetales (US20080066200); y células de pollo (WO2008142124).
En ciertos aspectos, los biMab de la divulgación se expresan de forma estable en una línea celular. La expresión estable se puede utilizar para la producción a largo plazo de alto rendimiento de proteínas recombinantes. Por ejemplo, se pueden generar líneas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo. Las células huésped pueden transformarse con un vector diseñado de manera apropiada que comprende elementos de control de la expresión (por ejemplo, promotor, potenciador, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, se puede permitir que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células que integraron establemente el plásmido en sus cromosomas crezcan y formen focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Los métodos para producir líneas celulares estables con un alto rendimiento son bien conocidos en la técnica y los reactivos generalmente están disponibles comercialmente.
En ciertos aspectos, los biMab de la divulgación se expresan transitoriamente en una línea celular. La transfección transitoria es un proceso en donde el ácido nucleico introducido en una célula no se integra en el genoma o el ADN cromosómico de esa célula. De hecho, se mantiene como un elemento extracromosómico, por ejemplo, como un episoma, en la célula. Los procesos de transcripción del ácido nucleico del episoma no se ven afectados y se produce una proteína codificada por el ácido nucleico del episoma.
La línea celular, estable o transfectada transitoriamente, se mantiene en medio de cultivo celular y en condiciones bien conocidas en la técnica que dan como resultado la expresión y producción de anticuerpos monoclonales. En ciertos aspectos, los medios de cultivo de células de mamífero se basan en formulaciones de medios disponibles comercialmente, que incluyen, por ejemplo, DMEM o Ham F12. En otros aspectos, los medios de cultivo celular se modifican para soportar aumentos tanto en el crecimiento celular como en la expresión de proteínas biológicas. Como se usa en el presente documento, los términos "medio de cultivo celular", "medio de cultivo" y "formulación de medio" se refieren a una solución nutritiva para el mantenimiento, crecimiento, propagación o expansión de células en un entorno artificial in vitro fuera de un organismo o tejido multicelular. El medio de cultivo celular puede optimizarse para un uso específico de cultivo celular, que incluye, por ejemplo, medio de crecimiento de cultivo celular que está formulado para promover el crecimiento celular, o medio de producción de cultivo celular que está formulado para promover la producción de proteína recombinante. Los términos nutrientes, ingrediente y componente se usan indistintamente en el presente documento para referirse a los constituyentes que forman un medio de cultivo celular.
Una vez que se ha producido una molécula, se puede purificar por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina u otras moléculas multiméricas, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígenos específicos (proteína A o proteína G y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, las moléculas de la presente divulgación o fragmentos de las mismas pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos heterólogos (denominadas en el presente documento "etiquetas") descritas anteriormente o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.
Cuando se usan técnicas recombinantes, la molécula puede producirse intracelularmente, en el espacio periplasmático, o secretarse directamente en el medio. Si la molécula se produce intracelularmente, como primer paso, los desechos en partículas, ya sea células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan en el espacio periplasmático de E. coli. Cuando la molécula se secreta al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa como PMSF en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.
La composición preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, diálisis y/o cromatografía de afinidad, ya sea sola o en combinación con otros pasos de purificación. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina, si está presente, en la molécula y será entendido por un experto en la materia. La matriz a la que está unido el ligando de afinidad es con frecuencia agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables, como el vidrio de poro controlado o el poli (estirenivinil) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Otras técnicas para la purificación de proteínas, como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía SEPHAROSE en una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y la precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo de la molécula a recuperar.
Después de cualquier etapa(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende la molécula de interés y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba de pH bajo usando un regulador de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, y realizarse a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0.25 M de sal).
Se puede preparar y purificar un biMab usando, por ejemplo, una cualquiera o una combinación de técnicas expuestas anteriormente y/o en los Ejemplos. Solamente para ilustrar, un biMab puede purificarse por afinidad usando cromatografía de afinidad de proteína A estándar usando la columna HiTrap rProteinA FF que se ha equilibrado en PBS 1X. El biMab puede cargarse en la columna, que puede lavarse para eliminar contaminantes y material no unido. El lavado se puede hacer con PBS 1X hasta que la traza A280 alcance la línea base. La proteína unida puede entonces eluírse en glicina 25 mM pH 2.8. Las fracciones pueden neutralizarse inmediatamente mediante la adición de 0.1 volúmenes de regulador Tris-HCl 1M pH 8. Luego, las fracciones pueden analizarse para determinar su contenido de biMab leyendo su absorbancia en A280. Las fracciones que contienen el biMab se pueden agrupar y dializar durante la noche usando un corte de membrana de diálisis de 10.000 kiloDalton (kDa), a 4°C en un volumen 10X de PBS 1X. El biMab dializado puede entonces filtrarse usando filtros de 0.22 micras y analizarse mediante SDS-PAGE reductora y no reductora, por ejemplo, un gel Nupage al 4-12% en un regulador MOPS.
Después de la purificación de la proteína A, el biMab puede analizarse mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño para determinar el peso molecular (MW, Dalton) y el contenido monomérico de los constructos. SEC-HPLC puede llevarse a cabo utilizando una columna TSK-GEL G3000SWXL (Tosoh Bioscience LLC, Montgomeryville, PA), que separa las proteínas globulares con un peso molecular que varía de aproximadamente 10 a 500 kDa, con un regulador que contiene fosfato de sodio 100 mM, pH 6.8, y a un caudal de 1 ml/min.
Independientemente de cómo se purifique un biMab, para confirmar la unión funcional de los biMab de la descripción, se pueden realizar ensayos de unión (antes y/o después de la purificación). Por ejemplo, se pueden usar ensayos ELISA duales. En algunos aspectos, un primer antígeno se recubre en un pozo, y la unión a este antígeno inmoviliza el biMab. Un segundo antígeno marcado se agrega al pozo y se detecta. Solo se detectarán moléculas biespecíficas que estén inmovilizadas por unión al primer antígeno y también unidas al segundo antígeno.
D. Formulaciones farmacéuticas
En ciertos aspectos, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones farmacéuticas pueden ser composiciones que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un biMab. Dichas composiciones farmacéuticas también pueden ser composiciones que comprenden un biMab, o una combinación de biMab, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos, las composiciones farmacéuticas de la divulgación se usan como medicamento.
En ciertos aspectos, un biMab o una combinación de biMab (o moléculas de ácido nucleico que codifican un biMab o una combinación de biMab) puede formularse con un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable, como composiciones farmacéuticas. En ciertos aspectos, tales composiciones farmacéuticas son adecuadas para la administración a un animal humano o no humano a través de una o más vías de administración usando métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la materia, la ruta y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o más materiales no tóxicos que no interfieren con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos. Dichas preparaciones pueden contener habitualmente sales, agentes reguladores, conservantes, vehículos compatibles y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Dichas preparaciones farmacéuticamente aceptables también pueden contener cargas sólidas o líquidas compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes que son adecuadas para la administración en un ser humano. Otros vehículos, excipientes y/o aditivos contemplados, que pueden utilizarse en las formulaciones descritas en el presente documento incluyen, por ejemplo, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, lípidos, excipientes de proteínas tales como albúmina sérica, gelatina, caseína, contraiones formadores de sal como el sodio. Estos y otros vehículos farmacéuticos conocidos, excipientes y/o aditivos adecuados para su uso en las formulaciones descritas en el presente documento son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se enumera en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005), y en "Physician's Desk Reference", 60a ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (2005). Se pueden seleccionar vehículos farmacéuticamente aceptables que sean adecuados para el modo de administración, solubilidad y/o estabilidad deseada o requerida.
Las formulaciones descritas en el presente documento comprenden agentes activos en una concentración que da como resultado un p/v apropiado para una dosis deseada. En ciertos aspectos, el agente activo está presente en una formulación a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, o aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml. En ciertos aspectos, el agente activo está presente en una concentración de aproximadamente 25 mg/ml. En ciertos aspectos, la concentración del agente activo en una formulación puede variar de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100% en peso. En ciertos aspectos, la concentración del agente activo está en el rango de 0.003 a 1.0 molar.
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación son formulaciones libres de pirógenos que están sustancialmente libres de endotoxinas y/o sustancias pirogénicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que están confinadas dentro de un microorganismo y se liberan solo cuando los microorganismos se descomponen o mueren. Las sustancias pirogénicas también incluyen sustancias termoestables que inducen fiebre (glucoproteínas) de la membrana externa de las bacterias y otros microorganismos. Ambas sustancias pueden causar fiebre, hipotensión y choque si se administran a humanos. Debido a los posibles efectos nocivos, incluso pequeñas cantidades de endotoxinas deben eliminarse de las soluciones farmacéuticas administradas por vía intravenosa. La Food & Drug Administration ("FDA") ha establecido un límite superior de 5 unidades de endotoxinas (UE) por dosis por kilogramo de peso corporal en un solo período de una hora para aplicaciones de drogas intravenosas (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26(1): 223 (2000)). En ciertos aspectos específicos, los niveles de endotoxinas y pirógenos en la composición son menores de 10 EU/mg, o menores de 5 EU/mg, o menores de 1 EU/mg, o menores de 0.1 EU/mg, o menores de 0.01 EU/mg, o menos de 0.001 EU/mg.
Cuando se usa para administración in vivo, las formulaciones de la divulgación deben ser estériles. Las formulaciones de la divulgación pueden esterilizarse por diversos métodos de esterilización, que incluyen filtración estéril, radiación, etc. En un aspecto, la formulación se esteriliza por filtración con un filtro preesterilizado de 0.22 micras. Las composiciones estériles para inyección pueden formularse de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional como se describe en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005).
Las composiciones terapéuticas de la presente divulgación pueden formularse para vías particulares de administración, tales como administración oral, nasal, pulmonar, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente", como se usan en el presente documento, se refieren a modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. Las formulaciones de la presente divulgación que son adecuadas para administración tópica o transdérmica incluyen polvos, aerosoles, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. Los biMab se pueden mezclar en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, regulador o propulsor que se requiera (Patente de los Estados Unidos No. 7,378,110; 7,258,873; 7,135,180; Publicación de los Estados Unidos No.
2004-0042972; y 2004-0042971).
Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica de la farmacia. Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxico para el paciente (por ejemplo, "una cantidad terapéuticamente efectiva"). El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares empleadas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, la salud general y el historial médico previo del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Las dosis adecuadas pueden variar de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o mayor, por ejemplo, aproximadamente 0.1, 1, 10 o 50 mg/kg de peso corporal, siendo aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal adecuado.
Nótese que la descripción contempla de manera similar que también se pueden hacer formulaciones adecuadas para uso de diagnóstico e investigación. La concentración del agente activo en tales formulaciones, así como la presencia o ausencia de excipientes y/o pirógenos se pueden seleccionar en función de la aplicación particular y el uso previsto.
E. Usos
biMab, como se describe en el presente documento, se puede usar para unir dianas asociadas con enfermedades o trastornos, eliminando o inhibiendo así la actividad de las dianas y tratando las enfermedades o trastornos y/o aliviando los síntomas de los mismos. En algunos aspectos, los biMab de la divulgación pueden usarse para tratar un trastorno relacionado con la angiogénesis, la proliferación celular, la motilidad celular, la invasión celular o la adhesión celular en un sujeto, administrando al sujeto que lo necesita una dosis terapéuticamente efectiva de un biMab de la divulgación que se une a una diana asociada con la enfermedad o los síntomas del trastorno. Por ejemplo, se ha demostrado que la señalización aberrante a través de factores de crecimiento y/o receptores de factores de crecimiento contribuye a la proliferación celular no deseada y al cáncer. En consecuencia, los biMab pueden usarse para tratar la proliferación celular no deseada y/o el cáncer asociado con la señalización del factor de crecimiento. En particular, la curva de crecimiento tumoral de un tumor y/o el volumen de un tumor pueden reducirse mediante la administración de un biMab dirigido a proteínas en las vías de señalización del factor de crecimiento. Se puede usar una estrategia similar para cánceres específicos o ejemplos de proliferación celular no deseada asociada con otras moléculas de señalización.
Un ejemplo no limitativo de un biMab específico es una molécula bivalente biespecífica que se une a EGFR e IGFR. Este biMab puede usarse para tratar la proliferación celular no deseada y/o el cáncer asociado con la señalización de EGF e IGF. Otro ejemplo de biMab específico no limitante es una molécula bivalente biespecífica que se une a VEGF y Ang2. Este biMab puede usarse para tratar la proliferación celular no deseada y/o el cáncer asociado con la señalización de VEGF y Ang2. Por ejemplo, el biMab puede usarse para inhibir el crecimiento tumoral y/o disminuir el volumen de un tumor existente. Del mismo modo, un biMab se puede utilizar de forma diagnóstica para detectar o controlar células o tumores. Además, un biMab puede usarse en un contexto de investigación para estudiar, por ejemplo, el crecimiento celular y la supervivencia en células y tejidos de tipo salvaje o enfermos.
En otros aspectos, los biMab de la divulgación pueden usarse para tratar enfermedades o trastornos causados por un agente infeccioso tal como un virus, bacteria o parásito. Un biMab puede estar diseñado para unirse a una o más dianas biomoleculares en un agente infeccioso, haciendo que el agente no pueda invadir y/o infectar las células huésped. Alternativamente, una pluralidad de biMab puede unirse a un agente infeccioso y, como las inmunoglobulinas nativas, desencadenar una respuesta inmune. Finalmente, un biMab puede usarse para unir una molécula diana liberada por un agente infeccioso, para evitar que la diana actúe sobre las células y tejidos del huésped.
En otros aspectos, los biMab de la divulgación pueden usarse para modular las respuestas inmunes a antígenos tales como polen, plantas, partes y/o secreciones de insectos, caspa de animales, nueces o autoantígenos. Los biMab pueden diseñarse para unirse a dianas biomoleculares presentes en estos antígenos y/o dianas que median la respuesta inmune a estas dianas, como IgE, anafilatoxinas o histamina.
Los biMab de la divulgación, tales como los descritos en el presente documento, también pueden usarse con fines de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden detectar una o más biomoléculas diana en tejidos o células de un sujeto para detectar una enfermedad o trastorno asociado con cambios en la expresión de las dianas. Un kit de diagnóstico puede comprender uno o más biMab que se unen a las moléculas diana, y un sistema de detección para indicar la reacción de los biMab(s) con el (las) diana(s), si los hay.
La divulgación contempla numerosos usos para biMab, incluyendo usos terapéuticos, diagnósticos y de investigación. Los usos de diagnóstico e investigación pueden ser in vivo o ex vivo. Por ejemplo, un biMab particular puede usarse para identificar, en cultivo celular, en biopsia de tejido o en un modelo animal o animal, si las células o el tejido expresan un antígeno(s) particular y si mejora la unión simultánea de una molécula de anticuerpo a ambos antígenos detección, altera la supervivencia o el comportamiento celular. Además, la actividad de biMab se puede comparar con la actividad de los anticuerpos convencionales para evaluar las interacciones o roles de múltiples dianas o múltiples vías de señalización en un estado normal o de enfermedad (por ejemplo, la inhibición simultánea de dos dianas tiene un efecto diferente en el comportamiento celular en comparación con la inhibición de cada diana por separado).
F. Kits
Otro aspecto de la presente divulgación es un kit. En un aspecto, un kit comprende cualquiera de las composiciones o composiciones farmacéuticas de un ácido nucleico, polipéptido, vector de expresión o célula huésped descrita anteriormente, y las instrucciones o una etiqueta que indique el uso o la administración apropiados. Opcionalmente, un kit también puede incluir uno o más recipientes y/o una jeringa u otro dispositivo para facilitar la entrega o el uso. La divulgación contempla que todos o cualquier subconjunto de los componentes para realizar ensayos de investigación, ensayos de diagnóstico y/o para administrar cantidades terapéuticamente eficaces pueden estar incluidos en el kit. De forma similar, el kit puede incluir instrucciones para fabricar un polipéptido, por ejemplo, cultivando una célula huésped que expresa un ácido nucleico que codifica un biMab de la divulgación en condiciones adecuadas. A modo de ejemplo adicional, un kit para la administración terapéutica de un biMab de la descripción puede comprender una solución que contiene una formulación farmacéutica del biMab, o una preparación liofilizada de un biMab, e instrucciones para administrar la composición a un paciente que lo necesite y/o para reconstituir el producto liofilizado.
La presente divulgación también abarca un producto farmacéutico empaquetado y etiquetado terminado. Este artículo de fabricación incluye la forma de dosificación unitaria apropiada en un recipiente o recipiente apropiado tal como un vial de vidrio u otro recipiente que esté sellado herméticamente. En el caso de formas de dosificación adecuadas para administración parenteral, el ingrediente activo, por ejemplo, un biMab descrito anteriormente, es estéril y adecuado para administración como una solución libre de partículas. En ciertos aspectos, la formulación es adecuada para administración intravenosa, tal como para infusión intravenosa a un humano o animal.
En un aspecto específico, las formulaciones de la divulgación se formulan en viales de dosis única como un líquido estéril. Los recipientes de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, viales, botellas, jeringas precargadas, bolsas intravenosas, envases de blíster (que comprenden una o más píldoras). Opcionalmente asociado con dicho(s) contenedor(es) puede haber una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, notificación que refleja la aprobación de la agencia de fabricación, uso o venta para diagnóstico humano y/o administración.
Como con cualquier producto farmacéutico, el material de empaque y el contenedor están diseñados para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y envío. Además, los productos de la divulgación incluyen instrucciones de uso u otro material informativo que aconseja al médico, técnico o paciente sobre cómo prevenir o tratar adecuadamente la enfermedad o trastorno en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye medios de instrucción que indican o sugieren un régimen de dosificación que incluye, entre otros, dosis reales, procedimientos de monitorización, etc., y otra información de monitorización.
Un kit para ensayos de diagnóstico puede comprender una solución que contiene un biMab o una preparación liofilizada de un biMab de la descripción, en donde el biMab se une específicamente a una o más dianas, así como reactivos para detectar dichos biMab. Los biMab pueden marcarse de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento, que incluyen, pero no se limitan a etiquetas tales como etiquetas fluorescentes de molécula pequeña, proteínas tales como biotina, GFP u otras proteínas fluorescentes, o secuencias de epítopos tales como his o myc. Del mismo modo, los anticuerpos primarios utilizados para detectar biMab pueden incluirse en el kit. Los anticuerpos primarios pueden dirigirse a secuencias en los biMab o a etiquetas, marcadores o epítopos con los que se etiquetan los biMab. Los anticuerpos primarios pueden, a su vez, marcarse para detección o, si se desea una mayor amplificación de la señal, los anticuerpos primarios pueden detectarse mediante anticuerpos secundarios, que también pueden incluirse en el kit.
También se contemplan kits para uso en investigación. Dichos kits pueden, por ejemplo, parecerse a kits destinados a usos de diagnóstico o terapéuticos, pero incluyen además una etiqueta que especifica que el kit y su uso están restringidos únicamente a fines de investigación.
Ejemplos
La divulgación se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos y la divulgación de ninguna manera debe interpretarse como limitada a estos ejemplos, sino que debe interpretarse para abarcar todas y cada una de las variaciones que se hacen evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento. En términos generales, la presente divulgación emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, química, bioquímica, biofísica, tecnología de ADN recombinante, inmunología e ingeniería de anticuerpos. Todas estas técnicas son de conocimiento común para alguien que trabaja en el mismo campo. Por supuesto, se apreciará que el listado específico o la descripción de equipos y reactivos particulares utilizados, tamaños, fabricante, etc., no deben considerarse limitantes de la divulgación actual, a menos que se indique específicamente. Se apreciará además que otros equipos y reactivos que funcionan de manera similar pueden sustituirse fácilmente.
Ejemplo 1: biMab representativos
La figura 1 es un diagrama esquemático de un biMab representativo de la descripción. El biMab es una proteína de unión biespecífica, bivalente para cada epítopo, en donde un dominio Fab que se une a un primer epítopo (unidad de enlace 1) está genéticamente unido a un dominio de unión que se une a un segundo epítopo, que se muestra aquí como un scFv (unidad de enlace 2), que luego está genéticamente vinculado a al menos una porción de un dominio Fc. La cadena pesada quimérica (que se muestra aquí con seis dominios y tres polipéptidos enlazadores interconectados; VH1 CH1 bisagra/enlazador superior (también denominado L1) scFv (se muestra aquí como VL2+enlazador+VH2) enlazador/ bisagra inferior (también denominada L2) Fc (que se muestra aquí que comprende Ch2 Ch3) puede expresarse como una molécula de cadena sencilla. El biMab también se compone de una cadena ligera convencional, que podría ser del isotipo kappa o lambda. También se contempla un biMab en donde las unidades de unión 1 y 2 se unen al mismo epítopo que tiene la monoespecificidad de un anticuerpo convencional, pero es tetravalente. El biMab puede poseer opcionalmente uno o más puentes disulfuro de intercadena nativos, en una o más de la cadena ligera, la cadena pesada o en una región de bisagra, como se muestra en esta representación. Sin embargo, un biMab de la presente divulgación no necesita contener ningún puente disulfuro intercadena y, en ciertos aspectos, no incluye ningún puente disulfuro intercadena. Para simplificar, solo la mitad del biMab representado en la Figura 1 está etiquetado esquemáticamente.
Para el biMab representativo representado en la Figura 1, también denominado en el presente documento "núcleo" de biMab, el dominio de unión (BD) que se une a un segundo epítopo (unidad de enlace marcada 2) es un scFv que se une al epítopo 2. Cuando un biMab incluye un scFv, como un scFv que se une a un segundo epítopo, el scFv puede estar en la orientación VH-enlace-VL, o en la orientación VL-enlace-VH. En ciertos aspectos, el scFv que sirve como unidad de enlace 2 está en la orientación VL-enlace-VH. Generalmente, el enlazador que interconecta las porciones VL y VH del scFv es un enlazador flexible, tal como un enlazador de glicina-serina. Los enlazadores adecuados, incluidos los enlazadores de glicina-serina adecuados son bien conocidos en la técnica. El scFv puede opcionalmente estabilizarse estructuralmente mediante la introducción de mutaciones estabilizadoras o mediante la introducción de enlaces disulfuro entre cadenas (que se muestra como un triángulo abierto en la Figura 1). Sin embargo, no se requieren mutaciones estabilizadoras y/o un enlace disulfuro intercadena introducido y, en ciertos aspectos, no está presente.
La primera unidad de enlace, que se representa en la Figura 1 como un dominio Fab que se une a un primer epítopo, está interconectada al scFv a través de un conector de polipéptido. Este enlazador de polipéptidos también se conoce como bisagra/enlazador superior o L1. Cuando el término "enlazador de polipéptidos" se usa para referirse a un enlazador de polipéptidos que interconecta la unidad de enlace 1 a la unidad de enlace 2 o la unidad de enlace 2 al dominio Fc, el término incluye polipéptidos que incluyen solo la secuencia de enlazador, solo la secuencia de bisagra, o ambos enlazadores y secuencia de bisagras. En ciertos aspectos, el dominio Fab está interconectado al extremo N de la unidad de enlace 2 (aquí, ya sea el VH o el VL de un scFv), utilizando un conector de polipéptido que comprende cisteínas (al menos una cisteína) que puede generar enlaces disulfuro intercadena. El C-terminal de la unidad de enlace 2 (aquí, ya sea el VH o el VL de un scFv) está interconectado al N-terminal del Ig bisagra-Fc usando un conector. Este conector puede ser de composición similar de la bisagra de Ig y puede tener cisteínas. Estas cisteínas pueden generar enlaces disulfuro entre cadenas.
El biMab presentado en la Figura 1 también comprende un dominio Fc que comprende al menos regiones CH2 y CH3. El dominio Fc puede estar glicosilado, como en el dominio Ch2 (mostrado en la Figura 1 como un círculo abierto), alternativamente, el dominio Fc puede estar desglicosilado o aglicosilado. Adicionalmente o alternativamente, el dominio Fc puede contener opcionalmente mutaciones estabilizantes, tales como enlaces disulfuro intracadena diseñados. El dominio Fc Ch3 puede contener o no mutaciones estabilizadoras o mutaciones que favorecen la heterodimerización. Además, el dominio Fc puede ser un dominio Fc variante, como se describe en este documento.
La Figura 2 proporciona información de secuencia de codificación de ácido nucleico e secuencia de aminoácidos para una cadena pesada quimérica biMab de ejemplo. Las porciones de la cadena pesada quimérica se presentan en las Figuras 2A y 2B. En la parte superior de la Figura 2A, la secuencia de ADN y proteína de la región VH1 se muestra esquemáticamente. Para cualquier biMab particular, esta secuencia correspondería al VH1 de la unidad de enlace particular uno, como el VH1 para un Fab particular. La Figura 2A proporciona entonces la secuencia de ADN y proteína para el dominio Ch1. Esto es seguido por la secuencia de ADN y aminoácidos para el conector de polipéptido 1 (L1) que interconectará el Fab y el BD en un biMab. L1 puede comprender una porción de bisagra y una porción de enlazador (bisagra/enlazador superior), y esto se representa en la Figura 2A. La Figura 2A representa primero la porción de bisagra de L1 (denotada como bisagra superior, en este caso bisagra superior de Ig1 humana). Nótese que la Figura 2A representa tres posibles aspectos de las porciones de bisagra para L1, denotadas como bisagra superior de IgG1 humana o bisagra superior de IgG1 humana modificada. Estas porciones de bisagra difieren en que la porción de bisagra modificada contiene una sustitución D a G inmediatamente después de la cisteína. La Figura 2A luego representa la porción del enlazador de L1, aquí un enlazador G4S. La secuencia de la bisagra humana completa se proporciona para comparación (SEQ ID NO: 9 y 10). La porción de bisagra superior y la porción de enlace forman juntas L1 (también denominada bisagra/enlace superior). Sin embargo, en ciertos aspectos, L1 incluye solo una porción de enlace o solo una porción de bisagra. La Figura 2B representa esquemáticamente la secuencia de ADN y proteína de la unidad de enlace 2, aquí un scFv, que puede estar en orientación VH2-enlace-VL2 o VL2-lenlace-VH2.
La secuencia de ADN y aminoácidos para el segundo conector de polipéptido (L2; también denominado conector/bisagra inferior) se representa en la Figura 2B. La parte de enlace de L2 se proporciona en la parte inferior de la Figura 2B. Como se muestra, esta parte del enlazador es un enlazador G4S. La porción de bisagra de L2 se representa en el medio de la Figura 2B (nótese que esta porción de bisagra se representa como bisagra inferior o variante de bisagra). La Figura 2B proporciona tres aspectos para la porción de bisagra de L2, la variante de bisagra de IgG1 humana y la bisagra inferior de IgG1 humana. Una porción de bisagra inferior y una porción de enlace forman juntas L2 (también denominado enlace/bisagra inferior). Sin embargo, en cierto aspecto, L2 incluye solo una porción de enlace o solo una porción de bisagra. La Figura 2C proporciona la secuencia de ADN y aminoácidos para los dominios Fc Ch2 y Ch3. Como se detalló anteriormente, los dominios Ch2 y Ch3 representados en la Figura 2C son de un IgG1, aunque podría generarse fácilmente un biMab usando el Fc de cualquier clase de Ig, incluidas IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluido IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Como se representa en la Figura 2A, un aspecto de una bisagra superior (presente como parte de L1) incluye la cisteína canónica de la bisagra superior IgG1 humana que participa en la formación de un puente disulfuro entre cadenas entre la cadena ligera y pesada en un Fab dominio. Esta cisteína está en negrita y subrayada en la Figura 2A. Esta cisteína también está presente en la bisagra superior modificada representada en la Figura 2A, aunque no está delimitada con un subrayado. Como se muestra en la Figura 2B, un aspecto de una región de bisagra inferior (presente como parte de L2) es una variante que tiene una mutación en la posición C220V de la UE para minimizar la codificación de disulfuro en la región de bisagra. Esta variante está en negrita y subrayada en la Figura 2B.
La figura 3 proporciona otra representación de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada quimérica para una representación esquemática de ejemplo de un biMab. Por supuesto, debe entenderse que la secuencia específica para el VH1 (dominio pesado variable 1 de la unidad de enlace 1) y la secuencia específica para el dominio de unión 2 (representado como un scFv en la orientación VH2-enlazador-VL2) no se proporcionan. Estas secuencias dependerán de las unidades de unión particulares que forman un biMab particular. Sin embargo, la posición relativa de las porciones de biMab entre sí se mantiene (por ejemplo, el formato biMab es el mismo, aunque las unidades de unión particulares varían).
En la Figura 3, L1 y L2 están subrayados y en cursiva, y las porciones de bisagra de L1 y L2 están en negrita. En el panel superior, la porción de bisagra de L1 corresponde a la bisagra superior de IgG1 humana, mientras que en el panel inferior la porción de bisagra de L1 corresponde a la bisagra superior de IgG1 humana modificada. En el panel superior, la porción de bisagra de L2 corresponde a la variante de bisagra inferior de IgG1 humana, mientras que en el panel inferior la porción de bisagra de L2 corresponde a la bisagra inferior de IgG1 humana. En cualquier caso, L1 interconecta la unidad de enlace 1 a la unidad de enlace 2, por ejemplo, interconectando el VH1 de la unidad de enlace 1 al VH2 de la unidad de enlace 2. L2 interconecta la unidad de enlace 2 a Fc, por ejemplo, interconectando el VL2 de enlace unidad 2 al dominio Ch2 de un Fc.
Se proporcionan representaciones esquemáticas adicionales de biMab en las Figuras 4 y 5. Estas figuras representan la posición relativa en la molécula de las porciones de bisagra de L1 y L2. Por ejemplo, en las Figuras 4A, 4B y 4C, se representa la posición relativa de la porción de bisagra de L1. L1 puede incluir además una porción de enlace, cuya secuencia no se muestra en la Figura 4A, 4B o 4C. Se proporcionan ejemplos de L1 que comprende además una porción de enlace en SEQ ID NO: 63, 64 y 65). Sin embargo, nótese que, cuando está presente, la porción de bisagra de L1 está interconectada directamente a la unidad de enlace 1 (por ejemplo, es contigua a una porción de la unidad de enlace 1) y la porción de enlace está interconectada directamente a la unidad de enlace 2 (por ejemplo, es contigua a una porción de la unidad de enlace 2). Debido a esta configuración, L1 también se conoce bisagra/enlazador superior. La porción de bisagra representada en la Figura 4B es una porción de bisagra modificada que tiene una mutación D221G, introducida para evitar la autoescisión espontánea relacionada con la bisagra. La secuencia de ADN y el residuo de aminoácido mutado se muestran en negrita, subrayados y en cursiva. La porción de la bisagra representada en la Figura 4C es una versión en corto que carece de los últimos tres aminoácidos de la bisagra proporcionada en la Figura 4A. A modo de ejemplo adicional, las Figuras 5A, 5B y 5C representan la posición relativa de la porción de bisagra de L2. L2 puede incluir además una porción de enlace adicional, cuya secuencia no se muestra en la Figura 5A o 5B. Sin embargo, nótese que, cuando está presente, la porción de bisagra de L2 está interconectada directamente al dominio Fc (por ejemplo, es contigua a una porción de un dominio Fc) y la porción enlazadora está interconectada directamente a la unidad de enlace 2 (por ejemplo, está contigua a una porción de la unidad de enlace 2). Debido a esta configuración, L2 también se conoce como enlazador/bisagra inferior. La porción de bisagra inferior representada en la Figura 5A es una bisagra modificada que tiene una mutación C220V, introducida para minimizar la codificación de disulfuro en la región de la bisagra. Se pueden usar dominios de bisagra inferiores alternativos representados en las Figuras 5B y 5C (es decir, una región de bisagra truncada) para evitar la escisión espontánea relacionada con la bisagra. Las porciones de bisagra específicas de L1 y L2 representadas en las Figuras 4 y 5 son meramente de ejemplo, y la descripción contempla el uso de estas, en cualquier combinación, así como el uso de ninguna porción de bisagra u otras porciones de bisagra.
Las Figuras 6A-C muestran la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas de la cadena ligera y la cadena pesada quimérica para un EGFR (dominio Fab) e IGF1R (dominio scFv) dirigido a biMab, donde la unidad de enlace a EGFR se deriva del anticuerpo monoclonal convencional Panitumumab y la unidad de enlace a IGF1R se derivan del anticuerpo monoclonal convencional Dalotuzumab. Este constructo biMab se conoce a lo largo de esta solicitud como biMab-EI (PaniX/Dalo). Este biMab específico contiene enlazadores de interconexión como se describe en la Figura 4-5. El dominio scFv dirigido a IGF1R está en la orientación VL-enlace-VH; el conector que conecta los dominios VL y VH tiene una longitud de 20 aminoácidos y está compuesto por glicina-glicina-glicina-glicina-serina repetida 4 veces. Los dominios VL y VH del scFv (VL2 y VH2 como se representa en las representaciones esquemáticas de biMab) contienen mutaciones VL-Cisteína 100 y VH-Cisteína44, que formarán un enlace disulfuro entre cadenas para estabilizar el scFv.
Las Figuras 7A-C muestran la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas de la cadena ligera y la cadena pesada quimérica para un biMab dirigido a VEGF (dominio Fab) y Ang2 (dominio scFv), donde la unidad de enlace a VEGF se deriva del anticuerpo monoclonal convencional Bevacizumab/Avastina y la unidad de enlace a Ang2 se derivan del anticuerpo monoclonal convencional denominado LC06. Este constructo biMab se conoce en toda esta solicitud como biMab-VA (Ava/LC06). Este biMab contiene enlazadores de interconexión como se describe en la Figura 4-5. El dominio scFv dirigido a Ang2 está en la orientación VL-enlace-VH; el conector que conecta los dominios VL y VH tiene una longitud de 20 aminoácidos y está compuesto por glicina-glicina-glicina-glicina-serina repetida 4 veces. Los dominios VL y VH del scFv (VL2 y VH2 como se representa en las representaciones esquemáticas de biMab) contienen mutaciones VL-Cisteina100 y VH-Cisteina44, que formarán enlaces disulfuro entre cadenas para estabilizar el scFv.
Las Figuras 8A-D muestran la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas de la cadena ligera y la cadena pesada quimérica para un biMab dirigido a Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PcrV (dominio Fab) y exopolisacárido Ps1 (dominio scFv), donde el PcrV la unidad de enlace se deriva del anticuerpo monoclonal convencional designado V2L2 y la unidad de enlace Ps1 se deriva del anticuerpo monoclonal convencional designado W4-RAD. Este constructo biMab se conoce en toda esta solicitud como Bs4-V2L2-2C. Este biMab contiene enlazadores de interconexión como se describe en las Figuras 4 y 5. El dominio scFv dirigido al exopolisacárido Ps1 está en la orientación VH-enlazador-VL; el conector que conecta los dominios VL y VH tiene una longitud de 20 aminoácidos y está compuesto por glicinaglicina-glicina-glicina-serina repetida 4 veces. Los dominios VL y VH del scFv (VL2 y VH2 como se representa en las representaciones esquemáticas de biMab) contienen mutaciones de cisteína, que formarán enlaces disulfuro entre cadenas para estabilizar el scFv.
Estos ejemplos específicos de biMab son ejemplos de polipéptidos bivalentes biespecíficos presentados en el formato biMab, como se describe en el presente documento. Ejemplos restantes informan los resultados de los experimentos realizados para evaluar los atributos estructurales y funcionales de estos biMab de ejemplo. Al hacerlo, las propiedades a menudo se comparan con las de los anticuerpos monoclonales parentales convencionales de los que se deriva cada unidad de enlace. En otras palabras, el biMab-EI específico descrito anteriormente puede compararse con los anticuerpos parentales convencionales panitumumab o dalotuzumab. Un biMab-EI específico también se puede comparar con otros anticuerpos convencionales que se unen a la misma diana o incluso al mismo epítopo, pero que no se usan para generar la unidad de enlace del biMab. De manera similar, el biMab-VA específico descrito anteriormente puede compararse con los anticuerpos parentales convencionales bevacizumab o LC06. Alternativamente, un biMab-VA específico también se puede comparar con otros anticuerpos convencionales que se unen a la misma diana o incluso al mismo epítopo. Además, las propiedades de estos ejemplos de biMab también se pueden comparar con los formatos de anticuerpos biespecíficos convencionales que se unen a las mismas dianas o incluso a los mismos epítopos.
Ejemplo 2: Estabilidad de biMab representativos
Los niveles de expresión transitoria, en mg/L, de biMab biMab-EI (PaniX/Dalo) y biMab-VA (Ava/LC06) representativos se analizaron después de 10 días de expresión en 293 células (Figura 9). Los niveles de expresión se determinaron usando un método de unión a proteína A. Más específicamente, los biMab que codifican el ADN se transfectaron en células HEK293F y/o CHO usando protocolos estándar. Las células transfectadas se cultivaron durante 10 días en medio Freestyle™ de Invitrogen. La expresión recombinante se determinó usando un ensayo de unión a proteína A. En resumen los medios de cultivo se cargaron automáticamente en una columna de proteína A usando un sistema de HPLC (Agilent 1100 Capillary LC System, Foster City, CA). El material no unido se lavó con una solución de regulador de fosfato de sodio 100 mM a pH 6.8, y los anticuerpos se eluyeron con ácido fosfórico al 0.1%, pH 1.8. El área correspondiente al pico eluido se integró y la concentración total de anticuerpos se determinó comparándola con un estándar de inmunoglobulina. Las concentraciones de los constructos purificados también se determinaron leyendo la absorbancia a 280 nm usando coeficientes de extinción determinados teóricamente. Después de la expresión de la proteína, los biMab se purificaron por afinidad usando cromatografía de afinidad de proteína A estándar usando la columna HiTrap rProteinA FF que se ha equilibrado en PBS 1X. Los biMab se cargaron en la columna y después de cargar la columna se lavó, para eliminar contaminantes y material no unido, con PBS 1X hasta que la traza A280 alcanzó la línea base. La proteína unida se eluyó luego en glicina 25 mM, pH 2.8. Las fracciones se neutralizaron inmediatamente mediante la adición de 0.1 volúmenes de regulador Tris-HCl 1M, pH 8. Se analizó el contenido de biMab en las fracciones leyendo su absorbancia a A280. La fracción que contenía los biMab deseados se agruparon y se dializaron durante la noche usando un corte de membrana de diálisis de 10.000 kiloDalton (kDa), a 4°C en un volumen 10X de PBS 1X.
Estos estudios indican que los biMab son capaces de unirse a la proteína A como los anticuerpos IgG convencionales. Aunque el nivel de expresión de este biMab-EI es inferior al nivel de expresión de este biMab-VA, la expresión observada es consistente con la observada para el anticuerpo convencional del que se deriva la unidad de enlace dos de biMab-EI.
Los biMab representativos utilizados en este estudio, se muestran esquemáticamente en las Figuras 6D y 7D. El biMab representado en la Figura 6D se denomina biMab-EI, y el ejemplo específico utilizado es biMab-EI (PaniX/Dalo). La porción Fab de este biMab (unidad de enlace 1) se une al EGFR (receptor de EGF) y el dominio de unión (unidad de enlace 2) es un scFv que se une al IGF1R (receptor de IGF1). Nótese que este biMab también incluye un conector de polipéptido (L1) que interconecta el Fab al scFv, y un conector de polipéptido (L2) que interconecta el scFv a una región Fc. El biMab representado en la Figura 7D se denomina biMab-VA, y el ejemplo específico utilizado es biMAb (Ava/LC06). La porción Fab de este biMab (unidad de enlace 1) se une a VEGF y el dominio de unión (unidad de enlace 2) es un scFv que se une a Ang2. Nótese que este biMab también incluye un conector de polipéptido (L1) que interconecta el Fab al scFv, y un conector de polipéptido (L2) que interconecta el scFv a una región Fc. La información de secuencia para estos ejemplos específicos de biMab se proporciona en las Figuras 6A, B, C, 7A, 7B y 7C.
Se usó cromatografía de exclusión por tamaño para determinar el contenido monomérico de los biMab representativos y se presenta en la Figura 9. La Figura 10 muestra los cromatogramas de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) para biMab-EI y biMab-VA después de la purificación de proteína A y diálisis en histidina-HCl 25 mM pH 6.
SEC-HPLC se llevó a cabo a 280 nm y a 25°C usando una columna TSK-GEL G3000SWXL (Tosoh Bioscience LLC, Montgomeryville, PA), que separa las proteínas globulares con un MW que varía de aproximadamente 10 a 500 kDa, con un regulador que contiene fosfato de sodio 100 mM, pH 6.8, y a un caudal de 1 ml/min. Un kit de calibración de filtración en gel de bajo peso molecular de Bio-Rad (Hercules, CA) que contiene vitamina B12 (11.350 Da), mioglobina equina (17.000 Da), ovoalbúmina de pollo (44.000 Da), gammaglobulina bovina (158.000 Da) y tiroglobulina (670.000 Da) se utilizó como patrones de masa molecular. Además, se usó una IgG monomérica al 99% altamente purificada como estándar de peso molecular de inmunoglobulina.
Como se muestra en la Figura 10, se obtuvo un alto nivel de contenido monomérico (>70%) después de la purificación de proteína A. El análisis SEC-HPLC muestra claramente que después de la purificación de la proteína A, biMab es predominantemente monomérico y monodisperso similar a los anticuerpos tradicionales.
Estas proteínas biMab-EI y biMab-VA representativas también se analizaron mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). La Figura 11 muestra los termogramas obtenidos utilizando DSC para biMab-EI (PaniX/Dalo) (Figura 11A) y para biMab-VA (Ava/LC06) (Figura 11B). Las temperaturas de transición correspondientes a los dominios biMab se muestran esquemáticamente (líneas negras en las Figuras 11A y B) y se han identificado superponiendo las transiciones de fusión para los respectivos anticuerpos convencionales de los que se derivaron las unidades de unión de estos biMab (por ejemplo, el anticuerpo anti-EGFR convencional (PaniX) y el anticuerpo anti-IGFIR convencional (Dalo) para biMab-EI; el anticuerpo anti-VEGF convencional (Ava) y el anticuerpo anti-Ang2 convencional (LC06) para biMab-VA). Los experimentos de calorimetría diferencial de barrido (DSC), como se muestra en la Figura 11A-B, a una velocidad de calentamiento de 1°C/min se llevaron a cabo utilizando un microcalorímetro de barrido ultrasensible Microcal VP-DSC (Microcal, Northampton, MA).
Se llevaron a cabo experimentos de DSC en histidina-HCl 25 mM, pH 6. Todas las soluciones y muestras usadas para DSC se filtraron usando un filtro de 0.22 micras y se desgasificaron antes de cargarlas en el calorímetro. Los dos biMab y los cuatro anticuerpos parentales que se usaron para los estudios de DSC fueron >99% monoméricos, según lo juzgado por la cromatografía analítica de filtración en gel realizada como se describió anteriormente. Para cada conjunto de mediciones, se obtuvieron primero al menos cuatro corridas de regulador versus línea de base. Inmediatamente después, la solución regulador se retiró de la celda de muestra y se cargó con aproximadamente 0.75 ml de muestra a una concentración de 1 mg/ml. Para cada medición, la celda de referencia se llenó con el regulador de muestra. En cada experimento de muestra versus regulador, se restó la corrida de referencia de regulador versus regulador correspondiente. Los datos en bruto se normalizaron para la concentración y la velocidad de exploración. El análisis de datos y la desconvolución se llevaron a cabo utilizando el software Origin™ DSC proporcionado por Microcal.
Estos datos proporcionados en las Figuras 11A y 11B muestran que los biMab de ejemplo tienen una alta termoestabilidad. De hecho, la transición de medición más baja para estos dos biMab de ejemplo es >60°C y la estabilidad del dominio es similar a la de sus respectivos brazos de anticuerpos parentales convencionales.
Los experimentos descritos en este ejemplo demuestran que el formato biMab es un formato de anticuerpo estable que puede expresarse en cantidades razonables que tienen un alto contenido monomérico y termoestabilidad comparable a los anticuerpos convencionales.
Ejemplo 3: Actividad de unión de biMab representativos
Estas proteínas biMab-EI y biMab-VA se analizaron para confirmar que, en formato biMab, estas unidades de unión retienen la capacidad de unirse a sus antígenos diana y que esta unión es comparable a sus respectivos anticuerpos parentales, en este ejemplo específico, EGFR e IGF1R para biMab-EI, y VEGF y Ang2 para biMab-VA. La Figura 12A muestra datos para la unión, medida por ELISA, de biMab-EI, el anticuerpo anti-EGFR parental convencional (PaniX) y el anticuerpo anti-IGF1 R parental convencional (Dalo). En los experimentos representados en el panel izquierdo de la Figura 12A, se evaluó la unión al EGFR inmovilizado. Como se esperaba, biMab-EI y el anticuerpo anti-EGFR parental convencional se unieron específicamente al EGFR inmovilizado, pero el anticuerpo anti-IGF1R parental convencional no lo hizo. De hecho, la unión del biMab y el anticuerpo anti-EGFR parental convencional fueron muy comparables, apoyando la conclusión de que el biMab retiene la propiedad de unión del anticuerpo anti-EGFR parental convencional. En los experimentos representados en el panel de la derecha de la Figura 12A, se evaluó la unión al IGFR1 inmovilizado. Como se esperaba, biMab-EI y el anticuerpo parental anti-IGFR1 convencional se unieron específicamente al IGFR1 inmovilizado, pero el anticuerpo parental anti-EGFR convencional no lo hizo. De hecho, la unión del biMab y el anticuerpo anti-IGFR1 parental convencional fueron muy comparables, apoyando la conclusión de que el biMab retiene la propiedad de unión del anticuerpo anti-IGFR1 parental convencional.
La Figura 12B muestra datos para la unión, medida por ELISA, de biMab-VA, el anticuerpo anti-VEGF parental convencional (Ava) y el anticuerpo anti-Ang2 parental convencional (LC06). En los experimentos representados en el panel izquierdo de la Figura 12B, se evaluó la unión al VEGF-165 inmovilizado. Como se esperaba, biMab-VA y el anticuerpo parental anti-VEGF convencional se unieron específicamente al VEGF-165 inmovilizado, pero el anticuerpo parental anti-Ang2 convencional no lo hizo. De hecho, la unión del biMab y el anticuerpo parental anti-VEGF convencional fue muy comparable, apoyando la conclusión de que biMab retiene la propiedad de unión del anticuerpo parental anti-VEGF convencional. En los experimentos representados en el panel de la derecha de la Figura 12B, se evaluó la unión a Ang2 inmovilizada. Como se esperaba, biMab-VA y el anticuerpo parental anti-Ang2 convencional se unieron específicamente a Ang2 inmovilizado, pero el anticuerpo parental anti-VEGF convencional no lo hizo. De hecho, la unión del biMab y el anticuerpo parental anti-Ang2 convencional fue muy comparable, apoyando la conclusión de que el biMab retiene la propiedad de unión del anticuerpo parental anti-An2 convencional.
En los ensayos de unión de ELISA anteriores, se recubrieron 2 pg/mL de cada antígeno diana (EGFR, IGF1R, VEGF165 y Ang2) en 30 pL de PBS, pH 7.4 en pozos de microtitulación durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pozos recubiertos con antígeno se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween-20 al 0.1% (v/v) y se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con BSA al 3%. Los biMab y los anticuerpos se diluyeron en serie en 30 pL de solución de bloqueo y se incubaron durante 2 horas a 37°C, seguido de lavados extensos con PBS que contenía Tween-20 al 0.1% (v/v). Los biMab y anticuerpos unidos se detectaron mediante anticuerpos secundarios anti-kappa conjugados con HRP (Figura 12A panel izquierdo), anti-humano-Fc (Figura 11A panel derecho y Figura 12A-B) y se visualizaron con 30 pL de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Pierce). La reacción se detuvo mediante la adición de 30 pl de ácido sulfúrico 0.18 M (Pierce). La absorbancia a 450 nm se midió usando un lector de placa de microtitulación. Los datos resultantes se analizaron utilizando el software Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA).
Ejemplo 4: Actividad de unión concurrente de biMab representativos
La figura 13 muestra la capacidad del biMab-EI (PaniX/Dalo) para unirse simultáneamente a sus dianas EGFR e IGF1R mediante ensayos BIAcore. El biMab-EI (PaniX/Dalo) se inmovilizó en el chip del sensor CM5 BIAcore (Figura 13A y B). La unión concurrente a EGFR e IGF1R está representada por el aumento en la unidad de respuesta (RU, eje Y en ambos gráficos que se muestran en la Figura 13). Ambos gráficos indican la inyección de EGFR e IGF1R, y la coinyección de las dos dianas. Se observó la unión concurrente de biMab-EI (PaniX/Dalo) a sus dianas independientemente del evento de inyección (por ejemplo, EGFR inyectado primero e IGFR1 inyectado segundo, como se muestra en el panel superior, o viceversa, como se muestra en el panel inferior) o formato de ensayo. Se observó una unión concurrente con IGF1R inyectado primero, seguido de una coinyección de EGFR e IGF1R (Figura 13A), y revertiendo esos eventos de inyección con EGFR inyectado primero, seguido de una coinyección de IGF1R y EGFR (Figura 13B).
La Figura 14 muestra la capacidad del biMab-VA (Ava/LC06) para unirse simultáneamente a sus dianas VEGF y Ang2. Para los experimentos resumidos en las Figuras 14A y 14B, el biMab-VA (Ava/LC06) se inmovilizó en el chip del sensor CM5 BIAcore. La unión concurrente a VEGF y Ang2 está representada por el aumento de la unidad de respuesta (RU, eje izquierdo en ambos gráficos mostrados en las Figuras 14A y B). Ambas gráficas indican la inyección de VEGF y Ang2, y la coinyección de los dos ligandos. Se observó la unión concurrente del biMab-VA (Ava/LC06) a sus dianas independientemente del evento de inyección (por ejemplo, VEGF inyectado primero y Ang2 inyectado segundo, como se muestra en el panel A, o viceversa, como se muestra en el panel B) o formato de ensayo. Se observó una unión concurrente con la inyección inicial de VEGF, seguida de una coinyección de Ang2 y VEGF (Figura 14A), y al revertir los eventos de inyección con Ang2 inyectada primero, seguida de una coinyección de Ang2 y VEGF (Figura 14B) .
Además, como se muestra en las Figuras 14C y D, la unión concurrente también se observa cuando una de las proteínas diana se inmoviliza en el chip sensor. En los experimentos representados en la Figura 14C, Ang2 se inmovilizó. En los experimentos representados en la Figura 14D, se inmovilizó VEGF. En ambos casos, se observó unión concurrente (representada por el aumento en la unidad de respuesta).
Para los resultados descritos en las Figuras 13 y 14, se midió la unión concurrente de los biMab usando el instrumento BIAcore 3000 (GE Healthcare). En resumen, se inmovilizaron diferentes células de flujo de un chip sensor CM5 con diferentes muestras de proteínas (en regulador de acetato 20 mM, pH 4.0) por acoplamiento de amina. Un anticuerpo de control de isotipo (IgG1) en celda de flujo-1, biMab-VA en celda de flujo-2, VEGF en celda de flujo-3 y Ang-2 en celda de flujo-4. Se preparó otro chip sensor CM5 inmovilizando el anticuerpo de control de isotipo (IgG1) en celda de flujo-1 y biMab-EI en celda de flujo-2. Los biMab y los antígenos (VEGF, Ang-2, EGFR-Fc, IGF1R) se diluyeron en el regulador de funcionamiento (HBS-EP - Hepes 10 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, ácido etilendiaminotetraacético 3 mM (EDTA) y 0.05% P20). La unión simultánea se determinó usando el procedimiento de "coinyección". La unión concurrente para biMab-EI se analizó utilizando el chip sensor CM5 con biMab-EI inmovilizado. Las inyecciones de analito estaban compuestas de EGFR seguido de una mezcla de EGFR e IGF1R (Figura 13A). El orden de las inyecciones de los antígenos se invirtió en el siguiente conjunto de experimentos (es decir, IGF1R seguido de una mezcla de IGF1R y EGFR) (Figura 13B). La unión concurrente para biMab-VA se realizó en las cuatro orientaciones posibles. En el primer experimento (Figura 14A), se midió la coinyección de VEGF y una mezcla de VEGF y Ang-2 en una superficie biMab-VA inmovilizada, mientras que en el segundo experimento (Figura 14B), se invirtió el orden de las inyecciones de antígeno. En el tercer experimento (Figura 14C), se midió la coinyección de biMab-VA y una mezcla de biMab-VA y VEGF en una superficie de Ang-2 inmovilizada. En el cuarto experimento (Figura 14D), se midió la coinyección de biMab-VA y una mezcla de biMab-VA y Ang-2 en una superficie de VEGF inmovilizada.
Ejemplo 5: Los biMab representativos se unen a FcRn
La capacidad de biMab representativos para unirse a FcRn se evaluó mediante análisis BIAcore. En resumen los biMab y el anticuerpo de control (10 pg/mL en regulador de acetato 20 mM pH 4.0) se inmovilizaron en un chip sensor CM5 mediante acoplamiento de amina para lograr los niveles de inmovilización deseados (~600 RU). Se intercambió regulador FcRn humano con el regulador en funcionamiento (fosfato de sodio 50 mM, pH 6.0) usando una columna de desalación HiTrap (GE lifesciences). Se inyectaron diluciones dobles de FcRn humano (30 pM-30 nM) sobre los anticuerpos inmovilizados para medir la unión de equilibrio durante 1 min a 30 pL/min. El analito se disoció del chip durante 5 minutos con regulador en ejecución. Cualquier FcRn restante se eliminó del chip con dos inyecciones de 60 segundos de PBS a pH 7.4. Los sensogramas se generaron y analizaron utilizando el software BiaEval versión 3.1. El equilibrio RU observado para cada inyección se trazó frente a la concentración de FcRn. Los valores de equilibrio Kd se obtuvieron mediante el análisis de las gráficas utilizando el modelo de afinidad de estado estacionario incluido en el software BiaEval.
La Figura 15 muestra la Kd para la unión de FcRn de biMab-EI (PaniX/Dalo) y biMab-VA (Ava/LC06), según lo determinado por BIAcore. También se muestra el Kd para la unión de FcRn para un anticuerpo parental representativo (PaniX, anti-EGFR). Como se muestra en la Figura 15, ambos biMab conservan la capacidad de unirse a FcRn, y dicha unión es similar a la de un anticuerpo convencional parental. Las diferencias en la Kd observada están dentro del error estándar de BIAcore normal.
Ejemplo 6: biMab representativos se unen a C1q
La capacidad de los biMab representativos para unirse a C1q se evaluó mediante ELISA. En resumen cinco microgramos por mililitro (30 pl/pozo) de biMab o anticuerpo anti-EGFR o BSA se revistieron en placas ELISA (Costar 3690) durante la noche en PBS (número de catálogo Invitrogen 20012). Las placas ELISA se lavaron 5 veces con PBST (1X PBS pH 7.2, 0.1% Tween-20) y se bloquearon con 150 pl de BSB-PBST (3% BSA (número de catálogo Sigma A2153), 50% Superblock (número de catálogo Thermo Scientfic 37515) en PBST durante 1 hora a 37°C. Se añadió una dilución doble de C1q humano (número de catálogo de Cell Sciences CRC 162B) a partir de 100 pg/ml en BSB-PBST (30 pl/pozo) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, las placas ELISA se lavaron 5 veces con PBST y se añadieron 30 pl de 1 pg/ml de C1q de oveja antihumano (número de catálogo SC1Q-80A de Immunology Consultants Lab) en BSB-PBST. Las placas ELISA se lavaron de nuevo 5 veces con PBST y se añadieron 30 pl de dilución 1:2500 de HRP anti-oveja/cabra de Asno (número de catálogo SeroTec Star88P) en BSB-PBST. Las placas se lavaron finalmente 5 veces con PBST y se desarrollaron con (30 pl/pozo) TMB (número de catálogo KPL 53-0-03) durante 5 minutos; después de lo cual, se agregaron 30 pl de HCl 0.2 N para detener la reacción. Los datos se trazaron utilizando el software Prism 5.
Como se muestra en la Figura 16, biMab-EI (PaniX/Dalo) y biMab-VA (Ava/LC06) se unen a C1q, y la unión tiene una afinidad similar a la de uno de los anticuerpos parentales convencionales representativos anti-EGFR (PaniX), que también sirve como control positivo. Estos datos respaldan la conclusión de que el formato biMab conserva la capacidad de mediar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), de manera similar a los anticuerpos convencionales.
Ejemplo 7: El biMab representativo retiene la actividad de destrucción celular observada para sus anticuerpos parentales convencionales
La Figura 17 muestra los resultados de un ensayo de destrucción celular que implica: (i) biMab-EI (PaniX/Dalo), o (ii) la combinación del anticuerpo parental anti-EGFR convencional (anticuerpo PaniX) y el anticuerpo parental anti-IGFIR convencional IGFIR (anticuerpo Dalo), o (iii) el anticuerpo anti-EGFR convencional parental solo (PaniX) solo, o (iv) el anticuerpo anti-IGFIR convencional parental (Dalo) solo, o (v) un anticuerpo de control negativo de isotipo. Las células utilizadas para este ensayo de citotoxicidad fueron H358 (células de adenocarcinoma de pulmón humano no pequeño que expresan los receptores EGFR e IGF1R; número de catálogo ATCC CRL-5807). Las células H358 se sembraron a 50.000 células por pozo en una placa de 96 pozos (número de catálogo Costar 3788) en 120 pl de medio de cultivo celular completo (1X RPMI 1640 número de catálogo Gibco 11875 10% Hi FBS Gibco número de catálogo 25300). Se hicieron diluciones en serie de cada anticuerpo en medio de cultivo celular a una concentración final 5X a partir de 200 nM. Se añadieron 30 pl/pozo de los anticuerpos diluidos a la placa de ensayo y se incubaron a 37°C, 95% de humedad durante 72 h. Se añadió reactivo de ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo® (número de catálogo Promega G7571) equilibrado a temperatura ambiente (120 pl/pozo) a las placas de ensayo, seguido de una suave mezcla e incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, se midió la luminiscencia del ATP utilizando el lector de multiples etiquetas Envision 2014 siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo® es un método homogéneo para determinar el número de células viables en cultivo basado en la cuantificación del ATP presente, lo que indica la presencia de células metabólicamente activas.
Como se muestra en la Figura 17, biMab-EI (PaniX/Dalo) destruyó las células H358 (representadas como una disminución en el porcentaje de células viables) a un nivel similar al del tratamiento combinado con ambos anticuerpos convencionales parentales (PaniX (anti-EGFR) Dalo (anti-IGF1R)). Estos resultados indican que el formato biMab conserva la función de cada uno de los anticuerpos convencionales de los que se deriva.
Ejemplo 8: Los biMab representativos retienen la actividad funcional para inhibir el ligando diana
La Figura 18 muestra la inhibición de la fosforilación de Tie2 (receptor natural de Ang2) (Figura 18A) y la inhibición de la fosforilación de VEGFR2 (receptor natural de VEGF) por biMab-VA (Figura 18B).
La capacidad de los anticuerpos de control negativo biMab-VA, anti-Ang2 (LC06) e isotipo negativo para unir Ang2 humana y bloquear la fosforilación del receptor Tie2 mediada por Ang2 se determinó usando el siguiente procedimiento. Las líneas celulares HEK293 transfectadas de manera estable que expresan el receptor Tie2 humano de longitud completa se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10% y puromicina 2 pg/ml a 37°C y CO2 al 5% utilizando placas de cultivo de 96 pozos (placas de cultivo de tejido de unión a células Corning forma Sigma-Aldrich) y luego suero privado de nutrientes durante 18 horas. Las células se estimularon durante 25 minutos en presencia de Ang2 recombinante humana purificada (número de catálogo de R&D Systems 623-AN-CF; Ang2 reconstituido a una solución madre de 3.6 pg/mL en PBS), preincubado con biMab-VA, anti-Ang2 (LC06) o anticuerpos isotípicos de control negativo. Las mezclas de anticuerpos y Ang2 se añadieron a las células y se diluyeron en serie a partir de una solución de 120 nM. Luego, las células se sometieron a lisis con 40 pL de regulador de lisis helado (7 ml de regulador de lisis RIPA, 1 tubo de inhibidor de detención, benzonasa -Thermo Scientific-), y los niveles de fosforilación de tirosina 992 del receptor Tie2 se determinaron a partir de lisados de células enteras mediante el uso de Meso Scale Discovery con el anticuerpo Tie2 total de ratón (número de catálogo Abcam ab24859) para la captura y un anticuerpo específico de conejo (número de catálogo de R&D Systems AF2720) para la detección.
Como se muestra en la Figura 18A, la inhibición de la fosforilación de Tie2 mediada por Ang2 es similar tras la adición de biMab-VA (Ava/LC06, IC50 1.79 nM) o su anticuerpo parental anti-Ang2 convencional (LC06, IC50 1.72 nM). El anticuerpo de control de isotipo negativo no inhibe la fosforilación mediada por Ang2 de Tie2. Este experimento revela que el biMab-VA (Ava/LC06) inhibe funcionalmente Ang2. Los valores de IC50 (media concentración inhibitoria máxima) en nM se presentan esquemáticamente. Como se muestra, biMab-VA (Ava/LC06) y su anticuerpo parental convencional anti-Ang2 (LC06) tienen una IC50 similar.
La capacidad de biMab-VA, anticuerpo anti-VEGF y anticuerpos de control negativo de isotipo para inhibir la fosforilación de VEGFR2 mediada por VEGF se determinó usando el siguiente procedimiento. El receptor VEGFR humano (hVEGFR2) se expresó de forma recombinante y estable en células AD293, que se cultivaron en medio DMEM con FBS al 10% (Invitrogen). Las células se sembraron a 15000 células por pozo en 100 pl de medio, usando placas de cultivo de tejido de unión a células de fondo plano Corning de 96 pozos (Sigma-Aldrich). Después de 24 horas de crecimiento, el medio se eliminó sin ningún tipo de lavado y se añadió medio de "inanición", 50 pl/pozo, compuesto de DMEM FBS al 0.2% BSA al 0.1% (Sigma-Aldrich). Las células fueron incubadas durante la noche. El medio se retiró de cada pozo y se añadieron a las células 50 pl de VEGF165 humano 4 nM (número de catálogo Peprotech 100­ 20) preparado en medio privado de nutrientes, seguido de una incubación de 30 minutos a 4°C. Al mismo tiempo, también se añadieron biMab-VA, anti-VEGF (Ava) y los anticuerpos de control negativo de isotipo y se diluyeron en serie a partir de 200 pg/ml. Luego se incubaron las células durante 7 minutos a 37°C, se retiraron los medios y no se realizó ninguna etapa de lavado. Luego, las células se sometieron a lisis con 40 pL de regulador de lisis helado (7 ml de regulador de lisis RIPA, 1 tubo de inhibidor de detención, benzonasa -Thermo Scientific-), y se determinó la fosforilación del VEGFR2 utilizando el kit de ensayos Meso Scale Discovery (catálogo MSD número K151DJD-2). Este kit proporciona componentes específicos del ensayo para la determinación cuantitativa de fosfo-VEGFR-2 (Tyr1054) en lisados de células enteras humanas.
Como se muestra en la Figura 18B, la inhibición de la fosforilación de VEGFR2 mediada por VEGF es similar tras la adición de biMab-VA (Ava/LC06, IC504.58 nM) y su anticuerpo anti-VEGF convencional parental (Ava, IC504.78 nM). El anticuerpo de control de isotipo negativo no inhibe la fosforilación mediada por VEGF de pVEGFR2. Este experimento revela que el biMab-VA (Ava/LC06) inhibe funcionalmente el VEGF. Los valores de IC50 (media concentración inhibitoria máxima) en nM se presentan esquemáticamente. Como se muestra, biMab-VA (Ava/LC06) y su anticuerpo parental convencional anti-VEGF (Ava) tienen una IC50 similar.
Ejemplo 9: El contenido de monómero homogéneo de biMab representativos se mantiene a concentraciones crecientes
La Figura 19 demuestra que los biMab representativos pueden concentrarse sin un impacto perjudicial en el contenido de monómero. En resumen las proteínas biMab se purificaron hasta un alto contenido monomérico usando proteína A y medios de cerámica de hidroxiapatita tipo II siguiendo las recomendaciones del fabricante (número de catálogo BioRad 158-2200) y se analizaron por SEC-HPLC en regulador de funcionamiento estándar (fosfato de sodio 0.1 mM, sulfato de sodio 0.1 mM pH 6.8). Las proteínas monoméricas purificadas se dializaron durante la noche en Histidina-HCl 25 mM pH 6 y se analizaron nuevamente por HPLC-SEC en regulador de análisis estándar para el porcentaje monomérico de preconcentración. Los biMab se concentraron luego a menos de un mililitro usando Vivaspin 20, 100 kDa MWCO (número de catálogo de atención médica de GE 28-9323-63) a 1455 x g y la concentración se determinó leyendo el valor de absorbancia A280 nm y usando una capacidad de absorción molar de 1.4. El material concentrado se filtró utilizando filtros de jeringa de 0.22 micras y se inspeccionó visualmente para detectar presencia de partículas y se corrigió a 25 mg/mL. Se analizó una alícuota de 250 microgramos de proteína de la solución de 25 mg/ml por HPLC-SEC usando el regulador estándar para determinar el porcentaje monomérico después de la concentración. Se llevó a cabo SEC-HPLC como se describe en el Ejemplo 2 anterior.
Las concentraciones iniciales y finales se muestran en mg/mL. La concentración inicial de cada biMab formulado se presenta en la mitad superior de la tabla presentada en la Figura 19, junto con el contenido de monómero (%) observado a esa concentración inicial. A estas concentraciones iniciales, el contenido de monómero fue superior al 99%. La preparación final más concentrada de cada biMab formulado a 20 mg/mL se presenta en la mitad inferior de

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína que comprende:
un brazo Fab que se une a un primer epítopo,
un dominio de unión (BD) que se une a un segundo epítopo, y
una región Fc que comprende dominios CH2 y CH3;
en donde la proteína comprende una cadena pesada quimérica que comprende los siguientes dominios de polipéptidos, desde el extremo N al extremo C
VH1-CH1-L1 -BD-L2-Fc-L2-BD-L1 -CH1-VH1;
en donde VH1 comprende el dominio variable de la cadena pesada del Fab, CH1 comprende el dominio constante de la cadena pesada 1 del Fab, L1 comprende el primer polipéptido conector, BD comprende un scFv, L2 comprende el segundo polipéptido conector y Fc comprende un CH2 y un dominio CH3 y en donde la proteína es bivalente para unirse a cada uno de los epítopos primero y segundo, y en donde el L1 comprende la secuencia de aminoácidos EPKSCDKT (SEQ ID NO: 4) o EPKSCGKT (SEQ ID NO: 6) o EPKSC (SEQ ID NO: 38) y/o en donde el L2 comprende la secuencia de aminoácidos EPKSVDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 12) o DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 40).
2. La proteína de la reivindicación 1, en donde el L1 comprende además una porción enlazadora que comprende un péptido Gly-Ser y/o en donde el L2 comprende además una porción enlazadora que comprende un péptido Gly-Ser.
3. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la región Fc se selecciona del grupo que consiste en una región Fc de una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE e IgD.
4. La proteína de la reivindicación 3 en donde la región Fc:
a) comprende una región Fc variante; o
b) está aglicosilado o desglicosilado; o
c) tiene fucosilación reducida o está afucosilado; o
d) comprende una región Fc variante y está aglicosilada o desglicosilada; o
e) comprende una región Fc variante y tiene fucosilación reducida o está afucosilada.
5. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el primer y segundo epítopos son diferentes o en donde el primer y segundo epítopos son iguales.
6. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el brazo Fab y/o la región Fc comprenden además al menos una unidad de enlace, opcionalmente en donde:
a) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la cadena pesada quimérica;
b) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la cadena ligera; c) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la cadena pesada, y al menos una unidad de enlace está interconectada al extremo N-terminal y/o C-terminal de la luz cadena; d) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y C-terminal de la cadena pesada, y/o al menos una unidad de enlace está interconectada al extremo N-terminal y C-terminal de la cadena ligera; o e) la al menos una unidad de enlace está interconectada en el extremo N-terminal y C-terminal de la cadena pesada, y al menos una unidad de enlace está interconectada al extremo N-terminal y C-terminal de la cadena ligera.
7. La proteína de la reivindicación 6, en donde la al menos una unidad de enlace está interconectada al brazo Fab y/o Fc a través de un conector de polipéptido.
8. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde cada unidad de enlace es un scFv que comprende un dominio VH, un conector de polipéptido y un dominio VL.
9. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde:
a) el dominio Fab está interconectado a través del L1 a un N-terminal del dominio VH del scFv y/o la región Fc está interconectada a través del L2 a un C-terminal del dominio VL del scFv; o
b) el dominio Fab está interconectado a través del L1 a un N-terminal del dominio VL del scFv y/o la región Fc está interconectada a través del L2 a un C-terminal del dominio VH del scFv.
10. La proteína de la reivindicación 9, en donde el dominio VL del scFv tiene una cisteína en la posición Kabat 100 y/o el dominio VH del scFv tiene una cisteína en la posición Kabat 44.
11. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde las unidades de unión se unen cada una a diferentes epítopos o en donde dos o más unidades de unión se unen cada una a los mismos epítopos.
12. La proteína de la reivindicación 11, en donde al menos una unidad de enlace no se une al primer epítopo y/o al segundo epítopo.
13. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el primer epítopo se selecciona del grupo que consiste en EGFR, IGFR1, VEGF, angiopoyetina-2 (Ang2), exopolisacárido (Ps1) y Pseudomonas aeruginosa (Per V).
14. Una composición que comprende la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 -13 formulada en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 -13.
16. Una célula huésped aislada que comprende un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 15.
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