KR101676515B1 - 펩티드 티오에스테르체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

[과제] 본 발명은 펩티드 사슬을 화학적으로 펩티드 티오에스테르체로 변환하는 신규한 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
[해결수단] 본 발명자들은, 펩티드 사슬에 있어서, 시스테인 잔기에 주목하였다. 그리고, 시스테인 잔기의 티올기에, -C(=X)-R1기를 도입하고, 이에 대해, 유기용매 중에서 -NH-C(=Y)NHR3로 표시되는 이탈기를 갖는 화합물을 반응시킴으로써, 시스테인 잔기의 N 말단측의 펩티드 결합의 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기가 부가되고, 상기 펩티드 결합이 절단되어, C 말단측의 펩티드 단편이 절제되는 것을 발견하였다. 또한, 이 -NH-C(=Y)NHR3기가 부가된 펩티드 사슬에 완충용액 중에서 티올을 반응시킴으로써, -NH-C(=Y)NHR3기가 결합되어 있는 카르보닐 탄소에 대해, 상기 티올의 티올기가 결합하여, 상기 -NH-C(=Y)NHR3기가 이탈된다고 하는 티올 교환반응에 의해, 펩티드 티오에스테르로 변환할 수 있는 것을 발견하였다.

Description

펩티드 티오에스테르체의 제조방법{Process for production of peptide thioester}
본 발명은, 펩티드 티오에스테르체의 제조방법에 관한 것이다.
단백질의 합성에는, 생합성, 화학합성, 무세포합성 등 각종 방법이 알려져 있다. 생합성 방법의 경우는, 대장균 등의 세포 내를 이용하여, 합성을 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA를 세포 내에 도입하여 발현시킴으로써, 단백질을 얻는다. 화학합성은, 아미노산을 유기화학적으로 차례대로 결합시킴으로써, 목적의 단백질을 합성한다. 또한, 무세포합성은, 대장균 등의 각종 세포 내에 존재하는 효소 등을 이용하여, 무세포적으로 단백질을 합성한다. 이들 방법은, 단백질의 사용목적이나, 사이즈, 부가하는 성질 등에 따라 적절히, 구분해서 사용되거나, 조합된다.
아미노산 서열의 중간부분에, 당쇄나 지질 등의 특정 수식을 균일하게 갖는 단백질을 합성하기 위해서는, 현재, 사전에 당쇄나 지질 등으로 수식된 아미노산을 사용하여, 그 주변의 펩티드 사슬을 화학합성하는 방법이 사용되고 있다.
펩티드 사슬을 화학합성하는 방법으로서는, 주로 고상합성법이 사용된다. 그러나 고상합성법에 의해 얻어지는 펩티드 사슬은, 일반적으로 단쇄이고, 길어도 50 잔기 정도이다.
이 때문에 수식을 갖는 장쇄의 펩티드 사슬을 합성하기 위해서는, 짧은 펩티드 사슬을 따로 따로 조제 후, 이들을 연결하는 방법이 주로 사용되고 있다. 펩티드 사슬 연결수법으로서는 다양한 수법이 보고되어 있으나, 널리 사용되고 있는 방법의 하나가 천연형 화학적 라이게이션법(Native Chemical Ligation, NCL법)이다. NCL법은, 무보호의 펩티드 사슬끼리도 행할 수 있어, 연결 부위(라이게이션 부위)에 천연 아미드 결합(펩티드 결합)을 생성하기 위한 유용한 방법인 것이 알려져 있다(예를 들면, 특허문헌 1). NCL법은, C 말단에 α카르복시티오에스테르 부분을 갖도록 한 제1 펩티드와 N 말단에 시스테인 잔기를 갖는 제2 펩티드의 화학 선택반응으로, 시스테인의 측쇄의 티올기(SH기, 설푸히드릴기라고도 한다)가 티오에스테르기인 카르보닐 탄소에 선택적으로 반응하여, 티올 교환반응에 의해, 티오에스테르 결합 초기 중간체가 생성된다. 이 중간체는, 자발적으로 분자 내 전위되어, 연결 부위에 천연 아미드 결합을 부여하는 한편, 시스테인 측쇄 티올을 재생시킨다.
이 방법은, 무보호의 펩티드를 사용하여 완충용액 중에서 혼합하는 것만으로, 펩티드 결합을 매개로 2개의 펩티드 사슬을 연결할 수 있는 수법이다. NCL법은 펩티드와 같이 수 많은 관능기를 가진 화합물끼리의 반응이더라도, 선택적으로 한쪽 펩티드 C 말단과 다른 쪽 펩티드 N 말단을 연결할 수 있다. 이러한 점에서, 단백질을 화학합성하기 위해서는 어떻게 NCL법을 이용하는지가 중요해진다.
그러나 NCL법의 이용에 있어서의 문제점으로서, 원료로서 필요한, C 말단에 α카르복시티오에스테르 부분을 갖는 펩티드 티오에스테르체의 조제를 들 수 있다. 펩티드 티오에스테르의 조제법에는 다양한 방법이 보고되어 있는데, 일반적으로 고상합성법을 기반으로 한, 2개의 타입으로 분류할 수 있다.
첫번째는, 수지 상에 펩티드 티오에스테르를 구축하는 방법이다. 이 방법은 펩티드 구축 후 수지로부터의 펩티드 사슬의 절단과 함께 펩티드 티오에스테르를 얻을 수 있다(e.g., Boc 고상합성법, Fmoc 고상합성법). 두번째는, 티오에스테르에 등가의 링커를 매개로 펩티드 사슬을 고상 상에 구축하는 방법이다(Safety Catch linker, Fujii method, Dawson method, Mercapto propanol method, Kawakami method, Danishefsky method, Hojo method, Aimoto method, etc.). 이 방법은, 링커에 의해 적절한 처리를 행하여 구축한 펩티드 사슬 C 말단을 활성화한 후, 펩티드 사슬을 thiolysis함으로써 티오에스테르를 얻는 방법이다(비특허문헌 1).
이들 이외에도 고상합성에 의해 측쇄가 보호되고 C 말단의 카르복실기만이 유리(遊離)되는 보호 펩티드를 합성한 후에, 적당한 축합조건으로 티오에스테르화하는 방법도 보고되어 있다(예를 들면, 특허문헌 2). 어느 방법도 확립된 방법으로, 과거의 다양한 단백질 합성에 있어서 사용되어 왔다. 그러나, 어느 수법도, 고상합성법의 제한에 속박되기 때문에, 합성할 수 있는 펩티드 티오에스테르체의 사이즈가 제한되어 버린다. 또한, 링커를 사용하는 수법의 경우는, 비천연형의 아미노산 유도체나, 특별한 유도체를 별도로 화학합성해야만 하기 때문에, 반드시 그 절차는 간편하다고는 할 수 없다.
고상합성법에 의한 티오에스테르화의 제한을 해결한 방법으로 Intein법이 있다(비특허문헌 2). 이는 세포에 의해 생합성된 폴리펩티드 프래그먼트를 티오에스테르체로서 얻을 수 있는 방법이다. Intein법의 경우는, 특정 단백질 서열에서 일어나는 단백질 스플라이싱 기능을 이용함으로써, 펩티드 사슬의 티오에스테르화를 행하여, 폴리펩티드 사슬을 티오에스테르체로서 얻는다. 이 방법의 유용점은 장쇄의 펩티드 티오에스테르를 얻을 수 있는 점이다. 이 수법과 화학합성법의 조합에 의해, 지금까지 합성하는 것이 곤란하다고 생각되어 온 대형의 피수식 단백질이더라도 합성이 가능해졌다(비특허문헌 3). 폴리펩티드 사슬을 발현하고, 얻는 방법은 이미 방대한 연구가 이루어져 있어, 생물학의 기본기술로서 충분히 확립되어 있다.
그러나, Intein법을 사용하는 경우는, 폴리펩티드를 발현시킬뿐 아니라, 단백질 스플라이싱을 기능시키기 위해, 표적이 되는 펩티드 서열이 필요하며, 또한 반드시 발현한 인테인 복합 단백질이 폴딩되어, 고유의 3차원 구조를 취해야만 한다. 이 때문에, 발현시키는 폴리펩티드 서열에 따라서는, 반드시 펩티드 티오에스테르가 얻어지지는 않아, 항상 충분한 조건의 최적화가 수반되어, 화학적인 번잡함이 뒤따른다.
한편, 펩티드의 절단방법으로서는, 펩티드 중의 시스테인 잔기의 SH기에 화합물을 반응시킴으로써 상기 시스테인 잔기의 위치에서 펩티드 사슬을 절단하는 방법이나(비특허문헌 4, 5), 링커를 사용하여 고상에 결합되어 있는 펩티드를 절단하는 방법이 알려져 있다(비특허문헌 6, 7). 또한, 브롬화시안(CNBr)을 사용하여, 메티오닌 잔기의 C 말단측의 펩티드 결합을 절단하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이들은 펩티드 단편을 티오에스테르체로서 얻는 방법은 아니다.
국제공개 WO96/34878호 국제공개 WO2007/114454호
Ingenito et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11369-11374 Schwartz et al., CHEM COMMUN., 2003, 2087-2090 Muir, Annu. Rev. Biochem. 2003, 72:249-289 Stark GR, Methods of Enzymology, 1977, 47, 129-132 Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 5513-5514 Sola et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1993, 1786-1788 Pascal et al., Tetrahedron Letters, 1994, Vol. 35, No. 34:6291-6294
상기 배경기술에 나타내어지는 바와 같은, 펩티드 티오에스테르화법의 경우는, 티오에스테르화할 수 있는 펩티드가 고상합성된 펩티드 사슬이나, 단백질 스플라이싱의 표적이 되는 펩티드 사슬에 한정된다. 이는 어느 수법도 비천연형의 아미노산 유도체나, 링커, 특정 3차원 구조 등을 필요로 하기 때문이다.
이에, 본 발명은, 폴리펩티드 사슬을 화학적으로 펩티드 티오에스테르체로 변환하는 신규한 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 펩티드 서열 중의 천연의 아미노산 잔기를 표적으로 하여, 선택적으로 펩티드 C 말단을 활성화하는 방법이 필요하다고 생각하였다. 이러한 방법이라면, 생합성 등의 어떠한 방법으로 얻어진 펩티드이더라도, 선택적으로 펩티드 사슬을 활성화하여, 티오에스테르화를 행하는 것이 가능하다.
이에, 본 발명자들은, 천연형 아미노산 중에서도 특수한 황 함유 아미노산인 시스테인 잔기에 주목하였다. 그리고, 하기의 도면에 나타내는 바와 같이, 시스테인 잔기의 티올기에, -C(=X)-R1기를 도입하고, 이것에 대해, 유기용매 중에서 -NH-C(=Y)NHR3로 표시되는 이탈기를 갖는 화합물을 반응시킴으로써, 시스테인 잔기의 N 말단측 펩티드 결합의 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기가 부가되고, 상기 펩티드 결합이 절단되어, C 말단측의 펩티드 단편이 절제되는 것을 발견하였다. 또한, 이 -NH-C(=Y)NHR3기가 부가된 펩티드 사슬에 완충용액 중에서 티올 화합물을 반응시킴으로써, -NH-C(=Y)NHR3기가 결합되어 있는 카르보닐 탄소에 대해, 상기 티올의 티올기가 결합하여, 상기 -NH-C(=Y)NHR3기가 이탈된다고 하는 티올의 교환반응에 의해, 펩티드 티오에스테르로 변환할 수 있는 것을 발견하였다.
상기의 일례로서, 구체적으로는, 먼저 시스테인 잔기의 티올기에 티오노포메이트기를 도입하였다. 그리고, 이 티오노포메이트기에 대해 유기용매 중에서 N-아세틸구아니딘을 반응시킴으로써, 시스테인 잔기의 N 말단측에서 펩티드 사슬의 절단이 생기고, C 말단이 N-아세틸구아니디도화된 펩티드 사슬을 얻었다. 또한, 이 N-아세틸구아니디도화된 펩티드 사슬은 완충용액 중에서 티올 R4-SH와 반응하여, 펩티드 티오에스테르로 변환되었다.
또한, 상기에서 얻어진, C 말단이 N-아세틸구아니디도화된 펩티드 사슬, 및 펩티드 티오에스테르체를, NCL법에 이용 가능한 것을 발견하였다.
Figure 112012003719737-pct00001
즉, 본 발명은, 구체적으로는 이하의 [1]~[14]를 제공하는 것이다.
[1]
펩티드 티오에스테르체의 제조방법으로서, 이하의 공정(a)~(c)：
(a) 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 사슬에 있어서, 상기 시스테인 잔기의 티올기에, 이하의 화학식 I：
[화학식 I]
Figure 112012003719737-pct00002
[화학식 중,
X는 황원자 또는 산소원자이고,
R1 및 R2는 이탈기이다.]
으로 표시되는 화합물 A를 반응시킴으로써 R2를 이탈시켜, 제1 중간체를 제작하는 공정；
(b) 유기용매 중에서, 상기 제1 중간체에 이하의 화학식 II：
[화학식 II]
Figure 112012003719737-pct00003
[화학식 중,
Y는 산소원자, 황원자, 또는, NH기이고,
R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
로 표시되는 화합물 B를 반응시켜, 상기 시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가하고, 상기 펩티드 결합을 절단함으로써, 절단된 상기 펩티드 결합보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 제2 중간체로서 얻는 공정； 및
(c) 상기 제2 중간체에 티올을 반응시키고, C 말단의 -NH-C(=Y)NHR3기와 티올기를 교환시킴으로써, 제2 중간체의 C 말단을 티오에스테르화하는 공정
을 포함하는, 방법.
[2]
X가 황원자인 상기 [1]에 기재된 방법.
[3]
R1이 -O-C6 아릴기인 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4]
R2가 할로겐원자 또는 치환 또는 비치환의 -S-C6-10 아릴기인 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5]
Y가 NH기인, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[6]
R3가 아세틸기인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[7]
상기 공정(c)에 있어서, 상기 티올이 이하의 화학식 III：
[화학식 III]
Figure 112012003719737-pct00004
[화학식 중, R4는 치환 또는 비치환의 벤질기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 및 치환 또는 비치환의 알킬기로부터 선택되는 어느 하나의 기이다.]
로 표시되는 티올인, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[8]
펩티드 사슬이 재조합 단백질인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[9]
펩티드 사슬이 정제용 태그를 포함하는 재조합 단백질인, 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[10]
상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 티오에스테르체와, N 말단에 시스테인을 갖는 펩티드 사슬을 라이게이션법에 의해 결합하는 공정을 포함하는, 폴리펩티드의 제조방법.
[11]
상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 펩티드 티오에스테르체의 제조방법에 사용하는 제2 중간체의 제조방법으로서, 이하의 공정(a) 또는 (b)：
(a) 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 사슬에 있어서, 상기 시스테인 잔기의 티올기에, 이하의 화학식 I：
[화학식 I]
Figure 112012003719737-pct00005
[화학식 중,
X는 황원자 또는 산소원자이고,
R1 및 R2는 이탈기이다.]
으로 표시되는 화합물 A를 반응시킴으로써 R2를 이탈시켜, 제1 중간체를 제작하는 공정；
(b) 유기용매 중에서, 상기 제1 중간체에 이하의 화학식 II：
[화학식 II]
Figure 112012003719737-pct00006
[화학식 중,
Y는 산소원자, 황원자, 또는, NH기이고,
R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
로 표시되는 화합물 B를 반응시켜, 상기 시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가하고, 상기 펩티드 결합을 절단함으로써, 절단된 상기 펩티드 결합보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 제2 중간체로서 얻는 공정
을 포함하는, 방법.
[12]
C 말단에 -NH-C(=Y)NHR3기
[화학식 중, Y는 산소원자 또는 NH기이고,
R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
를 갖는 펩티드 사슬.
[13]
상기 [12]에 기재된, C 말단에 -NH-C(=Y)NHR3기를 갖는 펩티드 사슬과, N 말단에 시스테인을 갖는 펩티드 사슬을 라이게이션법에 의해 결합하는 공정을 포함하는, 폴리펩티드의 제조방법.
[14]
재조합 단백질의 C 말단측에 부가된 정제용 태그를 제거하는 방법으로서, 이하의 공정(a)~(c)：
(a) C 말단에 정제용 태그를 포함하는 재조합 단백질에 있어서, 시스테인 잔기의 티올기에, 이하의 화학식 I：
[화학식 I]
Figure 112012003719737-pct00007
[화학식 중,
X는 황원자 또는 산소원자이고,
R1 및 R2는 이탈기이다.]
으로 표시되는 화합물 A를 반응시킴으로써 R2를 이탈시켜, 제1 중간체를 제작하는 공정；
(b) 유기용매 중에서, 상기 제1 중간체에 이하의 화학식 II：
[화학식 II]
Figure 112012003719737-pct00008
[화학식 중,
Y는 산소원자, 황원자, 또는, NH기이고,
R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
로 표시되는 화합물 B를 반응시켜, 상기 시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가하고, 상기 펩티드 결합을 절단함으로써, 절단된 상기 펩티드 결합보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 제2 중간체로서 얻는 공정； 및
(c) 상기 제2 중간체에 티올을 반응시키고, C 말단의 -NH-C(=Y)NHR3기와 티올기를 교환시킴으로써, 제2 중간체의 C 말단을 티오에스테르화하는 공정
을 포함하는, 방법.
본 발명에 의해, 폴리펩티드 사슬을 화학적으로 펩티드 티오에스테르체로 변환하는 신규한 방법이 제공되었다.
본 발명의 방법은, 종래의 티오에스테르화법에 필요한, 비천연형의 아미노산 유도체나 링커, 또는, 특정 3차원 구조 등을 갖지 않는 펩티드 사슬에 있어서도 티오에스테르화가 가능하다. 따라서, 생합성 등에 의해 얻어진 장쇄의 폴리펩티드 단편이더라도, 용이하게 티오에스테르화하는 것이 가능해졌다.
또한, 본 발명의 방법을 종래의 펩티드 합성법과 병용함으로써, 지금까지 합성이 곤란했던 펩티드의 일부분에 수식을 갖는 장쇄 펩티드이더라도, 예를 들면, 수식을 갖지 않는 부분은 비교적 장쇄를 합성하기 쉬운 생합성법을 사용하여 프래그먼트를 제작하고, 수식을 갖는 부분은 고상합성법을 사용하여 프래그먼트를 제작하여, 이들을 연결함으로써 간편하게 제조하는 것이 가능하다.
보다 구체적으로는, 수식이 당쇄인 경우는, 천연 결합형의 당쇄를 부가한 아미노산을 포함하는 단편만을 화학합성하고, 그 밖의 부분을 생합성에 의해 조제하여, 본원의 방법으로 티오에스테르화하고, 연결함으로써, 보다 장쇄의 당쇄 펩티드를 간편하게 제조 가능하다.
또한, 링커를 매개로 펩티드 사슬에 당쇄 등을 나중에 부가하는 방법이 공지이고, 이는 생합성한 장쇄 펩티드에도 당쇄를 나중에 부가하는 것이 가능하다. 그러나, 이 링커를 매개로 한 당쇄 결합방법은, 특정 아미노산이나 구조를 이용하여 당쇄 등을 결합시키는 것이다. 따라서, 예를 들면, 당쇄가 결합 가능한 부위가 펩티드 중에 복수 존재하는 경우에는, 생합성에 의해 장쇄 펩티드를 얻은 후에, 목적하는 결합 부위만을 포함하는 펩티드 프래그먼트를 장쇄 펩티드로부터 잘라내어 당쇄를 부가하고, 본원의 티오에스테르화 방법을 사용하여 당해 당쇄 부가 펩티드 프래그먼트를 티오에스테르화하여, 나머지 부분과 다시 연결함으로써, 종래와 비교하여 보다 간편하게 부위 선택적으로 당쇄를 부가하는 것도 가능하다.
또한, 생합성에 있어서는, 전장의 단백질은 정상으로 발현되어도, 펩티드 프래그먼트의 경우는 세포 중에서 미스라고 인식되어, 분해되는 등 정상으로 발현되지 않는 경우도 있을 수 있다. 전장 단백질을 생합성한 후에, 수식을 하고자 하는 부분의 프래그먼트만을 잘라내고, 필요한 수식 등의 처리를 행한 후에, 본원의 방법을 사용하여 피수식 펩티드 프래그먼트를 티오에스테르화하고, 나머지 부분과 다시 연결하여, 목적하는 피수식 단백질을 얻는 것도 가능하다.
이상과 같이, 본 발명의 펩티드 티오에스테르화방법은, 단백질의 합성 전반에 있어서 유용하다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해서 설명한다.
본 발명은, 신규한 펩티드 티오에스테르체의 제조방법으로서, 이하의 공정(a)~(c)：
(a) 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 사슬에 있어서, 상기 시스테인 잔기의 티올기에, 이하의 화학식 I：
[화학식 I]
Figure 112012003719737-pct00009
[화학식 중,
X는 황원자 또는 산소원자이고,
R1 및 R2는 이탈기이다.]
으로 표시되는 화합물 A를 반응시킴으로써 R2를 이탈시켜, 제1 중간체를 제작하는 공정；
(b) 유기용매 중에서, 상기 제1 중간체에 이하의 화학식 II：
[화학식 II]
Figure 112012003719737-pct00010
[화학식 중,
Y는 산소원자, 황원자, 또는, NH기이고,
R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
로 표시되는 화합물 B를 반응시켜, 상기 시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가하고, 상기 펩티드 결합을 절단함으로써, 절단된 상기 펩티드 결합보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 제2 중간체로서 얻는 공정； 및
(c) 상기 제2 중간체에 티올을 반응시키고, C 말단의 -NH-C(=Y)NHR3기와 티올기를 교환시킴으로써, 제2 중간체의 C 말단을 티오에스테르화하는 공정
을 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 「펩티드」란, 2 이상의 아미노산이 아미드 결합에 의해 결합되어 있는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 공지 펩티드 및 신규 펩티드 및 펩티드 개변체를 포함한다. 일반적으로 단백질이라 불리는 것도, 본 발명에 있어서는 펩티드 중에 포함하는 것으로 한다. 또한, 본 발명에 있어서는 「폴리펩티드」도, 마찬가지로 펩티드 중에 포함하는 것으로 한다. 본 발명의 방법에 사용되는 펩티드 사슬은, 천연의 단백질이어도 되고, 생합성, 화학합성 또는 무세포합성 등의 방법에 의해 얻어진 펩티드 사슬이어도 된다.
본 발명에 있어서, 「펩티드 개변체」란, 펩티드의 자연 변이체, 번역 후 수식체, 또는 인공적으로 개변한 화합물을 포함한다. 그러한 개변으로서는, 예를 들면, 펩티드의 1 또는 복수의 아미노산 잔기의, 알킬화, 아실화(예를 들면 아세틸화), 아미드화(예를 들면, 펩티드의 C 말단의 아미드화), 카르복실화, 에스테르 형성, 디설피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 수산화, 표지 성분의 결합 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「아미노산」이란, 그 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연의 아미노산, 예를 들면 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 글리신(Gly), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파라긴(Asp), 글루타민산(Glu), 글루타민(Gln), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 프롤린(Pro)뿐 아니라, 아미노산 변이체 및 유도체 등과 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 당업자라면, 이 넓은 정의를 고려하여, 본 발명에 있어서의 아미노산으로서, 예를 들면 L-아미노산；D-아미노산；아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학 수식된 아미노산；노르류신(norleucine), β-알라닌, 오르니틴 등 생체 내에서 단백질의 구성재료가 되지 않는 아미노산；및 당업자에게 공지의 아미노산의 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있는 것을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에서, 티오에스테르화되는 펩티드 사슬은, 시스테인 잔기를 포함하는 펩티드 사슬이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 펩티드 사슬의 유래나 합성방법, 사이즈 등은 특별히 한정되지 않는다. 또한 수식이나 보호기를 가지고 있어도 된다.
본 발명에서 사용되는 펩티드 사슬이 포함하는 시스테인 잔기 수는 특별히 한정되지 않으나, 시스테인 잔기를 표적으로 하여 펩티드 사슬이 절단된다. 따라서, 시스테인 잔기를 갖는 개소에 따라, 최종적으로 합성하는 단백질의 기본골격을 설계할 필요가 있는데, 당업자라면 이러한 설계는 용이하게 이룰 수 있다. 또한, 복수 개의 시스테인 잔기를 포함하는 펩티드 사슬에 있어서, 목적하는 시스테인 잔기의 위치에서만 티오에스테르화를 행하여, 나머지 시스테인 잔기가 반응의 영향을 받지 않도록, 목적하는 시스테인 잔기 이외의 시스테인 잔기를 사전에 보호기 등으로 보호해 두어도 된다. 이러한 보호기의 예로서는 Acm기 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 펩티드 사슬은, N 말단측에 지용성 보호기를 가지고 있어도 된다. 바람직한 보호기로서는, 아세틸(Ac)기 등의 아실기, ｔ-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, 알릴옥시카르보닐(Alloc)기 등의 카르보닐 함유기, 알릴기, 벤질기 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 사용되는 펩티드 사슬은, 천연의 단백질이어도 되고, 생합성, 화학합성 또는 무세포합성 등의 방법에 의해 얻어진 펩티드 사슬이어도 되나, 바람직하게는 균체 또는 세포 내에서 발현된 재조합 단백질이다. 재조합 단백질은 인위적으로 균체 내 또는 세포 내에서 발현시키는 한, 천연의 단백질과 동일한 펩티드 서열을 갖는 것이어도 되고, 변이나 정제용 태그 등의 수식을 갖는 펩티드 서열을 갖는 것이어도 된다.
본 발명에서 사용하는 재조합 단백질은, 당업자에게 공지의 방법에 의해 조제가 가능하다. 예를 들면, 재조합 벡터에 목적의 유전자를 도입하여 발현시킬 수 있다. 본 발명에서 사용하는 재조합 벡터로서는, 숙주세포를 형질전환할 수 있는 것이면 되고, 숙주세포에 대해 대장균용 플라스미드, 고초균용 플라스미드, 효모용 플라스미드, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 베큘로바이러스 등의 동물 바이러스 벡터 등이 사용된다. 이들에는, 그 숙주세포에서 단백질을 적절히 발현시킬 수 있는 프로모터 등의 제어 서열을 가지고 있는 것이 바람직하다. 또한, 숙주세포로서는, 재조합 벡터에서 외래성 유전자를 발현할 수 있는 것이면 되고, 일반적으로는, 대장균, 고초균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등이 사용된다.
숙주세포에 재조합 벡터를 이입하는 방법으로서는, 일반적으로 상용되고 있는 방법을 사용하면 되고, 예를 들면, 대장균의 경우는 염화칼슘법이나 전기천공법, 효모의 경우는 염화리튬법이나 전기천공법을 이용할 수 있다. 또한, 동물세포의 형질전환은, 전기천공 등의 물리적 방법, 또는, 리포솜법이나 인산칼슘법 등의 화학적 방법, 또는 레트로바이러스 등의 바이러스 벡터를 사용해서 행할 수 있다. 형질전환체인 숙주세포의 배양형태는, 숙주의 영양 생리학적 성질을 고려하여 배양조건을 선택하면 된다.
본 발명에서 사용되는 펩티드는, 정제되어 있는 것이 바람직하다. 펩티드의 정제방법은 통상의 일반적인 정제에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 재조합 단백질의 경우는, 본 발명에서 사용되는 재조합 단백질을 발현하는 균체 또는 세포를 배양 후, 공지의 방법으로 균체 또는 세포를 모으고, 이것을 적당한 완충액에 현탁하여, 초음파, 라이소자임 및/또는 동결융해 등에 의해 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과에 의해 펩티드의 조(粗)추출액을 조제한다. 완충액 중에는, 요소나 염산구아니딘 등의 단백질 변성제나, 트리톤 X-100TM 등의 계면활성제가 포함되어 있어도 된다. 이와 같이 하여 얻어진 추출액, 또는 배양상청 중에 포함되는 펩티드의 정제는, 공지의 정제방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 겔여과, 전기영동, 염석, 투석 등을 적절히 선택, 조합함으로써, 펩티드의 분리, 정제를 행하는 것이 가능하다.
또한, 재조합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해, 발현 벡터에 정제용 태그를 삽입해 두는 것도 가능하다. 정제용 태그의 예로서는, 예를 들면, His 태그, GST 태그, Myc 태그, FLAG 태그, 말토오스 결합 단백(MBP) 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 펩티드 사슬 내에 배치된 Cys로부터 N 말단측을 티오에스테르화하는 것으로부터, 펩티드의 C 말단측에 정제용 태그를 부가하여 정제 후에 티오에스테르화함으로써, 펩티드 사슬 중의 Cys로부터 C 말단측은 태그째 잘라 버려져, 효율적으로 펩티드 티오에스테르체를 얻을 수 있다. Cys의 위치를 펩티드 사슬 상의 목적하는 위치에 배치함으로써, 본 발명의 방법을 C 말단측의 태그의 제거에 사용하는 것도 가능하다.
따라서, 본 발명의 펩티드 티오에스테르체의 제조방법을 사용하여, 재조합 단백질의 C 말단에 부가된 정제용 태그를 제거하는 방법도 또한, 본 발명에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「펩티드 티오에스테르체」(이하, 간단히 티오에스테르체로 기재하는 경우도 있다)는 C 말단에 카르복시티오에스테르 부분(-C=O-SR)을 갖는 펩티드를 말한다. 본 발명에서 사용되는 펩티드 티오에스테르체는, 다른 티올기와 교환반응을 일으킬 수 있는 티오에스테르체라면, 특별히 한정되지 않는다. R기로서는, 예를 들면, 하기의 R4에 예시되는 기를 들 수 있다.
본 발명의방법은, 먼저, (a) 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 사슬에 있어서, 상기 시스테인 잔기의 티올기에 화합물 A를 반응시킴으로써, 제1 중간체를 제작하는 공정을 행한다.
본 발명에 있어서, 화합물 A는 이하의 화학식 I으로 나타내어진다.
[화학식 I]
Figure 112012003719737-pct00011
화학식 중, X는 황원자 또는 산소원자이나, 바람직하게는 황원자이다.
R1 및 R2는 이탈기로서, 하기 공정(a)의 반응 조건하에 있어서, 치환되는 원자 또는 원자단보다도 구핵성이 낮고, 이탈되는 기능을 갖는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, R1 및 R2는 각각 상이한 이탈기인 것이 바람직하다. R1 및 R2로서 구체적으로는, 할로겐원자, 치환 또는 비치환의 -O-알킬기, 치환 또는 비치환의 -O-알케닐기, 치환 또는 비치환의 -O-알키닐기, 치환 또는 비치환의 -O-아릴기, 치환 또는 비치환의 -O-헤테로아릴기, 치환 또는 비치환의 -S-알킬기, 치환 또는 비치환의 -S-알케닐기, 치환 또는 비치환의 -S-알키닐기, 치환 또는 비치환의 -S-아릴기, 또는, 치환 또는 비치환의 -S-헤테로아릴기를 들 수 있다. R1 및 R2로서 보다 바람직하게는, R1이 치환 또는 비치환의 -O-C6-10 아릴기, 및 치환 또는 비치환의 -S-C1-8 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 이탈기, 및 R2가 할로겐원자, 치환 또는 비치환의 -S-C1-8 알킬기, 치환 또는 비치환의 -S-C6-10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 이탈기인 조합을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「알킬기」란, 지방족 탄화수소로부터 임의의 수소원자를 1개 제거하고 유도되는 1가의 기로, 수소 및 탄소원자를 함유하는 히드로카르빌 또는 탄화수소의 부분 집합을 갖는다. 알킬기는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 구조를 포함한다. 본 발명의 알킬기로서 바람직하게는, 탄소원자수가 1~8인 알킬기를 들 수 있다. 또한, 「C1-8 알킬기」란, 탄소원자수가 1~8인 알킬기를 나타내고, 구체예로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 펜틸기, 헥실기, 헵틸기, 옥틸기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「알케닐기」란, 1개 이상의 이중결합을 갖는 1가의 기이다. 이중결합 및 치환기의 배치에 따라, 이중결합의 기하학적 형태는, 엔트게겐(Entgegen)(E) 또는 주잠멘(Zusammen)(Z), 시스(cis) 또는 트랜스(trans) 배치를 취할 수 있다. 알케닐기는, 직쇄상 또는 분지쇄상을 포함한다. 본 발명의 알케닐기로서 바람직하게는, 탄소원자수가 2~8인 알케닐기를 들 수 있다. 「C2-8 알케닐기」란, 탄소원자수가 2~8인 알케닐기를 나타내고, 구체예로서는, 비닐기, 알릴기, 프로페닐기, 부테닐기, 펜테닐기, 헥세닐기, 헵테닐기, 옥테닐기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「알키닐기」란, 1개 이상의 삼중결합을 갖는, 1가의 기이다. 알키닐기는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 알키닐기를 포함한다. 본 발명의 알키닐기로서 바람직하게는, 탄소원자수가 2~8인 알키닐기를 들 수 있다. 「C2-8 알키닐기」란, 탄소원자수가 2~8인 알키닐기를 나타내고, 구체예로서는, 에티닐기, 1-프로피닐기, 2-프로피닐기, 부티닐기, 펜티닐기, 헥시닐기, 헵티닐기, 옥티닐기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「아릴기」란, 방향족성의 탄화수소 환식기를 의미한다. 본 발명의 아릴기로서 바람직하게는, 탄소원자수가 6~10인 아릴기를 들 수 있다. 「C6-10 아릴기」란, 탄소원자수가 6~10인 아릴기를 나타내고, 구체적으로는, 예를 들면, 페닐기, 1-나프틸기, 2-나프틸기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「헤테로아릴기」란, 헤테로아릴 고리로부터 임의의 위치의 수소원자를 1 또는 2개 제거하고 유도되는 1가 또는 2가의 기를 의미한다. 본 발명에 있어서, 「헤테로아릴 고리」란, 고리를 구성하는 원자 중에 1 또는 복수 개의 헤테로원자를 함유하는 방향족성의 고리를 의미하고, 바람직하게는 5-9원환(員環)이다. 고리는 단환(單環)이어도 되고, 벤젠 고리 또는 단환 헤테로아릴 고리와 축합한 2환식 헤테로아릴기여도 된다. 구체예로서는, 푸라닐기, 티오페닐기, 피롤릴기, 벤조푸라닐기, 벤조티오페닐기, 인돌릴기, 피리딜기, 퀴놀리닐기 등을 들 수 있다.
전술한 이탈기가 갖는 치환기의 종류, 개수, 치환 위치는 특별히 한정되지 않으나, 치환기로서, 예를 들면, 알킬기, 알케닐기, 알콕시기, 아릴기, 포르밀기, 카르보닐기, 카르복실기, 알킬카르복실기, 알콕시카르보닐기, 할로겐, 설포닐기, 또는 니트로기 등을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 A로서, 보다 구체적으로는,
Figure 112012003719737-pct00012
Figure 112012003719737-pct00013
Figure 112012003719737-pct00014
Figure 112012003719737-pct00015
등을 들 수 있다.
또한, 상기의,
Figure 112012003719737-pct00016
Figure 112012003719737-pct00017
에 MPAA((4-카르복시메틸)티오페놀)를 반응시킨 하기의 티오노포메이트화 시약,
Figure 112012003719737-pct00018
Figure 112012003719737-pct00019
을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 화합물 A를 펩티드 중의 시스테인 잔기에 반응시킴으로써, 하기 도면과 같이 시스테인 잔기 중의 SH기에 -C(=X)-R1기가 결합한, 제1 중간체를 얻을 수 있다.
Figure 112012003719737-pct00020
본 발명에 있어서, 공정(a)는, 산성 조건하가 바람직하고, 특히 pH 3~5에서 행하는 것이 바람직하다. 반응은, 완충액과 아세토니트릴의 혼합용매 중, 0~50℃, 바람직하게는 15~25℃에서, 약 0.1~3시간, 바람직하게는 10분~1시간 행하는 것이 바람직하나, 이것에 한정되지 않는다.
이어서, 본 발명의 방법에서는, (b) 유기용매 중에서, 상기 제1 중간체에 화합물 B를 반응시켜, 상기 시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가하고, 상기 펩티드 결합을 절단함으로써, 절단된 상기 펩티드 결합보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 제2 중간체로서 얻는 공정을 행한다.
본 발명에 있어서, 화합물 B는 이하의 화학식 II로 나타내어진다.
[화학식 II]
Figure 112012003719737-pct00021
화학식 중, Y는 산소원자, NH기, 또는, 황원자이고, R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.
본 발명에 있어서, 「아실기」란, 카르복실산의 카르복실기로부터 OH기를 제거한 원자단을 의미한다. 본 발명의 아실기로서, 바람직하게는 탄소원자수가 1-4인 아실기를 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티로일기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「알콕시기」란, 「알킬기」가 결합한 옥시기인 것을 의미한다. 본 발명의 알콕시기는, 직쇄상이어도 되고 분지쇄상이어도 된다. 본 발명의 알콕시기로서, 바람직하게는 탄소원자수가 1~14인 직쇄상 알콕시기 또는 탄소원자수가 3~14개인 분지쇄상 알콕시기를 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 메톡시기, 에톡시기, n-프로필옥시기, 이소프로폭시기, n-부톡시기, 2-메틸-2-프로필옥시기, n-펜틸옥시기, n-헥실옥시기 등을 들 수 있다.
또한, 「C2-n 알콕시카르보닐기」란, C1-(n-1)의 알콕시기를 갖는 카르보닐기인 것을 의미한다. 본 발명의 알콕시카르보닐기로서, 바람직하게는 탄소원자수가 2~15인 알콕시카르보닐기를 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, n-프로필옥시카르보닐기, 이소프로폭시카르보닐기, n-부톡시카르보닐기, 2-메틸-2-프로필옥시카르보닐기, n-펜틸옥시카르보닐기, n-헥실옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.
아실기로서, 바람직하게는, 아세틸기를 들 수 있다. 또한, 알콕시카르보닐기로서 바람직하게는 tert-부톡시카르보닐기(Boc기)를 들 수 있다.
본 발명의 화합물 B로서, 보다 구체적으로는,
Figure 112012003719737-pct00022
Figure 112012003719737-pct00023
Figure 112012003719737-pct00024
Figure 112012003719737-pct00025
등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 공정(b)는, 유기용매의 존재하에 있어서 행하는 것이 바람직하다. 유기용매는 용해성이 높고, 또한, 구핵성이 낮은 것이 바람직하다. 이러한 유기용매로서는, 예를 들면, DMSO, DMF, 디옥산 등을 들 수 있다. 반응은, 0~50℃, 바람직하게는 15~25℃에서, 약 1~24시간, 바람직하게는 5~10시간 행하는 것이 바람직하나, 이것에 한정되지 않는다.
시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가함으로써, 하기 도면과 같이, 시스테인 잔기의 N 말단측에서 펩티드 사슬이 절단된다.
Figure 112012003719737-pct00026
또한, 펩티드의 측쇄에 아미노기를 갖는 경우에는, 본 발명의 공정(b)를 행하기 전에, 측쇄의 아미노기에 지용성의 보호기를 도입해도 된다. 지용성 보호기로서는, 예를 들면, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, ｔ-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 알릴옥시카르보닐(Alloc)기 등의 카르보닐 함유기, 아세틸(Ac)기 등의 아실기, 알릴기, 벤질기 등의 보호기를 들 수 있으나, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니다.
지용성 보호기를 도입하는데는, 예를 들면 Fmoc기를 도입하는 경우에는 9-플루오레닐메틸-N-숙시니미딜카보네이트와 탄산수소나트륨을 첨가하여 반응을 행함으로써 도입할 수 있다. 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1~5시간 정도 행하는 것이 좋지만, 이것에 한정되지 않는다.
공정(b)에 있어서는, 절단된 펩티드 사슬의 절단부보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 하기 화학식 1의 제2 중간체로서 얻을 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112012003719737-pct00027
본 발명의 펩티드 티오에스테르체의 제조방법은, 추가로, (c) 상기 제2 중간체에 티올을 반응시키고, C 말단의 -NH-C(=Y)NHR3기와 티올기를 교환시킴으로써, 제2 중간체의 C 말단을 티오에스테르화하는 공정을 포함한다.
공정(c)에 사용하는 제2 중간체는, 공정(b) 후에 단리되어 있어도 되고, 단리되어 있지 않아도 된다.
바람직한 태양에 있어서, 상기 공정(c)에는, 이하의 화학식 III로 표시되는 티올이 사용된다.
[화학식 III]
Figure 112012003719737-pct00028
R4는 티올 교환반응을 저해하지 않고, 카르보닐 탄소 상에서의 치환반응에 있어서 이탈기가 되는 기라면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, R4는 치환 또는 비치환의 벤질기, 치환 또는 비치환의 아릴기 및 치환 또는 비치환의 알킬기로부터 선택되는 어느 하나의 기이고, 보다 바람직하게는 치환 또는 비치환의 벤질기, 치환 또는 비치환의 C6-10 아릴기, 및 치환 또는 비치환의 C1-8 알킬기로부터 선택되는 어느 하나의 기이다. 보다 구체적으로는, 벤질메르캅탄 등의 벤질형의 이탈기, 티오페놀, 4-(카르복시메틸)-티오페놀 등의 아릴형의 이탈기, 2-메르캅토에탄설폰산기, 3-메르캅토프로피온산아미드 등의 알킬형의 이탈기 등으로부터 선택할 수 있다. 이들 이탈기가 갖는 치환기의 종류, 개수, 치환 위치는 특별히 한정되지 않는다.
공정(c)를 행함으로써, 제2 중간체는, 하기의 도면과 같이 완전히 티오에스테르체로 변환된다.
Figure 112012003719737-pct00029
전술한 바와 같이 하여 얻어진 펩티드 티오에스테르체는, 펩티드 또는 피수식 펩티드 중, -SH기를 갖는 아미노산 잔기를 N 말단에 포함하는 펩티드(또는 피수식 펩티드)와, 라이게이션법을 사용하여 연결할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 펩티드 티오에스테르체와, N 말단에 시스테인을 갖는 펩티드 사슬을 라이게이션법에 의해 결합하는 공정을 포함하는, 폴리펩티드의 제조방법도 또한 제공한다.
또한, 상기 펩티드 티오에스테르체 대신에, 상기 공정(b)에서 얻어진 제2 중간체를, 라이게이션법에 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 「라이게이션법」이란, 특허문헌 1에 기재된 천연형 화학적 라이게이션법(Native Chemical Ligation, NCL법)뿐 아니라, 비천연 아미노산, 아미노산 유도체(예를 들면, 트레오닌 유도체 A, 보호 메티오닌, 당쇄 부가 아미노산 등)를 포함하는 펩티드에 대해서, 상기 천연형 화학적 라이게이션법을 응용하는 경우도 포함한다. 라이게이션법에 의해, 연결 부위에 천연 아미드 결합(펩티드 결합)을 갖는 펩티드를 제조할 수 있다.
라이게이션법을 사용한 연결은, 펩티드-펩티드간, 펩티드-피수식 펩티드간, 피수식 펩티드-피수식 펩티드간 중 어느 것에 있어서도 행할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는, 특정 실시형태를 설명하기 위해 사용되는 것으로, 설명을 한정하는 의도는 아니다.
또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 「포함한다」는 용어는, 문맥상 명확하게 다른 이해를 해야하는 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 공정, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것으로, 그 이외의 사항(부재, 공정, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.
상이한 정의가 없는 한, 여기에 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는, 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는, 상이한 정의가 명시되어 있지 않는 한, 본 명세서 및 관련 기술분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로서 이해되어야 하고, 이상화되거나, 또는 과도하게 형식적인 의미에 있어서 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 실시형태는 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있는데, 모식도인 경우, 설명을 명확히 하기 위해, 과장되게 표현되어 있는 경우가 있다.
제1, 제2 등의 용어가 각종 요소를 표현하기 위해 사용되나, 이들 요소는 그들 용어에 의해 한정되어야 하는 것이 아닌 것이 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들면, 제1 요소를 제2 요소로 표기하고, 마찬가지로, 제2 요소는 제1 요소로 표기하는 것은, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 가능하다.
이하에 있어서, 본 발명을, 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 태양에 의해 구현화할 수 있고, 여기에 기재되는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1. 티오노포메이트기의 도입
(MPAA 페닐티오노포메이트의 합성)
Figure 112012003719737-pct00030
MPAA((4-카르복시메틸)티오페놀)(98 ㎎, 0.583 mmol), 페닐클로로티오노포메이트(Phenyl chloro thionoformate)(103 μL, 0.76 mmol)를 디클로로메탄(400 μL)에 용해하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 1시간 후, 반응용액을 실온에서 클로로포름 2.0 mL로 희석하고, 포화중조수 1.0 mL를 첨가하여, 이 혼합물을 클로로포름으로 추출 세정하였다. 클로로포름층을 포화식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조한 후에 감압 농축하여, 황색 투명의 시럽형상의 잔사를 얻었다. 이것을 이후의 티오노포메이트화 시약(MPAA 페닐티오노포메이트)으로서 사용하였다(MW：305.3, MS 데이터 없음).
(MPAA 페닐티오노포메이트 시약에 의한 티오노포메이트기의 도입)
펩티드(Ac-Val Try Ala Xaa Cys Gly-OH(서열번호:1), Xaa=Lys(서열번호:2), Ser(서열번호:3), Asp(서열번호:4), Ala(서열번호:5), Val(서열번호:6), crude(Lys, Ser, Asp, Ala, Val의 혼합물), 6 ㎎)를 pH 5.5의 완충용액(1.0 mL, 0.2 M Na2HPO4, 6 M Gn-HCl)에 용해한 후, 아세토니트릴(230 μL)에 용해한 MPAA 페닐티오노포메이트(15 μL)를 전량 첨가하였다. 1시간 후 Et2O로 반응용액을 세정하였다. HPLC로 정제를 행하여, 목적 화합물을 얻었다. 반응은 HPLC의 결과, 정량적으로 행해지고 있었다.
(Xaa=Lys, ESIMS calcd [M+H]+ 818.3, found [M+H]+ 818.4).
(Xaa=Ser, ESIMS calcd [M+H]+ 777.3, found [M+H]+ 777.3).
(Xaa=Asp, ESIMS calcd [M+H]+ 805.3, found [M+H]+ 805.3).
(Xaa=Ala, ESIMS calcd [M+H]+ 761.3, found [M+H]+ 761.3).
(Xaa=Val, ESIMS calcd [M+H]+ 789.3, found [M+H]+ ---).
펩티드(Ac-Val Try Ala Xaa Cys Gly-OH(서열번호:1), Xaa=Ser(서열번호:3), Phe(서열번호:8), Leu(서열번호:7), crude(Ser, Phe, Leu의 혼합물), 10 ㎎)를 pH 5.0의 완충용액(2.0 mL, 0.2 M Na2HPO4, 6 M Gn-HCl)에 용해하고, 아세토니트릴(700 μL)에 용해한 MPAA 페닐티오노포메이트(5 μL)를 첨가하였다. 1.5시간 후 Et2O로 반응용액을 세정하였다. HPLC로 정제를 행하여, 목적 화합물을 얻었다. 반응은 HPLC의 결과, 정량적이었다.
(Xaa=Ser, ESIMS calcd [M+H]+ 777.3, found [M+H]+ 777.3)
(Xaa=Leu, ESIMS calcd [M+H]+ 803.4, found [M+H]+ 803.3)
(Xaa=Phe, ESIMS calcd [M+H]+ 837.4, found [M+H]+ 837.3)
시스테인의 N 말단측에 인접하는 아미노산의 종류에 상관없이, 시스테인의 -SH기에 티오노포메이트기가 도입되었다.
실시예 2. N-아세틸구아니딜화 반응
Figure 112012003719737-pct00031
(Xaa=Ala, Leu, Phe, Ser, Lys로 실시)
(Xaa=Ala의 경우)
Ac-Val Tyr Ala Ala Cys(C(S)OPh)Gly-OH(서열번호:9)(0.2 ㎎, 0.28 μmol)를 250 mM N-아세틸구아니딘/DMSO 용액(260 ㎕)에 용해하였다. 2시간 후 Et2O로 화합물을 침전, 세정하였다. HPLC로 목적물을 정제하여 목적으로 하는 N-아세틸구아니디도체(Ac-Val Tyr Ala Ala-NHC(NH)NHAc(서열번호:10))를 얻었다(수율 80%, HPLC 면적강도로부터 계산하였다)
(ESIMS calcd [M+H]+ 548.3, found [M+H]+ 548.4).
(Xaa=Leu 또는 Phe의 경우)
Ac-Val Tyr Ala Leu Cys(C(S)OPh)Gly-OH(서열번호:11)(0.1 ㎎, 0.12 μmol), Ac-Val Tyr Ala Phe Cys(C(S)OPh)Gly-OH(서열번호:12)(0.1 ㎎, 0.12 μmol)의 혼합물을 250 mM N-아세틸구아니딘/DMSO 용액(100 μL)에 용해하였다. 4.5 시간 후 Et2O로 화합물을 침전, 세정하였다. HPLC로 목적물을 정제하여, 목적으로 하는 N-아세틸구아니디도체(Ac-Val Tyr Ala Leu-NHC(NH)NHAc(서열번호:13), 및 Ac-Val Tyr Ala Phe-NHC(NH)NHAc(서열번호:14))를 얻었다(수율 80%, HPLC 면적강도로부터 계산하였다).
(Xaa=Leu, ESIMS calcd [M+H]+ 590.3, found [M+H]+ 590.3)
(Xaa=Phe, ESIMS calcd [M+H]+ 624.3, found [M+H]+ 624.3)
(Xaa=Ser의 경우)
Ac-Val Tyr Ala Ser Cys(C(S)OPh)Gly-OH(서열번호：15)(0.2 ㎎, 0.26 μmol)를 250 mM N-아세틸구아니딘/DMSO 용액(100 μL)에 용해하였다. 3.5시간 후 Et2O로 화합물을 침전, 세정하였다. HPLC로 목적물을 정제하여 목적으로 하는 N-아세틸구아니디도체(Ac-Val Tyr Ala Ser-NHC(NH)NHAc(서열번호:16))를 얻었다(수율 70%, HPLC 면적강도로부터 계산하였다).
(Xaa=Lys의 경우)
펩티드(Ac-Val Tyr Ala Lys Cys(C(S)OPh)Gly-OH(서열번호:17), 0.1 ㎎)를 Boc2O(0.3 ㎎), 트리에틸아민(0.14 μL)을 포함한 DMSO(30 μL)에 용해하였다. 1.5시간 후 반응용액을 Et2O로 침전, 세정하였다. 얻어진 잔사를 250 mM N-아세틸구아니딘/DMSO 용액(100 ㎕)에 용해하였다. 2.5시간 후, HPLC로 목적물을 정제하여 목적으로 하는 N-아세틸구아니디도체(Ac-Val Tyr Ala Lys(Boc)-NHC(NH)NHAc(서열번호:18))를 얻었다(수율 70%, HPLC 면적강도로부터 계산하였다).
시스테인의 N 말단측에 인접하는 아미노산의 종류에 상관없이, 티오노포메이트화된 시스테인 잔기의 N 말단측 펩티드 결합으로의 구아니딘의 반응성이 있는 것이 확인되었다.
실시예 3. 24aa 펩티드의 티오에스테르화
Figure 112012003719737-pct00032
펩티드(H2N-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Gly-OH(서열번호:19), (crude(미정제)), 적당량(추정 1 ㎎ 정도)을 pH 5.0의 완충용액(300 μL, 0.2 M Na2HPO4, 6 M Gn-HCl)에 용해하고, 아세토니트릴(100 μL)에 용해한 MPAA 페닐티오노포메이트(1 μL)를 전량 첨가하였다. 50분 후 Et2O로 반응용액을 세정하였다. HPLC로 정제를 행하여 목적 화합물(H2N-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys(C(S)OPh)Gly-OH(서열번호:20))을 얻었다. 또한, 3번 위치의 Cys는, 티오노포메이트 시약의 영향을 받지 않도록, 사전에 Acm에 의해 보호하였다.
(ESIMS calcd [M+2H]2+ 1553.8, [M+3H]3+ 1035.8, found [M+2H]2+ 1552.9, [M+3H]3+ 1035.7)
펩티드(H2N-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys(C(S)OPh)Gly-OH(서열번호:20), ca. 0.3 ㎎)를 Boc2O(0.4 ㎎), 트리에틸아민(0.03 μL)을 포함한 DMSO(20 μL)에 용해하였다. 1.5시간 후 반응용액을 Et2O로 침전, 세정하였다. 얻어진 잔사를 250 mM　N-아세틸구아니딘/DMSO 용액(50 μL)에 용해하였다. 2.5시간 후, HPLC로 목적물을 정제하여 목적으로 하는 N-아세틸구아니디도체(BocHN-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly-NHC(NH)NHAc(서열번호:21))를 얻었다.
(ESIMS calcd [M+2H]2+ 1546.8, [M+3H]3+ 1031.5, found [M+2H]2+ 1547.0, [M+3H]3+ 1031.4)
24aa 펩티드(BocHN-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly-NHC(NH)NHAc(서열번호:21), ca. 0.1 ㎎>)를 MESNa(sodium 2-sulfanylethanesulfonate)(1 ㎎, 2% v/v)를 포함하는 pH 7.05의 완충용액(0.2 M　인산, 6 M 구아니딘, 50 ㎕)에 용해하였다. 3.5시간 후, HPLC로 목적물을 정제하여 티오에스테르체(BocHN-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly-SCH2CH2SO3(서열번호:22))를 얻었다(수율 불명, HPLC 상으로는 약 70%)
(ESIMS calcd [M+2H]2+ 1567.3, found [M+2H]2+ 1566.8).
실시예 4. 클로로티오노포메이트 시약에 의한 티오노포메이트기의 도입
펩티드(Ac-Val Tyr Ala Ala Cys Gly-OH(서열번호:5), 6 ㎎)를 pH 5.0의 완충용액(961 μL, 0.2 M Na2HPO4, 6 M Gn-HCl)에 용해하고, 아세토니트릴(320 μL)에 용해한 Phenyl chlorothionoformate(6.5 μL)를 첨가하였다. 1시간 후 Et2O로 반응용액을 세정하였다. HPLC로 정제를 행하여 목적의 티오노포메이트화 펩티드(서열번호：9)를 얻었다(6.4 ㎎, 88%)
(Xaa=Ala, ESIMS calcd [M+H]+ 761.3, found [M+H]+ 761.3).
펩티드(Ac-Val Tyr Ala Leu Cys Gly-OH(서열번호:7), 3.4 ㎎)를 pH 5.0의 완충용액(510 μL, 0.2 M Na2HPO4, 6 M Gn-HCl)에 용해하고, 아세토니트릴(170 μL)에 용해한 Phenyl chlorothionoformate(3.5 μL)를 첨가하였다. 1시간 후 Et2O로 반응용액을 세정하였다. HPLC로 정제를 행하여 목적의 티오노포메이트화 펩티드(서열번호：11)를 얻었다(3.8 ㎎, 92%)
(Xaa=Leu, ESIMS calcd [M+H]+ 803.4, found [M+H]+ 803.3).
펩티드(Ac-Val Tyr Ala Phe Cys Gly-OH(서열번호:8), 5.1 ㎎)를 pH 5.0의 완충용액(729 μL, 0.2 M Na2HPO4, 6 M Gn-HCl)에 용해하고, 아세토니트릴(243 μL)에 용해한 Phenyl chlorothionoformate(5.0 μL)를 첨가하였다. 1시간 후 Et2O로 반응용액을 세정하였다. HPLC로 정제를 행하여 목적의 티오노포메이트화 펩티드(서열번호：12)를 얻었다(5.1 ㎎, 84%)
(Xaa=Phe, ESIMS calcd [M+H]+ 837.4, found [M+H]+ 837.3).
펩티드(Ac-Val Tyr Ala Ser Cys Gly-OH(서열번호:3), 4.9 ㎎)를 pH 5.0의 완충용액(766 μL, 0.2 M Na2HPO4, 6 M Gn-HCl)에 용해하고, 아세토니트릴(265 μL)에 용해한 Phenyl chlorothionoformate(5.2 μL)를 첨가하였다. 1시간 후 Et2O로 반응용액을 세정하였다. HPLC로 정제를 행하여 목적의 티오노포메이트화 펩티드(서열번호：15)를 얻었다(5.5 ㎎, 92%)
(Xaa=Ser, ESIMS calcd [M+H]+ 777.3, found [M+H]+ 777.3).
펩티드(Ac-Val Tyr Ala Lys Cys Gly-OH(서열번호:2), 5.5 ㎎)를 pH 5.0의 완충용액(810 μL, 0.2 M Na2HPO4, 6 M Gn-HCl)에 용해하고, 아세토니트릴(270 μL)에 용해한 Phenyl chlorothionoformate(5.5 μL)를 첨가하였다. 1시간 후 Et2O로 반응용액을 세정하였다. HPLC로 정제를 행하여 목적의 티오노포메이트화 펩티드(서열번호：17)를 얻었다(6.1 ㎎, 94%)
(Xaa=Lys, ESIMS calcd [M+H]+ 818.3, found [M+H]+ 818.4).
클로로티오노포메이트 시약에 의해서도, 실시예 1에서 얻어진 것과 동일한 티오노포메이트화된 펩티드 사슬이 얻어졌다. 따라서 클로로티오노포메이트 시약에 의해 티오노포메이트기가 도입된 펩티드 사슬로부터도, 전술한 실시예 1 및 3에서 티오노포메이트기를 도입한 펩티드 사슬과 동일한 방법으로, N-아세틸구아니디도화, 이어서 티오에스테르화를 행함으로써, 펩티드 티오에스테르체를 얻을 수 있는 것이 명확해졌다.
본 발명에 의해, 폴리펩티드 사슬을 화학적으로 펩티드 티오에스테르체로 변환하는 신규한 방법이 제공되었다.
본 발명의 방법은, 종래의 티오에스테르화법에 필요한, 비천연형의 아미노산 유도체나 링커, 또는, 특정 3차원 구조 등을 갖지 않는 펩티드 사슬에 있어서도 티오에스테르화가 가능하여, 생합성 등에 의해 얻어진 장쇄의 폴리펩티드 단편이더라도, 용이하게 티오에스테르화하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 펩티드 티오에스테르화 방법은, 단백질의 합성 전반에 있어서 이용 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> OTSUKA CHEMICAL CO., LTD. <120> METHOD FOR PRODUCING PEPTIDE THIOESTER <130> OCKP0903F <150> JP 2009-151713 <151> 2009-6-26 <160> 22 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Lys, Ser, Asp, Ala, Val, Leu or Phe <400> 1 Val Tyr Ala Xaa Cys Gly 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <400> 2 Val Tyr Ala Lys Cys Gly 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <400> 3 Val Tyr Ala Ser Cys Gly 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <400> 4 Val Tyr Ala Asp Cys Gly 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <400> 5 Val Tyr Ala Ala Cys Gly 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <400> 6 Val Tyr Ala Val Cys Gly 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <400> 7 Val Tyr Ala Leu Cys Gly 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <400> 8 Val Tyr Ala Phe Cys Gly 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Cys having Phenylthionoformate group <400> 9 Val Tyr Ala Ala Cys Gly 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ala having acetyl guanidido group <400> 10 Val Tyr Ala Ala 1 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Cys having Phenylthionoformate group <400> 11 Val Tyr Ala Leu Cys Gly 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Cys having Phenylthionoformate group <400> 12 Val Tyr Ala Phe Cys Gly 1 5 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Leu having acetyl guanidido group <400> 13 Val Tyr Ala Leu 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Phe having acetyl guanidido group <400> 14 Val Tyr Ala Phe 1 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Cys having Phenylthionoformate group <400> 15 Val Tyr Ala Ser Cys Gly 1 5 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ser having acetyl guanidido group <400> 16 Val Tyr Ala Ser 1 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Cys having phenylthionoformate group <400> 17 Val Tyr Ala Lys Cys Gly 1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Val having acetyl group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Lys having acetyl guanidido group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Lys having blocking group Boc <400> 18 Val Tyr Ala Lys 1 <210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Cys having blocking group Acm <400> 19 Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Gly 20 25 <210> 20 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Cys having blocking group Acm <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Cys having Phenylthionoformate group <400> 20 Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Gly 20 25 <210> 21 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Leu having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Cys having blocking group Acm <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Gly having acetyl guanidido group <400> 21 Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly 20 <210> 22 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Leu having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Cys having blocking group Acm <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Gly having thioester group <400> 22 Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly 20

Claims (14)

  1. 펩티드 티오에스테르체의 제조방법으로서, 이하의 공정(a)~(c)：
    (a) 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 사슬에 있어서, 상기 시스테인 잔기의 티올기에, 이하의 화학식 I：
    [화학식 I]
    Figure 112012003719737-pct00033

    [화학식 중,
    X는 황원자 또는 산소원자이고,
    R1 및 R2는 이탈기이다.]
    으로 표시되는 화합물 A를 반응시킴으로써 R2를 이탈시켜, 제1 중간체를 제작하는 공정；
    (b) 유기용매 중에서, 상기 제1 중간체에 이하의 화학식 II：
    [화학식 II]
    Figure 112012003719737-pct00034

    [화학식 중,
    Y는 산소원자, 황원자, 또는, NH기이고,
    R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
    로 표시되는 화합물 B를 반응시켜, 상기 시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가하고, 상기 펩티드 결합을 절단함으로써, 절단된 상기 펩티드 결합보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 제2 중간체로서 얻는 공정； 및
    (c) 상기 제2 중간체에 티올을 반응시키고, C 말단의 -NH-C(=Y)NHR3기와 티올기를 교환시킴으로써, 제2 중간체의 C 말단을 티오에스테르화하는 공정
    을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    X가 황원자인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    R1이 -O-C6 아릴기인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    R2가 할로겐원자, 또는, 치환 또는 비치환의 -S-C6-10 아릴기인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    Y가 NH기인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    R3가 아세틸기인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 공정(c)에 있어서, 상기 티올이 이하의 화학식 III：
    [화학식 III]
    Figure 112016047931678-pct00035

    [화학식 중, R4는 치환 또는 비치환의 벤질기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 및 치환 또는 비치환의 알킬기로부터 선택되는 어느 하나의 기이다.]
    로 표시되는 티올인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    펩티드 사슬이 재조합 단백질인 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    펩티드 사슬이 정제용 태그를 포함하는 재조합 단백질인 방법.
  10. 폴리펩티드의 제조방법으로서, 이하의 공정(a)~(d)：
    (a) 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 사슬에 있어서, 상기 시스테인 잔기의 티올기에, 이하의 화학식 I：
    [화학식 I]
    Figure 112016047931678-pct00040

    [화학식 중,
    X는 황원자 또는 산소원자이고,
    R1 및 R2는 이탈기이다.]
    으로 표시되는 화합물 A를 반응시킴으로써 R2를 이탈시켜, 제1 중간체를 제작하는 공정；
    (b) 유기용매 중에서, 상기 제1 중간체에 이하의 화학식 II：
    [화학식 II]
    Figure 112016047931678-pct00041

    [화학식 중,
    Y는 산소원자, 황원자, 또는, NH기이고,
    R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
    로 표시되는 화합물 B를 반응시켜, 상기 시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가하고, 상기 펩티드 결합을 절단함으로써, 절단된 상기 펩티드 결합보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 제2 중간체로서 얻는 공정；
    (c) 상기 제2 중간체에 티올을 반응시키고, C 말단의 -NH-C(=Y)NHR3기와 티올기를 교환시킴으로써, 제2 중간체의 C 말단을 티오에스테르화하는 공정； 및
    (d) 상기 공정(a)~(c)에서 얻어진 펩티드 티오에스테르체와, N 말단에 시스테인을 갖는 펩티드 사슬을 라이게이션법에 의해 결합하는 공정을 포함하는,
    폴리펩티드의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 티오에스테르체의 제조방법에 사용하는 제2 중간체의 제조방법으로서, 이하의 공정(a) 또는 (b)：
    (a) 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 사슬에 있어서, 상기 시스테인 잔기의 티올기에, 이하의 화학식 I：
    [화학식 I]
    Figure 112012003719737-pct00036

    [화학식 중,
    X는 황원자 또는 산소원자이고,
    R1 및 R2는 이탈기이다.]
    으로 표시되는 화합물 A를 반응시킴으로써 R2를 이탈시켜, 제1 중간체를 제작하는 공정；
    (b) 유기용매 중에서, 상기 제1 중간체에 이하의 화학식 II：
    [화학식 II]
    Figure 112012003719737-pct00037

    [화학식 중,
    Y는 산소원자, 황원자, 또는, NH기이고,
    R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
    로 표시되는 화합물 B를 반응시켜, 상기 시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가하고, 상기 펩티드 결합을 절단함으로써, 절단된 상기 펩티드 결합보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 제2 중간체로서 얻는 공정
    을 포함하는, 방법.
  12. 삭제
  13. C 말단에 -NH-C(=Y)NHR3기
    [화학식 중, Y는 산소원자 또는 NH기이고,
    R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
    를 갖는 펩티드 사슬과, N 말단에 시스테인을 갖는 펩티드 사슬을 라이게이션법에 의해 결합하는 공정을 포함하는, 폴리펩티드의 제조방법.
  14. 재조합 단백질의 C 말단측에 부가된 정제용 태그를 제거하는 방법으로서, 이하의 공정(a)~(c)：
    (a) C 말단에 정제용 태그를 포함하는 재조합 단백질에 있어서, 시스테인 잔기의 티올기에, 이하의 화학식 I：
    [화학식 I]
    Figure 112012003719737-pct00038

    [화학식 중,
    X는 황원자 또는 산소원자이고,
    R1 및 R2는 이탈기이다.]
    으로 표시되는 화합물 A를 반응시킴으로써 R2를 이탈시켜, 제1 중간체를 제작하는 공정；
    (b) 유기용매 중에서, 상기 제1 중간체에 이하의 화학식 II：
    [화학식 II]
    Figure 112012003719737-pct00039

    [화학식 중,
    Y는 산소원자, 황원자, 또는, NH기이고,
    R3는 수소원자, 아실기, 또는, 알콕시카르보닐기이다.]
    로 표시되는 화합물 B를 반응시켜, 상기 시스테인 잔기의 N 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이의 펩티드 결합을 형성하는 카르복실기에 -NH-C(=Y)NHR3기를 부가하고, 상기 펩티드 결합을 절단함으로써, 절단된 상기 펩티드 결합보다도 N 말단측의 펩티드 단편을 제2 중간체로서 얻는 공정； 및
    (c) 상기 제2 중간체에 티올을 반응시키고, C 말단의 -NH-C(=Y)NHR3기와 티올기를 교환시킴으로써, 제2 중간체의 C 말단을 티오에스테르화하는 공정
    을 포함하는, 방법.
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