JP2012526805A - リシン化合物並びにペプチド及びタンパク質の部位選択的及び官能基選択的修飾におけるそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
[式中、−X−は(i)硫黄又は(ii)セレンを表し、−P1及び−P2は、独立して、(i)水素又は(ii)アミン保護基を表し、−P3は、(i)水素;(ii)式−X−R6で表されるアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキルセレノ又はアルケニルセレノ基(式中、−R6は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す);(iii)チオール又はセレノール保護基;或いは(iv)−R5部分又は(v)式−C(=O)−R5’で表される部分を表し、−R5及び−C(=O)−R5’は、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される、共有結合したリガンドの残基を表し、−R7は、(i)水素或いは(ii)場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す]、又は前記リシン化合物のエステル、塩、溶媒和物、若しくは水和物に関する。
[式中、
−R1は、(i)水素;(ii)式(Ia)及び(Ib)に関して本明細書で以上に定義した−P1;又は(iii)式−C(=O)−R5’で表される部分を表し、−R1’は、式−C(=O)−R5’で表される部分を表し、−R2は、(i)水素;(ii)式(Ia)及び(Ib)に関して本明細書で以上に定義した−P2;(iii)C→Nポリペプチド鎖又は(iv)式−C(=O)−R5’で表される部分を表し、−R3は、(i)水素;(ii)式(Ia)及び(Ib)に関して本明細書で以上に定義した−P3;(iii)−R5部分;又は(iv)式−C(=O)−R5’で表される部分を表し、−R4は、(i)−OH又は(ii)N→Cポリペプチド鎖を表し、−X−は(i)硫黄又は(ii)セレンを表し、−R5及び−C(=O)−R5’は、式(Ia)及び(Ib)に関して本明細書で以上に定義した意味と同じ意味を有し、−R7は、(i)水素又は(ii)場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す、但し、それぞれの式において、−R2及び−R4の少なくとも一方は、ポリペプチド鎖を表すことを条件とする。
一般試薬は、Sigma Aldrich、Fluka及びAcrosから入手し、精製をさらに行うことなく使用した。H−DL−δ−ヒドロキシ−DL−Lys−OH・HClはBachemから、(5R)−5−ヒドロキシ−L−リシン二塩酸塩一水和物はSigma Aldrichから購入した。ユビキチンはBIOMOLから購入した。SUMOタンパク質1及び2、ユビキチン用のE1(UBA)、並びにSUMO(AOS1−SAE2ダイマー)は、Prof.Titia Sixmaのグループ(NKI−AVL)からの寄贈であった。V50(2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩)はSigma Aldrichから購入し、VA−044(2,2’−アゾビス[2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン]二塩酸塩)は、和光純薬工業(Wako Pure Chemical Industries)(日本)から購入した。溶媒は、BIOSOLVE及びAldrichから購入し、必要な場合はモレキュラーシーブ(DCM、DMFについては4Å、MeOHについては3Å)で終夜乾燥した。分析用薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル60F254でプレコーティングしたアルミニウムシートで行い、エタノール中20%ニンヒドリンを使用し、ヒートガンで加熱した。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル(0.035〜0.070mm、90Å、Acros)で実施した。核磁気共鳴スペクトル(1H−NMR、13C−NMR、COSY及びHSQC)は、別段の示唆のない限り、Bruker ARX 400分光計(1H:400MHz、13C:100MHz)又はBruker Avance−III 300分光計(1H:300MHz、13C:75MHz)を使用して、重水素化メタノール(MeOD−d4、1H基準δ 4.87ppm;13C基準δ 49.15ppm)、重水素化クロロホルム(CDCl3、1H基準δ 7.26ppm;13C基準δ 77.00ppm)又は重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO−d6、1H基準δ 2.50ppm;13C基準δ 39.52ppm)中、298Kで決定した。NMRスペクトルのピーク形状は、「d」(二重線)、「dd」(二重二重線)、「s」(一重線)、「br s」(ブロード一重線)、「t」(三重線)及び「m」(多重線)という記号で示される。化学シフト(δ)はppmの単位で示され、結合定数JはHzの単位で示される。LC−MS測定は、Waters 2795分離モジュール(Alliance HT)、Waters 2996フォトダイオードアレイ検出器(190−750nm)、Waters Alltima C18カラム(2.1x100mm)及びLCT(商標)垂直加速飛行時間型質量分析計を装備したシステムで行われた。2つの移動相:A=0.1%ギ酸水溶液及びB=0.1%ギ酸水溶液中CH3CNを使用して、試料を流速0.40ml/分で流した。
Waters Atlantis T3 C18、2.1×100mm、3μM);流速=0.4mL/分、ランタイム=10分、カラムT=20℃、ストローク容積=25μL;グラジエント:0.0→2.0分:5% B;2.0→5.0分:5% B→95% B;5.0→7.0分:95% B;7.0→7.2分:95% B→5% B;7.2→9.9分:5% B。
Waters Symmetry 300、2.1×100mm、3.5μM;流速=0.4mL/分、ランタイム=24分、カラムT=20℃、ストローク容積=25μL;グラジエント:0.0〜2.0分:5% B;2.0〜20.0分:5% B→90% B;20.0〜21.0分:90% B→95% B;21.0〜24.0分:95% B→5% B。
C4 Vydacカラムを使用したShimadzu LC−20AD/T(Grace Davison Discovery Sciences(商標)、カタログ番号214TP1022)。移動相:A=0.05%TFA水溶液、及びB=0.05%TFA水溶液中CH3CN。カラムT=20℃。流速=10.0mL/分。LC−MSプログラム2と同様のグラジエント。
アンモニア水溶液(50mL)を、(5RS)−5−ヒドロキシ−DL−リシン塩酸塩(5g、25.2mmol)に0℃で添加した。30分間撹拌した後、溶液を濃縮し、結晶質固体を、さらに使用する前に高真空中で乾燥した。固体を、撹拌している9−BBN(7.00g、28.8mmol)の熱メタノール(100mL)溶液に1回で添加した。反応混合物を、清澄な溶液が得られるまで窒素下で(約3時間)還流した。溶媒を蒸発させた後、残渣を1,4−ジオキサン/水(1/1 v/v、50mL)に溶解し、氷浴中で冷却し、NaHCO3(2.5g、29.8mmol)及びBoc2O(5.5g、25.2mmol)で処理した。終夜撹拌した後、反応混合物を濃縮し、塩水で希釈し、EtOAcで抽出した。有機層を乾燥し、濃縮した後、粗生成物をシリカゲル(n−ヘキサン/EtOAc;1/0→1/1→1/9)で精製した。表題化合物(Rf=0.4、EtOAc)が白色の発泡体として得られた。
アンモニア水溶液(10mL)を、(5R)−5−ヒドロキシ−L−リシン二塩酸塩一水和物(1.04g、4.11mmol)に0℃で添加した。30分間撹拌した後、溶液を濃縮し、結晶質固体を、さらに使用する前に高真空中で乾燥した。固体を、撹拌している9−BBN(1.2g、4.7mmol)の熱メタノール(20mL)溶液に1回で添加した。反応混合物を、清澄な溶液が得られるまで窒素下で(約3時間)還流した。溶媒を蒸発させた後、残渣を1,4−ジオキサン/水(2/3 v/v、30mL)に溶解し、氷浴中で冷却し、NaHCO3(0.5g)及びBoc2O(1.1g)で処理した。終夜撹拌した後、反応混合物を濃縮し、塩水で希釈し、EtOAcで抽出した。有機層を乾燥し、濃縮した後、粗生成物をシリカゲル(n−ヘキサン/EtOAc;1/0→0/1)で精製した。表題化合物(Rf=0.4、EtOAc)が白色の発泡体として得られた。収率:1.39g、3.63mmol、2ステップ全体で89%。45.7mmolのスケールで、生成物を全収率82%で得た(シリカゲルクロマトグラフィー、DCM→10% MeOH/DCM)。
ステップ1:0℃のDL−3.1(0.95g、2.48mmol)及びEt3N(730μL、5.24mmol)のジクロロメタン(15mL)溶液に、MsCl(326μL、4.19mmol)を添加した。反応混合物を終夜撹拌したが、TLC分析によって、反応が完結していないことが明らかになった。さらに0.52mLのEt3N及び0.23mLのMsClを添加した後、1時間以内で反応が完結したことがTLC分析によってわかった。粗生成物をシリカゲル(n−ヘキサン/EtOAc 1/1→1/4)で精製し、高真空下で乾燥した後、メシレート(Rf=0.8、EtOAc)が発泡体として得られた。
反応を20mmolスケールでも行い、メシレートを>99%で5RS−δ−ヒドロキシ−DL−リシンから単離した。
ステップ1:0℃のL−3.1(1.35g、2.48mmol)及びEt3N(730μL、5.24mmol)のジクロロメタン(15mL)溶液に、MsCl(326μL、4.19mmol)を添加した。混合物を1時間撹拌し、TLC分析によって、反応が完結したことがわかった。粗生成物をシリカゲル(n−ヘキサン/EtOAc 1/1→1/3)で精製して、L−3.1(Rf=0.8、EtOAc)が発泡体として得られた。
チオアセテートDL−3.2(1.00g、2.27mmol)をメタノール(15mL)に溶解し、1N NaOH溶液(3mL)で15分間、0℃で処理した。反応混合物を、等モル量のHOAcを添加することによって慎重に中和し、濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濃縮して、粗チオールが油として得られた。次に、粗チオールのDCM(7mL)溶液を、メタンチオールスルホン酸S−メチル(3当量、6.9mmol、0.66mL)及びEt3N(9当量、2.76mL、20.4mmol)のDCM(7mL)溶液に滴下した。反応混合物を1時間撹拌し、その後、TLC分析(n−ヘキサン/EtOAc 1/3)によって、出発材料が完全に消費されたことがわかった。DCMを蒸発させた後、粗生成物をシリカゲル(n−ヘキサン→EtOAc 2/3)で精製して、ジスルフィドDL−3.3(Rf=0.8、EtOAc)が黄色の油として得られた。
チオアセテートL−3.2(1.13g、2.5mmol)をメタノール(15mL)に溶解し、1N NaOH溶液(3mL)で15分間、0℃で処理した。反応混合物を、等モル量のHOAcを添加することによって慎重に中和し、濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濃縮して、粗チオールが油として得られた。
次に、粗チオールのDCM(7mL)溶液を、メタンチオールスルホン酸S−メチル(3当量、6.9mmol、0.66mL)及びEt3N(9当量、2.76mL、20.4mmol)のDCM(7mL)溶液に滴下した。反応混合物を1時間撹拌し、その後、TLC分析(n−ヘキサン/EtOAc 1/3)によって、出発材料が完全に消費されたことがわかった。DCMを蒸発させた後、粗生成物をシリカゲル(n−ヘキサン→EtOAc 2/3)で精製して、ジスルフィドL−3.3(Rf=0.8、EtOAc)が油として得られた。
化合物DL−3.3(2.6g、5.9mmol)をTHF(40mL)に溶解し、エチレンジアミン(3.0mL)を添加した。溶液を約70℃に5分間加熱すると、白色の固体が沈殿した。反応混合物をHyflo(登録商標)に通して濾過し、濾液をフラッシュカラムクロマトグラフィー(DCM→DCM中40%MeOH、Rf=0.4)で精製した。遊離アミノ酸が油として得られた。
次に、Fmoc−OSu(2.5g、7.4mmol)のアセトン(25mL)溶液を、この粗アミノ酸及びNaHCO3(0.59g、1.1当量)のアセトン/H2O(50mL/50mL)溶液に添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌し、濃縮し、1N HCl水溶液で酸性にし、DCMで抽出した。水層をクロロホルム及びEtOAcで再び抽出した。有機層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(DCM中10%MeOH)で精製した。
化合物L−3.3(1.15g、2.5mmol)をTHF(40mL)に溶解し、エチレンジアミン(1.3mL)を添加した。溶液を約70℃に5分間加熱すると、白色の固体が沈殿した。沈殿物は、Falcon管で遠心分離する(4000rpmで10分)又はHyflo(登録商標)に通して濾過することによって除去した。濾液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(DCM→DCM中40% MeOH、Rf=0.4)で精製した。
次に、Fmoc−OSu(1.25当量、0.66g、2.0mmol)のアセトン(10mL)溶液を、このアミノ酸(0.51g、1.57mmol)及びNaHCO3(145mg、1.73mmol、1.1当量)のアセトン/H2O(10mL/10mL)溶液に添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌し、濃縮し、1N HCl水溶液で酸性にし、EtOAcで抽出した。有機層を乾燥し(MgSO4)、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(DCM中10% MeOH)で精製した。
Syro II MultiSyntech自動ペプチド合成装置で、標準的9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc−)をベースとした固相ペプチド化学により、25又は50μmolの単位で、ペプチドを合成した。前処置したFmocアミノ酸Wang樹脂(0.2mmol/g)で始めて、連続するアミノ酸をそれぞれ、4モル過剰で、pyBOP及びDiPEAと45分間カップリングさせた。Fmoc−基の脱保護は、NMP中20%ピペリジンで実現した(3×1.2mL、2×2及び1×5分)。ペプチドは、TFA/iPr3SiH/H2O(95/2.5/2.5)で切断され、冷n−ヘキサン/ジエチルエーテル中で沈殿した。精製は、Waters 1525EF Binary HPLCでAtlantis(Waters、19×250mm、10μM)分取カラムを使用して行った。
一般プロトコル 5−チオリシン修飾ペプチドのユビキチン連結
ストック溶液試薬:
200mM MgCl2
0.5M ATP
2.0M MESNa
50mM Tris−HCl(pH 7.5)中10mgmLユビキチン
71μM E1及びミリQ中7.1μM(第1ストックを10倍希釈)
4mM MgCl2
50mM MESNa
ユビキチン
ペプチド
2mM ATP
E1
0.5mMペプチドのミリQ(400μL)溶液を、下記を使用して37℃で終夜インキュベートした。
100μLの40mMグルタチオン溶液
80μLの0.2M VA−044又はV−50溶液(以下の構造を参照のこと)
0.5M TCEPを含有する、400μLの0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=6.5)。
本明細書に記載されたチオリシン構築ブロックのペプチドのユビキチン化における効率を評価するために、Muir及び同僚によって使用されたペプチド(Angew.Chem.Int.Ed.、2007年、46巻、2814頁)であるTKAVTK*YTSSKにおいて、DL−3.4を組み込むことを選択する。この配列は、ヒストン核タンパク質H2Bの残基115−125に対応し、イタリック体のK*はチオリシン残基の位置を示す。さらに、天然アラニン残基を位置117において使用することに決定した。対照的に、Muir及び同僚(Nature、2008年、453巻、812頁)は、この代わりにシステインをチオールコンジュゲーションのための潜在的部位として使用した。Balakirev及び同僚によるプロトコル(ChemBiochem、2006年、7巻、1667頁)に基づいて、本発明者らは1組の実験を行い、その間に、ユビキチンのペプチドへの完全な連結が何時間後に観察されたか(図2)、ペプチドの最少量(図3)及びE1濃度(図4)を決定した。連結反応混合物を37℃でインキュベートし、以下の材料からなるものであった。
反応をSDS−PAGE及びLC−MSで分析した。
その後に、構築ブロックDL−3.4を、3種の生物学的に関連性のあるモノユビキチン化タンパク質に由来する1組のペプチド(表1)に組み込んだ。ペプチド1及び2はそれぞれ、DNAポリメラーゼのプロセッシビティー因子であるPCNA(増殖細胞核抗原)の残基155〜184及び161〜168に対応する。構築ブロックDL−3.4(K*)を、位置164において組み込んだ。それは、保存(酵母及び哺乳類)モノユビキチン化リシン残基である。ペプチド3及び4はそれぞれ、腫瘍抑制物質PTEN(染色体TENに位置するホスファターゼ及びテンシン相同体)の残基1〜19及び286〜309に対応する。DL−3.4を、PTENの2つの主要なモノユビキチン化部位であることがわかっている位置13及び289に組み込み、その核内移行を制御した。4種のペプチド配列がすべて、システイン残基を含むとき、それがS−(o−ニトロベンジル)システイン(C*、表1)として組み込まれるように選択した。というのは、ニトロベンジル基は、連結条件と適合性があるはずであり、光分解により容易に除去されるからである。最後に、DL−3.4は、p53配列において、そのC末端の調節部分の残基365−389に対応して組み込まれた。C末端のp53ペプチドが、ヒト変異p53癌細胞において放射線誘導アポトーシスを増強させることがわかったことを指摘するのは興味深い。この配列中の6種のリシン残基はすべて、ユビキチン化部位であることが公知なので、6種のペプチド1組を合成した。
4.1の合成は、図13に示すような実験装置を使用して、Kollonitschら(J.Am.Chem.Soc.、1964年、86巻、1857頁)に記載された文献の手順に従って行った。
4.1(1.27g、5.0mmol)の乾燥MeOH(25mL)溶液に、撹拌しながらDiPEA(1.75mL、10.0mmol)を添加した。反応混合物は混濁し、5分後に、9−BBN(1.40g、5.75mmol)を添加した。懸濁液を、窒素下で清澄な溶液が得られるまで、70℃で加熱した(約2時間)。LC−MS分析によって、ボロネート化生成物への完全変換が確認された:Rt=6.73分(LC−MSプログラム3)、MS ES+(原子質量単位):300.98[M+H]+)。溶媒を真空中で除去し、残渣をDCMで2回共蒸発させた。残渣を乾燥THF(25mL)に溶解し、DiPEA(1.75mL、10.0mmol)及びBoc2O(1.091g、5.0mmol)を添加した。反応混合物を3時間撹拌した後、1N KHSO4(25mL)を添加した。THFを真空中で除去し、残留している水相をEtOAcで抽出した。その後、有機層を1N KHSO4及び塩水で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(EtOAc/n−ヘキサン 3/7→1/1 v/v)で白色の発泡体として単離した。
KSAc(122mg、1.07mmol)を、4.2(244mg、0.61mmol)のDMF(10mL)溶液に添加した。反応混合物を65℃で3時間撹拌した後、溶媒を真空中で除去した。残渣をEtOAcに再溶解し、塩水で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(EtOAc/n−ヘキサン 3/7→1/1 v/v)で白色の発泡体として単離した。
チオアセテート4.3(597mg、1.36mmol)をメタノール(14mL)に溶解し、1N NaOH(1.36mL)で30分間、0℃で処理した。反応混合物を、等モル量のHOAcを添加することによって慎重に中和し、濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに再溶解し、1N KHSO4及び塩水で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濃縮して、粗チオールが油として得られた。別のフラスコにおいて、DCM(25mL)中MsCl(0.53mL、6.80mmol)、2−メチル−2−プロパンチオール(0.767mL、2.72mmol)及びEt3N(1.90mL、13.6mmol)の混合物を30分間撹拌した後、粗チオール及びEt3N(0.190mL、1.36mmol)のDCM(25mL)溶液を添加した。反応混合物をさらに2時間撹拌した。次に、1N KHSO4(50mL)を添加し、DCMを真空中で除去した。水性残渣をEtOAcで抽出し、有機層を1N KHSO4及び塩水で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(DCM→EtOAc/DCM 1/1 v/v)で白色の発泡体として単離した。
2N LiOH(7.5mL)を4.4(243mg、0.5mmol)のTHF(7.5mL)溶液に添加し、2時間激しく撹拌した後、THFを真空中で除去した。水性残渣を1N HClでpH=4まで酸性にし、DCMで洗浄した。水層を25mLまで濃縮し、Et3NでpH 8.5にした。Fmoc−OSu(252mg、0.75mmol)のMeCN(25mL)溶液を添加した。反応混合物を室温で撹拌する一方、pHを8から8.5の間に保った。30分後、反応混合物を1N HClでpH=3に酸性にし、MeCNを真空中で除去した。1N KHSO4(25mL)を添加し、混合物をEtOAcで抽出した。有機層を1N KHSO4及び塩水で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(DCM中5%MeOH→DCM中10%MeOH v/v%)で白色の発泡体として単離した。
Nε−tert−ブトキシカルボニル−5−チオ−リシナト−ビシクロノニルボロン(100mg、251μmol)及びテトラ−O−アセチル−ガラクトシルブロミド(180mg、440μmol、1.75当量)のDMF(10mL)溶液に、5%Na2CO3(10mL)を添加した。混合物を終夜撹拌した後、LC−MS分析によって、チオールは存在せず、チオグリコシドが生成されていることがわかった。反応をEtOAcで希釈し、塩水及び飽和NaHCO3で洗浄し、有機層をMgSO4で脱水し、真空中で濃縮して、残渣を得、フラッシュカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン→EtOAc)で精製した。
(参考文献:X.Zhu、K.Pachamuthu、R.R.Schmidt、J.Org.Chem.2003年、68巻、5641頁)
Fmoc−Gly−PEG−PS樹脂(1.0g、0.18mmol/g)に、ピペリジン:NMP(20:80 v/v、5mL)を添加した。45分間振盪した後、樹脂をCH2Cl2で洗浄した。この手順を繰り返し、続いてCH2Cl2/NMP(1/1、v/v)及びNMPで洗浄した。樹脂に、Nε−(フルオレン−9−イルメトキシカルボニル)−Nε−tert−ブトキシカルボニル−5S−(メチルジスルファニル)−L−リシン(196.8mg、0.36mmol)、PyBOP(206mg、0.40mmol)、DiPEA(138μL、0.79mmol)、及びNMP(5mL)を添加した。樹脂を室温で終夜振盪し、CH2Cl2/NMP(1/1、v/v)で十分に洗浄し、最後にEt2Oで洗浄した後、高真空下で乾燥した。Fmoc含有量の分光光度分析によって、チオリシン修飾樹脂では、含有量が18mmol/g(収率>99%)であることがわかった。
H−Gly−PEG−PS樹脂(1.0g、0.18mmol/g)に、スルホローダミンB酸クロリド(31.9mg、55.3μmol)、DiPEA(18μL、103μmol)及びCH2Cl2(5mL)を添加した。15分間振盪した後、樹脂をCH2Cl2/NMP(1/1、v/v)で洗浄し、スルホローダミンB酸クロリド(13.3mg、23.05μmol)及びDiPEA(8μL、46.1μmol)で再び処理した。室温で終夜振盪した後、樹脂をCH2Cl2/NMP(1/1、v/v)で素通り画分が無色になるまで洗浄した。TFAを用いた脱保護を、TAMRAコンジュゲートで記載されているように行うと、所望のスルホローダミンB−チオリシン−Glyが紫色の油(33.0mg、87%)として得られた。
表2の反応混合物:100mM Tris−HCl(pH 8.0)、4mM MgCl2(4mM)、50mM MESNa、25μM Ub、25〜500μM 5(6)TAMRA−又はスルホローダミンB−チオリシン−Gly−OH、4mM ATP、及び100nM E1を37℃で3時間インキュベートし、さらに4μLのATPを加え、37℃で終夜インキュベートした。LC−MS分析によって、すべての例において完全な連結が見られた。SDS−PAGE分析と、その後に続くゲルの蛍光イメージング(ProXpress 2D、Perkin Elmer)によって、染料のUbへのコンジュゲーションが確認された。
粗反応混合物(1.88mL、最終濃度12.2μM)に、0.5M TCEP(1.88mL、最終濃度0.24M)及び100μLの0.2M VA−044溶液(最終濃度5.2mM)を添加した。反応を37℃で終夜インキュベートし、その後、LC−MS分析によって、出発材料の完全な脱硫が見られた。反応混合物を100mM Tris−HCl(pH 8.0)で全量15mLまで希釈し、Amicon Ultra−15 Centrifugal Filter装置(3kDaカットオフ、4000rpmで30分)で濾過した。これを6回繰り返した後、無色の素通り画分を得、TAMRA−チオリシン−Gly−OHが存在していないことを示唆した。これは、LC−MS分析で確認された。脱硫生成物は全量で4.0mL回収し、最終濃度3.13μMに相当するものであった。
Claims (15)
- 式(Ia)又は(Ib)で表されるリシン化合物:
[式中、
−X−は(i)硫黄又は(ii)セレンを表し、
−P1及び−P2は、独立して、(i)水素又は(ii)アミン保護基、好ましくはカルボベンジルオキシ;p−メトキシベンジルカルボニル;tert−ブチルオキシカルボニル(Boc);9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc);ベンジル;p−メトキシベンジル;3,4−ジメトキシベンジル;p−メトキシフェニル;トシル;スルホンアミド;アリルオキシカルボニルトリチル及びメトキシトリチルからなる群から独立して選択されるアミン保護基を表し、
−P3は、(i)水素、(ii)式−X−R6で表される基(式中、−R6は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す);(iii)チオール又はセレノール保護基、好ましくはベンジル;4−メトキシベンジル;トリチル;メトキシトリチル;t−ブチル;t−ブチルチオール;アセチル;3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル;アセトアミドメチル;メタンチオール及び2−ニトロベンジルからなる群から選択されるチオール又はセレノール保護基;(iv)−R5部分又は(v)式−C(=O)−R5’で表される部分を表し、
−R5及び−C(=O)−R5’は、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される、共有結合リガンドの残基を表し、
−R7は、(i)水素又は(ii)場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す]
又は前記リシン化合物のエステル、塩、溶媒和物、若しくは水和物。 - Xが硫黄を表す、請求項1に記載のリシン化合物、又はそのエステル、塩、溶媒和物、若しくは水和物。
- 式(IIa)又は(IIb)で表される非天然ペプチド:
[式中、
−R1は、(i)水素、(ii)請求項1に記載の−P1、又は(iii)式−C(=O)−R5’で表される部分を表し、
−R2は、(i)水素、(ii)請求項1に記載の−P2、(iii)C→Nポリペプチド鎖又は(iv)式−C(=O)−R5’で表される部分を表し、
−R3は、(i)水素、(ii)請求項1に記載の−P3;(iii)−R5部分;又は(iv)式−C(=O)−R5’で表される部分を表し、
−R4は、(i)−OH又は(ii)N→Cポリペプチド鎖を表し、
−X−は(i)硫黄又は(ii)セレンを表し、
−R5及び−C(=O)−R5’は、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される共有結合リガンドの残基を表し、
−R7は、(i)水素又は(ii)場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す、
但し、それぞれの式において、−R2及び−R4の少なくとも一方は、ポリペプチド鎖を表すことを条件とする]。 - 前記リガンドが、染料、プローブ、ラベル、タグ、溶解性改変剤、酵素標的、受容体リガンド、免疫調節剤、補助因子、及び架橋剤からなる群から選択される機能性剤である、請求項3に記載の非天然ペプチド。
- R2及びR4が、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片の全アミノ酸配列の相補部分を含むように選択されている、請求項3又は4に記載の非天然ペプチド。
- R2及びR4が、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片のアミノ酸配列中の選択された単一アミノ酸残基、好ましくはリシン残基に隣接するC→N及びN→Cポリペプチド部分を表すように選択されている、請求項3又は4に記載の非天然ペプチド。
- −R4がポリペプチド鎖を表し、−R2が−P2又は水素を表す、請求項3又は4に記載の式(IIb)による非天然ペプチド。
- 治療剤又は診断剤として使用するための、請求項3から6までのいずれか一項に記載の非天然ペプチド。
- 選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾方法であって、
i)前記選択された配列に、式(Ia)又は(Ib)による少なくとも1種のリシン化合物(式中、−P3は水素又は請求項1に記載の保護基を表す)が付加又は置換により組み込まれる、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列を合成又は生成するステップと;
ii)前記リシン化合物の残基中の−P3で表される基を除去し、式−R5又は−C(=O)−R5’で表される基(式中、−R5及び−C(=O)−R5’は、式(IIa−IIc)に関して定義したのと同じ意味を有する)と、前記リシン化合物の残基を硫黄原子又はセレン原子においてコンジュゲートするステップと
を含む上記方法。 - −C(=O)−R5’部分が、リシン化合物の残基にコンジュゲートし、−P3基を置換して、対応するチオエステル又はセレノエステルを生成し、前記方法は、その後に式−C(=O)−R5’で表される前記基の−εアミン基への分子内転移ステップiii)を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の生成が、直交性tRNA/アミノアシル−tRNAシンテターゼ対を使用してリシン化合物を組み込むことを含み、前記リシン化合物が、選択された配列をコードする遺伝子に含まれているナンセンスコドン又は4塩基コドンに応答して組み込まれる、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列が、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片である、請求項9から11までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択的修飾が、ユビキチン化を含み、又は構成する、請求項9から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1に記載のリシン化合物の合成方法であって、
(ia)4−ヒドロキシリシン又は5−ヒドロキシリシン化合物を有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を得、それをその後にアミン保護基と反応させて、保護された4−ヒドロキシルシン又は5−ヒドロキシリシンを得るステップ;或いは
(ib)4−クロロリシン、5−クロロリシン、4−ブロモリシン、又は5−ブロモリシン化合物を有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を得、それをその後にアミン保護基と反応させて、保護された4−クロロリシン、5−クロロリシン、4−ブロモリシン、又は5−ブロモリシンを得るステップ;
(iia)ステップ(ia)で得られた化合物をメシル化し、それをその後に好適なチオカルボン酸若しくはセレノカルボン酸又はその塩と反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップ;或いは
(iib)ステップ(ib)で得られた化合物と好適なチオカルボン酸若しくはセレノカルボン酸又はその塩を反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップ;
(iii)ステップ(iia)又は(iib)で得られたチオエステル又はセレノエステルを、アルカリ金属水酸化物の水溶液で加水分解して、チオール又はセレノール化合物を得、それをその後に、請求項1に記載の−P3基を、チオール基又はセレノール基に転移させることができる作用物質と反応させるステップ;及び
(iv)アミノ酸を保護している有機ボラン基を除去し、場合によっては、その後に前記化合物とアミン保護剤を反応させて、本明細書で以上に定義した式(Ia)又は(Ib)による化合物を得るステップ
を含む上記方法。 - 選択されたペプチド又はタンパク質の合成における構築ブロックとして、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾のための連結ハンドルを形成するための、請求項1又は2に記載のリシン化合物の使用。
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Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2552478A (en) * | 1947-02-12 | 1951-05-08 | American Cyanamid Co | Preparation of therapeutic substance |
US3627824A (en) * | 1968-06-25 | 1971-12-14 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for crystallizing{65 -alkylmercaptolysine dihydrochloride |
US4204991A (en) * | 1977-10-25 | 1980-05-27 | G. D. Searle & Co. | Sarcosine1 dehydroalanine8 angiotensin II derivatives |
JPH03261761A (ja) * | 1989-08-07 | 1991-11-21 | Takeda Chem Ind Ltd | S―ニトロソチオール誘導体 |
JP2001513484A (ja) * | 1997-07-31 | 2001-09-04 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 非環式メタロプロテアーゼ阻害剤 |
JP2001524488A (ja) * | 1997-11-21 | 2001-12-04 | ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション,インコーポレイテッド | ヒプシンペプチド |
WO2008137165A1 (en) * | 2007-05-07 | 2008-11-13 | President And Fellows Of Harvard College | Anti-glycated cd59 antibodies and uses thereof |
WO2008154743A1 (en) * | 2007-06-19 | 2008-12-24 | Innodia Inc. | Methods for the synthesis of 4-hydroxyisoleucine, stereoisomers and analogs thereof |
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US2552478A (en) * | 1947-02-12 | 1951-05-08 | American Cyanamid Co | Preparation of therapeutic substance |
US3627824A (en) * | 1968-06-25 | 1971-12-14 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for crystallizing{65 -alkylmercaptolysine dihydrochloride |
US4204991A (en) * | 1977-10-25 | 1980-05-27 | G. D. Searle & Co. | Sarcosine1 dehydroalanine8 angiotensin II derivatives |
JPH03261761A (ja) * | 1989-08-07 | 1991-11-21 | Takeda Chem Ind Ltd | S―ニトロソチオール誘導体 |
JP2001513484A (ja) * | 1997-07-31 | 2001-09-04 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 非環式メタロプロテアーゼ阻害剤 |
JP2001524488A (ja) * | 1997-11-21 | 2001-12-04 | ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション,インコーポレイテッド | ヒプシンペプチド |
JP2009513562A (ja) * | 2005-10-26 | 2009-04-02 | アステラス製薬株式会社 | 新規環状ペプチド化合物 |
WO2008137165A1 (en) * | 2007-05-07 | 2008-11-13 | President And Fellows Of Harvard College | Anti-glycated cd59 antibodies and uses thereof |
WO2008154743A1 (en) * | 2007-06-19 | 2008-12-24 | Innodia Inc. | Methods for the synthesis of 4-hydroxyisoleucine, stereoisomers and analogs thereof |
Non-Patent Citations (4)
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JPN5013005276; FILIPPOV D V: 'PARALLEL SOLID PHASE SYNTHESIS OF TRICOMPONENT BISUBSTRATE ANALOGUES AS POTENTIAL以下備考' SYNTHESIS V5, 20040101, P773-778, GEORG THIEME VERLAG * |
JPN5013005277; HILLAERT U: 'RECEPTOR-MEDIATED TARGETING OF CATHEPSINS IN PROFESSIONAL ANTIGEN PRESENTING CELLS' ANGEWANDTE CHEMIE.INTERNATIONAL EDITION V48, 20090101, P1629-1632, WILEY VCH VERLAG * |
JPN6014022806; van Swieten P.F. et al: Org. Biomol. Chem. No.3, 2005, pp.20-27 * |
JPN6014022808; Lim H. et al: J. Med. Chem. vol.29, 1986, pp.1743-1748 * |
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