CN103237884B - 新的土壤微生物、从所述土壤微生物分离的新氧化还原酶、编码所述氧化还原酶的基因和使用所述微生物、氧化还原酶和基因产生糖苷配基的方法 - Google Patents

新的土壤微生物、从所述土壤微生物分离的新氧化还原酶、编码所述氧化还原酶的基因和使用所述微生物、氧化还原酶和基因产生糖苷配基的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新的根瘤菌GIN611KCTC11708BP或其细胞提取物，显示糖酵解活性的新氧化还原酶，编码所述氧化还原酶的基因，包括重组载体蛋白的重组菌株，或编码重组蛋白的表达载体，以及使用上述物质作为生物催化剂将天然产物糖酵解的方法。本发明还涉及一种使用上述物质从各种天然产物产生糖苷配基的方法。从本发明新的微生物分离的新氧化还原酶不属于葡糖苷酶类，但属于氧化还原酶类，并具有针对天然产物的糖酵解活性。新的氧化还原酶氧化天然产物糖苷配基中的糖，从而产生各种糖苷配基。

Description

新的土壤微生物、从所述土壤微生物分离的新氧化还原酶、编码所述氧化还原酶的基因和使用所述微生物、氧化还原酶和基因产生糖苷配基的方法
技术领域
本文内容涉及一种从土壤分离的新的微生物，从所述微生物分离的氧化还原酶，以及利用上述物质将各种植物糖苷去糖基化并产生各种糖苷配基的方法。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种草药，在亚洲国家包括朝鲜、中国和日本其通常用于多种疾病的治疗和预防。人参皂苷是人参的主要活性成分，已知具有多种生理活性，包括在中枢神经***、心血管***和免疫***中的抗衰老活性、抗炎活性、抗氧化活性、抗糖尿病活性和抗肿瘤活性。
迄今为止，已经分离并鉴定出超过40种人参皂苷。人参皂苷(其是具有包括糖苷配基的达玛烷结构的糖苷)大致上可以分为原人参萜二醇和原人参萜三醇。属于原人参萜二醇类的人参皂苷主要是Rb1、Rb2、Rc和Rd，属于原人参萜三醇类的人参皂苷主要是Re和Rg1(参见图1和图2)。
吸收后，人参皂苷通过肠道微生物代谢，已知代谢产物具有多种生理活性。例如，典型的基于原人参萜二醇的皂苷Rb1、Rb2和Rc被人肠道微生物代谢为CK，基于原人参萜三醇的皂苷Re和Rg1被肠道微生物代谢为Rh1或F1，进而显示多种生理活性。已知CK诱导预防肿瘤侵袭和形成的抗转移或抗癌功效。并且，据报道与糖附着的对应物Rh2相比，其糖苷配基PPD(S)具有更高的生理活性。
因此，已经研究将人参皂苷转化为具有更少糖的代谢物。除了酶促法之外，已经报道了使用弱酸的水解，使用碱的降解等等。但是，因为这些方法诱导数种副反应诸如差向异构、水合、羟化等等，所以最近研究了使用酶、肠道微生物等等转化为活性人参皂苷的方法。但是，大部分报道的微生物是厌氧肠道微生物，在工业应用中存在限制。此外，因为大部分酶缺乏将人参皂苷转化为糖苷配基的活性并具有它们自己的特异性，它们只适用于特定人参皂苷的生产。
尽管到目前为止已对通过肠道微生物将人参皂苷Rb1的代谢物生物转化为CK进行了大量研究，但对其糖苷配基的产生几乎没有研究。并且，据报道，在皂苷主链上具有一个糖的人参皂苷不再被微生物的酶所降解。已知糖苷配基形式的人参皂苷更容易被吸收入血流并作为活性化合物起作用。此外，作为多种人参皂苷骨架的糖苷配基的产生将为所需人参皂苷类型的特定生产提供基础技术。因此，需要探索参与人参皂苷糖苷配基产生的酶。
发明内容
技术问题
本文内容涉及提供一种新的微生物，从所述微生物分离的显示去糖基化活性的一种新的氧化还原酶和一种使用编码所述氧化还原酶的基因和重组蛋白产生多种人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基的方法。
技术方案
在一个一般方面，提供新的根瘤菌(Rhizobium sp.)GIN611(KCTC11708BP)或其细胞提取物。
在另一个一般方面，提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为生物催化剂将天然产物去糖基化的方法。
在另一个一般方面，提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为生物催化剂从多种糖苷产生糖苷配基的方法。
在另一个一般方面，提供具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶或包括所述氧化还原酶的细胞提取物。
在另一个一般方面，提供编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的DNA，具有SEQ ID NO2序列的DNA，包括具有SEQ ID NO2序列的DNA的重组DNA载体，用包括具有SEQ ID NO2序列的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞或包括用包括具有SEQ ID NO2序列的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物。
在另一个一般方面，提供一种与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶或包括所述氧化还原酶的细胞提取物。
在另一个一般方面，提供一种使用生物催化剂将天然产物去糖基化的方法，所述生物催化剂选自：具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶，包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，用包括DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包含用包括DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用重组DNA载体(其包括具有SEQ ID NO2序列的DNA)转化的宿主细胞，用重组DNA载体(其包括具有SEQ ID NO2序列的DNA)转化的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与SEQID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶，和包括与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。
在另一个一般方面，提供一种使用生物催化剂从多种糖苷产生糖苷配基的方法，所述生物催化剂选自：具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶，包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，用包括DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包括DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用重组DNA载体(其包括具有SEQ ID NO2序列的DNA)转化的宿主细胞，用重组DNA载体(其包括具有SEQ ID NO2序列的DNA)转化的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶，和包括与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。
在另一个一般情况下，提供一种制备以下物质的方法：根瘤菌GIN611的细胞提取物，包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，包括用包括DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，包括用包括DNA(其具有SEQ ID NO2的序列)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，或包括氧化还原酶(其与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性)的细胞提取物，包括通过添加人参皂苷来诱导酶表达。
有益效果
通常，已知人参皂苷去糖基化酶属于葡糖苷酶家族。本发明人发现属于氧化还原酶家族但不属于葡糖苷酶家族的一种酶对人参皂苷具有去糖基化活性。这种新的氧化还原酶在序列上完全不同于先前已知的去糖基化酶，与氧化还原酶家族的酶具有序列相似性，并在天然存在的糖苷中通过氧化糖来诱导自发的去糖基化。
附图描述
图1显示基于原人参萜二醇(PPD)的人参皂苷。
图2显示基于原人参萜三醇(PPT)的人参皂苷。
图3描述了一种反应，其中通过去糖基化从人参皂苷化合物K(CK)产生糖苷配基PPD(S)。
图4显示新的氧化还原酶的活性分析结果。星号代表氧化的CK，三角形代表PPD(S)。色谱图3显示3小时反应的结果，色谱图4显示12小时反应的结果。底物CK的量随着时间减少，其中间物(氧化的CK)增加然后减少，其终产物PPD(S)始终随着时间增加。
图5显示图4中分析的氧化CK的质量分析结果。
图6比较在完全培养基和M9/人参皂苷培养基中表达的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
图7显示比较从在完全培养基和M9/人参皂苷培养基中培养的细胞获得的蛋白反应性的结果。
图8显示利用人参皂苷作为碳源生长的新的土壤微生物根瘤菌GIN611的16S DNA序列。
图9显示由根瘤菌GIN611产生的氧化还原酶的氨基酸序列及编码其的基因序列。
图10显示新的氧化还原酶的反应机理。
图11显示新的氧化还原酶对于多种人参皂苷和异黄酮的反应性分析结果。可以看出所述酶对葡萄糖具有特异反应性。
图12显示测量camelliaside A和camelliaside B混合物的去糖基化活性的结果。
图13显示测量淫羊藿苷去糖基化活性的结果。
最佳方式
本文内容使用的术语是相关领域常用的那些，可以被本领域技术人员容易地理解。简单描述其中一些术语。
(1)人参皂苷：人参的活性成分。
(2)化合物K(CK):20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人参萜二醇。
(3)人参皂苷Rh2:3-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人参萜二醇。
(4)人参皂苷F2:3-O-(β-D-吡喃葡糖基)-20-O-(β-D-吡喃葡糖基)-20(S)原人参萜二醇。
(5)人参皂苷Rb1:3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,2)-β-D-吡喃葡糖基]-20-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。
(6)人参皂苷Rb2:3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,2)-β-D-吡喃葡糖基]-20-O-[(α-L-吡喃***糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。
(7)人参皂苷Rc:3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,2)-β-D-吡喃葡糖基]-20-O-[(α-L-***呋喃糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。
(8)人参皂苷Rb3:3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,2)-β-D-吡喃葡糖基]-20-O-[(β-D-吡喃木糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。
(9)人参皂苷F1:20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人参萜二醇。
(10)人参皂苷Re:6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基(1,2)-β-D-吡喃葡糖基]-20-O-(β-D-吡喃葡糖基)-20(S)-原人参萜三醇。
(11)大豆苷:黄苷元7-O-β-D-糖苷。
(12)PPD(S):20(S)-原人参萜二醇。
(13)化合物Y:20-O-[(α-L-吡喃***糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。
(14)化合物Mc:20-O-[(α-L-***呋喃糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。
(15)化合物Mx:20-O-[(β-D-吡喃木糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。
(16)PPT(S):20(S)-原人参萜三醇。
(17)人参皂苷Rg2:6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基(1,2)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)-原人参萜三醇。
(18)黄苷元:7-羟基-3-(4-羟苯基)色烯-4-酮。
(19)淫羊藿苷:3,4',5,7-四羟基-8-异戊烯基黄酮-4'-Me***-3-O-alpha-L-吡喃鼠李糖苷,7-O-beta-D-吡喃葡糖苷。
(20)Camelliaside A:莰非醇3-O-(2-O-吡喃半乳糖基-6-O-吡喃鼠李糖基)吡喃葡糖苷。
(21)Camelliaside B:莰非醇3-O-(2-O-吡喃木糖基-6-O-吡喃鼠李糖基)吡喃葡糖苷。
(22)甘油栓:粘附到糖苷上的糖分子。
(23)全细胞反应：使用全细胞且不破坏细胞或分离酶的反应。
(24)氧化还原酶：催化为生物体提供能量必需的氧化和还原反应的酶。有机化合物的大部分氧化通过脱氢作用发生。
(25)氧化还原酶提取物：包括通过破坏根瘤菌GIN611的细胞获得的氧化还原酶或表达所述氧化还原酶的重组蛋白的细胞提取物。
(22)MALDI-TOF质谱：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。
(26)HPLC：高效液相层析。
(27)PCR：聚合酶链式反应；一种特异性扩增DNA区域的技术。
(28)ORF：开放读框；在起始密码子和终止密码子之间的序列。
(29)克隆：一种技术，将DNA片段***重组DNA克隆载体并使用获得的重组DNA转化宿主细胞。
(30)bp：碱基对。
本文内容提供新的微生物根瘤菌GIN611或其细胞提取物。本文内容的发明人已经选择出利用多种人参皂苷的混合物作为碳源生长的微生物并证实所述微生物具有利用人参皂苷CK作为底物的反应性。
在一个实施方案中，本文内容提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为生物催化剂将天然产物去糖基化的方法。
天然产物可以是人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷，但不限于此。
在另一个实施方案中，本文内容提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为生物催化剂从糖苷产生各种糖苷配基的方法。
天然产物可以是人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷，但不限于此。
糖苷配基可以是人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基，但不限于此。
人参皂苷糖苷不特别限定，但可以选自例如人参皂苷化合物K(CK)、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1和人参皂苷Re。特别地，其可以是人参皂苷化合物K(CK)。
人参皂苷糖苷配基不特别限定，但可以选自例如人参皂苷PPD(S)、人参皂苷化合物Y、人参皂苷Mc、人参皂苷化合物Mx、人参皂苷PPT(S)和人参皂苷Rg2。特别地，其可以是人参皂苷PPD(S)。
人参皂苷糖苷和人参皂苷糖苷配基概述于表1。
表1
人参皂苷糖苷 人参皂苷糖苷配基
人参皂苷化合物K(CK) 人参皂苷PPD(S)
人参皂苷Rh2 人参皂苷PPD(S)
人参皂苷F2 人参皂苷PPD(S)
人参皂苷Rb1 人参皂苷PPD(S)
人参皂苷Rb2 人参皂苷化合物Y
人参皂苷Rc 人参皂苷Mc
人参皂苷Rb3 人参皂苷化合物Mx
人参皂苷F1 人参皂苷PPT(S)
人参皂苷Re 人参皂苷Rg2
异黄酮糖苷不特别限定，但可以是例如大豆苷。
异黄酮糖苷配基不特别限定，但可以是例如黄苷元。
类黄酮糖苷不特别限定，但可以是例如淫羊藿苷、camelliaside A或camelliaside B。
通过氧化天然产物糖苷的糖来实现去糖基化。例如，如果所述糖是葡萄糖，则通过氧化葡萄糖残基的3-羟基(OH)基团自发发生去糖基化。
糖不特别限定，但可以选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、***糖和木糖。
在另一个实施方案中，本文内容提供一种包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶或包括所述氧化还原酶的细胞提取物。特别地，所述氧化还原酶可以分离自根瘤菌GIN611。
在另一个实施方案中，本文内容提供编码SEQ ID NO3的氨基酸序列的DNA序列或编码所述氧化还原酶的DNA序列。特别地，所述序列是SEQ IDNO2。特别地，所述DNA可以是编码分离自根瘤菌GIN611的氧化还原酶的DNA。
在另一个实施方案中，本文内容提供编码蛋白的DNA，所述蛋白与SEQID NO3的序列具有至少60%、特别地至少90%、更特别地至少97%、此外更特别地至少99%的序列相同性并具有针对天然产物的去糖基化活性。被所述蛋白降解的糖可以选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、***糖和木糖。
在另一个实施方案中，本文内容提供一种重组DNA载体，其包括编码SEQ ID NO3的氨基酸序列的DNA序列，编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的DNA序列或包括SEQ ID NO2的序列的DNA序列。
在另一个实施方案中，本文内容提供用所述重组DNA载体转化的宿主细胞和包括所述宿主细胞的细胞提取物。
在另一个实施方案中，本文内容提供氧化还原酶和包括所述氧化还原酶的细胞提取物，所述氧化还原酶与SEQ ID NO3的序列具有至少60%、特别地至少90%、更特别地至少97%、此外更特别地至少99%的序列相同性并具有针对天然产物的去糖基化活性。
氧化还原酶不特别限定，但可以来源于土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)，鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)或狭长平胞属(Stenotrophomonas sp)。
在另一个实施方案中，本文内容提供一种使用生物催化剂将天然产物去糖基化的方法，所述生物催化剂选自：包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶，包含氧化还原酶（其包括SEQ ID NO3的氨基酸序列）的细胞提取物，用包括DNA（其编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶）的重组DNA载体转化的宿主细胞，包含用包括DNA（其编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶）的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA（其包括SEQ ID NO2的序列）的重组DNA载体转化的宿主细胞，用包括DNA（其包括SEQ ID NO2的序列）的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA（其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白）的重组DNA载体转化的宿主细胞，包含用包括DNA（其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白）的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶，以及包括与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。
在另一个实施方案中，本文内容提供一种使用生物催化剂产生天然产物的各种糖苷配基的方法，所述生物催化剂选自：包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶，包含包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，用包括DNA（其编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶）的重组DNA载体转化的宿主细胞，包含用包括DNA（其编码包括SEQID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶）的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA（其包括SEQ ID NO2的序列）的重组DNA载体转化的宿主细胞，用包括DNA（其包括SEQ ID NO2的序列）的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA（其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白）的重组DNA载体转化的宿主细胞，包含用包括DNA（其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白）的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶，以及包含与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。特别地，所述方法是利用生物催化剂从各种糖苷产生糖苷配基的方法，更特别地是从人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷产生人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基的方法。
在另一个实施方案中，本文内容提供一种制备以下物质的方法：根瘤菌GIN611的细胞提取物，包含包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，包含用包括DNA(其编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，包含用包括DNA(其包括SEQ ID NO2的序列)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，包含用包括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，或包括与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物，包括通过添加人参皂苷来诱导酶表达。
选择包括对人参皂苷具有去糖基化活性的酶的微生物
本文内容的发明人已经使用包括人参皂苷混合物作为碳源的基本培养基，从土壤中选择出包括酶(具有针对人参皂苷CK的活性)的土壤微生物，如表2所述。表2显示包括人参皂苷混合物作为碳源的基本培养基的组成。
表2
利用基本培养基选择微生物的方法是基于生长速率的简单方法。在培养期间，具有低去糖基化活性的微生物被自发去除，只剩余包括高活性酶的微生物。
因此选择的微生物是新的。本发明人基于编码16S rRNA序列的特征性DNA序列鉴定出其属于根瘤菌属，将其命名为根瘤菌GIN611。在2010年6月4日将所述微生物(KCTC11708BP)保藏于韩国典型菌种保藏中心(KCTC)。
使用从选择的根瘤菌GIN611分离出的去糖基化酶的底物特异性研究显示所述微生物显示对人参皂苷CK的高活性并对其他各种人参皂苷具有去糖基化活性。本文内容的发明人破坏和离心微生物，从上清产生包括所述活性酶的细胞提取物。
利用去糖基化酶提取物作为生物催化剂产生人参皂苷糖苷配基
从包括微生物或去糖基化酶提取物和人参皂苷CK的反应溶液产生糖苷配基PPD(S)。通过向反应溶液中添加所述微生物或酶提取物作为生物催化剂来起始相关反应。
除了人参皂苷CK之外，基于PPD的人参皂苷如人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷F2和人参皂苷Rh2可以用作底物。作为基于PPT的人参皂苷，可以使用人参皂苷Re或人参皂苷F1。此外，可以使用异黄酮大豆苷和类黄酮淫羊藿苷、camelliaside A或camelliaside B。
下文中，通过实施例进一步详细描述本文内容。实施例只用于说明目的。本领域普通技术人员将理解其不是试图限制本文内容的范围。
实施例1)根瘤菌GIN611的选择
将土样(10g)添加到磷酸盐缓冲盐水(PBS;50mL)并在室温下搅拌2小时。将获得的混浊混合物通过滤纸以去除悬浮物。将过滤的微生物溶液(0.2mL)添加到表2描述的基本培养基(10mL)并在30℃温育3天。在重复该过程3次后，将培养液(0.2mL)转移到由液体基本培养基和1.5%琼脂组成的固体基本培养基并在30℃温育24小时。在将各3mL的微生物在液体基本培养基中分别温育和反应后，对人参皂苷CK显示高活性的菌落被鉴定为根瘤菌属。
实施例2)去糖基化酶提取物的制备
将在培养基(下文中，完全培养基)(由酵母提取物(5g/L)，蛋白胨(10g/L)和氯化钠(10g/L)组成)中培养的细胞用PBS缓冲液(pH7.0)洗涤3次，去除细胞以外的培养基组分。将回收的细胞悬浮于5细胞体积等量的缓冲液(下文中，裂解缓冲液)，所述缓冲液由5细胞体积等量的20mM磷酸盐缓冲液、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和1mM二硫苏糖醇(DTT)组成。在使用超声匀浆器破坏细胞、然后在13,000rpm离心30分钟后，回收上清液，获得去糖基化酶提取物。
实施例3)通过添加人参皂苷诱导去糖基化酶表达
将使用表2所述液体基本培养基(下文中，M9/人参皂苷培养基)培养的细胞用PBS缓冲液洗涤3次，去除细胞以外的培养基组分。将回收的细胞悬浮于裂解缓冲液。在使用超声匀浆器破坏细胞、然后在13,000rpm离心30分钟后，回收上清液，获得包括去糖基化酶(其在基本培养基中被诱导表达)的细胞提取物。
实施例4)在完全培养基和M9/人参皂苷培养基中制备的蛋白的反应性 和表达水平的比较
将实施例2和实施例3中制备的细胞提取物的蛋白定量后，使用相同量的蛋白比较对于人参皂苷CK的反应性。结果显示，实施例3制备的细胞提取物比实施例2制备的细胞提取物显示更高的反应性(见图7)。使用相同量的蛋白反应后，根据每单位蛋白量比较活性。尽管当使用500或更多的蛋白时从完全培养基培养的细胞获得的蛋白(实施例2)造成人参皂苷CK到PPD(S)的完全转化，但是当使用100或更多的蛋白时，从M9/人参皂苷培养基培养的细胞获得的蛋白造成人参皂苷CK到PPD(S)的转化。此外，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)比较两种提取物中蛋白的表达水平。结果显示于图6。在图6中，箭头指示在实施例2和实施例3的酶提取物中其表达水平不同的蛋白。
实施例5)去糖基化酶的分离和纯化
为了从新的根瘤菌GIN611分离催化图3所示反应的酶，在添加人参皂苷(10L)后在表2所述的液体基本培养基中培养微生物。然后，按照实施例2所述的相同方式从培养的微生物制备酶提取物。将制备的酶提取物用于60-70%饱和硫酸铵分级分离。然后使用数根柱通过快速蛋白液相层析(FPLC)将获得的蛋白进行分离和纯化。通过天然凝胶电泳研究纯化蛋白的反应性。
实施例6)纯化酶对人参皂苷CK的活性
研究了实施例5中纯化的酶对人参皂苷CK的活性。使用约100μg酶溶液、0.1mM CK和50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)并添加与该溶液相同体积的醋酸乙酯进行反应。在反应完成后，通过使用80%乙腈(ACN)的等度洗脱进行HPLC分析。结果显示于图4。在图中，三角形指示的峰是PPD(S)的，星号指示的峰是氧化的CK的。可以看到氧化的CK的量增加，然后随时间减少，而PPD(S)的量始终增加。这表明通过人参皂苷CK的氧化，新的酶降解糖。反应机理显示于图10。
实施例7)新的酶的N端和内部肽序列的确定
在进行12%SDS-PAGE电泳、将片段转移到PVDF膜(Bio-Rad)后，利用Edman分析技术，使用Procise491测序仪(Applied Biosystems,CA)通过Edman测序确定实施例5中纯化的氧化还原酶的N端氨基酸序列。使用LTQ-Orbitrap质谱分析仪在分析经用于测序的胰蛋白酶(Promega)处理获得的肽片段的序列后，使用PEAKS软件确定内部肽的序列。
实施例8)从根瘤菌GIN611分离总DNA
将在完全培养基中培养的细胞在4℃和4,000rpm离心10分钟并沉淀。在去除上清液后，将剩余细胞在10mL裂解缓冲液(15%蔗糖，25mM EDTA，25mM Tris缓冲液)中裂解并在添加1.2mL EDTA(0.5M)和0.13mL Pronase后在37℃静置10分钟。然后，在添加10%SDS(1mL)后，将混合物在70℃放置10分钟，然后在冰水中放置10分钟。随后，在添加5M醋酸钾(2.5mL)后在冰水中进行反应15分钟。向反应溶液添加相同体积的苯酚/氯仿混合物(50:50)并混合30分钟后，在4℃和4,000rpm进行离心10分钟，获得上清液。向所得溶液添加0.5体积等量的氯仿并缓慢混合后，在4℃和4,000rpm进行离心10分钟并获得上清液。然后，用直至50/mL的RNase处理、继之以37℃温育1小时后，添加0.8体积等量的异丙醇，然后添加2.5体积等量的80%乙醇。在温和振荡后，使用Pasteur移液管收集总DNA，转移到1.5mL微管，干燥，然后溶于无菌水用于进一步使用。
实施例9)通过PCR对去糖基化酶的基因测序
使用实施例7确定的N端氨基酸序列和内部序列制备引物后，使用实施例8获得的基因组DNA作为模板获得氧化还原酶的DNA片段。制备与所获DNA片段特异性结合的引物并通过反向PCR确定剩余序列。利用Hind III限制性酶通过切割基因组DNA片段然后用连接酶处理获得的自连接DNA被用作反向PCR的模板。
实施例10)转化的大肠杆菌中的重组表达载体和表达
利用BamHI/SalI限制性酶将所获氧化还原酶的DNA序列消化，将得到的片段连接入pETDuet-1(Novagen)以制备重组质粒，然后其被转化大肠杆菌以表达(Rosetta-gami2;DE3)。在含氨苄青霉素的培养基中培养转化的大肠杆菌。当光密度达到0.3-0.7时，添加IPTG，通过在20℃进一步温育15小时诱导酶的表达。
实施例11)与SEQ ID NO3的新酶具有至少65%序列相似性的3种酶对源 于天然产物的人参皂苷和糖苷的去糖基化反应性
将来源于土壤杆菌属、鞘氨醇杆菌属或狭长平胞属并与SEQ ID NO3具有至少60%氨基酸序列相似性的酶克隆，研究它们对人参皂苷的葡萄糖的去糖基化反应性。来源于所述微生物的酶被证实通过氧化降解人参皂苷的葡萄糖残基。
实施例12)使用表达诱导的酶测量糖苷配基产生活性
在按照实施例2描述的方法制备酶(其表达在实施例11中被诱导)后，使用人参皂苷CK作为底物测量糖苷配基产生活性。
实施例13)使用各种人参皂苷和异黄酮作为底物测量活性
在使用人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Re或异黄酮大豆苷作为底物进行反应、然后通过添加相同体积的醋酸乙酯进行提取后，干燥醋酸乙酯层，然后再次溶于乙醇，其被用于通过MALDI质谱的活性测量。
实施例14)测量对不同糖苷配基结构的去糖基化活性和对甘油栓底物的 特异性
来源于根瘤菌GIN611的氧化还原酶(其表达被诱导)以如上述方式与作为底物的类黄酮淫羊藿苷、camelliaside A或camelliaside B反应并通过MALDI质谱来测量活性。鉴定附着到camelliaside A的半乳糖的氧化及其去糖基化活性。还鉴定附着到camelliaside B的木糖的氧化及其去糖基化活性。即，证实酶显示对附着到基于类黄酮的糖苷配基的糖的去糖基化活性并且通过氧化它们不仅能够降解葡萄糖而且能够降解半乳糖和木糖(参见图12和13)。
实施例15)对甘油栓结合的底物特异性
利用4-硝基苯基α-D-吡喃葡糖苷、4-硝基苯基β-D-吡喃葡糖苷、4-硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷和p-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷研究了酶对α-键合和β-键合的特异性。酶显示针对α-键合和β-键合二者的活性(参见表3)。
表3
底物 相对活性(%)
p-硝基苯基α-D-吡喃葡糖苷 103
p-硝基苯基β-D-吡喃葡糖苷 100
p-硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷 201
p-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷 400
[登录号]
KCTC11708BP
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
国际表格
原始保藏的接受
按照细则7.1
致：KIM,Byung-Gee
Seoul National University
599Gwanak-ko，Gwanak-gu，Seoul151-742
Republic of Korea
表格BP/4b（KCTC表格17）
新的土壤微生物、从所述土壤微生物分离的新氧化还原酶、编码所述氧化还原酶的基因和使用所述微生物、氧化还原酶和基因产生糖苷配基的方法
<130>OF11P234/PCT
<150>KR10/055988
<151>2010-06-14
<150>KR10/066307
<151>2010-07-09
<160>3
<170>KopatentIn1.71
<210>1
<211>971
<212>DNA
<213>根瘤菌GIN611
<400>1
gaatgcgagc ttaccatgca gtcgagcgcc ccgcaagggg agcggcagac gggtgagtaa60
cgcgtgggaa tctaccgagc cctgcggaat agctccggga aactggaatt aataccgcat120
acgccctacg ggggaaagat ttatcggggt ttgatgagcc cgcgttggat tagctagttg180
gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc catagctggt ctgagaggat gatcagccac240
attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa300
tgggcgcaag cctgatccag ccatgccgcg tgagtgatga aggccctagg gttgtaaagc360
tctttcaacg gtgaagataa tgacggtaac cgtagaagaa gccccggcta acttcgtgcc420
agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgttcgga attactgggc gtaaagcgca480
cgtaggcgga tatttaagtc aggggtgaaa tcccggggct caacctcgga actgcctttg540
atactgggta tcttgagtat ggaagaggta agtggaattg cgagtgtaga ggtgaaattc600
gtagatattc gcaggaacac cagtggcgaa ggcggcttac tggtccatta ctgacgctga660
ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga720
tgaatgttag ccgtcgggca gtatactgtt cggtggcgca gctaacgcat taaacattcc780
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gggtatgggc agtggagaca ttgtccttca gttaggctgg ccccagaaca ggtgctgcat960
ggctgtcgtc a971
<210>2
<211>1686
<212>DNA
<213>根瘤菌GIN611
<400>2
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tacattcctc gcttccgcaa catcggcgat gaaaagcgta aatatctgcg tggttttggt1140
tatcagggtt cggcaagccg ctcccgctgg gagcgcgaaa tcgccgagat gaatattgga1200
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ccgacccgag gcagctacgc acccggtatg ggtattcacg aaatgggaac ggcgcgcatg1500
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ctgtaa1686
<210>3
<211>561
<212>PRT
<213>根瘤菌GIN611
<400>3
Met Ala Asn Asn His Tyr Asp Ala Ile Val Val Gly Ser Gly Ile Ser Gly Gly
1                5                  10                   15
Trp Ala Ala Lys Glu Leu Thr Gln Lys Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Glu Arg
     20                  25                  30                  35
Gly Arg Asn Ile Glu His Ile Thr Asp Tyr Gln Asn Ala Asp Lys Glu Ala Trp
             40                  45                  50
Asp Tyr Pro His Arg Asn Arg Ala Thr Gln Glu Met Lys Ala Lys Tyr Pro Val
55                   60                  65                  70
Leu Ser Arg Asp Tyr Leu Leu Glu Glu Ala Thr Leu Gly Met Trp Ala Asp Glu
         75                  80                  85                  90
Gln Glu Thr Pro Tyr Val Glu Glu Lys Arg Phe Asp Trp Phe Arg Gly Tyr His
                 95                 100                 105
Val Gly Gly Arg Ser Leu Leu Trp Gly Arg Gln Thr Tyr Arg Trp Ser Gln Thr
     110                 115                 120                 125
Asp Phe Glu Ala Asn Ala Lys Glu Gly Ile Ala Val Asp Trp Pro Ile Arg Tyr
             130                 135                 140
Gln Asp Val Ala Pro Trp Tyr Asp Tyr Val Glu Arg Phe Ala Gly Ile Ser Gly
145                  150                 155                 160
Ser Lys Glu Gly Leu Asp Ile Leu Pro Asp Gly Glu Phe Leu Pro Pro Ile Pro
        165                 170                 175                 180
Leu Asn Cys Val Glu Glu Asp Val Ala Arg Arg Leu Lys Asp Arg Phe Lys Gly
                185                 190                 195
Thr Arg His Leu Ile Asn Ser Arg Cys Ala Asn Ile Thr Gln Glu Leu Pro Asp
    200                 205                 210                 215
Gln Asp Arg Thr Arg Cys Gln Phe Arg Asn Lys Cys Arg Leu Gly Cys Pro Phe
            220                 225                 230
Gly Gly Tyr Phe Ser Thr Gln Ser Ser Thr Leu Pro Ala Ala Val Ala Thr Gly
235                 240                 245                 250
Asn Leu Thr Leu Arg Pro Phe Ser Ile Val Lys Glu Ile Leu Tyr Asp Lys Asp
        255                 260                 265                 270
Lys Lys Lys Ala Arg Gly Val Glu Ile Ile Asp Ala Glu Thr Asn Met Thr Tyr
                275                 280                 285
Glu Tyr Thr Ala Asp Ile Ile Phe Leu Asn Ala Ser Thr Leu Asn Ser Thr Trp
    290                 295                 300                 305
Val Leu Met Asn Ser Ala Thr Asp Val Trp Glu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Ser
            310                 315                 320
Gly Glu Leu Gly His Asn Val Met Asp His His Phe Arg Met Gly Ala Thr Gly
325                 330                 335                 340
Glu Val Glu Gly Phe Asp Glu Phe Tyr Phe Lys Gly Arg Arg Pro Ala Gly Phe
        345                 350                 355                 360
Tyr Ile Pro Arg Phe Arg Asn Ile Gly Asp Glu Lys Arg Lys Tyr Leu Arg Gly
                365                 370                 375
Phe Gly Tyr Gln Gly Ser Ala Ser Arg Ser Arg Trp Glu Arg Glu Ile Ala Glu
    380                 385                 390                 395
Met Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Lys Asp Ala Leu Thr Glu Pro Gly Gly Trp Thr
            400                 405                 410
Ile Gly Met Thr Ala Phe Gly Glu Met Leu Pro Tyr His Glu Asn Arg Val Lys
415                 420                 425                 430
Leu Asp Gln Asn Lys Lys Asp Lys Trp Gly Leu Pro Val Leu Ser Met Asn Val
        435                 440                 445                 450
Glu Leu Lys Gln Asn Glu Leu Asp Met Arg Glu Asp Met Val Asn Asp Ala Val
                455                 460                 465
Glu Met Phe Glu Ala Val Gly Ile Lys Asn Val Lys Pro Thr Arg Gly Ser Tyr
    470                 475                 480                 485
Ala Pro Gly Met Gly Ile His Glu Met Gly Thr Ala Arg Met Gly Arg Asp Pro
            490                 495                 500
Lys Ser Ser Val Leu Asn Gly Asn Asn Gln Val Trp Asp Ala Pro Asn Val Phe
505                 510                 515                 520
Val Thr Asp Gly Ala Cys Met Thr Ser Ala Ala Cys Val Asn Pro Ser Leu Thr
        525                 530                 535                 540
Tyr Met Ala Leu Thr Ala Arg Ala Ala Asp Phe Ala Val Ser Glu Leu Lys Lys
                545                 550                 555
Gly Asn Leu
    560

Claims (16)

1.根瘤菌(Rhizobium sp.)GIN611，以保藏号KCTC 11708BP保藏于韩国典型菌种保藏中心。
2.权利要求1的根瘤菌GIN611的细胞提取物，其中所述细胞提取物包含由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶。
3.一种利用权利要求1的根瘤菌GIN611或权利要求2的细胞提取物作为生物催化剂将天然产物去糖基化的方法，其中所述根瘤菌GIN611或所述细胞提取物包含由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶，且所述天然产物选自人参皂苷化合物K、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Re、大豆苷、淫羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B，且
其中所述根瘤菌GIN611或所述细胞提取物对人参皂苷化合物K、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Re、大豆苷、淫羊藿苷的葡萄糖去糖基化，对camelliaside A的半乳糖去糖基化，对camelliaside B的木糖去糖基化。
4.权利要求3的将天然产物去糖基化的方法，其中所述糖通过氧化降解。
5.权利要求3的将天然产物去糖基化的方法，其中通过氧化葡萄糖残基的3-羟基基团将葡萄糖降解。
6.一种从人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷产生人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基的方法，所述方法使用权利要求1的根瘤菌GIN611或权利要求2的细胞提取物作为生物催化剂，
其中所述人参皂苷糖苷选自人参皂苷化合物K、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1和人参皂苷Re，且
其中所述异黄酮糖苷是大豆苷，且
其中所述类黄酮糖苷选***羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B。
7.一种氧化还原酶，其由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成。
8.一种细胞提取物，其包括权利要求7的氧化还原酶。
9.一种DNA，其编码权利要求7的氧化还原酶。
10.权利要求9的DNA，其由SEQ ID NO 2的序列组成。
11.一种重组DNA载体，其包含权利要求9或10的DNA。
12.一种用权利要求11的重组DNA载体转化的宿主细胞。
13.一种来自权利要求12的宿主细胞的细胞裂解物的上清液。
14.一种使用生物催化剂将天然产物去糖基化的方法，所述生物催化剂选自：由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶，包括由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶的细胞裂解物上清液，用包含编码由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，来自用包含编码由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞裂解物上清液，用包含由SEQ ID NO 2的序列组成的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，和来自用包含由SEQ ID NO 2的序列组成的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞裂解物上清液，
其中所述天然产物选自人参皂苷化合物K、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Re、大豆苷、淫羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B，且
其中所述生物催化剂对人参皂苷化合物K、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、 人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Re、大豆苷、淫羊藿苷的葡萄糖去糖基化，对camelliaside A的半乳糖去糖基化，对camelliaside B的木糖去糖基化。
15.一种使用生物催化剂从人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷产生人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基的方法，所述生物催化剂选自：由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶，包括由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶的细胞裂解物上清液，用包含编码由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，来自用包含编码由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞裂解物上清液，用包含由SEQ ID NO 2的序列组成的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，和来自包含由SEQ ID NO 2的序列组成的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞裂解物上清液，
其中所述人参皂苷糖苷选自人参皂苷化合物K、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1和人参皂苷Re，且
其中所述异黄酮糖苷是大豆苷，且
其中所述类黄酮糖苷选***羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B。
16.一种制备下列细胞裂解物上清液的方法，包括通过添加人参皂苷来诱导酶表达：根瘤菌GIN611的细胞裂解物上清液，包括由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶的细胞裂解物上清液，来自用包含编码由SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞裂解物上清液，和来自用包含由SEQ ID NO 2的序列组成的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞裂解物上清液。
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