JP2013534416A - 新規土壌微生物、前記土壌微生物から分離された新規な酸化還元酵素、前記酸化還元酵素をコード化する遺伝子、及びこれらを利用した無糖体の生産方法 - Google Patents
新規土壌微生物、前記土壌微生物から分離された新規な酸化還元酵素、前記酸化還元酵素をコード化する遺伝子、及びこれらを利用した無糖体の生産方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(1)ジンセノサイド:高麗人蔘サポニンであり、高麗人蔘の有効成分
(2)コンパウンドK(Compound K:CK):20−O−ベータ−D‐グルコピラノシル−20(S)−プロトパナキサジオール(20−O−beta−D‐glucopyranosyl−20(S)−protopanaxadiol)
(3)ジンセノサイドRh2:3−O−ベータ−D‐グルコピラノシル−20(S)−プロトパナキサジオール(3−O−beta−D‐glucopyranosyl−20(S)−protopanaxadiol)
(4)ジンセノサイドF2:3−O−(ベータ−D‐グルコピラノシー)−20−O−(ベータ−D‐グルコピラノシル)−20(S)プロトパナキサジオール(3−O−(beta−D‐glucopyranosy)−20−O−(beta−D‐glucopyranosyl)−20(S)protopanaxadiol)
(5)ジンセノサイドRb1:3−O−[(ベータ−D‐グルコピラノシー)(1,2)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20−O−[(ベータ−D‐グルコピラノシル)(1,6)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20(S)プロトパナキサジオール(3−O−[(beta−D‐glucopyranosy)(1,2)−beta−D‐glucopyranosyl]−20−O−[(beta−D‐glucopyranosyl)(1,6)−beta−D‐glucopyranosyl]−20(S)protopanaxadiol)
(6)ジンセノサイドRb2:3−O−[(ベータ−D‐グルコピラノシー)(1,2)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20−O−[(アルファ−L‐アラビノピラノシル)(1,6)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20(S)プロトパナキサジオール(3−O−[(beta−D‐glucopyranosy)(1,2)−beta−D‐glucopyranosyl]−20−O−[(alpha−L‐arabinopyranosyl)(1,6)−beta−D‐glucopyranosyl]−20(S)protopanaxadiol)
(7)ジンセノサイドRc:3−O−[(ベータ−D‐グルコピラノシー)(1,2)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20−O−[(アルファ−L‐アラビノフラノシル)(1,6)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20(S)プロトパナキサジオール(3−O−[(beta−D‐glucopyranosy)(1,2)−beta−D‐glucopyranosyl]−20−O−[(alpha−L‐arabinofuranosyl)(1,6)−beta−D‐glucopyranosyl]−20(S)protopanaxadiol)
(8)ジンセノサイドRb3:3−O−[(ベータ−D‐グルコピラノシー)(1,2)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20−O−[(ベータ−D‐キシロピラノシル)(1,6)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20(S)プロトパナキサジオール(3−O−[(beta−D‐glucopyranosy)(1,2)−beta−D‐glucopyranosyl]−20−O−[(beta−D‐xylopyranosyl)(1,6)−beta−D‐glucopyranosyl]−20(S)protopanaxadiol)
(9)ジンセノサイドF1:20−O−ベータ−D‐グルコピラノシル−20(S)−プロトパナキサジオール(20−O−beta−D‐glucopyranosyl−20(S)−protopanaxadiol)
(10)ジンセノサイドRe:6−O−[アルファ−L‐ラムノピラノシル(1,2)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20−O−(ベータ−D‐グルコピラノシル)−20(S)−プロトパナキサトリオール(6−O−[(alpha−L‐rhamnopyranosyl)(1,2)−beta−D‐glucopyranosyl]−20−O−(beta−D‐glucopyranosyl)−20(S)−protopanaxatriol)
(11)ダイズイン(daidzin):ダイゼイン7−O−ベータ−D‐グルコシド(daidzein 7−O−beta−D‐glucoside)
(12)PPD(S):20(S)−プロトパナキサジオール(20(S)−protopanaxadiol)
(13)コンパウンドY:20−O−[(アルファ−L‐アラビノピラノシル)(1,6)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20(S)プロトパナキサジオール(20−O−[(alpha−L‐arabinopyranosyl)(1,6)−beta−D‐glucopyranosyl]−20(S)protopanaxadiol)
(14)コンパウンドMc:20−O−[(アルファ−L‐アラビノフラノシル)(1,6)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20(S)プロトパナキサジオール(20−O−[(alpha−L‐arabinofuranosyl)(1,6)−beta−D‐glucopyranosyl]−20(S)protopanaxadiol)
(15)コンパウンドMx:20−O−[(ベータ−D‐キシロピラノシル)(1,6)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20(S)プロトパナキサジオール(20−O−[(beta−D‐xylopyranosyl)(1,6)−beta−D‐glucopyranosyl]−20(S)protopanaxadiol)
(16)PPT(S):20(S)−プロトパナキサトリオール(20(S)−protopanaxatriol)
(17)ジンセノサイドRg2:6−O−[アルファ−L‐ラムノピラノシル(1,2)−ベータ−D‐グルコピラノシル]−20(S)−プロトパナキサトリオール(6−O−[(alpha−L‐rhamnopyranosyl)(1,2)−beta−D‐glucopyranosyl]−20(S)−protopanaxatriol)
(18)ダイゼイン(Daidzein):7−ヒドロキシ−3−(4−ヒドロキシフェニル)クロモン−4−オン(7−hydroxy−3−(4−hydroxyphenyl)chromen−4−one)
(19)イカリイン(Icariin):3,4´,5,7−Tetrahydroxy−8−prenylflavone−4´−Me ether−3−O−alpha−L‐rhamnopyranoside, 7−O−beta−D‐glucopyranoside
(20)カメリアシドA(Camelliaside A):ケンフェロール3−O−(2−O−ガラクトピラノシル−6−O−ラムノピラノシル)グルコピラノシド(Kaempferol 3−O−(2−O−galactopyranoyl−6−O−rhamnopyranosyl)glucopyranoside)
(21)カメリアシドB(Camelliaside B):ケンフェロール3−O−(2−O−キシロピラノシル−6−O−ラムノピラノシル)グルコピラノシド(Kaempferol 3−O−(2−O−xylopyranosyl− 6−O−rhamnopyranosyl)glucopyranoside)
(22)グリコン(Glycone):配糖体に結合された多様な糖分子
(23)全細胞反応:細胞を破砕したり、酵素を分離精製したりすることなく、完全な細胞全体を利用した反応
(24)酸化還元酵素:生体に必要なエネルギーを供給するために酸化還元反応を触媒する酵素。有機化合物の酸化は、大部分が脱水素によって起こる。
(25)酸化還元酵素抽出物:酸化還元酵素が含まれたリゾビウムsp.GIN611又は酸化還元酵素を発現する組換えタンパク質の細胞を破砕して得た細胞抽出液
(22)MALDI−TOF質量分析器:Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化)−Time of flight
(26)HPLC:高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography)
(27)PCR:ポリメラーゼ連鎖反応−DNAのある領域を特異的に増幅させる方法
(28)ORF:オープンリーディングフレーム(Open Reading Frame)、initiation codonからstop codonまでの配列をいう
(29)クローニング:DNA切片を組換えDNAクローニングベクターに混入させ、こうした組換えDNAを使用する宿主細胞を形質転換させる方法
(30)bp:塩基対
本発明は、土壌微生物の選別のために、本発明者らが下記表2の組成成分からなるジンセノサイドの混合物を炭素源として含む最小培地を構成し、これを利用して土壌からジンセノサイドCKに活性を有する酵素を含む微生物を選別した。下記表2は、ジンセノサイド混合物を炭素源とした最小培地成分である。
前記収得した微生物又は生産された糖分解酵素抽出物、ジンセノサイドCKにより構成された反応液から無糖体PPD(S)を生産する。本発明の微生物又は生産された酵素抽出物を生触媒として反応液に添加して、反応を開始する。
土壌試料10gを、Phosphate Buffered Saline(PBS)50mLに添加して、常温で2時間攪拌した。混濁液を、濾過紙を利用して浮遊物を濾過した後、濾過された微生物溶液を前記表2の最小培地10mLに0.2mL添加し、30℃で3日間培養する過程を3回繰り返した後、培養液0.2mLを前記液体最小培地と1.5%寒天により構成される固体最小培地に塗抹して、30℃で24時間培養し、それぞれの微生物を液体最小培地に3mLずつ培養して反応させ、ジンセノサイドCKに活性の高いコロニーを同定した結果、リゾビウム種と命名した。
酵母抽出物(5g/L)、ペプトン(10g/L)、塩化ナトリウム(10g/L)により構成され培地(以下、完全培地)に培養された細胞をPBS緩衝溶液(pH7.0)で3回洗浄して、回収された細胞外部の培地成分を除去した。回収された細胞を、細胞の5倍の体積の20mMリン酸緩衝溶液、1mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)、1mM phenylmethanesulfonylfluoride(PMSF)、1mM Dithiothretiol(DTT)により構成された緩衝溶液(以下、破砕溶液)に混濁した後、超音波破砕機を利用して細胞を破砕した後、13,000rpmで30分間遠心分離した後、上澄み液を回収して最終的な糖分解酵素抽出物を生産した。
表2に提示した液体最小培地(以下、M9/ジンセノサイド培地)を利用して培養された細胞を、PBS緩衝溶液で3回洗浄して、回収された細胞外部の培地成分を除去した。回収された細胞を、5倍の体積の破砕溶液に混濁した後、超音波破砕機を利用して細胞を破砕した後、13,000rpmで30分間遠心分離した後、上澄み液を回収して、最小培地で発現誘導された糖分解酵素を含む細胞抽出物を生産した。
前述した実施例2と実施例3において生産された細胞抽出物のタンパク質量を定量した後、同一の量のタンパク質を使用してジンセノサイドCKに対する反応性を比較した。比較した結果、実施例3において生産された細胞抽出物が、実施例2において生産された細胞抽出物に比べて高い反応性が示されることを確認することができた。これを図7に示した。同一の量のタンパク質を使用して反応を送った後、各タンパク質の量に応じて反応性を比較した。結果から見られるところのように、実施例2の完全培地で培養されたセルから製造されたタンパク質の場合、500以上のタンパク質使用時にジンセノサイドCKが完全にPPD(S)に変換されるのに対し、実施例3のM9/ジンセノサイド培地に培養されたセルから製造されたタンパク質は、100以上においてジンセノサイドCKがPPD(S)に変換されることを見ることができた。また、2つの抽出物のタンパク質発現の差を、SDS−PAGE(sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide gel electrophoresis)により比較して、図6に示した。図6において、矢印で表示されたものは、実施例2と実施例3における酵素抽出物のタンパク質発現の程度を比較したときに発現量が異なるタンパク質を示したものである。
新規リゾビウムsp.GIN611から図3に示した反応を遂行する酵素を精製するために、10Lジンセノサイドを添加した表2の液体最小培地を利用して微生物を培養した。培養した微生物を、実施例2と同様の方法で酵素抽出物を製造した。製造された酵素抽出物を、60〜70%飽和されたアンモニウムサルフェート沈殿分画法を通じて準備した。準備されたタンパク質を、FPLC及び複数のカラムを利用して分離精製した。分離精製されたタンパク質は、最終的に、Native‐gelを利用して最終反応性を確認した。
実施例5において精製された酵素を利用して、ジンセノサイドCKに対する活性を調査した。約100μgの酵素液と、0.1mMのCK、50mMのリン酸緩衝溶液(pH6.5)を利用して反応体積と同一の量のエチルアセテートを添加後に反応を終了させた後、これをHPLCを利用して分析した。分析に使用した条件は、80%アセトニトリル(ACN)等溶離として利用した。結果は、図4に示し、三角印で表示したピークはPPD(S)に該当し、星印で表示したピークは酸化されたCKを示したものであり、時間の経過につれて、酸化されたCKは増加した後に減少し、PPD(S)は継続的に増加することを知ることができた。したがって、新規発見された酵素により、ジンセノサイドCKの酸化過程を経て糖が分解されるということを知ることができた。これを図10に示した。
実施例5において分離精製して得られた酸化還元酵素のN‐末端アミノ酸の配列は、12%SDS‐PAGE電気泳動後に節をPVDF膜に移した後(バイオラッド)、エドマン分析手法を利用するprocise 491 sequencer(アプライドバイオシステムズ、カリフ)を利用して決定した。内部ペプチドの配列決定は、配列決定用トリプシン(プロメガ)により処理した後、得られたペプチド断片の配列をLTQ‐orbitrap質量分析計を利用して分析した後、PEAKSプログラムを利用して配列を決定した。
完全培地に培養された細胞を、4℃、4,000rpmで10分遠心分離して細胞を沈殿させた。上層液を除去し、細胞を10mLのlysis緩衝溶液(15%スクロース、25mM EDTA、25mM Tris緩衝溶液)に溶かした後、1.2mL EDTA(0.5M)と0.13mL pronaseを添加後、37℃で10分間放置した。その後、10%SDS 1mLを入れ、70℃で10分間放置後、氷水に10分間放置した。その後、5M酢酸カリウム2.5mLを入れ、氷水に15分間反応させた。前記溶液の量と同一の量のフェノール−クロロホルム混合物(50:50)を入れ、30分混合した後、4℃、4,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄み液を獲得した。得られた溶液の0.5倍に達するクロロホルムを加え、徐々に混合した後、4℃、4,000rpmで10分間遠心分離し、上澄み液を獲得した後、50/mLの量に達するようにRNase処理後、37℃で1時間反応させた。その後、0.8倍に達するイソプロパノールを添加後、2.5倍に達する80%エタノールを添加し、徐々に揺らした後、パスツールピペットを利用して全細胞DNAを収集して、1.5mLマイクロチューブに移した後、乾燥させた後に滅菌水に溶かして使用した。
実施例7を経て得られたN‐末端アミノ酸配列と内部配列からプライマーを作製した後、実施例8の過程を経て分離されたゲノムDNAを鋳型として利用して、酸化還元酵素の部分DNA断片を得た。得られたDNA断片に特異的に付くプライマーを作製し、逆転写(Inverse)PCR法を利用して残りの配列を取得し。Inverse PCRに使用された鋳型は、ゲノムDNA断片をHind III制限酵素で切断した後、リガーゼを処理してセルフライゲーションがなされたDNAライブラリを使用した。
得られた酸化還元酵素の遺伝子配列は、それぞれBamHI/SalI制限酵素で消化して、その分画をそれぞれpETDuet‐1(Novagen)にライゲーションして組換えプラスミドを生成し、発現用大腸菌であるRosetta‐gami2(DE3)に形質転換させた。得られた形質転換大腸菌は、アンピシリンを含有した培地において培養し、細胞懸濁度が0.3〜0.7となったときにIPTGを付加し、20℃で15時間をさらに培養することにより、酵素の発現を誘導した。
アグロバクテリウム(Agrobacterium)sp.、スフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium)sp.又はステノトロフォモナーゼ(Stenotrophomonase)sp.由来の、配列番号3と60%以上のアミノ酸類似度がある酵素をクローニングして、ジンセノサイドに対するグルコース分解反応性を調査した。各微生物由来の酵素は、ジンセノサイドのグルコース残基に、酸化反応を通じて糖分解することを確認した。
実施例11において発現が誘導された酵素を、実施例2の酵素製造方法で製造した後、ジンセノサイドCKを基質として、無糖体生産活性を測定した。
ジンセノサイドRh2、ジンセノサイドF2、ジンセノサイドRb1、ジンセノサイドRb2、ジンセノサイドRc、ジンセノサイドRb3、ジンセノサイドF1、ジンセノサイドRe、及びイソフラボン系ダイズイン(daidzin)を基質として、前記反応方法に従って反応させた後、同一の量のエチルアセテートを添加して抽出した後、エチルアセテート層を乾燥させた後、エタノールに再び溶かした後、マルディ質量分析器を利用して活性を測定した。
リゾビウムsp.GIN611由来の酸化還元酵素から発現が誘導された酵素を、フラボノイド系イカリイン(Icarlin)、カメリアシドA(Camelliaside A)、カメリアシドB(Camelliaside B)を基質として、前記反応方法に従って反応させた後、マルディ質量分析器を利用して活性を測定した結果、カメリアシドAに付いているガラクトース(galactose)の酸化反応及び糖分解活性を確認した。また、カメリアシドBに付いているキシロース(Xylose)の酸化反応及び糖分解活性を確認した。すなわち、フラボノイド系の無糖体構造に結合された糖に対する糖分解活性を示し、グルコース以外に、ガラクトース、キシロースを酸化させた後、糖を分解する機能があることを確認した(図12及び図13)。
4−ニトロフェニルアルファ−D‐グルコピラノシド(4−Nitrophenyl α−D‐glucopyranoside)、4−ニトロフェニルベータ−D‐グルコピラノシド(4−Nitrophenyl β−D‐glucopyranoside)、4−ニトロフェニルアルファ−D‐ガラクトピラノシド(4−Nitrophenyl α−D‐galactopyranoside)、4−ニトロフェニルベータ−D‐ガラクトピラノシド(4−Nitrophenyl β−D‐galactopyranoside)を利用して、アルファ結合及びベータ結合に対する酵素の特異性を調査した結果、アルファとベータともに活性があることを確認した(表3)。
Claims (28)
- 新規リゾビウムsp.GIN611(Rhizobium sp.GIN611)KCTC11708BP。
- 請求項1に記載のリゾビウムsp.GIN611の細胞抽出物。
- 請求項1に記載のリゾビウムsp.GIN611又は請求項2に記載の細胞抽出物を生触媒として使用する天然物の糖分解方法。
- 前記天然物は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体であることを特徴とする、請求項3に記載の天然物の糖分解方法。
- 前記天然物は、ジンセノサイドコンパウンドK(CK)、ジンセノサイドRh2、ジンセノサイドF2、ジンセノサイドRb1、ジンセノサイドRb2、ジンセノサイドRc、ジンセノサイドRb3、ジンセノサイドF1、ジンセノサイドRe、ダイズイン、イカリイン、カメリアシドA及びカメリアシドBからなる群より選択されることを特徴とする、請求項3に記載の天然物の糖分解方法。
- 前記糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース及びキシロースからなる群より選択されるものであり、前記糖を酸化させて分解することを特徴とする、請求項3に記載の天然物の糖分解方法。
- 前記グルコースは、グルコース残基の3位ヒドロキシ基(OH)を酸化させて分解することを特徴とする、請求項6に記載の天然物の糖分解方法。
- 請求項1に記載のリゾビウムsp.GIN611又は請求項2に記載の細胞抽出物を生触媒として使用して、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体から、ジンセノサイド無糖体、イソフラボン無糖体又はフラボノイド無糖体を生産する方法。
- 配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素。
- 請求項9に記載の酸化還元酵素を含む細胞抽出物。
- 請求項9に記載の酸化還元酵素をコード化するDNA。
- 配列番号2の配列からなる、請求項11に記載のDNA。
- 請求項11又は12に記載のDNAを含む組換えDNAベクター。
- 請求項13に記載の組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項14に記載の宿主細胞を含む細胞抽出物。
- 配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、天然物の糖分解活性を有する酸化還元酵素。
- 前記天然物は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体であることを特徴とする、請求項16に記載の酸化還元酵素。
- 前記天然物は、ジンセノサイドコンパウンドK(CK)、ジンセノサイドRh2、ジンセノサイドF2、ジンセノサイドRb1、ジンセノサイドRb2、ジンセノサイドRc、ジンセノサイドRb3、ジンセノサイドF1、ジンセノサイドRe、ダイズイン、イカリイン、カメリアシドA及びカメリアシドBからなる群より選択されることを特徴とする、請求項16に記載の酸化還元酵素。
- 前記糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース及びキシロースからなる群より選択されるものであり、前記糖を酸化させて分解することを特徴とする、請求項16に記載の酸化還元酵素。
- 前記酸化還元酵素は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体から、ジンセノサイド無糖体、イソフラボン無糖体又はフラボノイド無糖体を生産することを特徴とする、請求項16に記載の酸化還元酵素。
- 前記酸化還元酵素は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)sp.、スフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium)sp.又はステノトロフォモナーゼ(Stenotrophomonase)sp.から由来することを特徴とする、請求項16に記載の酸化還元酵素。
- 請求項16に記載の酸化還元酵素を含む細胞抽出物。
- 天然物の糖分解方法であって、
配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素、配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号2の配列からなるDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号2の配列からなるDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素、及び配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素の細胞抽出物からなる群より選択される生触媒を使用する天然物の糖分解方法。 - 前記天然物は、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体であることを特徴とする、請求項23に記載の天然物の糖分解方法。
- 前記天然物は、ジンセノサイドコンパウンドK(CK)、ジンセノサイドRh2、ジンセノサイドF2、ジンセノサイドRb1、ジンセノサイドRb2、ジンセノサイドRc、ジンセノサイドRb3、ジンセノサイドF1、ジンセノサイドRe、ダイズイン、イカリイン、カメリアシドA及びカメリアシドBからなる群より選択されることを特徴とする、請求項23に記載の天然物の糖分解方法。
- 前記糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース又はキシロースであり、前記糖を酸化させて分解することを特徴とする、請求項23に記載の天然物の糖分解方法。
- 無糖体を生産する方法であって、
配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素、配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号2の配列からなるDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号2の配列からなるDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞、配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素、及び配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素の細胞抽出物からなる群から選択される生触媒を使用して、ジンセノサイド配糖体、イソフラボン配糖体又はフラボノイド配糖体から、ジンセノサイド無糖体、イソフラボン無糖体又はフラボノイド無糖体を生産する方法。 - 細胞抽出物の製造方法であって、
リゾビウムsp.GIN611の細胞抽出物、配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素を含む細胞抽出物、配列番号3のアミノ酸配列からなる酸化還元酵素をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号2の配列からなるDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有するタンパク質をコード化するDNAを含む組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を含む細胞抽出物、又は配列番号3の配列と60%以上相同性を有し、糖分解活性を有する酸化還元酵素を含む細胞抽出物を製造する方法であり、ジンセノサイドを添加して酵素発現を誘導することを特徴とする細胞抽出物の製造方法。
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