JP7440516B2 - 切断多価多量体 - Google Patents
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Description
2つ以上の標的に特異的に結合する、共通軽可変領域及び再構成重鎖を含む、抗体のパネルを得ることと、
共通軽鎖可変領域及び2つ以上の再構成重鎖をコードする核酸を宿主細胞に組み込むことであって、当該再構成重鎖のうちの2つが、対合可能なCH1、CH2、及び/又はCH3ドメインを含む定常領域を含む、組み込むことと、
宿主細胞を、共通軽鎖及び2つ以上の再構成重鎖を含む無傷の多価多量体の発現をもたらす条件下で培養することであって、当該再構成重鎖のうちの2つが、当該2つの再構成重鎖の各々のCH1とCH2ドメインとの間で対合される、培養することと、
無傷の多価多量体を、当該2つの再構成重鎖の各々からCH2及び/又はCH3領域を切断する酵素により処理し、当該2つの再構成重鎖の対合を維持して、多価多量体を形成することと、を含む、方法を対象とする。
「抗体」は、抗原上のエピトープに結合する1つ以上のドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子を意味し、このようなドメインは、抗体の可変領域に由来するか又はそれとの配列相同性を共有する。抗体結合は、特異性及び親和性を含む異なる性質を有する。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されているかを判定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。本明細書では、抗体の「特異性」は、特定の抗原に対するその選択性を指し、「親和性」は、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープとの間の相互作用の強度を指すことに注意しておくとよい。
本発明は、切断多価多量体であって、その単複の標的に、その2つ以上の結合ドメインにより結合することが可能な、切断多価多量体を提供する。本発明の多価多量体は、抗原に結合することが可能な、2つ以上の可変領域又はその一部分を含んでもよい。重要なことに、多量体は、Fc領域の全て又は一部分、好ましくはFc全体を欠いている。本明細書に開示される本発明の多量体は、ヒンジ、好ましくは天然ヒンジ、より好ましくは2つ以上のジスルフィド結合を含むヒンジによりそれぞれのC末端で対合されている、2つの重鎖領域を含む。
一実施形態では、多価多量体は、無傷の多価抗体の酵素消化、又は、当該多価多量体のポリペプチドの天然ヒンジ若しくは対合を無傷で残す特定の領域での当該多価抗体の切断によって、製造することができる。無傷の抗体は、全長免疫グロブリン、例えば、全長IgG、IgA、IgE、IgD又はIgM部分であってもよいが、好ましくはIgG、より好ましくはIgG1であってもよい。
本発明の多価多量体は、1つ以上の可変領域を接続する、1つ以上のリンカーを含んでもよい。リンカーは、リンカーが接続される結合ドメインと共に、多価多量体の機能性を少なくとも部分的に決定する。
本明細書で使用されるリンカーによって、1つ以上の可変領域を少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続することができる。加えて、少なくとも1つの追加の結合ドメインがFabドメインであるか、又は重鎖可変領域と軽鎖可変領域との対合から構成される場合、リンカーによって、共有結合により、典型的にはジスルフィド架橋により、重鎖及び軽鎖を対合することができる。したがって、リンカーによって可変領域を接続する場合、それは、ポリペプチドの一次アミノ酸配列の一部、例えば、VH1-CH1-リンカー-VH2-CH1を形成する。対照的に、リンカーによって2つの可変ドメインを対合する場合、それにより、例えば、別個のポリペプチドを構成する、2つの可変ドメイン間で接点、共有結合、例えば、ジスルフィド結合を作ることによって、これらのドメインを一緒に架橋する。
2つ以上の可変ドメインが異なる抗原に結合する場合、第1の抗原及び第2の抗原は、1つの細胞又は異なる細胞型に位置する2つの異なる分子又は部分であってもよい。内因性免疫細胞を動員及び活性化することによって細胞傷害を媒介する2つの結合ドメインを含む抗体は、新たなクラスの抗体治療薬である。これは、標的細胞(すなわち、腫瘍細胞)及びエフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞、及びマクロファージ)の抗原結合特異性を1分子中で組み合わせることによって得ることができる(例えば、国際公開第2014/051433号を参照のこと)。本発明の多量体は、少なくとも2つの結合ドメインを含む。3つ以上の結合ドメインを含む多価多量体は、1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の腫瘍関連抗原を標的化して、正常細胞に対する有害細胞の特異的標的化を可能にし得る。例えば、多価多量体の1つの結合ドメイン又は2つの結合ドメインは、異常な(腫瘍)細胞上の抗原に結合し得、一方で、多価多量体の第2又は第3の結合ドメインは、1つ以上の腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の方向付けられた殺傷を引き起こし得る免疫エフェクター細胞上の抗原に結合し得る。あるいは、多価多量体の2つの結合ドメインは、腫瘍細胞で発現される同一の抗原又は異なる抗原上の2つの異なるエピトープに特異的に結合し得、一方で、これらのアームの親和性は、1つの抗原のみを発現する細胞への結合を軽減するために、又は多価多量体の1つの結合ドメインのみが結合する場合に弱められる。あるいは、本発明の多価多量体の3つの結合ドメインは、3つの異なる抗原又は同一の抗原に、但し、免疫エフェクター細胞の異なるエピトープで結合し得る。
本発明の多価多量体では、2つ以上の結合ドメイン(可変領域)の各々において共通鎖を使用することができる。記載のように、一実施形態では、多価多量体は、1つの抗原に結合する第1の重鎖可変領域/軽鎖可変領域(VH/VL)の組み合わせ、及び第2の抗原に結合する第2のVH/VLの組み合わせを有する。各々の追加の結合ドメインはまた、抗原上の更なるエピトープに結合する追加のVH/VLの組み合わせを含んでもよい。
一実施形態では、宿主細胞は、2つ以上の重鎖可変領域及び共通軽鎖可変領域をコードする核酸と共トランスフェクションされて多価多量体を産生し得、当該重鎖可変領域のうちの2つは、CH1、CH2及び/又はCH3を含む定常領域を含み、これらは、CH1ドメインとCH2ドメインとの間のヒンジでの対合によりヘテロ二量体化が可能であり、当該2つの重鎖は各々、CH2及び/又はCH3領域を切断することが可能なタンパク質分解酵素によって認識される当該ヒンジの下方で、アミノ酸配列を含む。あるいは、本発明の多価多量体は、2つ以上の軽鎖可変領域及び共通重鎖を一緒にコードする1つ以上の遺伝子構築物により個々の細胞の共トランスフェクションによって製造することができ、2つの共通重鎖は、CH1、CH2及び/又はCH3を含む、定常領域を含み、これらは、CH1ドメインとCH2ドメインとの間のヒンジでの対合によりヘテロ二量体化が可能であり、当該2つの重鎖は各々、CH2及び/又はCH3領域を切断することが可能なタンパク質分解酵素によって認識される当該ヒンジの下方で、アミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の方法及び組成物は、好適な方法から得られる、それに由来する、又はそれに基づいて、結合ドメインを有する好適な多価結合タンパク質を作製することを可能にする。好適な方法としては、ファージディスプレイ法(ファージディスプレイシステムにおいて生成された生殖細胞系列配列の修飾を含む)、及び当該技術分野において既知の他のin vitro法を挙げることができる。特に有用な方法は、遺伝子組換え非ヒト動物に、体細胞組換えの自然なプロセス、及び親和性成熟により、共通軽鎖と会合して発現することができる好適な重鎖可変ドメインを作製させることである。
本発明は、本発明の多価多量体の組み立てに使用することができるポリペプチド又はリンカーをコードする核酸配列、このような核酸配列を含むベクター、本発明の多価多量体を産生することが可能な細胞、及びこのような細胞を使用してこのような多価多量体を調製する方法を、更に提供する。
組換え宿主細胞における抗体の発現は、当該技術分野において記載されている。本発明の多量体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、染色体外コピーとして存在してもよく、及び/又は宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましく、その場合には遺伝子サイレンシングを欠くこと、又はそれを低減することが知られている、遺伝子座を標的化し得る。
当該技術分野では、F(ab’)2の製造のため、酵素消化及び化学的結合を採用してきた。例えば、抗体の親和性対アビディティ結合は、F(ab’)2と比較したとき、Fabの生成及び標的との比較を通じて、一価の標的物により抗原との結合が二価標的物よりも少なくなるかどうかについて試験し、及び二価性がアビディティにつながるかどうかを理解することで、分析されてきた。化学コンジュゲーション及びタンパク質分解消化によりF(ab’)2部分を生成する従来方法は、非効率的であること、不安定又は潜在的に免疫原性部分の生成、並びにこのような部分の分離及び使用を非実用的にする抗体断片の不均質混合物の生成により、研究及び治療用途にとってつまらないものであった。Fcの特異的切断が可能な酵素の使用と組み合わせて本明細書に記載の技術により高純度で発現された、新規な多価多量体フォーマットの出現によって、ペプシン消化から観察されるC末端不均一性を排除することによる、当該切断多価多量体の産物の高濃度の生成が可能である。
必須ではないが、切断多価多量体の生成時にタンパク質分解酵素を除去することが好ましい場合がある。固定化酵素(例えば、アガロースに固定化)の使用もまた、好ましい場合がある。酵素の除去は、酵素の末端(好ましくはN末端)に存在するHIS-NiNTI、ビオチン-アビジン、又はVSV/FLAG -抗VSV/FLAGタグなどのタグを含むタンパク質分解酵素を使用することなど、当該技術分野において既知の様々な手段によって達成することができ、酵素を抗タグ親和性カラムによって除去することを可能にする。Fcなどの抗体断片はまた、親和性クロマトグラフィー法を用いて単離することができる。同様に、タンパク質分解酵素は、電荷クロマトグラフィーによって除去することができ、又は電荷クロマトグラフィーによって後で除去することができるよう、強められた電荷を有する修飾酵素を製造することができる。
また、本発明の多量体と、医薬的に許容される担体及び/又は希釈剤と、を含む医薬組成物が、本発明によって提供される。
5つの異なる抗体(PG6058p02(HER3 IgG Fc WT)配列番号66及び67;PG3004p04(HER2 IgG Fc WT)配列番号68及び69;二重特異性PB11247 MF6058(HER3)xMF3004(HER2)Biclonics(登録商標)Fc WT DEKK(米国特許出願公開第2017/0058035号)配列番号66~69;PG1337(TT IgG FcWT)配列番号70及び71;PB4248(TTxTT)Biclonics(登録商標)Fc WT DEKK(国際公開第2017/069628号)を、GingisKHAN Fabキット及びFabRICATORキット(Genovis)を使用して消化し、それぞれFab及びF(ab’)2断片を生成した。抗体配列を表3に示す。
F(ab’)n断片(F(ab’)3、2Fab’、及びFab断片を含む)を多価多量体から生成する能力も、分析した。図4に示されるように、F(ab’)3と、2Fab’又はFab断片との両方が、選択されたプロテアーゼ(例えば、FabRICATOR又はGingisKHAN)に基づいて生成される。異なる抗原結合特性及び共通軽鎖を含む以下の三価多量体、すなわち、PT23103p09(配列番号72及び73の重鎖VH2-リンカー-CH1-VH3配列を有する);PT23103p15(配列番号74及び75の重鎖VH2-リンカー-CH1-VH3配列を有する);PT23103p04(配列番号76及び77の重鎖VH2-リンカー-CH1-VH3配列を有する);PT23103p08(配列番号78及び79の重鎖VH2-リンカー-CH1-VH3配列を有する);PT23103p03(配列番号80及び81の重鎖VH2-リンカー-CH1-VH3配列を有する);PT23103p11(配列番号82及び83の重鎖VH2-リンカー-CH1-VH3配列を有する);及びPT23103p12(配列番号84及び85の重鎖VH2-リンカー-CH1-VH3配列を有する)を分析した。各PTは、MF1337(破傷風トキソイド)配列番号70及び71をVH3の位置(頂部の長いアーム)で含み、MF1122(フィブリノーゲン)配列番号86及び87をVH2の位置(内部の長いアーム)で含み、MF1025(サイログロブリン)配列番号88及び89をVH1の位置(短いアーム)で含み、各VHがcLCと対合されている、以下の三価多量体をコードする。図4を参照のこと。三価多量体配列を表6に示す。
Claims (22)
- 3つのFabドメイン(Fab1、Fab2、Fab3)を含み、各々が、可変領域(VL)及び定常領域(CL)を含む共通軽鎖領域と対合されている可変領域(VH)及び定常領域(CH1)を含む重鎖領域を含み、Fab2及びFab3は、Fab2の重鎖可変領域及びFab3のCH1ドメインを接続するポリペプチドリンカーにより接続され、Fab1及びFab2は、Fab1の重鎖領域及びFab2の重鎖領域のC末端に存在する少なくとも2つのジスルフィド結合を含むヒンジにより対合されている、三価多量体の製造方法であって、
共通軽鎖可変領域及び未再構成重鎖可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物を、2つ以上の抗原で免疫化することと、
前記2つ以上の抗原に特異的に結合する、前記共通軽鎖可変領域及び再構成重鎖領域を含む、抗体のパネルを得ることと、
前記2つ以上の抗原に特異的に結合する、前記共通軽鎖可変領域及び3つの再構成重鎖領域をコードする、核酸を宿主細胞に組み込むことであって、前記再構成重鎖領域のうちの2つが、ジスルフィド架橋の形成により対合可能なCH1、CH2、及び/又はCH3ドメインを含む定常領域を含み、前記再構成重鎖領域のうちの2つがポリペプチドリンカーにより接続されている、組み込むことと、
前記宿主細胞を、前記共通軽鎖可変領域及び2つ以上の再構成重鎖領域を含む無傷の三価多量体を発現するために培養することであって、前記再構成重鎖領域のうちの2つが、前記2つの再構成重鎖の各々の前記CH1とCH2ドメインとの間でジスルフィド架橋により対合される、培養することと、
前記無傷の三価多量体を、前記2つの再構成重鎖領域の各々から前記CH2及び/又はCH3領域を切断する酵素により処理し、前記2つの再構成重鎖領域のジスルフィド架橋による前記対合を維持して、前記三価多量体を形成することと、を含む、方法。 - CH1、CH2、及び/又はCH3ドメインを含む定常領域を含む、前記2つの重鎖領域が、相補的な修飾を含み、ヘテロ二量体化を促進する、請求項1に記載の方法。
- 前記修飾が、免疫グロブリンCH2又はCH3領域にある、請求項2に記載の方法。
- 前記相補的な修飾が、孔修飾、静電修飾、又はDEKK修飾したノブを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記2つの重鎖領域のうちの第1の重鎖領域が、前記2つの重鎖領域のうちの第2の重鎖領域の第2のCH3ドメインと二量体化する第1のCH3ドメインを含み、そのうちの前記第1のCH3は、351位及び366位又はそれに対応する位置にアミノ酸残基リジンを含み、そのうちの前記第2のCH3は、351位又はそれに対応する位置にアスパラギン酸のアミノ酸残基、及び368位又はそれに対応する位置にグルタミン酸のアミノ酸残基を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記共通軽鎖可変領域が、その生殖細胞系列中の、再構成可変鎖核酸配列を含むトランスジェニックげっ歯類によってコードされる核酸から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく核酸によってコードされる、請求項1に記載の方法。
- 前記共通軽鎖が、配列番号1の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- Fab2及びFab3を接続する前記リンカーが、配列番号2~25のいずれか1つの配列を含み、又は前記配列番号2~25のいずれか1つと少なくとも約85%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- Fab2及びFab3を接続する前記リンカーが、配列番号2~25のいずれか1つの配列を含む、請求項8に記載の方法。
- Fab2及びFab3を接続する前記リンカーのアミノ酸配列が、天然に生じる配列を含む、又は天然に生じる配列に由来する配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記リンカーが、中央ヒンジ領域配列を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記リンカーが、上部及び下部ヒンジ配列を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記リンカーが、らせん形成配列を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記2つ以上の重鎖領域の前記可変領域が、異なるエピトープに特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記多量体が、少なくとも2つの異なる抗原に結合する、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多量体が、3つの異なる抗原に結合する、請求項15に記載の方法。
- 前記酵素をタグ付けし、前記酵素を抗タグ親和性カラムにより除去することによって、前記三価多量体を回収することを更に含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~17のいずれか一項に記載の方法によって製造された、又は得ることが可能な、三価多量体。
- 請求項18に記載の三価多量体に組み立てることが可能なポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む、細胞。
- 請求項18に記載の三価多量体と、医薬的に許容される担体及び/又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
- 医療上の適応症に罹患している対象の治療するための、請求項20に記載の医薬組成物。
- 治療に使用するための、請求項18に記載の三価多量体。
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