JP2013510564A - 肺癌におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答を予測するための分子バイオマーカー - Google Patents

Abstract

本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異を有する肺癌を患っている患者について、前記患者の試料におけるＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルに基づいて、前記患者のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療に対する応答を予測する方法であって、ＢＲＣＡ１発現レベルが小さいときには患者の陽性反応を示唆しているものとする方法に関する。この陽性反応は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性と通常関連しているＥＧＦＲ遺伝子におけるＴ７９０Ｍ突然変異を示す患者においても観察される。

Description

本発明は、薬理ゲノミクスの分野に関し、より詳細には、肺癌を患っており且つＥＧＦＲ遺伝子に突然変異を有する患者の、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルに基づくＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答を予測する方法に関する。

発明の背景

非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、毎年世界中で１２０万の新しい症例がある全ての肺癌の約８０％を占める。ＮＳＣＬＣによる死亡は、２００１年には世界中で１００万人を超え、男性と女性の両方における癌関連死亡の主要原因（それぞれ３１％及び２５％）である。進行したＮＳＣＬＣの予後はよくない。最近の米国東海岸癌臨床試験グループによる患者１１５５人の検査では、使用した化学療法間では差異はなかった：シスプラチン／パクリタキセル、シスプラチン／ゲムシタビン、シスプラチン／ドセタキセル及びカルボプラチン／パクリタキセル。進行するまでの総期間の中央値は３．６カ月であり、生存期間の中央値は７．９カ月であった。

診断時に、ＮＳＣＬＣを患っている患者は、疾患の程度及び治療法の両方を反映した三群に分けることができる：
・第一群の患者には、外科的に切除可能である腫瘍がある（一般的に、ステージI腫瘍、ステージＩＩ腫瘍及び選択されたステージＩＩＩ腫瘍）。この群の予後は、最もよい。
・第二群は、局部的（Ｔ３〜Ｔ４）及び／又は領域的（Ｎ２〜Ｎ３）進行性肺癌を患った患者を含む。切除不可能又はＮ２〜Ｎ３疾患を患った患者は、放射線治療と化学療法とを併用して治療される。Ｔ３又はＮ２疾患を患った選択された患者は、外科的切除及び術前や術後の化学療法又は放射線化学療法で効果的に治療され得る。
・最後の群は、遠隔転移（Ｍ１）を患った患者を含む。この群は、苦痛緩和放射線療法又は化学療法で治療できる。

ＮＳＣＬＣを患っている患者の全５年生存率は、過去２０年間１５％未満を維持している。ＴＮＭのステージグループ分け（Ｔ＝原発腫瘍；Ｎ＝所属リンパ節；Ｍ＝遠隔転移）により、同様の予後及び治療の選択肢を持つ患者群を同定することができる。５年生存率は、病理学的ステージＩＩＢ（Ｔ１−２Ｎ１Ｍ０、Ｔ３Ｎ０Ｍ０）では約２５％であり、ステージＩＩＩＡ（Ｔ３Ｎ１Ｍ０、Ｔ１−２−３Ｎ２Ｍ０）では１３％であり、ステージＩＩＩＢ（Ｔ４Ｎ０−１−２Ｍ０）では７％と低かった。

多くの調査により、術後の予後決定因子を同定することが試みられ、そして種々の臨床病理学的因子の予後の重要性に関して矛盾した証拠が得られた。予後不良と関連することが分かった因子には次にあげるものなどがある：
・肺疾患症状の存在。
・大きな腫瘍サイズ（＞３ｃｍ）。
・非鱗状組織。
・ＴＮＭ確定結節ステーション内の複数リンパ節への転移。
・血管浸潤。
・腫瘍検体における腫瘍血管数の増加。

過去数年間、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるＥＧＦＲに対して直接的に作用する標的療法の開発に努力が向けられていた。ＥＧＦＲは、大部分のＮＳＣＬＣに存在する。ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む密接に関連した受容体のＥｒｂＢファミリーに属する。ＥＧＦＲの活性化により、受容体チロシンキナーゼ活性及び一連の下流シグナル伝達事象が生じ、これにより細胞の増殖、運動、接着、浸潤、アポトーシスのブロック、そして化学療法に対する耐性の増加が生じる。ＥＧＦＲ及びそのリガンド、ＥＧＦ並びに形質転換成長因子アルファは、ＮＳＣＬＣの８０％超で発現する。リガンドが結合すると、ＥＧＦＲは、ホモ二量体化するか、あるいはＥｒｂＢファミリーの他のものとヘテロ二量体を形成し、受容体リン酸化及び下流シグナル伝達事象の活性化を生じる。ＥＧＦＲの活性化により、Ｓｈｅ、Ｇｒｂ２、Ｓｒｃ、ＪＡＫｓ、ＰＬＤ、ＰＬＣＧＡＭＭＡ及びＰＩ３Ｋなどの複数のシグナル伝達メディエーターとの関連、続いてＥＲＫ１／２、ＦＡＫ、ＪＮＫ、ＳＴＡＴ及びＡｋｔなどのシグナル伝達トランスデューサーの活性化を生じる。腫瘍形成においてＥＧＦＲが重要であることから、その機能をブロックする治療薬の開発及び商業化が促進された。

ＮＳＣＬＣを患っている患者の一部分におけるＥＧＦＲの二種の低分子阻害剤であるゲフィチニブ（イレッサ）及びエルロチニブ（タルセバ）の治療が、最近において成功を納めたことが、ＥＧＦＲが有効な標的であるという前提をさらに確実なものとした。いくつかのグループが、それぞれ独自に、肺腺癌において、ＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインにおける頻発体細胞突然変異を確認した。これらは、米国において配列決定された肺腺癌試料の１６％、及びアジアにおいて配列決定された肺腺癌試料の４０％において生じている。突然変異は、ゲフィチニブとエルロチニブの両方に対する感受性と関連しており、これらの薬剤による治療に対する希少且つ劇的な臨床的応答を部分的に説明する。続いて複数のグループが検討したところ、数多くのさらなる肺癌患者からＥＧＦＲキナーゼドメイン突然変異が同定された。これらの突然変異は、四つの群又は領域；Ｇ７１９Ｓ及びＬ８５８Ｒでのエクソン１９欠失、エクソン２０挿入及び点突然変異において集まる。これらのキナーゼドメイン突然変異の発生は、扁平上皮癌などの他の組織学的サブタイプの肺癌におけるよりも腺癌において一般的である。最近得られたデータも、免疫組織化学及びＥＧＦＲ遺伝子コピー数により評価されるＥＧＦＲ発現が、より応答しやすい患者を同定するのに等しく重要な役割を果たすことがあり、且つゲフィチニブ又はエルロチニブで治療したときの生存期間がより長いことを示唆している。

しかしながら、エルロチニブ及びゲフィチニブに最初から応答したほぼ全ての患者はその後再発する。３つの研究により、再発した患者からの腫瘍においてＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異体が同定された。これらの突然変異体が、感作ＥＧＦＲキナーゼドメイン突然変異と組み合わされると、エルロチニブ及びゲフィチニブの存在下で腫瘍細胞の成長が継続する。ＥＧＦＲ、ＣＬ−３８７，７８５及びＨＫＩ−２７２の二種の不可逆阻害剤が、生体外でＴ７９０Ｍ耐性突然変異体の成長を阻害し、獲得耐性を有する腫瘍の治療について有望な方法を提供することが判明した。これらの二種の薬剤のうちＨＫＩ−２７２だけが、現在のところ臨床開発が進んでいる。これは、生体外でナノモル範囲において受容体のキナーゼ活性を阻害することができるパンＥＲＢＢ不可逆阻害剤である。

種々のタイプの癌についての予後マーカーとして好適であるとことが判明したＤＮＡ修復に関与する別の遺伝子は、ＢＲＣＡ１である。ＢＲＣＡ１は、転写と共役したヌクレオチド除去修復（ＴＣ−ＮＥＲ）に関係しており、その発現の調節により、ＴＣ−ＮＥＲの修飾、したがって、放射線耐性及び化学耐性を生じる。ＢＲＣＡ１発現の上向き調節により、ＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞株におけるシスプラチン耐性が増加し（Ｈｕｓａｉｎ Ａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９８、５８巻（６）：１１２０−３）、ＢＲＣＡ１陰性ＨＣＣ１９３７ヒト乳癌細胞株におけるＢＲＣＡ１の修復により放射線耐性が回復した。ＢＲＣＡ１は、ＤＮＡ損傷に応答した相同組換え修復（ＨＲＲ）及び非相同末端結合にも関与している。さらに、ＢＲＣＡ１は、多数のミスマッチ修復タンパク質を含有するＢＲＣＡ１関連ゲノムサーベイランス複合体と称される巨大ＤＮＡ修復複合体の成分であり、このことはＢＲＣＡ１がミスマッチ修復において潜在的役割を果たしている可能性を示している。また、ＢＲＣＡ１とｂ−チューブリンが有糸***紡錘体の微小管及び中心体に共局在化するので、ＢＲＣＡ１は有糸***紡錘体集合の調節因子であることもできる。最後に、増大したＢＲＣＡ１発現が、シスプラチン誘発ＤＮＡ損傷により活性化されるｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ経路を介してアポトーシスに関連している。この経路の阻害により、細胞株におけるシスプラチン感受性が増加した。

散発性乳癌と遺伝性乳癌の両方において、改変ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡの発現が観察された（Ｋｅｎｎｅｄｙ ＲＤ等、２００２ Ｌａｎｃｅｔ、３６０巻、１００７−１０１４）。これらの患者は、ＤＮＡ損傷型化学療法には応答するが、抗微小管剤には応答しない。さらに、ＤＮＡ損傷型化学療法により、ＢＲＣＡ１突然変異保因者に対して、非突然変異保因者よりも顕著な延命効果が与えられる。また、低ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡレベルの卵巣癌患者も、高ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡレベルの患者よりも、プラチナ製剤ベースの化学療法により改善された生存期間を示した（Ｑｕｉｎｎ等、２００７Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第１３巻（２４）：７４１３−２０）。

さらに、ＢＲＣＡ１遺伝子は、ＮＳＣＬＣの予後マーカーであることが判明した。例えば、米国特許出願ＵＳ２００６／００９４０２１及びＴａｒｏｎ等 ２００４（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００４、第１３巻（２０）：２４４３−２４４９）は、ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡ発現レベルがＮＳＣＬＣにおける化学療法に対する感受性差の良好なマーカーであり、この極めて一般的且つ致死的疾患における生存期間を向上させるためにＮＳＣＬＣ化学療法をカスタマイズする重要なツールが提供できることを開示している。一方、Ｒｏｓｅｌｌ等（ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２００７、２：ｅ１１２９）は、ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡの過剰発現がＮＳＣＬＣ患者における生存期間がよくないことと強い相関があることを開示している。

したがって、当該技術分野において、ＮＳＣＬＣを患っている患者の臨床転帰を予測するためのさらなる予後マーカーが必要とされている。

第一の態様によれば、本発明は、肺癌を患っている患者であり、かつＥＧＦＲ遺伝子において少なくとも突然変異を有する患者のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答を予測する方法であって、
（ｉ）前記患者から単離した試料中のＢＲＣＡ１の発現レベルを測定する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＢＲＣＡ１の発現レベルを標準試料と比較する工程と
を含んでなり、
標準試料と比較してＢＲＣＡ１の発現レベルが減少した場合には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤での治療に対して応答が良好であることを示し、又は、
標準試料と比較してＢＲＣＡ１の発現レベルが増加した場合には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤での治療に対して応答が不良であることを示しているとすることを特徴とする方法に関する。

第二の態様によれば、本発明は、肺癌の治療に使用されるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であって、前記治療すべき患者が、低ＢＲＣＡ１発現レベルを示し且つ前記ＥＧＦＲ遺伝子に少なくとも突然変異を有している、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に関する。

第三の態様によれば、本発明は、
（ｉ）ＢＲＣＡ１発現レベルを検出する試薬と、
（ｉｉ）ＥＧＦＲにおける少なくとも突然変異を検出する試薬と
を含んでなるキットに関する。

図１は、Ｔ７９０Ｍ突然変異が存在するときのエルロチニブで治療した１２９人の患者における無進行生存期間を示す。 図２は、Ｔ７９０Ｍ突然変異が存在するときの無進行生存期間のサブグループ解析を示す。Ａ：ｄｅｌ１９を有する患者。Ｂ：Ｌ８５８Ｒを有する患者。 Ｃ：初回療法としてエルロチニブ処置した患者。Ｄ：第二次療法としてエルロチニブ処置した患者。 図３は、ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡレベルによるＥＧＦＲ突然変異を有する８１人の非小細胞肺癌患者における無進行生存期間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。 図４は、ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡレベルによるＥＧＦＲ突然変異を有する患者におけるエルロチニブに対する全生存期間を示す。 図５は、ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡレベルによる無進行生存期間のサブグループ解析を示す。Ａ：Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する患者。Ｂ：Ｔ７９０Ｍ突然変異を有しない患者。 Ｃ：一次療法としてエルロチニブ処置した患者。Ｄ：二次療法としてエルロチニブ処置した患者。

チロシンキナーゼ阻害剤に対する肺癌患者の応答を判定する方法
本発明の発明者らは、肺癌を患っており且つＥＧＦＲ受容体において突然変異を有する患者では、その患者からの試料で測定したＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルが標準試料で測定したＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルよりも低いとき、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による療法に対して改善された応答を示すことを見出した。本発明の実施例に示すように、エルロチニブに対する無進行生存期間の中央値は、低ＢＲＣＡ１レベルのＥＧＦＲ突然変異を有する患者では２７カ月（９５％ＣＩ、２１．３〜３２．７）であり、中ＢＲＣＡ１レベルのＥＧＦＲ突然変異を有する患者では１８カ月（９５％ＣＩ、６．３〜２９．７）であり、高ＢＲＣＡ１レベルのＥＧＦＲ突然変異を有する患者では１０カ月（９５％ＣＩ、６．７〜１３．３）である（Ｐ＝０．０２）（図１参照）。この知見により、肺癌患者のために、ＢＲＣＡ１発現レベルに基づいて、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答を予測し、そして個別療法を設計することが可能である。

したがって、第一の態様によれば、本発明は肺癌を患っている患者であり、かつＥＧＦＲ遺伝子において少なくとも突然変異を有する患者のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答を予測する方法であって、
（ｉ）前記患者から単離した試料中のＢＲＣＡ１の発現レベルを測定する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＢＲＣＡ１の発現レベルを標準試料と比較する工程と
を含んでなり、
標準試料と比較してＢＲＣＡ１の発現レベルが減少した場合には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤での治療に対して反応が良好であることを示し、又は、
標準試料と比較してＢＲＣＡ１の発現レベルが増加した場合には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤での治療に対して反応が不良であることを示しているとすることを特徴とする方法（以下「本発明の第一の方法」という。）に関する。

本明細書で使用される用語「応答を予測する」は、一定の療法に対して患者が好ましい応答を示すか又は好ましくない応答を示す可能性を判定することを示す。とりわけ、本明細書で使用される用語「予測」は、患者の進展を判定するのに有用であることができるいずれかのパラメータの個別評価に関する。当業者には理解されるように、チロシンキナーゼによる治療に対する臨床応答の予測は、好ましくはあるけれども、診断又は評価される被験者の１００％について正しい必要はない。しかしながら、この用語は、被験者の統計的に有意な部分が、陽性応答を有する高い確率として同定できる必要がある。被験者が統計的に有意であるかどうかは、種々の周知の統計的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントのｔ検定、マンホイットニー検定などを用いて、当業者により、さしたる困難もなく判定できる。詳細は、Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（研究のための統計）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、 １９８３年に記載されている。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％ 少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは０．２、０．１又は０．０５である。

本明細書で使用される用語「患者」は、哺乳動物として分類される全ての動物を指し、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）、霊長類及びヒト、例えば、人間、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ又は齧歯類などが挙げられるが、これらには限定されない。好ましくは、患者は、年齢又は人種を問わず男性又は女性の人間である。

本明細書で使用される用語「臨床応答」は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた療法に対するＮＳＣＬＣを患っている被験者の応答を指す。化学療法に対する応答を評価するためのここで使用できる規格基準（Ｍｉｌｌｅｒ等、Ｃａｎｃｅｒ、１９８１；４７：２０７−１４）には、反応、安定化及び進行などがある。この規格基準は、全ての検出可能な悪性疾患の消失である完全応答（又は完全寛解）、又は一つ以上の病巣（腫瘍病巣）の最大垂直直径の積の合計の約５０％超の減少、新しい病巣がないこと、及びいずれの病巣の進行もないこととして定義される部分寛解であることができる。完全又は部分応答が得られた患者は「レスポンダー」とみなされ、その他の全ての患者は「ノンレスポンダー」とみなされる。

本明細書で使用される用語「安定化」は、腫瘍サイズの２５％を超える増加の５０％未満の減少として定義される。

本明細書で使用される用語「進行」は、腫瘍病巣のサイズの２５％増加又は新しい病巣の出現として定義される。

代替治療の有効性を比較するために広く受け入れられている他のパラメータを、治療に対する応答を判定するのに使用できる。例えば、次のようなものが挙げられるが、これらには限定されない：
・本明細書で使用される無病進行は、試験中の期間の間に疾患の再発がない完全寛解の患者の割合である。
・本明細書で使用される無病生存期間（ＤＦＳ）は、被験者が疾患の兆候を示さずに生存する、疾患の治療後の時間の長さであると理解される。
・本発明で使用される客観的反応は、治療された人々のうちの完全又は部分応答が観察される人の割合である。
・本発明で使用される腫瘍制御は、治療された人々のうちで、６カ月以上の間、完全応答、部分応答、マイナーな応答又は不変が観察される人の割合に関する。
・本明細書で使用される無進行生存期間は、治療の開始から、癌増殖の最初の測定までの時間として定義される。
・本明細書で使用される無進行期間（ＴＴＰ）は、疾患の治療がなされた後、疾患が悪化し始めるまでの時間に関する。用語「進行」については、上記で定義した。

個々の患者における応答は、当該技術分野において理解されているように、完全応答、部分応答、安定及び進行として特徴づけられる。一つの実施態様によれば、応答は、病理学的完全応答である。例えば、手術又は生体検査時に除去された組織の検査後の病理学者により測定された病理学的完全応答は、一般的に外科検体における浸潤性腫瘍細胞の組織学的証拠がないことを指す。特に、応答は、呼吸困難、咳、息切れ、喘鳴、胸痛及び喀血などの肺癌関連の一つ以上の兆候及び症状が部分的又は完全に消失したことを観察することにより判定できる。

用語「肺癌」は、肺のいずれかの癌を指し、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌などがある。好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、ＮＳＣＬＣを患った被験者に適用できる。特定の実施態様によれば、ＮＳＣＬＣは、肺の扁平上皮癌、肺の大細胞癌及び肺の腺癌から選択される。さらに、本発明の方法は、ＮＳＣＬＣのいずれのステージ（ステージ０、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ又はＩＶ）を患っている被験者にも適用できる。

本明細書で使用される用語「ＥＧＦＲ遺伝子に少なくとも突然変異を示す患者」は、腫瘍が、ＥＧＦＲを過剰発現する（例えば、ＦＤＡ認可ＥＧＦＲ ｐｈａｒｍａＤｘキット（「ＤＡＫＯ」試験；ＤＡＫＯ Ｎｏｔｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社）、ｔｈｅ Ｚｙｍｅｄ ＥＧＦＲキット又はｔｈｅ Ｖｅｎｔａｎａ ＥＧＦＲ ３Ｃ６抗体により検出される）か、又は改変チロシンキナーゼ活性を示すＥＧＦＲ突然変異体を過剰発現する細胞を少なくとも１％、特に少なくとも２％、３％、４％又は５％、特に少なくとも１０％含有する患者を指すのに使用できる。

用語「ＥｒｂＢ１」、「上皮成長因子受容体」及び「ＥＧＦＲ」は、本明細書において相互に交換可能に使用され、シグナル伝達経路並びに細胞の成長及び生存を調節し、且つＥＧＦ分子に親和性を示すチロシンキナーゼを指す。ＥｒｂＢファミリー受容体は、４種の密接に関連したサブタイプからなる：ＥｒｂＢ１（上皮成長因子受容体 ［ＥＧＦＲ］）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）及びＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）並びにそれらの変異体（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ等（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９０、８７：４２０７−４２１１）に記載のような欠損変異体ＥＧＦＲ）。

ＥＧＦＲ突然変異は、典型的にＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼドメインに位置しており、チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す突然変異及びＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を示す突然変異などが挙げられる。

本明細書で使用される「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す突然変異」は、エルロチニブなどの阻害剤による処置に反応してＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の阻害を増大させる、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける突然変異を指す。チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性の増加を示すＥＧＦＲ突然変異体には、エクソン２１における位置Ｌ８５８での突然変異、例えば、活性化ループ（エクソン２１）におけるＬ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｐ、Ｌ８６１Ｑ又はＬ８６１点突然変異、ＥＬＲＥＡ配列（エクソン１９）におけるインフレーム欠失／挿入突然変異、例えば、Ｅ７４６−Ｒ７４８欠失、Ｅ７４６−Ａ７５０欠失、Ｅ７４９Ｑ及びＡ７５０Ｐ置換と一緒のＥ７４６−Ｒ７４８欠失、ｄｅｌＬ７４７−Ｅ７４９欠失とＡ７５０Ｐ置換との組み合わせ、Ｌ７４７Ｓ置換とＲ７４８−Ｐ７５３欠失との組み合わせ、Ｌ７４７−Ｓ７５２欠失とＥ７４６Ｖ置換との組み合わせ、Ｌ７４７−Ｔ７５１欠失とセリン挿入との組み合わせ、位置Ｍ７６６−Ａ７６７でのＡＩ挿入、位置Ｓ７６８−Ｖ７６９でのＳＶＡ挿入、又はＧ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１０Ｓなどのヌクレオチド結合ループ（エクソン１８）における位置７１９での置換などがあるが、これらには限定されない。

本明細書で使用される「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を与える突然変異」は、前に示した増加した感受性を示すＥＧＦＲ突然変異体だけでなく、野生型ＥＧＦＲにおいても、チロシンキナーゼ阻害剤に対するＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性の感受性の損失を生じる、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける突然変異体を指す。既知のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を示す突然変異体ＥＧＦＲには、いずれか一つ以上のＥＧＦＲポリペプチド又はこれをコードするヌクレオチド（一つ以上の位置に、イマチニブ耐性表現型を裏付けるｃ−ａｂｌ（ＢＣＲ−ＡＢＬ）残基に類似する非野生型残基を有する）などがある。ＥＧＦＲで変異するとき薬剤耐性を与える残基には、とりわけ、例えば、Ｐループ及び活性化ループ（これらには限定されない）を含むキナーゼドメインからの残基などがある。ここで、ＥＧＦＲポリペプチドにおける突然変異残基はｃ−ａｂｌｅ残基と類似している。意図する耐性ＥＧＦＲ突然変異体は、ＥＧＦＲにおけるＬｙｓ７１４、Ｌｅｕ７１８、Ｓｅｒ７２０、Ａｌａ７２２、Ｐｈｅ７２３、Ｔｈｒ７２５、Ａｌａ７５０、Ｔｈｒ７９０、Ｌｅｕ７９２、Ｍｅｔ８２５、Ｇｌｕ８２９、Ｌｅｕ８３３、Ｈｉｓ８７０、Ｔｈｒ８９２、Ｐｈｅ９６１残基それぞれに対応するアミノ酸位置で非野生型残基を有する。好ましい突然変異には、エクソン２０におけるＴ７９０Ｍ点突然変異及びエクソン２０における所定の挿入、例えば、位置Ｄ７７０−Ｎ７７１でのＮＰＧ挿入、位置Ｐ７７２−Ｈ７７３でのＶ挿入などがある。

一定の突然変異体がチロシンキナーゼ活性に対する感受性又は耐性を示すかどうかを判定する方法が従来技術に詳細に説明されており、とりわけゲフィニチブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））又はパニツムマブでの治療に応答してＥＧＦＲを過剰発現する細胞において測定されるＥＧＦＲの自己リン酸化能の検出に基づく、ＷＯ２００６０９１８８９に記載の方法などが挙げられる。

好ましい実施態様によれば、患者は、チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性を示す突然変異を少なくとも示し、そしてこのような阻害剤に対して耐性を示す少なくとも一つの突然変異を示す。さらにより好ましい実施態様によれば、患者は、Ｌ８５８Ｒ置換及びＥＬＲＥＡ欠失からなる群から選択される第一突然変異、並びに、エクソン２０におけるＴ７９０Ｍ点突然変異である第二突然変異を示す。さらにより好ましい実施態様によれば、患者は、Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ突然変異を示す。

ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異及び遺伝子多型は、当該技術分野において知られているいずれかの方法を用いて判定される。典型的には、遺伝子多型又は突然変異の存在は、被験者において、ゲノムに存在する多型性部位の両方のコピーに関して判定される。例えば、完全遺伝子型は、−／−、−／＋又は＋／＋として特徴付けられ得る。ここで、マイナス記号は多型性部位に参照配列が存在することを示し、プラス記号は参照配列以外の多型性変異が存在することを示している。本明細書に記載されている検出手段のいずれも、被験者のゲノムに存在する遺伝子多型の一つ又は両方のコピーに関して被験者の遺伝子型を判定するのに使用することができる。

２種の核酸間の少なくとも一つのヌクレオチドの違いを検出する方法としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅又は選択的プライマー伸長などが挙げられるが、これらには限定されない。

例えば、既知の多型性ヌクレオチドが中央に位置するオリゴヌクレオチドプローブ（対立遺伝子特異的プローブ）を調製し、その後完全マッチである場合のみハイブリダイゼーションできる条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせることができる（Ｓａｉｋｉ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６２３０；及びＷａｌｌａｃｅ等（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３５４３）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法は、遺伝子の異なる多型領域におけるいくつかのヌクレオチド変化の同時検出に使用できる。例えば、特異的多型変異体のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション膜に結合させた後、この膜を標識された試料核酸とハイブリダイゼーションする。次にハイブリダイゼーションシグナルを分析して、試料核酸の多型変異体を同定する。オリゴヌクレオチドを、リソグラフィーを含む種々のプロセスにより固体支持体に結合できる。例えば、チップは最大２５０,０００までのオリゴヌクレオチドを保持できる（ＧｅｎｅＣｈｉｐ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。「ＤＮＡプローブアレイ」とも称されるオリゴヌクレオチドを含んでなるこれらのチップを用いた突然変異検出分析は、例えば、Ｃｒｏｎｉｎ等（Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ、１９９６、７：２４４）及びＫｏｚａｌ等（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９６、２：７５３）に記載されている。次に、固相支持体を、試験核酸と接触させ、そして特異的プローブへのハイブリダイゼーションを検出する。したがって、一つ以上の遺伝子の非常に多くの多型変異体がは、簡単なハイブリダイゼーション実験で同定できる。例えば、本明細書に記載されている多型部位のいずれかでの多型変異体の同定は、単一のハイブリダイゼーション実験でおこなうことができる。

別法として、選択的ＰＣＲ増幅による対立遺伝子特異的増幅法を使用してもよい。このため、意図する断片の増幅のためのプライマーとして好適なオリゴヌクレオチドを有することが必要である。本明細書で使用される用語「プライマー」は、適切な緩衝剤中、好適な温度で、適切な条件下での鋳型指向ＤＮＡ合成（例えば、４種の異なるヌクレオチド三リン酸塩及び重合剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素の存在下）の開始点としての役割を果たすＳＮＰを指す。適切なプライマー長は、プライマーの意図する用途により異なるが、典型的には１５〜３０ヌクレオチドである。短プライマー分子では、一般的により低温で十分に安定な鋳型とのハイブリッド複合体を形成する必要がある。プライマーは、鋳型の完全配列に完全に相補的である必要はないが、それとハイブリダイゼーションするのに十分な相補性がなければならない。用語「プライマー部位」は、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの配列を指す。用語「プライマー対」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマー、及び増幅されるべき配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一連のプライマーを指す。

特異的増幅のためにプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心（増幅が示差的ハイブリダイゼーションに依存するように）（Ｇｉｂｂｓ 等 （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：２４３７−２４４８）又は適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を防止又は減少することができる一つのプライマーの極３’末端（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８；Ｎｅｗｔｏｎ等（１９８９） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：２５０３）に意図する多型変異体を担持することができる。この手法は、プローブオリゴ塩基伸長用「プローブ」とも称される。さらに、突然変異の領域に新規な制限部位を導入して開裂に基づく検出をおこなうことが望ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ等、１９９２、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅ ６：１）。

本明細書に記載されている種々の検出法は、多型変異体を同定する前に、まず遺伝子の少なくとも一部分を増幅することを含む。増幅は、当該技術分野において知られている方法に準じて、例えば、ＰＣＲ及び／又はＬＣＲにより行うことができる。

さらなる増幅法として、例えば、自律配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ、Ｊ．Ｃ．等、１９９０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ、Ｄ．Ｙ．等、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：１ １７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ、Ｐ．Ｍ．等、１９８８、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１ １９７）、又は他の核酸増幅法などがある。増幅後、当業者に周知の手法を用いて増幅分子を検出する。これらの検出スキームは、極めて少数しか存在しない核酸分子の検出にとりわけ有用である。

当該技術分野において知られている種々のシークエンス反応のいずれかを使用して、遺伝子の少なくとも一部分を直接配列決定し、試料配列を対応の制御配列と比較することにより多型変異体を検出することができる。典型的なシークエンス反応には、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９７７、７４：５６０）又はＳａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒ 等、１９７７、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７４：５４６３）により開発された手法に基づくものなどがある。また、質量分析法による配列決定を含む種々の自動配列決定法のいずれかを利用して多型変異体(Biotechniques (1995) 19:448)を同定してもよい。例えば、米国特許第５，５４７，８３５号及び国際公開公報ＷＯ９４／１６１０１号、米国特許第５，５４７，８３５号及び国際出願ＷＯ９４１２１８２２号並びに米国特許第５，６０５，７９８号及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６５１号；Ｃｏｈｅｎ等（１９９６） Ａｄｖ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；及びＧｒｉｆｆｉｎ等（１９９３）Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８：１４７−１５９を参照されたい。当業者には、ある実施態様によれば、核酸塩基の一つ、二つ又は三つの存在だけをシークエンス反応で決定する必要があることが明らかであろう。例えば、Ａ−トラックなどの単一のヌクレオチド試験には、一つだけのヌクレオチドを検出すればよく、したがって、改良シークエンス反応を実施できる。

さらに他の好適な配列決定法が、例えば、米国特許第５，５８０，７３２号及び米国特許第５，５７１，６７６号に開示されている。

場合によっては、被験者からのＤＮＡ試料における特異的多型変異体の存在は、制限酵素分析により明らかにすることができる。例えば、特異的多型変異体では、別の多型変異体のヌクレオチド配列にはない制限部位を含んでなるヌクレオチド配列を得ることができる。

他の実施態様によれば、電気泳動移動度の変化を使用して多型変異体を同定することができる。例えば、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）を使用して、多型変異体間の電気泳動移動度差を検出することができる（Ｏｒｉｔａ等（１９８９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ （１９９３） Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ２８５：１２５−１４４；及びＨａｙａｓｈｉ （１９９２）Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３− ７９）。試料の一本鎖ＤＮＡ断片及びコントロールの核酸を、変性し、そして再生する。一本鎖核酸の二次構造は、配列により異なり、生じた電気泳動移動度の変化により単一の塩基変化であっても検出できる。ＤＮＡ断片を、標識してもよいし、標識プローブで検出してもよい。アッセイの感度は、二次構造が配列の変化に対してより感度が高いＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を用いて高めることができる。

多型変異体の同一性は、変性剤の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲルにおいて多型変異体を含む核酸の移動を分析すること、例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により得ることもできる（Ｍｙｅｒｓ等（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析の方法として使用するとき、ＤＮＡを修飾して、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを添加することにより、完全には変性しないようにする。別の実施態様によれば、多型変異体の同定は、例えば、米国特許第４，９９８，６１７号及びＬａｎｄｅｇｒｅｎ、Ｕ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）に記載されているように、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を用いて実施する。ＯＬＡプロトコルでは、標的の一本鎖の隣接配列にハイブリダイズできるように設計された２つのオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドの一つは分離マーカーに連結、例えば、ビオチニル化し、他は検出可能に標識する。正確な相補配列が標的分子にある場合、オリゴヌクレオチドは、その末端を隣接させ、そしてライゲーション基質を形成するようにハイブリダイゼーションする。ライゲーションにより、標識オリゴヌクレオチドをアビジンなどのビオチンリガンドを用いて回収できる。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ａ．等には、ＰＣＲとＯＬＡの特性を組み合わせた核酸検出アッセイを記載されている（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ａ．等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：８９２３−８９２７（１９９０）。この方法では、ＰＣＲを使用して標的ＤＮＡを指数関数的に増幅した後、ＯＬＡを用いて検出する。

ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼドメインにおける突然変異を検出する方法は当該技術分野において知られており、いくつかの対応する診断ツールがＦＤＡにより承認され、市販されており、例えば、非小細胞肺癌を患っている患者における上皮成長因子受容体突然変異の検出用アッセイがある（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００６ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ （Ｐｏｓｔ−Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＶｏＩ ２４、Ｎｏ １８Ｓ （Ｊｕｎｅ ２０ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、２００６： Ａｂｓｔｒａｃｔ １００６０）。好ましい実施態様によれば、ＥＧＦＲにおける突然変異は、特異的サソリプローブと増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）との組み合わせを使用して、ＷＯ０７０３９７０５号に記載されている方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９８９、１７：２５０３−２５１６ 及び Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、１７：８０４−８０７）又は野生型変異体に特異的なＰＮＡプローブを使用することによってなされる突然変異体対立遺伝子の選択的増幅に基づいて、ＷＯ０８００９７４０に記載されている方法により血清試料で判定する。

別法として、少なくとも一つのキナーゼ活性増大核酸相違の有無を検出することもできる。この場合、ＷＯ２００５０９４３５７号に記載の方法で、Ａｋｔ及びＳＴＡＴ５などのＥＧＦＲの下流標的の活性化状態を測定することを含む。

本願の一つの実施態様によれば、ＥＧＦＲ突然変異の存在は、当該技術分野において周知の免疫学的方法、例えば、抗体法、例えば、免疫組織化学、免疫細胞化学、ＦＡＣＳ走査、免疫ブロット法、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット法、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び誘導体法（活性化されたＥＧＦＲの下流標的に対して直接作用する抗体を使用を用いて測定できる。このような標的としては、例えば、リン酸化ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ５及びリン酸化Ａｋｔなどがある。リン酸特異的抗体を使用して、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５及びＡｋｔの活性化状態を測定できる。ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５及びＡｋｔの活性化は、活性化ＥＧＦＲ突然変異の診断指標として有用である。

本明細書で使用される表現「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤」は、ＡＴＰのγ−リン酸基を、上皮細胞成長因子の受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼドメインにより触媒されたタンパク質における特異的チロシンの水酸基に転移させる「チロシンキナーゼ」を阻害する化学物質に関する。チロシンキナーゼ活性は、タンパク質のリン酸化を検出することにより測定される。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、当該技術分野において知られている。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＡＴＰからタンパク質チロシン残基へのチロシン介在性転移リン酸塩の減少を検出することにより同定される。

チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、ｅｒｂＢチロシンキナーゼ阻害剤である。あるいは、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。チロシンキナーゼ阻害剤は、可逆的チロシンキナーゼ阻害剤である。あるいは、チロシンキナーゼ阻害剤は、不可逆的チロシンキナーゼ阻害剤である。可逆的チロシンキナーゼ阻害剤としては、例えば、ＨＫＩ−２７２、ＢＩＢＷ２９９２、ＥＫＢ−５６９、ＣＬ−３８７，ＣＬ−７８５又はそれらの類似物若しくは誘導体などがある。他のチロシンキナーゼ阻害剤としては、米国特許第６，３８４，０５１号及び第６，２８８，０８２号並びに米国特許出願第２００５００５９６７８号（これらの内容全体は、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる）に記載されたものなどがある。

ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤には、例えば、キナゾリンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリドピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリミドピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピロロピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピラゾロ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フェニルアミノピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、オキシインドールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、インドロカルバゾールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フタラジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、イソフラボンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、キナロンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤並びにチルホスチンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、例えば、以下の特許公開公報並びに前記ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の全ての薬学的に許容しうる塩及び溶媒和物などがある：国際公開公報ＷＯ９６／３３９８０、ＷＯ９６／３０３４７、ＷＯ９７／３００３４、ＷＯ９７／３００４４、ＷＯ９７／３８９９４、ＷＯ９７／４９６８８、ＷＯ９８／０２４３４、ＷＯ９７／３８９８３、ＷＯ９５／１９７７４、ＷＯ９５／１９９７０、ＷＯ９７／１３７７１、ＷＯ９８／０２４３７、ＷＯ９８／０２４３８、ＷＯ９７／３２８８１、ＷＯ９８／３３７９８、ＷＯ９７／３２８８０、ＷＯ９７／３２８８、ＷＯ９７／０２２６６、ＷＯ９７／２７１９９、ＷＯ９８／０７７２６、ＷＯ９７／３４８９５、ＷＯ９６／３１５１０、ＷＯ９８／１４４４９、ＷＯ９８／１４４５０、ＷＯ９８／１４４５１、ＷＯ９５／０９８４７、ＷＯ９７／１９０６５、ＷＯ９８／１７６６２、ＷＯ９９／３５１４６、ＷＯ９９／３５１３２、ＷＯ９９／０７７０１及びＷＯ９２／２０６４２；ヨーロッパ特許出願ＥＰ５２０７２２、ＥＰ５６６２２６、ＥＰ７８７７７２、ＥＰ８３７０６３及びＥＰ６８２０２７；米国特許第５，７４７，４９８、第５，７８９，４２７、第５，６５０，４１５及び第５，６５６，６４３；並びにドイツ国特許出願ＤＥ１９６２９６５２。低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のさらなる例として、Ｔｒａｘｌｅｒ、Ｐ．、１９９８、Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｐａｔｅｎｔｓ ８（１２）：１５９９−１６２５に記載のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤があるが、これらには限定されない。

本発明で使用できる低分子量ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の好ましい具体例として、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナドリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（ＯＳＩ−７７４、エルロチニブ又はＴＡＲＣＥＶＡ．ＲＴＭ．（エルロチニブＨＣｌ）としても知られている；ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（米国特許第５，７４７，４９８号；国際公開公報ＷＯ０１／３４５７４及びＭｏｙｅｒ、Ｊ．Ｄ．等（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４８３８−４８４８）；ＣＩ−１０３３（正式にはＰＤ１８３８０５；Ｐｆｉｚｅｒとして知られている）（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ等、１９９９、Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４０：７２３）；ＰＤ−１５８７８０（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ−１４７８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＣＧＰ−５９３２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；ＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６又はラパチニブジトシレートとしても知られている；ＧＳＫ）；並びにゲフィチニブ（ＺＤ１８３９又はＩＲＥＳＳＡ．ＴＭ．としても知られている；Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）（Ｗｏｏｄｂｕｒｎ等、１９９７、Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３８：６３３）などが挙げられる。本発明で使用できる特に好ましい低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナドリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（すなわち、エルロチニブ）、その塩酸塩（すなわち、エルロチニブＨＣｌ、ＴＡＲＣＥＶＡ．ＲＴＭ．）又は他の塩形態（例えば、エルロチニブメシラート）である。

また、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤として、例えば、ＥＧＦＲキナーゼに対して活性を有するマルチキナーゼ阻害剤、すなわち、ＥＧＦＲキナーゼ及び一種以上のさらなるキナーゼを阻害する阻害剤が挙げられる。このような化合物としては、例えば、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤ＣＩ−１０３３（正式にはＰＤ１８３８０５としても知られている；Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤ＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６又はラパチニブジトシラートとしても知られている；ＧＳＫ）；ＥＧＦＲ及びＪＡＫ２／３阻害剤ＡＧ４９０（チルホスチン）；ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤ＡＲＲＹ−３３４５４３（Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）；ＢＩＢＷ−２９９２、不可逆的デュアルＥＧＦＲ／ＨＥＲ２キナーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．）；ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；ＶＥＧＦ−Ｒ２及びＥＧＦＲ阻害剤ＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ．ＴＭ．としても知られている；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）並びにＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤ＢＭＳ−５９９６２６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）などが挙げられる。

抗体型チロシンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤には、天然リガンドによるＥＧＦＲ活性化を部分的又は完全にブロックできるいずれの抗ＥＧＦＲ抗体又は抗体断片が含まれる。抗体型ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ、Ｈ．等、１９９３、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６７：２４７−２５３；Ｔｅｒａｍｏｔｏ、Ｔ．等、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ ７７：６３９−６４５；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等、１９９５、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：１３１１−１３１８；Ｈｕａｎｇ、Ｓ．Ｍ．等、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：５９（８）：１９３５−４０；及びＹａｎｇ、Ｘ．等、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：１２３６−１２４３に記載のものが挙げられるが、これらには限定されない。したがって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、モノクローナル抗体Ｍａｂ Ｅ７．６．３（Ｙａｎｇ、Ｘ． Ｄ．等（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：１２３６−４３）若しくはＭａｂ Ｃ２２５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−８５０８）又はそれらの結合特異性を有する抗体若しくは抗体断片であることができる。好適なモノクローナル抗体ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として、ＩＭＣ−Ｃ２２５（セツキシマブ又はＥＲＢＩＴＵＸ．ＴＭ．としても知られている；Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ＲＨ３（Ｙｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ）などが挙げられるが、これらには限定されない。

別の実施態様によれば、アンチセンス法を使用して変異体ＥＧＦＲのキナーゼ活性を阻害してもよい。この手法では、例えば、アンチセンス核酸でｍＲＮＡをマスキングするか、又はリボザイムでｍＲＮＡを切断することにより、特異的ｍＲＮＡの翻訳をブロックするアンチセンス核酸又はリボザイムを利用してもよい。アンチセンス技術についての一般的な考察については、例えば、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｄ． Ｍｅｌｔｏｎ、ｅｄ．、１９８８）を参照されたい。

変異体ＥＧＦＲ遺伝子転写の可逆的短期阻害が有用なこともある。このような阻害は、ｓｉＲＮＡを使用することにより可能である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術により、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）などの低分子ＲＮＡを用いることにより、遺伝子の発現を抑制する。そして、この技術では、ＲＮＡｉが、植物から昆虫、哺乳動物にいたるまでの数多くの生体のほとんどの細胞における遺伝子サイレンシングのための自然生物学的機構であるという事実を利用する（ＭｃＭａｎｕｓ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００２、３（１０） ｐ． ７３７）。ＲＮＡｉは、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡコピーである分子中間体を確実に破壊することにより、遺伝子が機能タンパク質を産生することを抑制する。ｓｉＲＮＡを、以下のようにして、裸形態で使用し、ベクターに取り込むことができる。さらに、アプタマーを使用して変異体ＥＧＦＲ遺伝子転写を特異的に阻害することもできる。これについては、例えば、米国特許第６，６９９，８４３号を参照されたい。本発明に有用なアプタマーを、ＳＥＬＥＸプロセスを用いて同定してもよい。ＳＥＬＥＸの方法は、例えば、米国特許第５，７０７，７９６号、第５，７６３，１７７号、第６，０１１，５７７号、第５，５８０，７３７号、第５，５６７，５８８号及び第５，６６０，９８５号に記載されている。

「アンチセンス核酸」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子における相補的塩基と細胞質内条件下でハイブリダイズしたとき、後者の役割を阻害する一本鎖核酸分子である。ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ転写物の場合には、アンチセンス核酸は逆方向転写物又はｍＲＮＡ干渉相補的核酸である。現在使用されている「アンチセンス」は、広義にはＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用、リボザイム、ＲＮＡｉ、アプタマー及びＲｎａｓｅ−Ｈ介在性停止を含む。

リボザイムは、他の一本鎖ＲＮＡ分子をＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに多少類似している方法で特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、あるｍＲＮＡが自身のイントロンを切除する能力を有するという観察結果から見出された。これらのリボザイムのヌクレオチド配列の改変により、研究者は、ＲＮＡ分子における特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを切断する分子を設計することができた（Ｃｅｃｈ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５（４９１５）ｐ．２７６）。これらは配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化される。

アンチセンス核酸分子は、細胞での発現のための組換え遺伝子によりコードされることができるか（例えば、米国特許第５，８１４，５００号；米国特許第５，８１１，２３４号）又は合成することもできる（例えば、米国特許第５，７８０，６０７号）。

ｓｉＲＮＡは、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６；５５０−５５３，２００２、Ｊａｑｕｅ等、Ｎａｔｕｒｅ ４１８；４３５−４３８、２００２、Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．等（２００１）Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４９４−４９８、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ等（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ、４１８： ３８−３９；Ｘｉａ Ｈ等（２００２）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０、Ｎｏｖｉｎａ等（２００２）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：６８１−６８６及び米国特許出願第２００３０１９８６２７号に記載されている。

突然変異した受容体及び正常な受容体の両方を阻害するゲフィチニブなどの薬剤を使用することに対するこのような療法の重要な利点は、突然変異したＥＧＦＲに対して特異的に直接作用するｓｉＲＮＡは、野生型ＥＧＦＲを阻害をしないはずであるということである。下痢及び皮膚炎を含むゲフィチニブ治療の「副作用」は機能を必要とする正常組織におけるＥＧＦＲの阻害の結果であると一般的に思われているので、このことは意味がある。

別の実施態様によれば、化合物は、キナーゼドメインに少なくとも一つの相違があるＥＧＦＲをコードするヒト配列に特異的なアンチセンス分子である。投与治療剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に天然核酸からの化学修飾を有する合成オリゴヌクレオチド、又はＲＮＡなどのアンチセンス分子を発現する核酸構築物でもよい。アンチセンス配列は、標的ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する（例えば、Ｎｙｃｅ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７２０を参照されたい。）。アンチセンス分子は、ＲＮＡｓｅＨの活性化又は立体障害により、翻訳に利用できるｍＲＮＡの量を減少させることで遺伝子発現を阻害する。一つの又は複数のアンチセンス分子の組み合わせを投与することもできる。組み合わせは、単一の標的遺伝子とは異なる複数の異なる配列、又はいくつかの異なる遺伝子を補完する配列を含んでなることができる。

好ましい標的遺伝子は、キナーゼドメインに少なくとも一つの核酸の相違を有するＥＧＦＲである。一般的に、アンチセンス配列は、動物宿主と同じ起源の種を有する。

アンチセンス分子は、適切なベクターにおける標的遺伝子配列の全て又は一部分の発現により産生してもよい。ここで、ベクターは、標的細胞に導入し、発現させる。転写開始は、アンチセンス鎖をＲＮＡ分子として産生するように配向させる。アンチセンスＲＮＡは、内在センス鎖ｍＲＮＡとハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現をブロックする。天然転写開始領域又は外来転写開始領域を用いてもよい。

プロモーターは、生体外組換え法によるか、又は染色体への配列の相同組み込みの結果として導入してもよい。筋細胞中で活性である多くの強力なプロモーターは、βアクチンプロモーター、ＳＶ４０前期及び後期プロモーター、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター、レトロウイルスＬＴＲなどをはじめとして当該技術分野において公知である。転写ベクターは、一般的に核酸配列の挿入を提供するプロモーター配列付近に位置する都合のよい制限部位を有する。転写開始領域、標的遺伝子又はその断片、及び転写終結領域を含んでなる転写カセットを調製してもよい。転写カセットを、種々のベクター、例えば、プラスミド；レトロウイルス、例えば、レンチウイルス；アデノウイルス；等に導入してもよい。ここで，ベクターは、一時的又は安定的に、通常少なくとも約１日、より一般的には少なくともほぼ数日間、細胞に維持されることができるものである。

また、アプタマーも有用である。アプタマーは、有望な新しい種類の治療用オリゴヌクレオチド又はペプチドであり、生体外で、例えば、リガンド受容体などの高親和性を有する一定の標的に特異的に結合させるために選択される。それらの結合特性は、オリゴヌクレオチドが分子内核酸塩基対により一緒に保持される三次元構造を形成する能力を反映したものと思われる。アプタマーは、標的タンパク質、リガンド（脂質、炭水化物、代謝物質など）と相互作用する、正常及び改変されたものでもよい合成ＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチド配列（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、チオリン酸化ＤＮＡなど）である。さらなる実施態様によれば、変異体ＥＧＦＲに特異的なＲＮＡアプタマーを、治療法として細胞に導入するか、又は細胞で発現させることができる。

ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ある点では、オリゴヌクレオチド及びそれらの類似体と同様であり、したがって、ＤＮＡ及びＲＮＡに似ている化合物である。ＰＮＡにおいては、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース主鎖が、擬ペプチド主鎖により置き換えられている（Ｎｉｅｌｓｅｎ等、１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、１４５７−１５００）。各サブユニット又はモノマーは、この主鎖に結合して天然又は非天然核酸塩基を有している。一つのこのような主鎖は、アミド結合を介して連結したＮ（２−アミノエチル）グリシンの繰り返し単位から構成されている。ＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対及びヘリックスフォールドにより相補的核酸とハイブリダイズする。擬ペプチド主鎖により、優れたハイブリダイゼーション特性（Ｅｇｈｏｌｍ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６５、５６６−５６８）、酵素分解耐性（Ｄｅｍｉｄｏｖ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９４）４８、１３１０−１３１３）及び種々の化学修飾の利用（Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｈａａｉｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ （１９９７）７３−７８）が提供される。変異体ＥＧＦＲに特異的なＰＮＡは、治療手段として細胞に導入するか又は細胞中で発現できる。ＰＮＡは、例えば、米国特許出願第２００４００６３９０６号に記載されている。

好ましい実施態様によれば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブである。

第一工程において、本発明の第一の方法は、前記患者から単離された試料中におけるＢＲＣＡ１の発現レベルを測定することを含んでなる。

本明細書で使用される用語「試料」は、被験者から得ることができるいずれかの試料に関する。試料は、体液試料又は組織試料を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）からの種々の源から採取することができる。採取試料は、ヒト正常及び腫瘍試料、毛髪、血液、他の生体液、細胞、組織、器官又は体液、例えば、脳組織、血液、血清、唾液を含む痰、血漿、乳頭アスピラント（ｎｉｐｐｌｅ ａｓｐｉｒａｎｔ）、滑液、脳脊髄液、汗、尿、糞便、膵液、骨梁液（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、脳脊髄液、涙、気管支洗浄液、ぬぐい液（ｓｗａｂｂｉｎｇ）、気管支アスピラント（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｐｉｒａｎｔ）、***、前立腺液、前頸部液（ｐｒｅｃｅｒｖｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、膣液、および***前液（ｐｒｅ−ｅｊａｃｕｌａｔｅ）であることができるが、これらには限定されない。好適な組織試料として、種々の腫瘍又は癌組織、又は器官組織、例えば、生体検査で採取されるものなどがある。

特定の実施態様によれば、前記試料は、腫瘍細胞を含有するいずれかの試料、好ましくは腫瘍組織試料又はその一部分などである。好ましくは、前記腫瘍組織試料は、抗癌治療を受けているか、あるいは以前に受けたことがある、ＮＳＣＬＣを患っている被験者からの肺腫瘍組織試料である。前記試料は、関連医療技術における当業者に周知の方法を用いることにより、従来の方法、例えば、生体検査により得ることができる。生体検査からの試料を得る方法には、塊の粗分割（ｇｒｏｓｓ ａｐｐｏｒｔｉｏｎｉｎｇ)若しくは顕微解剖又は他の当該技術分野において知られている細胞分離法などがある。腫瘍細胞は、さらに穿刺吸引細胞診から得ることができる。試料の保存及び取扱いを単純化するために、これらを、ホルマリン固定且つパラフィン包埋するか、又は急速冷凍し、極低温媒体への浸漬により冷凍固化性媒体、例えば、ＯＣＴ化合物でまず凍結した後包埋することができる。

本明細書で使用される用語「発現レベル」又はその文法的に同等な用語は、被験者における核酸、例えば、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又は遺伝子のタンパク質の量の測定値、あるいは前記被験者における遺伝子若しくはタンパク質の活性レベルを意味する。

当業者が理解するように、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを求めることによるか、又は前記遺伝子によりコードされたタンパク質レベル、すなわち、ＢＲＣＡ１タンパク質を求めることにより測定できる。

したがって、特定の実施態様によれば、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを求めることにより測定される。

ＢＲＣＡ１遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するために、生体試料を処理して組織又は細胞構造を物理的又は機械的に破壊し、細胞内成分を水溶液又は有機溶液に放出してさらなる分析用の核酸を調製してもよい。核酸は、市販の試薬を用いて、当業者に知られている方法により試料から抽出される。次に、ＲＮＡを、当該技術分野における典型的な方法のいずれかにより凍結試料又は採取したばかりの試料から抽出する［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９）］。抽出過程中にＲＮＡが分解しないように注意することが好ましい。

発現レベルは、上記で定義した被験者から得たホルマリン固定、パラフィン包埋した組織試料から得たｍＲＮＡを用いて求めることができる。この場合、組織試料をまず脱パラフィンする。典型的な脱パラフィン法には、パラフィン包埋した試料を、例えば、キシレンなどの有機溶媒で洗浄することが含まれる。脱パラフィン試料は、低級アルコールの水溶液で再水和することができる。好適な低級アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールなどがある。脱パラフィン試料を、例えば、低級アルコール性溶液の濃度を減少させながら連続洗浄して元に戻すこともできる。別法として、試料を、同時に脱パラフィン及び再水和する。次に、試料を溶解し、ＲＮＡを試料から抽出する。

全ての遺伝子発現プロファイリング法（リアルタイム−ＰＣＲ、ＳＡＧＥ又はＴａｑＭａｎ（登録商標））が先述した本発明の態様を実施するのに好適であるが、ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）により求めることがよくある。検出は、個々の試料又は組織マイクロアレイで実施できる。

特定の実施態様によれば、ＢＲＣＡ１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、定量ＰＣＲ、好ましくはリアルタイム−ＰＣＲにより求める。

種々の試料のｍＲＮＡ発現値を正規化するために、試験試料における意図するｍＲＮＡの発現レベルとコントロールＲＮＡの発現とを比較することが可能である。本明細書で使用される「コントロールＲＮＡ」は、発現レベルが、非腫瘍形成細胞に対して腫瘍細胞において変化しないか又は限られた量だけ変化するＲＮＡに関する。好ましくは、コントロールＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子由来であり、構成的に発現され、必須細胞機能を果たすタンパク質をコードするｍＲＮＡである。本発明に使用されるハウスキーピング遺伝子としては、例えば、β−２−ミクログロブリン、ユビキチン、１８−Ｓリボソームタンパク質、サイクロフィリン、ＧＡＰＤＨ及びβ−アクチンなどが挙げられる。特定の実施態様によれば、コントロールＲＮＡは、β−アクチンｍＲＮＡである。一実施態様によれば、相対的遺伝子発現定量化を、内在性コントロールとしてのβアクチン及び標準物質としての市販のＲＮＡコントロールを使用する比較Ｃｔ法に準じて算出しておこなう。最終結果を、式 ２−（試料ΔＣｔ−標準物質ΔＣｔ）に準じて求める。ここで、標準物質と試料のΔＣＴ値は、βアクチン遺伝子のＣＴ値から標的遺伝子のＣＴ値を減ずることにより求める。

被験者間のばらつき（例えば、年齢、人種などに関する側面）のため、ＢＲＣＡ１遺伝子についての絶対的基準値を確立することは（ほとんど不可能ではないにせよ）極めて困難である。したがって、この場合、ＢＲＣＡ１遺伝子の「高」又は「低」発現についての基準値を、ＢＲＣＡ１の発現レベルについての正常被験者（すなわち、ＮＳＣＬＣと診断されていない人）から単離された試料群の試験を含む従来の手段により百分率を算出することにより求める。その結果、例えば、「高」レベルを、好ましくは、ＢＲＣＡ１遺伝子についての発現レベルが正規母集団において５０パーセンタイルと等しいかそれを超える試料、例えば、発現レベルが正規母集団における６０パーセンタイルと等しいかそれを超える試料、発現レベルが正規母集団における７０パーセンタイルと等しいかそれを超える試料、発現レベルが正規母集団における８０パーセンタイルと等しいかそれを超える試料、発現レベルが正規母集団における９０パーセンタイルと等しいかそれを超える試料、及び発現レベルが正規母集団における９５パーセンタイルと等しいかそれを超える試料に割り当てる。別の実施態様によれば、発現レベルは、中央値に対する値に従って、「高」又は「低」として割り当てられる。この中央値は、試料のより高い半分とより低い半分とを分離する値である。中央値を「高」発現レベル及び「低」発現レベルの患者を選択するためのカットオフ値として用いることにより、集団の最大半分が中央値よりも小さい値を有し、最大半分が中央値よりも大きい値を有している。

別の特定の実施態様によれば、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子によりコードされているタンパク質レベル、すなわち、ＢＲＣＡ１タンパク質を求めることにより測定される。

実際に、ＢＲＣＡ１タンパク質レベルを定量化するために、本発明の範囲内において、いずれかの従来の方法を使用することができる。前記タンパク質レベルは、従来の方法、例えば、ＢＲＣＡ１タンパク質（又は抗原決定基をを含むその断片）に特異的に結合する能力を有する抗体を用い、続いて得られた抗体−抗原複合体を定量化することにより定量することができるが、これには限定されない。

これらのアッセイで用いる抗体は、例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清又はモノクローナル抗体、抗体断片、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’ ｙ Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及びヒト化抗体であることができる。それに加えて、抗体を標識してもいいし、標識しなくてもよい。使用できるマーカーの具体例として、放射性同位元素、酵素、蛍光、化学発光試薬、酵素基質又は補因子、酵素阻害剤、粒子、着色剤などが挙げられるが、これらには限定されない。本発明に使用できる多種多様な周知のアッセイがある。これらのアッセイでは、非標識抗体（一次抗体）及び標識抗体（二次抗体）が使用される。これらの手法には、ウエスタンブロット若しくはウエスタントランスファ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ（酵素免疫測定）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学法及び免疫組織化学法、バイオチップの使用に基づく方法、特異的抗体を含むタンパク質マイクロアレイ、又はディップスティックなどの形式でのコロイド沈殿に基づく方法などが含まれる。ＢＲＣＡ１タンパク質を検出し且つ定量する他の方法には、アフィニティクロマトグラフィー、結合リガンドアッセイなどの方法などが挙げられる。

一方、ＢＲＣＡ１タンパク質レベルの測定は、集めた被験者試料を含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構成し、免疫組織化学法によりＢＲＣＡ１タンパク質レベルを測定することにより実施できる。免疫染色強度は、２人の異なる病理学者により評価され、方法の再現性を維持するために、均一で明確なカットオフ基準を用いて記録する。不一致は、同時再評価により解決できる。簡単に述べると、免疫染色の結果は、腫瘍細胞における発現及び各マーカーについての特異的カットオフを考慮して、陰性発現（０）、陽性発現については低発現（１＋）、中発現（２＋）及び高発現（３＋）で記録する。一般的基準として、再現性を容易にし、そして可能であれば、生物学的事象を説明するために、カットオフ値を選択した。

本明細書で使用される用語「ＢＲＣＡ１」又は「乳癌感受性遺伝子１」は、家族性乳癌との遺伝的関連に基づいて同定される腫瘍抑制遺伝子を指す。腫瘍抑制遺伝子は、正常細胞における２２０キロダルトンの核リンタンパク質をコードする。ヒトにおけるＢＲＣＡ１遺伝子の突然変異は、乳癌と卵巣癌へのなりやすさと関連している。実際、ＢＲＣＡ１突然変異及びＢＲＣＡ２突然変異は、家族性乳癌の大部分に関与している。ＢＲＣＡ１遺伝子及びＢＲＣＡ２遺伝子における遺伝性突然変異は、全ての乳癌及び卵巣癌のほぼ７〜１０％を占める。ＢＲＣＡ突然変異を有する女性は、乳癌の生涯リスクが５６〜８７％であり、卵巣癌の生涯リスクが２７〜４４％である。さらに、ＢＲＣＡ１遺伝子における突然変異は、種々の他の腫瘍、例えば、増殖性***疾患（ＰＢＤ）、腹膜の乳頭漿液性癌（ＰＳＣＰ）及び前立腺癌とも関連があるとされている（Ｓｃｈｏｒｇｅ等、Ｊ．Ｎａｔ． Ｃｃｅｒ／、９０：８４１−８４５（１９９８）；Ａｒａｓｏｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、５２：７１１−７１７（１９９３）；Ｌａｎｇｓｔｏｎ等、Ｎｅｗ Ｅ７Ｚｇ．Ｊ；Ｍｅｄ．、３３４：１３７−１４２（１９９６））。

第二工程では、本発明の第一の方法は、第一工程で得られたＢＲＣＡ１の発現レベルと標準試料とを比較することを含む。

本明細書で使用される用語「標準試料」、「コントロール試料」又はそれらの文法的に等価なものは、本発明の方法のための基準核酸又はタンパク質のソースとして使用される基準核酸又はタンパク質を含有する試料に関する。好ましい実施態様によれば、標準試料は、補助化学療法処置の前に得られた、肺癌被験者、好ましくはＮＳＣＬＣ被験者由来の腫瘍組織生検試料の同量をプールすることにより得られる。

次に、ＢＲＣＡ１核酸又はタンパク質レベルを前記標準試料で測定後、得られた値を試験試料におけるタンパク質又は核酸のレベルと比較する。これにより、試験試料を「低」発現、「通常」発現又は「高」発現として割り当てることができる。基準レベルを得る試料の採取は、好ましくは同種の癌、すなわち、ＮＳＣＬＣを患っている被験者から構成される。

本明細書で使用される表現「発現の低下」とは、一定の遺伝子の発現レベルが標準試料における発現レベルに対して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％あるいはそれを超える減少変化があることを指す。

本明細書で使用されている表現「発現の増加」とは、一定の遺伝子の発現レベルが標準試料における発現レベルに対して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％あるいはそれを超える増加変化があることを指す。

本明細書で使用される、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤での治療に言及したときの表現「陽性反応」とは、生理食塩水コントロール又はプラシーボを用いて得られた反応よりも実質的によい反応を指す。この反応は、（１）減速及び完全な成長停止を含む腫瘍成長のある程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの減少；（４）隣接する末梢器官及び／又は組織への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、減少、減速又は完全停止）；（５）転移の阻害；（６）腫瘍の退行又は拒絶を生じる可能性のある抗腫瘍免疫反応の高まり；（７）腫瘍と関連する一つ以上の症状のある程度の軽減；（８）治療後の生存期間の増加；及び／又は（９）治療後の一定の時点での死亡率の減少など（これらには限定されない）の患者に対するメリットを示す任意の評価項目を用いて評価できる。

また、陽性臨床反応も、臨床転帰の種々の測定値で表すことができる。また、陽性臨床転帰は、同等の臨床診断を有する患者集団の転帰に対する個人の転帰の関連で考えることができ、無再発期間（ＲＦＩ）の間における増加、集団における全生存期間（ＯＳ）と比較した生存時間の増加、無病生存期間（ＤＦＳ）の増加、遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）の増加などの種々の評価項目を用いて評価できる。陽性臨床反応の可能性の増加は、癌再発の可能性の減少に相当する。

ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤での治療に言及したときの、本明細書で使用される用語「陰性反応」は、治療により、評価されている癌の症状の減少がないか、あるいは治療されている癌の症状の増加を生じることを意味する。

本発明の第一の方法は、チロシンキナーゼ阻害剤が以前に化学療法で治療しなかった患者に一次治療として使用されるとき、及びＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が以前に通常の化学療法で治療したが、応答しなかったか、あるいは応答が停止した患者に二次治療として使用されるときの両方で、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する、ＥＧＦＲに少なくとも突然変異を有する肺癌患者の応答を予測するのに好適である。

本明細書で使用される用語「第一選択治療」又は「第一選択療法」は、当該技術分野において認識されている用語であり、一次治療又は一次療法とも称される外科治療及び／又は放射線治療と組み合わせてもよい癌の第一化学療法処置を指すものと理解される。肺癌の治療のための第一選択として使用することができる典型的な抗腫瘍化合物には、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びエトポシドなどの植物性アルカロイド；ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシンを含むアントラサイクリン系抗生物質；フルオロウラシル；ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、ダクチノマイシンを含む抗生物質；カンプトテシン及びその類似体などのトポイソメラーゼ阻害剤；並びにシスプラチン及びその類似体、例えば、カルボプラチンを含む白金化合物などがあるが、これらには限定されない。使用するのに好適な他の従来の化学療法剤は、当業者に知られており、アスパラギナーゼ、ブスファン（ｂｕｓｕｆｆａｎ）、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、リン酸エストラムスチンナトリウム、フロクシウリジン、フルオロウウラシル（５−ＦＵ）、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート（ＭＴＸ）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオグアニン、チオテパ、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビスグアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）及び硫酸ビンデシンなどが挙げられる。

本明細書で使用される用語「第二選択治療」又は「第二選択療法」は、当該技術分野において認識されている用語であり、初回又は一次治療（第一選択療法又は一次療法）の効力がないか、あるいは効力が停止したときにおこなわれる化学療法処置を指すと理解される。

本発明の治療法
本発明の発明者らは、驚くべきことに、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療に対する、ＥＧＦＲ受容体に少なくとも突然変異を有する肺癌患者の応答が、患者が当該患者から単離した試料中のＢＲＣＡ１レベルの減少を示すときに向上することを見出した。したがって、この結果は、患者が低ＢＲＣＡ１レベルを示すときは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を用いて、ＥＧＦＲ受容体に少なくとも突然変異を有する肺癌患者のより効果的な治療を可能とする。したがって、別の態様によれば、本発明は、肺癌の治療を必要とし、ＥＧＦＲ受容体に少なくとも突然変異を有する患者の肺癌の治療方法であって、ＢＲＣＡ１レベルの減少を示す患者にＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を投与することを含んでなる方法に関する。また、本発明によれば、ＢＲＣＡ１レベルの減少を示し且つＥＧＦＲ受容体に少なくとも突然変異を有する患者におけるＥＧＦＲ受容体に少なくとも突然変異を有する肺癌の治療に使用されるチロシンキナーゼ阻害剤が提供される。また、本発明によれば、ＥＧＦＲ受容体に少なくとも突然変異を有し且つＢＲＣＡ１レベルの減少を示す患者における肺癌の治療用医薬の製造のためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用が提供される。

本明細書で使用される用語「治療」又はその文法的に等価なものは、治療効果及び/又は予防効果が得られることを意味する。治療効果は、治療している基礎疾患が解消又は改善されることを意味する。また、治療効果は、患者が依然として基礎疾患に悩んでいるにもかかわらず基礎疾患に関連する生理的症状の一つ以上が解消又は改善して患者の改善が見られることで得られる。予防効果については、組成物を、特定の疾患が生じる恐れのある患者、あるいは疾患の診断がなされていない場合でも疾患の生理的症状の一つ以上が報告されている患者に投与することができる。

用語「肺癌」は、本発明の第一の方法に関連して上記で説明した。好ましい実施態様によれば、肺癌は、非小細胞肺癌である。

用語「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤」は、本発明の第一の方法に関連して詳細に説明した。好ましい実施態様によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブである。

好ましい実施態様によれば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲ遺伝子に一つ以上の突然変異を有する患者に投与される。肺腫瘍に一般的に見られるＥＧＦＲ遺伝子における突然変異は、本発明の第一の方法に関連して上記で定義したものである。好ましい実施態様によれば、ＥＧＦＲ突然変異は、Ｔ７９０Ｍ突然変異、Ｌ８５８Ｒ突然変異、エクソン１９における欠失又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましい実施態様によれば、患者は、チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を付与することが知られている、Ｌ８５８Ｒ突然変異及びエクソン１９における欠失、並びにチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を付与するＴ７９０Ｍ突然変異からなる群から選択される突然変異を一つ以上有する。

次に、チロシンキナーゼ阻害剤を、当該技術分野において知られているようなＢＲＣＡ１レベルの減少を示す患者に投与する。投与経路は、静脈内（ＬＶ）、筋肉内（ＬＭ）、皮下（ＳＣ）、皮内（ＩＤ）、腹腔内（ＬＰ）、くも膜下腔内（ＬＴ）、胸膜内、子宮内、直腸、膣内、局所的、腫瘍内などでよい。チロシンキナーゼ阻害剤は、注射によるか、あるいは時間をかけて徐々に点滴することにより非経口投与でき、蠕動手段により送達できる。

投与は、経粘膜的手段又は経皮的手段によるものでよい。経粘膜的投与又は経皮的投与には、バリア透過に適切な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は、当該技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜的投与については、胆汁塩及びフシジン酸誘導体などが挙げられる。さらに、洗浄剤を使用して浸透を容易にしてもよい。経粘膜的投与は、例えば、鼻内噴霧によるか、あるいは座剤を用いておこなってもよい。

経口投与の場合、チロシンキナーゼ阻害剤は、カプセル、錠剤及びトニックなどの通常の経口投与形態に製剤化する。

局所的投与の場合、医薬組成物（キナーゼ活性の阻害剤）を、当該技術分野において一般的に知られている外用軟膏剤、軟膏、ゲル剤又はクリーム剤に製剤化する。

典型的には、チロシンキナーゼ阻害剤を、例えば、単位投与量を注射することにより静脈内投与する。本発明の治療組成物に言及して使用するときの用語「単位投与量」は、被験者のための一回投与量として好適な物理的に個別な単位を指し、この場合の各単位は、必要とされる希釈剤、すなわち、担体又はビヒクルとの関連で、所望の治療効果を生じるように算出された所定量の活性物質を含有する。

組成物は、製剤と適合する方法で且つ治療的に有効な量で投与される。投与すべき量とタイミングは、治療される被験者、被験者のシステムが活性成分を利用する能力、及び所望の治療効果の程度により異なる。投与するのに必要とされる活性成分の正確な量は、専門家の判断により異なり、各個人に特有である。

本発明の方法を実施するのに有用なチロシンキナーゼ阻害剤は、本明細書に記載されている。当業者に一般的に知られているような、意図する使用に好適である活性成分を含有する製剤又は薬物送達システムを使用できる。経口、直腸、局所又は非経口（吸入、皮下、腹腔内、筋肉内及び静脈内を含む）投与に好適な薬学的に許容しうる担体は、当業者に知られている。担体は、製剤の他の成分と適合し、その受容者に有害ではない点で薬学的に許容しうるものでなければならない。

本明細書で使用される用語「薬学的に許容しうる」、「生理学的に許容しうる」及びそれらの文法的な変形は、組成物に言及したときには、担体、希釈剤及び試薬が相互交換可能に使用され、そしてこれらの物質が望ましくない生理学的効果を生じることなく哺乳動物に投与できることを表す。

非経口投与に好適な製剤は、都合のよいものとしては、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物の無菌水性製剤が挙げられる。したがって、このような製剤は、都合のよいものとしては、蒸留水、蒸留水にブトウ糖５％添加したもの又は生理食塩水を含有する。また、有用な製剤には、適切な溶媒で希釈すると上記非経口投与に好適な溶液となる、上記化合物を含有する濃縮液又は固形物などがある。

腸内投与の場合、化合物を、カプセル、カシェ剤、錠剤又はロゼンジなどの個別単位の不活性担体に配合できる。この場合、個別単位は、所定量の活性化合物を、粉末又は顆粒として、あるいは水性液体又は非水性液体における懸濁液又は溶液、例えば、シロップ、エリキシル、乳剤又はドラフトとして含有する。好適な担体は、澱粉又は糖であることができ、滑剤、矯味矯臭剤、バインダー及び同じ性質の他の物質などを含んでもよい。

錠剤は、必要に応じて一種以上の補助成分とともに、圧縮又は成形により作成することができる。圧縮錠剤は、好適な機械で、活性化合物を、易流動性形態、例えば、粉末又は顆粒剤で、必要に応じて補助成分、例えば、バインダー、滑剤、不活性希釈剤、表面活性又は分散剤と混合して、圧縮することにより調製できる。成形錠剤は、好適な機械で、活性化合物粉末といずれかの好適な担体との混合物を成形することにより調製できる。

シロップ又は懸濁剤は、活性化合物を糖、例えば、ショ糖の濃縮水溶液に添加（これにさらにいずれかの補助成分を添加してもよい）することにより調製できる。このような補助成分は、矯味矯臭剤、糖結晶化抑制剤又は他の成分の溶解度増加剤、例えば、多価アルコール、例えば、グリセロール又はソルビトールを含有してもよい。

直腸投与用製剤は、座剤の基剤用の通常の担体、例えば、ココアバター又はＷｉｔｅｐｓｏｌ Ｓ５５（ドイツ国のＤｙｎａｍｉｔｅ Ｎｏｂｅｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社の商標）を用いた座剤として提供してもよい。

経口投与製剤は、促進剤を用いて提供してもよい。経口的に許容しうる吸収促進剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、パルミトイルカミチン（ｃａｍｉｔｉｎｅ）、Ｌａｕｒｅｔｈ−９、ホスファチジルコリン、シクロデキストリン及びそれらの誘導体などの界面活性剤；デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム及びフシジン酸ナトリウムなどの胆汁塩；ＥＤＴＡ、クエン酸及びサリチル酸塩を含むキレート化剤；並びに脂肪酸類（例えば、オレイン酸、ラウリン酸、アシルカミチン、モノ及びジグリセリド）などがある。他の経口吸収促進剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ＣＨＡＰＳ（３−（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネ−ト）、Ｂｉｇ−ＣＨＡＰＳ（Ｎ、Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル)コールアミド）、クロロブタノール、オクトキシノール−９、ベンジルアルコール、フェノール類、クレゾール類及びアルキルアルコール類などがある。本発明にとりわけ好ましい経口吸収促進剤は、ラウリル硫酸ナトリウムである。

また、チロシンキナーゼ阻害剤は、リポソーム又は微小球（又は微小粒子）で投与してもよい。患者への投与用リポソーム及び微小球を調製する方法は、当業者に周知である。米国特許第４，７８９，７３４号（内容は、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる）は、リポソームにおける生物学的物質をカプセル化する方法を記載している。基本的には、物質を水溶液に溶解し、適切なリン脂質及び脂質を、必要ならば界面活性剤とともに添加し、必要に応じて透析するか、あるいは超音波処理する。既知の方法の再検討はＧ． Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ １４，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ” Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ(生物及び医学におるけ薬物担体)、ｐｐ．２８７−３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７９）により提供される。

ポリマー又はタンパク質から形成された微小球は、当業者には周知であり、胃腸管を介して直接血流に入るように作製できる。あるいは、化合物を組み入れ、微小球又は微小球の複合体を埋め込み、数日〜数カ月徐放させることもできる。例えば、米国特許第４，９０６，４７４号，第４，９２５，６７３号及び第３，６２５，２１４号並びにＪｅｉｎ、ＴＩＰＳ １９：１５５−１５７（１９９８）（これらに開示されている内容は、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる）を参照されたい。

一実施態様によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、静脈内投与後に毛細血管床にとどまる好適な大きさにしたリポソーム又は微粒子に製剤化することができる。リポソーム又は微粒子が虚血組織の周囲の毛細血管床にとどまるとき、薬剤は最も有効である部位に局所投与できる。虚血組織を標的とするのに好適なリポソームは、一般的に約２００ナノメータ未満であり、また典型的には、例えば、米国特許第５，５９３，６８８号（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ、発明の名称「Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｔｉｓｓｕｅ」（虚血組織のリポソーム標識）、（ここに開示されている内容は、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる）に開示されているように、単層ベシクルである。

好ましい微粒子は、ポリグリコリド、ポリラクチド及びそれらの共重合体などの生分解性ポリマーから調製されたものである。当業者は、所望の薬物放出速度及び所望の投与量などの種々の要因に応じて適切な担体システムを容易に決めることができる。

一実施態様によれば、製剤は、カテーテルを介して血管内に直接に投与される。投与は、例えば、カテーテルにおける穴を介して生じることができる。活性化合物の半減期が比較的長い（１日〜１週間あるいはそれ以上）これらの実施態様では、製剤は、生分解性高分子ヒドロゲル、例えば、米国特許第５，４１０，０１６号（Ｈｕｂｂｅｌｌ等）に開示されているようなものに含ませることができる。これらの高分子ヒドロゲルは、組織内腔内に送達され、ポリマーが分解するにつれて活性化合物が経時的に放出される。必要に応じて、高分子ヒドロゲルは、そこに分散された活性化合物を含む微粒子又はリポソームを有することができ、活性化合物を制御放出する別の機構が提供される。

製剤は、単位投与形態での提供が都合よく、薬学技術分野において周知である方法のいずれかにより調製できる。全ての方法は、活性化合物を一種以上の補助成分を構成する担体と関連される工程を含む。一般的に、製剤は、活性化合物を均一且つ均質に液状担体又は微細固体担体と関連させた後、必要に応じて生成物を成形して所望の単位投与形態とすることにより調製する。

製剤は、さらに医薬製剤の技術分野で利用されている一種以上の任意の補助成分、例えば、希釈剤、緩衝液、矯味矯臭剤、バインダー、界面活性剤、増粘剤、滑剤、懸濁剤、防腐剤（酸化防止剤）などを含むことができる。

本発明の方法の化合物は、気道への投与のために、噴霧器用鼻吸入剤、エアロゾル又は溶液、あるいは吹送用超微粒粉末として、単独又はラクトースなどの不活性担体と組み合わせて提供してもよい。このような場合、活性化合物の粒子は、直径が５０ミクロン未満が好適であり、１０ミクロン未満が好ましく、２〜５ミクロンがより好ましい。

一般的に、経鼻投与の場合、弱酸性ｐＨが好ましい。好ましくは、本発明の組成物のｐＨは、約３〜５であり、より好ましくは約３．５〜約３．９であり、最も好ましくは３．７である。塩酸などの適切な酸を添加することによりｐＨを調整できる。

活性成分を溶解又は分散して含有する薬理学的組成物の調製は、当該技術分野においてよく理解されており、製剤に基づいて制限する必要はない。典型的には、このような組成物は、溶液又は懸濁液の形態の注射可能物として調製されるが、使用前に液状溶液又は懸濁液にするのに好適な固形物を調製してもよい。製剤は、乳剤化することもできる。

活性成分は、薬学的に許容でき、活性成分と適合し、本明細書で記載されている治療法に使用するのに好適な量の賦形剤と混合できる。このような賦形剤として、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、必要に応じて、組成物は、活性成分の有効性を高める少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などを含有することができる。

本発明により投与されるチロシンキナーゼ阻害剤は、その成分の薬学的に許容しうる塩を含むことができる。薬学的に許容しうる塩としては、無機酸、例えば、塩酸若しくはリン酸、又は有機酸、例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸などにより形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基とともに形成される）などが挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄、及び有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導することもできる。

生理学的に許容しうる担体は、当業者に周知である。液状担体の典型的な例として、活性成分及び水の他に物質を含有しないか、あるいは生理学的ｐＨ値でのリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水又はそれらの両方、例えば、リン酸緩衝生理食塩水を含有する無菌水溶液がある。さらにまた、水性担体は、一種以上のの緩衝塩と、塩、例えば、塩化ナトリウム及び塩化カリウム、ブドウ糖、ポリエチレングリコール及び他の溶質とを含有することができる。

液状組成物は、水の他又は水を除外して液相を含有することもできる。このような追加の液相としては、グリセリン、植物油、例えば、綿実油及び油中水型エマルジョンなどがある。

チロシンキナーゼ阻害剤が、ＲＮＡ干渉（例えば、ｓｉＲＮＡ）に基づくものである場合、ｓｉＲＮＡは、生体外転写などを用いて化学合成して生成できる。さらに、ｓｉＲＮＡ分子を、腫瘍に確認される突然変異に正確に対応するように、個々の患者に合わせてカスタマイズすることができる。ｓｉＲＮＡは、単一ヌクレオチドだけしか異なっていないヌクレオチド配列間を識別できるので、単一のヌクレオチド置換又はいくつかのヌクレオチドの小さな欠失（両方とも本明細書に記載の腫瘍において確認されている）と関連しているＥＧＦＲ遺伝子の突然変異型を一意的に標的とするｓｉＲＮＡを設計することができる。

現在入手できるいくつかの遺伝子送達「ビヒクル」のいずれかにより、腫瘍にｓｉＲＮＡを送達できる可能性がある。これらには、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス及びレトロウイルス、並びに化学物質介在遺伝子送達システム（例えば、リポソーム）、あるいは機械的ＤＮＡ送達システム（ＤＮＡガン）などがある。このような遺伝子発現のｓｉＲＮＡ介在性阻害のために発現されるオリゴヌクレオチドは、長さが１８〜２８ヌクレオチドであろう。

本発明のキット
また、本発明によれば、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを同定し、さらにＥＧＦＲ遺伝子における突然変異の存在を同定するのに好適であり、同定後、肺癌を患っている患者からの試料を解析し、得られた結果に基づいて前記患者のための個別治療を設定することができるキットが提供される。したがって、別の態様によれば、本発明は、
（ｉ）ＢＲＣＡ１の発現レベルを検出するための試薬と、
（ｉｉ）ＥＧＦＲにおける少なくとも突然変異を検出する試薬と
を含んでなるキットに関する。

本明細書で使用される用語「キット」は、試料のプロセス、方法、アッセイ、分析又は操作を容易にする物品の組み合わせに関連して使用される。これらのキットにより、本発明において記載されている方法を実施するのに必要な器具が提供される。

キットの第一要素は、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを検出する一連の試薬である。

特定の実施態様によれば、キットの試薬は、ＢＲＣＡ１遺伝子によりコードされているｍＲＮＡのレベルを特異的に検出することができる。別の実施態様によれば、キットの試薬は、ＢＲＣＡ１タンパク質のレベルを特異的に検出することができる。

ＢＲＣＡ１遺伝子によりコードされているｍＲＮＡのレベルを特異的に検出できる薬剤は、
（ｉ）ＢＲＣＡ１遺伝子ヌクレオチド配列の断片を特異的に増幅できるオリゴヌクレオチドプライマー、及び
（ｉｉ）ＢＲＣＡ１遺伝子ヌクレオチド配列の断片に相補的なオリゴヌクレオチド プローブである。

当業者が理解するように、本発明のキットのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、遺伝子発現プロファイリングの全ての手法に使用することができる（ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＡＧＥ、ＴａｑＭａｎ、リアルタイム−ＰＣＲ等）。本発明のキットのプライマー及びプローブ形成部は、検出可能に標識してもよい。キットは、例えば、緩衝剤、防腐剤又はタンパク質安定剤を含んでなることもできる。キットは、さらに検出可能な標識（例えば、酵素又は基質）を検出するために必要な成分を含んでなることができる。また、キットは、評価され、試験試料と比較され得るコントロール試料又は一連のコントロール試料を含んでなることができる。キットの各要素は、個々の容器内に入れることができる。種々の容器の全てを、キットを用いて実施されたアッセイの結果を解釈するための説明書とともに、単一のパッケージに入れることができる。

ＢＲＣＡ１タンパク質の発現レベルを特異的に検出することができる薬剤は、ＢＲＣＡ１タンパク質（又は抗原決定基を含むその断片）に特異的に結合する能力を有する抗体である。本発明に用いられる抗体の例は、上記でとりあげた。本発明のキットの抗体は、タンパク質発現レベルを検出する通常の方法、例えば、ウエスタンブロット若しくはウエスタントランスファ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学法及び免疫組織化学法、バイオチップの使用に基づく方法、特異的抗体を含むタンパク質マイクロアレイ、又はディップスティックなどの形式でのコロイド沈殿に基づく方法などで使用できる。典型的には、キットは、ポリペプチド又は第一抗体に結合し、検出可能な標識にコンジュゲートする第二の異なる抗体を含んでなる。

キットの第二要素は、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異を検出するための一連の試薬である。試薬は、例えば、結合又はハイブリダイゼーションの違いにより、遺伝子の特定の形態又は特定の相違（単一または複数）の存在を識別することができるプローブでよい。したがって、典型的なプローブには、核酸ハイブリダイゼーションプローブ、ペプチド核酸プローブ、少なくとも一種のヌクレオチド類似体も含有するヌクレオチド含有プローブ、そして抗体、例えば、モノクローナル抗体及び本明細書に記載の他のプローブなどがある。当業者は、特定の特異性を有するプローブの調製に精通している。当業者は、種々の変数、例えば塩濃度、温度、ｐＨの変化、そしてＧＣ対ＡＴ塩基対の親和性の差異に影響する種々の化合物、例えば、塩化テトラメチルアンモニウムの添加など、を調整して遺伝子の二つの変異形態間の識別を最適化できる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新プロトコル）、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ． Ｂｒｅｎｔ、Ｒ． Ｅ． Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ．Ｄ． Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ｇ． Ｓｅｉｄｍａｎ、Ｋ Ｓｔｒｕｈｌ及びＶ．Ｂ． Ｃｈａｎｄａ （編者）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ参照）。このような核酸ハイブリダイゼーションプローブは、二つ以上の相違する部位に及ぶことがある。特記のない限りは、核酸プローブは、塩基対の機能が保持される限りは、一つ以上の核酸類似体、標識又は他の置換基若しくは部分を含むことができる。

当業者は、キットの第二要素の性質がＥＧＦＲ遺伝子における突然変異を同定するのに使用される方法により異なることは理解するであろう。

検出をディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法により実施する場合、試薬は、例えば、結合又はハイブリダイゼーションの違いにより、特定の遺伝子の形態又は特定の相違（単一または複数）の存在を識別できるプローブであることができる。したがって、典型的なプローブには、核酸ハイブリダイゼーションプローブ、ペプチド核酸プローブ、少なくとも一種のヌクレオチド類似体も含有するヌクレオチド含有プローブ、そして抗体、例えば、モノクローナル抗体及び本明細書に記載の他のプローブなどがある。当業者は、特定の特異性を有するプローブの調製に精通している。当業者は、種々の変数、例えば塩濃度、温度、ｐＨの変化、そしてＧＣ対ＡＴ塩基対の親和性の差異に影響する種々の化合物、例えば、塩化テトラメチルアンモニウムの添加などを調整して遺伝子の二つの変異形態間の識別を最適化できる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新プロトコル）、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ． Ｂｒｅｎｔ、Ｒ．Ｅ． Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ．Ｄ． Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ｇ． Ｓｅｉｄｍａｎ、Ｋ Ｓｔｒｕｈｌ及びＶ．Ｂ． Ｃｈａｎｄａ （編者）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ参照）。このような核酸ハイブリダイゼーションプローブは、二つ以上の相違する部位に及ぶことがある。特記のない限りは、核酸プローブは、塩基対の機能が保持される限りは、一つ以上の核酸類似体、標識又は他の置換基若しくは部分を含むことができる。

検出が、ハイブリダイゼーションの前に、標的核酸の増幅をおこなうものである場合、キットは、遺伝子の一つ以上の保存領域に対応し、標的配列、プライマーを増幅するための縮重プライマーを含む、ＰＣＲ又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）をおこなうのに適している試薬（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ等、１９８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａ等、１９９４ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９１：３６０−３６４参照）を含んでなる。

別の増幅法には、以下の方法などがある：自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ等、１９９０．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７： １８７４−１８７８参照）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ等、１９８９．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：１１７３−１１７７参照）；Ｑｂレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ等、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７参照）又はいずれかの他の核酸増幅法。増幅後、当業者に周知の手法を用いて、増幅された分子を検出する。これらの検出スキームは、このような分子が極めて少ない数で存在する場合には、核酸分子の検出にとりわけ有用である。

本発明に有用なプライマーは、タンパク質のアミノ酸配列又はＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインの核酸配列をガイドとして用いて設計される。プライマーは、遺伝子の相同領域において設計される。ここで、ホモロジーの少なくとも２つの領域は、可変配列の分岐領域により分離されており、配列は長さ又は核酸配列において可変である。例えば、同一又は高度の相同性は、少なくとも約６以上、好ましくは少なくとも８〜１０以上の連続するアミノ酸の好ましくは少なくとも８０％〜８５％以上、より好ましくは少なくとも９０〜９９％以上のアミノ酸配列が相同である。最も好ましくは、アミノ酸配列は、１００％同一である。順方向プライマー及び逆方向プライマーは、知られている遺伝子ファミリーに属するもののうち、一定の位置でのコドン縮退の維持及び種々のアミノ酸の表示に基づいて設計される。本明細書で言及している相同性の程度は、標準配列比較ソフトウエア、例えば、デフォルト設定を用いたタンパク質−ＢＬＡＳＴを用いたアミノ酸配列の分析に基づいている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）。

プライマーは、当業者に知られている標識を用いて標識できる。このような標識には、放射性標識、蛍光標識、染料標識及び酵素標識などがあるが、これらに限定されない。

別の実施態様によれば、試料細胞からのＥＧＦＲ遺伝子における突然変異は、制限酵素切断パターンにおける変化によって同定できる。この場合、本発明のキットは、野生型及び突然変異型ＥＧＦＲ遺伝子を識別することができる制限エンドヌクレアーゼをさらに含んでなる。

ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異を検出する他の方法には、切断剤からの保護を使用してＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法などがある。例えば、Ｍｙｅｒｓ等、１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１２４２を参照されたい。一般的に、「ミスマッチ切断」の当該技術分野の方法では、最初に野生型ＥＧＦＲ配列を含有する（標識された）ＲＮＡ又はＤＮＡを、組織試料から得た突然変異の可能性のあるＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイズさせることにより形成されたヘテロ二本鎖を提供する。二本鎖を、コントロール鎖と試料鎖との間の塩基対のミスマッチのため存在する、二本鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処置してミスマッチ領域を酵素的に消化することができる。他の実施態様によれば、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を、ヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウムで処理し、そしてピペリジンで処理してミスマッチ領域を消化できる。ミスマッチ領域を消化後、得られた物質を、変性ポリアクリルアミドゲルによりサイズで分離して突然変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ等、１９８８．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａ等、１９９２．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照されたい。一実施態様によれば、コントロールＤＮＡ又はＲＮＡを、検出のために標識することができる。

さらに別の実施態様によれば、ミスマッチ切断反応では、細胞の試料から得たＥＧＦＲ ｃＤＮＡにおける点突然変異を検出し且つマッピングするための規定されたシステムにおいて、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する一種以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を用いる。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチでＴを切断する。例えば、Ｈｓｕ等、１９９４．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１５：１６５７−１６６２を参照されたい。典型的な実施態様によれば、突然変異ＥＧＦＲ配列に基づくプローブ、例えば、ＤＥＬ−１〜ＤＥＬ−５、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ８５７Ｖ、Ｌ８８３Ｓ又はＬ８５８Ｒ ＥＧＦＲ配列を、試験細胞由来のｃＤＮＡ又は他のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。二本鎖を、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、切断産物がある場合には、電気泳動プロトコルなどから検出できる。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照されたい。

他の実施態様によれば、電気泳動移動度の変化を使用してＥＧＦＲ遺伝子における突然変異を同定する。例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を使用して突然変異体と野生型核酸との間の電気泳動移動度の差異を検出する。例えば、Ｏｒｉｔａ等、１９８９． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ、１９９３． Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ、１９９２． Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ．９：７３−７９を参照されたい。試料の一本鎖ＤＮＡ断片及びコントロールＥＧＦＲ核酸を変性し、そして再生させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列により異なり、得られた電気泳動移動度の変化により、単一塩基の変化であっても検出できる。ＤＮＡ断片は、標識してもよいし、あるいは標識されたプローブを用いて検出してもよい。アッセイの感度は、二次構造が配列の変化に対する感度がより高いＲＮＡ(ＤＮＡではなく)を使用することにより高めることができる。一実施態様によれば、対象の方法では、ヘテロ二本鎖解析を利用して、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロ二本鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎ等、１９９１． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照されたい。

さらに別の実施態様によれば、濃度勾配を有する変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける突然変異体又は野生型断片の移動を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）を用いて評価する。例えば、Ｍｙｅｒｓ等、１９８５． Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用するとき、例えば、ＰＣＲによって高融点ＧＣリッチＤＮＡの約４０ｂｐのＧＣクランプを添加することにより、完全に変性しないようにＤＮＡを修飾する。さらなる実施態様によれば、変性剤濃度勾配の代わりに温度勾配を使用して、コントロールＤＮＡ及び試料ＤＮＡの移動度の差異を同定する。例えば、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ及びＲｅｉｓｓｎｅｒ、１９８７． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１２７５３を参照されたい。

点突然変異を検出する他の手法として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅又は選択的プライマー伸長などがあるが、これらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の突然変異が中央に配置された後、標的ＤＮＡに、完全一致の場合にのみハイブリダイズできる条件下でハイブリダイズさせて調製できる。例えば、Ｓａｉｋｉ等、１９８６． Ｎａｔｕｒｅ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉ、等、１９８９． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６２３０を参照されたい。オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション膜に結合し、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズしたときには、このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡ又は多数の異なる突然変異にハイブリダイズ。

好ましい実施態様によれば、本発明時のキットは、Ｔ７９０Ｍ突然変異、Ｌ８５８Ｒ突然変異、エクソン１９における欠失又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異を同定するための試薬を含んでなる。

キットに存在することができる別の要素は、試薬を定められた境界内に維持することができる充填材である。このような充填材を調製するのに好適な材料には、ガラス、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、サッシェなどがある。本発明のキットは、さらに本発明の方法において試薬を使用するための説明書を含んでなることができる。前記説明書は、印刷物又は電子サポートの形態であることができる。電子サポートの形態の場合、被験者によって説明書を、電子記憶媒体（磁気ディスク、テープなど）、光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）などで読み取られることができるように保存することができる。媒体は、追加的に又はその代りに、前記説明書を提供するインターネットウエブサイトを含んでなることができる。

一実施態様によれば、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベル及び固体支持体上のｅｒｂＢ１のキナーゼドメインにおける相違の検出用キットが提供される。キットは、例えば、一つのアッセイにおいて複数の相違を検出するための材料及び試薬を含んでなることができる。キットは、例えば、固体支持体、特異的な一連の標的ポリヌクレオチド用オリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ連鎖反応試薬及び成分、例えば、ＤＮＡ合成用酵素、標識物質及び他の緩衝液及び洗浄試薬を含んでなることができる。また、キットは、固体支持体上で特異的標的を増幅するためにキットを使用するための説明書を含んでなることもできる。キットが、例えば、特定の一連の標的ポリヌクレオチドを増幅するために、予め個体支持体上に固定された一連のプライマーを有する調製された固体支持体を含んでなる場合、このような調製された固体支持体の設計及び構成は、上記で説明した通りである。また、キットは、支持体がイン・サイチュ型ＰＣＲ装置を用いてＰＣＲ増幅できる、例えば、イン・サイチュ型又は固相型ＰＣＲ法を用いて固体支持体上でＰＣＲをおこなうのに必要な試薬を含んでなる。キットに含まれるＰＣＲ試薬は、通常のＰＣＲ緩衝液、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）並びに他の成分及び標識分子（例えば、上記した直接又は間接標識）を含んでなる。キットは、固定化プライマーを単独又は溶液相プライマーとともに用いてＰＣＲ増幅法を実施するように組み立てることができる。あるいは、キットは、ＢＲＣＡ１に特異的なオリゴヌクレオチドを固定した固体支持体及び上記で定義したいずれかの数のＥＧＦＲ相違を含んでなることができる。試験用生体試料は、ＢＲＣＡ１発現レベルの測定及びＥＧＦＲにおける突然変異の有無の判定のために、選択的ハイブリダイゼーション条件下で固体支持体に適用できる。

本発明の固相支持体は、ヌクレオチドハイブリダイゼーション及び合成をサポートするのに好適ないずれかの固体物質及び構造のものであることができる。好ましくは、固相支持体は、少なくとも一つの実質的に剛性な表面であって、上にオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドプライマーを固定できる表面を含んでなる。固相支持体は、例えば、ガラス、合成ポリマー、プラスチック、硬質非メッシュナイロン又はセラミックで作製することができる。他の好適な固体支持体材料は知られており、当業者は容易に入手できる。固体支持体のサイズは、ＤＮＡマイクロアレイ技術に有用な標準的マイクロアレイサイズのいずれかであることができ、サイズは本発明の反応を行うために使用される特定の機械に合うように調整してもよい。オリゴヌクレオチドを固定するための固相支持体を誘導体化するための方法および材料は、当業者に知られており、例えば、米国特許第５，９１９，５２３号（開示の内容は、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる）に記載されている。

固体支持体は、流体が入った容器内に提供してもよいし、あるいは流体が入った容器の一部であることもできる。例えば、固体支持体は、支持体上にポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を封じ込めるように、固体支持体の縁に沿って密閉状態にする側面を有しているチャンバー内に配置することができる。具体例を挙げると、チャンバーは、矩形の支持体のそれぞれの側部に壁を有していて、ＰＣＲ混合物が確実に支持体上に残るように、さらに全表面がプライマーを提供するのに有用であるようになっている。

本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドプライマーは、固体支持体上の特定の位置にオリゴヌクレオチドを固定（ｆｉｘ）し、固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）し、設け及び／又は適用するための任意の利用可能な手段を使用して、貼り付け、固定化し、設け及び／又は適用される。たとえば、米国特許第５，９１９，５２３号、第５，８３７，８３２号、第５，８３１，０７０号及び第５，７７０，７２２号（これらは、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる）に記載されているように、フォトリソグラフィー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、 Ｃａｌｉｆ．）を使用してチップまたは固体支持体上の特定の位置にオリゴヌクレオチドプライマーを適用することができる。また、オリゴヌクレオチドプライマーは、米国特許第５，８０７，５２２号（ＢｒｏｗｎおよびＳｈａｌｏｎ、１９９８）に記載されているように固体支持体に適用してもよい。さらに、プライマーは、Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ、 Ｍａｓｓ．）、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、Ｃａｌｉｆ．）又はＣａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆ．）によって製造されるものなどのロボットシステムを使用して固体支持体に適用してもよい。

本発明の一態様によれば、生体試料由来の標的ポリヌクレオチドの固相増幅であって、複数のオリゴヌクレオチドプライマー群が固相支持体上に固定される固相増幅がおこなわれる。好ましい実施態様によれば、群内のプライマーは、配列が同一であり、標的ポリヌクレオチドの規定された配列に対して相補的であり、適切な条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、そして核酸合成（すなわち、鎖伸長又は延長）のための初期プライマーとして好適である第一の一連のプライマーを少なくとも含んでなる。参照配列の特定の領域をカバーする選択されたプライマーを、群として、個別の位置にて、固体支持体上に固定する。好ましくは、群間の距離は、増幅産物を検出するために使用される検出手段の分解能よりも大きい。好ましい実施態様によれば、プライマーを固定してマイクロアレイまたはチップを形成し、これを自動化処理により処理及び分析することができる。固定したプライマーは、核酸増幅手段に好適な条件下での標的ポリヌクレオチドの固相増幅に使用される。このようにして、ｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおける種々の潜在的相違の有無を、1つのアッセイ法で決定することができる。

マイクロアレイ上のイン・サイチュ型ＰＣＲ反応は、実質的に、例えば、Ｅｍｂｒｅｔｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：３５９−３６２（１９９３）；Ｇｏｓｄｅｎ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５（１）：７８−８０（１９９３）；Ｈｅｎｉｆｏｒｄ等 Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１（１４）：３１５９−３１６６ （１９９３）；Ｌｏｎｇ等、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９９：１５１−１６２ （１９９３）；Ｎｕｏｖｏ等、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２（４）：３０５−３１２（１９９３）；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ等 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９７６−９７９（１９９３）に記載されているようにおこなうことができる。

あるいは、ｅｒｂＢ１のキナーゼドメインにおける相違は、支持体上でＰＣＲを実施することなく、固相法によって決定することができる。それぞれがｅｒｂＢ１のキナーゼドメインに明確な相違を含む複数のオリゴヌクレオチドプローブを、二組、三組又は四組で固相支持体に結合してもよい。試験生体試料における相違の有無は、当業者に知られており且つ上記した選択的ハイブリダイゼーション法によって検出してもよい。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、単に実例を示すだけであり、本発明の範囲を限定するものではない。

患者
２１７人のＥＧＦＲ突然変異を有する非小細胞肺癌患者を、スペイン肺癌グループプログラム１の一部分としてエルロチニブで予め治療した。治療前腫瘍組織が得られた１２９人の患者について、Ｔ７９０Ｍ突然変異が存在するかどうかを調査した。これらの患者についての臨床所見及び反応（表１）は、２１７人全ての患者における所見及び反応と同様であった。Ｔ７９０Ｍは、４５人の患者（３５％）に見られた。Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する患者と突然変異のない患者の間には、所見又は初期反応において差がなかった（表１）。

無進行期間及び全生存期間
無進行生存期間の中央値は、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する患者では１２カ月（９５％ＣＩ、７．６〜１６．４）であり、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有しない患者では１８カ月（９５％ＣＩ、１４．１〜２１．９；Ｐ＝０．０５）であった（図１）。全生存期間はＴ７９０Ｍ突然変異を有する患者では２７カ月（９５％ＣＩ、１４．９〜３９）であり、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有しない患者では２９カ月（９５％ＣＩ、２４．８〜３３．２；Ｐ＝０．４７）であった。

ｄｅｌ１９を有する患者８１人からなるサブグループでは、無進行生存期間は、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する患者では１２カ月（９５％ＣＩ、７．８〜１６．２）であり、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有しない患者では２０カ月（９５％ＣＩ、１２．９〜２７．１；Ｐ＝０．０３）であった（図２Ａ）。Ｌ８５８Ｒを有する患者４８人からなるサブグループでは、無進行生存期間は、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する患者では１６カ月（９５％ＣＩ、６．３〜２６．６）であり、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有しない患者では１５カ月（９５％ＣＩ、１０．３〜１９．７；Ｐ＝０．８３）であった（図２Ｂ）。一次治療としてエルロチニブ処置した患者６５人からなるサブグループでは、無進行生存期間は、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する患者では８カ月（９５％ＣＩ、３．５〜１２．５）であり、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有しない患者では１８カ月（９５％ＣＩ、１３．２〜２２．７；Ｐ＝０．０４）であった（図２Ｃ）。二次治療としてエルロチニブ処置した患者６４人からなるサブグループでは、無進行生存期間は、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する患者では１３カ月（９５％ＣＩ、９．４〜１６．６）であり、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有しない患者では１８カ月（９５％ＣＩ、９．９〜２６．１；Ｐ＝０．３５）であった（図２Ｄ）。

多変量解析では、不良無進行生存期間との関連は、Ｔ７９０Ｍ突然変異の存在（危険率、１．９；９５％ＣＩ、１．１〜３．６；Ｐ＝０．０２）、男性（危険率、２．９；９５％ＣＩ、１．３〜５．１；Ｐ＝０．００６）、二次治療としてのエルロチニブ（危険率、０．４８；９５％ＣＩ、０．２６〜０．８９；Ｐ＝０．０２）及び現喫煙者（危険率、３；９５％ＣＩ、１．２〜７．８；Ｐ＝０．０２）との間にみられた（表２）。

生存期間についての多変量解析では、短生存期間と、二次治療としてのエルロチニブ（危険率、０．４８；９５％ＣＩ、０．２６〜０．８９；Ｐ＝０．０２）及びＥＣＯＧパフォーマンスステータス２（危険率、３．３１；９５％ＣＩ、１．２４〜８．８１；Ｐ＝０．０２）との間に関連があった（表３）。

ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡ発現レベル
エルロチニブに対するＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡの発現と、Ｔ７９０Ｍステータスと、臨床転帰との間の関係を、Ｔ７９０Ｍ突然変異解析を実施した後でも十分な治療前腫瘍組織が入手できた１２９人の患者のうちの８１人について評価した。これらの患者８１人におけるエルロチニブに対する所見及び初期反応は、全ての患者１２９人における所見及び初期反応と同様であった。Ｔ７９０Ｍ突然変異の有無による遺伝子発現レベルの差はなかった（表４）。表５及び表６は、ＢＲＣＡ１発現レベルによるＴ７９０Ｍ突然変異を有する患者及び有しない患者の所見を示す。

エルロチニブに対する無進行生存期間中央値は、低ＢＲＣＡ１レベルの患者では２７カ月（９５％ＣＩ、２１．３〜３２．７）であり、中ＢＲＣＡ１レベルの患者では１８カ月（９５％ＣＩ、６．３〜２９．７）であり、高ＢＲＣＡ１レベルの患者では１０カ月（９５％ＣＩ、６．７〜１３．３）であった（Ｐ＝０．０２）（図３）。全生存期間は、低ＢＲＣＡ１レベルの患者では３３カ月（９５％ＣＩ、２８．３〜３７．６）であり、中又は高ＢＲＣＡ１レベルの患者では得られなかった（Ｐ＝０．１８）（図４）。

Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する患者２８人では、無進行生存期間中央値は、低ＢＲＣＡ１レベルの患者では１９カ月（９５％ＣＩ、０〜４１．２）であり、中ＢＲＣＡ１レベルの患者では４カ月（９５％ＣＩ、０〜１１．７）であり、高ＢＲＣＡ１レベルの患者では８カ月（９５％ＣＩ、０〜２０．２）であった（Ｐ＝０．１５）（図５Ａ）。Ｔ７９０Ｍ突然変異を有しない患者５３人では、無進行生存期間中央値は、低ＢＲＣＡ１レベルの患者では２７カ月であり、中ＢＲＣＡ１レベルの患者では得られず、高ＢＲＣＡ１レベルの患者では１２カ月（９５％ＣＩ、５．６〜１８．４）であった（Ｐ＝０．１５）（図５Ｂ）。一次治療としてエルロチニブ処置した患者４７人からなるサブグループでは、無進行生存期間は、低ＢＲＣＡ１レベルの患者では２７カ月（９５％ＣＩ、１７〜３６．９）であり、中ＢＲＣＡ１レベルの患者では９カ月（９５％ＣＩ、３．７〜１４．３）であり、高ＢＲＣＡ１レベルの患者では１６カ月（９５％ＣＩ、８．５〜２３．５）であった（Ｐ＝０．０９）（図５Ｃ）。一次治療としてエルロチニブ処置した患者３４人からなるサブグループでは、無進行生存期間は、低ＢＲＣＡ１レベルの患者では得られず、中ＢＲＣＡ１レベルの患者では２４カ月であり、高ＢＲＣＡ１レベルの患者では９カ月（９５％ＣＩ、３．６〜１４．４）であった（Ｐ＝０．０１）（図５）。

多変量解析（Ｔ７９０Ｍ、性別、パフォーマンスステータス、喫煙歴、ｄｅｌ１９対Ｌ８５８Ｒ、一次対二次治療、脳又は骨転移の有無及びＢＲＣＡ１ｍ ＲＮＡレベルを含む）では、短無進行生存期間と、Ｔ７９０Ｍ突然変異の存在（危険率、３．９６；９５％ＣＩ、１．７７〜８．８９；Ｐ＝０．００１）、男性（危険率、３．１８；９５％ＣＩ、１．３１〜７．６９；Ｐ＝０．０１）、脳転移の存在（危険率、４．５５；９５％ＣＩ、１．５５〜１３．６２；Ｐ＝０．００６）、中ＢＲＣＡ１レベル（危険率、４．３６；９５％ＣＩ、１．４６〜１３．１０；Ｐ＝０．００８）及び高ＢＲＣＡ１レベル（危険率、５．８１；９５％ＣＩ、１．９６〜１７．１９；Ｐ＝０．００１）との間に関連性があった（表７）。生存期間についての多変量解析において、より短い生存期間と、パフォーマンスステータス１（危険率、１０．１；９５％ＣＩ、１．８５〜５５．１６；Ｐ＝０．００８）及び高ＢＲＣＡ１レベル（危険率、５．２０；９５％ＣＩ、１．１８〜２２．８４；Ｐ＝０．０３）との間に関連性があった（表８）。

要約すれば、本発明の発明者らは、ＢＲＣＡ１の発現レベルを、肺癌を患い且つＥＧＦＲ遺伝子において少なくとも突然変異を有する患者におけるバイオマーカーとして使用して、前記患者のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する反応を予測することができることを見出した。耐性Ｔ７９０Ｍ突然変異の存在及びＢＲＣＡ１の発現レベルによる、エルロチニブに対する感受性を与えるＥＧＦＲにおける少なくとも突然変異を有する患者のＴＴＰ（進行までの期間）を、表９に示す。

Claims (17)

1. 肺癌を患っている患者であり、かつＥＧＦＲ遺伝子における突然変異を少なくとも有する患者のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答を予測する方法であって、
   （ｉ）前記患者から単離した試料中のＢＲＣＡ１の発現レベルを測定する工程と、
   （ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＢＲＣＡ１の発現レベルを標準試料と比較する工程と
   を含んでなり、
   標準試料と比較してＢＲＣＡ１の発現レベルが減少した場合には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤での治療に対して応答が良好であることを示しており、
   標準試料と比較してＢＲＣＡ１の発現レベルが増加した場合には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤での治療に対して応答が不良であることを示しているとすることを特徴とする、方法。
2. 前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、一次化学療法又は二次化学療法として使用されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ＥＧＦＲ遺伝子における前記少なくとも一つの突然変異が、チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性を与える突然変異、及びチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を与える突然変異からなる群から選択されるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記患者が、チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性を与える突然変異と、チロシンキナーゼに対して耐性を与える突然変異とをＥＧＦＲ遺伝子において同時に有していることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性を与えるＥＧＦＲ遺伝子における突然変異が、Ｌ８５８Ｒ突然変異及びエクソン１９におけるＥＬＲＥＡ欠失からなる群から選択されるものであり、及び／又は、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を与える突然変異が、Ｔ７９０Ｍ突然変異である、請求項５又は６に記載の方法。
8. 前記試料が、腫瘍細胞を含有してなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 肺癌の治療に使用されるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であって、治療すべき患者が、低ＢＲＣＡ１発現レベルを示し、かつＥＧＦＲ遺伝子において少なくとも突然変異を有している患者である、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤。
10. 前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項８に記載のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤。
11. 前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブである、請求項９に記載のＥＧＦＲチロシンキナーゼ。
12. 請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であって、
    前記ＥＧＦＲ遺伝子における少なくとも一つの突然変異が、チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性を与える突然変異、及びチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を与える突然変異からなる群から選択されるものである、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤。
13. 前記患者が、チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性を与える突然変異と、チロシンキナーゼに対して耐性を与える突然変異とをＥＧＦＲ遺伝子において同時に有している患者である、請求項１１に記載のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤。
14. チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性を与えるＥＧＦＲ遺伝子における突然変異が、Ｌ８５８Ｒ突然変異及びエクソン１９におけるＥＬＲＥＡ欠失からなる群から選択されるものであり、及び／又は、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を与える突然変異がＴ７９０Ｍである、請求項１２に記載のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤。
15. 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、一次化学療法又は二次化学療法として使用される、請求項８〜１３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤。
16. （ｉ）ＢＲＣＡ１の発現レベルを検出する試薬と、
    （ｉｉ）ＥＧＦＲにおける少なくとも突然変異を検出する試薬と
    を含んでなるキット。
17. 前記ＥＧＦＲ突然変異が、Ｔ７９０Ｍ突然変異、Ｌ８５８Ｒ突然変異、エクソン１９におけるＥＬＲＥＡ欠失又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１５に記載のキット。

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