CN113912532B - 一种可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针及其制备方法 - Google Patents

一种可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针，具有如式VI所示的结构通式：本发明还提供了一种蛋白质的修饰方法，加入需要修饰的蛋白质，所述的化学修饰位点为蛋白质赖氨酸残基；可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI投料为蛋白质的0.1当量至200当量。根据蛋白质赖氨酸残基的化学选择性修饰技术和应用的需求，本发明提供了以含吡啶盐为活性官能团的蛋白质赖氨酸残基的高效选择性化学修饰方法。

Description

一种可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针及其制备方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针及其制备方法，具体来说是一种含有吡啶盐的酯类衍生物，可用于修饰蛋白质赖氨酸(Lys，K)残基。
背景技术
亲核氨基酸对蛋白质功能做出重要贡献，包括在催化中发挥关键作用和作为翻译后修饰的位点。靶向氨基酸亲核试剂的亲电基团已被用于制造共价配体和药物，但到目前为止，主要限于半胱氨酸和丝氨酸。蛋白质赖氨酸(Lys)是生物体必须的氨基酸之一，在维持各项生理功能中发挥着至关重要的作用。赖氨酸侧链残基为氨基在蛋白质功能中起着许多重要的作用。氨基侧链是一个良好的亲核基团，对其进行化学修饰有望改变蛋白质的化学结构使其空间结构发生变化从而改善自身生物活性及功能的提高。因此在生物样品中采用化学方法修饰赖氨酸，是研究蛋白质立体结构与生理功能的重要手段,也是定向改造蛋白质性质的一种方法,在蛋白质工程和组学研究中有着广泛的应用前景。
吡啶盐具有很好的水溶解性，在与生命有机体相互作用可以不用使用其他的有机溶剂，环保高效。以吡啶环作为探针的关键结构单元具有更好的生物相容性、更低的生物毒性、更高的内吸性和更高的选择性，可以解决其他氨基酸探针例如碘代乙酰胺作为半胱氨酸探针的对细胞高毒性的问题，因此含吡啶盐的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针在蛋白质侧链化学修饰上具有重要的非常广阔的应用空间。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针及其制备方法，所述的这种可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针及其制备方法要解决现有技术中对于含吡啶盐为活性官能团的蛋白质赖氨酸残基的化学修饰选择性不佳的技术问题。
本发明提供了一种可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针，具有如式VI所示的结构通式：
其中：R1、R2分别选自：氢、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6卤代烯基、C2-C6炔基、C2-C6卤代炔基、羟基、C3-C6环烷基、被取代的哌啶-1-基、被取代的吗啉-1-基、被取代的四氢吡咯-1-基、苯基、卤素取代的苯基、C1-C6烷基取代的苯基或C1-C6卤代烷基取代的苯基、C3-C6环烷基取代的苯基、硝基取代的苯基、C2-C6烯基取代的苯基、C2-C6卤代烯基取代的苯基、C3-C6环烯基取代的苯基、C2-C6炔基取代的苯基、C2-C6卤代炔基取代的苯基、C3-C6环炔基取代的苯基、吡啶基、卤素取代的吡啶基、C1-C6烷基取代的吡啶基、C1-C6卤代烷基取代的吡啶基、C3-C6环烷基取代的吡啶基、硝基取代的吡啶基、C2-C6烯基取代的吡啶基、C2-C6卤代烯基取代的吡啶基、C3-C6环烯基取代的吡啶基、C2-C6炔基取代的吡啶基、C2-C6卤代炔基取代的吡啶基、C3-C6环炔基取代的吡啶基、嘧啶基、卤素取代的嘧啶基、C1-C6烷基取代的嘧啶基、C1-C6卤代烷基取代的嘧啶基、C3-C6环烷基取代的嘧啶基、硝基取代的嘧啶基、C2-C6烯基取代的嘧啶基、C2-C6卤代烯基取代的嘧啶基、C3-C6环烯基取代的嘧啶基、C2-C6炔基取代的嘧啶基、C2-C6卤代炔基取代的嘧啶基或C3-C6环炔基取代的嘧啶基、被取代的含1个或2个N原子的五元或六元杂芳基、含1个或2个S原子的被取代的五元或六元杂芳基、含1个或2个O原子的被取代的五元或六元杂芳基、含1个N原子和1个S原子的被取代的五元或六元杂芳基、含1个N原子和1个O原子的被取代的五元或六元杂芳基、含2个N原子和1个S原子的被取代的五元或六元杂芳基、或含2个N原子和1个O原子的被取代的五元或六元杂芳基；上述五元或六元杂芳基选自：被取代的呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并***基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁唑基、异构化的喹啉基、异构化的异喹啉基、酞嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基或萘啶基、烷基或烯基取代的硅基；
所述的卤素是氟、氯、溴或碘；
所述烷基、烯基或炔基为直链的或支链的烷基；烷基本身或作为其它取代基的部分选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基及其异构体，其异构体选自异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基或叔戊基；
所述卤代烷基基团选自含一个或多个相同或不同的卤素原子的基团，所述卤代烷基选自CH2Cl、CHCl2、CCl3、CH2F、CHF2、CF3、CF3CH2、CH3CF2、CF3CF2或CCl3CCl2；
所述环烷基本身或作为其它取代基的部分选自环丙基、环丁基、环戊基或环己基；
所述烯基本身或作为其它取代基的部分选自乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、戊烯-1-基、戊烯-3-基、己烯-1-基或4-甲基-3-戊烯基；
所述炔基本身或作为其它取代基的部分选自乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、1-甲基-2-丁炔基、己炔-1-基或1-乙基-2-丁炔基。
X选自：烷基酸根、取代烷基酸根、卤素及其含氧酸根、磷酸根、硫酸根、磺酸根或者硼酸根；
所述烷基酸根、取代烷基酸根选自C1-C6烷基酸根或者C1-C6卤代烷基酸根；
所述卤素及其含氧酸根选自氟、氯、溴或碘、次氯酸根、亚氯酸根、氯酸根、高氯酸根、次溴酸根、亚溴酸根、溴酸根、高溴酸根、次碘酸根、亚碘酸根、碘酸根或者高碘酸根；
所述磷酸根选自磷酸一氢根、磷酸二氢根、焦磷酸根、偏磷酸根、次磷酸根、亚磷酸根、多聚磷酸根、磷酸根或者六氟磷酸根；
所述硫酸根选自硫负离子、硫酸氢根、硫酸根、亚硫酸氢根、亚硫酸根、焦硫酸根、连二硫酸根、硫代硫酸根、连二亚硫酸根或者过硫酸根；
所述磺酸根选自三氟甲磺酸根、甲磺酸根、苯基磺酸根或者对-甲基苯磺酸根；
所述硼酸根选自硼酸根或者四氟硼酸根；
Y选自：氧或者硫。
本发明的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI的合成方法如下：
其中，取代基如前所述R1优选自：苯基、取代苯基、甲基；R2优选自：甲基；X优选自：碘、三氟甲磺酸根；Y优选自：氧、硫。
本发明还公开了上述的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针的制备方法，包括以下步骤：
1)一个制备化合物Ⅲ的步骤：
在一个反应容器中加入化合物I、羧酸底物和酯化缩合剂，所述的化合物I的结构式为所述的化合物I选自：2-羟基吡啶、3-羟基吡啶、4-羟基吡啶、2-巯基吡啶、3-巯基吡啶或者4-巯基吡啶，所述的羧酸底物的结构式为/>反应溶剂选自：二氯甲烷、甲苯或者乙腈，反应完全后，减压浓缩除去多余溶剂，残余物经100～200目硅胶柱层析纯化得化合物III，所述的化合物III的结构式为/>洗脱剂为60～90摄氏度的石油醚:乙酸乙酯，根据产物的不同，石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:1-6:1，收率76-91％；化合物III制备的量和反应容器的体积按相应比例扩大或缩小。
2)化合物VI的制备:
在另外一个反应容器中加入化合物III和烷基化试剂IV R2X，所述的烷基化试剂IV选自：碘甲烷、三氟甲磺酸甲酯、三氟甲磺酸乙酯、苯磺酸甲酯或者三甲基氧鎓四氟硼酸盐，反应溶剂选自：二氯甲烷、甲苯、乙腈、***或者四氢呋喃，得到可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针产物以沉淀的形式直接析出，或添加反应溶剂等体积的***促进产物的析出，收率83％-95％；化合物VI制备的量和反应容器的体积按相应比例扩大或缩小。
本发明还提供了上述的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针的含吡啶盐的酯类化合物及其衍生物。
本发明还提供了上述的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针及其中间体在蛋白质赖氨酸修饰上的用途。
本发明还提供了一种蛋白质的修饰方法，加入需要修饰的蛋白质，所述的化学修饰位点为蛋白质赖氨酸残基；可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI投料为蛋白质的0.1当量至200当量。
进一步的，反应溶剂为水或极性有机溶剂：所述的溶剂选自水、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的任意一种或者它们任意两种的混合溶剂。
进一步的，所述的反应时间为0.1小时至100小时。
进一步的，所述的反应温度为-20至50摄氏度。
本发明对可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI进行了合成研究，并对可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI进行了化学生物学活性的探索。
本发明公开的上述化合物的结构通式、合成方法与用作蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针的用途，其与化学生物学上可接受的探针以及与商品化半胱氨酸探针、酪氨酸探针和赖氨酸探针等组合使用在多肽、蛋白质、细胞水平上的修饰蛋白质组学和生物医药上的用途和制备方法。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。根据蛋白质赖氨酸残基的化学选择性修饰技术和应用的需求，本发明提供了一种以含吡啶盐为活性官能团的蛋白质赖氨酸残基的高效选择性化学修饰方法。
附图说明：
图1是可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI与蛋白的反应和二级质谱分析。
图2可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI与细胞裂解液的反应和蛋白组学分析。
具体实施方式：
本发明通过特定制备和化学生物学实施例更加具体说明可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI的合成与生物应用，所述实施例仅用于具体说明本发明而非限制本发明，尤其是生物应用仅是举例说明，而非限制本专利，具体实施方式如下：
实施例1：化合物Ⅲ-1的制备：
在250毫升双口圆底烧瓶中加入2.4克4-羟基吡啶I，4.4克4-炔丙氧基苯甲酸和4.8克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。加入100毫升反应溶剂二氯甲烷。TLC监测反应完全后，减压浓缩除去多余溶剂，残余物经100～200目硅胶柱层析纯化得化合物III，洗脱剂为60～90摄氏度的石油醚:乙酸乙酯，体积比为6:1，产物为白色粉末5.0克，收率78％。该化合物的核磁数据如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.66(dd,J＝4.7,1.6Hz,2H),8.21–8.10(m,2H),7.23(dd,J＝4.7,1.6Hz,2H),7.13–7.01(m,2H),4.79(d,J＝2.4Hz,2H),2.57(t,J＝2.4Hz,1H)。同类的化合物合成及表征数据：
白色粉末,收率91％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.66(dd,J＝4.8,1.3Hz,2H),8.21–8.13(m,2H),7.69–7.63(m,1H),7.51(t,J＝7.9Hz,2H),7.24(dd,J＝4.7,1.6Hz,2H).
黄色粉末,收率84％.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.70(d,J＝4.5Hz,2H),8.03(d,J＝7.8Hz,2H),7.66(t,J＝7.2Hz,1H),7.60–7.42(m,4H).
黄色粉末,收率81％.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.74–8.66(m,1H),8.07–8.00(m,2H),7.79(td,J＝7.6,1.8Hz,1H),7.74(d,J＝7.8Hz,1H),7.65–7.60(m,1H),7.50(t,J＝7.7Hz,2H),7.34(ddd,J＝7.2,4.9,1.2Hz,1H).
黄色粉末,收率65％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.66(d,J＝5.8Hz,2H),8.00(d,J＝8.8Hz,2H),7.46(dd,J＝4.7,1.3Hz,2H),7.06(d,J＝9.0Hz,2H),4.78(d,J＝2.4Hz,2H),2.57(t,J＝2.4Hz,1H).
黄色粉末,收率54％.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.74–8.68(m,1H),8.06(d,J＝8.9Hz,2H),7.87–7.73(m,2H),7.37(ddd,J＝7.3,4.9,1.1Hz,1H),7.09(d,J＝8.9Hz,2H),4.81(d,J＝2.3Hz,2H),2.61(t,J＝2.4Hz,1H).
实施例2：化合物VI-1的制备:
在100毫升单口圆底烧瓶中加入1.3克III和1.5毫升三氟甲磺酸甲酯。加入30毫升反应溶剂二氯甲烷。TLC监测反应完全后，添加反应溶剂等体积的***促进产物的析出，产物为白色粉末1.8克，收率89％。该化合物的核磁数据如下：1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.93(d,J＝7.1Hz,2H),8.23–8.17(m,2H),8.10(d,J＝7.4Hz,2H),7.21–7.15(m,2H),4.88(d,J＝2.4Hz,2H),4.37(s,3H),3.04(t,J＝2.4Hz,1H)。
同类的化合物合成及表征数据：
灰白色粉末,收率91％.1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.99(d,J＝7.1Hz,2H),8.25(dt,J＝8.5,1.5Hz,2H),8.15(d,J＝7.3Hz,2H),7.78(tt,J＝7.3,1.3Hz,1H),7.69–7.57(m,2H),4.41(s,3H).
白色粉末,收率94％.1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.00(d,J＝7.1Hz,2H),8.32–8.25(m,2H),8.17(d,J＝7.2Hz,2H),7.86–7.77(m,1H),7.70–7.61(m,2H),4.44(s,3H).
黄色粉末,收率92％.1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.93(d,J＝6.7Hz,2H),8.39(d,J＝6.7Hz,2H),8.16–8.09(m,2H),7.86–7.77(m,1H),7.70–7.62(m,2H),4.46(s,3H).
黄色粉末,收率89％.1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.06(d,J＝7.3Hz,1H),8.01–7.96(m,2H),7.66–7.55(m,2H),7.42(dt,J＝28.7,7.5Hz,3H),6.85(t,J＝6.1Hz,1H),3.96(s,3H).
白色粉末,收率86％.1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.93(d,J＝6.9Hz,2H),8.20(d,J＝9.0Hz,2H),8.10(d,J＝7.1Hz,2H),7.18(d,J＝9.0Hz,2H),4.88(d,J＝2.2Hz,2H),4.38(s,3H),3.04(t,J＝2.3Hz,1H).
黄色粉末,收率89％.1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.90(d,J＝6.7Hz,2H),8.37(d,J＝6.8Hz,2H),8.16–8.08(m,2H),7.27–7.20(m,2H),4.93(d,J＝2.4Hz,2H),4.44(s,3H),3.10(t,J＝2.4Hz,1H).
黄色粉末,收率85％.1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.28(d,J＝6.1Hz,1H),8.68(td,J＝7.9,1.2Hz,1H),8.51–8.44(m,1H),8.27–8.19(m,1H),8.15–8.07(m,2H),7.30–7.22(m,2H),4.95(d,J＝2.3Hz,2H),4.51(s,3H),3.11(t,J＝2.4Hz,1H).
实施例3：本发明的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI与离体蛋白质的反应结果：
为了验证可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针与赖氨酸(Lys)共价结合在蛋白标记层面的反应性，采用蒸馏水将蛋白溶解并配置成7.5μM的蛋白溶液。准确称量可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI用PBS缓冲液或者蒸馏水配置成相应浓度的反应试液。将蛋白溶液与50μM探针在PBS溶液中于37℃钟孵育2小时。然后利用“click”反应给蛋白标记荧光标签，具体做法是在反应体系中加入CuSO4(1mM)，TECP(1mM)，TBTA(100μM)，5-TAMRA-N3(100μM)，于25℃孵育2小时，反应结束。最后跑SDS-PAGE蛋白胶，观察胶内荧光。蛋白可以为牛血清蛋白(BSA)，马血清蛋白(HSA)，溶菌酶(Lysozyme)，胰岛素(Insulin)，碳酸酐酶(CA),肌红蛋白(Myoglobin),核糖核酸酶A (RNaseA)等。
从图1a，1b蛋白的标记实验中，我们观察到吡啶盐类探针KP2(结构式VI)具有较强的荧光，KP2高荧光活性吸引了我们的注意值得进行进一步深入的研究，因此我们选择KP2进行后续蛋白标记反应。从图1b中发现KP2探针在与蛋白反应5min就有一定荧光强度同时随着反应时间的延长与蛋白的反应荧光强度增强。在反应剂量上，随着KP2浓度的增加，荧光逐渐增强，探针浓度对荧光强度具有重要影响。该蛋白上赖氨酸残基的数量较多，完全反应需要450μM左右的探针。为了进一步探究KP2探针标记蛋白反应在不同pH状态下的标记效率，我们在pH 3-11的缓冲溶液中进行蛋白反应并观察荧光强度。研究发现随着pH的增大荧光逐渐增强，但是在pH过大蛋白不稳定，容易被碱破坏，因此在pH 11和12的时候荧光变弱，同时蛋白的CBB条带也变得分散。最佳反应pH在7-10。
商品化NHS-Ac是在蛋白标记中常用的试剂，主要用于赖氨酸残基的封闭，IAA是商品化用于半胱氨酸的封闭试剂，KP-B本发明用于赖氨酸封闭的探针。从图1c中用发现将BSA跟KP2探针能被NHS-Ac和KP-B竞争，不会被IAA的浓度影响，随着NHS-Ac和KP-B的浓度加大，荧光逐渐被封闭，但是IAA浓度的增大对荧光无明显变化，表明该标记可被商品化赖氨酸封闭试剂所封闭，证明本研究的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI选择性的作用于蛋白质赖氨酸残基。
为了检验KP2探针对蛋白赖氨酸的特异性标记，通过二级质谱研究，具体步骤为：将蛋白与探针在PBS缓冲液中反应，跑SDS-PAGE蛋白胶。跑完切胶进行质谱制样，先脱色离心，再还原烷基化(可选择)，胰酶酶解，肽段萃取和富集，准备进行二级质谱分析。
从图1d中在碎片峰可以检测到对蛋白赖氨酸修饰的序列碎片，从碎片峰中能检测到相应的b，y信号，证明本发明探针在BSA的K(Lys)上进行修饰，二级质谱实验进一步证明本发明的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI与蛋白质的反应主要位点为赖氨酸，可作为高选择性赖氨酸的修饰探针进行进一步研究。
实施例4：本发明的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI与细胞裂解液的反应结果：
具体步骤为：将收获的细胞通过超声裂解，定浓度。准确称量可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI用PBS缓冲液或者蒸馏水配置成相应浓度的反应试液。将细胞裂解液稀释至适宜浓度与50μM探针在PBS溶液中于37°C钟孵育2小时。然后利用“click”反应给蛋白标记荧光标签，具体做法是在反应体系中加入CuSO4(1mM)，TECP(1mM)，TBTA(100μM)，5-TAMRA-N3(100μM)，于25℃孵育2小时，反应结束。最后跑SDS-PAGE蛋白胶，观察胶内荧光。细胞可以为A549，293T，Hela,MCF-7等。
从图2a、2b细胞裂解液的标记实验中，我们观察到吡啶盐类探针KP2具有较强的荧光，因此选择KP2继续进行后续细胞裂解液标记反应。从图2b中发现KP2探针在与细胞裂解液反应10min就有一定荧光强度同时随着反应时间的延长与蛋白的反应荧光强度增强,在1h作用达到最佳。在反应剂量上(图2a)，随着KP2浓度的增加，荧光逐渐增强，探针在低浓度下就能有很好的标记效果。
在细胞裂解液中也采用了商品化NHS-Ac和IAA分别用于赖氨酸和半胱氨酸的封闭，KP-B本发明用于赖氨酸封闭的探针。从图2c中用发现，细胞裂解液和KP2探针的反应能被NHS-Ac和KP-B竞争，不会被IAA的浓度影响，随着NHS-Ac和KP-B的浓度加大，荧光逐渐被封闭，但是IAA浓度的增大对荧光无明显变化，从细胞裂解液层面也表明本研究的赖氨酸探针VI可选择性的作用于蛋白质赖氨酸残基。
实施例5：本发明的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI的毒性研究：
同时与商品化探针NHS-ph和NHS相比，KP2探针对MCF-7细胞更加安全。从图2d中，KP2在200μM情况下，细胞的存活率接近100％，而商品化NHS-ph和NHS在此浓度下细胞存活率急速下降，证明在此浓度下KP2对细胞是非常安全，可作为活细胞的赖氨酸修饰探针进行开发探索。
实施例6：本发明的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI的蛋白质组学研究结果：
将细胞和探针共孵育3h，进行click反应，直接离心沉淀4℃ 14,000rpm5min，用冰丙酮或者冰甲醇放-80预冷，洗涤沉淀。用含1.2％SDS的PBS超声复溶，实时观察，超声直到没有沉淀为止)稀释至含0.2％SDS。用一定体积的SA beads在29℃孵育3小时。用水和PBS洗涤beads，beads重悬在500uL pH 8.5含有6M urea的50mM Tris溶液里。依次加入DTT和IAA，反应，反应结束离心，加胰酶工作液，再加胰酶消化过夜。离心，上清液加酸终止反应，除盐，进行LC-MS/MS分析。Beads用PBS和水洗涤，进行光切或者酸切。离心收集上清，进行除盐和LC-MS/MS分析。
从图2e中发现，KP2探针在与不同细胞系的细胞进行蛋白组学的研究都能打出KP2对赖氨酸进行修饰的反应位点，其中对Jurkat细胞可以打出4424个KP2对赖氨酸的修饰位点，对MCF7细胞可以打出5338个KP2对赖氨酸的修饰位点，对A549细胞可以打出5969个KP2对赖氨酸的修饰位点，对Hela细胞可以打出3699个KP2对赖氨酸的修饰位点。这些实验结果证明本发明的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针VI的广谱适用性，可广泛用于多种细胞系的蛋白质组学研究。本发明探针具有高选择性的修饰蛋白赖氨酸残基，用于蛋白质赖氨酸残基的选择性修饰具有极其重要的应用价值。

Claims (6)

1.一种可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针，其特征在于，具有如下所示的结构式：
或者/>
2.权利要求1所述的可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针在蛋白质赖氨酸修饰上的用途。
3.一种采用权利要求1所述的探针对蛋白质进行的修饰方法，其特征在于，加入需要修饰的蛋白质，所述的化学修饰位点为蛋白质赖氨酸残基；权利要求1所述可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针投料量为蛋白质的0.1当量至200当量。
4.根据权利要求3所述的一种蛋白质的修饰方法，其特征在于，反应溶剂为水或极性有机溶剂：所述的溶剂选自水、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的任意一种或者它们任意两种的混合溶剂。
5.根据权利要求3所述的一种蛋白质的修饰方法，其特征在于，所述的反应时间为0.1小时至100小时。
6.根据权利要求3所述的一种蛋白质的修饰方法，其特征在于，所述的反应温度为-20至50℃。
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