JP2014015462A - 水耕栽培朝鮮人参由来ジンセノシドf2を含有する皮膚外用剤組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】培地耕の朝鮮人参水耕栽培システムまたは噴霧耕の朝鮮人参水耕栽培システムで栽培して収穫した清浄な生の朝鮮人参及び朝鮮人参の葉から抽出したジンセノシドF2を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物。
【効果】優れた抗酸化力を通じて皮膚老化防止効果、皮膚保湿力改善効果、抗炎症効果、にきび及びアトピーなどの皮膚トラブル改善効果、美白効果、皮脂調節効果、毛穴収縮効果、血行改善による顔色改善などの全般的な皮膚状態改善効果だけでなく、フケ防止効果、育毛効果及び白毛防止効果などの頭皮及び毛髪状態改善効果を示す。
【選択図】図1
Description
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有する美白用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有する保湿用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有するにきび改善用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有するアトピー改善用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有する血色及び皮膚トーン改善用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有する毛穴収縮用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有する皮脂調節用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有するフケ防止用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有する育毛用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を有効成分として含有する白毛防止用皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、ジンセノシドF2を天然防腐剤として使用する皮膚外用剤組成物を提供する。
本発明で使用するジンセノシドF2は、下記化学式1の構造を有する。
a)苗参を出庫後、15℃の貯蔵温室に移して1〜2日保管した後、仮植を行う順化1段階と;
b)仮植された上記苗参を温室で1〜2日保管し、上記温室の環境に適応させた後、上記苗参を排水溝付きのベッドの内部に形成された混合培地に定植する順化2段階と;
c)養液を調剤する段階と;
d)上記養液の適正量を上記苗参に供給する段階と;
e)前記混合培地に定植する順化2段階終了後30日〜120日後に収穫する段階。
a)苗参を出庫後、15℃の貯蔵温室に移して1〜2日保管した後、仮植を行う順化1段階と;
b)仮植された上記苗参を温室で1〜2日保管し、上記温室の環境に適応させた後、上記苗参をベッドに定植する順化2段階と;
c)養液を調剤する段階と;
d)上記養液をミストノズルを通じて上記苗参の根に噴射する段階と;
e)使用された上記養液が上記ベッドの一端に形成された排水口を通じて養液槽に流入されて再使用される段階と;
f)前記ベッドに定植する順化2段階終了後30日〜120日後に収穫する段階。
低温貯蔵された苗参を15℃の貯蔵温室に移して2日間保管後、70%〜80%水分を含有する園芸用床土(ココピート50%、ピートモス30%、バーミキュライト10%、ゼオライト10%)に仮植して順化させた。順化段階の温度は、20〜23℃に維持し、5〜7日後、苗参の若芽が緑化した後、25℃、湿度80%〜90%に維持された温室に移した。2日後、苗参をベッドに定植した後、養液を適正量供給し、水耕栽培朝鮮人参を栽培した。
一般栽培(露地栽培)朝鮮人参の葉は、金山の朝鮮人参卸売りセンターで購入(2011年10月)し、水耕栽培朝鮮人参の葉は、苗参を2012年1月定植した後、上記参考例1の方法で栽培し、30日、60日、90日、120日後に採取した。
水耕栽培した朝鮮人参に特有のジンセノシドであるジンセノシドF2の含量を高めるために、80%エタノールで抽出した水耕栽培朝鮮人参抽出物(上記抽出物パウダー)5gを水500mlに溶解させた後、同量の水飽和ブタノール(water saturated butanol)を加えて分液漏斗に入れ、この分液漏斗を何度も振った後、水飽和ブタノール層を分取し、得られた水飽和ブタノール溶液を減圧下に濃縮し、ジンセノシドF2の含量が高くなった水耕栽培朝鮮人参抽出物を得た。
また、ジンセノシドF2の標準品は、アンボ研究所(Korea)から購入した。
人間の表皮組職から分離した角質形成細胞(keratinocyte)を24ウェルプレートの各ウェルに5×104個を入れ、24時間付着させた。16時間後、この角質形成細胞を濃度1%のジンセノシドのDMSO溶液で処理した。この際、対照群は、ジンセノシドF2を処理しなかった。2時間後に培養液を除去した後、各ウェルに100μLのリン酸緩衝溶液(PBS)を入れた。この角質形成細胞に紫外線B(UVB)ランプ(Model:F15T8、UV B 15W、Sankyo Dennki社、Japan)を利用して紫外線30mJ/cm2を照射した後、PBSを取り出し、各ウェルに角質形成細胞培養液200μLを添加した。これにジンセノシドF2をさらに処理し、一定時間帯別に紫外線刺激によって増加した活性酸素種の量を定量した。ROSの量は、ROSによって酸化されるDCF−DA(dichlorofluorescin diacetate)の蛍光を測定するTanの方法を参照して定量し(Tan et al., 1998, J. Cell Biol., Vol. 141, pp1423-1432)、ビヒクルだけを処理した対照群のROSに対する比率を算出した。結果を表1に示す。
ジンセノシドF2のエラスターゼ活性阻害能をEGCGと比較して測定した。使用したエラスターゼ及び基質は、米国シグマアルドリチ社から購入した(Cat.No.E0127)。
96ウェルプレートで10mg/L Tris-HCL緩衝液(pH8.0)で調剤したものにジンセノシドF2のDMSO溶液200μL及び20μg/mLエラスターゼ・タイプIII溶液50μLを混合した。陽性対照群としてエラスターゼ活性抑制剤として知られるEGCGを250μM使用し、陰性対照群である非処理群は、蒸留水を使用した。その後、上記緩衝液として調剤した0.4514mg/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE 100μLを添加し、25℃で15分反応させた。反応終了後、波長415nmにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い、補正した。エラスターゼ活性阻害作用の計算方法は、下記数式1に示された通りであり、結果は、下記表2に示した。
A:試験物質無添加、酵素添加での波長415nmにおける吸光度
B:試験物質無添加、酵素無添加での波長415nmにおける吸光度
C:試験物質添加、酵素添加での波長415nmにおける吸光度
D:試験物質添加、酵素無添加での波長415nmにおける吸光度
本発明のジンセノシドF2のコラゲナーゼ生成阻害能をコラゲナーゼ発現阻害剤として知られるレチノイン酸と比較して測定した。
2.5%の牛胎児血清が含有されたDMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)培地が入っている96孔平板培養器(96-well microtiter plate)に人間の線維芽細胞を5,000細胞/孔(well)になるように入れ、CO2 5%、37℃の培養器(incubator)で70〜80%程度成長するまで培養した。ジンセノシドF2またはレチノイン酸を10μg/mL濃度で24時間処理した後、細胞培養液を採取した。
このような結果を通じて、本発明のジンセノシドF2は、基質メタロプロテアーゼ(MMP−1)を阻害する効果を有することを確認することができる。
下記表4の組成からなる栄養クリームを一般的な方法で製造した(単位:重量%)。
人間での皮膚弾力向上効果を確認するために、上記剤形例1と比較剤形例1の剤形で次のように評価した。
30〜40代の元気な女性20人をそれぞれ剤形例1と比較剤形例1の2つの群に対して10人ずつ2グループに分けて栄養クリームを毎日1回ずつ12週間顔面に塗布するようにした後、皮膚弾力測定器(Cutometer SEM 575、C+K Electronic Co. Germany)を利用して皮膚弾力を測定した。その結果を表5に示す。表5の結果値は、Cutometer SEM 575のΔR8値で記載したが、R8値は、皮膚粘弾性(viscoelasticity)の性質を示す。
したがって、本発明のジンセノシドF2を含有する組成物は、皮膚弾力向上に非常に効果的であることを確認することができる。
本発明の組成物による人間でのしわ改善効果を確認するために、上記剤形例1と比較剤形例1を利用した。
上記剤形例1と比較剤形例1のしわ改善効果を確認するために、次のように評価した。40代の元気な女性20人をそれぞれ剤形例1と比較剤形例1の2つの群に対して10人ずつ2グループに分けて栄養クリームを毎日1回ずつ12週間顔面に塗布するようにした後、シリコーンを利用してレプリカを作成し、しわの状態を皮膚測定器(visiometer、SV600、Courage+Khazaka electronic Gmbh、Germany)で測定し、画像分析した。その結果を表6に示す。下記表6の値は、塗布12週後のそれぞれの変数(parameter)値から塗布前の変数値を差し引いたものの平均を示したものである。
R1:しわ等高線の最高値と最低値との差の値
R2:しわ等高線を任意に5個ずつ分けた後、それらのうちR1値の平均
R3:5個ずつ分けたR1値のうち最高値
R4:しわ等高線のベースライン(baseline)から各角の頂上と谷の値を差し引いた平均値
R5:しわ等高線のベースライン(baseline)から各角のしわ輪郭を差し抜いた値の差の値
チロシナーゼ酵素は、きのこ類(Mushroom)から抽出したもので、シグマ(SIGMA)社のものを使用した。まず、基質であるチロシンを蒸留水に溶解させて0.3mg/mLの溶液とし、その溶液を1.0mLずつ試験管に入れた後、これにポタシウム−ホスフェート緩衝溶液(0.1mol濃度、pH6.8)1.0mL及び蒸留水0.7mLを添加した。
本発明のジンセノシドF2をエタノール溶液に適当な濃度で混合して準備した試料液0.2mLを反応液に入れた後、37℃恒温槽で10分間反応させた。この際、対照群は、各試料液の代わりに、溶媒のみを0.2mL入れたものを準備し、陽性対照群としては、アスコルビン酸を使用した。この反応液に2500ユニット/mLのチロシナーゼ溶液0.1mLずつを入れ、さらに37℃恒温槽で10分間反応させた。この反応液が入った試験管を氷水の中に入れて急冷させて反応を中止させ、光電分光分析計で波長475nmでの吸光度を測定し、その結果を表7に示す。それぞれのチロシナーゼ阻害効果は下記数式3で算出した。
ジンセノシドF2及びコウジ酸をそれぞれ0.001重量%で含有する試料を試験物質として一定濃度でB16/F10メラノマ細胞(韓国細胞株銀行)の培養液に添加し、3日間培養した後、培養液を除去し、PBSで洗浄し、1N-NaOHで細胞をとかして、405nmで吸光度を測定した。試験物質を添加しない細胞を対照群として対照群でのメラニン含量と比較し、各試験物質のメラニン生成阻害程度を測定した。数式4によってメラニン生成抑制率を計算し、その結果を表8に示す。
ジンセノシドF2が皮膚保湿力増加に及ぶ効果を測定するために、上記剤形例1及び比較剤形例1を利用し、下記のように評価した。
乾燥皮膚として分類された40〜50代の大人男女20人をそれぞれ剤形例1及び比較剤形例1の2つの群に対して10人ずつ2グループに分けて栄養クリームを毎日2回ずつ4週間顔面に塗布するようにした。塗布開始前と、塗布後に1週、2週、4週経過した時点、そして塗布を中止した2週経過(総6週経過)後に恒温、恒湿条件(24℃、相対湿度40%)で皮膚水分量測定器(Corneometer CM825、C+K Electronic Co., ドイツ)で皮膚水分量を測定した。結果を表9に示す。表9の結果は、試験開始直前に測定した皮膚水分量の値を基準として一定期間処理した後の測定値の増加分を百分率で表示したものである。
ジンセノシドF2の角質形成細胞の分化促進効果を調べるために、下記のように角質形成細胞の分化時に生成されるCE(Cornified Envelop)量を吸光度を利用して測定した。
まず、新生児の表皮から分離して一次培養した人間の角質形成細胞を培養用フラスコに入れて底に付着させた後、ジンセノシドF2を培養液に5ppm濃度で処理した後、細胞が底面積の70〜80%程度成長するまで5日間培養した。この際、低カルシウム(0.03mM)処理群と高カルシウム(1.2mM)処理群をそれぞれ陰性対照群、陽性対照群とした。次に、上記培養した細胞を収穫し、PBS(Phosphate buffered saline)で洗浄した後、2%SDS(sodium dodecyl sulfate)と20mM濃度のDTT(Dithiothreitol)を含有する10mM濃度のトリス−塩酸緩衝液(Tris-HCl、pH7.4)1mLを加えて、ソニケーション(sonication)、ボイリング(boiling)、遠心分離を行い、沈殿物をさらにPBS 1mLに懸濁させて340nmでの吸光度を測定した。これと別に、上記ソニケーション後の溶液を一部取って、タンパク質の含量を測定し、細胞分化程度の評価時に基準とした。結果を表10に示す。
ジンセノシドF2が皮膚損傷によって損傷された皮膚障壁機能の回復に及ぶ効果を測定するために、下記のような実験を行った。成人男女10人の上膊をテープストリピング(Tape Stripping)方法を利用して皮膚障壁に損傷を与え、それぞれ下記表11の組成で製造した剤形例2及び比較剤形例2の2つの群を塗布しながら7日間一日に一度ずつ経皮水分損失量(TWEL)の回復程度をVapometer(Delfin、フィンランド)で測定比較した。ここで、比較剤形例2は、陰性対照群としてビヒクル(vehicle)である。結果を表12に示す。表12の結果は、障壁損傷前と障壁損傷後の処理前の差異を100%を基準として比較した。
本発明による化粧料組成物の皮膚血液循環促進効果を評価するために、LDPI(Laser Doppler Perfusion Imager)を利用して皮膚での血液循環程度を測定した。LDPIは、皮膚での血液循環を測定する機器として広く知られており、皮膚の毛細血管で血液の速度及び量だけでなく、小動脈と小静脈でのフローまで測定することができる非常に敏感な機器である。
普段手足が冷たい女性30人を対象に、恒温恒湿室で顔をせっけんで水洗した後、30分間適応させ、LDPIを利用して額の下部分の初期血流量を測定した。その後、上記剤形例1及び比較剤形例1を1週間被試験者に使用するようにした後に測定した血流量と上記初期測定値を比較した結果(皮膚血流量変化)を表13に示す。
上記剤形例1及び比較剤形例1の皮膚トーン改善効果を調べるために、30人の被験者にそれぞれ使用(夕方1回/日塗布、総1週間)するようにした後、Facial Stage DM-3(Moritex、Japan)機器を活用して皮膚トーン改善程度を評価した。皮膚トーン改善率は、皮膚の明度及び色彩測定値で皮膚の明度及び色彩変化値として判断し、その結果は、下記表14に示した。明度及び色彩変化値が大きいほど皮膚トーンが改善したことを意味する。
1.コラーゲン生合成促進による毛穴縮小効果
本発明によるジンセノシドF2のコラーゲン生合成促進効果をTGF−βと比較して測定した。まず、線維芽細胞(fibroblast)を24ウェル(well)に1孔当たり105個ずつ播種(seeding)し、90%程度成長するまで培養した。これを24時間無血清DMEM培地で培養した後、無血清培地にとかした本発明のジンセノシドF2とTGF−βをそれぞれ10ng/mLずつ処理し、CO2培養器で24時間培養した。これらの上澄み液を取って、プロコラーゲン型(I)ELISAキット(procollagen type(I))を利用してプロコラーゲン(procollagen)の増減有無を調べた。その結果を表15に示し、コラーゲンの合成能は、非処理群を100として対比した。
剤形例1及び比較剤形例1の毛穴縮小効果を調べるために次のように評価した。毛穴サイズが広い被験者男女20人を選定し、10人ずつ2つの群に分けて各群別に顔に剤形例1及び比較剤形例1の栄養クリームを4週間毎日塗布するようにした。毛穴縮小の効果に対する判定は、実験前と4週後に写真を撮って専門家の目視評価で行われた。その結果を下記表16に示した(評価等級:0−全然縮小されなかった;4−非常に縮小された)。
1.5α−リダクターゼ活性抑制による皮膚過分泌抑制効果
5α−リダクターゼ活性抑制効果を確認するために、HEK293−5αR2細胞で[14C]テストステロンが[14C]ジヒドロテストステロン(DHT:dihydrotestosterone)に変換される比率を測定した。HEK293細胞にp3xFLAG−CMV−5αR2を形質感染させて、24ウェルプレートにウェル当たり2.5×105細胞で入れて培養した(Park et al., 2003、JDS. Vol.31, pp.191-98)。翌日、酵素基質と阻害剤が添加された新しい培地に変えた。培地の基質としては、0.05μCi[14C]テストステロン(Amersham Pharmacia biotech、UK)を使用した。
プラスチック試料を空気中で乾燥した後、同位元素の量を測定するために、バースシステムを使用したが、乾燥したプラスチックシートとX線フィルムを一緒にバースカセットに入れ、1週間後にフィルムに残っているテストステロンとジヒドロテストステロンの同位元素の量を測定した後、下記数式5及び6によって転換率及び阻害率をそれぞれ算出し、その結果を下記表17に示した。
上記剤形例1及び比較剤形例1の皮脂分泌抑制効果を調べるために、次のように評価した。皮脂分泌が多いと感じる被験者男女30人を選定し、指定された部位に剤形例1及び比較剤形例1の栄養クリームを4週間毎日塗布するようにした。皮脂減少の効果に対する判定は、皮脂量測定器(Sebumeter SM810、C+K Electronic Co.,ドイツ)を使用して2週及び4週経過後に平均皮脂減少率(%)をそれぞれ測定し、その結果を下記表18に示した。
下記表19に示した成分及び含量(重量%)によって剤形例3及び比較剤形例3〜4を製造した。具体的に説明すれば、剤形例3は、ジンセノシドF2を配合させたものであり、比較剤形例3は、にきび皮膚改善の有効成分を全く含ませないものであり、比較剤形例4は、抗菌力に対する基準とする標準物質としてにきび治療剤に多く使用されるエリスロムマイシン(erythromycin)を含有させたものである。
剤形例3及び比較剤形例3〜4の製造方法は、次の通りである。表19のA相の成分を完全溶解させ、別の溶解槽でB相の成分を完全溶解させた後、B相をA相に添加して混合し、可溶化させた。これにC相の成分を表19に記載した配合比率によって添加して混合し、均一化させた後、濾過させて、本組成物を製造した。
剤形例3及び比較剤形例3〜4の組成で製造されたそれぞれの化粧料組成物について、にきび原因菌株であるプロピオニバクテリウムアクネス(ATCC 6919:培地−BHIブロス(broth))に対する抗菌力を試験した。
にきび菌に対する抗菌力試験方法は、次の通りである。
(1)試験菌液準備
プロピオニバクテリウムアクネスは、BHIブロスに接種し、嫌気培養した培養液を使用した。
(2)希釈溶液準備
BHIブロス(pH6.8)またはLBブロス(pH4.5)15mLに上記試験菌液を0.15mL添加し、よく混合したものを希釈溶液として使用した。
(3)試料準備
剤形例3及び比較剤形例3〜4で製造された化粧料組成物原液そのままを試料として使用した。
(4)抗菌力試験
1)96ウェルの細胞培養管(96 well plate)1番の行に出発濃度に合うように試料を入れ、希釈溶液として総量を200μLずつ入れる。
2)1番の行の混合液をよく混ぜた後、100μLを取って、2番の行に入れ、よく混ぜた後、さらに100μLを取って3番の行に入れる方式で二重希釈(double dilution)を行う。
3)32℃で24時間及び48時間静置培養した後、懸濁された程度によって菌の増殖有無を判断し、菌の増殖がない最小濃度をMIC(最小阻止濃度;Minimum Inhibitory Concentration)値として決定する。混合液が不透明なために、菌の増殖有無を判断しにくい場合は、顕微鏡観察を通じて確認する。
にきび菌に対する抗菌力試験結果を表20に示す。MICは、剤形に含有された有効成分の濃度に換算して表記した。
マウスの線維芽細胞株(fibroblast cell line)である3T3−L1細胞を10%の牛胎児血清(fetal bovine serum、FBS)が含有されたDMEM(Dulbecco's modified eagles medium、GIBCO BRL、Life Technologes社)培地が収容された6ウェル培養プレート(culture plate)に1×105細胞/ウェルで付着させた。2日後、さらに新しいDMEM(10%FBS含有)培地に交換し、2日間培養した。次に、上記培養した細胞をさらに1μg/mLインシュリン(insulin)、0.5mM IBMX及び0.25μMデキサメタソン(dexamethasone)を含有するDMEM(10%FBS含有)で分化誘導を行い、ジンセノシドF2及びカフェインを50μMで処理した後、処理2日が経過した後、さらにインシュリンが含まれたDMEMに交換し、5日間培養した。5日後、さらに正常培地(DMEM、10%FBS含有)に交換し、上記細胞が形態的に脂肪細胞に変化するまで観察しながら培養した。
にきびを保有している30人を10人ずつ3つの群に分けてそれぞれの群に該当する被験者に上記剤形例3及び比較剤形例3〜4で製造された化粧料組成物を1ヶ月間使用するようにした。にきび改善尺度は、1点から5点までであり、1点では、‘改善しない’、3点は‘普通である’、5点は‘非常に改善する’で表記するようにした。実験結果は、下記の表22に10人の平均点数で表記した。
にきび消滅時期は、消滅が確認された日数を基準とし、にきび再発は、有無で1ヶ月後の結果を基準とした。皮脂分泌減少は、1点から5点までであり、1点では‘減少しない’、3点は‘普通である’、5点は‘非常に減少する’で表記するようにした。実験結果は、下記表22に10人の平均点数で表記した。皮膚刺激の有無は、(刺激反応を示した人数)/(総試験者の数)から確認した。
1.プロスタグランジンの生成抑制効果
抗炎症効果をプロスタグランジンの生成抑制効果で評価した。ジンセノシドF2を利用して大食細胞を対象として効果を測定した。まず、マウスの腹腔で採取した大食細胞に最終濃度が500Mになるようにアスピリンを添加し、細胞に残存するシクロオキシゲナーゼ(cyclooxygenase、COX)活性を非可逆的に抑制した。その後、上記懸濁液を96ウェルの細胞培養管の各ウェルに100μLを入れ、5%CO2と37℃条件の培養器で2時間培養し、大食細胞を容器の表面に付着させた。次いで、付着した大食細胞をPBSで3回洗浄した後、これを炎症改善効果試験に使用した。上記培養された大食細胞5×104細胞/mLにLPSを1%(w/v)で含有するRPMI培地を添加し、12時間培養した後、プロスタグランジンの生成を誘発し、ジンセノシドF2を100μL処理し、遊離されたプロスタグランジンを酵素免疫分析法(ELISA)を利用して定量した。
この際、ジンセノシドF2のプロスタグランジンの生成抑制活性は、LPSを処理した群と処理しない群でそれぞれ生成したプロスタグランジンの差を100%に設定し、LPSと試料を一緒に処理し、減少したプロスタグランジンの百分率により対照群と比較、判定した。その結果(プロスタグランジンの生成抑制効果)を表23に示す。
これにより、本発明のジンセノシドF2は、優れた炎症改善効果を提供することができることが分かる。
また、ジンセノシドF2は、皮膚炎症因子であるプロスタグランジンの発現を抑制し、皮膚トラブルを防止し、改善させることができることが分かる。
実験1日前に、皮膚角化上皮細胞(Normal human skin keratinocyte、NHEK、入手先:Lonza)を96ウェル(well)プレートに5×104細胞/ウェルになるように分株した後、37℃、5%CO2インキュベーター(incubator)で24時間培養した。24時間後、PBSで細胞を2回洗浄し、無血清KBM(serum free keratinocyte basement media)に交替した。それぞれのウェルにジンセノシドF2を下記表24の濃度別に処理して30分間反応させた後、PGSA(10μg/mL)、PGSA(50μg/mL)、PGSA(50μg/mL)+LPS(1μg/mL)をそれぞれ処理した。ここで、PGSA(peptidoglycan from S.aureus)は、葡萄状球菌から抽出したペプチドグリカン(peptidoglycan)であって、グラム陽性(+)菌の細胞壁の主要構成成分であり、バクテリアの細胞膜成分は、炎症を誘発させるものと知られており、特に葡萄状球菌の場合、アトピー患者の90%程度がこの菌による2次感染を起こすものと報告されている。LPS(lypopolysaccaride)は、グラム陰性(−)バクテリア菌の細胞膜主要構成成分であり、炎症誘発の主原因として知られている。
24時間37℃、5%CO2インキュベーターで培養した後、培養液を取って、インターロイキン−8(Interleukin-8、IL-8)に対するELISAを進行し、その結果を下記表24に示した。ELISAは、製造会社(BD science)の実験方法を利用した。
実験1日前に角質形成細胞(細胞株名:HaCaT、入手先:ATCC)を96ウェル(well)プレートに4×104細胞/ウェルになるように分株した後、37℃、5% CO2インキュベーター(incubator)で24時間培養した。24時間後、HBSS(Hanks' Balanced Salt solution)バッファーで96ウェルプレートを2回ウォシング(washing)した後、反応バッファー(2μM Fluo-4-AM、20% pluronic acid、2.5mM probenecid)を細胞に入れた。37℃、5% CO2インキュベーターで30分、常温で30分間反応させた後、HBSSバッファーで2回ウォシングし、下記表25のような濃度(%)のジンセノシドF2で細胞を処理した。
したがって、本発明のジンセノシドF2を含有する皮膚外用剤組成物は、痒さを誘発させるPAR−2活性を効果的に抑制することによって、優れた抗掻痒効果を提供することができる。
下記表26の組成でシャンプーを製造した。具体的に、界面活性剤とエチレングリコールジステアレートを精製水に添加し、80℃になるまで加熱して均一に溶解させた後、攪拌の下に40℃まで徐々に冷却し、上記混合物に本発明による有効成分と防腐剤、粘度調節剤、香料、毛髪コンディショニング剤を投入して混合した後、攪拌の下に室温まで冷却させて製造した。
上記剤形例4及び比較剤形例5の抗フケ性を測定して比較した。この際、試験菌株としては、フケ菌である ピチロスポルム‐オバーレ(Pityrosporum Ovalae(ATCC12078))を使用した。
抗菌力測定方法は、皮膚ディスク拡散法を利用した。皮膚ディスク拡散法(skin disc diffusionmethod;SDDM)は、消費者の使用習慣に最も近接した方法であり、人間の皮膚と類似のギニーピッグ(guinea pig)の皮膚を対象として抗菌力を測定する方法である。
具体的には、ギニーピック皮膚(guinea pig skin)をむいた後、70%エタノールで処理し、均一に広げて乾かした後、一定のサイズに切断した皮膚ディスクを使用した。滅菌処理された皮膚ディスクをシャンプー希釈溶液に3分間浸漬してから、流水で洗浄した。その後、皮膚ディスクを試験菌が接種された固体培地上に載置し後、試験菌を培養した。培養後、菌の増殖が抑制された透明帯(clear zone)のサイズを測定し、相対的な抗菌力を測定した。実験結果値は、3回測定した結果の平均値として表27に示した。
試験フケが比較的多い19〜35歳の男性24人を選定し、各剤形例4及び比較剤形例5のシャンプーに対して12人ずつ2つのグループとして1ヶ月間以下の手順で使用後、フケ減少率を測定した。
試験開始前に、通常のシャンプーで洗髪し、洗髪後、2日間累積したフケを採集した。各剤形例4及び比較剤形例5のシャンプーを使用して、1ヶ月間、2日に1回ずつ洗髪し、試験終了後、2日間累積したフケを採集し、試験開始前と試験終了後のフケ重量を比較評価した。この際、累積したフケは、真空吸入装置により頭皮から直接採集し、下記数式7に基づいてフケ減少率を求めた。結果を表28に示す。
比較的頭皮痒さをひどく感じる25歳〜45歳の男女24人を選定し、12人ずつ2つのグループに分けて各剤形例4及び比較剤形例5のシャンプーを3日に1回ずつ2週間使用するようにした後、頭皮かゆみ防止効果を下記評価基準を用いて評価し、その結果を下記表29に示した。
〔評価基準〕
非常に優秀−5点
優秀−4点
普通−3点
不良−2点
非常に不良−1点
毛髪を構成するケラチンタンパク質は、毛根部ケラチン形成細胞(keratinocyte)で生成され、このケラチン形成細胞は、毛乳頭細胞から分化される。本組成物による毛乳頭細胞の活性を評価するために、本発明では、DP6(rat immortalized dermal papilla cell)細胞株を使用した(Wendy Filsell、Journal of Cell Science 107、1761-1772(1994))。この毛乳頭細胞株は、雄性PVGラットひげの毛根から顕微解剖(microdissection)方法で分離して培養した細胞株であり、10%FBS(Fetal bovine serum)が含有されたDMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium、Gibco BRL、Gaithersburg、MD、USA)で5%CO2、37℃が維持されるインキュベーターで24時間培養した。DP6を96ウェルプレートに入れ、24時間37℃インキュベーターで培養した後、このジンセノシドF2をそれぞれ5ppm、10ppm及び20ppmの濃度で処理した。薬物処理24時間経過後に、WST−1キット(Roche)を使用して細胞増殖能を測定した。結果は、下記表30に示した。
脱毛治療剤であるミノキシジルは、潜在的なミトコンドリアカリウムイオンチャネルオープナー(KATP channel opener)として知られており、アンドロゲン性脱毛の治療に使用される代表的な薬物である。このようなミノキシジルの機作を評価するために、頭皮の真皮を構成する線維芽細胞でKATPチャネルを阻止するトルブタミド(SIGMA ALDRICH、T0891)を処理し、細胞増殖を抑制し、さらにカリウムイオンチャネルを開いて細胞増殖が回復される試験法を使用した。
本組成物のKATPチャネルオープナーとしての機能を評価するために、本発明では、線維芽細胞株であるNIH3T3(Mouse embryonic fibroblast cell line)細胞株を使用した。本細胞株は、NIHスイスマウス胚芽(Swiss mouse embryo)から分離した線維芽細胞株を3T3プロトコルで自然不滅化させた細胞株である。上記細胞株は、10%FBSが含有されたDMEM(Gibco BRL、Gaithersburg、MD、USA)で5%CO2、37℃が維持されるインキュベーターで24時間培養した。NIH3T3を96ウェルプレートに入れ、24時間37℃インキュベーターで培養した後、2.5mMトルブタミドを処理し、10分後に陽性対照群であるミノキシジル10μMとジンセノシドF2をそれぞれ2.5ppm、5ppm及び10ppmの濃度で処理し、薬物処理48時間経過後に、WST−1キット(Roche)を使用して細胞増殖能を測定した。結果を表31に示す。
表32の成分配合比(単位:重量%)で通常的な方法でクリーム基材の組成物を製造した。
ICRマウスの背中の毛を除毛器で除毛した後、除毛クリーム(ヴィートクリーム)を使用して毛を完全に除去した。対照群(normal群)を除いた他の2つの群に対して1%DNCBで200μLずつ皮膚に1日1回塗布し、皮膚炎症を3日間誘発させた。3日後から対照群を除いた群に対して上記剤形例5及び比較剤形例6のクリーム基材を1日1回塗布し、各群の発毛程度を観察した。結果を図3に示す。
図3から明らかなように、15日間の観察で、対照群は除毛された部分で発毛現象が認められなかった。ジンセノシドF2を含有しないクリーム基材のみを適用した群では微々たる発毛効果を示した。一方、ジンセノシドF2を含むクリームを適用した群では、除毛された部分全体で顕著な発毛効果を示すことを確認することができる。
上記試験例25の方法で背中の毛を除毛したマウスにジニトロクロロベンゼン(dinitrochlorobenzene、DNCB)を適用し、皮膚炎症を誘発させて皮膚内ストレス条件を与えて、毛の生長を著しく低下させた。本発明の組成物における毛髪再生効能を評価するために、ジンセノシドF2を含む上記剤形例5及び比較剤形例6のクリームをマウスに適用し、各適用日数時に発毛した毛の長さを測定し、対照群と比較した。結果を表33に示す。
これは、ジンセノシドF2が皮膚ストレスの下に形成された毛髪再生抑制条件の下でも毛髪再生を促進したものと判断され、これにより、ジンセノシドF2は、ストレスの下で脱毛された毛髪に対する再生機能があることが分かる。
RPMI培地に5%の牛胎児血清、100IUのペニシリンG及び0.2μMのTPAを添加した培地にメラニン細胞(melan-a)を24ウェルプレート(24-well microtiter plate)に50,000細胞/ウェルになるように分株した。翌日、分株された細胞に試験物質としてジンセノシドF2を最終濃度10ppmまたは50ppmで処理し、陰性対照群としては0.1%DMSOを、陽性対照群としては100μM IBMXを処理した後、37℃で3日間培養した。培養後、PBSでウェルを洗浄し、1N NaOHを100μLずつ入れた後、細胞内のメラニンを溶解させた。溶解されたメラニンの吸光度を平板培養測定器(microplate reader)を利用して405nmで測定した。ジンセノシドF2のメラニン生成促進効果を対照群と比較した結果を表34に示す。
501mel細胞株を利用して6ウェルプレート(6-well microtiter plate)に500,000細胞/ウェルになるように分株し、各ウェルに陰性対照群としてはDMSO 0.1%、陽性対照群としてはIBMX 100μM、そして試験群としてはジンセノシドF2を10ppmで処理し、37℃で24時間、48時間、72時間培養した後、タンパク質を得た。このように得たタンパク質に対してMITF及びチロシナーゼ抗体を利用してウェスタンブロットを行った。タンパク質抽出とウェスタンブロットは、通常、当業者が使用する標準方法で行った。ウェスタンブロット後、その結果を陰性対照群を100にしてこの値と比較し、表35に示す。
白斑症マウス(C57bl/6-Mitfmi-vit)は、米国のThe Jackson Labで購入して使用した。上記白毛発生が促進されたマウスを利用した白毛防止物質効果実験方法は、下記の通りである。12週齢のマウスの背中の毛を脱毛(depilation)で除去した。但し、毛を除去する部位の広さは、個体ごとに同一となるように調節した。毛を抜いた翌日から1日に2回ずつ白毛防止物質を、毛を抜いた部位に塗布した。白毛防止物質の運搬体(vehicle)としては、EtOH:1、3−BG:DW=3:2:5(体積比)の混合物を使用し、上記運搬体を陰性対照群として、これにIBMX 50mMを添加した液を陽性対照群として、そしてジンセノシドF2を2.5%添加した液を試験群として使用した。約3週が経過した後、各物質間の白毛防止効能差が目視で識別されれば、新たに育った毛を収集し、毛髪内のメラニン量を測定した。毛髪内のメラニン量は、タンパク質加水分解酵素であるエスペラゼ(Esperase、Novozyme)を利用して測定した。バッファー(50mM Tris-HCl、5mM DTT、pH9.3)にエスペラゼを1NPU/mLの濃度になるようにとかして反応バッファーを製造した。反応バッファー1mLにマウス毛髪5mgを入れ、37℃で1,000rpmの速度で攪拌しながら13時間反応させた後、瞬間的な遠心分離により毛髪と反応液を分離した。このように得られた反応液を96ウェルプレートに収納し、405nm波長で吸光度を測定すれば、反応液内のメラニン量を測定することができる。白毛発生が促進された白斑症マウスモデルに陰性対照群、陽性対照群、試験群物質を処理した場合、その効能を目視観察及び毛髪内のメラニン定量方法で測定した結果を下記表36に示した。
ジンセノシドF2の抗菌力を評価するために抗菌実験を実施した。具体的な実験方法は、次の通りである。
実験に使用したスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)菌株は、トリプチックソイブロス(Tryptic Soy Broth)で、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスぺルギルスニガー(Aspergillus niger)菌株は、サブローデキストロースブロス(Sabouraud Dextrose Broth)で培養した。培養液を各培地に1/100(カンジダ・アルビカンス菌株は1/10)希釈した希釈液を試験菌液として使用した。アスぺルギルスニガーは、2×108cfu/mLになるように製造した胞子懸濁液を試験菌液として使用した。
各培地15mLに上記試験菌液を0.15mL添加し、よく混合したものを希釈溶液として使用した。
96ディップウェルプレート(96 well plate)1番の行に試料を16μLずつ入れ、希釈溶液を184μLずつ入れた。残りのウェルには、希釈溶液100μLずつ入れた。1番の行の混合液をよく混ぜた後、100μLを取って2番の行に入れ、よく混ぜた後、さらに100μLを取って3番の行に入れる方式で2倍ずつ希釈させた。
スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)は、32℃恒温槽で、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスぺルギルスニガー(Aspergillus niger)は25℃恒温槽で培養した。
48時間後、菌増殖の可否を懸濁度と顕微鏡で確認し、最小阻害濃度(MIC)値を決定した。結果を表37に示す。
Claims (25)
- 培地耕の朝鮮人参水耕栽培システムまたは噴霧耕の朝鮮人参水耕栽培システムで栽培して収穫した清浄な生の朝鮮人参及び朝鮮人参の葉から抽出した、下記化学式1で表現されるジンセノシドF2を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物。
- 上記清浄な生の朝鮮人参及び朝鮮人参の葉は、
a)苗参を出庫後、15℃の貯蔵温室に移して1〜2日保管した後、仮植を行う順化1段階と;
b)仮植された上記苗参を温室で1〜2日保管し、上記温室の環境に適応させた後、上記苗参を排水溝付きのベッドの内部に形成された混合培地に定植する順化2段階と;
c)養液を調剤する段階と;
d)上記養液の適正量を上記苗参に供給する段階と;
e)前記混合培地に定植する順化2段階終了後30日〜120日後に収穫する段階と;
を含む培地耕の朝鮮人参水耕栽培システムを利用した方法で生産されることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。 - 上記清浄な生の朝鮮人参及び朝鮮人参の葉は、
a)苗参を出庫後、15℃の貯蔵温室に移して1〜2日保管した後、仮植を行う順化1段階と;
b)仮植された上記苗参を温室で1〜2日保管し、上記温室の環境に適応させた後、上記苗参をベッドに定植する順化2段階と;
c)養液を調剤する段階と;
d)上記養液をミストノズルを通じて上記苗参の根に噴射する段階と;
e)使用された上記養液が上記ベッドの一端に形成された排水口を通じて養液槽に流入されて再使用される段階と;
f)前記ベッドに定植する順化2段階終了後30日〜120日後に収穫する段階と;
を含む噴霧耕の朝鮮人参水耕栽培システムを利用した方法で生産されることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。 - 上記ジンセノシドF2は、組成物全体重量に対して0.001〜50重量%の量で含有されることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、抗老化用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、皮膚弾力向上用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、皮膚しわ改善用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、美白用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、保湿用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、皮膚障壁機能強化用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、皮膚角質形成細胞分化誘導用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、にきび改善用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、抗菌用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、抗炎症用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、脂質生成を抑制することを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、アトピー改善用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、血色及び皮膚トーン改善用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、毛穴収縮用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、皮脂調節用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、皮膚トラブル改善用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、皮膚刺激生成防御用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、フケ防止用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、育毛用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記組成物は、白毛防止用であることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
- 上記ジンセノシドF2は、天然防腐剤として使用されることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
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