MX2014005566A - Terapias de combinacion que usan moleculas de union anti-psl y pcrv de pseudomonas. - Google Patents

Abstract

Terapias de combinación que comprenden moléculas de unión anti-Psl y PcrV de Pseudomonas y composiciones relacionadas, para usar en la prevención y tratamiento de infección por Pseudomonas.

Description

TERAPIAS DE COMBINACION QUE USAN MOLECULAS DE UNION ANTI-PSL Y PCRV DE PSEUDOMONAS Campo de la Invención Esta descripción se relaciona con terapias de combinaciones que usan dominios de unión a Psl y PcrV anti-Pseudomonas para usarse en la prevención y tratamiento de infección por Pseudomonas. Adicionalmente, la descripción provee composiciones útiles en las terapias.

Antecedentes de la Invención La Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es un patógeno oportunista gram negativo que provoca infecciones agudas y crónicas en individuos comprometidos (Ma y col . , Journal of Bacteriology 189 (22) : 8353-8356 (2007)) . Esto es debido parcialmente a la alta resistencia innata de la bacteria a antibióticos usados clínicamente, y parcialmente debido a la formación de biopelículas altamente resistentes a antibióticos (Drenkard E . , Microbes Infect 5:1213-1219 (2003); Hancock & Speert, Drug Resist Update 3:247-255 (2000)).

La P. aeruginosa es una causa común de infecciones adquiridas en los hospitales en el mundo occidental. Es un agente causal frecuente de bacteremia en víctimas quemadas e individuos inmunocomprometidos (Lyczak y col., Microbes Infect 2:1051-1060 (2000)) . También es la causa más común de neumonía nosocomial con gram negativos (Craven y col., Semin Ref. 248286 Respir Infect 11:32-53 (1996)), especialmente en pacientes ventilados mecánicamente, y es el patógeno más prevalente en los pulmones de individuos con fibrosis quística (Pier y col., ASM News 5:339-347 (1998)).

El exopolisacárido Psl de Pseudomonas se informa que se encuentra anclado en la superficie de P. aeruginosa y por lo tanto es importante en la colonización de tejidos huéspedes y en el establecimiento/mantenimiento de la formación de biopelículas (Jackson, K.D., y col., J Bacteriol 186, 4466-4475 (2004)). Su estructura comprende pentasacárido con repeticiones ricas en mañosa (Byrd, M.S., y col., Mol Microbiol 73, 622-638 (2009)).

El PcrV es un componente relativamente conservado del sistema de secreción tipo III. El PcrV parece ser un componente integral del aparato de translocación del sistema de secreción tipo III que media el direccionamiento de toxinas secretorias tipo III a las células eucarióticas blanco (Sawa T. , y col. Nat . Med. 5, 392-398 (1999)). La inmunización activa y pasiva contra PcrV mejoró el daño pulmonar agudo y mortalidad de ratones infectados con P. aeruginosa citotóxica (Sawa y col. 2009). El principal efecto de la inmunización contra PcrV fue debido al bloqueo de la translocación de las toxinas secretorias tipo III a células eucarióticas .

Debido a la resistencia multidrogas en aumento, hay una necesidad en el arte por el desarrollo de estrategias novedosas para la identificación de nuevos agentes profilácticos y terapéuticos específicos por Pseudomonas.

Breve Descripción de la Invención La descripción provee una molécula de unión o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas, el cual comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende SYAMN (SEQ ID NO: 218), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; una CDR2 de cadena pesada que comprende AITISGITAYYTDSVKG (SEQ ID NO: 219), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; y una CDR3 de cadena pesada que comprende EEFLPGTHYYYGMDV (SEQ ID NO: 220), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; (b) una CDR1 de cadena liviana que comprende RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 221) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; una CDR2 de cadena liviana que comprende SASTLQS (SEQ ID NO: 222) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; y una CDR3 de cadena liviana que comprende LQDYNYPWT (SEQ ID NO: 223), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; o combinaciones de (a) y (b) . En una modalidad, la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma se une específicamente a PcrV de Pseudomonas, y comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SYAMN (SEQ ID NO: 218) , una CDR2 de cadena pesada que comprende AITISGITAYYTDSV G (SEQ ID NO: 219) , y una CDR3 de cadena pesada que comprende EEFLPGTHYYYGMDV (SEQ ID NO: 220); y (b) una CDRl de cadena liviana que comprende RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 221) , una CDR2 de cadena liviana que comprende SASTLQS (SEQ ID NO: 222) , y una CDR3 de cadena liviana que comprende LQDYNYPWT (SEQ ID NO: 223) . En una modalidad, la molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígeno de la misma específicamente se une a PcrV de Pseudomonas y comprende (a) una región variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 216; (b) una región variable de cadena liviana que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 217; o combinaciones de (a) y (b) . En otra modalidad, la molécula de unión o fragmento de la misma comprende: (a) una región variable de cadena pesada que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 216; (b) una región variable de cadena liviana que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 217; o combinaciones de (a) y (b) . En otra modalidad, la molécula de unión o fragmento de la misma es V2L2 y comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 216; y (b) una región variable de cadena liviana que comprende SEQ ID NO: 217.

En una modalidad, la descripción provee una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente al mismo epítopo de PcrV de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las regiones VH y VL de V2L2. En otra modalidad, la descripción provee una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas, e inhibe competitivamente a la unión de PcrV de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH y VL de V2L2. En una modalidad, la molécula de unión o fragmento de la misma es un anticuerpo recombinante . En una modalidad, la molécula de unión o fragmento de la misma es un anticuerpo monoclonal . En una modalidad, la molécula de unión o fragmento de la misma es un anticuerpo quimérico. En una modalidad, la molécula de unión o fragmento de la misma es un anticuerpo humanizado. En una modalidad, la molécula de unión o fragmento de la misma es un anticuerpo de humano. En una modalidad, la molécula de unión o fragmento de la misma es un anticuerpo biespecífico .

En una modalidad, la molécula de unión o fragmento de la misma inhibe el direccionamiento de las toxinas secretorias tipo III a las células blanco.

En una modalidad, la descripción provee un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio de unión que se une a Psl de Pseudomonas y un dominio de unión que se une a PcrV de Pseudomonas. En una modalidad, el dominio de unión a Psl comprende un fragmento scFv y el dominio de unión a PcrV comprende una inmunoglobulina intacta. En una modalidad, el dominio de unión a Psl comprende una inmunoglobulina intacta y el dominio de unión a PcrV comprende un fragmento scFv. En una modalidad, el scFv está fusionado al amino terminal de la región VH de la inmunoglobulina intacta. En una modalidad, el scFv está fusionado al carboxilo terminal de la región CH3 de la inmunoglobulina intacta. En una modalidad, el scFv está insertado en la región bisagra de la inmunoglobulina intacta.

En una modalidad, el anti -dominio de unión a Psl se une específicamente al mismo epítopo de Psl de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena liviana (VL) al menos 90% idéntica a la correspondiente región de WapR-004. En una modalidad, el anti-dominio de unión a Psl se une específicamente a Psl de Pseudomonas, e inhibe competitivamente la unión de Psl de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región VH y VL al menos 90% idéntica a la correspondiente región de WapR-004. En una modalidad, las VH y VL de WapR-004 comprenden la SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente. En una modalidad, la secuencia WapR-004 se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229 y SEQ ID NO: 235. En una modalidad, el anti-PcrV dominio de unión se une específicamente al mismo epítopo de PcrV de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las regiones VH y VL de V2L2. En una modalidad, el dominio de unión anti-PcrV se une específ camente al PcrV de Pseudomonas, e inhibe competitivamente la unión a PcrV de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH y VL de V2L2. En otra modalidad, el dominio de unión anti-PcrV se une específicamente al mismo epítopo de PcrV de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región VH y VL al menos 90% idéntica a la correspondiente región de V2L2. En una modalidad, las VH y VL de V2L2 comprenden la SEQ ID NO: 216 y SEQ ID NO: 217, respectivamente. En una modalidad, las VH y VL de WapR-004 (SEQ ID NOs:ll y 12, respectivamente) y las VH y VL de V2L2 (SEQ ID NOs : 216 y 217, respectivamente) . En una modalidad, el anticuerpo biespecífico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229 y SEQ ID NO: 235.

En una modalidad, la descripción provee un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216 o SEQ ID NO: 217. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo.

En una modalidad, la descripción provee una célula que comprende o produce la molécula de unión o polipéptido descrito en la presente.

En una modalidad, la descripción provee una molécula polinucleotídica aislada que comprende un polinucleotido que codifica para una molécula de unión o polipéptido descrito en la presente. En una modalidad, la molécula polinucleotídica comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:238 y SEQ ID NO:239. En otra modalidad, la descripción provee un vector que comprende un polinucleotido descrito en la presente. En otra modalidad, la descripción provee una célula que comprende un polinucleotido o vector.

En una modalidad, la descripción provee una composición que comprende una molécula de unión, anticuerpo biespecífico, o polipéptido descrito en la presente y un transportador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la descripción provee una composición que comprende un dominio de unión que se une a Psl de Pseudomonas y un dominio de unión que se une a PcrV de Pseudomonas . En una modalidad, el anti -dominio de unión a Psl se une específicamente al mismo epítopo Psl de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena liviana (VL) al menos 90% idéntica a la correspondiente región de WapR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003 o WapR-016. En una modalidad, el anti-dominio de unión a Psl se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe competitivamente la unión a Psl de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región VH y VL al menos 90% idéntica a la correspondiente región de WapR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003 o WapR-016. En una modalidad, las VH y VL de WapR-004 comprenden las SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente, las VH y VL de Cam-003 comprenden las SEQ ID NO:l y SEQ ID NO : 2 , respectivamente, las VH y VL de Cam-004 comprenden las SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO : 2 , respectivamente, las VH y VL de Cam-005 comprenden las SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO : 2 , respectivamente, las VH y VL de WapR-001 comprenden las SEQ ID NO : 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente, las VH y VL de WapR-002 comprenden las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, las VH y VL de WapR-003 comprenden las SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente y las VH y VL de WapR-016 comprenden las SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En una modalidad, el anti-PcrV dominio de unión se une específicamente al mismo epítopo de PcrV de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las regiones VH y VL de V2L2. En una modalidad, el anti-PcrV dominio de unión se une específicamente a PcrV de Pseudomonas e inhibe competitivamente la unión a PcrV de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las VH y VL de V2L2. En una modalidad, el anti-PcrV dominio de unión se une específicamente al mismo epítopo de PcrV de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región VH y VL al menos 90% idéntica a la correspondiente región de V2L2. En una modalidad, las VH y VL de V2L2 comprenden las SEQ ID NO: 216 y SEQ ID NO: 217, respectivamente. En una modalidad, el anti-dominio de unión a Psl comprende las regiones VH y VL de WapR-004 y el anti-dominio de unión a PcrV comprende las regiones VH y VL de V2L2 o fragmentos de unión a antígeno del mismo.

En una modalidad, la composición comprende una primera molécula de unión que comprende el anti-dominio de unión a Psl y una segunda molécula de unión que comprende un dominio de unión a PcrV. En una modalidad, la primera molécula de unión es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y la segunda molécula de unión es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: monoclonal, humanizado, quimérico, humano, Fragmento Fab, Fragmento Fab' , fragmento F(ab)2 y fragmento scFv. En una modalidad, los dominios de unión, moléculas de unión o fragmentos de las mismas, se unen a dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más serotipos diferentes de P. aeruginosa. En una modalidad, los dominios de unión, moléculas de unión o fragmentos de las mismas, se unen a al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de las cepas de P. aeruginosa aisladas de pacientes infectados. En una modalidad, las cepas de P. aeruginosa son aisladas de uno o más de pulmón, esputo, ojo, pus, heces, orina, senos, una herida, piel, sangre, hueso o fluido de rodilla. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la misma es conjugado a un agente seleccionado del grupo que consiste en agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de respuesta biológica, agente farmacéutico, una linfoquina, un anticuerpo heterólogo o fragmento del mismo, una marca que se puede detectar, polietilenglicol (PEG) y una combinación de dos o más de cualquiera de los mencionados agentes. En una modalidad, la marca que se puede detectar se selecciona del grupo que consiste en una enzima, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente , una marca bioluminiscente , una marca radiactiva o una combinación de dos o más de cualquiera de las mencionadas marcas que se pueden detectar.

En una modalidad, la descripción provee un método para prevenir o tratar una infección por Pseudomonas en un sujeto que necesita del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición descrita en la presente, en donde la administración provee un efecto terapéutico sinérgico en prevención o tratamiento de la infección por Pseudomonas en el sujeto y en donde el efecto sinérgico es mayor que la suma de los efectos individuales de la administración de cantidades molares iguales de los dominios de unión individuales. En una modalidad, el efecto terapéutico sinérgico da como resultado una mayor supervivencia porcentual que la supervivencia porcentual sumada de sujetos a los cuales se les ha administrado solo uno de los dominios de unión. En una modalidad, la composición se administra durante dos o más ciclos de prevención/tratamiento. En una modalidad, los dominios de unión o moléculas de unión se administran simultáneamente. En una modalidad, los dominios de unión o moléculas de unión se administran secuencialmente . En una modalidad, la infección por Pseudomonas es una infección por P. aeruginosa . En una modalidad, el sujeto es un humano. En una modalidad, la infección es una infección ocular, una infección pulmonar, una infección de quemadura, una infección de herida, una infección de la piel, una infección de la sangre, una infección de hueso o una combinación de dos o más de las infecciones. En una modalidad, el sujeto tiene neumonía aguda, daño por quemadura, infección de la córnea, fibrosis quística o una combinación de los mismos.

En una modalidad, la descripción provee un método para prevenir o tratar una infección por Pseudomonas en un sujeto que necesita del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la molécula de unión o fragmento del mismo, un anticuerpo biespecífico, un polipéptido o a composición descrito en la presente.

En una modalidad, la descripción provee un conjunto de elementos que comprende una composición descrito en la presente .

Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A, IB, 1C, ID, 1E, y 1F: El tamizaje fenotípico de célula entera con bibliotecas de fagos para anticuerpos humanos identificó anticuerpos específicos por P. aeruginosa funcionalmente activos, (fig. 1A) Vista general de la estrategia de selección de anticuerpo, (fig. IB) Diagrama de flujo que describe el proceso para aislar genes de la región variable del anticuerpo de pacientes recientemente expuestos a P. aeruginosa. (fig. 1C) Características de las bibliotecas de expresión en fago scFv, que indican el tamaño y diversidad del repertorio de anticuerpos clonados, (fig. ID) Comparación de la eficacia de selección de expresión en fagos usando la biblioteca de anticuerpos del paciente o una biblioteca de anticuerpo naive, cuando se selecciona en P. aeruginosa 3064 ? WapR (x) o P. aeruginosa PAOl MexAB OprM ? WapR (2) en suspensión. Las barras indican los títulos de salida (en CFU) en cada ronda de selección y los círculos indican la proporción de secuencias de CDR3 de VH duplicadas, una indicación de enriquecimiento clonal. (fig. 1E) Tamizaje por ELISA de scFv de expresión en fagos para probar la unión a cepas múltiples de P. aeruginosa . Los datos de ELISA (absorbancia a 450 nra) se muestran para ocho fago-scFv individuales de selecciones y un fago-scFv irrelevante, (fig. 1F) Unión por FACS de anticuerpos específicos por P. aeruginosa con cepas representativas de serotipos de P. aeruginosa únicos. Para cada anticuerpo ensayado se muestra un anticuerpo IgG control negativo humano como un pico sombreado.

Figuras 2A y 2B : Evaluación de mAb que promueven OPK de P. aeruginosa (fig. 2A) Ensayo de opsonofagocitosis con la cepa del serogrupo 05 de P. aeruginosa luminiscente (PAOl. lux), con diluciones de anticuerpos monoclonales purificados derivados de paneo de fagos, (fig. 2B) Ensayo de opsonofagocitosis con la cepa del serogrupo 011 de P. aeruginosa luminiscente ( 9882 - 80. lux) , con diluciones de los anticuerpos monoclonales WapR-004 y Cam-003 purificados derivados del paneo de fagos. En A y B, R347, se usó un anticuerpo monoclonal humano con coincidencia de isotipo que no se une a antígenos de P. aeruginosa, como un control negativo .

Figuras 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H y 31: Identificación del exopolisacárido Psl de P. aeruginosa lanco de anticuerpos derivados de tamizaje fenotípico. La reactividad de los anticuerpos se determinó por ELISA indirecto en placas recubiertas con las cepas indicadas de P. aeruginosa: (fig. 3A) PA01 de tipo salvaje, PAOl wbpL, PAOlArmlC y PAOlAgaltJ. (fig. 3B) PAOlApslA. El anticuerpo Genway es específico por una proteína de membrana externa de P. aeruginosa y se usó como un control positivo, (fig. 3C) El análisis de unión por FACS de Cam-003 a PAOl y PAOlApslA. Cam-003 está indicado con una línea negra sólida y pico transparente; se usó un anticuerpo IgGl humano no específico por P. aeruginosa con coincidencia de isotipo como un control negativo y está indicado por una línea gris y pico sombreado, (fig. 3D) Se resolvió LPS purificado de PAOl y PAOlApslA por SDS-PAGE y se inmunotransfirió con antisuero derivado de ratones vacunados con PAOlAwapRAalgD, una cepa mutante deficiente en el transporte del antígeno 0 a la membrana externa y producción de alginato. (fig. 3E) Los datos de unión de ELISA para Cam-003 con mutantes isogénicos de PAOl. El Cam-003 es el único con capacidad de unirse a cepas que expresan Psl. EL pP 145 es un vector de expresión de pUCP que contiene pslA. (figs. 3F y 3G) Ensayos de opsonofagocitosis que indican que el Cam-003 solo media la muerte de cepas con capacidad de producir Psl (PA01 de tipo salvaje y PAOlApslA complementados in trans con el gen pslA) . (figs. 3H y 31) Datos de ELISA que indican la reactividad de anticuerpos anti-Psl Wap -001, WapR-004 y WapR-016 con PA01 kwbpL algD y PA01 wbpLñalgD pslA. Se usó R347 como un control negativo en todos los experimentos.

Figura 4: Los mAb anti-Psl inhiben la unión a células de la cepa PA01. lux de P. aeruginosa luminiscente a células A549. Se agregaron PAOl . lux en fase logarítmica a una monocapa confluente de células A549 a una MOI de 10 seguido por el análisis de RLU luego de repetidos lavados para eliminar la P. aeruginosa no unida. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes realizados por duplicado para cada concentración de anticuerpo .

Figuras 5A, 5B y 5C: Las cepas de P. aeruginosa con pasajes in vivo mantienen/aumentan la expresión de Psl. El anticuerpo Cam-003 se muestra con una línea negra sólida y un pico transparente; el anticuerpo IgG humano control negativo se muestra como una línea gris y un pico sombreado, (fig. 5A) Para el control positivo, se ensayó el Cam-003 para la unión a cepas crecidas hasta fase logarítmica de un cultivo durante la noche (aproximadamente 5 x 108/ml) . (fig. 5B) El inoculo de cada cepa se preparó a 5 x 108 CFU/ml durante un crecimiento en placa TSA durante la noche y se ensayó para la reactividad contra Cam-003 por citometría de flujo, (fig. 5C) Cuatro horas posteriores al enfrentamiento intraperitoneal , las bacterias se recolectaron de ratones por lavado peritoneal y se estudió la presencia de Psl y Cam-003 por citometría de flujo.

Figuras 6A, 6B, 6C, 6D, 6E y 6F: tasas de supervivencia de animales tratados con los anticuerpos monoclonales anti-Psl Cam-003 o WapR-004 en un modelo de neumonía aguda por P. aeruginosa. (figs. 6A-6D) Los animales se trataron con Cam-003 a 45, 15 y 5 mg/kg y R347 a 45 mg/kg o PBS 24 horas antes de la infección intranasal con (fig. 6A) PAOl (1,6 x 107 CFU) , (fig. 6B) 33356 (3 x 107 CFU), (fig. 6C) 6294 (7 x 106 CFU), (fig. 6D) 6077 (1 x 106 CFU). (figs. 6E-6F) Los animales se trataron con WapR-004 a 5 y 1 mg/kg como se indica seguido por la infección con 6077 a (fig. 6E) (8 x 105 CFU) o (fig. 6F) (6 x 105 CFU) . Se monitoreó cuidadosamente la supervivencia de los animales hasta 72 horas (figs. 6A-6D) o durante 120 horas (figs. 6E-6F) . En todos los experimentos, PBS y R347 sirvieron como controles negativos. Los resultados están representados como curvas de supervivencia de Kaplan-Meier; las diferencias en la supervivencia se calcularon por la prueba de intervalos logarítmicos para Cam-003 vs . R347. (fig. 6A) Cam-003 (45 mg/kg - P<0,0001; 15 mg/kg - P=0,0003; 5 mg/kg - P=0,0033). (fig. 6B) Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0012; 15 mg/kg - P=0,0012; 5 mg/kg - P=0,0373). (fig. 6C) Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0007; 15 mg/kg - P=0,0019; 5 mg/kg -P=0,0212). (fig. 6D) Cam-003 (45 mg/kg - P<0,0001; 15 mg/kg -P<0,0001; 5 mg/kg - P=0,0001). Los resultados son representativos de al menos dos experimentos independientes, (fig. 6E) [Cam-003 (5 mg/kg) vs . R347 (5 mg/kg): P=0,02; Cam-003 (1 mg/kg) vs . R347 (5 mg/kg): P=0.4848; WapR-004 (5 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (1 mg/kg) vs . R347 (5 mg/kg): P=0,0886; WapR-004 (5 mg/kg) vs . Cam-003 (5 mg/kg): P=0,0017; WapR-004 (1 mg/kg) vs. Cam-003 (1 mg/kg): P=0,2468; R347 (5 mg/kg) vs . PBS : P=0,6676] (F) [Cam-003 (5 mg/kg) vs . R347 (5 mg/kg): P=0,0004; Cam-003 (1 mg/kg) vs . R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (5 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (1 mg/kg) vs . R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (5 mg/kg) vs . Cam-003 (5 mg/kg): P=0,0002; WapR-004 (1 mg/kg) vs . Cam-003 (1 mg/kg): P=0,2628; R347 (5 mg/kg) vs . PBS: P=0,6676]. Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes.

Figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E y 7F: Los anticuerpos monoclonales anti-Psl, Cam-003 y WapR-004, reducen la carga en órganos luego de la inducción de neumonía aguda. Los ratones tratados con el anticuerpo Cam-003 24 horas antes de la infección con (fig. 7A) PA01 (1,1 x 107 CFU) , (fig. 7B) 33356 (1 x 107 CFU), (fig. 7C) 6294 (6,25 x 106 CFU) (fig. 7D) 6077 (1 x 106 CFU) y anticuerpo WapR-004 24 horas antes de la infección con (fig. 7E) 6294 (aproximadamente 1 x 107 CFU) y (fig. 7F) 6206 (aproximadamente 1 x 106 CFU) . 24 horas luego de la infección, los animales se sometieron a eutanasia seguida por la recolección de órganos para la identificación de CFU viables. Las diferencias en CFU viables se determinaron por la prueba U de Mann-Whitney para Cam-003 o WapR-004 vs. R347. (fig. 7A) pulmón: Cam-003 (45 mg/kg -P=0,0015; 15 mg/kg - P=0,0021; 5 mg/kg - P=0,0015); bazo: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0120; 15 mg/kg - P=0,0367); ríñones: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0092; 15 mg/kg - P=0,0056); (fig. 7B) pulmón: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0010; 15 mg/kg - P<0,0001; 5 mg/kg - P=0,0045); (fig. 7C) pulmón: Cam-003 (45 mg/kg -P=0,0003; 15 mg/kg - P=0,0039; 5 mg/kg - P=0,0068); Bazo: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0057; 15 mg/kg - P=0,0230; 5 mg/kg -P=0,0012); (fig. 7D) Pulmón: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0005; 15 mg/kg - P=0,0003; 5 mg/kg - P=0,0007); Bazo: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0015; 15 mg/kg - P=0,0089; 5 mg/kg - P=0,0089); Ríñones: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0191; 15 mg/kg - P=0,0355; 5 mg/kg - P=0,0021). (fig. 7E) Pulmón: WapR-004 (15 mg/kg -P=0,0011; 5 mg/kg - P=0,0004; 1 mg/kg - P=0,0002); Bazo: WapR-004 (15 mg/kg - P<0,0001; 5 mg/kg - P=0,0014; 1 mg/kg -P<0,0001); (fig. 7F) Pulmón: WapR-004 (15 mg/kg - P<0,0001; 5 mg/kg - P=0,0006; 1 mg/kg - P=0,0079); Bazo: WapR-004 (15 mg/kg - P=0,0059; 5 mg/kg - P=0,0261; 1 mg/kg - P=0,0047); Riñon: WapR-004 (15 mg/kg - P=0,0208; 5 mg/kg - P=0,0268.

Figuras 8A-8H: Los anticuerpos monoclonales anti-Psl Cam-003 y apR-004 son activos en un modelo de queratitis por P. aeruginosa y modelo de daño térmico. Los ratones se trataron con un anticuerpo IgGl control o Cam-003 a 45 mg/kg (figs. 8A y 8B) o 15 mg/kg (figs. 8C y 8D) o PBS o un anticuerpo IgGl control o Cam-003 a 45 mg/kg o WapR-004 a 45 mg/kg o 15 mg/kg o 5 mg/kg (figs. 8F y 8G) 24 horas antes de la infección con 6077 (011 citotóxica - 2xl06 CFU) . Inmediatamente antes de la infección, se hicieron 3 estrías de 1 mm en la córnea izquierda de cada animal seguido por aplicación tópica de P. aeruginosa en un inoculo de 5 µ? . 24 horas después de la infección, se calcularon las puntuaciones patológicas de la córnea seguido por la eliminación del ojo para la determinación de CFU viables. Las diferencias en las puntuaciones de patología y CFU viables se determinaron por la prueba U de Mann-Whitney. (fig. 8A) P=0,0001, (fig. 8B) P<0,0001, (fig. 8C) P=0,0003, (fig. 8D) P=0,0015. (fig. 8F) y (fig. 8G) Cam-003 (45 mg/kg) vs . WapR-004 (45 mg/kg): P=0,018; Cam-003 (45 mg/kg) vs . WapR-004 (15 mg/kg): P=0,0025; WapR-004 (45 mg/kg) vs . WapR-004 (15 mg/kg): P=0,1331; WapR-004 (5 mg/kg) vs . Ctrl: P<0,0001. Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes, (fig. 8E) Análisis de supervivencia de ratones CF-1 tratados con Cam-003 y R347 en un modelo de daño térmico con P. aeruginosa luego de infección con 6077 (2 x 10s CFU) (intervalo logarítmico: R347 vs. Cam-003 15 mg/kg, P=0,0094; R347 vs . Cam-003 5 mg/kg, P=0,0017) . Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes, (n) se refiere al número de animales en cada grupo. Figura 8H: Los anticuerpos monoclonales anti-Psl y anti-PcrV son activos en un modelo de queratitis ocular en ratones por P. aeruginosa . Los ratones se inyectaron intraperitonealemente (IP) con PBS o un anticuerpo IgGl control (R347) a 45 mg/kg o WapR-004 ( -Psl) a 5 mg/kg o V2L2 ( -PcrV) a 5 mg/kg, 16 horas antes de la infección con 6077 (Oll-citotóxico - lxlO6 CFU) . Inmediatamente antes de la infección, los ratones se anestesiaron seguido por la iniciación de tres estrías de 1 mm en la córnea y estroma superficial de un ojo de cada ratón usando una aguja de calibre 27 bajo un microscopio de disección, seguido por la aplicación tópica de la cepa 6077 de P. aeruginosa en un inoculo de 5 µ? .

Figuras 9A, 9B y 9C: Un anticuerpo mutante Cam-003 Fe, Cam-003-??, ha disminuido la OPK y la eficacia in vivo pero mantiene la actividad anti-unión de célula, (fig. 9A) Ensayo OPK de PAOl.lux con Cam-003 y Cam-003-??, que porta mutaciones en el dominio Fe que previene las interacciones de Fe con los receptores Fcy (Oganesyan, V., y col., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700-704 (2008)). Se usó R347 como un control negativo, (fig. 9B) Ensayo de unión a células PAOl con Cam-003 y Cam-003-??. (fig. 9C) Modelo de neumonía aguda comparando eficacia de Cam-003 vs . Cam-003-??.

Figuras 10A, 10B, y 10C: Fig. 10a: Mapeo de epítopo e identificación de la afinidad de unión relativa para anticuerpos monoclonales anti-Psl. El mapeo de epítopos se realizó por ELISA de competición y se confirmó usando un sistema de flujo 0CTET° con Psl derivado del sobrenadante de un cultivo durante la noche de la cepa PAOl de P. aeruginosa . Las afinidades de unión relativas se midieron en un instrumento FORTEBIO* OCTET* 384. También se muestran concentraciones de anticuerpo en donde la unión a células fue máximamente inhibida y valores EC50 de OPK para cada anticuerpo. Fig. 10B, fig. 10C: Afinidades de unión relativas de diferentes mutantes WapR-004 medidas en un instrumento FORTEBIO® OCTET® 384. También se muestran los valores EC50 de OPK para los diferentes mutantes.

Figuras HA, 11B, 11C, 11D, HE, 11F, 11G, 11H, 111, 11J, 11K, 11L, 11M, UN, 110, 11P y 11Q: Evaluación de clones mutantes WapR-004 (W4) en el ensayo de muerte opsonofagocítica (OPK) de P. aeruginosa (figs 11A-11M) Ensayo OPK con la cepa del serogrupo 05 de P. aeruginosa luminiscente (PAOl. lux), con diluciones de diferentes clones mutantes W4 en formato scFv-Fc. En algunos casos, se incluyó IgGl W4 en el ensayo y está indicado como W4-IgGl. W4-RAD-Cam y W4-RAD-GB representan la misma secuencia WapR-004RAD descrita en la presente. "W4-RAD" es un nombre abreviado para WapR-004RAD y W4-RAD-Cam y las designaciones W4-RAD-GB en los paneles D a representan dos preparaciones diferentes de WapR-004RAD. (figs. 11N-11Q) : Evaluación de los mAb anti-Psl optimizados derivados de la optimización de compuestos (WapR-004) en el ensayo OPK de P. aeruginosa. (figs. 11N-110) Ensayo de OPK con PAOl . lux luminiscente usando diluciones de anticuerpos monoclonales purificados con optimización de compuesto. (figs. 11P-11Q) Ensayo de OPK repetido con PAOl . lux con diluciones de mAb purificados para confirmar resultados. (figs. 11N-11Q) : Se usó W4-RAD como un control positivo comparativo. En todos los experimentos, R347, como un control negativo se usó un anticuerpo monoclonal IgGl humano que no se une a antígenos de P. aeruginosa.

Figuras 12A, 12B, 12C, 12D, 12E, 12F, 12G y 12H : (fig. 12A) La diversidad de epítopos de PcrV. (fig. 12B) inhibición porcentual de análisis de citotoxicidad para el mAb parental V2L2, mAbl66 (control positivo) y R347 (control negativo), (fig. 12C) Evaluación de la capacidad de mAb V2L2, mAbl66 (control positivo) y R347 (control negativo) para prevenir la lisis de los RBC. (fig. 12D) Evaluación del mAb de línea germinal V2L2 (V2L2-GL) y mAb V2L2-GL optimizados (V2L2-P4 , V2L2- FS, V2L2-MD y V2L2-MR) para prevenir la lisis de los RBC. (fig. 12E) Evaluación de los mAb 1E6, 1F3, 11A6, 29D2, PCRV02 y V2L7 para prevenir la lisis de los RBC (fig. 12F) Evaluación de mAb V2L2 y 29D2 para prevenir la lisis de los RBC. (figs. 12G-12H) Afinidades de unión relativas de anticuerpos V2L2-GL y V2L2-MD.

Figura 13A, 13B, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13H y 131: Estudio de supervivencia in vivo de ratones tratados con el anticuerpo anti-PcrV. (fig. 13A) Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con: 1,03 x 106 CFU de 6077 (exoU+) con 45 mg/kg de R347 (control negativo), 45 mg/kg, 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 1,0 mg/kg de mAbl66 (control positivo) o 15 mg/kg, 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg o 0,2 mg/kg de V2L2. La supervivencia se monitoreó durante 96 horas. (fig. 13B) Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con: 2,1 x 107 CFU de 6294 (exoS+) con 15 mg/kg de R347 (control negativo), 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 1,0 mg/kg de mAbl66 (control positivo) o 15 mg/kg, 5,0 mg/kg o 1,0 mg/kg de V2L2. La supervivencia se monitoreó durante 168 horas. Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con: (fig. 13C) 6294 (06) o (fig. 13D) PA103A con R347 (control negativo) , 5 mg/kg del anticuerpo contra PcrV PcrV- 02 o 5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 0,2 mg/kg o 0,04 mg/kg de V2L2. Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con la cepa 6077 con R347 (control negativo) , 5 mg/kg del anticuerpo contra PcrV PcrV- 02, V2L7 (5 mg/kg o 1 mg/kg) , 3G5 (5 mg/kg o 1 mg/kg) o 11A6 (5 mg/kg o 1 mg/kg) (fig. 13E) o 25 mg/kg del V2L7, 1E6 , 1F3 , 29D2, R347 o 1 mg/kg del anticuerpo contra PcrV PcrV-01 (fig. 13F) o 25 mg/kg del 21F1, V2L2, 2H3 , 4A8 , SH3 , LE10, R347 o 1 mg/kg del 5 PcrV-02 (fig. 13G) o el 29D2 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) , el V2L2 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) , R347 o 1 mg/kg del PcrV-02 (fig. 13H) . Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con: 6294 (06) o PA103A con el V2L2 (0,04 mg/kg, 0,2 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/kg), R347 o 5 mg/kg del PcrV-02. El porcentaje de supervivencia se ensayó en un modelo de neumonía aguda.

Figuras 14A y 14B: Análisis de carga en órganos de ratones tratados con V2L2. Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con 6206 con (fig. 14A) R347 (control negativo), 1 mg/kg, 0,2 mg/kg o 0,07 mg/kg de V2L2 y (fig. 14B) 15 mg/kg de R347 (control negativo); 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 1,0 mg/kg de mAbl66 (control positivo); o 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg o 0,2 mg/kg de V2L2. Las unidades formadoras de colonia se identificaron por gramo de tejido en pulmón, bazo y riñon.

Figura 15 : Análisis de carga en órganos de ratones tratados con V2L2 y WapR-004 ( 4) . Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con 6206 (011-ExoU+) con R347 (control negativo), V2L2 solo o V2L2 (0,1 mg/kg) en combinación con concentraciones en aumento de W4 (0,1, 0,5, 1,0 o 2,0 mg/kg). Las unidades formadoras de colonias se identificaron por gramo de tejido en pulmón, bazo y riñon.

Figura 16A, 16B, 16C, 16D, 16E, 16F y 16G: Tasas de supervivencia para animales tratados con anticuerpo monoclonal anti-PcrV V2L2 en un modelo de neumonía aguda por P. aeruginosa. Las designaciones de V2L2-GL, V2L2-MD, V2L2-PM4 , V2L2-A y V2L2-MFS en las figuras 16A-16G representan diferentes preparaciones de V2L2. (figs. 16A-16C) Los animales se trataron con V2L2 a 1 mg/kg, 0,5 mg/kg o R347 a 0,5 mg/kg antes de la infección intranasal con (fig. 16A) 6077 (9,75 x 105 CFU) , (figs. 16B, 16C) 6077 (9,5 x 105 CFU) . (figs. 16D-16F) Los animales se trataron con V2L2 a 0,5 mg/kg, 0,1 mg/kg o R347 a 0,5 mg/kg seguido por la infección con 6077 (fig. 16D) (1 X 106 CFU), (fig. 16E) (9,5 X 105 CFU) O (Fig. 16F) (1,026 x 106 CFU). (fig. 16G) Los animales se trataron con V2L2-MD a (0,04 mg/kg, 0,2 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/kg), mAbl66 (control positivo) a (0,2 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg o 15 mg/kg) o R347 a 0,5 mg/kg seguido por infección con 6206 (2 x 107+ CFU) .

Figuras 17A y 17B: Representación esquemática de anticuerpos biespecíficos para Psl/PcrV (fig. 17A) Bsl-TNF0C/W4, BS2-TNF0/W4, Bs3-TNF0l/W4 y (fig. 17B) BS2-V2L2/W4-RAD, Bs3 -V2L2/W4 -RAD y Bs4 -V2L2 - 4 -RAD . (fig. 17A) Para Bsl- TNFa/W4, el W4 scFv está fusionado al amino terminal de TNFa VL por medio de un conector (G4S)2. Para Bs2-TNFa/W4, el W4 scFv está fusionado al amino terminal de TNFa VH por medio de un conector (G4S)2. Para Bs3-TNFa/W4, el W4 scFv está fusionado al carboxilo terminal de CH3 por medio de un conector (G4S)2. (fig. 17B) Para Bs2-V2L2-2C, el W4-RAD scFv está fusionado al amino terminal de V2L2 VH por medio de un conector (G4S)2. Para Bs2 -W4 -RAD-2C, el V2L2 scFv está fusionado al amino terminal de W4-RAD VH por medio de un conector (G4S)2. Para Bs3-V2L2-2C, el W4-RAD scFv está fusionado al carboxilo terminal de CH3 por medio de un conector (G4S)2. Para Bs4-V2L2-2C, el W4-RAD scFv está insertado en la región bisagra, conectado por el conector (G4S)2 en el extremo N-ternminal y C-ternminal del scFv.

Figura 18: Evaluación de la actividad de WapR-004 (W4) scFv en construcciones biespecíficas descritas en la Figura 17A. El W4 scFv se ligó sobre dos construcciones biespecíficas diferentes (en orientaciones alternantes N- o C-terminal) teniendo un brazo de unión a TNFOC. Cada construcción biespecífica W4-TNF0C (Bsl-TNFa/W4 , Bs2-TNFGc/W4 y Bs3-TNFoc/W4) retuvo si capacidad para inhibir la unión a células similarmente a W4 usando el ensayo PAOl . lux (05) indicando que el W4 scFv retiene su actividad en un formato biespecífico . Se usó R347 como un control negativo.

Figuraa 19A, 19B y 19C: Los dominios de unión anti-Psl y anti-PcrV se combinaron en un formato biespecífico por reemplazo del anticuerpo TNFoc de la Figura 17B por V2L2. Estas construcciones son idénticas a aquellas descritas en la Figura 17B excepto por el uso de W4-scFv no estabilizado en lugar del W4-RAD scFv estabilizado. W4 y W4-RAD están dirigidos a epítopos idénticos y tienen actividades funcionales idénticas. El porcentaje de inhibición de citotoxicidad se analizó para BS2-V2L2 y BS3-V2L2 usando células A549 tratadas con (fig. 19A) 6206 y (fig. 19B) 6206Apsl_¾. (fig. 19C) Se evaluó la capacidad de BS2-V2L2, BS3-V2L2 y BS4-V2L2 para prevenir la lisis de RBC en comparación al control parental . Todas las construcciones biespecíficas retuvieron la actividad anti-citotoxicidad similar al anticuerpo parental V2L2 usando células infectadas con 6206 y 6206ApslA y previno la lisis de RBC similar al control parental (V2L2) . Se usó R347 como un control negativo en todos los experimentos .

Figuras 20A, 20B y 20C: Evaluación de construcciones biespecíficas anti-Psl/anti-PcrV para promover la OPK de P. aeruginosa. El ensayo de opsonofagocitosis se muestra la cepa serogrupo 05 de P. aeruginosa luminiscente (PAOl.lux), con diluciones de anticuerpos biespecíficos purificados Psl/TNFa (Bs2 -TNFa y Bs3 -TNFa) ; los anticuerpos parentales W4-RAD o V2L2-IgGl; los anticuerpos biespecíficos Psl/PcrV Bs2- V2L2 o BS3-V2L2 o el Bs2 -V2L2 -2C, Bs3-V2L2-2C, Bs4-V2L2-2C o el anticuerpo Bs4-V2L2-2C que porta una mutación YTE (Bs4-V2L2-2C-YTE) . (fig.20A) Si bien el anticuerpo Bs2-V2L2 mostró una muerte similar en comparación al anticuerpo parental W4-RAD, la muerte por el anticuerpo Bs3-V2L2 fue disminuida, (fig. 20B) Si bien los anticuerpos Bs2-V2L2-2C y Bs4-V2L2-2C mostraron muerte similar en comparación al anticuerpo parental 4-RAD, la muerte por el anticuerpo Bs3-V2L2-2C fue disminuida. (fig.20C) Las designaciones W4-RAD y W4-RAD-YTE representan diferentes preparaciones de W4-RAD. Las designaciones de Bs4-V2L2-2C (lote viejo) y Bs4-V2L2-2C (lote nuevo) , representan preparaciones diferentes de Bs4-V2L2-2C. La modificación YTE en Bs4-V2L2-2C-YTE es una modificación hecha a anticuerpos que aumentan la vida media de anticuerpos. Las diferentes preparaciones de los anticuerpos Bs4 (lote viejo vs . lote nuevo) mostraron muerte similar en comparación al anticuerpo parental W4-RAD, sin embargo los anticuerpos Bs4 -V2L2 -2C-YTE tuvieron una caída de 3 veces en la actividad OPK en comparación a Bs4-V2L2-2C (véase la Tabla de EC50) . Se usó R347 como un control negativo en todos los experimentos.

Figuras 21A, 21B, 21C, 21D, 21E, 21F, 21G, 21H, 211: Estudio de supervivencia in vivo de ratones tratados con los anticuerpos biespecíficos anti-Psl/anti-PcrV Bs2-V2L2, Bs3-V2L2, Bs4-V2L2-2C y Bs4 -V2L2 -2C-YTE en un sistema de modelo de neumonía aguda por 6206. Los ratones (n=10) se trataron con (fig. 21A) : R347 (control negativo, 0,2 mg/kg) , Bs2-V2L2 (0,28 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,28 mg/kg), V2L2 (0,2 mg/kg) o W4-RAD (0,2 mg/kg); (21B-21C) : R347 (control negativo, 1 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,5 mg/kg o 1 mg/kg) o Bs4-V2L2-2C (0,5 mg/kg o 1 mg/kg) ; (fig. 21D) : R347 (control negativo, 1 mg/kg) , Bs3-V2L2 (0,5 mg/kg o 1 mg/kg) o Bs4-V2L2-2C (0,5 mg/kg o 1 mg/kg) ; (fig. 21E) : R347 (control negativo, N o C-ternminal 2 mg/kg) , una combinación de los anticuerpos individuales W4 y V2L2 (0,5 mg/kg o 1 mg/kg cada uno) o Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg o 2 mg/kg) ; (fig. F) : R347 (control negativo, 1 mg/kg) , una mezcla de los anticuerpos individuales W4 y V2L2 (0,5 mg/kg o 1 mg/kg cada uno) o Bs4 -V2L2 -2C (1 mg/kg o 0,5 mg/kg). Veinticuatro horas posteriores al tratamiento, todos los ratones se infectaron con aproximadamente (entre 6,25xl05 y lxlO6 CFU/animal) 6206 (011-ExoU+) . Todos los ratones se monitorearon durante 120 horas, (fig. 21A) : Todos los ratones control sucumbieron a la infección en aproximadamente 30 horas posteriores a la infección. Todos los animales Bs3-V2L2 sobrevivieron, junto con aquellos que recibieron el control V2L2. Aproximadamente el 90% de los animales inmunizados con W4-RAD sobrevivieron. Por el contrario, aproximadamente 50% de los animales Bs2-V2L2 sucumbieron a la infección a las 120 horas, (fig. 21B-21F) : Todos los ratones control sucumbieron a la infección en aproximadamente 48 horas posteriores a la infección, (fig. 21B) : Bs4-V2L2-2C tuvo mayor actividad en comparación a Bs2-V2L2 a 1,0 y 0,5 mg/kg. (fig. 21C) : Bs4-V2L2-2C pareció tener mayor actividad en comparación con Bs2-V2L2 a 1,0 mg/kg (los resultados no son estadísticamente significativos) . (fig. 21D) : Bs4-V2L2-2C tuvo mayor actividad en comparación con Bs3-V2L2 a 0,5 mg/kg. (fig. E) : Bs4-V2L2-2C a 2 mg/kg y 1 mg/kg tuvo mayor actividad en comparación con la mezcla de anticuerpos a 1,0 y 0,5 mg/kg. (fig. 21F) : Bs4-V2L2 (1 mg/kg) tiene actividad similar a 1,0 y 0,5 mg/kg. (fig. 21G-21H) : Bs4-V2L2-2C y Bs -V2L2 -2C-YTE tuvieron actividad similar a 1,0 y 0,5 mg/kg. Los resultados están representados como curvas de supervivencia de Kaplan-Meier; las diferencias en la supervivencia se calcularon por la prueba de intervalos logarítmicos para (fig. 21B) Bs4-V2L2-2C vs. Bs2-V2L2 (1 mg/kg - P=0,034; 0,5 mg/kg - P=0,0002); (fig. 21D) BS4-V2L2-2C vs . Bs3-V2L2 (0,5 mg/kg - P<0,0001); (fig. 21E) : Bs4-V2L2-2C (2 mg/kg) vs . mezcla de anticuerpo (1 mg/kg cada uno) -P=0 , 0012 ; Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg) vs . mezcla de anticuerpos (0,5 mg/kg cada uno) -P=0 , 0002. (fig. 21G-21H) : Los ratones (n=8) se trataron con: R347 (control negativo, 1 mg/kg), Bs4-V2L2-2C (1 y 0,5 mg/kg) y Bs4-V2L2-2C-YTE (1 y 0,5 mg/kg) y 6206 (9e5 CFU) . No se observó diferencia en la supervivencia entre Bs4-V2L2-2C y Bs4-V2L2-2C-YTE a ninguna dosis por intervalos logarítmicos, (fig. 211) : Para analizar la eficacia de cada construcción de anticuerpo, los ratones se trataron con 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg y se analizó la supervivencia en un modelo de neumonía letal por 6206. El porcentaje de supervivencia se indica en la tabla con el número de animales para cada comparación indicado entre paréntesis .

Figura 22: Análisis de carga en órganos de animales tratados con anticuerpo biespecífico anti-Psl/PcrV usando el modelo de neumonía aguda por 6206. Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con 6206 (011-ExoU+) con R347 (control negativo), V2L2 o W4-RAD solo (0,2 mg/kg) , Bs2-V2L2 (0,28 mg/kg) o BS3-V2L2 (0,28 mg/kg). Las unidades formadoras de colonia se identificaron por gramo de tejido en pulmón, bazo y riñon. A la concentración ensayada, Bs2-V2L2 y Bs3-V2L2 disminuyeron significativamente la carga en órgano en pulmón. Sin embargo, ninguna de las construcciones biespecífica fue capaz de afectar significativamente la carga en órgano en bazo o riñon en comparación a los anticuerpos parentales .

Figuras 23A y 23B: Análisis de carga en órganos de animales tratados con anticuerpo biespecífico anti-Psl/PcrV usando un sistema modelo con 6294. Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con 6294 con R347 (control negativo), V2L2 o W4-RAD solo (0,5 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,7 mg/kg) o Bs3-V2L2 (0,7 mg/kg) (fgi. 23A) o V2L2 o W4-RAD solo (0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,2 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,2 mg/kg) o una combinación de los anticuerpos individuales W4-RAD y V2L2 (0,1 mg/kg cada uno) (fig. 23B) . Veinticuatro horas posteriores a la administración de anticuerpo, todos los ratones se infectaron con un inoculo conteniendo 2,5 x 107 CFU 6294 (fig. 23A) o 1, 72 x 107 CFU 6294 (fig. 23B) . Las unidades formadoras de colonia se identificaron por gramo de tejido en pulmón, bazo y riñon. Usando el sistema modelo de 6294, (fig. 23A) tanto BS2-V2L2 como BS3-V2L2 disminuyeron significativamente la carga en órganos en todos los tejidos hasta un nivel comparable al del anticuerpo parental V2L2. El anticuerpo parental W4-RAD no tuvo efecto en disminuir la carga en órganos. (fig. 23B) Bs2-V2L2, Bs3-V2L2 y la combinación W4-RAD+V2L2 disminuyó significativamente la carga en órganos en todos los tejidos hasta un nivel comparable al del anticuerpo parental V2L2.

Figura 24 : Estudio de supervivencia in vivo de ratones tratados con BS2-W4/V2L2 y Bs3-W4/V2L2 en un sistema modelo de 6294. Los ratones se trataron con R347 (control negativo, 0,2 mg/kg) , Bs2-V2L2 (0,28 mg/kg) , Bs3-V2L2 (0,28 mg/kg) , V2L2 (0,2 mg/kg) o W4-RAD (0,2 mg/kg). Veinticuatro horas posteriores al tratamiento, todos los ratones se infectaron con 6294. Todos los ratones se monitorearon durante 120 horas Todos los ratones control sucumbieron a la infección en aproximadamente 75 horas posteriores a la infección. Sesenta por ciento de los animales Bs3-V2L2 y 50% de los Bs2-V2L2 sobrevivieron luego de 120 horas posteriores a la inoculación Ta, como se vio en los estudios de carga en órganos, la inmunización con W4-RAD no afectó la supervivencia con todos los ratones sucumbiendo a la infección a aproximadamente el mismo tiempo que los controles .

Figura 25A, 25B, 25C y 25D) : Análisis de carga en órganos de anticuerpo biespecífico anti-Psl/PcrV o terapia combinada de W4 + V2L2 en el sistema modelo de 6206. Se usaron concentraciones subóptimas de anticuerpo (figs. 25A-25C) para permitir la capacidad de descifrar la actividad del anticuerpo, (fig. 25D) Se usaron concentraciones altas de Bs4. Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con 6206 con R347 (control negativo), V2L2 o W4-RAD solo (0,2 mg/kg) , Bs2-V2L2 (0,2 mg/kg) , Bs3-V2L2 (0,2 mg/kg) , Bs4 (15,0, 5,0 y 1,0 mg/kg) o una combinación de los anticuerpos individuales W4 y V2L2 (0,1 mg/kg cada uno). Veinticuatro horas posteriores a la administración de anticuerpo, todos los ratones se infectaron con un inoculo conteniendo (fig. 25A) , (fig. 25B) 4,75 x 105 CFU de 6206 (011-ExoU+) o (fig. 25C) 7,75 x 105 CFU de 6206 (011-ExoU+) o (fig. 25D) 9,5 x 105 CFU de 6206 (011-ExoU+) . Las unidades formadoras de colonia se identificaron por gramo de tejido en pulmón, bazo y riñon. Usando el sistema modelo de 6206, BS2-V2L2 y BS3-V2L2 disminuyeron la carga en órganos en el pulmón, bazo y ríñones hasta un nivel comparable al de la combinación 4 + V2L2. En el pulmón, la combinación redujo significativamente las CFU bacterianas Bs2- y Bs3-V2L2 y V2L2 usando la prueba de Kruskal-Wallis con Dunn posterior. No se observaron diferencias significativas en la carga bacteriana en el bazo y riñon, a pesar de que se vio una tendencia hacia la reducción. (fig. 25D) Cuando se usaron concentraciones óptimas de Bs4-V2L2-2C (15,0, 5,0 y 1,0), se observó una depuración rápida y eficaz del pulmón. Adicionalmente, la diseminación baceriana al bazo y ríñones también fue evitada. Los asteriscos indican significancia estadística en comparación al control R347 usando la prueba de Kruskal-Wallis con Dunn posterior.

Figuras 26A, 26B, 26C, 26D, 26E, 26F, 26G, 26H, 261 y 26J: Terapia adyuvante terapéutica: Bs4-V2L2-2C + antibiótico, (fig. 26A-fig. 26B) Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección con 1 x 106 CFU de 6206 con 0,5 mg/kg de R347 (control negativo) o Bs4-V2L2-2C (0,2 mg/kg o 0,5 mg/kg) o Ciprofloxacina (CIP) (20 mg/kg o 6,7 mg/kg) 1 hora posterior a la infección o una combinación del Bs4-V2L2-2C 24 horas antes de la infección y CIP 1 hora posterior a la infección (0,5 mg/kg + 20 mg/kg o 0,5 mg/kg + 6,7 mg/kg o 0,2 mg/kg + 20 mg/kg o 0,2 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente), (fig. 26C) Los ratones se trataron 1 hora posterior a la infección con 9,5 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 o CIP (20 mg/kg o 6,7 mg/kg) o Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg o 5 mg/kg) o una combinación del Bs4-V2L2-2C y CIP (5 mg/kg + 20 mg/kg o 5 mg/kg + 6,7 mg/kg o 1 mg/kg + 20 mg/kg o 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente) . (fig. 26D) Los ratones se trataron 2 horas posteriores a la infección con 9,5 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 o CIP (20 mg/kg o 6,7 mg/kg) o Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg o 5 mg/kg) o una combinación del Bs4-V2L2-2C y Cipro (5 mg/kg + 20 mg/kg o 5 mg/kg + 6,7 mg/kg o 1 mg/kg + 20 mg/kg o 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente), (fig- 26E) Los ratones se trataron 2 horas posteriores a la infección con 9,75 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 o Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg o 5 mg/kg) o CIP (20 mg/kg o 6,7 mg/kg) 1 hora posterior a la infección o una combinación del Bs4-V2L2-2C 2 horas posteriores a la infección y CIP 1 hora posterior a la infección (5 mg/kg + 20 mg/kg o 5 mg/kg + 6,7 mg/kg o 1 mg/kg + 20 mg/kg o 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente), (fig. 26F) Los ratones se trataron 1 hora posterior a la infección con 9,5 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 o Meropenem (MEM) (0,75 mg/kg o 2,3 mg/kg) o Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg o 5 mg/kg) o una combinación del Bs4-V2L2-2C y MEM (5 mg/kg + 2,3 mg/kg o 5 mg/kg + 0,75 mg/kg o 1 mg/kg + 2,3 mg/kg o 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente) . (fig. 26G) Los ratones se trataron 2 horas posteriores a la infección con 9,75 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 o Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg o 5 mg/kg) o MEM (0,75 mg/kg o 2,3 mg/kg) 1 hora posterior a la infección o una combinación del Bs4-V2L2-2C 2 horas posteriores a la infección y MEM 1 hora posterior a la infección (5 mg/kg + 2,3 mg/kg o 5 mg/kg + 0,75 mg/kg o 1 mg/kg + 2,3 mg/kg o 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente), (fig. 269H) Los ratones se trataron 2 horas posteriores a la infección con 1 x 106 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 o Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg o 5 mg/kg) o MEM (0,75 mg/kg o 2,3 mg/kg) o una combinación del BS4-V2L2-2C 2 y MEM (5 mg/kg + 2,3 mg/kg o 5 mg/kg + 0,75 mg/kg o 1 mg/kg + 2,3 mg/kg o 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente) . (fig. 261) Los ratones se trataron 4 horas posteriores a la infección con 9, 25 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 o CIP (6,7 mg/kg) o Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg o 5 mg/kg) o una combinación del Bs4-V2L2-2C y CIP (5 mg/kg + 6,7 mg/kg o 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente) , (fig. 26J) Los ratones se trataron 4 horas posteriores a la infección con 1,2 x 106 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 + CIP (6,7 mg/kg), CIP (6,7 mg/kg) o Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg o 5 mg/kg) o una combinación del Bs4-V2L2-2C y CIP (5 mg/kg + 6,7 mg/kg o 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente). (fig.s 26A-26J) El anticuerpo Bs4 combinado con CIP o MEM aumenta la eficacia de la terapia con antibióticos, indicando protección sinérgica cuando las moléculas son combinadas. Adicionalmente , a pesar de que el antibiótico administrado solo o en combinación con un anticuerpo no específico por P. aeruginosa puede reducir o controlar las CFU bacterianas en el pulmón, el antibiótico solo no protege a los ratones de la letalidad en estas condiciones. La protección óptima en estas condiciones requiere incluir Bs4-V2L2-2C en combinación con antibiótico.

Figuras 27A, 27B y 27C: Diferencia en la actividad funcional de los anticuerpos biespecífieos BS4-WT, BS4-GL y BS4-GL0: ensayo de muerte opsonofagocítica (fig. 27A) , ensayo anti-unión a células (fig. 27B) y un ensayo de anti-citotoxicidad por lisis de RBC (fig. 27C) .

Figuras 28A y 28B: Porcentaje de protección contra la neumonía letal en ratones desafiados en condiciones profilácticas (fig. 28A) o terapéuticas (fig. 28B) con cepas de P. aeruginosa . El porcentaje de supervivencia está indicado en la tabla con el número de animales para cada comparación indicado entre paréntesis. Los guiones indica no ensayado.

Figuras 29A y 29B: Tasas de supervivencia para animales tratados con anticuerpo biespecífico Bs4-GLO en un modelo de bacteriemia letal por P. aeruginosa . (fig. 29A) Los animales se trataron con Bs4-GLO a 15 mg/kg, 5 mg/kg, 1 mg/kg o R347 a 15 mg/kg 24 horas antes de la infección intraperitoneal con 6294 (06) (5,58 x 107 CFU) . (fig. 29B) Los animales se trataron con Bs4-GL0 a 5 mg/kg, 1 mg/kg, 0,2 mg/kg o R347 a 5 mg/kg 24 horas antes de la infección intraperitoneal con 6206 (011-ExoU+) (6,48 x 106 CFU). Los resultados se representan como curvas de supervivencia de Kaplan-Meier; las diferencias en la supervivencia se calcularon por la prueba de intervalos logarítmicos para BS4-GL0 a cada concentración vs . R347. (fig 29A) Bs4-GL0 a todas las concentraciones vs . R347 P<0,0001. (fig. 29B) Bs4-GL0 a todas las concentraciones vs . R347 P=0,0003. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

Figuras 30A, 30B y 30C: Tasas de supervivencia para animales tratados profilácticamente (prevención) con Bs4-GL0 en un modelo de daño térmico por P. aeruginosa. (fig. 30A) Los animales se trataron con Bs4-GL0 a 15 mg/kg, 5 mg/kg o R347 a 15 mg/kg 24 horas antes de la inducción de daño térmico e infección subcutánea con la cepa 6077 de P. aeruginosa (011-ExoU+) con 1,4 x 105 CFU directamente bajo la herida, (fig. 30B) Los animales se trataron con Bs4-GLO a 15 mg/kg o R347 a 15 mg/kg 24 horas antes de la inducción de daño térmico e infección subcutánea con la cepa 6206 de P. aeruginosa (011-ExoU+) con 4,15 x 104 CFU directamente bajo la herida, (fig. 30C) Los animales se trataron con Bs4-GLO a 15 mg/kg, 5 mg/kg o R347 a 15 mg/kg 24 horas antes de la inducción de daño térmico e infección subcutánea con la cepa 6294 de P. aeruginosa (06) con 7,5 x 101 CFU directamente bajo la herida. Los resultados se representan como curvas de supervivencia de Kaplan-Meier; las diferencias en la supervivencia se calcularon por la prueba de intervalos logarítmicos para Bs4-GL0 a cada concentración vs . R347. (figs. 30A-30C) Bs4-GLO a todas las concentraciones vs . R347 P<0,0001. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes para cada cepa de P. aeruginosa.

Figura 31A y 31B: Tasas de supervivencia para animales tratados terapéuticamente (tratamiento)) con Bs4-GL0 en un modelo de daño térmico por P. aeruginosa. (fig. 31A) Los animales se trataron con Bs4-GL0 a 42,6 mg/kg, 15 mg/kg o R347 a 45 mg/kg 4h horas después de la inducción del daño térmico e infección subcutánea con la cepa 6077 de P. aeruginosa (011-ExoU+) con 1,6 x 105 CFU directamente bajo la herida, (fig. 31B) Los animales se trataron con Bs4-GLO a 15 mg/kg, 5 mg/kg o R347 a 15 mg/kg 12 horas después de la inducción de daño térmico e infección subcutánea con la cepa 6077 de P. aeruginosa (011-ExoU+) con 1,0 x 105 CFU directamente bajo la herida. Los resultados se representan como curvas de supervivencia de Kaplan-Meier; las diferencias en la supervivencia se calcularon por la prueba de intervalos logarítmicos para BS4-GLO a cada concentración vs . R347. (fig 31A) Bs4-GL0 a cada concentración vs . R347 - P=0,0004. (fig. 31B) Bs4 -GLO a 5 mg/kg vs . R347 - P=0,048. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

Figuras 32A y 32B: Terapia adyuvante terapéutica: Bs4GL0 + ciprofloxacina (CIP) : (fig. 32A) Los ratones se trataron 4 horas posteriores a la infección con 9,5 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 + CIP (6,7 mg/kg) o Bs4-WT (1 mg/kg o 5 mg/kg) o una combinación del Bs4-WT y CIP (5 mg/kg + 6,7 mg/kg o 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente) . (fig. 32B) Los ratones se trataron 4 horas posteriores a la infección con 9,5 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 + CIP (6,7 mg/kg) o Bs4-GLO (1 mg/kg o 5 mg/kg) o una combinación del BS4-GL0 y CIP (5 mg/kg + 6,7 mg/kg o 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente Figuras 33A y 33B: Terapia adyuvante terapéutica: Bs4-GLO + meropenem (MEM) : (fig. 33A) Los ratones se trataron 4 horas posteriores a la infección con 9,5 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 + MEM (0,75 mg/kg) o Bs4-WT (1 mg/kg o 5 mg/kg) o una combinación del Bs4-WT y MEM (5 mg/kg + 0,75 mg/kg o 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente), (fig. 33B) Los ratones se trataron 4 horas posteriores a la infección con 9,5 x 105 CFU de 6206 con 5 mg/kg de R347 + MEM (0,75 mg/kg) o Bs4-GLO (1 mg/kg o 5 mg/kg) o una combinación del Bs4-GLO y MEM (5 mg/kg + 0,75 mg/kg o 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente) .

Figuras 34A, 34B y 34C: Terapia adyuvante terapéutica: Bs4-GLO + antibiótico en un modelo de bacteriemia letal. Los ratones se trataron 24 horas antes de la infección intraperitoneal con la cepa 6294 de P. aeruginosa (06) 9,3 x 107 con Bs4 -GLO a (0,25 mg/kg o 0,5 mg/kg) o R347 (control negativo) . Una hora posterior a la infección, los ratones se trataron subcutáneamente con (fig. 34A) 1 mg/kg de CIP, (fig. 34B) 2,5 mg/kg de MEM o (fig. 34C) 2,5 mg/kg de TOB. Los resultados se representan como curvas de supervivencia de Kaplan-Meier las diferencias en la supervivencia se calcularon por la prueba de intervalos logarítmicos para Bs4-GLO a cada concentración vs . R347.

Figuras 35A y 35B Representación esquemática de formatos alternativos de las construcciones Bs4 (Fig. 35A) las regiones variables de anti-PcrV están presentadas por separado en las cadenas pesada y liviana mientras las regiones variables de anti-Psl se presentan como un scFv dentro de la región bisagra de la cadena pesada y (fig. 35B) regiones variables de anti-Psl se presentan separadamente en las cadenas pesada y liviana mientras que las regiones variables del anti-PcrV se presentan como un scFv dentro de la región bisagra de la cadena pesada.

Descripción Detallada de la Invención DEFINICIONES Se hace notar que el término "uno/a" o "un" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, "una molécula de unión que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas" , se entiende que representa una o más moléculas de unión que se unen específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas. Como tales, los términos "uno/a" (o "un"), "uno o más", y "al menos uno" pueden usarse como sinónimos en la presente.

Como se usa en la presente, el término "polipéptido" tiene como intención abarcar un "polipéptido" singular así como "polipéptidos" plurales, y se refiere a una molecular compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos) . El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos , "proteína", "cadena de aminoácidos", o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" puede usarse en lugar de o en forma intercambiable con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también tiene como intención referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, que incluyen a título enunciativo no taxativo glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupo protectores/bloqueantes conocidos, clivaje proteolítico o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede derivar de una fuente biológica natural o ser producido por tecnología recombinante , pero no necesariamente traducido desde una secuencia de ácido nucleico designada. Puede ser generado de cualquier modo, que incluye síntesis química.

Un polipéptido como se describe en la presente puede ser de un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1,000 o más o 2,000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, a pesar de que no necesariamente tengan la estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida son referidos como plegados y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, en su lugar pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes y son referidos como no plegados. Como se usa en la presente, el término glicoproteína se refiere a una proteína acoplada a al menos un grupo hidrato de carbono que está unido a la proteína por medio de una cadena lateral que contiene oxígeno o que contiene nitrógeno de un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo serina o un residuo asparagina.

Por un polipéptido o un fragmento, variante o derivado del mismo "aislado" se entiende un polipéptido que no está en su ambiente natural. No se requiere un nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede ser quitado de su ambiente nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos en forma recombinante expresados en células huéspedes son considerados aislados como se describe en la presente, ya que son polipéptidos nativos o recombinante que han sido separados, fraccionados o parcial o sustancialmente purificados por cualquier técnica adecuada.

Otros polipéptidos descritos en la presente son fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores y cualquier combinación de los mismos.

Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a una molécula de unión tal como un anticuerpo que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas como se describe en la presente incluyen cualquier polipéptido que retiene al menos alguna de las propiedades de unión a antígeno del correspondiente anticuerpo o polipéptido nativo. Los fragmentos de polipéptidos incluyen, por ejemplo, fragmentos proteolíticos , así como fragmentos de eliminación, además de fragmentos de anticuerpo específicos descritos en otra parte de la presente. Las variantes de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas como se describe en la presente incluyen fragmentos como se describió anteriormente y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ser de origen natural o de origen no natural . Las variantes de origen no natural pueden ser producidas usando técnicas de mutagénesis conocidas en el arte. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, eliminaciones o adiciones. Los derivados de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas como se describe en la presente son polipéptidos que han sido alterados de forma que exhiben características adicionales no encontradas en el polipéptido nativo. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también pueden ser referidos en la presente como "análogos de polipéptidos" . Como se usa en la presente un "derivado" de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas se refiere a un polipéptido sujeto que tiene uno o más residuos químicamente derivatizados por reacción de un grupo lateral funcional. También se incluyen como "derivados" aquellos péptidos que contienen uno o más aminoácidos de origen natural derivados de los veinte aminoácidos estándares Por ejemplo, la 4 -hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; la 5 -hidroxilisina puede sustituirse por lisina; 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la homoserina puede sustituirse por serina; y la ornitina puede sustituirse por lisina.

El término "polinucleótido" tiene como intención abarcar un ácido nucleico en singular así como ácidos nucleicos en plural y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp) . Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como el que se encuentra en los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) ) . El término "ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o AR , presentes en un polinucleótido . Por ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido quitado de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica para una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas contenido en un vector es considerado aislado como se describe en la presente. Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huéspedes heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcriptos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados incluyen además las moléculas producidas sintéticamente. Adicionalmente , el polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulatorio tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un terminador de la transcripción.

Como se usa en la presente, una "región codificante" es una porción de un ácido nucleico que consiste de codones traducidos a aminoácidos. A pesar de que un " codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no es traducido a un aminoácido, puede considerarse que es parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitio de unión a ribosoma, terminadores de la transcripción, intrones y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una construcción de polinucleótido simple, por ejemplo, en un vector simple o en construcciones de polinucleótidos separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes) . Adicionalmente, cualquier vector puede contener una región codificante simple o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector simple puede codificar por separado una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina . Adicionalmente, un vector, polinucleótido o ácido nucleico puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas con un ácido nucleico que codifica para una molécula de unión que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal de secreción o un dominio funcional heterólogo.

En ciertas modalidades, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso de ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otro elemento de control de la transcripción o traducción asociado operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operativa se da cuando una región codificante para un producto de un gen, por ejemplo, un polipéptido, está asociado con una o más secuencias regulatorias de forma tal que pone la expresión del producto del gen bajo la influencia o control de la o las secuencias regulatorias. Dos fragmentos de ADN (tal como una región codificante para un polipéptido y un promotor asociado a la misma) están "asociados operativamente " si la inducción de una función promotora da como resultado la transcripción del AR m que codifica para el producto del gen deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias regulatorias de la expresión para dirigir la expresión del producto del gen o interferir con la capacidad del molde de ADN a ser transcrito. Por lo tanto, una región promotora podría estar asociada operativamente con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido si el promotor tuvo la capacidad de realizar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores , operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden estar asociados operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula. En la presente se describen promotores y otras regiones adecuadas de control de transcripción.

Una variedad de regiones de control de la transcripción son conocidas por aquellos con experiencia en el arte. Estas incluyen, a título enunciativo no taxativo, regiones de control de la transcripción cuya función en células de vertebrados, tal como, a título enunciativo no taxativo, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón-A) , virus de simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tal como virus del sarcoma de Rous) . Otras regiones de control de la transcripción incluyen aquellas derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovina y ß-globina de conejo, así como otras secuencias con capacidad de controlar la expresión de genes en células eucarióticas . Las regiones de control de transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido así como promotores inducibles por linfoquinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleuquinas) .

Similarmente , una variedad de elementos de control de la traducción son conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en el arte. Estos incluyen, a título enunciativo no taxativo, sitios de unión a ribosoraas, codones de inicio y de terminación de la traducción y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio de entrada a ribosoma interno o IRES, también referido como una secuencia CITE) .

En otras modalidades, un polinucleótido puede ser ARN, por ejemplo, en la forma de un ARN mensajero (ARNm) .

Las regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden estar asociadas con regiones codificantes adicionales que codifican para péptidos de secreción y señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido como se describe en la presente, por ejemplo, un polinucleótido que codifica para una molécula de unión que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen una secuencia de péptido señal o líder de secreción que es clivada de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena proteica en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Aquellos con experiencia ordinaria en el arte saben que los polipéptidos secretados por las células de vertebrados generalmente tienen un péptido señal fusionado al extremo N-ternminal del polipéptido, que es clivado del polipéptido completo o de "longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En ciertas modalidades, se usa el péptido señal nativo, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o cadena liviana de inmunoglobulina o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está asociado operativamente al mismo. Como alternativa, puede usarse un péptido señal heterólogo o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo salvaje puede ser sustituida por una secuencia líder del activador de plasminógeno tisular humano (TPA) o ß-glucuronidasa de ratón.

En la presente se describen ciertas moléculas de unión o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de las mismas. A menos que se refiera específicamente a anticuerpos de longitud completa tal como los anticuerpos de origen natural, el término "molécula de unión" abarca anticuerpos de longitud completa así como fragmentos de unión a antígeno, variantes, análogos o derivados de los anticuerpos, por ejemplo, moléculas de anticuerpo o inmunoglobulinas de origen natural o moléculas de anticuerpo o fragmentos diseñados que se unen al antígeno de un modo similar a las moléculas de anticuerpo.

Como se usa en la presente, el término "molécula de unión" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Como se describe adicionalmente en la presente, una molécula de unión puede comprender uno o más dominios de unión descritos en la presente. Como se usa en la presente, un "dominio de unión" incluye un sitio que se une específicamente el determinante antigénico. Un ejemplo no limitante de una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento de la misma que retiene la unión específica a antígeno.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" pueden usarse como sinónimo en la presente. Un anticuerpo (o un fragmento, variante o derivado del mismo) como se describe en la presente comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada y al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena liviana. Las estructuras de inmunoglobulina básica en sistemas vertebrados están relativamente bien entendidas. Véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. 1988) .

Tal como se describirá con más detalle más adelante, el término "inmunoglobulina" comprende diferentes clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Aquellos con experiencia en el arte apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (?, µ, , d, e) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, ?1-?4) . La naturaleza de esta cadena es la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos) por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, etc. están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para una persona con experiencia en vista de la presente descripción y, en consecuencia, se encuentran dentro del alcance de esta descripción.

Las cadenas livianas se clasifican como kappa o lambda (?, ?) . Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena liviana kappa o lambda. En general, las cadenas livianas y pesadas están unidas covalentemente entre sí y las porciones "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por uniones disulfuro covalentes o uniones no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas, células B o células huéspedes diseñadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos corren del extremo N-ternminal en los extremos bifurcados de la configuración Y hacia el extremo C-ternminal en la parte inferior de cada cadena.

Las cadenas livianas y pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional . Los términos "constante" y "variable" se usan funcionalmente . Respecto a esto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de cadena liviana (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y especificidad de antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena liviana (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tal como secreción, movilidad transplacentaria, unión a receptor de Fe, unión a complemento y similares. Por convención la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se hace más distal del sitio de unión a antígeno o amino terminal del anticuerpo. La porción del extremo N-ternminal es una región variable y en la porción del extremo C-ternminal es una región constante; los dominios CH3 y CL en realidad comprenden el carboxilo terminal de las cadena pesada y cadena liviana, respectivamente .

Como se indica más adelante, la región variable le permite a la molécula de unión reconocer selectivamente y unirse específicamente a los antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH o subconjunto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) , de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se combina para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura cuaternaria de la molécula de unión forma el sitio de sitio de unión a antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno está definido por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL.

En los anticuerpos de origen natural, las seis "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" presentes en cada dominio de unión a antígeno son secuencias cortas, no contiguas de aminoácidos que están posicionadas específicamente para formar el dominio de unión a antígeno cuando el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión a antígeno, referidos como regiones "esqueleto", muestran menos variabilidad entre las moléculas. Las regiones esqueleto adoptan principalmente una conformación de hoja ß y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja ß. Por lo tanto, las regiones esqueleto actúan para formar una estructura basal que sirve para el posicionamiento de las CDR en la orientación correcta por interacciones no covalentes entre las cadenas. El dominio de unión a antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie de complementariedad para el epítopo sobre el antígeno inmunoreacti o . Estas superficies de complementariedad promueven la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo cognado. Los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones esqueleto, respectivamente, pueden ser identificados fácilmente para cualquier dada región variable de cadena pesada o liviana por una persona con experiencia ordinaria en el arte, ya que han sido definidos precisamente (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., y col., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); y Chothia y Lesk, J". Mol. Biol . , 196: 901-917 (1987), que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad) .

En el caso en donde hay dos o más definiciones de un término que se usa y/o acepta en el arte, la definición del término tal como se usa en la presente tiene como intención incluir todos los significados a menos que se indique explícitamente lo contrario. El uso del término "región determinante de complementariedad" ("CDR") es un ejemplo específico para describir los sitios de combinación a antígeno no contiguos encontrados dentro de la región variable de los polipéptidos de la cadena pesada y liviana. Esta región particular ha sido descrita por Kabat y col., U.S. Dept . of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia y col., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que se incorporan a la presente a modo de referencia, en donde las definiciones incluyen superposición o subconuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo tiene como intención estar dentro del alcance del término como se lo define y se usa en la presente. Los residuos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDR 5 como los definen cada una de las referencias citadas anteriormente se indican más adelante en la Tabla 1 a modo de comparación. Los números de residuos exactos que abarcan una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Aquellos con experiencia en el arte podrán determinar de rutina cuáles residuos de aminoácidos comprenden una CDR particular según la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA 1: Definiciones de CDR1 ^"La numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 es de acuerdo con las convenciones de numeración indicada por Kabat y col. (véase más adelante) .

Kabat y col. también definieron un sistema de numeración para secuencias del dominio variable que se puede aplicar a cualquier anticuerpo. Una persona con experiencia ordinaria en el arte puede asignar con claridad este sistema de "numeración de Kabat " a cualquier secuencia de dominio variable, sin seguridad en los datos experimentales más allá de la secuencia misma. Como se usa en la presente, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración descrito por Kabat y col., U.S. Dept . of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) . A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de las posiciones de residuos de aminoácidos específicos en una molécula de unión que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo como se describe en la presente, están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Las moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos incluyen, a título enunciativo no taxativo, anticuerpos policlonales , monoclonales , humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos de unión a epítopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv, Fv de cadena simple (scFv) , anticuerpos de cadena simple, Fv con unión disulfuro (sdFv) , fragmentos que comprenden un dominio VL o VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Las moléculas ScFv son conocidas en el arte y se describen, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. 5.892.019. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpo abarcadas por esta descripción pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina .

Por "se une específicamente", se entiende de manera general que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo se une a un epítopo por medio de su dominio de unión a antígeno y que esta unión implica algo de complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, una molécula de unión se dice que "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, por medio de su dominio de unión a antígeno más fácilmente que si se uniese a un epítopo al azar, no relacionado. El término "especificidad" se usa en la presente para calificar la afinidad relativa por la cual cierta molécula de unión se une a un cierto epítopo. Por ejemplo, la molécula de unión "A" puede considerarse que tiene una especificidad mayor por un dado epítopo que una molécula de unión "B" , o puede decirse que la molécula de unión "A" se une al epítopo "C" con una especificidad mayor que la que tiene por el epítopo relacionado "D" .

Por "se une preferencialmente" , se entiende que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente que lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. Por lo tanto, un anticuerpo que "se une preferencialmente " a un dado epítopo se uniría más probablemente a ese epítopo que a un epítopo relacionado, aunque el anticuerpo pueda reaccionar cruzado con el epítopo relacionado .

A modo de ejemplo no limitante, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo puede considerarse que se une a un primer epítopo preferencialmente si se une a el epítopo con una constante de disociación (KD) que es menor que la KD del anticuerpo por el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, una molécula de unión tal como un anticuerpo puede considerarse que se une a un primer antígeno preferencialmente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la KD del anticuerpo por el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, una molécula de unión puede considerarse que se une a un primer epítopo preferencialmente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la KD del anticuerpo por el segundo epítopo .

En otro ejemplo no limitante, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede considerarse que se une a un primer epítopo preferencialmente si se une al primer epítopo con una tasa de disociación (k(off)) que es menor que la k(off) del anticuerpo por el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, una molécula de unión puede considerarse que se une a un primer epítopo preferencialmente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo por el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, una molécula de unión puede considerarse que se une a un primer epítopo preferencialmente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo por el segundo epítopo.

Puede decirse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une a un antígeno blanco, por ejemplo, un polisacárido descrito en la presente o un fragmento o variante del mismo con una tasa de disociación (k(off)) menor de o igual a 5 X 10"2 seg"1, 10"2 seg"1, 5 X 10"3 seg"1 o 10"3 seg"1. Puede decirse que una molécula de unión como se describe en la presente se une a un antígeno blanco, por ejemplo, un polisacárido con una tasa de disociación (k(off)) menor de o igual a 5 X 10"4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10"5 seg"1 o 10"5 seg"1 5 X 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg"1 o 10"7 seg"1.

Puede decirse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en la presente se une a un antígeno blanco, por ejemplo, un polisacárido con una tasa de asociación (k(on)) mayor de o igual a 103 M"1 seg"1, 5 X 103 M"1 seg"1, 104 M"1 seg"1 o 5 X 104 M"1 seg"1. Puede decirse que una molécula de unión como se describe en la presente se une a un antígeno blanco, por ejemplo, un polisacárido con una tasa de asociación (k(on)) mayor de o igual a 105 M"1 seg"1, 5 X 105 M"1 seg"1, 106 M"1 seg"1 o 5 X 10s M"1 seg"1 o 107 M"1 seg"1.

Se dice que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígeno a un dado epítopo si se une preferencialmente a ese epítopo en la mediad que bloquea, en algún grado, la unión del anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígeno al epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse por cualquier método conocido en el arte, por ejemplo, ensayos de ELISA por competición. Puede decirse que una molécula de unión inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígeno a un dado epítopo en al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60% o al menos 50%.

Como se usa en la presente, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un epítopo individual con la CDR de una molécula de inmunoglobulina . Véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. 1988) en las páginas 27-28. Como se usa en la presente, el término "avidez" se refiere a la estabilidad total del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la fuerza de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulinas con el antígeno. Véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez se relaciona con la afinidad de moléculas individuales de inmunoglobulina en la población con epítopos específicos y también con las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo muy repetitivo, tal como un polímero, podría ser una de alta avidez.

Las moléculas de unión o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de las mismas como se describe en la presente también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en la presente, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, específico por un antígeno, para reaccionar con un segundo antígeno; una medida del parentesco entre las dos sustancias antigénicas diferentes. Por lo tanto, una molécula de unión tiene reactividad cruzada si se une a un epítopo diferente de uno que indujo su formación. El epítopo con reacción cruzada generalmente contiene muchas de las mismas características estructurales de complementariedad que el epítopo inductor y en algunos casos, en realidad puede ajustarse mejor que el original .

Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo también puede describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un antígeno. Por ejemplo, una molécula de unión puede unirse a un antígeno con una constante de disociación o KD no mayor de 5 x 10"2 M, 10"2 M, 5 x 10"3 M, 10"3 M, 5 x 10"4 M, 10~4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 10"5 M, 10"6 M, 5 x 1CT7 M, 10"7 M, 5 x 10"8 M, 10~8 M, 5 x 10"9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 1CT11 M, 5 x 10"12 M, 10"12 M, 5 x 10~13 M, 10"13 M, 5 x 10"14 M, 10" 14 M, 5 x 10"15 M o 10"15 M.

Los fragmentos de anticuerpo que incluyen anticuerpos de cadena simple pueden comprender la o las regiones variables solas o en combinación con todo o una porción de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen fragmentos de unión a antígeno que también comprenden cualquier combinación de región o regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en la presente pueden ser de origen animal que incluyen aves y mamíferos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, murinos, de burro, conejo, cabra, conejillo de Indias, camello, llama, caballo o pollo. En otra modalidad, la región variable puede ser de origen de condrictios (por ejemplo, de tiburones) . Como se usa en la presente, anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describió anteriormente y, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. No. 5.939.598 por Kucherlapati y col.

Como se usa en la presente, el término "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media, y/o inferior), un dominio CH2 , un dominio CH3 o una variante o fragmento de los mismos. Por ejemplo, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede comprender una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio CH2 ; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3 ; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio CH3 o una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra modalidad, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo comprende una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH3. Además, una molécula de unión para usar en la descripción puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2) . Como se indica anteriormente, una persona con experiencia ordinaria en el arte entenderá que estos dominios (por ejemplo, las porciones de la cadena pesada) puede modificarse de forma tal que varíen en la secuencia de aminoácidos respecto a la molécula de inmunoglobulina de origen natural.

Las porciones de cadena pesada de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo como se describe en la presente puede derivarse de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula de IgGl y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgGl y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgGl y, en parte, de una molécula de IgG4.

Como se usa en la presente, el término "porción de cadena liviana" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena liviana de inmunoglobulina . La porción de cadena liviana comprende al menos uno de un dominio VL o CL.

Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente pueden describirse o especificarse en términos del o los epítopos o porciones de un antígeno, por ejemplo, un polisacárido blanco que reconocen o al que se unen específicamente. La porción de un polisacárido blanco que interacciona específicamente con el dominio de unión un antígeno de un anticuerpo es un "epítopo", o un "determinante antigénico" . Un antígeno blanco, por ejemplo, un polisacárido puede comprender un epítopo simple, pero típicamente comprende al menos dos epítopos y puede incluir cualquier número de epítopos, dependiendo del tamaño, conformación y tipo de antígeno.

Como se indicó previamente, las estructuras de subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Como se usa en la presente, el término "dominio VH" incluye el dominio variable amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio CH1" incluye el primer dominio de región constante (amino más terminal) de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 está adyacente del dominio VH y es amino terminal a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina .

Como se usa en la presente el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo usando los esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y residuos 231-340, sistema de numeración EU; véase Kabat EA y col. citado en la presente. El dominio CH2 es único en que no está íntimamente apareado con ningún otro dominio. En su lugar, dos cadenas de carbohidratos ramificados unidas por N están interpuestas entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hacia el extremo C-ternminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.

Como se usa en la presente, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 con el dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo de este modo que las dos regiones N-terminales de unión a antígeno se muevan independientemente. Las regiones bisagras puede subdividirse en tres dominio diferentes: dominios de bisagra superior, medio e inferior (Roux y col., J. Immunol. 152:4083 (1998)).

Como se usa en la presente el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG de origen natural, las regiones CH1 y CL están unidas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas por dos enlaces disulfuro en las posiciones que corresponden a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración EU) .

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo quimérico" se usará para referirse a cualquier anticuerpo en donde la región o sitio inmunoreactivo se obtiene o deriva de una primera especie y la región constante (que puede ser intacta, parcial o modificada) se obtiene de una segunda especie. En algunas modalidades la región o sitio de unión blanco será de una fuente no humana (por ejemplo ratón o primate) y la región constante es humana.

El término "anticuerpo biespecífico" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes dentro de una única molécula de anticuerpo. Se apreciará que pueden construirse otras moléculas con dos especificidades de unión además de la estructura canónica del anticuerpo. También se apreciará que la unión a antígeno por anticuerpos biespecífieos puede ser simultánea o secuencial. Los hibridomas triomas e híbridos son dos ejemplos de líneas celulares que pueden secretar anticuerpos biespecífieos . Los anticuerpos biespecífieos también pueden construirse por medios recombinantes . (Stróhlein y Heiss, Future Oncol . 5:1387-94 (2010); abry y Snavely, IDrugs . 13:543-9 (2010)).

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo diseñado" se refiere a un anticuerpo en el cual el dominio variable en la cadena pesada y liviana o ambas está alterado por reemplazo al menos parcial de una o más CDR de un anticuerpo de especificidad conocida y, si es necesario, por reemplazo parcial de la región esqueleto y cambio de secuencia. A pesar de que las CDR pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase como el anticuerpo del cual derivan las regiones esqueleto, se prevé que las CDR derivarán de un anticuerpo de clase diferente y preferentemente de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo diseñado en el cual una o más CDR "donante" de un anticuerpo no humano de especificidad conocida son injertadas en una región esqueleto de cadena pesada o liviana de humano es referido en la presente como un "anticuerpo humanizado" . Puede no ser necesario reemplazar todas las CDR con las CDRs completas de una región variable donante para transferir la capacidad de unión a antígeno de un dominio variable a otro.

En su lugar, puede resultar necesario solo transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión a blanco. Dadas las explicaciones indicadas en, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. Nos. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 6.180.370, estará dentro de la competencia de aquellos con experiencia en el arte, realizando experimentos de rutina o por prueba de ensayo y error el obtener un anticuerpo diseñado o humanizado funcional .

Como se usa en la presente el término "polipéptido plegado apropiadamente" incluye polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos anti-Psl y PcrV de Pseudomonas) en los cuales todos los dominios funcionales que comprenden el polipéptido son activos de manera diferente. Como se usa en la presente, el término "polipéptido plegado no apropiadamente" incluye polipéptidos en los cuales al menos uno de los dominios funcionales del polipéptido no es activo. En una modalidad, un polipéptido plegado apropiadamente comprende cadenas polipeptídicas unidas por al menos un enlace disulfuro e, inversamente, un polipéptido plegado no apropiadamente comprende cadenas polipeptídicas no unidas por al menos un enlace disulfuro.

Como se usa en la presente el término "diseñado" incluye la manipulación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios de síntesis (por ejemplo por técnicas recombinantes , síntesis peptídica in vitro, por acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas) .

Como se usa en la presente, los términos "unido", "fusionado" o "fusión" se usan como sinónimos. Estos términos se refieren a la unión entre sí de dos o más elementos o componentes, por cualquier medio que incluye conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en inglés) de polinucleótido para formar un ORF continuo más largo, de un modo que mantenga el correcto marco de lectura de traducción de los ORF originales. Por lo tanto, una proteína de fusión recombinante es una proteína única que contiene dos o más segmentos que se corresponden con polipéptidos codificados por los ORF originales (segmentos que normalmente no están unidos por naturaleza) . A pesar de que el marco de lectura se hace de este modo continuo por los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar física o espacialmente separados por, por ejemplo, una secuencia conectora en marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican para las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden estar fusionados, en marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región esqueleto de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, con la condición que las CDR "fusionadas" sean cotraducidas como parte de un polipéptido continuo.

En el contexto de polipéptidos , una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección de amino a carboxilo terminal en la cual los residuos que son vecinos entre sí en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido.

El término "expresión" como se usa en la presente se refiere a un proceso por el cual un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula que incluye, a título enunciativo no taxativo, supresión génica así como expresión transitoria y expresión estable. Incluye a título enunciativo no taxativo la transcripción del gen a ARN mensajero (AR m) y la traducción de el ARNm a polipéptido (s) . Si el producto deseado final es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico" . Como se usa en la presente, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un gene o un polipéptido que se traduce a partir de un transcripto. Los productos de genes descritos en la presente además incluyen ácidos nucleicos con modificaciones post transcripcionales , por ejemplo, poliadenilación o polipéptidos con post traduccionales , por ejemplo, metilación, glicosilación, el agregado de lípidos, asociación con otras subunidades, clivado proteolítico y similares .

Como se usan en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren ambos a tratamiento terapéutico y medidas profilácticas y preventivas, en donde el objeto es prevenir o enlentecer (disminuir) un cambio fisiológico no deseado, infección o trastorno. Los resultados beneficiosos o clínicos deseados incluyen, a título enunciativo no taxativo, alivio de síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado de la enfermedad estabilizado (es decir, no empeoramiento) , depuración o reducción de un agente infeccioso tal como P. aeruginosa en un sujeto, un retraso o enlentecimiento en la progresión de la enfermedad, mejoramiento o paliación del estado de la enfermedad y remisión (parcial o total), detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación a la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la infección, condición o trastorno así como aquellos propensos a tener la condición o trastorno o aquellos en los cuales la condición o trastorno se va a prevenir, por ejemplo, en pacientes quemados o pacientes inmunosuprimidos susceptibles a la infección por P. aeruginosa.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se refiere a cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para los cuales se desea el diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, animales de granja y de zoológico, animales para deportes o mascotas tales como perros, gatos, conejillos de las Indias, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, osos, entre otros.

Como se usan en la presente, las frases tales como "un sujeto que podría beneficiarse con la administración de dominios de unión o moléculas de unión anti-Psl y PcrV de Pseudomonas" y "un animal que necesita tratamiento" incluye sujetos, tales como sujetos mamíferos, que se podrían beneficiar con la administración de dominios de unión o una molécula de unión anti-Psl y PcrV Pseudomonas, tal como un anticuerpo, que comprende uno o más de los dominios de unión. Los dominios de unión o moléculas de unión pueden usarse, por ejemplo, para la detección de Psl o PcrV de Pseudomonas (por ejemplo, para un procedimiento de diagnóstico) y/o para tratamiento, es decir, paliación o prevención de una enfermedad, con moléculas de unión anti-Psl y PcrV de Pseudomonas. Como se describe con más detalle en la presente, las moléculas de unión anti-Psl y PcrV de Pseudomonas pueden usarse en forma no conjugada o pueden ser conjugadas, por ejemplo, con un fármaco, profármaco o un isótopo.

El término "efecto sinérgico", como se usa en la presente, se refiere a un efecto terapéutico más que aditivo producido por una combinación de compuestos en donde el efecto terapéutico obtenido con la combinación excede los efectos aditivos que de otra forma serían el resultado de la administración individual de los compuestos solos . Ciertas modalidades incluyen métodos para producir un efecto sinérgico en el tratamiento de infecciones por Pseudomonas, en donde el efecto es al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 200%, al menos 500% o al menos 1000% mayor que el correspondiente efecto aditivo.

"Coadministración" se refiere a la administración de diferentes compuestos, tal como un dominio de unión o molécula de unión anti-Psl y anti-PcrV que comprende uno o ambos dominios de unión anti-Psl y anti-PcrV, tal que los compuestos produzcan un efecto sinérgico sobre la inmunidad anti-Pseudomonas . Los compuestos pueden administrarse en la misma o diferentes composiciones que si son separadas se administran próximas entre sí, generalmente dentro de las 24 horas una de la otra y más típicamente dentro de aproximadamente entre 1 y 8 horas una de la otra e incluso más típicamente dentro de entre 1 y 4 horas una de la otra o cercano a la administración simultánea. Las cantidades relativas se dosifican para alcanzar el sinergismo deseado. II. DOMINIOS DE UNIÓN Y MOLÉCULAS DE UNIÓN Los anticuerpos que unen Psl y formatos para usar estos anticuerpos han sido descritos en el arte. Véase, por ejemplo, Las Solicitudes Internacionales Nos. PCT/US2012/041538 , presentada el 8 de junio de 2012 y PCT/US2012/63639 , presentada el 6 de noviembre de 2012 (expediente del agente no. AEMS-115W01, bajo el título "MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF" ) , que se incorporan a la presente en su totalidad a modo de referencia.

Una modalidad está dirigida a dominios de unión que se unen específicamente a PcrV de Pseudomonas, en donde la unión puede alterar la actividad del sistema de secreción de toxinas tipo III. En ciertas modalidades, los dominios de unión tienen la misma especificidad de unión a Pseudomonas que el anticuerpo V2L2.

Otra modalidad está dirigida a dominios de unión que se unen específicamente a Psl o PcrV de Pseudomonas, en donde la administración de ambos dominios de unión da como resultado un efecto sinérgicos contra las infecciones por Pseudomonas por (a) inhibir la unión Pseudomonas aeruginosa a células epiteliales, (b) promover, mediar o potenciar la muerte opsonofagocítica (OPK) de P. aeruginosa, (c) inhibir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales o (d) alterar la actividad del sistema de secreción de toxinas tipo III. En ciertas modalidades, los dominios de unión tienen la misma especificidad de unión a Pseudomonas que los anticuerpos Cam-003, WapR-004, V2L2 o 29D2.

Otras modalidades están dirigidas a una o más moléculas de unión aisladas que comprenden uno o ambos dominios de unión que se unen específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, en donde la administración de la molécula de unión da como resultado el efecto sinérgico contra infecciones por Pseudomonas. En ciertas modalidades, la molécula de unión puede comprender un dominio de unión de los anticuerpos o fragmentos de los mismos que incluyen, a título enunciativo no taxativo, Cam-003, WapR-004, V2L2 o 29D22.

Como se usa en la presente, los términos "dominio de unión" o "dominio de unión a antígeno" incluyen un sitio que se une específicamente a un epítopo sobre un antígeno (por ejemplo, un epítopo de Psl o PcrV de Pseudomonas) . El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo típicamente incluye al menos una porción de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y al menos una porción de una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina. El sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo.

La descripción está dirigida más específicamente a una composición que comprende al menos dos dominios de unión anti-Pseudomonas, en donde un dominio de unión se une específicamente a Psl y el otro dominio de unión se une específicamente a PcrV. En una modalidad, la composición comprende un dominio de unión que se une específicamente al mismo epítopo Psl de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena liviana (VL) de apR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, apR-003 o WapR-016. En ciertas modalidades, el segundo dominio de unión se une específicamente al mismo epítopo de PcrV de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la misma que comprende la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena liviana (VL) de V2L2 o 29D2.

En una modalidad, la composición comprende un dominio de unión que se une específicamente a Psl de Pseudomonas y/o inhibe competitivamente la unión a Psl de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las VH y VL de WapR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003 o WapR-016. En ciertas modalidades, el segundo dominio de unión se une específicamente al mismo epítopo de PcrV de Pseudomonas y/o inhibe competitivamente la unión a PcrV de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la misma que comprende la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena liviana (VL) de V2L2 o 29D2.

Otra modalidad está dirigida a una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de PcrV de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las regiones VH y VL de V2L2 o 29D2.

También se incluye una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de la misma que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas e inhibe competitivamente la unión a PcrV de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las VH y VL de V2L2 o 29D2.

Una modalidad está dirigida a una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al mismo epítopo Psl de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las regiones VH y VL de WapR-001, WapR-002 o WapR-003.

También se incluye una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe competitivamente la unión a Psl de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las VH y VL de WapR-001, WapR-002 o WapR-003.

Además se incluye una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de la misma que se une específicamente al mismo epítopo Psl de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las VH y VL de WapR-016.

También se incluye una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe competitivamente la unión a Psl de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las VH y VL de WapR-016.

Los métodos para hacer anticuerpos son bien conocidos en el arte y se describen en la presente. Una vez que se han producido anticuerpos contra diferentes fragmentos de o contra Psl o PcrV de longitud completa de Pseudomonas sin la secuencia señal, la determinación de cuales a aminoácidos o epítopo, de Psl o PcrV de Pseudomonas se une el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede hacerse por protocolos de mapeo de epítopo como se describe en la presente así como métodos conocidos en el arte (por ejemplo ELISA en sándwich con anticuerpo doble como se describe en el "Capítulo 11 -Immunology" , Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel y col., v.2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)). En Morris, G. Epítopo Mapping Protocols, New Jersey: Humana Press (1996) , que se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad, pueden encontrarse protocolos adicionales de mapeo de epítopo. El mapeo de epítopos puede realizarse por medios disponibles comercialmente (es decir ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee, Wisconsin) ) .

En ciertos aspectos, la descripción está dirigida a una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) que es menor que la KD para el anticuerpo de referencia monoclonal.

En ciertas modalidades una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo como se describe en la presente se une específicamente a al menos un epítopo de Psl o PcrV, es decir, se une a el epítopo más fácilmente que lo que se uniría a un epítopo no relacionado o al azar; se une preferencialmente a al menos un epítopo de Psl o PcrV, es decir, se une a el epítopo más fácilmente que lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo; inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia que se une específicamente o preferencialmente a cierto epítopo de Psl o PcrV; o se une a al menos un epítopo de Psl o PcrV con una afinidad caracterizada por una constante de disociación KD menor de aproximadamente 5 x 10~2 M, aproximadamente 10~2 M, aproximadamente 5 x 10"3 M, aproximadamente 10"3 M, -4 aproximadamente 5 -4 X 10 M, aproximadamente 10 M, aproximadamente 5 X 10 -5 M, aproximadamente 10 -5 M, aproximadamente 5 X 10 -6 M, aproximadamente 10 -6 M, aproximadamente 5 -7 X 10 M, aproximadamente 10 -7 M, aproximadamente 5 X 10 - 8 M, aproximadamente 10 -8 M, aproximadamente 5 - 9 X 10 M, aproximadamente 10 - 9 M, aproximadamente 5 10 X 10" M, aproximadamente 10" 10 M, aproximadamente 5 11 X 10" M, aproximadamente 11 10" M, aproximadamente 5 X 10" 12 M, aproximadamente 10" 12 M, aproximadamente 5 X 10" 13 M, aproximadamente 13 10" M, aproximadamente 5 X 10" 14 M, aproximadamente 10" 14 M, aproximadamente 5 x 10"15 M o aproximadamente 10"15 M.

Como se usa en el contexto de las constantes de disociación de unión, el término "aproximadamente" permite el grado de variación inherente en los métodos utilizados para medir la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, dependiendo del nivel de precisión del instrumental usado, error estándar en base al número de muestras medidas y error por redondeo, el término "aproximadamente 10"2 M" podría incluir, por ejemplo, entre 0,05 M y 0,005 M.

En modalidades específicas una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo se une a Psl y/o PcrV de Pseudomonas con una tasa de disociación (k(off)) menor de o igual a 5 X 10~2 seg"1, 10"2 seg"1, 5 X 10"3 seg"1 o 10"3 seg"1.

Como alternativa, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo se une a Psl y/o PcrV de Pseudomonas con una tasa de disociación (k(off)) menor de o igual a 5 X 10"4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10"5 seg"1 o 10"5 seg"1 5 X 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg"1 o 10"7 seg"1.

En otras modalidades, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo como se describe en la presente se une a Psl y/o PcrV de Pseudomonas con una tasa de asociación (k(on)) mayor de o igual a 103 M"1 seg"1, 5 X 103 "1 seg"1, 104 M"1 seg"1 o 5 X 104 M"1 seg"1. Como alternativa, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo como se describe en la presente se une a Psl y/o PcrV de Pseudomonas con una tasa de asociación (k(on)) mayor de o igual a 105 M"1 seg"1, 5 X 105 "1 seg"1, 106 M"1 seg"1 o 5 X 106 M"1 seg"1 o 107 M"1 seg"1.

En diferentes modalidades, una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo como se describe en la presente promueve la muerte opsonofagocítica de Pseudomonas o inhibe la unión de Pseudomonas a células epiteliales. En ciertas modalidades descritas en la presente, el blanco Psl o PcrV de Pseudomonas es Psl o PcrV de Pseudomonas aeruginos . En otras modalidades, ciertas moléculas de unión descritas en la presente pueden unirse a moléculas de polisacáridos estructuralmente relacionados sin importar su fuente. Podría esperarse que las moléculas similares a Psl sean idénticas a o que tengan suficiente relevancia estructural con Psl de P. aeruginosa para permitir el reconocimiento específico por una o más de las moléculas de unión descritas. En otras modalidades, ciertas moléculas de unión descritas en la presente pueden unirse moléculas polipeptídicas relacionadas estructuralmente sin importar su fuente. Podría esperarse que las moléculas similares a PcrV sean idénticas a o que tengan suficiente relevancia estructural a PcrV de P. aeruginosa para permitir el reconocimiento específico por una o más de las moléculas de unión descritas. Por lo tanto, por ejemplo, ciertas moléculas de unión descritas en la presente pueden unirse a moléculas similares a Psl y/o similares a PcrV producidas por otra especie bacteriana, por ejemplo, moléculas similares a Psl o similares a PcrV producidas por otra especie de Pseudomonas, por ejemplo, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida o Pseudomonas alcaligenes . Como alternativa, ciertas moléculas de unión como se describen en la presente pueden unirse a moléculas similares a Psl y/o similares a PcrV producidas sintéticamente o por células huéspedes modificadas genéticamente para producir moléculas similares a Psl o similares a PcrV. 7 A menos que se indique específicamente, como se usa en la presente un "fragmento del mismo" en referencia a una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se refiere a un fragmento de unión a antígeno, es decir, una porción del anticuerpo que se une específicamente al antígeno.

Las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos puede comprender una región constante que media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente Cl del complemento a una región constante del anticuerpo puede activar el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de patógenos. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar involucrada en la hipersensibilidad autoinmune . Además, los anticuerpos se unen a receptores en diferentes células por medio de la región Fe, con un sitio de unión al receptor de Fe sobre la región Fe del anticuerpo uniéndose al receptor de Fe (FcR) sobre una célula. Hay un número de receptores de Fe que son específicos por diferentes clases de anticuerpo, que incluyen IgG (receptores gamma) , IgE (receptores epsilon) , IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu) . La unión del anticuerpo a receptores Fe sobre la superficie celular inicia un número de respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen engullición y destrucción de partículas recubiertas con anticuerpo, depuración de complejos inmunes, lisis de células blanco recubiertas con anticuerpo por células asesinas (llamado citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo o ADCC) , liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas .

En consecuencia, ciertas modalidades descritas en la presente incluyen una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, en el cual al menos una fracción de uno o más de los dominios de región constante han sido eliminados o alterados de otro modo tal que proveen características bioquímicas deseadas tal como funciones efectoras reducidas, la capacidad de dimerizar no covalentemente , aumentar la capacidad para localizarse en el sitio de un tumor, vida media en suero reducida o vida media en suero aumentada en comparación a un anticuerpo completo, no alterado de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, ciertas moléculas de unión descritas en la presente son anticuerpos con dominios eliminados que comprenden una cadena polipeptídica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero la cual carece de al menos una porción de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en ciertos anticuerpos, se eliminará un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se eliminará todo o parte del dominio CH2.

Las formas modificadas de moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos pueden hacerse a partir de anticuerpos precursores completos o parentales usando técnicas conocidas en el arte. Las técnicas e emplificativas se describen en otra parte dentro de la presente.

En ciertas modalidades las regiones variables y constantes de moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno son completamente humanas. Los anticuerpos completamente humanos pueden hacerse usando técnicas que son conocidas en el arte y como se describen en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos completamente humanos contra un antígeno específico pueden prepararse por administración del antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir los anticuerpos en respuesta a un enfrentamiento antigénico, pero cuyos loci endógenos han sido deshabilitados. Las técnicas ej emplificativas que pueden usarse para hacer los anticuerpos se describen en las patentes de los EE.UU.: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140. En el arte se conocen otras técnicas. Los anticuerpos completamente humanos pueden ser producidos igualmente por diferentes tecnologías de expresión, por ejemplo, expresión en fagos u otros sistemas de expresión viral, como se describe con más detalle dentro de la presente.

Las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos como se describe en la presente pueden hacerse o fabricarse usando técnicas que son conocidas en el arte. En ciertas modalidades, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas son "producidas en forma recombinante" , es decir, son producidas usando tecnología de ADN recombinante. Las técnicas ej emplificativas para hacer moléculas de anticuerpo o fragmentos de las mismas se describen con más detalle dentro de la presente.

En ciertas moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente, la porción Fe puede mutarse para disminuir la función efectora usando técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (por medio de mutaciones puntales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión al recetor de Fe del anticuerpo modificado circulante aumentando de este modo la localización a tumor. En otros casos puede ser que las modificaciones de la región constante moderen la unión a complemento y de este modo reduzcan la vida media en suero y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. También pueden usarse otras modificaciones de la región constante para modificar las uniones disulfuro o grupos oligosacáridos que permitan una localización mejorada debido a una especificidad por antigeno aumentada o flexibilidad del anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tal como localización, biodistribución y vida media en suero, pueden medirse fácilmente y cuantificarse usando técnicas inmunológicas bien conocidas sin experimentación no debida.

En ciertas modalidades, las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno, variantes o derivados de los mismos no presentarán una respuesta inmune perjudicial en el animal a ser tratado, por ejemplo, en un humano. En una modalidad, las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno, variantes o derivados de los mismos son modificadas para reducir su inmunogenicidad usando técnicas reconocidas en el arte. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanizados, desinmunizados o quiméricos. Estos tipos de anticuerpos derivan de un anticuerpo de no humano, típicamente un anticuerpo murino o de primate, que retiene o sustancialmente retiene las propiedades de unión a antigeno del anticuerpo parental, pero que es menos inmunogénico en humanos. Esto puede lograrse por diferentes métodos, que 2 incluyen (a) injertar los dominios variables no humanos completos en regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos; (b) injertar al menos una parte de una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) no humanas en regiones esqueleto y constantes humanas con o sin retención residuos del esqueleto críticos; o (c) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero "ocultándolos" con una sección similar a humano por reemplazo de residuos de superficie. Los métodos se describen en Morrison y col., Proc. Nati. Acad. Sci. 82:6851-6855 (1984); Morrison y col., Adv. Immunol . 44:65-92 (1988); Verhoeyen y col., Science 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994) y Patentes de los EE.UU. Nos. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 6.190.370, las cuales se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.

La desinmunización también puede usarse para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Como se usa en la presente, el término "desinmunización" incluye la alteración de un anticuerpo para modificar epítopos de células T (véase, por ejemplo, 09852976A1, WO0034317A2) . Por ejemplo, las secuencias de VH y VL de un anticuerpo de partida se analizan y un "mapa" del epítopo de células T humanas de cada región V muestra la localización de epítopos en relación a la complementariedad-regiones determinantes de complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epítopos de célula T individuales del mapa de epítopos de células T son analizados con el objetivo de identificar sustituciones de aminoácidos alternativos con un riesgo bajo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se designa un intervalo de secuencias de VH y VL alternativas que comprende combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias son incorporadas posteriormente a un intervalo de polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos por Psl y/o PcrV de Pseudomonas o fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en la presente, a los que luego se le analiza la función. Los genes de la cadena pesada y liviana completas que comprenden regiones V y C humanas son luego clonados en vectores de expresión y los plásmidos subsecuentes son introducidos en líneas celulares para la producción de anticuerpo completo. Los anticuerpos son luego comparados en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados y se identifica la variante óptima.

Las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos pueden generarse por cualquier método adecuado conocido en el arte. Los anticuerpos policlonales contra un antígeno" de interés pueden producirse por diferentes procedimientos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, un anti-Psl de Pseudomonas y/o anticuerpo contra PcrV o fragmento de unión a antígeno del mismo puede administrarse a diferentes animales huéspedes incluyendo, a título enunciativo no taxativo, conejos, ratones, ratas, pollos, conejillos de las Indias, cabras, monos, etc., para inducir las producción de suero que contiene anticuerpos policlonales específicos por el antígeno. Los diferentes adyuvantes puede usarse para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie de huésped e incluyen a título enunciativo no taxativo, Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles de plurónico, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guérin) y Corynejbacterium parvum. Los adyuvantes también son bien conocidos en el arte.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en el arte que incluyen el uso de hibridomas, tecnologías recombinantes y de expresión en fagos o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridoma incluyendo aquellas conocidas en el arte y que se describen, por ejemplo, en Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. (1988) .

El ADN que codifica anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, sitio de unión a antígenos) también puede derivarse de bibliotecas de anticuerpos, tal como bibliotecas de expresión en fagos. En particular, el fago puede utilizarse para expresar antígeno-dominios de unión expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humano o murino) . Puede seleccionarse o identificarse un fago con antígeno que expresa un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o esfera. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen dominios de unión fd y M13 expresados en fago con scFv, Fab, Fv OE DAB (región de Fv individual de las cadenas livianas o pesadas) o dominios de anticuerpos Fv estabilizados por disulfuro fusionados en forma recombinante al gen III del fago o proteína del gen VIII. Los métodos ejemplificativos se describen, por ejemplo, en EP 368 684 Bl; Patente de los EE.UU. 5.969.108, Hoogenboom, H.R. y Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy y col. Na . Med. 8:801 (2002); Huie y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 98:2682 (2001); Lui y col., J. Mol. Biol . 325:1063 (2002), cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia Diferentes publicaciones (por ejemplo, Marks y col., Bio/Technology 10:779-783 (1992)) han descrito la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad por mezcla de cadenas, así como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para la construcción de bibliotecas de fagos grandes. En otra modalidad, puede usarse la expresión en ribosomas para reemplazar los bacteriófagos como la plataforma de expresión (véase, por ejemplo, Hanes y col., Nat. Biotechnol. 18:1287 (2000); ilson y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:3150 (2001); o Irving y col., J". Immunol . Methods 248:31 (2001)). En aún otra modalidad, las bibliotecas de superficie celular pueden ser tamizadas para anticuerpos (Boder y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 57:10701 (2000); Daugherty y col., J". Immunol. Methods 243:211 (2000)). Los procedimientos proveen alternativas a las técnicas de hibridomas tradicionales para el aislamiento y posterior clonado de anticuerpos monoclonales.

En los métodos de expresión en fago, los dominios de anticuerpo funcional son expresados en la superficie de partículas de fagos que portan las secuencias polinucleotídicas que los codifican. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican las regiones VH y VL son amplificadas a partir de bibliotecas de ADNc de animal (por ejemplo, bibliotecas de ADNc de humano o murino de tejido linfoide) o bibliotecas de ADNc sintético. En ciertas modalidades, el ADN que codifica para las regiones VH y VL están unidas entre sí por un conector scFv por PCR y clonadas en un vector fagómido (por ejemplo, pCANTAB 6 o pComb 3 HSS) . El vector es electroporado en E. coli y la E. coli es infectada con el fago colaborador. Los fagos usados en estos métodos típicamente son fagos filamentosos que incluyen fd y M13 y las regiones VH o VL están usualmente fusionadas en forma recombinante al gen III o gen VIII del fago. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno de interés (es decir, Psl o PcrV de Pseudomonas) puede ser seleccionado o identificado con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado en una superficie sólida o esfera.

Los ejemplos adicionales de métodos de expresión en fago que pueden usarse para hacer los anticuerpos incluyen aquellos descritos en Brinkman y col., J. Immunol . Methods 182:41-50 (1995); Ames y col., J. Immunol. Methods 184:111-186 (1995); Kettleborough y col., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic y col., Gene 187:9-18 (1997); Burton y col., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Solicitud PCT No. PCT/GB91/01134 ; Publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de los EE.UU. Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108; cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Como se describió en las referencias anteriores y en los ejemplos de más adelante, luego de la selección del fago, las regiones codificantes del anticuerpo del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado y expresarse en cualquier otro huésped deseado, que incluye células de mamífero, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacteria. Por ejemplo, las técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab ' y F(ab')2 también puede emplearse usando métodos conocidos en el arte tales como aquellos descritos en la Publicación PCT WO 92/22324; Mullinax y col., BioTechniques 12 (6) : 864-869 (1992); y Sawai y col., AJRI 34:26-34 (1995); y Better y col., Science 240:1041-1043 (1988) (las referencias se incorporan a modo de referencia en su totalidad) .

Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fvs de cadena simple y anticuerpos incluyen aquellas descritas en las Patentes de los EE.UU. Nos. 4.946.778 y 5.258.498; Huston y col., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu y col., PNAS 50:7995-7999 (1993); y Skerra y col., Science 240:1038-1040 (1988). En ciertas modalidades tal como administración terapéutica, pueden usarse anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes especies de animales, tal como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos con conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies y col., J. Immunol . Methods 125:191-202 (1989); Patentes de los EE.UU. Nos. 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397 que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de anticuerpos de especies no humanas que se unen al antígeno deseado que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de la especie no humana y regiones esqueleto de una molécula de inmunoglobulina humana. Con frecuencia, los residuos del esqueleto en las regiones esqueleto humanas se sustituirán con el correspondiente residuo del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferentemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones en el esqueleto se identifican por métodos bien conocidos en el arte, por ejemplo, por modelado de las interacciones de los residuos de CDR y esqueleto para identificar los residuos importantes del esqueleto para la unión a antígeno y la comparación de secuencia para identificar residuos de esqueleto no usuales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen y col., Patente de los EE.UU. No. 5.585.089; Riechmann y col., Nature 332:323 (1988), que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad) . Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de técnicas conocidas en el arte que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (EP 239,400; Publicación PCT WO 91/09967; Patentes de los EE.UU. Nos. 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), reformulación de los residuos de superficie o remodelamiento de superficie (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5) :489-498 (1991); Studnicka y col., Protein Engineering 7 (6) :805-814 (1994); Roguska . y col., PNAS 91:969-973 (1994)) y mezcla de cadenas (Patente de los EE.UU. No. 5.565.332) .

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden hacerse por una variedad de métodos conocidos en el arte que incluyen métodos de expresión en fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véase también, las Patentes de los EE.UU. Nos. 4.444.887 y 4.716.111; y Publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741; cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando ratones transgénicos que no tienen la capacidad de 1 1 expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por e emplo, los complejos de genes de cadena pesada y liviana de inmunoglobulina humana pueden introducirse al azar o por recombinación homologa en células madre embriónicas de ratón. Adicionalmente , diferentes compañías pueden involucrarse para proveer anticuerpos humanos producidos en ratones transgénicos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita anteriormente.

Los anticuerpos completamente humanos que reconocerán un epítopo seleccionado pueden generarse usando una técnica referida como "selección guiada". En esta estrategia se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers y col., Bio/Technology 12:899-903 (1988). Véase también la Patente de los EE.UU. No. 5.565.332).

En otra modalidad, el ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales deseados puede ser fácilmente aislado y secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que tienen la capacidad de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y liviana de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma aisladas y subclonadas o fagos aislados, por ejemplo, pueden servir como una fuente de el ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego son transferidos a células huéspedes procariotas y eucariotas tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro nodo no producen inmunoglobulinas . Más particularmente, puede usarse ADN aislado (que puede ser sintético como se describe en la presente) para clonar las secuencias constantes y variables para la fabricación de anticuerpos como se describe en Newman y col., Patente de los EE.UU. No. 5.658.570, presentada el 25 de enero de 1995, que se incorpora a modo de referencia en la presente. Las células transformadas que expresan el anticuerpo deseado pueden hacerse crecer en cantidades relativamente altas para proveer provisiones clínicas y comerciales de la inmunoglobulina .

En una modalidad, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo comprende al menos una CDR de cadena pesada o liviana de una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, una molécula de unión aislada comprende al menos dos CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, una molécula de unión aislada comprende al menos tres CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, una molécula de unión aislada comprende al menos cuatro CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, una molécula de unión aislada comprende al menos cinco CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, una molécula de unión aislada de la description comprende al menos seis CDR de una o más moléculas de anticuerpo .

En una modalidad específica, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de la cadena pesada y/o liviana puede inspeccionarse para identificar las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) por métodos que son bien conocidos en el arte, por ejemplo, por comparación con secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y liviana para determinar las regiones de hipervaribilidad de secuencia. Usando técnicas de ADN recombinante de rutina, pueden insertarse una o más de las CDR dentro de regiones esqueleto, por ejemplo, en regiones esqueleto de humano para humanizar un anticuerpo no humano. Las regiones esqueleto pueden ser de origen natural o regiones esqueleto consenso y preferentemente regiones esqueleto humanas (véase, por ejemplo, Chothia y col., J". Mol. Biol. 278:457-479 (1998) para un listado de las regiones esqueleto humanas) . El polinucleótido generado por la combinación de las regiones esqueleto y CDR codifica para un anticuerpo que se une específicamente a al menos un epítopo de un antígeno deseado, por ejemplo, Psl o PcrV. Pueden hacerse una o más sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones esqueleto, y, las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuerpo por su antígeno. Adicionalmente , los métodos pueden usarse para hacer sustituciones de aminoácidos o eliminaciones de uno o más residuos de cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro entre cadenas para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces disulfuro entre las cadenas. La presente descripción abarca otras alteraciones del polinucleótido y se encuentran dentro de las capacidades de una persona con experiencia en el arte.

También se proveen moléculas de unión que comprenden, consisten esencialmente de o consisten de, variantes (que incluyen derivados) de moléculas de anticuerpo (por ejemplo, las regiones VH y/o regiones VL) descritas en la presente, en donde las moléculas de unión o fragmentos de las mismas específicamente se unen a Psl o PcrV de Pseudomonas . Las técnicas estándares conocidas por aquellos con experiencia en el arte pueden usarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de unión o fragmento de la misma que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, que incluye, a título enunciativo no taxativo, mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PC que da como resultado sustituciones de aminoácidos. Las variantes (que incluyen derivados) codifican polipéptidos que comprenden menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2 sustituciones de aminoácidos en relación a la región VH de referencia, VHCDR1, VHCDR2 , VHCDR3 , región VL, VLCDR1, VLCDR2 o VLCDR3. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con carga similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Como alternativa, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis por saturación y los mutantes resultantes pueden tamizarse de acuerdo a su actividad biológica para identificar mutantes que retengan la actividad (por ejemplo, la capacidad para unirse a un Psl o PcrV de Pseudomonas) .

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones solo en regiones esqueleto o solo en regiones de CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones silentes o con cambio de sentido neutro, es decir, no tiene o tiene poco, efecto sobre la capacidad del anticuerpo para unirse a antígeno. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones o mejorar la producción de anticuerpo del hibridoma. Como alternativa, las mutaciones con cambio de sentido no neutro pueden alterar la capacidad del anticuerpo para unir antígeno. La localización de las mutaciones más silentes y con cambio de sentido neutro es más probable que sea en las regiones esqueleto, mientras que la localización de las mutaciones con cambio de sentido más no neutro es más probable que estén en la CDR, a pesar de que este no es un requerimiento absoluto. Una persona con experiencia en el arte 'tendría la capacidad de diseñar y ensayar moléculas mutantes con propiedades deseadas tal como no alteración en la actividad de unión a antígeno o alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejora en la actividad de unión a antígeno o cambio en la especificidad del anticuerpo) . Luego de la mutagénesis , la proteína codificada puede expresarse de rutina y puede determinarse la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada, (por ejemplo, capacidad para unirse a al menos un epítopo de Psl o PcrV de Pseudomonas) usando técnicas descritas en la presente o por técnicas modificadas de rutina conocidas en el arte.

Una modalidad provee un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio de unión anti-Psl y PcrV de Pseudomonas descrito en la presente. En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico contiene un primer dominio de unión a Psl y el segundo dominio de unión a PcrV. Los anticuerpos biespecíficos con más de dos valencias están contempladas. Por ejemplo, los anticuerpos triespecíficso también pueden prepararse usando los métodos descritos en la presente. (Tutt y col., J. Immunol., 147:60 (1991)).

Una modalidad provee un método para producir un anticuerpo biespecífico, que utiliza una cadena liviana simple que puede aparearse con los dominios variables de cadena pesada presentes en la molécula biespecífica . Para identificar esta cadena liviana, se emplean diferentes estrategias. En una modalidad, una serie de anticuerpos monoclonales se identifican para cada antígeno que pueden dirigirse con el anticuerpo biespecífico, seguido por la determinación de cuál de las cadenas livianas utilizadas en estos anticuerpos tiene la capacidad de funcionar cuando se aparean con la cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos identificados con el segundo blanco. De este modo puede identificarse una cadena liviana que puede funcionar con dos cadenas pesadas para permitir la unión a ambos antígenos. En otra modalidad, las técnicas de expresión, tal como expresión en fagos, puede permitir la identificación de una cadena liviana que puede funcionar con dos o más cadenas pesadas. En una modalidad, se construye una biblioteca de fagos que comprende un repertorio diverso de dominios variables de cadena pesada y un dominio variable de cadena simple. Esta biblioteca puede utilizarse adicionalmente para identificar anticuerpos que se unen a diferentes antígenos de interés. Por lo tanto, en ciertas modalidades, los anticuerpos identificados compartirán una cadena liviana común.

En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un Fv de cadena simple (scFv) . En ciertas modalidades el anticuerpo biespecífico comprende dos scFv. Por ejemplo, un scFv puede fusionarse a uno o ambos polipéptidos que contienen dominio CH3 contenidos en un anticuerpo. Algunos métodos comprenden producir una molécula biespecífica en donde se utiliza una o ambas regiones constantes de la cadena pesada que comprende al menos un dominio CH3 junto con un dominio Fv de cadena simple para proveer unión a antígeno.

III . POLIPEPTIDOS ANTICUERPOS La descripción está dirigida a polipéptidos aislados que constituyen moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de las mismas como se describe en la presente, comprenden polipéptidos, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que codifican, por ejemplo, regiones de unión a antígeno específicas por Psl y/o específicas por PcrV derivadas de moléculas de inmunoglobulina . Un polipéptido o secuencia de aminoácidos "derivado de" una proteína designada se refiere al origen del polipéptido. En ciertos casos, el polipéptido o secuencia de aminoácidos el cual derivad de un polipéptido o secuencia de aminoácidos de partida particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la de la secuencia de partida o una poción de la misma, en donde la porción consiste en al menos entre 10 y 20 aminoácidos, al menos entre 20 y 30 aminoácidos, al menos entre 30 y 50 aminoácidos o que puede ser identificada de otra forma por una persona con experiencia ordinaria en el arte como que tiene su origen en la secuencia de partida.

También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 O SEQ ID NO: 74 como se muestra en la Table 2.

Además se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos de VH idéntica a o idéntica excepto por una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos a una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 O SEQ ID NO: 74 como se muestra en la Tabla 2.

Algunas modalidades incluyen una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH, en donde una o más de las regiones VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más secuencias de aminoácidos de VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 de las cadenas pesadas de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 74 como se muestra en la Tabla 2.

Además se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH, en donde una o más de las regiones VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son idénticas a o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos de VHCDRl, VHCDR2 y/o VHCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 74 como se muestra en la Tabla 2. Por lo tanto, de acuerdo con esta modalidad la VH comprende una o más de una VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 idéntica a o idéntica excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más de las secuencias de aminoácidos VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 mostradas en la Tabla 3.

También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VL, por sus siglas en inglés) de inmunoglobulina al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a una o más de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 O SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla 2.

Algunas modalidades describen una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos de VL idéntica a o idéntica excepto por una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos, a una o más de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla 2.

También se provee una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL, en donde una o más de las regiones VLCDR1, VLCDR2 o VLCDR3 de la VL son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a una o más secuencias de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 o VLCDR3 de cadena liviana de referencia de una de una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla 2.

Además se provee una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL, en donde una o más de las regiones VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 de la VL son idénticas a o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más VLCDRl, VLCDR2 y/o VLCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla 2. Por lo tanto, de acuerdo con esta modalidad el VL comprende una o más de una VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 idénticas a o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más de las secuencias de aminoácidos VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 mostradas en la Tabla 3.

En otras modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudo onas, comprende, consiste esencialmente de o consiste de secuencias de aminoácidos de VH y VL al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a: (a) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO : 2, respectivamente, (c) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO : 2, respectivamente, (d) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente, (e) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, (f) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente, (g) SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente, (h) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente; (i) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, 4 respectivamente; o (j) SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 12, respectivamente. En ciertas modalidades, el anticuerpo descrito anteriormente o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 y una VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo descrito anteriormente o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO : 1 y una VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, el anticuerpo descrito anteriormente o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 y una VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.

Ciertas modalidades proveen una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, que comprende una VH de inmunoglobulina y una VL de inmunoglobulina, en donde cada uno comprende una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) , CDR2 y CDR3 , en donde la CDR1 de VH es PYYWT (SEQ ID NO:47), la CDR2 de VH es YIHSSGYTDYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), la CDR3 de VH se selecciona del grupo que consiste en AD DRLRALDI (Psl0096, SEQ ID NO:258), AMDIEPHALDI (Psl0225, SEQ ID NO:267), ADDPFPGYLDI (PS10588, SEQ ID NO:268), ADWNEGRKLDI (Psl0567, SEQ ID NO:269), ADWDHKHALDI (Psl0337, SEQ ID NO:270), ATDEADHALDI (PS10170, SEQ ID NO:271), ADWSGTRALDI (Psl0304, SEQ ID NO:272), GLPEKPHALDI (Psl0348, SEQ ID N0:273), SLFTDDHALDI (PS10573, SEQ ID NO:274), ASPGWHALDI (Psl0574, SEQ ID NO:275), AHIESHHALDI (Psl0582, SEQ ID N0:276), ATQAPAHALDI (Psl0584, SEQ ID NO:277), SQHDLEHALDI (Psl0585, SEQ ID NO:278) y AMPDMPHALDI (Psl0589f SEQ ID NO:279) , la CDR1 de VL es RASQSIRSHLN (SEQ ID NO:50), la CDR2 de VL es GASNLQS (SEQ ID N0:51) y la CDR3 de VL se selecciona del grupo que consiste en QQSTGAWNW (Psl0096, SEQ ID NO:280) , QQDFFHGPN (Psl0225, SEQ ID NO:281), QQSDTFPLK (Psl0588, SEQ ID NO:282), QQSYSFPLT (WapR0004, Psl0567, Psl0573, Psl00574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, SEQ ID NO:52), QDSSSWPLT (Psl0337, SEQ ID NO:283), SQSDTFPLT (Psl0170, SEQ ID NO:284), GQSDAFPLT (Psl0304, SEQ ID NO:285), LQGDLWPLT (Psl0348, SEQ ID NO:286) y QQSLEFPLT (Psl0589, SEQ ID NO: 287) , en donde las CDR de VH y VL CDR son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Ciertas modalidades proveen una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, que comprende una VH de inmunoglob li a y una VL de inmunoglobulina, en donde cada uno comprende una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) , CDR2 y CDR3 , en donde la CDR1 de VH es PYYWT (SEQ ID NO:47), la CDR2 de VH es YIHSSGYTDYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), la CDR1 de VL es RASQSIRSHLN (SEQ ID NO:50), la CDR2 de VL es GASNLQS (SEQ ID NO: 51) y la CDR3 de VH y la CDR3 de VL comprenden, respectivamente, ADWDRLRALDI (Psl0096, SEQ ID NO: 258) y QQSTGAWNW (Psl0096, SEQ ID NO:280); AMDIEPHALDI (Psl0225, SEQ ID NO:267) y QQDFFHGPN (Psl0225, SEQ ID NO:281); ADDPFPGYLDI (Psl0588, SEQ ID NO:268) y QQSDTFPLK (Psl0588, SEQ ID NO:282) ; ADWNEGRKLDI (Psl0567, SEQ ID NO: 269) y la CDR3 de VL es QQSYSFPLT (WapR0004, Psl0567, Psl0573, Psl00574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, SEQ ID NO:52); ADWDHKHALDI (Psl0337, SEQ ID NO:270) y QDSSSWPLT (Psl0337, SEQ ID NO:283); ATDEADHALDI (Psl0170, SEQ ID NO:271) y SQSDTFPLT (Psl0170, SEQ ID NO:284); ADWSGTRALDI (Psl0304, SEQ ID NO:272) y GQSDAFPLT (Psl0304, SEQ ID NO:285); GLPEKPHALDI (Psl0348, SEQ ID NO:273) y (Psl0348, SEQ ID NO:286); SLFTDDHALDI (Psl0573, SEQ ID NO:274) y SEQ ID NO: 52; ASPGWHALDI (Psl0574, SEQ ID NO: 275) y SEQ ID NO: 52; AHIESHHALDI (Psl0582, SEQ ID NO: 276) y SEQ ID NO: 52; ATQAPAHALDI (Psl0584, SEQ ID NO:277) y SEQ ID NO:52; SQHDLEHALDI (Psl0585, SEQ ID NO:278) y SEQ ID NO:52; o AMPDMPHALDI (Psl0589, SEQ ID NO:279) y QQSLEFPLT (Psl0589, SEQ ID NO: 287) .

Ciertas modalidades proveen una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudo onas, que comprende una VH de inmunoglobulina y una VL de inmunoglobulina, en donde la VH comprende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWT IRQPPGKX1LELIGYIHSSGYTDYN PSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWDRLRALDIWGQGTMVTVSS, en donde XI es G o C (Psl0096, SEQ ID NO: 288) y el VL comprende DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLN YQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSTGAWNWFGX2GTKVEIK, en donde X2 es G o C (Psl0096, SEQ ID NO:289); en donde la VH comprende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAMDIEPHALDIWGQGTMVTVSS (Psl0225, SEQ ID NO:290) y el VL comprende DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLN YQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDDGFPNFGGGT VEIK (Psl0225, SEQ ID NO: 291); en donde la VH comprende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADDPFPGYLDIWGQGTMVTVSS (Psl0588, SEQ ID NO: 292) y el VL comprende DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDTFPLKFGGGTKVEIK (Psl0588, SEQ ID NO: 293); en donde la VH comprende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SL SRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWNEGRKLDIWGQGTMVTVSS (Psl0567, SEQ ID NO: 294) y el VL comprende SEQ ID NO: 11; en la presente la VH comprende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWDHKHALDIWGQGTMVTVSS (Psl0337, SEQ ID NO: 295) y el VL comprende DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHL YQQKPGKAPKLLIYGASMLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQDSSSWPLTFGGGTKVEIK (Psl0337, SEQ ID NO:296); en donde la VH comprende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWT IRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARATDEADHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0170, SEQ ID NO:297) y el VL comprende EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLN YQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSDTFPLTFGGGTKLEIK (Psl0170, SEQ ID NO:298); en donde la VH comprende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARADWSGTRALDIWGQGTLVTVSS (Psl0304, SEQ ID NO: 299) y el VL comprende EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCWASQSIRSHLN YQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTL ISSLQPEDFATYYCGQSDAFPLTFGGGTKLEIK (Psl0304, SEQ ID NO: 300); en donde la VH comprende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYY TWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARGLPEKPHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0348, SEQ ID NO:301) y el VL comprende EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLN YQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGDLWPLTFGGGTKLEIK (Psl0348, SEQ ID NO: 302) ; en donde la VH comprende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYY TWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARSLFTDDHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0573, SEQ ID NO: 303) y el VL comprende SEQ ID NO: 11; en donde la VH comprende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDY P SLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARASPGWHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0574, SEQ ID NO:304) y el VL comprende SEQ ID NO: 11; en donde la VH comprende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWT IRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARAHIESHHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0582, SEQ ID NO:305) y el VL comprende SEQ ID NO:ll; en donde la VH comprende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRV ISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARATQAPAHALDI GQGTLVTVSS (Psl0584, SEQ ID NO:306) y el VL comprende SEQ ID NO: 11; en donde la VH comprende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWT IRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARSQHDLEHALDI GQGTLVTVSS (Psl0585, SEQ ID NO:307) y el VL comprende SEQ ID NO: 11; o en donde la VH comprende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYY T IRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNP SLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARAMPDMPHALDI GQGTLVTVSS (Psl0589, SEQ ID NO: 308) y el VL comprende EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLEFPLTFGGGTKLEIK (Psl0589, SEQ ID NO: 325) .

También se describe un fragmento Fv de cadena simple de anticuerpo aislado (ScFv) que se une específicamente a Psl de Pseudomonas (un "ScFv anti-Psl"), que comprende la fórmula VH-L-VL o como alternativa VL-L-VH, en donde L es una secuencia conectora. En ciertos aspectos el conector puede comprender (a) [GGGGS]n, en donde n es O, 1, 2, 3, 4 o 5, (b) [GGGG] n, en donde n es O, 1, 2, 3, 4 o 5 o una combinación de (a) y (b) . Por ejemplo, un conector ej emplificativo comprende: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 326) . En ciertas modalidades el conector además comprende los aminoácidos ala-leu en el extremo C-ternminal del conector. En ciertas modalidades el ScFv anti-Psl comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254 o SEQ ID NO: 262.

También se describe un fragmento Fv de cadena simple (ScFv) de anticuerpo aislado que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas (un "ScFv anti-PcrV" ) , que comprende la fórmula VH-L-VL o como alternativa VL-L-VH, en donde L es una secuencia conectora. En ciertos aspectos el conector puede comprender (a) [GGGGS]n, en donde n es O, 1, 2, 3, 4 o 5, (b) [GGGG]n, en donde n es O, 1, 2, 3, 4 o 5 o una combinación de (a) y (b) . Por ejemplo, un conector ejemplificativo comprende: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 326). En ciertas modalidades el conector además comprende los aminoácidos ala-leu en el extremo C-ternminal del conector.

También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (VH) y/o región variable de cadena liviana (VL) de inmunoglobulina al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a SEQ ID NO: 216 o SEQ ID NO: 217.

Además se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas que comprende una VH, en donde una o más de las regiones VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son idénticas a o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 y/o VHCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NOs : 218-220 como se muestra en la Tabla 3. Por lo tanto, de acuerdo con esta modalidad la VH comprende una o más de VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 idénticas a o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más de las secuencias de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 que se muestran en la Tabla 3.

Además se provee una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas que comprende una VL, en donde una o más de las regiones VLCDR1, VLCDR2 o VLCDR3 de la VL son idénticas a o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos VLCDRl, VLCDR2 y/o VLCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NOs : 221-223 como se muestra en la Tabla 3. Por lo tanto, de acuerdo con esta modalidad la VL comprende una o más de una VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 idénticas a o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más de las secuencias de aminoácidos de VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 que se muestran en la Tabla 3.

También se provee una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas que comprende una VH y una VL, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 255 y SEQ ID NO: 257 y en donde el VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 256.

Además se provee una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas que comprende una VH y una VL, en donde cada uno comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 , en donde la CDR1 de VH es (a) SYAMS (SEQ ID N0:311), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas, la CDR2 de VH es AISGSGYSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 312), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas y la VHCDR3 es EYSISSNYYYGMDV (SEQ ID NO: 313), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; o (b) en donde la CDR1 de VL es WASQGISSYLA (SEQ ID NO:314), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas, la CDR2 de VL es AASTLQS (SEQ ID NO:315), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas y la CDR3 de VL es QQLNSSPLT (SEQ ID NO:316), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; o (c) una combinación de (a) y (b) ; en donde las CDR de VH y VL son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. En ciertos aspectos de esta modalidad, (a) la VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO: 317, (b) el VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO: 318; o (c) una combinación de (a) y (b) .

También se describe una molécula de unión biespecífica aislada, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas y PcrV de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos región variable de cadena pesada (VH) y/o región variable de cadena liviana (VL) de inmunoglobulina al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica to SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229 o SEQ ID NO: 235.

En ciertas modalidades, un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente tiene la estructura de BS1, BS2, BS3 o BS4, todas como se muestra en la FIG. 17. En ciertos anticuerpos biespecífieos descritos en la presente el dominio de unión que se une específicamente a Psl de Pseudomonas comprende una molécula ScFv anti-Psl. En otros aspectos el dominio de unión que se une específicamente a Psl de Pseudomonas comprende una cadena pesada y cadena liviana convencionales. Similarmente en ciertos anticuerpos biespecíficos descritos en la presente el dominio de unión que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas comprende una molécula ScFv anti-PcrV. En otros aspectos el dominio de unión que se une específicamente a PcrV de Pseudomonas comprende una cadena pesada y cadena liviana convencionales.

En ciertos aspectos un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente tiene la estructura BS4 , descrita con detalle en la Solicitud Provisional de los EE.UU. No. 61/624.651 presentada el 16 de abril de 2012 y la Solicitud Internacional No: PCT/US2012/63639 , presentada el 6 de noviembre de 2012 (expediente del agente no. AEMS-115W01, bajo el título "MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF" ) , que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad. Por ejemplo, esta descripción provee un anticuerpo biespecífico en el cual se inserta una molécula ScFv anti-Psl en la región bisagra de cada cadena pesada de un anticuerpo anti-PcrV o fragmento del mismo .

Esta descripción provee una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de anticuerpo y una cadena liviana de anticuerpo, en donde la cadena pesada de anticuerpo comprende la fórmula VH-CH1-H1-L1-S-L2-H2-CH2-CH3, en donde CH1 es un dominio- 1 de región constante de cadena pesada, Hl es un primer fragmento de región bisagra de cadena pesada, Ll es un primer conector, S es una molécula ScFv anti-PcrV, L2 es un segundo conector, H2 es un segundo fragmento de región bisagra de cadena pesada, CH2 es un dominio-2 de región constante de cadena pesada y CH3 es un dominio-3 de región constante de cadena pesada. En ciertos aspectos la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257 o SEQ ID NO: 317. En ciertos aspectos Ll y L2 son los mismos o diferentes e independientemente comprenden (a) [GGGGS] n, en donde n es 0 , 1 , 2 , 3 , 4 o 5 , (b) [GGGG] n, en donde n es O, 1, 2, 3, 4 o 5 o una combinación de (a) y (b) . En ciertas modalidades Hl comprende EPKSC (SEQ ID NO:320) y H2 comprende DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 321) .

En ciertos aspectos, S comprende una molécula ScFv anti-Psl que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:240, SEQ ID N0:241, SEQ ID N0:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253, SEQ ID NO:254 o SEQ ID NO:262 O cualquier combinación de dos o más de estas secuencias de aminoácidos .

En otros aspectos, CH2-CH3 comprende (SEQ ID NO:322), en donde XI es M o Y, X2 es S o T y X3 es T o E. En otros aspectos la cadena liviana de anticuerpo comprende VL-CL, en donde CL es una región constante de cadena liviana kappa de anticuerpo o una región constante de cadena liviana lambda de anticuerpo. En otros aspectos VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 256 o SEQ ID NO: 318. CL puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 323.

Además se provee una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a Psl de Pseudomonas y PcrV de Pseudomonas que comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 264 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 263.

En algunas modalidades, los anticuerpos biespecífieos de la invención pueden ser un fragmento Fv de cadena simple (se) en tándem, que contiene dos fragmentos scFv diferentes (es decir, V2L2 y W4) sujetos covalentemente entre sí por un conector (por ejemplo, un conector polipeptídico) . (Ren-Heidenreich y col. Cáncer 100:1095-1103 (2004); Korn y col. J Gene Med 5:642-651 (2004)). En algunas modalidades, el conector puede contener o ser, todo o parte de una región pesada polipeptídica de cadena pesada tal como un dominio CH1. En algunas modalidades, los dos fragmentos de anticuerpo pueden estar sujetos covalentemente entre sí por medio de un conector poliglicina-serina o poliserina-glicina como se describe en, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. Nos. 7.112.324 y 5.525.491, respectivamente. Los métodos para generar anticuerpos scFv en tándem biespecífieos se describen en, por ejemplo, Maletz y col. Int J Cáncer 93:409-416 (2001); y Honemann y col. Leukemia 18 : 636-644 (2004) . Como alternativa, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" como se describe en, por ejemplo, Zapata y col. Protein Eng. 8:1057-1062 (1995). Brevemente, estos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de unión a antígeno.

La descripción también abarca formas variantes de anticuerpos biespecíficos tal como las moléculas de inmunoglobulina de dominio variable dual (DVD-Ig) tetravalentes descritas en Wu y col. (2007) Nat Biotechnol 25 (11) : 1290-1297. Las moléculas DVD-Ig son diseñadas de forma tal que dos dominios variables de cadena liviana (VL) diferentes de dos anticuerpos parentales están unidos en tándem directamente o por medio de un conector corto por técnicas de ADN recombinante , seguido por el dominio constante de la cadena liviana. Por ejemplo, el polipéptido de la cadena liviana de DVD-Ig puede contener en tándem: (a) el VL de V2L2 y (b) el VL de WapR-004. Similarmente , la cadena pesada comprende los dos dominios variables de la cadena pesada (VH) diferentes unidos en tándem, seguido por el dominio constante CH1 y la región Fe. Por ejemplo, el polipéptido de la cadena pesada de DVD-Ig puede contener en tándem: (a) la VH de V2L2; y (b) la VH de WapR-004. En este caso, la expresión de las dos cadenas en una célula da como resultado un heterotetrámero que contiene cuatro sitios de combinación a antígeno, dos que se unen específicamente a V2L2 y dos que se unen específicamente a Psl. Los métodos para generar las moléculas DVD-Ig desde dos anticuerpos parentales se describen adicionalmente en, por ejemplo, las Publicaciones PCT Nos. WO 2008/024188 y WO 2007/024715.

En ciertas modalidades, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en la presente se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor de 5 x 10~2 M, 10~2 M, 5 x 10~3 M, 10"3 M, 5 x 10"4 M, 10"4 , 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10~7 M, 10"7 M, 5 X 10~8 M, 10~8 M, 5 X 10~9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10"12 M, 10"12 M, 5 x 10"13 , 10"13 M, 5 x 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M o 10"15 M.

En modalidades específicas, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en la presente se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) en un intervalo de aproximadamente entre 1 x 10"10 y aproximadamente 1 x 10"6 M. En una modalidad, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en la presente se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1,18 x 10" M, determinado por el ensayo de unión OCTET descrito en la presente. En otra modalidad, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en la presente se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, con una afinidad caracterizada por una D de aproximadamente 1,44 x 10"7 M, determinado por el ensayo de unión OCTET8 descrito en la presente.

Algunas modalidades incluyen las moléculas de unión aisladas por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de la misma como se describe anteriormente, que (a) puede inhibir la unión de Pseudomonas aeruginosa a células epiteliales, (b) puede promover la OPK de P. aeruginosa o (c) puede inhibir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales y puede promover la OPK de P. aeruginosa .

En algunas modalidades la molécula de unión aislada por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de la misma como se describe anteriormente, en donde se logra la inhibición máxima de la unión de P. aeruginosa a células epiteliales a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 50 ug/ml o menor, 5,0 µg/ml o menor o aproximadamente 0,5 µg/ml o menor o a una concentración de anticuerpo que varía en un intervalo entre aproximadamente 30 µg/ml y aproximadamente 0,3 µg/ml o a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 1 µg/ml o a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,3 ug/mi .

Ciertas modalidades incluyen la molécula de unión aislada por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de la misma como se describió anteriormente, en donde la EC50 de OPK es menor de aproximadamente 0,5 ug/ml, menor de aproximadamente 0,05 ug/ml o menor de aproximadamente 0,005 ug/ml o en donde la EC50 de OPK varía en un intervalo entre aproximadamente 0,001 ug/ml y aproximadamente 0,5 ug/ml o en donde la EC50 de OPK varía en un intervalo entre aproximadamente 0,02 µg/ml y aproximadamente 0,08 g/ml o en donde la EC50 de OPK varía en un intervalo entre aproximadamente 0,002 ug/ml y aproximadamente 0,01 ug/ml o en donde la EC50 de OPK es menor de aproximadamente 0,2 ig/ml o en donde la EC50 OPK es menor de aproximadamente 0,02 µ9/p?1. En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une específicamente al mismo epítopo PsI que el anticuerpo monoclonal WapR-004, WapR-004RAD, Cam-003, Cam-004 o Cam-005 o inhibirá competitivamente la unión de el anticuerpo monoclonal a Psl de Pseudomonas. El WapR-004RAD es idéntico a WapR-004 excepto por una sustitución del aminoácido G98A de la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 11.

Algunas modalidades incluyen mutantes de WapR-004 (W4) que comprenden una secuencia de aminoácidos de la molécula scFv-Fc idéntica a o idéntica excepto por una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos a una o más de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; o SEQ ID NO: 146.

Otras modalidades incluyen imitantes de WapR-004 ( 4) que comprenden una secuencia de aminoácidos de molécula scFv-Fc al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; o SEQ ID NO: 146.

En algunas modalidades, una molécula de unión anti- Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal WapR-001, WapR-002 o WapR-003 o inhibirá competitivamente la unión de el anticuerpo monoclonal a Psl de Pseudomonas.

En ciertas modalidades, una molécula de unión anti- Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal WapR-016 o inhibirá competitivamente la unión del anticuerpo monoclonal a Psl de Pseudomonas.

TABLA 2: Secuencias de aminoácidos de VH y VL de referencia* Nombre del VH VL anticuerpo ALDIWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 74 V2L2 EMQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGI FTFSSYAMNWVRQAPGEGLEWVSAIT RNDLGWYQQKPGKAPKLVIYSASTLQSGV ISGTTAYYTDSVKGRFTISRDNSKNT PSRFSGSGSGTDFTLSISSLQPDDFATYY LYLQMNSLRAGDTAVYYCAKEEFLPG CLQDYNYPWTFGQGTKVEIK THYYYGMDV GQGTTVTVSS SEQ ID NO: 217 SEQ ID NO: 216 * Las secuencias de aminoácidos de CDR1 , CDR2 y CDR3 de VH y VL están subrayadas TABLA 3: Secuencias de aminoácidos de CDR1 , CDR2 y CDR3 de VH y VL de referencia En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une específicamente al mismo epítopo de PcrV que el anticuerpo monoclonal V2L2, y/o inhibirá competitivamente la unión de el anticuerpo monoclonal a PcrV de Pseudomonas .

Por ejemplo, en ciertos aspectos la molécula de unión anti-PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo comprende V2L2-GL y/o V2L2-MD.

En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une específicamente al mismo epítopo de PcrV que el anticuerpo monoclonal 29D2, y/o inhibirá competitivamente la unión de el anticuerpo monoclonal a PcrV de Pseudomonas.

Cualquier molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente pueden además incluir polipép idos adicionales, por ejemplo, un péptido señal para dirigir la secreción del polipéptido codificado, regiones constantes de anticuerpo como se describe en la presente u otros polipéptidos heterologos como se describe en la presente. Adicionalmente, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas de la descripción incluyen fragmentos polipeptídicos como se describe en otra parte. Adicionalmente las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente pueden ser polipéptidos de fusión, fragmento Fab, scFv u otros derivados, como se describe en la presente.

Además, como se describe con más detalle dentro de la presente, la descripción incluye composiciones que comprenden moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudo onas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente.

También lo entenderá una persona con experiencia ordinaria en el arte que las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente pueden ser modificados tal que pueden variar en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión de origen natural del cual derivan. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de aminoácidos derivada de una proteína designada puede ser similar, por ejemplo, tener un cierto porcentaje de identidad con la secuencia de partida, por ejemplo, puede ser 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a la secuencia de partida.

Como se sabe en el arte, la "identidad de secuencia" entre dos polipéptidos se determina por comparación de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Cuando se describe en la presente, si cualquier polipéptido particular es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntico a otro polipéptido puede determinarse usando métodos y programas de computadora/sof ware conocido en el arte tal como, a título enunciativo no taxativo, el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . El BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y aterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineamiento de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se ajustan, por supuesto, tal que el porcentaje de identidad se calcula para toda la longitud de la secuencia del polipéptido de referencia y se permite no coincidencias en la homología de hasta 5% del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.

El porcentaje de "identidad de secuencia" también puede determinarse por comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación. Con el objetivo de alinear óptimamente secuencias para la comparación, la porción de una secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones llamadas no coincidencias mientras que la secuencia de referencia se mantiene constante. Un alineamiento óptimo es ese alineamiento que, incluso con no coincidencias, produce el mayor número posible de posiciones "idénticas" entre las secuencias de referencia y de comparación. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias puede determinarse usando la versión del programa "BLAST 2 Sequences" que se encuentra disponible del Centro Nacional de Información Biotecnológica con fecha Io de septiembre de 2004, programa que incorpora los programas BLASTN (para comparación de secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para comparación de secuencia polipeptídicas) , programas que son en base al algoritmo de Karlin y Altschul (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (12 ) : 5873 -5877 , 1993). Cuando se utiliza "BLAST 2 Sequences", pueden usarse los parámetros que eran parámetros por defecto al 1° de septiembre de 2004, para el tamaño de palabra (3) , penalidad por no coincidencia abierta (11) , penalidad por no coincidencia de extensión (1) , caída para no coincidencia (50) , valor esperado (10) y cualquier otro parámetro requerido que incluye a título enunciativo no taxativo opción de matriz.

Adicionalmente, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos o aminoácidos, eliminaciones o inserciones que llevan a sustituciones o cambios conservativos en regiones de aminoácidos "no esenciales". Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o de aminoácidos derivada de una proteína designada puede ser idéntica a la secuencia de partida excepto por una o más sustituciones individuales de aminoácidos, inserciones o eliminaciones, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte o más sustituciones individuales de aminoácidos, inserciones o eliminaciones. En ciertas modalidades, una secuencia polipeptídica o de aminoácidos derivada de una proteína designada tienen entre una y cinco, entre una y diez, entre una y quince o entre una y veinte sustituciones individuales de aminoácidos, inserciones o eliminaciones en relación a la secuencia de partida.

Una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente puede comprender, consistir esencialmente o consistir de una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión a blanco y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción con la cual normalmente no está unida por naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que son juntadas en el polipéptido de fusión o que pueden existir normalmente en la misma proteína pero son colocadas en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión pueden crearse, por ejemplo, por síntesis química o por creación y traducción de un polinucleótido en el cual las regiones peptídicas están codificadas en la relación deseada.

El término "heterologo" como se aplica a un polinucleótido, polipéptido u otros grupos significa que el polinucleótido, polipéptido u otro grupo deriva de una entidad diferente de la del resto de la entidad con la cual se está comparando. En un ejemplo no limitante, un "polipéptido heterologo" a ser fusionado con una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo deriva de un polipéptido no inmunoglobulina de la misma especie o un polipéptido inmunoglobulina o no inmunoglobulina de una especie diferente.

IV. PROTEÍNAS DE FUSIÓN Y CONJUGADOS DE ANTICUERPO En algunas modalidades, las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse en muchas veces en forma conjugada. En aún otra modalidad, las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse en forma no conjugada, luego en forma conjugada o vice versa.

En modalidades específicas, las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos pueden conjugarse con uno o más agente antimicrobianos, por ejemplo, Polimixina B (PMB) . La PMB es un antibiótico lipopeptídico pequeño aprobado para el tratamiento de infecciones por gram negativos resistentes a mutifármacos . Además de su actividad bactericida, la PMB se une a lipopolisacárido (LPS) u neutraliza sus efectos proinflamatorios . (Dixon, R.A. & Chopra, I. J Antimicrob Chemother 18, 557-563 (1986)). El LPS se piensa que contribuye significativamente a la inflamación y el inicio de la sepsis por gram negativos. (Guidet, B., y col., Chest 106, 1194-1201 (1994)). Se ha mostrado que los conjugados de PMB con moléculas transportadoras neutralizan el LPS y media la protección en modelos animales de endotoxemia e infección. (Drabick, J.J., y col. Antimicrob Agents Chemother 42, 583-588 (1998)). También se describe un método para unir una o más moléculas de PMB a residuos de cisteína introducida en la región Fe de anticuerpos monoclonales (mAb) de la descripción. Por ejemplo, los conjugados Cam-003-PMB retuvieron la unión específica, mediada por mAb a P. aeruginosa y también retuvieron la actividad OPK. Adicionalmente , los conjugados mAb-PMB se unen y neutralizan LPS in vitro. En modalidades específicas, las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos pueden combinarse con antibióticos (por ejemplo, Ciprofloxacia, Meropenem, Tobramicina, Aztreonam) .

En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente puede comprender una secuencia de aminoácidos heteróloga o uno o más de otros grupos que normalmente no están asociados con un anticuerpo (por ejemplo, un agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de respuesta biológica, agente farmacéutico, una linfoquina, un anticuerpo heterologo o fragmento del mismo, una marca que se puede detectar, polietilenglicol (PEG) y una combinación de dos o más de cualquiera de los mencionados agentes) . En otras modalidades, una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede comprender una marca que se puede detectar seleccionada del grupo que consiste en una enzima, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente , una marca bioluminiscente , una marca radiactiva o una combinación de dos o más de cualquiera de las mencionadas marcas que se pueden detectar.

V. POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN PARA MOLÉCULAS DE UNIÓN También se proveen en la presente moléculas de ácido nucleico que codifican para las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descrito en la presente.

Una modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ IS NO: 74 o SEQ ID NO: 216 como se muestra en la Tabla 2.

Una modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina de la SEQ ID NO: 257 o SEQ ID NO: 259. Por ejemplo las secuencias de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 261 y SEQ ID NO: 259, respectivamente.

Otra modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VH idéntica a o idéntica excepto por una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos a una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 74 o SEQ ID NO: 216 como se muestra en la Tabla 2.

Otra modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una VH, en donde una o más de las regiones VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son idéntica a o idéntica excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 y/o VHCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 74 o SEQ ID NO: 216 como se muestra en la Tabla 2.

Otra modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH, en donde una o más de las regiones VHCDR1 , VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son idénticas a o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 y/o VHCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 74 como se muestra en la Tabla 2.

Otra modalidad provee una molécula de unión aislada por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificado por el polinucleótido que específica o preferencialmente se une a Psl y/o PcrV de Pseudomonas .

Otra modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VL) de inmunoglobulina al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 217 como se muestra en la Tabla 2.

Otra modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VL) de inmunoglobulina de la SEQ ID NO: 256, por ejemplo, la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 260.

Otra modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VL idéntica a o idéntica excepto por una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos con una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 217 como se muestra en la Tabla 2.

Otra modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una VL, en donde una o más de las regiones de VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 de la VL son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a una o más secuencias de aminoácidos de VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 de cadena liviana de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 217 como se muestra en la Tabla 2.

Otra modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL, en donde una o más de las regiones VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 de la VL son idénticas a o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, con una o más secuencias de aminoácidos de una o más secuencias de aminoácidos de VLCDRl, VLCDR2 y/o VLCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 217 como se muestra en la Tabla 2.

En otra modalidad, las moléculas de unión aisladas por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende el VL codificado por el polinucleótido se une específica o preferencialmente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas .

Una modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una molécula scFv que incluye una VH y una VL, cuando el scFv es al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a una o más de la SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70 como se muestra en la Tabla 4.

TABLA 4: Secuencias de ácidos nucleicos scFv de referencia En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, comprende, consiste esencialmente de o consiste de secuencias de aminoácidos de VH y VL al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a: (a) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (c) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (d) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 , respectivamente, (e) SEQ ID NO : 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, (f) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente, (g) SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 respectivamente, (h) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente; (i) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente; o (j) SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 12, respectivamente .

En ciertas modalidades, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor de 5 x 10~2 , 10"2 M, 5 x 10~3 M, 10"3 M, 5 x 10"4 M, 10"4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 X 10"7 M, 10"7 M, 5 X 10~8 , 10"8 M, 5 X 10"9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10"12 M, 10"12 M, 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 x 10"14 M, 10~14 M, 5 x 10"15 M o 10"15 M.

En modalidades específicas, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) en un intervalo de entre aproximadamente 1 x 10"10 y aproximadamente 1 x 10"6 M. En una modalidad, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1,18 x 10 M, determinado por el ensayo de unión OCTET descr to en la presente. En otra modalidad, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1,44 x 10~7 M, determinado por el ensayo de unión 0CTET° descrito en la presente.

En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo codificado por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente al mismo epítopo de Psl que el anticuerpo monoclonal WapR-004, apR-004RAD, Cam-003, Cam-004 o Cam-005 o inhibirá competitivamente la unión de el anticuerpo monoclonal a Psl de Pseudomonas; y/o se une específicamente al mismo epítopo de PcrV que el anticuerpo monoclonal V2L2 o inhibirá competitivamente la unión de el anticuerpo monoclonal a PcrV de Pseudomonas. El WapR-004RAD es idéntico a WapR-004 excepto por una sustitución en el ácido nucleico G293C de la secuencia del ácido nucleico de VH que codifica la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 11 (una sustitución del nucleótido en la porción que codifica para VH de la SEQ ID NO: 71 en la posición 317) . La secuencia de ácido nucleico que codifica para VH de WapR-004RAD se presenta como SEQ ID NO 76.

Algunas modalidades proveen un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de la molécula scFv-Fc mutante W4 idéntica a o idéntica excepto por una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos a una o más de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; O SEQ ID NO: 146.

Otras modalidades proveen un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de la molécula scFv-Fc mutante W4 al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; o SEQ ID NO: 146.

Una modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para una molécula scFv-Fc mutante 4 , en donde el ácido nucleico es al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntico a una o más de la SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151 O SEQ ID NO: 152, SEQ IS NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, -SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO : 213, SEQ ID NO: 214; o SEQ ID NO: 215.

Una modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente de o consiste de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido V2L2, en donde el ácido nucleico es al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntico a una o más de la SEQ ID NO: 238 o SEQ ID NO: 239.

En otras modalidades, una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo codificado por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal WapR-001, apR-002 o WapR-003 o inhibirá competitivamente la unión de el anticuerpo monoclonal a Psl de Pseudomonas.

En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo codificado por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal WapR-016 o inhibirá competitivamente la unión de el anticuerpo monoclonal a Psl de Pseudomonas.

La descripción también incluye fragmentos de los polinucleótidos como se describe en otro lugar dentro de la presente. Adicionalmente se proveen polinucleótidos que codifican para polinucleótidos fusión, fragmento Fab y otros derivados, como se describe en la presente.

Los polinucleótidos pueden producirse o fabricarse por cualquier método conocido en el arte. Por ejemplo, si la secuencia del nucleótido del anticuerpo es conocida, puede ensamblarse un polinucleótido que codifica para el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier y col., BioTechniques 17:242 (1994)), en donde, brevemente, involucra la síntesis de oligonucleótidos que se superponen que contienen porciones de la secuencia que codifica para el anticuerpo, apareamiento y ligado de esos oligonucleótidos y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.

Como alternativa, puede generarse un polinucleótido que codifica para una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo a partir de un ácido nucleico de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo particular no está disponible, pero la secuencia de la molécula de anticuerpo es conocida, puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico que codifique para el anticuerpo u obtenerse a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferentemente poli A+AR , aislado de, cualquier tejido o célula que expresa el anticuerpo o las células de hibridoma seleccionada para expresar un anticuerpo) por amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridizar con los extremos 3 ' y 51 de la secuencia o por clonado usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia del gen particular a identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica para el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados por PCR pueden ser clonados entonces en vectores de clonado que pueden replicarse usando cualquier método bien conocido en el arte.

Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos de una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, su secuencia de nucleótidos puede manipularse usando métodos bien conocidos en el arte para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante , mutagénesis dirigida a sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) y Ausubel y col., eds . , Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998) , las cuales se incorporan a modo de referencia a la presente en su totalidad) , para generar anticuerpos que tienen una secuencia diferente de aminoácidos, por ejemplo para crear sustituciones de aminoácidos, eliminaciones, y/o inserciones .

Un polinucleótido que codifica para una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica para una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por ADN de cadena simple o doble, ADN que sea una mezcla de regiones de cadena simple y doble cadena, ARN de simple y doble cadena y ARN que es una mezcla de regiones de simple y doble cadena, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden de simple cadena o, más típicamente, doble cadena o una mezcla de regiones de simple y doble cadena. Adicionalmente, un polinucleótido que codifica para una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por regiones de triple cadena que comprende ARN o ADN o ARN y ADN. Un polinucleótido que codifica para una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo también puede contener una o más bases modificadas o esqueletos de ADN o ARN modificados para estabilidad o para otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Pueden hacerse una variedad de modificaciones a ADN y ARN; por lo tanto, "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas .

Un polinucleótido aislado que codifica para una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglob lina (por ejemplo, una porción de cadena pesada o porción de cadena liviana de inmunoglobulina) puede crearse por introducción de una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótido en la secuencia de nucleótidos de la inmunoglobulina tal que una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos se introduzcan en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse por técnicas estándares, tal como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se hacen en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales.

VI. EXPRESIÓN DE POLIPEPTIDOS ANTICUERPO Tal como se conoce, el ARN puede aislarse a partir de células de hibridoma originales o de otras células transformadas por técnicas estándares, tales como extracción con isotiocianato de guanidinio y precipitación segiuda por centrifugación o cromatografía. Cuando se desea, el ARNm puede aislarse a partir de ARN total por técnicas estándares tales como cromatografía sobre celulosa oligo dT. Las técnicas adecuadas son familiares en el arte.

En una modalidad, los ADNc que codifican para las cadenas livianas y pesadas de la molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo pueden hacerse, simultáneamente o por separado, usando transcriptasa reversa y ADN polimerasa de acuerdo con métodos bien conocidos. Puede iniciarse una PCR con cebadores consenso de la región constante o por cebadores más específicos en base a las secuencias publicadas de ADN y aminoácidos de la cadena pesada y liviana. Tal como se describe anteriormente, la PCR también se puede usar para aislar clones de ADN que codifican para las cadenas livianas y pesadas del anticuerpo. En este case las bibliotecas pueden ser tamizadas por cebadores consenso o sondas homologas más grandes, tal como sondas de región constante de ratón.

El ADN, típicamente ADN plasmídico, puede aislarse a partir de células usando técnicas conocidas en el arte, mapeado por restricción y secuenciado de acuerdo con técnicas estándares, bien conocidas, indicadas con detalle, por ejemplo, en las referencias anteriores en relación a técnicas de ADN recombinantes . Por supuesto que el ADN puede sintetizarse de acuerdo con la presente descripción en cualquier punto durante el proceso de aislamiento o análisis posterior .

Luego de la manipulación del material genético aislado para proveer una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo de la descripción, los polinucleótidos que codifican moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, típicamente son insertados en un vector de expresión para la introducción en células huéspedes que pueden usarse para producir la cantidad deseada de moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas.

La expresión recombinante de un anticuerpo o fragmento, derivado o análogo del mismo, por ejemplo, una cadena pesada o liviana de un anticuerpo que se une a una molécula blanco descrita en la presente, por ejemplo, Psl y/o PcrV, requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica para una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o liviana de un anticuerpo o porción de la misma (que contiene el dominio variable de la cadena pesada o liviana) , de la descripción, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en el arte. Por lo tanto, en la presente se describen métodos para preparar una proteína por expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo. Para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican para anticuerpo y señales apropiadas de control transcripcional y traduccional pueden usarse métodos que son bien conocidos por aquellos con experiencia en el arte. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas in vitro de ADN recombinante, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo. La descripción, por lo tanto, provee vectores que pueden replicarse que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican para una molécula de anticuerpo de la descripción o una cadena pesada o liviana del mismo o un dominio variable de la cadena pesada o liviana, ligado operativamente a un promotor. Los vectores puede incluir la secuencia de nucleótidos que codifican para la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, Publicación PCT WO 86/05807; Publicación PCT WO 89/01036; y Patente de los EE.UU. No. 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en el vector para la expresión de la cadena liviana o pesada completa.

El término "vector" o "vector de expresión" se usa en la presente para referirse a vectores usados de acuerdo con la presente descripción como un vehículo para introducirle y expresar un gen deseado en una célula hospedera. Tal como conocen las personas con experiencia en el arte, los vectores pueden seleccionarse fácilmente del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente descripción comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar el clonado del gen deseado y la capacidad de entrar y/o replicarse en células eucarióticas o procarióticas Para el propósito de esta descripción, pueden emplearse numerosos sistemas vectores de expresión. Por ejemplo, una clase de vectores que utiliza elementos de ADN que derivan de virus animales tal como el virus de papiloma bovino, virus del polioma, adenovirus, virus vacuna, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros involucran el uso de sistemas policistrónicos con sitios de unión a ribosoma internos. Adicionalmente, las células que han integrado el ADN en sus cromosomas pueden seleccionarse por introducción de uno o más marcadores que permiten la selección de células huéspedes transfectadas . El marcador puede proveer prototropía a un huésped auxotrófico, resistencia a biocida (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados tales como cobre. El gen marcador de selección puede estar unido directamente a las secuencias de ADN a ser expresadas o introducido en la misma célula por cotransformación. Los elementos adicionales también pueden necesitarse para la síntesis óptima del ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias señales, señales de corte y empalme, así como promotores transcripcionales, potenciadores y señales de terminación.

En algunas modalidades los genes clonados de región variable son insertados en un vector de expresión junto con los genes sintéticos de la región constante de la cadena pesada y liviana (por ejemplo, humano) como se describió anteriormente. Por supuesto que cualquier vector de expresión que tiene la capacidad de generar la expresión en células eucarióticas puede usarse en la presente descripción. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, a título enunciativo no taxativo los plásmidos pcDNA3 , pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl y pZeoSV2 (disponible de Invitrogen, San Diego, CA) y el plásmido pCI (disponible de Promega, Madison, WI) . En general, el tamiza e de grandes números de células transformadas para aquellas que expresan en forma adecuada niveles altos de cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulina es un experimento de rutina que puede realizarse, por ejemplo, por sistemas robóticos.

Más generalmente, una vez que se ha preparado el vector o la secuencia de ADN que codifica para una subunidad monomérica de la molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo de la descripción, el vector de expresión puede introducirse en una célula hospedera apropiada. La introducción del plásmido en la célula hospedera puede realizarse por diferentes técnicas bien conocidas por aquellos con experiencia en el arte. Estas incluyen, a título enunciativo no taxativo, transfección (que incluye electroforesis y electroporación) , fusión de protoplastos , precipitación con fosfato de calcio, fusión de células con ADM empaquetado, microinyección e infección con virus intacto Véase, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodríguez y Denhardt, Eds . , Butterworths , Boston, Mass., Capítulo 24.2, pp . 470-472 (1988). Típicamente, la introducción de plásmidos en un huésped se hace por electroporación. Las células huéspedes que portan la construcción de expresión se hacen crecer bajo condiciones apropiadas para la producción de las cadenas livianas y cadenas pesadas y se ensayan para la síntesis de proteína de cadena pesada y/o liviana. Las técnicas de ensayo ej emplificativas incluyen ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) o análisis por clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) , inmunohistoquímica y similares.

El vector de expresión es transferido a una célula hospedera por técnicas convencionales y las células transfectadas son luego cultivadas por técnicas convencionales para producir un anticuerpo para usar en los métodos descritos en la presente. Por lo tanto, la descripción incluye células huéspedes que contienen un polinucleótido que codifica para una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo o una cadena pesada o liviana del mismo, ligado operativamente a un promotor heterólogo. En algunas modalidades para la expresión de anticuerpos de doble cadena, se pueden coexpresan vectores que codifican para las cadenas pesadas y livianas en la célula hospedera para la expresión de la molécula completa de inmunoglobulina, como se detalla más adelante.

Ciertas modalidades incluyen un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para las VH y VL descritas anteriormente, en donde una molécula de unión o fragmento de unión a antígeno del mismo expresados por el polinucleótido se une específicamente Psl y/o PcrV de Pseudomonas. En algunas modalidades el polinucleótido como se describe codifica para una molécula scFv que incluye VH y VL, al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a una o más de la SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO : 70 como se muestra en la Tabla 4.

Algunas modalidades incluyen vectores que comprenden los polinucleótidos descritos anteriormente. En algunas modalidades, los polinucleótidos están asociados operativamente con un promotor. En modalidades adicionales, la descripción provee células huéspedes que comprenden los vectores. En otras modalidades, la descripción provee vectores en los cuales el polinucleótido está asociado operativamente con un promotor, en donde los vectores pueden expresar una molécula de unión que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas en una célula hospedera adecuada.

También se provee un método para producir una molécula de unión o fragmento de la misma que se une específicamente a Psl y/o PcrV de Pseudomonas, que comprende cultivar una célula hospedera que contiene un vector que comprende los polinucleótidos descritos anteriormente y eliminar el anticuerpo o fragmento del mismo. En otras modalidades, la descripción provee una molécula de unión aislada o fragmento de la misma producido por el método descrito anteriormente.

Como se usa en la presente, "células huéspedes" se refiere a células que portan vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican para al menos un gen heterólogo. En las descripciones de procesos para el aislamiento de anticuerpos a partir de huéspedes recombinantes , los términos "célula" y "cultivo celular" se usan en forma intercambiable para indicar la fuente de anticuerpo a menos que se especifique claramente de otra forma. En otras palabras, la recuperación del polipéptido de las "células" puede significar a partir de células completas centrifugadas o a partir del cultivo de células que contiene tanto el medio como las células en suspensión.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de huésped-vector de expresión para expresar las moléculas de anticuerpo para usar en los métodos que se describen en la presente. Los sistemas de huésped - vector de expresión representan vehículos mediante los que se pueden producir y subsiguientemente purificar las secuencias codificantes de interés, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes nucleotídicas adecuadas, expresar una molécula de anticuerpo de la descripción in situ. Estas incluyen a título enunciativo no taxativo microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformados con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen las secuencias codificantes de anticuerpos; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión recombinantes de levaduras que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas celulares de insectos infectadas con vectores de expresión recombinantes virales (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión viral recombinantes (por ejemplo, virus mosaico de coliflor, CaMV; virus mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con los vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que portan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores que derivan del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de virus vaccinia de 7,5 K) . Las células bacterianas tales como las células de Escherichia coli o eucariotas, en especial para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa, se usan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamíferos tales como las células de ovario de hámster chino (CHO) , en conjunto con un vector tal como el elemento promotor génico intermediario temprano mayor del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking y col., Gene 45:101 (1986); Cockett y col., Bio/Technology 8:2 (1990)).

La línea de células huéspedes que se usa para la expresión de proteínas con frecuencia es de origen mamífero; las personas con experiencia en el arte poseen la capacidad para determinar las líneas de células huéspedes particulares que están mejor adecuadas para el producto génico deseado a expresar en la misma. Los ejemplos de líneas de células huéspedes incluyen a, a título enunciativo no taxativo, las células CHO (ovario de hámster chino) , DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, DHFR menos) , HELA (carcinoma cervical humano) , CVI (línea de riñon de mono) , COS (un derivado de CVI con el antígeno SV40 T) , VERY, BHK (riñon de hámster bebé), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón) , HAK (línea de riñon de hámster), SP2/0 (mieloma de ratón), P3x63 -Ag3.653 (mieloma de ratón) , BFA-lclBPT (células endoteliales bovinas) , RAJI (linfocito humano) y 293 (riñon humano) . Las líneas de células huéspedes están típicamente disponibles a partir de servicios comerciales, la American Tissue Culture Collection o a partir de la literatura publicada.

Además, puede elegirse una cepa de células huéspedes que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico en la forma deseada específica. Las modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, clivaje) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células huéspedes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-traduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse las líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de de la proteína foránea expresada. Para este fin, pueden usarse células huéspedes eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación y fosforilación del producto génico.

Para una producción a largo plazo de alto rendimiento de proteínas recombinantes , se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden construirse líneas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, pueden transformarse las células huéspedes con ADN controlado por elementos control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN foráneo, las células modificadas pueden hacerse crecer entre 1 y 2 días en un medio enriquecido y luego se pasan a un medio selectivo. El marcador de selección en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y le permite a las células integrar establemente el plásmido a sus cromosomas y crecer para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse a líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para construir líneas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo.

Puede usarse un número de sistemas de selección, incluyendo a título enunciativo no taxativo la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler y col., célula 21:223 (1977)), los genes de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y col., célula 22:817 1980) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, puede usarse la resistencia a antimetabolitos como base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotraxato ( igler y col., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1521 (1981)); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, Bioterapia 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 250:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. J?ev. Biochem. 52:191-217 (1993) ;,TIB TECH 11 (5) : 155-215 (Mayo, 1993); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col., Gene 30:147 (1984) . Los métodos comúnmente conocidos en el arte de la tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli y col. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin y col., J. Mol. Biol . 150:1 (1981) , que se incorporan a modo de referencia en la presente en su totalidad.

Los niveles de expresión de un molécula de anticuerpo pueden incrementarse por amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nueva York, Vol . 3. (1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable , un incremento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedera incrementará el número de copias del gen marcador, debido a que la región amplificada se asocia con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también se incrementará (Crouse y col., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).

La producción in vitro permite un escalado para dar grandes cantidades de los polipéptidos deseados. Las técnicas para cultivo de células de mamífero bajo condiciones de cultivo celular son conocidas en el arte e incluyen cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo en un reactor por aerotransporte o en un reactor de agitación continua o cultivo celular inmovilizado o entrampado, por ejemplo en fibras huecas, microcápsulas , sobre microesferas de agarosa o cartuchos cerámicos. Si fuese necesario y/o deseado, las soluciones de polipéptidos pueden purificarse por métodos de cromatografía a medida, por ejemplo filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de (inmuno- ) afinidad, por ejemplo, después de la biosíntesis preferencial de un polipéptido de región bisagra sintética o antes o subsiguientemente al paso de cromatografía HIC descrito en la presente .

También se pueden expresar construcciones que codifican para las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de las mismas, como se describen en la presente en células de no mamíferos tales como células de bacterias o levaduras o plantas. Las bacterias que toman fácilmente los ácidos nucleicos incluyen a miembros de enterobacteriaceae , tales como las cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Además se apreciará que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos típicamente forman parte de cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos deben aislarse, purificarse y luego ensamblarse en moléculas funcionales. Cuando se desean formas tetravalentes de los anticuerpos, las subunidades se autoensamblarán en anticuerpos tetravalentes ( O02/096948A2 ) .

En los sistemas bacterianos, puede seleccionarse ventajosamente un número de vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de la proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos proteicos de fusión que se purifiquen fácilmente. Los vectores incluyen a, a título enunciativo no taxativo, al vector de expresión en E. coli pUR278 (Ruther y col., EMBO J. 2:1791 (1983)), en el que el secuencia que codifica para el anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en marco con la región codificante lacZ de forma de producir una proteína de fusión; los vectores pIN (Inouye & Inouye, iVucleic Acid Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); y similares. También se pueden usar los vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST) . En general, las proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y unión a una matriz de esferas de glutatión-agarosa seguido por elusión en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de clivaje para trombina o proteasa de factor Xa de forma de que el producto génico blanco clonado pueda liberarse del grupo GST.

Además de los procariotas, también pueden usarse microbios eucariotas. La Saccharomyces cerevisiae o levadura común de panadería, es el microorganismo más comúnmente usado entre los microorganismos eucariotas a pesar de que también están disponibles varias otras cepas, por ejemplo, Pichia pastoris .

Para su expresión en Saccharomyces, comúnmente se usa el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb y col., Nature 282:39 (1979); Kingsman y col., Gene 7:141 (1979); Tschemper y col., Gene 10:157 (1980)). este plásmido ya contiene el gen TRP1 que provee un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). La presencia de la lesión trpl como característica del genoma de la célula hospedera de levadura entonces provee un entorno eficaz para detectar una transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.

En un sistema de insecto, típicamente se usa el virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en las células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica para el anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un AcNPV promotor (por ejemplo el promotor de polihedrina) .

Una vez que la molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudo onas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado de la misma, como se describe en la presente se ha expresado recombinantemente, el mismo puede purificarse por cualquier método conocido en el arte para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico después de columna de Proteína A y cromatografía en columna de exclusión) , centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Otro método para incrementar la afinidad de anticuerpos de la descripción se divulga en US 2002 0123057 Al .

VII . IDENTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS DE UNIÓN INDIFERENTES DE SEROTIPO La descripción abarca una estrategia de célula completa indiferente de blanco para identificar moléculas de unión terapéuticas independientes de serotipo por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con actividades terapéuticas superiores o deseadas. El método puede usarse para identificar moléculas de unión que pueden antagonizar, neutralizar, eliminar o bloquear una actividad indeseada de un agente infeccioso, por ejemplo, un patógeno bacteriano. Como se conoce en el arte, muchos agentes infecciosos exhiben una variación significativa en sus antígenos de superficie dominantes, lo que les permite evadir la vigilancia inmune. El método de identificación descrito en la presente puede identificar moléculas de unión cuyos antígenos blanco están compartidos entre muchas especies diferentes de Pseudomonas u otros patógenos Gram-negativos , proveyendo de esa forma un agente terapéutico que puede direccionarse contra múltiples patógenos de múltiples especies. Por ejemplo, el método se utilizó para identificar una serie de moléculas de unión que se unen a la superficie de P. aeruginosa de una forma independiente del serotipo y cuando se unen a los patógenos bacterianos, median, promueven o aumentan la actividad opsonofagocítica (OPK) contra células bacterianas tales como patógenos bacterianos, por ejemplo especies oportunistas a Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida y Pseudomonas alcaligenes) y/o inhiben la unión de las células bacterianas a las células epiteliales.

Ciertas modalidades divulgan un método para identificar moléculas de unión indiferentes de serotipo que comprende: (a) preparar bibliotecas de anticuerpo en gafos no modificados y/o convalecientes, (b) eliminar anticuerpos específicos de serotipo de una biblioteca mediante eliminación por cribado, (c) cribado de la biblioteca para anticuerpos que específicamente se unen a células completas independientes de serotipo y (d) cribado de los anticuerpos resultantes para propiedades funcionales deseadas.

Ciertas modalidades proveen una estrategia de cribado fenotípico de células completas como se describe en la presente con bibliotecas de anticuerpos en fago que derivan de pacientes no afectados o convalecientes por infección con P. aeruginosa . Usando una estrategia de cribado que inicialmente seleccionó contra reactividad específica de serotipo, se aislaron diferentes clones que se unen a células completas de P. aeruginosa . se convirtieron los clones seleccionados a anticuerpos IgGl humanos y se confirmó su reacción con aislados clínicos de P. aeruginosa sin importar la clasificación serotípica o el sitio de tejido de aislamiento (véanse los Ejemplos) . Las selecciones por actividad funcional descritas en la presente indicaron que los anticuerpos fueron eficaces para prevenir la unión de P. aeruginosa a las células de mamífero y que mediaron la muerte opsonofagocítica (OPK) de una forma dependiente de la concentración y de manera independiente del serotipo.

En otras modalidades, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se describieron previamente, anticuerpos o fragmentos de las mismas o composiciones, se unen a dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más serotipos diferentes de P. aeruginosa o a al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de las cepas de P. aeruginosa aisladas de pacientes infectados. En otras modalidades, las cepas de P. aeruginosa se aislan de uno o más de pulmón, esputo, ojo, pus, heces, orina, senos, una herida, piel, sangre, hueso o fluido de rodilla .

VIII. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE COMPRENDEN MOLÉCULAS DE UNIÓN ANTI-PSL Y/O PCRV DE PSEUDOMONAS Las composiciones farmacéuticas que se usan en esta descripción comprenden transportadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos por las personas con experiencia en el arte. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ciertas composiciones farmacéuticas como las que se describen en la presente pueden administrarse por vía oral en una forma de dosificación aceptable que incluye, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. Ciertas composiciones farmacéuticas también pueden administrarse por aerosol o inhalación nasal. Puede haber presentes también conservantes y otros aditivos tales como por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Las formulaciones adecuadas para usar en los métodos terapéuticos que se describen en la presente se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16° ed. (1980).

La cantidad de una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado de la misma, que se puede combinar con los materiales transportadores para producir una forma de dosificación individual variarán dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. También se pueden ajustar los regímenes de dosificación para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) . Las composiciones también pueden comprender las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de las mismas dispersas en un material transportador biocompatible que funcione como un sistema de administración o soporte adecuado para los compuestos.

IX. MÉTODOS D ETRATAMIENTO QUE USAN MOLÉCULAS DE UNIÓN TERAPÉUTICAS Los métodos para preparar and administrar moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado de las mismas, como se describe en la presente, a un sujeto que lo necesite son bien conocidas o de fácil determinación para las personas con experiencia en el arte. La ruta de administración de las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado de las mismas, puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral como se usa en la presente incluye, por ejemplo, administración intravenosa, intraarterial , intraperitoneal , intramuscular o subcutánea. Una forma adecuada de administración sería una solución para inyección, en particular para inyección goteo intravenoso o intraarterial . Sin embargo, en otros métodos compatibles con los contenidos de la presente, pueden administrarse moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado de las mismas, como se describe en la presente, directamente en el sitio de la población celular adversa por ejemplo, una infección, incrementando de esa manera la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico. Por ejemplo, una molécula de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas puede administrarse directamente al tejido ocular, tejido dañado por quemadura o pulmonar .

Las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de las mismas, como se describen en la presente pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de una infección por Pseudomonas. Con respecto a esto, ha de apreciarse que las moléculas de unión divulgadas se formularán de forma de facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. Para los propósitos de la presente solicitud, una cantidad farmacéuticamente eficaz significa una cantidad suficiente para conseguir la unión eficaz a un blanco y para conseguir un beneficio, por ejemplo, tratar, mejorar, disminuir, eliminar o prevenir una infección por Pseudomonas .

Algunas modalidades están dirigidas a un método para prevenir o tratar una infección por Pseudomonas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la molécula de unión o fragmento del mismo, el anticuerpo o fragmento del mismo, la composición, el polinucleótido, el vector o la célula hospedera descrita en la presente. En otras modalidades, la infección por Pseudomonas es una infección por P. aeruginosa. En algunas modalidades, el sujeto es un humano. En ciertas modalidades, la infección es una infección ocular, una infección pulmonar, una infección de quemadura, una infección de herida, una infección de la piel, una infección de la sangre, una infección de hueso o una combinación de dos o más de las infecciones. En otras modalidades, el sujeto sufre de neumonía aguda, daño por quemadura, infección de la córnea, fibrosis quística o una combinación de las mismas.

Ciertas modalidades están dirigidas a un método para bloquear o prevenir la unión de P. aeruginosa a las células epiteliales que comprende poner en contacto una mezcla de células epiteliales y P. aeruginosa con la molécula de unión o fragmento del mismo, el anticuerpo o fragmento del mismo, la composición, el polinucleótido, el vector o la célula hospedera descrita en la presente.

También se divulga un método para aumentar la OPK de P. aeruginosa que comprende poner en contacto una mezcla de células fagocíticas y P. aeruginosa con la molécula de unión o fragmento del mismo, el anticuerpo o fragmento del mismo, la composición, el polinucleótido, el vector o la célula hospedera descrito en la presente. En otras modalidades, las células fagocíticas son células HL-60 diferenciadas o leucocitos humanos polimorfonucleares (PMNs) .

Siempre dentro del alcance de la descripción, las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de las mismas, pueden administrarse a un humano u otro animal de acuerdo con los métodos de tratamiento que se mencionaron previamente en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de las mismas, descrito en la presente pueden administrarse a el humano u otro animal en una forma de dosificación convencional que se prepara por combinación del anticuerpo de la descripción con un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional de acuerdo con las técnicas conocidas.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente descripción, para el tratamiento de una infección por Pseudomonas varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, sitio blanco, estado fisiológico del paciente, si el paciente es un humano u otro animal, otras medicaciones administradas y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Usualmente, el paciente es un humano pero también se pueden tratar mamíferos no humanos incluyendo a mamíferos transgénicos . Las dosificaciones para el tratamiento pueden titularse usando los métodos de rutina conocidos por las personas con experiencia en el arte para optimizar la seguridad y eficacia.

Las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de las mismas pueden administrarse en múltiples ocasiones a diversas frecuencias dependiendo de diversos factores conocidos para las personas con experiencia en el arte. Como alternativa, las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de las mismas pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente.

Las composiciones de la descripción pueden administrarse por cualquier método adecuado, por ejemplo, por vía parenteral, por vía intraventricular, por vía oral, por inhalación de atomizado, por vía tópica, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal o por vía de un reservorio implantado. El término "parenteral" como se usa en la presente incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial , intraesternal , intratecal, intrahepática, intralesional e intracranial .

X. SINERGISMO Chou y Talalay (Adv. Enzyme Regul . , 22:21-55 (1984)) desarrollaron un método matemático para describir los hallazgos experimentales de efectos de fármacos combinados de una forma cualitativa y cuantitativa. Para fármacos mutuamente excluyentes, mostraron que la ecuación generalizada isobólica se aplica para cualquier grado de efecto (véase la página 52 en Chou y Talalay) . Un isobol o isobolograma es una representación gráfica de todas las combinaciones de dosis de dos fármacos que tienen el mismo grado de efecto. En los isobologramas , una línea recta indica efectos aditivos, una curva cóncava (curva debajo de la línea recta) representa efectos sinérgicos y una curva convexa (curva por arriba de la línea recta) representa efectos antagónicos. Estas curvas también muestran que una combinación de dos fármacos mutuamente excluyentes mostrará el mismo tipo de efecto sobre todo el intervalo de concentración, con una combinación aditiva, sinérgica o antagonista. La mayoría de las combinaciones de fármacos muestran un efecto aditivo. En algunos casos sin embargo, las combinaciones muestran menos o más que un efecto aditivo.

Estas combinaciones se llaman antagonistas o sinérgicas, respectivamente. una combinación manifiesta sinergia terapéutica si la misma es terapéuticamente superior a uno u otro de los constituyentes cuando se usan en su dosis óptima. Véase, T. H. Corbett y col., Cáncer Tratamiento Reports, 66, 1187 (1982) . Tallarida RJ (J Pharmacol Exp Ther. 2001 Sep; 298 (3) : 865-72) también destaca que "dos fármacos que producen efectos claramente similares a veces producirán efectos exagerados o disminuidos cuando se los usa concurrentemente. Es necesaria una evaluación cuantitativa para distinguir entre estos casos y la simple acción aditiva" .

Un efecto sinérgico puede medirse usando el método de índice de combinación (CI, por sus siglas en inglés) de Chou y Talalay (véase Chang y col., Cáncer Res. 45: 2434-2439, (1985)) que se basa en el principio de la mediana de efecto, este método calcula el grado de sinergismo, aditividad o antagonismo entre dos fármacos a diferentes niveles de citotoxicidad. Cuando el valor de CI es menos de 1, existe sinergismo entre los dos fármacos. Cuando el valor de CI es 1, existe un efecto aditivo, pero no un efecto sinérgico. Los valores de CI mayores que 1 indican un antagonismo. Cuando menor es el valor de CI, mayor es el efecto sinérgico. En otra modalidad, se determina un efecto sinérgico usando la concentración inhibitoria fraccionaria (FIC, por sus siglas en inglés) . Este valor fraccionario se determina expresando la IC50 de un fármaco actuando en combinación, como función de la IC50 del fármaco actuando solo. Para dos fármacos que interaccionan, la suma del valor de la FIC para cada fármaco representa la medida de la acción sinérgica. Cuando la FIC es menos de 1, existe un sinergismo entre los dos fármacos. Un valor de FIC de 1 indica un efecto aditivo. Cuanto menor es el valor de FIC, mayor es la interacción sinérgica.

En algunas modalidades, se obtiene un efecto sinérgico en el tratamiento de Pseudomonas en donde se administra uno o más de los agentes de unión en una "dosis baja" (es decir, usando una dosis o varias dosis que se considerarían no terapéuticas si se administran solas) , en donde la administración de la dosis baja de agente de unión en combinación con otros agentes de unión (administrados a una dosis baja o terapéutica) resulta en un efecto sinérgico que excede los efectos aditivos que de otra forma resultarían de la administración individual del agente de unión solo. En algunas modalidades, el efecto sinérgico se consigue a través de la administración de uno o más de los agentes de unión administrados en una "dosis baja" en donde se provee la dosis baja para reducir o evitar la toxicidad u otros efectos colaterales indeseados .

XI . INMUNOENSAYOS Las moléculas de unión anti-Psl y/o PcrV de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de las mismas pueden ensayarse para unión inmunoespecífica mediante un método conocido en el arte. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen a título enunciativo no taxativo sistemas de ensayos competitivos o no competitivos que usan técnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzima), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunoradiométricos , inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A, por nombrar algunos. Los ensayos son de rutina y bien conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Ausubel y col., eds, Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, Vol. 1 (1994), que se incorpora a modo de referencia en la presente en su totalidad). Los ejemplos de inmunoensayos se describen brevemente más adelante (pero sin pretender representar una limitación) .

Existe una variedad de métodos disponibles para medir la afinidad de una interacción anticuerpo-antígeno, pero relativamente pocos para determinar las constantes de velocidad. La mayoría de los métodos se basan en la marcación del anticuerpo o el antígeno, lo que inevitablemente complica las medidas de rutina e introduce imprecisiones en las cantidades que se miden. La afinidad de un anticuerpo puede medir por un número de métodos, que incluyen a OCTET°, BIACORE®, ELISA y FACS .

® El sistema OCTET usa biosensores en un formato de placa de 96 pocilios para informar el análisis de cinética. Puedes monitorearse los eventos de unión y disociación proteica midiendo la unión de una proteína en solución a una segunda proteína inmovilizada sobre el biosensor FortéBio. En el caso de medir la unión de los anticuerpos anti-Psl o PcrV a Psl o PcrV, se inmoviliza la Psl o PcrV en las puntas del ® OCTET seguido por el análisis de la unión del anticuerpo, que está en solución. Luego se detecta la asociación y disociación del anticuerpo a las Psl o PcrV inmovilizadas mediante el sensor del instrumento. Luego se recolectan los datos y se exportan a GraphPad Prism para el ajuste de la curva de afinidad.

La resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en ingles) llevada a cabo en un BIACORE ofrece un número de ventajas por sobre los métodos convencionales para medir la afinidad de interacciones anticuerpo-antígeno : (i) no requerimiento de marca en el anticuerpo o antígeno; (ii) los anticuerpos no necesitan purificarse por adelantado, puede usarse directamente el sobrenadante de cultivo celular; (iii) se pueden hacer medidas en tiempo real, lo que permite una comparación semi rápida de diferentes interacciones de anticuerpos monoclonales, y eso es suficiente para muchos propósitos de evaluación; (iv) puede regenerarse la superficie bioespecífica por lo tanto puede compararse una serie de diferentes anticuerpos monoclonales bajo condiciones idénticas; (v) los procedimientos analíticos pueden automatizarse automáticamente y pueden llevarse a cabo largas series de medidas sin la intervención del usuario. BIAapplications Handbook, versión AB (reimpresión en 1998) , BIACORE® código No. BR- 1001-86; BIAtechnology Handbook, versión AB (reimprimido en 1998) , BIACORE0 código No. BR-1001-84.

Los estudios de unión basados en SPR requieren que un miembro de un par de unión se inmovilice sobre una superficie de sensor. El socio de unión inmovilizado se denomina como ligando. El socio de unión en solución se denomina analito. En algunos casos, el ligando está unido indirectamente a la superficie a través de la unión a otra molécula inmovilizada, que se denomina como molécula de captura. La respuesta de la SPR refleja un cambio en la concentración de masa en la superficie del detector a medida que se unen o se disocian los analitos.

En base a la SPR, las medidas de BIACORE* en tiempo real monitorean las interacciones directamente a medida que suceden. La técnica es bien adecuada para la determinación de parámetros cinéticos. La clasificación por comparación de afinidad es extremadamente simple de llevar a cabo y pueden obtenerse las constantes tanto cinéticas como de afinidad a partir de los datos del sensograma.

Cuando se inyecta analito en un pulso discreto a través de una superficie de ligando, el sensograma resultante puede dividirse en tres fases esenciales: (i) Asociación del analito con ligando durante la inyección de muestra; (ii) Equilibrio o estado estacionario durante la inyección de muestra, en donde la tasa de unión de analito está balanceada por la disociación del complejo; (iii) Disociación de analito desde la superficie durante el flujo de solución amortiguadora.

Las fases de asociación y disociación proveen información sobre la cinética de la interacción analito-ligando (ka y kd, las velocidades de formación y disociación de complejo, kd/ka = KD) . La fase de equilibrio provee información acerca de la afinidad de la interacción analito-ligando (KD) .

El programa BIAevaluation provee facilidades integrales para el ajuste de las curvas usando algoritmos tanto de integración numérica como de ajuste global. Con el análisis adecuado de los datos, puede obtenerse constantes separadas de velocidad y de afinidad para la interacción a partir de investigaciones de BIACORE® individuales. El intervalo de afinidades medibles mediante esta técnica es muy amplio, en el intervalo entre mM y p .

La especificidad epítopo es una característica importante de un anticuerpo monoclonal. El mapeo de epítopo con BIACORE^, contrariamente a las técnicas convencionales que usan radioinmunoensayos , ELISA u otros métodos de adsorción superficial, no requiere el marcado o la purificación de anticuerpos y permite pruebas de especificidad en sitios múltiples usando una secuencia de varios anticuerpos monoclonales . Además pueden procesarse grandes números de análisis en forma automática.

Los experimentos de unión de a pares prueban la capacidad de dos mAb para unirse simultáneamente al mismo antígeno. Los mAb dirigidos contra epítopos separados se unirán independientemente, mientras que los mAb dirigidos contra epítopos idénticos o epítopos muy relacionados interferirán con la unión de uno con otro. Estos experimentos de unión con BIACORE son para llevarse a cabo directamente.

Por ejemplo, uno puede usar una molécula de captura para unir el primer Mab, seguido por el agregado de antígeno y el segundo mAb en forma secuencial. Los sensogramas revelarán: 1. cuánto antígeno se une al primer Mab, 2. en qué extensión el segundo mAb se une al antígeno anclado a la superficie, 3. en caso de que el segundo mAb no se una, si la inversión del orden de la prueba de a pares altera los resultados.

La inhibición peptídica es otra técnica que se usa para el mapeo de epítopos. Este método puede complementar los estudios de unión de anticuerpos de a pares y puede relacionar los epítopos funcionales con características estructurales cuando la secuencia primaria del antígeno es conocida. Los péptidos o fragmentos de antígeno se prueban para inhibición de la unión de diferentes mAb a antígeno inmovilizado. Los péptidos que interfieren con la unión de un mAb dado se asumen como estructuralmente relacionados con el epítopo definido por ese mAb.

XII . ADMINISTRACIÓN Una composición que comprende dominio de unión anti-Psl o un dominio de unión anti-PcrV o una composición que comprende ambos dominios de unión anti-Psl y anti-PcrV se administran en una forma tal que los mismos proveen un efecto sinérgico en el tratamiento de Pseudomonas en un paciente. La administración puede ser por cualquier medio adecuado con la condición de que la administración provea el efecto terapéutico deseado, es decir, sinergismo. En ciertas modalidades, los anticuerpos se administran durante el mismo ciclo de terapia, por ejemplo, durante un ciclo de terapia durante un periodo de tiempo prescrito, en donde ambos anticuerpos se administran al sujeto. En algunas modalidades, la administración de los anticuerpos puede ser durante la administración secuencial en ciclos de terapia separados, por ejemplo, en donde el primer ciclo de terapia implica la administración de un anticuerpo anti-Psl y el segundo ciclo de terapia implica la administración de un anticuerpo anti-PcrV. La dosificación de los dominios de unión que se administran a un paciente también dependerá de la frecuencia de administración y se puede determinar fácilmente por parte de una persona con experiencia en el arte.

En otras modalidades los dominios de unión se administran más de una vez durante un ciclo de tratamiento. Por ejemplo, en algunas modalidades, los dominios de unión se administran semanalmente durante tres semanas consecutivas en un ciclo de tratamiento de entre tres y cuatro semanas.

La administración de la composición que comprende uno o más de los dominios de unión puede ser en los mismos o en diferentes días con la condición de que la administración provea el efecto terapéutico deseado.

Ha de ser fácilmente evidente para las personas con experiencia en el arte que otras dosis o frecuencias de administración que provean el efecto terapéutico deseado sean adecuadas para usar en la presente invención.

XII . CONJUNTOS DE COMPONENTES En aún otras modalidades, la presente inversión provee kits que se pueden usar para llevar a cabo los métodos que se describen en la presente. En ciertas modalidades, un conjunto de elementos comprende una molécula de unión descrita en la presente en uno o más recipientes. Una persona con experiencia en el arte reconocerá fácilmente que los dominios de unión, polipéptidos y anticuerpos divulgados de la presente inversión pueden incorporarse fácilmente en uno de los formatos establecidos de conjunto de elementos que son bien conocidos en el arte.

*** La práctica de la descripción empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología de transgenes, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de los conocimientos del arte, las técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2o Ed. , Sambrook y col., ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989) ; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook y col., ed. , Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed. , Volúmenes I y II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullís y col. Patente de los EE.UU. No.: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds . (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; el tratado, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds . , Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu y col. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, Londres (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , (1986); and in Ausubel y col., CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) .

Los principios generales de la construcción de anticuerpos se establecen en Antibody Engineering, 2° edición, C.A.K. Borrebaeck, Ed. , Oxford Univ. Press (1995). Los principios generales de la construcción de proteínas se establecen en Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., y col., Eds., IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra (1995) . Los principios generales de anticuerpos y unión de anticuerpo-hapteno se establecen en: Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2° ed. , Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); y Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, Nueva York, NY (1984) . Además, los métodos estándar de inmunología conocidos en el arte y no descritos específicamente en general son según se describe en Current Protocols in Immunology, John iley & Sons, Nueva York; Stites y col. (eds), Basic and Clinical -Immunology (8o ed. ) , Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) y Mishell and Shiigi (eds) , Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., Nueva York (1980) .

Los trabajos de referencia estándar que establecen los principios generales de la inmunología incluyen a Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein, J., Immunology: The Science oí Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Nueva York (1982); Kennett, R., y col., eds., Monoclonal antibodies, Hybridoma : A New Dimensión in Biological Analyses, Plenum Press, Nueva York (1980) ; Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" en Burden, R. , y col., eds., La£>oratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol . 13, Elsevere, Ámsterdam (1984), Kuby Immunnology 4° ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt and Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology 6° ed. Londres: Mosby (2001); Abbas A., Abul , A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology Ed. 5, Elsevier Health Sciences División (2005); Kontermann and Dubel, Anti±>ody Engineering, Springer Verían (2001) ; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow and Lañe, Antibodies ; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003) .

EJEMPLOS Ejemplo 1: Construcción y cribado de bibliotecas de exposición en fagos de anticuerpos humanos Este ejemplo describe una estrategia de cribado de células completas indiferente de blanco con bibliotecas de anticuerpos humanos en fagos derivados de pacientes tanto no infectados como convalecientes infectados con P. aeruginosa para identificar nuevos antígenos protectores contra infección por Pseudomonas (Figura 1A) . Los ensayos incluidos en los cribados funcionales in vitro incluyeron ensayos de muerte por opsonofagocitosis (OPK) y ensayos de unión en células usando la línea de células epiteliales A549. Los mejores candidatos, en base a una actividad superior in vitro, en probaron en modelos de neumonía aguda, queratitis y quemado con P. aeruginosa.

La Figura IB muestra la construcción de una biblioteca de exposición en fagos de anticuerpos de pacientes. Se agruparon las muestras de sangre completa de 6 pacientes en recuperación entre 7 y 10 días después del diagnostico seguido por Extracción de ARN y construcción de biblioteca en fago como se describió previamente (Vaughan, T.J., y col., Nat Biotechnoll , 309-314 (1996); Wrammert , J. , y col. ,Nature 453, 667-671 (2008)). La Figura 1C muestra que la biblioteca final de scFv clonados contuvo 5,4 x 108 transformantes y la secuenciación reveló que el 79% de los genes de scFv eran de longitud completa y en marco. Los bucles de la CDR3 de VH, con frecuencia importantes para determinar la especificidad epítopo, tuvieron una diversidad de 84% a nivel de aminoácidos antes de la selección de la biblioteca.

Además de la biblioteca de pacientes, se usó una biblioteca de exposición en fagos de scFv humanos de sujetos no infectados conteniendo hasta lxlO11 miembros de unión (Lloyd, C, y col., Protein Eng Des Sel22 , 159-168 (2009)) para aislamiento de anticuerpos (Vaughan, T.J., y col., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)). Se inmovilizaron P. aeruginosa (lxlO9) muertas por calor en I MUNO™ Tubes (Nunc; MAXISORP™) seguido por selecciones de exposición en fago como se describió previamente (Vaughan, T.J., y col., Nat Biotechnoll4 , 309-314 (1996) ) con la excepción de que se usó trietanolamina (100 nM) como solución amortiguadora de elusión. para la selección en P. aeruginosa en suspensión, se bloquearon las células muertas por calor seguido por agregado de los fago bloqueados a las células. Después de lavar, se usaron los fagos eluidos para infectar células de E. coli como se describió previamente (Vaughan, 1996) . El rescate de los fagos de las E. coli y la unión a las P. aeruginosa muertas por calor por ELISA se llevó a cabo como se describió previamente (Vaughan, 1996) .

Después del desarrollo y la validación de la metodología de selección por afinidad en células completas, se sometió a la nueva biblioteca de pacientes convalecientes y a la biblioteca de sujetos no infectados construida previamente (Vaughan, T.J., y col., Nat Biotechnoll4, 309-314 (1996) ) a selección por afinidad sobre suspensiones de P. aeruginosa de cepa 3064 que poseen un antígeno 0 completo así como también una cepa mutante isogénica wapR que carece que expresión en superficie del Antígeno O. La Figura ID muestra que los títulos resultantes de las sucesivas selecciones de biblioteca de paciente se incrementaron en una tasa más grande para la biblioteca de pacientes que para la biblioteca de no infectados (lxlO7 vs 3xl05 en la ronda 3, respectivamente) . Además, también se halló una mayor duplicación de secuencias de bucle de CDR3 de VH en las bibliotecas (una medida de enriquecimiento clonal durante la selección) , en la biblioteca de pacientes, alcanzando entre 88 y 92%, en comparación con entre 15 y 25% en la biblioteca de sujetos no infectados en la ronda 3 (Figura ID) . Luego se cribaron los gafos scFv individuales a partir de las selecciones de afinidad por ELISA para reactividad contra cepas de serotipos heterologos de P. aeruginosa (Figura 1E) . Se recubrieron placas de ELISA (Nunc; MAXISORP™) con cepas de P. aeruginosa de cultivos de una noche como se describió 20 previamente (Di Giandomenico, A., y col., Infecí Immun 72, 7012-7021 (2004)). Se agregaron los anticuerpos diluidos sobre las placas bloqueadas durante 1 hora, se lavaron y se trataron con Anticuerpos secundarios anti-humano conjugados con HRP durante 1 hora seguido por revelado y análisis como se describió previamente (Ulbrandt, N.D., y col. ,iJ Virc-180, 7799-7806 (2006) ) . Las especies dominantes de fago obtenido a partir de las selecciones de células completas con ambas bibliotecas dieron reactividad específica de serotipo (datos no mostrados) . Se seleccionaron los clones que exhibían unión independiente de serotipo en ausencia de unión no específica a E. coli o albúmina sérica bovina para evaluación adicional.

Para la expresión de IgG, se clonaron las cadenas VH y VL de anticuerpos seleccionados en vectores de expresión de IgGl humana, se coexpresaron en células HEK293 y se purificaron por cromatografía de afinidad con proteína A como se describió previamente (Persic, L., y col., Genel87, 9-18 (1997) ) . Se confirmaron los anticuerpos IgGl humanos hecho con las regiones variables de estos gafos seleccionados independientes de serotipo para especificidad a P. aeruginosa y se priorizaron para un análisis subsiguiente por unión a células completas a serotipos clínicamente relevantes dominantes mediante análisis por FACS (Figura 1F) , debido a que este método tiene más seguridad que el ELISA. Para los ensayos de unión basados en citometría de flujo se concentraron las cepas de P. aeruginosa en fase media logarítmica en PBS a una OD650 de 2,0. Después de la incubación del anticuerpo (10 g/mL) y las bacterias (aproximadamente 1 x 107 células) durante 1 hora a 4°C con agitación, se incubaron las células lavadas con un anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con Alexa Fluor 647® (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 0,5 horas a 4°C. Se tiñeron las células lavadas con tinción para bacterias verde BacLight™ según las recomendaciones (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Se corrieron las muestras en un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences) y se analizaron usando un BD FacsDiva (v. 6.1.3) y FlowJo(v. 9.2; TreeStar) . Los anticuerpos que exhibieron unión por FACS se priorizaron para las pruebas de actividad funcional en un ensayo de muerte por opsonofagocitosis (OPK) .

Ejemplo 2: Evaluación de mAb que promueven la OPK de P. aeruginosa Este ejemplo describe la evaluación de los anticuerpos de IgGl humana ordenados por prioridad para promover la OPK de P. aeruginosa . La Figura 2A muestra que con la excepción de WapR-007 y el anticuerpo control negativo R347, todos los anticuerpos mediaron una muerte dependiente de la concentración de la cepa de P. aeruginosa luminiscente de serogrupo 05 (PAOl.lux). El WapR-004 y el Cam-003 exhibieron una actividad superior de OPK actividad. Se llevaron a cabo ensayos de OPK como se describió previamente (DiGiandomenico, A., y col., Infect Immun 72, 7012-7021 (2004)), con modificaciones. Brevemente, se llevaron a cabo los ensayos en placas de 96 pocilios usando 0,025 mi de cada componente de la OPK; cepas de P. aeruginosa; suero diluido de conejo bebé; células HL-60 diferenciadas; y anticuerpo monoclonal . En algunos ensayos de OPK, se usaron cepas de P. aeruginosa luminiscentes, que se construyeron como se describió previamente (Choi, K.H., y col., Wat Methods 2, 443-448 (2005) ) . Los ensayos luminiscentes de OPK se llevaron a cabo como se describió previamente pero con determinación de unidades relativas de luciferasa (RLU) usando un lector de placas Perkin Elmer Envision Multilabel (Perkin Elmer) .

Se evaluó la capacidad de los anticuerpos WapR-004 y Cam-003 para mediar la actividad de OPK contra otra cepa con antígeno O de serotipo clínicamente relevante, 9882-80. lux. La Figura 2B muestra que la actividad de OPK aumentada de WapR-004 y Cam-003 se extiende a la cepa 9882-80 (011) .

Además, este ejemplo describe la evaluación de los mutantes WapR-004 (W4) en el formato scFv-Fc para promover la OPK de P. aeruginosa . Se creó específicamente un mutante, Wap-004RAD (W4-RAD) , a través de una serie de mutagénesis dirigidas a sitio para eliminar un motivo RGD en la VH. Se prepararon otros mutantes W4 como sigue. Se llevó a cabo una PCR anidada como se describió previamente (Roux, K.H., PCR Methods Appl4 , S185-194 (1995)), para amplificar las variantes W4 (derivadas de hipermutación somática) de la biblioteca de scFv derivada de los pacientes convalecientes infectados con P. aeruginosa, para su análisis, esta es la biblioteca a partir de la cual se obtuvo el WapR-004. Se subclonaron los fragmentos de las variantes W4 y se secuenciaron usando procedimientos estándar conocidos en el arte. Se recombinaron cadenas livianas (LC) mutantes de W4 con la cadena pesada (HC) de WapR-004 para producir los mutantes 4 en formato scFv-Fc. Además, se recombinaron los mutantes de cadena pesada (HC) de WapR-004 RAD con las LC parentales de M7 y M8 en formato scFv-Fc. Las construcciones se prepararon usando procedimientos estándar conocidos en el arte. Las Figuras 11 (A-M) muestran que con la excepción del anticuerpo control negativo R347, todos los mutantes WapR-004 (W4) mediaron la muerte dependiente de concentración de la cepa luminiscente de P. aeruginosa serogrupo 05 (PAOl.lux).

Se retrotrajo la región variable de WapR-004-RAD a línea germinal para reducir la inmunogenicidad potencial, produciendo el WapR-004 -linea germinal ( "WapR- 004 -GL" ) y se optimizó por secuencia líder a través de mutagénesis dirigida a sitio. Los clones con mejor afinidad contra Psl se seleccionaron en cribados basados en competición. Los mejores clones se ordenaron por mejora de afinidad y se analizaron en un ensayo funcional in vi ro. Los 14 clones optimizados por secuencia líder son: Psl0096, Psl0170, Psl0225, Psl0304, PS10337, PS1348, Psl0567, Psl0573, Psl0574, Psl0582, Psl0584, PS10585, Psl0588 y Psl0589.

Ejemplo 3: Anticuerpos independientes de serotipo anti- P.aeruginosa se dirigen contra el exopolisacárido Psl Este ejemplo describe la identificación del blanco de los anticuerpos anti-P. aeruginosa derivados de un cribado fenotípico. Se llevó a cabo un análisis de blanco para probar si los anticuerpos independientes de serotipo se direccionan a antígenos de proteína o de carbohidrato. No se observó pérdida de unión en el ELISA contra extractos de célula completa PA01 exhaustivamente digeridos con proteinasa K, lo que sugiere que la reactividad se dirigió a los residuos de carbohidratos accesibles en la superficie (datos no mostrados) . Se construyeron mutantes isogénicos en genes responsables para la biosíntesis de antígeno 0, alginato y LPS nuclear; wbpL (deficiente de antígeno O) ; wbpL/algD (deficiente en antígeno 0 y alginato) ; rmlC (deficiente de antígeno O y núcleo externo truncado) ; y galU (deficiente de antígeno 0 y núcleo interno truncado) . Se construyeron mutantes de P. aeruginosa en base a la estrategia de reemplazo de alelo descrita por Schweizer (Schweizer , H.P., Mol Microbiol 6, 1195-1204 (1992); Schweizer, H.D., Biotechniques 15, 831-834 (1993) ) . Se movilizaron los vectores de E. coli de cepa S17.1 a P. aeruginosa de cepa PA01; se aislaron los recombinantes como se describió previamente (Hoang, T.T., y col., Gene212, 77-86 (1998)). La eliminación génica se confirmó por PCR. Se complementaron los mutantes de P. aeruginosa con construcciones basadas en pUCP30T que portan genes de tipo salvaje. Se determinó la reactividad de los anticuerpos por ELISA indirecto sobre placas recubiertas con las cepas antes indicadas de P. aeruginosa: La Figura 3A muestra que la unión de Cam-003 a wbpL o al mutante doble wbpL/algD no estuvo afectada, sin embargo la unión a los mutantes rmlC y galU estuvo anulada. Mientras que estos resultados fueron consistentes con la unión al núcleo de LPS, no se observó reactividad para el LPS purificado de PA01. Recientemente se mostró que los genes rmlC y galU se requieren para la biosíntesis del exopolisacárido Psl, un polímero de polisacárido repetitivo que consiste en D-manosa, L-rhamnosa y D-glucosa. Se probó la unión de Cam-003 a un KO isogénico de pslA PAOlApslA, ya que pslA se requiere para la biosíntesis de Psl (Byrd, M.S., y col., Mol Microbiol 73, 622-638 (2009)). La unión de Cam-003 a PAOlApslA estuvo anulada cuando se la probó por ELISA (Figura 3B) y por FACS (Figura 3C) , mientras que la molécula de LPS en este mutante no se vio afectada (Figura 3D) . Se restituyó la unión de Cam-003 en un mutante triple PAOlAwbpL/algD/psl-A complementado con pslA (Figura 3E) como también la capacidad de Cam-003 para mediar la muerte opsónica a PAOlApslA complementado en contraste con el mutante (Figura 3F y 3G) . La unión del anticuerpo Cam-003 a un mutante de exopolisacárido Peí también se vio no afectada confirmando además a Psl como el blanco del anticuerpo (Figura 3E) . Los ensayos de unión confirmaron que los restantes anticuerpos también se unen a Psl (Figura 3H y 31) .

Ejemplo 4: Los mAb anti-Psl bloquean la unión de P. aeruginosa a células epiteliales cultivadas.

Este ejemplo muestra que los anticuerpos anti-Psl bloquearon la asociación de P. aeruginosa con las células epiteliales. Se agregaron los anticuerpos anti-Psl a una monocapa confluente de células A549 (una línea celular epitelial basal alveolar de adenocarcinoma humano) crecidas en placas opacas de 96 pocilios (Nunc Nunclon Delta) . Se agregó la cepa luminiscente PAOl de P. aeruginosa (PAOl. lux) en fase log a una MOI de 10. Después de la incubación de PAOl. lux con las células A549 a 37°C durante 1 hora, se lavaron las células A549, seguido por agregado de LB+0,5% de glucosa. Se cuantificaron las bacterias después de una breve incubación a 37°C como se llevó a cabo en el ensayo OPK que se describió en el Ejemplo 2. Las medidas de los pocilios sin células A549 se usaron para corregir por unión no específica. La Figura 4 muestra que con la excepción de Cam-005 y WapR-007, todos los anticuerpos redujeron la asociación de PAOl.lux a las células A549 en una forma dependiente de la dosis. Los mAb que se desempeñaron mejor en los ensayos de OPK, WapR-004 y Cam-003 (véanse las Figuras 2A-2B y el Ejemplo 2), fueron también los más activos para la inhibición de la unión celular de P. aeruginosa a las células epiteliales de pulmón A549, proveyendo hasta aproximadamente 80% de reducción en comparación con el control negativo. WapR-016 fue el tercer anticuerpo más activo, mostrando una actividad inhibitoria similar a WapR-004 y Cam-003 pero a una concentración de anticuerpo 10 veces mayor.

Ejemplo 5: Cepas de P. aeruginosa repicadas in vivo mantienen/incrementan la expresión de Psl Para probar si se mantiene la expresión de Psl in vivo, se inyectaron los ratones por vía intraperitoneal con aislados de P. aeruginosa seguido por recolección de bacterias por lavado peritoneal cuatro horas después de la infección. Se analizó la presencia de Psl con un anticuerpo control y Cam-003 por citometría de flujo debido a que las condiciones de unión del anticuerpo son más severas y permiten la cuantificación de las células que son positivas o negativas para la Expresión de Psl. Para la unión ex vivo, se preparó un inoculo bacteriano (0,1 mi) a partir de una placa de TSA de una noche y se administró por vía intraperitoneal a Ratones BALB/c. 4 horas después del enfrentamiento, se cosecharon las bacterias, se lisaron los RBC, se sonicaron y resuspendieron en PBS suplementado con 0,1% de Tween-20 y 1% de BSA. Se tiñeron las muestras y se analizaron como se describió previamente en el Ejemplo 1. Las Figuras 5A-5C muestra que las bacterias cosechadas después del lavado peritoneal con tres cepas de tipo salvaje de P. aeruginosa mostraron una fuerte tinción con Cam-003, que fue comparable a las bacterias cultivadas en fase log (comparar las Figuras 5A y 5C) . Las bacterias de tipo salvaje repicadas in vivo exhibieron una tinción aumentada en comparación con le inoculo (comparar las Figuras 5B y 5C) . dentro del inoculo, no se detectó Psl para la cepa 6077, y fue mínimamente detectado para las cepas PAOl (05) y 6206 (Oll-citotóxica) . La unión de Cam-003 a las bacterias se incrementó en relación al inoculo lo que indica que la expresión de Psl se mantiene o se incrementa in vivo. Las cepas de tipo salvaje 6077, PAOl y 6206 expresan Psl después de repique in vivo, sin embargo la cepa PAOl que porta una eliminación de pslA (PAOlApslA) es incapaz de reaccionar con Cam-003. Estos resultados confirman adicionalmente que Psl es el blanco de los anticuerpos monoclonales .

Ejemplo 6: Tasas de supervivencia para animales tratados con anticuerpos monoclonales anti-Psl Cam-003 y apR-004 en un modelo de neumonía por P. aeruginosa Se administraron los anticuerpos o PBS 24 horas antes de la infección en cada modelo. Se usaron los modelos de infección de neumonía aguda, queratitis y daño térmico con P. aeruginosa como se describió previamente (Di Giandomenico, A. , y col., Proc Nati Acad Sci U S A104 , 4624-4629 (2007)), con modificaciones. En el modelo de neumonía aguda, se infectaron ratones BALB/c (The Jackson Laboratory) con las cepas de P. aeruginosa suspendidas en un inoculo de 0,05 mi. En el modelo de daño térmico, ratones CF-1 (Charles River) recibieron una quemadura de 10% del área superficial total con una barra de metal calentada a 92 °C durante 10 segundos. Se infectaron los animales subcutáneamente con la cepa 6077 de P. aeruginosa a la dosis indicada. Para los experimentos de carga en órganos, se indujo neumonía aguda en ratones, seguido por recolección de los pulmones, bazos y ríñones 24 horas después de la infección para la determinación de las CFU.

Se evaluaron los anticuerpos monoclonales Cam-003 y WapR-004 en un modelo de neumonía letal aguda contra cepas de P. aeruginosa que representan los serotipos más frecuentes asociados con enfermedad clínica. Las Figuras 6A y 6C muestran una supervivencia significativamente dependiente de la concentración en ratones tratados con Cam-003 infectados con las cepas PA01 y 6294 en comparación con los controles. Las Figuras 6B y 6D muestran que se consiguió una protección completa ante el enfrentamiento con 33356 y la cepa citotóxica 6077 mediante el uso de Cam-003 a 45 y 15 mg/kg, mientras que se observó una supervivencia de 80 y 90% a 5 mg/kg para 33356 y 6077, respectivamente. Las Figuras 6E y 6F muestran la supervivencia significativamente dependiente de la concentración en ratones tratados con WapR-004 en el modelo de neumonía aguda con la cepa 6077 (011) (8 x 105UFC) (Figura 6E) o 6077 (011) (6 x 105UFC) (Figura 6F) .

Luego se examinaron Cam-003 y WapR-004 para su capacidad para reducir la carga en los órganos de P. aeruginosa en pulmón y la dispersión a órganos distales, y luego se trataron los animales con diversas concentraciones de WapR-004, Cam-003 o anticuerpos control en varias concentraciones diferentes. El Cam-003 fue eficaz para reducir la carga pulmonar de P. aeruginosa contra las cuatro cepas probadas. El Cam-003 fue más eficaz contra la cepa citotóxica altamente patogénica, 6077, en donde la dosis baja fue tan eficaz como la dosis superior (Figuras 7D) . El Cam-003 también tuvo un efecto marcado para reducir la diseminación a bazo y ríñones en ratones infectados con PA01 (Figura 7A) , 6294 (Figura 7C) y 6077 (Figura 7D) , mientras que no se observó diseminación a estos órganos en los ratones infectados con 33356 (Figura 7B) . Las Figuras 7E y 7F muestran que de forma similar, el WapR-004 redujo la carga en los órganos después de la inducción de neumonía aguda con 6294 (06) y 6206 (011) . Específicamente, el WapR-004 fue eficaz para reducir la diseminación de P. aeruginosa al bazo y los ríñones en los ratones infectados.

Ejemplo 7: Construcción de anticuerpo monoclonal anti-PcrV V2L2 Se inmunizaron ratones Veloclmmune® (Regeneron Pharmaceuticals) por el método de inmunización Ultra-Short con r-PcrV y se siguieron los títulos séricos para unión a PcrV y neutralización de la actividad hemolítica de P. aeruginosa vivas. Los ratones con actividad anti -hemolítica en el suero se sacrificaron y se recolectaron el bazo y los nodulos linfáticos (axial, inguinal y popliteal) . Las poblaciones de células de estos órganos se cribaron con r-Pcrv biotinilado para seleccionar las células B específicas anti-PcrV. Las células seleccionadas se fusionaron luego con un mieloma de ratón P3X63-Ag8 y se sembraron a 25 K células/pocilio en medio de selección de hibridomas. Después de 10 días se cambió completamente el medio de los pocilios de hibridoma por medio fresco y después de otros 3 a 4 días, se ensayaron los sobrenadantes de los hibridomas para anti-actividad hemolítica. Se clonaron por dilución limitante las colonias con actividad anti-hemolítica a 0,2 células/pocilio en placas de 96 pocilios y se repitió el ensayo de antiactividad hemolítica. Los clones con actividad anti-hemolítica se adataron a un medio de cultivo para hibridoma con ultra bajo contenido de IgG. Se purificaron las IgG del medio condicionado y se ensayaron para actividad anti-hemolítica in vitro e in vivo para protección contra infección por P. aeruginosa . También se categorizaron los anticuerpos, mediante ensayo de competición, en diferentes grupos. Se subclonaron los dominios variables (V) de los anticuerpos de interés a partir del ADNc derivado de sus diferentes clones respectivos. Se fusionaron los segmentos V subclonados en marco con el ADNc para el correspondiente dominio constante en un plásmido de expresión en mamíferos. Se expresaron y se purificaron las IgG recombinantes a partir de células HEK293. En los casos en donde se obtuvo más de una secuencia de ADNc V a partir de un clon particular, se expresaron todas las combinaciones de cadenas variables pesadas y livianas y se caracterizaron para identificar la IgG funcional.

Ejemplo 8: Tasas de supervivencia para animales tratados con anticuerpos monoclonales anti-Psl Cam-003, WapR-004 y anticuerpo monoclonal anti-PcrV V2L2 en un modelo de infección corneal por P. aeruginosa Luego se evaluó la eficacia de Cam-003 y WapR-004 en un modelo de infección corneal por P. aeruginosa que enfatiza la capacidad de los patógenos para anclarse y colonizar el tejido dañado. Las Figuras 8A-8D y 8F-8G muestran que los ratones que recibieron Cam-003 y WapR-004 tuvieron significativamente menos patología y menores conteos bacterianos en homogenatos de ojo total que lo observado en los animales tratados con control negativo. La Figura 8E muestra que Cam-003 también fue eficaz cuando se probó en un modelo de daño térmico, proveyendo una protección significativa para 15 y 5 mg/kg en comparación con el control tratado con anticuerpo. Figura 8H: se probó la actividad de los anticuerpos monoclonales V2L2 anti-Psl y anti-PcrV en un modelo de queratitis ocular de ratón por P. aeruginosa. Se inyectaron los ratones C3H/HeN por vía intraperitoneal (IP) con PBS o un anticuerpo IgGl control (R347) a 45mg/kg o WapR-004 (OÍ-PSI) a 5 mg/kg o V2L2 (a-PcrV) a 5 mg/kg, 16 horas antes de la infección con 6077 (Oll-citotóxico - lxl06UFC) . Inmediatamente antes de la infección, se anestesiaron los ratones seguido por el inicio de tres raspados de 1 mm en la córnea y un estroma superficial en un ojo de cada ratón usando una aguja de 27-gauge bajo un microscopio de disección, seguido por aplicación tópica de P. aeruginosa de cepa 6077 en un inoculo de 5 µ? . Se fotografiaron los ojos a las 48 horas después de la infección seguido por graduación de córnea por visualización de los ojos bajo un microscopio de disección. La graduación de la infección córnea se llevó a cabo como se describió previamente en Preston y col. (Preston, MJ., 1995, Infect. Immun. 63:3497). Brevemente, se graduaron los ojos infectados 48 h después de la infección con la cepa 6077 por parte de un investigador que no conocía los tratamientos del animal. Se usó el siguiente esquema de graduación: grado 0, ojo macroscópicamente idéntico a un ojo no infectado; grado 1, opacidad débil que cubre parcialmente la pupila; grado 2, opacidad densa que cubre la pupila; grado 3, opacidad densa que cubre toda la pupila; grado 4, perforación de la córnea (contracción del globo ocular) . Los ratones que recibieron una dosis sistémica (IP) de Cam-003 o WapR-004RAD mostraron significa ivamente menos patología y menores unidades formadoras de colonias bacterianas (CFU) en los homogenatos de ojo total en comparación con los animales tratados con mAb control R347. Se observaron resultados similares en los animales tratados con V2L2 en comparación con los controles tratados con R347.

Ejemplo 9: Un anticuerpo mutante de Fe de Cam-003, Cam-003 -TM, tiene menor OPK y eficacia in vivo pero mantiene la actividad anti-unión celular.

Dado el potencial de los mecanismos de acción duales, se creó un mutante de Fe de Cam-003, Cam- 003 -TM, que porta mutaciones en el dominio Fe que reducen su interacción con los receptores Fcy (Oganesyan, V., y col., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr64 , 700-704 (2008)), para identificar si la protección estaba más correlacionada con el actividad anti-unión celular o de OPK. Se construyeron mutantes de P. aeruginosa en base a la estrategia de reemplazo de alelos descrita por Sch eizer (Sch eizer, H.P., Mol Microbiol 6, 1195-1204 (1992); Schweizer, H.D., Biotec nigues 15, 831-834 (1993)) . Se movilizaron los vectores desde E. coli de cepa 4 S17.1 a P. aeruginosa de cepa PA01; se aislaron los recombinantes como se describió previamente (Hoang, T.T., y col., Gene212, 77-86 (1998)). Se confirmó la eliminación génica por PCR. Se complementaron los mutantes de P. aeruginosa con construcciones basadas en pUCP30T que portan genes de tipo salvaje. La Figura 9A muestra que el Cam-003-?? exhibió una caída de 4 veces en la actividad OPK en comparación con el Cam-003 (EC50 de 0,24 y 0,06, respectivamente) pero fue igual de eficaz en la ensayo de unión a células (Figura 9B) . La Figura 9C muestra que el Cam-003 -TM también fue menos eficaz contra neumonía lo que sugiere que es necesaria una actividad OPK óptima para una protección óptima. Se llevaron a cabo ensayos de OPK y de unión a células como se describió previamente en los Ejemplos 2 y 4, respectivamente.

Ejemplo 10: Mapeo de epítopos y afinidad relativa para anticuerpos anti-Psl Se llevó a cabo un mapeo de epítopo por ELISA de competición y se confirmó usando un sistema de flujo OCTET° con Psl derivados del sobrenadante de un cultivo de una noche de P. aeruginosa cepa PA01. Para el ELISA de competición, se biotinilaron los anticuerpos usando el conjunto de elementos EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin and Biotinylation (Thermo Scientific) . Se trataron las placas recubiertas con antígeno con la EC50 de anticuerpos biotinilados coincubados con anticuerpos no marcados. Después de la incubación con estreptavidina conjugada con HPR (Thermo Scientific) , se revelaron las placas como se describió previamente. Los experimentos de competición entre los mAb anti-Psl determinaron que los anticuerpos se direccionaron a al menos tres epítopos únicos, llamados como anticuerpos de clase 1, 2 y 3 (Figura 10A) . Los anticuerpos de clase 1 y 2 no compiten por la unión, sin embargo el anticuerpo de clase 3, WapR-016, inhibe parcialmente la unión de los anticuerpos de clase 1 y 2.

Se determinó la afinidad de anticuerpo mediante los ensayos de unión en OCTET usando un Psl derivado del sobrenadante de cultivos de una noche de PA01. Se determinó la KD de los anticuerpos por promedio de la cinética de unión de siete concentraciones para cada anticuerpo. Las medidas de afinidad se tomaron con un instrumento FORTEBIO® OCTET* 384 usando 384 placas de pocilio inclinados. Se usaron los sobrenadantes de cultivos de una noche de PA01 ± el gen pslA como fuente de Psl. Se cargaron las muestras en sensores OCTET® de AminoPropilSilano (hidratados en PBS) y se bloquearon, seguido por la medida de la unión de los mAb anti-Psl a varias concentraciones y con disociación en PBS + 1% de BSA. Todos los procedimientos se llevaron a cabo como se describió previamente ( ang, X., y col., J Immunol Methods362, 151-160) . Los datos de ??? de asociación y disociación de filas se ajustaron a una curva con GraphPad Prism. La Figura 10A muestra las afinidades de unión relativa de los anticuerpos anti-Psl caracterizados previamente. Los anticuerpos de clase 2 tuvieron las mayores afinidades de todos los anticuerpos anti-Psl. La Figura 10A también muestra un resumen de los datos de los experimentos de unión a célula y de OPK. La Figura 10B muestra las afinidades de unión relativas y los valores de EC50 de OPK del mutante Wap-004RAD (W4RAD) así como también de otros mutantes W4 optimizados por secuencia líder a través de mutagénesis dirigida a sitio como se describió en el Ejemplo 2. La Figura 10C muestra las afinidades de unión relativas del Wap-004RAD (W4RAD) , Wap-004RAD-Germline (W4RAD-GL) así como también de los anticuerpos monoclonales anti-Psl optimizados por secuencia líder (Psl0096, Psl0170, Psl0225, Psl0304, Psl0337, Psl348, Psl0567, Psl0573, Psl0574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, Psl0588 y Psl0589) . Se seleccionaron los clones resaltados Psl0096, Psl0225, Psl0337, Psl0567 y Psl0588 en base a su actividad OPK aumentada, como se muestra en el Ejemplo 10 más adelante.

Ejemplo 11: Evaluación de clones mutantes WapR-004 (W4) optimizados por secuencia líder y anticuerpos monoclonales anti-Psl optimizados por secuencia líder en el ensayo de muerte opsonofagocítica (OPK) de P. aeruginosa Este ejemplo describe la evaluación de los clones mutantes optimizados por secuencia líder WapR-004 (W4) y los anticuerpos monoclonales anti-Psl optimizados por secuencia líder para promover la OPK de P. aeruginosa usando el método que se describió en el Ejemplo 2. Las Figuras 11A-11Q muestran que con la excepción del anticuerpo control negativo R347, todos los anticuerpos produjeron una muerte dependiente de la concentración de la cepa luminiscente de P. aeruginosa serogrupo 05 (PAOl.lux).

Ejemplo 12: El anticuerpo monoclonal V2L2 anti-PcrV reduce la letalidad de neumonía aguda producida por múltiples cepas Se analizó la diversidad de epítopos de PcrV usando tres estrategias: métodos de citometría de flujo en base a esferas, ELISA de competición y transferencia western de rPcrV fragmentados. Los experimentos de competición entre los mAb anti-PcrV determinaron que los anticuerpos se direccionaron a al menos seis epítopos únicos, denominados como anticuerpos de clase 1, 2, 3, 4, 5 y 6 (Figura 12A) . Los anticuerpos de clase 2 y 3 compiten parcialmente por la unión Se probaron mAb que representan clases de epítopos adicionales: clase 1 (V2L7, 3G5, 4C3 y 11A6) , clase 2 (1E6 y 1F3), clase 3 (29D2, 4A8 y 2H3), clase 4 (V2L2) y clase 5 (21F1, LE10 a SH3) para protección in vivo como se describe más adelante.

Se aislaron nuevos mAb anti-PcrV usando la tecnología de hibridomas y se seleccionaron los inhibidores más potentes de T3SS usando un ensayo de inhibición de la lisis de células sanguíneas rojas de conejo. Se analizó el porcentaje de inhibición de citotoxicidad para el mAb parental V2L2, mAbl66 (control positivo) y R347 (control negativo) , en donde los anticuerpos se administraron a la línea de células bronco epiteliales A549 cultivadas combinados con cepa 6077 de P. aeruginosa (exoU+) en fase log a una MOI de aproximadamente 10. se ensayó la lisis de A549 por medida de la liberación de actividad de lactato dehidrogenasa (LDH) y por lisis en presencia de mAb en comparación con los pocilios sin mAb, para determinar el porcentaje de inhibición. Los mAb V2L2 , mAbl66 (control positivo) y R347 (control negativo) se evaluaron para su capacidad para prevenir la lisis de las RBC, en donde los anticuerpos se mezclaron con P. aeruginosa 6077 (exoU+) en fase log y células sanguíneas rojas de conejo (RBC) lavadas y se incubaron durante 2 horas a 37°. Se peletearon las RBC intactas y se determinó la extensión de la lisis por medida de la OD405 del sobrenadante libre de células. Se comparó la lisis en presencia de mAb anti-PcrV con los pocilios sin mAb para determinar el porcentaje de inhibición. El anticuerpo control positivo, mAbl66, es un anticuerpo anti-PcrV caracterizado previamente (J Infect Dis. 186: 64-73 (2002), Crit Care Med. 40: 2320-2326 (2012)). (fig. 12B) El mAb parental V2L2 demostró una inhibición de la citotoxicidad con una IC50 de 0,10 ug/ml y exhibió una concentración IC50 28 veces menor que el mAbl66 (IC50 de 2,8 pg/ml) . (12C) V2L2 también demostró la prevención de la lisis de las RBC con una IC50 de 0,37 µ9/??1 y exhibió una concentración IC50 10 veces menor que el mAbl66 (IC50 de 3,7 µ9/p?1) .

Se retrotrajo a línea germinal complemente la región variable de V2L2 para reducir la inmunogenicidad potencial . Se maduró en afinidad el V2L2 usando la estrategia de mutagénesis parsimoniosa para randomizar cada posición con 20 aminoácidos para las seis CDR, identificando mutaciones individuales que mejoran la afinidad. Luego se usó una biblioteca combinatoria, que codifica para todas las posibles combinaciones de mutaciones individuales que mejoran la afinidad. Los clones con afinidad mejorada contra PcrV se seleccionaron usando un ELISA de unión en formato de IgG. Los mejores clones se ordenaron por mejora de afinidad y se analizaron en un ensayo funcional in vitro. Se mutagenizaron sistemáticamente las CDR de V2L2 y se seleccionaron los clones con afinidad mejorada contra PcrV en cribados basados en competición. Se ordenaron los clones por incremento de afinidad y se analizaron en un ensayo funcional. Como se muestra en la Figura 12D, se analizó la lisis de RBC para mAb V2L2-a línea germinal (V2L2-GL) , los mAb V2L2 -optimizados por GL (V2L2-P4M, V2L2-MFS, V2L2-MD y V2L2- R) y un anticuerpo R347 control negativo usando células A549 infectadas con Pseudomonas de cepa 6077. V2L2-GL, V2L2-P4M, V2L2-MFS, V2L2- 30 MD y V2L2-MR demostraron una prevención de la lisis de las RBC. Como se muestra en la Figura 12E, los mAb 1E6, 1F3, 11A6, 29D2, PCRV02 y V2L7 demostraron una prevención de la lisis de las RBC. Como se muestra en la Figura 12F, V2L2 fue más potente que el 29D2 en la prevención de la lisis de las RBC.

Se midió la cinética de unión de V2L2-GL y V2L2-MD usando un instrumento Bio-Rad ProteOn™ XPR36. Se capturaron los anticuerpos en una chip biosensor de GLC usando reactivos anti-IgG humana. Se inyectó la proteína rPcrV a múltiples concentraciones y se siguió la fase de disociación durante 600 segundos. Se registraron los datos y se analizaron usando el programa ProteOn Manager. Las Figuras 12G-12H) muestra las afinidades de unión relativas de los anticuerpos (fig. 12G) V2L2-GL y (fig. 12H) V2L2-MD. El clon V2L2-MD tuvo una Kd incrementada entre 2 y 3 veces por sobre el V2L2-GL.

Se estudió el efecto in vivo de la administración de anticuerpos anti-PcrV en ratones usando un modelo de neumonía aguda. Se trataron grupos de ratones con concentraciones crecientes del anticuerpo V2L2, un anticuerpo control positivo anti-PcrV (mAbl66) o un control negativo (R347) , como se muestra en la Figuras 13A-13B. También se trataron grupos de ratones con concentraciones crecientes del anticuerpo V2L2, el anticuerpo contra PcrV PcrV-02 o un control negativo (R347) , como se muestra en la Figuras 13C-13D) . Veinticuatro horas después del tratamiento, todos los ratones se infectaron con 5 x 107UFC de (fig. 13C) Pseudomonas aeruginosa 6294 (06) o (fig. 13D) PA103A (011) . Como se muestra en las Figuras 13A-13I, casi todos los animales tratados con control sucumbieron ante la infección a las 48 horas después de la infección. Sin embargo, el V2L2 mostró un efecto dependiente de la dosis sobre la supervivencia mejorada incluso más allá de las 168 horas después de la infección. Además, el V2L2 proveyó una protección significativamente más potente que el mAbl66 a dosis similares (P=0,025, 5 mg/kg para la cepa 6077; P <0,0001, 1 mg/kg para la cepa 6294).

Se trataron grupos de ratones con concentraciones crecientes de 11A6, 3G5 o V2L7, las mismas concentraciones de 29D2, 1F3, 1E6, V2L2, LE10, SH3 , 4A8 , 2H3 o 21F1, concentraciones crecientes del 29D2, concentraciones crecientes del V2L2, el anticuerpo contra PcrV PcrV-02 o un control negativo (R347) , como se muestra en la Figura 13E-13H Se inyectaron los ratones por vía intraperitoneal (IP) con los mAb 24 horas antes de la infección intranasal con Pseudomonas de cepa 6077 (1 x 106 CFU/animal) . Como se muestra en la Figura 13E, los mAb 11A6, 3G5 y V2L7 no proveyeron protección in vivo. Como se muestra en la Figura 13F, el mAb 29D2 proveyó protección in vivo. Como se muestra en la Figura 13G, el mAb V2L2 también provee protección in vivo. La Figura 13H muestra la comparación in vivo de 29D2 y V2L2. La Figura 131 muestra que el mAb V2L2 protege contra cepas adicionales de Pseudomonas (es decir, la 6294 y la PA103A) .

También se estudió la carga en órganos de ratones infectados con Pseudomonas en respuesta a la administración de V2L2. Figura 14A Los ratones se trataron con 1 mg/kg de R347 (control) o 1 mg/kg, 0,2 mg/kg o 0,07 mg/kg de V2L2 y luego se infectaron por vía intranasal con 1,2 x 106 CFU de Pseudomonas 6206. Figura 14B Los ratones también se trataron con 15 mg/kg de R347 (control negativo); 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 1,0 mg/kg de mAbl66 (control positivo); o 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg o 0,2 mg/kg de V2L2 y luego se infectaron por vía intranasal con 5,5 x 106 CFU de Pseudomonas 6206. Como se muestra en la Figura 14A-14B) , mientras que V2L2 tuvo poco efecto sobre la eliminación en riñon, el mismo redujo en gran medida la diseminación tanto a pulmón como a bazo en una forma dependiente de la dosis. Además, el V2L2 proveyó una reducción significativamente mayor que mAbl66 en las CFU de los órganos a dosis similares (P <0,0001, 1 mg/kg, pulmón).

Ejemplo 13: Actividad in vivo de terapia de combinación usando los anticuerpos WapR-004 (anti-Psl) y V2L2 (anti-PcrV) Se estudió además el efecto in vivo de la administración por combinación de dominios de unión anti-Psl and anti-PcrV en ratones usando los anticuerpos V2L2 y WapR-004 (RAD) . Se trataron grupos de ratones con R347 (2,1 mg/kg - control negativo), V2L2 (0,1 mg/kg), W4-RAD (0,5 mg/kg) o combinación de V2L2/W4 (ya sea a 0,1, 0,5, 1,0 o bien a 2,0 mg/kg cada uno) . Veinticuatro horas después de la administración de los anticuerpos, se infectaron todos los ratones con un inoculo conteniendo 5,25 x 105UFC de 6206 (011-ExoU+) . Veinticuatro horas después de la infección, se extrajeron los pulmones, bazos y ríñones, se homogeneizaron y plaquearon para identificación de unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo de tejido. Como se muestra en la Figura 15, a las concentraciones probadas, tanto V2L2 como W4 fueron eficaces para disminuir la carga en los órganos, la combinación de V2L2/W4 mostró un efecto aditivo en la eliminación tisular. El examen histológico de tejido pulmonar reveló menor hemorragia, menor edema y menos infiltrado inflamatorio en comparación con los ratones que recibieron V2L2 o WapR-004 solos (Tabla 5) .

De forma similar también se evaluaron animales inmunizados para su supervivencia a partir de infección de neumonía aguda .

Tabla 5 Ejemplo 14: Tasas de supervivencia para anima tratados con anticuerpo monoclonal anti-PcrV V2L2 en un modelo de neumonía aguda por P. aeiruginosa Se evaluaron los anticuerpos monoclonales V2L2-GL, V2L2-MD, V2L2-A, V2L2-C, V2L2-PM4 y V2L2-MFS en un modelo de neumonía letal aguda por cepa P. aeruginosa 6077 como se describió previamente en el Ejemplo 11. Las Figuras 16A-16F muestran la supervivencia en todos los ratones tratados con V2L2 infectados con la cepa 6077 en comparación con el control. Sin embargo, no se observa una diferencia significativa en la supervivencia entre los anticuerpos V2L2 en cualquiera de las dosis: 0,5 mg/kg y 1 mg/kg (Fig. 16A-16C) o 0,5 mg/kg y 0,1 mg/kg (figs .16A-16F) . Las Figuras 16G-16I muestran la supervivencia en todos los ratones tratados con V2L2 infectados con la cepa 6077 en comparación con el control. No se observa diferencia significativa en la supervivencia entre los anticuerpos V2L2 en cualquiera de las dosis: 0,5 mg/kg y 1 mg/kg (figs. 16G-16I) . (Figs. 16A-16H) Todos los ratones control sucumbieron ante la infección aproximadamente a las 48 horas después de la infección.

Ejemplo 15: Construcción de WapR- 004/anticuerpos V2L2 biespecíficos La Figura 17A muestra las construcciones modelo biespecíficas de TNFoc. Para Bsl-TNFa/W4, el W4 scFv está fusionado al extremo amino terminal de TNFoc VL por medio del , conector (G4S)2. Para Bs2-TNFa/ 4, le W4 scFv esta fusionado al extremo amino terminal de TNFa VH por medio del conector (G4S)2. Para Bs3-TNFa/ 4, el 4 scFv está fusionado al extremo carboxilo terminal de CH3 por medio del conector (G4S) 2.

Debido a que la combinación de WapR-004 + V2L2 provee una protección contra el enfrentamiento a Pseudomonas, se generaron construcciones biespecíficas que comprenden una WapR-004 scFv (W4-RAD) y IgG V2L2 (Figura 17B) . Para generar a Bs2-V2L2-2C, el scFv de W4-RAD está fusionado al extremo N-terminal de VH de V2L2 a través del conector (G4S)2. Para generar Bs3-V2L2-2C, se fusionó el scFv de W4-RAD al extremo C-terminal de CH3 a través del conector (G4S) 2. Para generar Bs4-V2L2-2C, se insertó el scFv de W4-RAD en la región bisagra, se conectó con el conector (G4S)2 en el extremo N-terminal y C-terminal de scFv. Para generar a Bs2-W4-RAD-2C, se fusionó el V2L2 scFv al extremo amino terminal de VH de 4-RAD por medio de conector (G4S)2.

Para generar el scFv de 4-RAD para la construcción Bs3, las VH y VL de W4-RAD por PCR. Los cebadores que se usaron para amplificar la VH de 4-RAD fueron: VH de W4-RAD cebador directo: incluye el conector (G4S)2 y 22 bp de la secuencia N-terminal de la VH (GTAAAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGT CGG (SEQ ID NO:224)); y VH de W4-RAD cebador reverso: incluye parte del conector (G4S)4 y 22 pb de la secuencia C-terminal de VH (GATCCTCCGCCGCCGCTGCCCCCTCCCCCAGAGCCCCCTCCGCCACTCGAGACGGTGACC AGGGTC (SEQ ID NO: 225) . De forma similar, se amplificó la VL de W4-RAD por PCR usando los cebadores: W4-RAD VL cebador 7 directo: incluye parte del conector (G4S)2 y 22 pb de la secuencia N-terminal de VL (AGGGGGCAGCGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCGAAATTGTGTTGACACAGTC TC (SEQ ID NO:226)); y W4-RAD VL cebador reverso: incluye parte de vector secuencia y 22 pb de la secuencia C-terminal de VL (CAATGAATTCGCGGCCGCTCATTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAC SEQ ID NO:227)) . Los fragmentos solapados se fusionaron juntos para forma el scFv de W4-RAD.

Secuencia scFv de W4-RAD en vector Bs3 : las secuencias subrayadas son el conector G4S GGGGSGGGGSEVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYY T IRQPPGKCL ELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARAD DLLHAL DIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQS IRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QSYSFPLTFGCGTKLEIK (SEQ ID NO: 228) Después de amplificar el fragmento scFv de W4-RAD, se purificó entonces por gel y se ligó en el vector Bs3 que se había digerido con BamHI/Notl. La ligación de hizo usando le sistema In-Fusion, seguido por transformación en células competentes Stellar. Se secuenciaron las colonias para confirmar la inserción correcta de scFv de W4-RAD.

Para generar el Bs3-V2L2-2C, se reemplazó la porción de IgG en el vector Bs3 con la IgG V2L2. Brevemente, el vector Bs3 que contiene el scFv de W4-RAD se digirió con BssHII / Salí y la banda de vector resultante se purificó por gel. De forma similar, el vector que contiene al vector V2L2 se digirió con BssHII / Salí y el inserto de V2L2 se purificó por gel. Se ligó luego el inserto de V2L2 con el vector scFv de Bs3-W4-RAD y se secuenciaron las colonias para confirmar la inserción correcta de la IgG V2L2.

Se usó una estrategia similar para generar el Bs2-V2L2- 2C.

Secuencias de VH de 4-RAD scFv-V2L2 secuencias en el vector Bs2 : las secuencias subrayadas son del conector G4S EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKCLELIGYIHSSG YTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARADWDLLHALDI GQGTLVT VSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQ KPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPLTFG CGTKLEIKGGGGSGGGGSEMQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGE GLEWVSAITISGITAYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAGDTAVYYCAKEEFLPG THYYYGMDV GQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 229) Se usaron los siguientes cebadores para amplificar a W4-RAD scFv.VH (cebador directo) y VL (cebador reverso) : cebador directo de VH de W4-RAD para el vector Bs2 que incluye algún intrón, péptido señal 3' y 22 bp de la secuencia N-terminal de W4-RAD (TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGG (SEQ ID NO:230)) y cebador reverso de W4-RAD VL para el vector Bs2 : incluye al conector (G4S)2 y 32 pb de la secuencia C-terminal de VL (CCCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCACAGCCGAAAG (SEQ ID NO: 231) ) Para amplificar la región VH de V2L2 se usaron los siguientes cebadores: VH de V2L2 cebador directo: incluye el conector (G4S)2 y 22 pb de la secuencia N-terminal de VH de V2L2 (GGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGAGATGCAGCTGTTGGAGTCTGG (SEQ ID NO:232)) y VH de V2L2 cebador reverso: incluye alguno de la secuencia N-terminal de CH1 y 22 pb de la secuencia C-terminal de VH de V2L2 (ATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC (SEQ ID NO : 233)).

Estos cebadores se usaron entonces para amplificar la VH de V2L2, que luego se unió por solapamiento con el scFv de W4-RAD y la VH de V2L2 para conseguir el W4-RAD scFv-V2L2-VH. El W4-RAD scFv-V2L2-VH se ligó luego en el vector Bs2 por purificación en gel de W4-RAD scFv-V2L2-VH (a partir de la PCR solapada) ; digiriendo el vector Bs2 con BsrGI/SalI y purificando por gel la banda de vector. El W4-RAD scFv-V2L2-VH se ligó luego con el vector Bs2 por el sistema In-Fusion y se transformó en células competentes Stellar y se confirmaron las colonias para la inserción correcta de W4-RAD scFv- V2L2-VH. Para reemplazar la VL del vector Bs2 con la VL de V2L2, el vector Bs2 que contiene a W4-RAD scFv-V2L2-VH se digirió con BssHII / BsiWI y la banda de vector se purificó por gel. Luego se digirió el vector pOE-V2L2 con BssHII / BsiWI y se purificó por gel el inserto de VL de V2L2. El inserto de VL de V2L2 se ligó luego con el vector Bs2-W4-RAD scFv-V2L2-VH y se secuenciaron las colonias para la inserción correcta de la IgG V2L2.

Finalmente, se usó una estrategia similar basada en PCR para generar la construcción Bs4 -V2L2 -2C. La región bisagra con secuencia conectora se muestra más adelante: Región bisagra con secuencia conectora: KVDKRVEPKSCGGGGSGGGGS - N- terminal de scFv(SEQ ID NO:329) CH1 conector bisagra C- terminal de scFv - GGGGSGGGG5DKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO: 330) conector bisagra CH2 scFv de W4-RAD secuencias in BS4 vector: scFv de W4-RAD está en itálicas y negritas el conector G4Ss está subrayado y en negritas} regiones bisagras están doblemente subrayadas KVDKRV] EPKSCGGGGSGGGGSEVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYY WTWIRQPPGKCLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYF CARADWDLLHALDIWGQGTLVTVSSGGGGSeeGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSTSVG DRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQSYSFPLTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO:324) scFv de W4-RAD se presenta en itálicas y negritas con los conectores G4S subrayados en itálicas y negritas EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKCLELIGYIHSSG YTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSL VSSVTAADTAVYFCARADWDLLHALDIWGQGTLVT VSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQ KPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPLTFG CGTKLEIK Se generó scFv de 4-RAD usando PCR y los siguientes cebadores: cebador directo VH de W4-RAD para el vector Bs4 : incluye algunas de las secuencias cebadoras y 24 pb de la secuencia N-terminal de VH de W4-RAD (GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGGGC (SEQ ID NO: 236)); y el cebador reverso W4-RAD VL para el vector Bs4 : incluye alguna secuencia bisagra, conector y 21 pb de la secuencia C-terminal de W4-RAD VL (GTGTGAGTTTTGTCggatccCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTTTGATCTCCAGCTTG GTCCC (SEQ ID NO: 237)).

Se ligó luego el scFv de W4-RAD en el vector Bs4 para conseguir el Bs4-V2L2-2C por purificación en gel de scFv de W4-RAD (de una PCR) ; el vector Bs4-V2L2 se digirió con BamHI y la banda de vector se purificó por gel. El scFv de W4-RAD se ligó con el vector Bs4 por sistema In-Fusion y se transformó el vector en células competentes Stellar. Se secuenciaron las colonias para la correcta inserción de scFv de 4-RAD.

Las secuencias para la cadena liviana y la cadena pesada de la construcción de Bs4-V2L2-2C se proveen en SEQ ID NOS: 327 y 328, respectivamente.

Ejemplo 16: Un anticuerpo biespecífico anti-Psl/PcrV promueve la supervivencia en modelos de neumonía Como objetivo inicial, se probaron los anticuerpos biespecíficos Bs2 y Bs3 para examinar si los mismos retenían su actividad W4 o V2L2 en un formato biespecífico. Para el W4 scFv parental, se generó un anticuerpo biespecífico que tiene un brazo de unión a 4 y a TNF-alf . Se llevó a cabo un ensayo de unión a células como se describió previamente usando la cepa luminiscente de P. aeruginosa PAOl.lux. Como se muestra en la Figura 18, todas las construcciones biespecíficas se desempeñaron en forma similar a la construcción W4-IgGl parental.

Como se muestra en las Figuras 19A-19C, se analizó el porcentaje de inhibición de citotoxicidad tanto para Bs2-V2L2 como para Bs3-V2L2 usando células infectadas con (fig. 19A) 6206 y (fig. 19B) 6206ApslA y (fig. 19C) se analizó el porcentaje de inhibición de lisis de RBC para Bs2-V2L2-2C, Bs3-V2L2-2C y Bs4-V2L2-2C usando células infectadas con 6206. Como se muestra en las Figuras 19A-19C, todos los anticuerpos biespecíficos retuvieron la actividad anti-citotoxicidad e inhibieron la lisis de RBC a niveles similares que el anticuerpo parental V2L2 usando células infectadas con 6206 y 6206Apsl_¾.

Se evaluó la capacidad de los anticuerpos biespecíficos Bs2 y Bs3 para mediar la OPK de P. aeruginosa usando el método que se describen en el Ejemplo 2. Mientras que el anticuerpo Bs2-V2L2 mostró una muerte similar en comparación con el anticuerpo W4-RAD parental, la muerte para el anticuerpo Bs3-V2L2 estuvo disminuida (Figura 20A) . Mientras que los anticuerpos Bs2-V2L2-2C y Bs4-V2L2-2C mostraron una muerte similar en comparación con el anticuerpo parental W4-RAD, la muerte para el anticuerpo Bs3-V2L2-2C estuvo disminuida (Figura 20B) . La Figura 20C muestra que diferentes preparaciones de los anticuerpos Bs4 (lote viejo vs . lote nuevo) mostraron una muerte similar en comparación con el anticuerpo parental 4-RAD, sin embargo los anticuerpos Bs4-V2L2-2C-YTE tuvieron una caída de tres veces en la actividad OPK en comparación con el Bs4 -V2L2 -2C . Un mutante YTE comprende una combinación de tres "mutaciones YTE " : M252Y, S254T y T256E, en donde la numeración es de acuerdo con el índice EU como se establece en Kabat, introducidas en la cadena pesada de una IgG. Véase la Patente de los EE.UU. No. 7.658.921, que se incorpora a modo de referencia en la presente. El mutante YTE ha demostrado incrementar la vida media en suero de los anticuerpos aproximadamente cuatro veces en comparación con las versiones de tipo salvaje del mismo anticuerpo. Véase, por ejemplo, Dall'Acqua y col., J. Biol. Chem. 281:23514-24 (2006) y la Patente de los EE.UU. No. 7.083.784, que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Después de la confirmación de que tanto W4 como V2L2 retuvieron la actividad en un formato biespecífico, se evaluaron las construcciones Bs2-V2L2, Bs3-V2L2 y Bs4-V2L2 para supervivencia de infecciones con neumonía aguda. Como se muestra en la Figura 21A, todos los ratones control sucumbieron ante la infección en aproximadamente 30 horas después de la infección. Todos los animales con Bs3-V2L2 sobrevivieron, junto con los que recibieron el control de V2L2. Aproximadamente 90% de los animales inmunizados con W4-RAD sobrevivieron. Por el contrario, las Figuras 21B-21F muestran que aproximadamente el 50% de los animales Bs2-V2L2 sucumbieron ante la infección a las 120 horas. Todos los ratones control sucumbieron ante la infección aproximadamente a las 48 horas después de la infección. Las Figuras 21G-21H no muestran una diferencia de supervivencia entre los ratones tratados con Bs4-V2L2-2C y Bs4 -V2L2 -2C-YTE en cualquiera de las dosis. Estos resultados sugieren que ambos anticuerpos funcionan equivalentemente en el modelo de neumonía aguda por 6206. La Figura 211 muestra que la mezcla de anticuerpos Bs2-V2L2, BS4-V2L2-2C y W4-RAD + V2L2 son las más eficaces en la protección contra la neumonía letal en ratones enfrentados con la cepa 6206 de P. aeruginosa (ExoU+) .

También se evaluó la carga en los órganos para ratones similarmente inmunizados como se describió previamente. Después de una inmunización como la anterior, se enfrentaron los ratones a 2, 75 x 105UFC de 6206. Como se muestra en la Figura 22, a la concentración probada, tanto Bs2-V2L2 como Bs3-V2L2 disminuyeron significativamente la carga en los órganos in pulmón. Sin embargo, ninguna de las construcciones biespecíficas fue capaz de afectar significativamente la carga en los órganos de bazo o riñon en comparación con los anticuerpos parentales debido al uso de concentraciones subóptimas de las construcciones biespecíficas . Las concentraciones subóptimas se usaron para poder tener la capacidad de descifrar la actividad del anticuerpo.

Los efectos de supervivencia y carga en los órganos de los anticuerpos biespecíficos también fueron investigados usando la cepa 6294. Usando el sistema modelo con 6294, tanto el BS2-V2L2 como el BS3-V2L2 disminuyeron significativamente la carga en los órganos en todos los tejidos a un nivel comparable al del anticuerpo parental V2L2. El anticuerpo W4-RAD parental no tuvo efecto sobre la disminución de la carga en los órganos (Figura 23A) . Como se muestra en la Figura 23B, la combinación de Bs2-V2L2, Bs3-V2L2 y W4-RAD+V2L2 disminuyó significativamente la carga en los órganos en todos los tejidos a un nivel comparable al del anticuerpo V2L2 parental.

Los datos de supervivencia para ratones inmunizados fueron similares e los ratones enfrentados con 6294 como antes. Como se muestra en la Figura 24, el BS3-V2L2 mostró una actividad de supervivencia similar a los ratones tratados solo con V2L2, mientras que los ratones tratados con BS2-V2L2 mostraron un nivel de protección levemente inferior de ante el enfrentamiento .

También se evaluó la carga en los órganos en animales tratados con anticuerpos biespecífieos en comparación con animales tratados con combinación como se describió previamente. Como se muestra en las Figuras 25A-25C, tanto el BS2-V2L2 como el BS3-V2L2 disminuyeron la carga en los órganos en pulmón, bazo y ríñones a un nivel comparable a la combinación W4 + V2L2. En pulmón, la combinación redujo significativamente las CFU bacterianas para Bs2- y Bs3-V2L2 y V2L2 usando la prueba de Kruskal- allis con post prueba de Dunn. No se observaron diferencias significativas en las cargas bacterianas en el bazo y el riñon, a pesar de que se evidenció una tendencia hacia la reducción. También se llevo a cabo un estudio de carga en los órganos con Bs4-GL0 usando 6206 en el modelo de neumonía. Como se muestra en la Figura 25D, cuando se usaron mayores concentraciones de anticuerpo en la profilaxis de los ratones, se observó un nivel de reducción significativo (Kruskal-Wallis con post prueba de Dunn) en la carga bacteriana de pulmón. También se observaron reducciones significativas en la diseminación bacteriana al bazo y los ríñones cuando se usaron mayores concentraciones de Bs4-GL0 en este modelo.

Estos resultados se confirmaron por examen histológico de tejido de pulmón de los ratones BALB/c inmunizados desafiados con l,33xl07UFC usando la cepa de P. aeruginosa 6294 (Tabla 6A) , l,7xl07UFC usando la cepa de P. aeruginosa 6294 (Tabla 6B) y 9, 25 x 105UFC usando la cepa de P. aeruginosa 6206 (Tabla 7) .

Ejemplo 17: Terapia terapéutica adyuvante: Bs4-V2L2-2C + antibiótico Se evaluó el efecto de supervivencia del anticuerpo biespecífico Bs4 y una terapia adyuvante con antibiótico en un modelo de neumonía letal aguda contra P. aeruginosa cepa 6206 como se describió previamente en el Ejemplo 6 (Figuras 26A-26J) . (26A-26B) 24 horas antes de la infección con 6206 se trataron los ""ratones con R347 (control negativo) o Bs4-V2L2-2C o Ciprofloxacina (CIP) 1 hora después de la infección o con una combinación de Bs4-V2L2-2C 24 horas antes de la infección y Cipro 1 hora después de la infección, (fig. 26C) Los ratones se trataron 1 hora después de la infección con 6206 con R347 o CIP o Bs4-V2L2-2C o una combinación del Bs4-V2L2-2C y CIP. (fig. 26D) 2 horas después de la infección con 6206 se trataron los ratones con R347 o CIP o Bs4-V2L2-2C o una combinación del Bs4-V2L2-2C y CIP. (fig. 26E) 2 horas después de la infección con 6206 se trataron los ratones con R347 o Bs4-V2L2-2C o CIP 1 hora después de la infección o con una combinación del Bs4-V2L2-2C 2 horas después de la infección y CIP 1 hora después de la infección. (fig. 26F) Los ratones se trataron 1 hora después de la infección con 6206, con R347 o Meropenem (MEM) o Bs4-V2L2-2C o una combinación del BS4-V2L2-2C y MEM. (fig. 26G) 2 horas después de la infección con 6206 se trataron los ratones con R347 o Bs4-V2L2-2C o MEM 1 hora después de la infección o con una combinación del Bs4-V2L2-2C 2 horas después de la infección y MEM 1 hora después de la infección. (fig. 26H) 2 horas después de la infección con 6206 se trataron los ratones con R347 o Bs4-V2L2-2C o MEM o con una combinación de Bs4-V2L2-2C 2 y MEM. (fig. 261) 4 horas después de la infección con 6206 se trataron los ratones con R347 o Cipro o Bs4-V2L2-2C o con una combinación del Bs4-V2L2-2C y Cipro. Todos los ratones control sucumbieron ante la infección en aproximadamente 24 horas después de la infección. Como se muestra en las Figuras 26A-26I el anticuerpo Bs4 combinado con CIP o bien con MEM incrementa la eficacia de la terapia con antibiótico, lo que indica una protección con sinergismo cuando se combinan las moléculas. Otros estudios se focalizaron en el nivel de carga bacteriana en ratones tratados con Bs4 o CIP solo o en combinación (Bs4+CIP) . Como se muestra en la Figura 26J, el nivel de carga bacteriana en todos los órganos (pulmón, bazo y ríñones) fue similar en R347+CIP y en Bs4+CIP, sin embargo solo los ratones en los que se incluyó Bs4 en la combinación con CIP, sobrevivieron a la infección (Figuras 26A-26E, 261)) En resumen, estos datos indican que los antibióticos son importantes para reducir la carga bacteriana en este sistema de modelo animal, sin embargo se requiere del anticuerpo específico para reducir la patogenicidad bacteriana, protegiendo de esa manera la inmunidad normal de huésped.

Se evaluará el efecto de supervivencia del anticuerpo biespecífico Bs4 y terapia adyuvante con antibiótico Tobramicina en un modelo de neumonía letal aguda contra P. aeruginosa cepa 6206 como se describió previamente en el Ejemplo 6. 24 horas antes de la infección con 6206 se tratarán los ratones con R347 (control negativo) o Bs4-V2L2-2C o Tobramicina 1 hora después de la infección o con una combinación de Bs4-V2L2-2C 24 horas antes de la infección y Tobramicina 1 hora después de la infección. También se tratarán los ratones 1 hora después de la infección con 6206, con R347 o Tobramicina Bs4-V2L2-2C o con una combinación de Bs4-V2L2-2C y Tobramicina. Además, 2 horas después de la infección con 6206 se tratarán los ratones con R347 o Tobramicina o Bs4-V2L2-2C o con una combinación de Bs4-V2L2-2C y Tobramicina. Más aún, 2 horas después de la infección con 6206 se tratarán los ratones con R347 o BS4-V2L2-2C o Tobramicina 1 hora después de la infección o con una combinación de Bs4-V2L2-2C 2 horas después de la infección y Tobramicina 1 hora después de la infección. 4 horas después de la infección con 6206 se tratarán los ratones con R347 o Tobramicina o BS4-V2L2-2C o con una combinación de BS4-V2L2- 2C y Tobramicina .

Se evaluará el efecto de supervivencia del anticuerpo biespecífico Bs4 y terapia adyuvante con antibiótico Aztreonam en un modelo de neumonía letal aguda contra P. aeruginosa cepa 6206 como se describió previamente en el Ejemplo 6. 24 horas antes de la infección con 6206 se tratarán los ratones con R347 (control negativo) o Bs4-V2L2-2C o Aztreonam 1 hora después de la infección o con una combinación de Bs4-V2L2-2C 24 horas antes de la infección y Aztreonam 1 hora después de la infección. También se tratarán los ratones 1 hora después de la infección con 6206 con R347 o Aztreonam o Bs4-V2L2-2C o con una combinación de Bs4-V2L2-2C y Aztreonam. Además, 2 horas después de la infección con 6206 se tratarán los ratones con R347 o Aztreonam o Bs4-V2L2-2C o una combinación de Bs4-V2L2-2C y Aztreonam. Más aún, 2 horas después de la infección con 6206 se tratarán los ratones con R347 o Bs4-V2L2-2C o Aztreonam 1 hora después de la infección o con una combinación de Bs4-V2L2-2C 2 horas después de la infección y Aztreonam 1 hora después de la infección. 4 horas después de la infección con 6206 se tratarán los ratones con R347 o Aztreonam o Bs4-V2L2-2C o con una combinación de Bs4-V2L2-2C y Aztreonam.

Ejemplo 18: Construcción del anticuerpo biespecífico BS4-GL0 Se generó una construcción biespecífica BS4-GL0 (Optimizado por Líder de Línea Germinal) que comprende el scFv anti-Psl (Psl0096 scfv) y el V2L2-MD (VH+VL) como se muestra en la Figura 35A. La cadena liviana BS4-GLO comprende región variable de cadena liviana de anticuerpo anti-PcrV (es decir, V2L2-MD) optimizada por líder de línea germinal. La cadena pesada de BS4-GL0 comprende la fórmula VH-CH1-H1-L1-S-L2-H2-CH2-CH3 , en donde CH1 es un dominio de región constante de cadena pesada- 1, Hl es un primer fragmento de región bisagra de cadena pesada, Ll es un primer conector, S es una molécula de ScFv anti-PcrV, L2 es un segundo conector, H2 es un segundo fragmento de región bisagra de cadena pesada, CH2 es un dominio de región constante de cadena pesada- 2 y CH3 es un dominio de región constante de cadena pesada-3.

Cadena liviana de Bs4-GL0: AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLL NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:...) La región variable de cadena liviana GLO (optimizado por línea germinal) de V2L2 (es decir, V2L2-MD) está subrayada Cadena pesada de Bs4-GL0: EMQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGEGLEWVSAITISGITAYYT DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKEEFLPGTHYYYGMDV GQGTTVTV SS [ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAvLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV] EPKSCGGGGSGGGGSEVQLL ESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKCLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSR VTISGDTSKKQFSL VSSVTAADTAVYFCARADWDLLHALDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIY GASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPLTFGCGTKLEIKGGG GSgGGggDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVK FN YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK La región variable de cadena pesada GLO (optimizada por líder de línea germinal) de V2L2 (es decir, V2L2-MD) está subrayada ; CH1 está entre corchetes [] ; El scFv de W4-RAD GLO (optimizada por líder de línea germinal) (es decir, Psl0096) está en itálica en negrita con el conector G4Ss subrayado en negrita e itálicas; las regiones bisagras están doblemente subrayadas .

Una construcción biespecífica alternativa de Bs4-GLO que comprende un ScFv anti-PcrV y un anti-Psl (VH+VL) se muestra en la Figura 35B y se genera en forma similar.

Ejemplo 19: Evaluación de la actividad funcional y la eficacia del anticuerpo biespecífico Bs4-GLO Se probaron los anticuerpos biespecífieos Bs4-WT (también llamados en la presente como Bs4-V2L2-2C) , Bs4-GL (que comprende las regiones variables de línea germinal de anti-PcrV y anti-Psl) y Bs4-GLO producido como se describió en el Ejemplo 18 para diferencias de actividad funcional en 5 un ensayo de muerte opsonofagocítica (Figura 27A) , como se describió previamente en el Ejemplo 2, una ensayo anti-unión celular (Figura 27B) , como se describió previamente en el Ejemplo 4 y un ensayo de anti-citotoxicidad de lisis de RBC (Figura 27C) , como se describió previamente en el Ejemplo 12. No se observó una diferencia in vitro en las actividades funcionales de los anticuerpos.

Se examinó la eficacia in vivo de Bs4-GL0 como sigue. Para la evaluación profiláctica, se trataron profilácticamente los ratones con varias concentraciones de Bs4-GLO (es decir, 0,007 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10mg/kg o 15 mg/kg) (Figura 28A) , 24 horas antes de la infección con las siguientes cepas de P. aeruginosa (6206 (1, 0 x 106) , 6077 (1, 0 x 105) , 6294 (2, 0 x 107) o PA103 (1,0 x 106) ) . Para la evaluación terapéutica, se trataron los ratones terapéuticamente con varias concentraciones de Bs4-GLO (es decir, 0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg o 45 mg/kg) (Figura 28B) , a una hora después de la infección con las siguientes cepas de P. aeruginosa (6206 (1,0 x 106) , 6077 (1,0 x 106) , 6294 (2, 0 x 107) o PA103 (1,0 x 106) ) .

Se evaluó el efecto de supervivencia del anticuerpo biespecífico Bs4-GL0 en un modelo de neumonía letal aguda contra diferentes cepas de P. aeruginosa como se describió previamente en el Ejemplo 6. Las Figuras 29A y 29B muestran las tasas de supervivencia para los animales tratados con el Bs4-GL0 en un modelo de bacteriemia letal con P. aeruginosa. Los aspectos del modelo de bacteriemia se divulgan en detalle en la Solicitud Provisional de los EE.UU. No. 61/723,128, presentada el 6 de noviembre de 2012 (expediente del agente no. ATOX-500P1, titulada "MÉTODOS PARA TRATAR ENFERMEDADES ASOCIADAS CON S. AUREUS" ) , que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Los animales se trataron con Bs4-GL0 o R347, 24 horas antes de la infección intraperitoneal con (fig. 29A) 6294 (06) o (fig.29B) 6206. El BS4-GL0 es eficaz a todas las concentraciones probadas en la protección contra neumonía letal en ratones enfrentados con P. aeruginosa de cepas (fig. 29A) 6294 y (fig. 29B) 6206.

Se evaluó el efecto de supervivencia del anticuerpo biespecífico Bs4-GL0 en un modelo de daño térmico e P. aeruginosa contra diferentes cepas de P. aeruginosa.

Figuras 30A-30C muestran tasas de supervivencia para animales tratados profilácticamente con el Bs4-GLO in en un modelo de daño térmico con P. aeruginosa . Se trataron los animales trataron con Bs4-GL0 o R347 horas antes de la inducción de daño térmico e infección subcutánea con P. aeruginosa de cepa (fig. 30A) 6077 (011-ExoU+) o (fig. 30B) 6206 (011-ExoU+) o (fig. 30C) 6294 (06) directamente bajo la herida. El BS4-GLO es eficaz a todas las concentraciones probadas en la prevención del modelo de daño térmico por P. aeruginosa en ratones enfrentados con P. aeruginosa de cepas (fig. 30A) 6077, (fig. 30B) 6206 y (fig. 30C) 6294.

Las Figuras 31A y 3IB muestran las tasas de supervivencia para animales tratados terapéuticamente con el anticuerpo biespecífico Bs4-GLO en un modelo de daño térmico por P. aeruginosa . (fig. 31A) Se trataron los animales con BS4-GLO o R347 (fig. 31A) 4h horas o (fig. 31B) 12 horas después de la inducción de daño térmico e infección subcutánea con la cepa 6077 de P. aeruginosa (011-ExoU+) directamente bajo la herida. El Bs4-GLO es eficaz a todas las concentraciones probadas en el tratamiento en un modelo de daño térmico por P. aeruginosa en ratones tratados con Bs4-GLO (fig. 31A) 4h horas o (fig. 31B) 12 horas después de la inducción del daño térmico e infección subcutánea con P. aeruginosa de cepa 6077.

Ejemplo 20: Terapia adyuvante terapéutica: Bs4-GL0 + antibiótico Se evaluó el efecto de supervivencia de del Anticuerpo biespecífico Bs4-GL0 y de terapia adyuvante con antibiótico en un modelo de neumonía letal aguda contra P. aeruginosa de cepa 6206 como se describió previamente en el Ejemplo 6.

Las Figuras 32A y 32B muestran la terapia adyuvante terapéutica con ciprofloxacina (CIP) . (fig. 32A) Los ratones se trataron 4 horas después de la infección con P. aeruginosa de cepa 6206 con R347 + CIP o Bs4-WT o una combinación de Bs4-WT y CIP. (32B) Los ratones se trataron 4 horas después de la infección con P. aeruginosa de cepa 6206 con R347 + CIP o Bs4-GLO o una combinación de Bs4-GL0 y CIP. (figs. 32A-32B) El anticuerpo Bs4-WT o BS4-GLO combinado con CIP incrementó la eficacia de la terapia con antibiótico.

Las Figuras 33A y 33B muestran la terapia adyuvante terapéutica con meropenem (MEM) : (fig. 33A) Los ratones se trataron 4 horas después de la infección con P. aeruginosa de cepa 6206 con R347 + MEM o Bs4-WT o una combinación de BS4-WT y MEM. (fig. 33B) Los ratones se trataron 4 horas después de la infección con P. aeruginosa de cepa 6206 con R347 + MEM o BS4 o una combinación de Bs4-GLO y MEM. (figs. 33A-33B) El anticuerpo Bs4- T o Bs4-GL0 combinado con MEM incrementa la eficacia de la terapia con antibiótico.

Las Figuras 34A, 34B y 34C muestran la terapia adyuvante terapéutica: Bs4-GLO plus antibiótico en un modelo de bacteriemia letal. Los ratones se trataron 24 horas antes de infección intraperitoneal con P. aeruginosa de cepa 6294 con Bs4-GLO a las concentraciones indicadas, que se determinaron previamente como dosis protectoras subterapéuticas en este modelo y R347 (control negativo) . Una hora después de la infección, los ratones se trataron subcutáneamente con los antibióticos a las concentraciones indicadas, las que se determinaron previamente como dosis protectoras subterapéuticas (fig. 34A) Ciprofloxacina (CIP) , (fig. 34B) Meropenem (MEM) o (fig. 34C) Tobramicina (TOB) . Se monitorearon cuidadosamente los animales para supervivencia hasta 72 horas después de la infección. El anticuerpo Bs4-GL0 combinado con CIP, MEM o TOB, a dosis sub-protectoras , incrementa la eficacia de la terapia con antibiótico.

*** La descripción no posee limitado su alcance por las modalidades específicas que se describen, las que pretender ser simples ilustraciones de aspectos individuales de la descripción, y cualquier composición o método que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de la descripción. De hecho, serán evidentes para las personas con experiencia en el arte diversas modificaciones de la descripción además de las mostradas y descritas en la presente a partir de la descripción previa y de las figuras acompañantes. Las modificaciones caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente que se mencionan en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente a modo de referencia en la misma extensión como si cada publicación y solicitud de patente individual estuviese específicamente e individualmente indicada como incorporada por referencia. Además, se incorporan las Solicitudes Provisionales de los EE.UU. Nos.: 61/556.645 presentada el 7 de noviembre de 2011; 61/624.651 presentada el 16 de abril de 2012; 61/625.299 presentada el 17 de abril de 2012; 61/697.585 presentada el 6 de setiembre de 2012 y la Solicitud Internacional No: PCT/US2012/63639 , presentada el 6 de noviembre de 2012 (expediente del agente no. AEMS- 115W01 , titulada "PROTEÍNAS DE UNIÓN MULTIESPEC IFICAS Y MULTIVALENTES Y USOS DE LAS MISMAS") se incorporan a modo de referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Tabla 6A Tabla 6B 5 Tabla 7 hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una molécula de enlace aislada o el fragmento de unión a antígeno de la misma, caracterizada porque se une específicamente a PcrV de Pseudomonas , caracterizada porque : (a) se enlaza al mismo epitopo PcrV de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 216 y una región variable de cadena liviana (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 217; (b) inhibe competitivamente el enlace a PcrV de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una VH que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 216 y la VL que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 217, o (c) una combinación de (a) y (b) .

2. La molécula de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SYAMN (SEQ ID No. : 218) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; una CDR2 de cadena pesada que comprende AITTISGITAYYTDSVKG (SEQ ID No. : 219) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; y una CDR3 de cadena pesada que comprende EEFLPGTHYYYGMDV (SEQ ID No. : 220) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; (b) una CDR1 de cadena liviana que comprende RASQGIRNDLG (SEQ ID No. : 221) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos conservativas, una CDR2 de cadena ligera que comprende SASTLQS (SEQ ID No. : 222) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; y una CDR3 de cadena ligera que comprende LQDYNYPWT (SEQ ID No.: 223), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos conservativas; o (c) una combinación de (a) y (b) .

3. La molécula de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad secuencial a la SEQ ID No.: 216; (b) una región variable de cadena liviana que tiene al menos 90% de identidad secuencial a la SEQ ID No.: 217; (c) una combinación de (a) y (b) .

4. La molécula de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, del mismo.

5. La molécula de enlace o el fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque es un anticuerpo recombinante, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo biespecífico, o cualquier combinación de los mismos.

6. La molécula de enlace o el fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID No.: 216; y (b) una región variable de cadena liviana que comprende la SEQ ID No.: 217.

7. Un anticuerpo biespecífico, caracterizado porque comprende un dominio de enlace que se une a Psl de Pseudomonas y un dominio de enlace que se une a PcrV de Pseudomonas.

8. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque: (a) el dominio de enlace a Psl comprende un fragmento scFv y el dominio de enlace a PcrV comprende una inmunoglobulina intacta; o (b) el dominio de enlace a Psl comprende una inmunoglobulina intacta y el dominio de enlace a PcrV comprende un fragmento ScFv.

9. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque: (a) el scFv está fusionado al extremo amino de la región VH de la inmunoglobulina intacta; o (b) el scFv está fusionado al extremo carboxilo de la región CH3 de la inmunoglobulina intacta, o (c) el scFv es insertado en la región de bisagra de la inmunoglobulina intacta.

10. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el dominio de enlace anti-Psl : (a) se enlaza al mismo epitopo PS1 de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una VH que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. : 11 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 12, (b) puede inhibir competitivamente el enlace a Psl de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una VH que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 11 y una VL que incluye una secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 12; o (c) una combinación de (a) y (b) .

11. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el dominio de enlace anti-PcrV: (a) se enlaza al mismo epitopo PcrV de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una VH que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 216 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 217; (b) inhibe competitivamente el enlace a PcrV de Pseudomonas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una VH que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 216 y una VL que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. : 217; o (c) una combinación de (a) y (b) .

12. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el dominio de enlace anti-PcrV comprende una VH que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. : 216 y una VL que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 217.

13. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el dominio de enlace anti-Psl comprende una VH que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. : 11 y una VL que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 12, y en donde el dominio de enlace anti-PcrV comprende una VH que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. : 216 y una VL que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 217.

14. Una molécula polinucleotídica aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la molécula de enlace o el fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 1, o el anticuerpo biespecífico o el fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 7.

15. Una composición, caracterizada porque comprende la molécula de enlace o el fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 1, al anticuerpo biespecífico o al fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 7, y un portador farmacéuticamente aceptable.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende un dominio de enlace que se une a Psl de Pseudomonas y un dominio que se une a PcrV de Pseudomonas .

17. Un método para prevenir o para tratar una infección por Pseudomonas en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 15.

18. Un kit, caracterizado porque comprende la composición de conformidad con la reivindicación 15.