JP2012513217A - 対立遺伝子、ゲノムおよびトランスクリプトームを検出する方法および遺伝子型決定パネル - Google Patents
対立遺伝子、ゲノムおよびトランスクリプトームを検出する方法および遺伝子型決定パネル Download PDFInfo
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Abstract
2つの個体の混合物中の対立遺伝子、ゲノムおよびトランスクリプトームを検出する方法および遺伝子型決定パネルが開示される。
Description
本発明は、2つの個体の混合物の対立遺伝子、ゲノムおよびトランスクリプトームを検出する方法および遺伝子型決定パネルの分野にある。
関連出願
本願は、2008年12月22日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号61/140,063、2009年4月2日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号61/166,188、および2009年8月4日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号61/231,232に対する優先権を主張し、それらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
本願は、2008年12月22日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号61/140,063、2009年4月2日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号61/166,188、および2009年8月4日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号61/231,232に対する優先権を主張し、それらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
出生前診断方法は、胎児または胚の遺伝子情報を得ることを主に目的とする。診療に用いる出生前遺伝子診断方法は、本質的に、羊水穿刺、絨毛膜絨毛の採取および胎児血液または組織生検の採取のごとき侵襲性技術を含む。それらの技術は、胎児から直接的に、または女性生殖器構造から間接的にサンプルを得ることを含む。それらの方法の高侵襲性の性質のために、それらは母親または胎児を合併症に付す傾向にある。羊水穿刺の場合に列挙できるかかる合併症の例は、感染、可能な同種免疫処置での胎児母体間出血、羊水損失および腹部痛のリスクである。異なる研究は、羊水穿刺後の流産のリスクを対照群のものより高い0.06%〜2.1%と見積もった (Eddleman, Obstet Gynecol 2006 108(5): 1067-1072)。結果的に、羊水穿刺は、単に、臨床的にかなりの遺伝的変異を持った小児を有するリスクが、医原性流産のものを超える女性にき示唆され、多数の医師は、むしろ彼らの経験に比例したリスク(典型的には、300例中の1〜500例中の1例)を引用することを好む。
前記の合併症のリスクを有し、一般的に不快および/または母親のストレス源である侵襲性の出生前診断方法の使用を制限するために、非侵襲性方法の開発は、現代の産科学の主要な目的を構成する。
特に、母体血液中で循環する胎児細胞は、出生前遺伝子診断方法に潜在的に有用な遺伝物質源を構成する(Bianchi, Br J Haematol 1999 105: 574-583; Fisk, Curr Opin Obstet Gynecol 1998 10: 81-83)。妊娠中に、胎児起源の異なる細胞型は、胎座を横断し、母体血液中で循環する(Bianchi, Br J Haematol 1999 105: 574-583)。かかる細胞型はリンパおよび赤血球系細胞、骨髄性前駆体ならびに絨毛上皮細胞(栄養膜細胞層および合胞体栄養細胞)を含む。
出生前診断の目的で母体血液中で循環する胎児細胞のゲノムを分析する方法を記載するが、それらは診断の感度および特異性につき比較的限定されている(Di Naroら, Mol Hum Reprod 2000 6: 571-574; Watanabeら, Hum Genet 1998 102: 611-615; Takabayashiら, Prenat Diagn 1995 15: 74-77; Sekizawaら, Hum Genet 1998 102: 393-396)。非侵襲性の高度に特異的な出生前診断方法の開発における利点は、結果が結局陰性である妊婦において実行される侵襲性診断方法の割合を低減するためにそれを用いる可能性に起因する。一例として、700人に1人の女性に関係する21番染色体トリソミーの場合には、母親が38歳である場合のみ、フランスで出生前診断が現在提供され、一方、5%の羊水穿刺の対価のために、60%の21番染色体トリソミー症例を検出できる生化学的分析試験が、より若い女性につき提案されている。しかしながら、21番染色体トリソミー症例の40%は、現在利用可能な試験によって検出されない。FISH技術を用いる母体血漿から単離された胎児細胞における21番染色体トリソミーの出生前検出が記載されている。このアプローチは注目されるが、胎児細胞として、血漿中ではまれであり(500個中1〜2000個中1個)、しばしばアポトーシス細胞を含み、信頼できる診断は、非常に多数の細胞に対してその方法を実行することを必要とし、ルーチン的に実行することを不可能にする。さらに、正倍数性胎児細胞はそのアプローチによって同定できない。
かかるアプローチの1つの制限は、血液中で循環する胎児細胞が非常に低濃度で存在するという事実に由来する。先の選択がない血液サンプル中のY染色体のPCR検出に基づく研究は、胎児細胞の平均数が1ミリリットルの血液当たり約1個の胎児リンパ球細胞であることを決定するのを可能にした(Bianchi, J Perinat Med 1998 26: 175-85)。より最近では、胎児細胞の平均数は、改善された富化技術がより多数の細胞を与えるので、上方に変更されている。1つの最近の研究では、1ミリリットルの血液当たり37個の胎児リンパ球の平均値が判明している(Huang, Prenatal Diagnosis 2008 28: 892-899)。
かくして、胎児の対立遺伝子および胎児の遺伝的変異を検出するための改善された方法およびツールについての必要性が存在する。
本発明の具体例は、胎児対立遺伝子および胎児遺伝的変異の検出のための方法および遺伝子型決定パネルに関する。本発明の1つの具体例は、母体および胎児の細胞の混合物を含むサンプルを得;サンプルをサブサンプルに分割し;胎児識別子の存在につきサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定し;次いで、少なくとも1つのサブサンプル中の胎児細胞から少なくとも1つの胎児識別子の存在を同定することを含む、胎児識別子を検出する方法である。
本発明の具体例は、1以上の以下のものを含むことができ、また、含み得る:さらに、少なくとも1つのサブサンプルに対してサブサンプル増幅を行ない、増幅生成物を提供することを含む方法;さらに、増幅生成物をアリコートに分割することを含み、ここに、少なくとも1つの胎児識別子の存在についてのサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、胎児識別子の存在につきアリコートをスクリーニングすることを含むことを特徴とする方法;サブサンプル増幅が、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、標的核酸増幅、胎児識別子以外の核酸配列の増幅、核酸配列用の代理(proxy)の生成および細胞***よりなる群から選択される方法を含む方法;前増幅が全ゲノム増幅または全トランスクリプトーム増幅を含む方法;前増幅が標的核酸増幅、胎児識別子以外の核酸配列の増幅、核酸配列用の代理の生成および細胞***を含む方法;さらに、母体細胞の遺伝物質が、1組の標的遺伝子座にてホモ接合性またはヘテロ接合性であるかを決定して、母体の遺伝子型を決定することを含み、ここに、胎児識別子についてのアリコートもしくはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、少なくとも1つの標的遺伝子座にて母体遺伝子型とは異なる遺伝子型につきアリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含み、母体の遺伝子型と異なる遺伝子の存在は、増幅生成物中の有益な父性対立遺伝子の存在を示し、少なくとも1つの胎児識別子の存在の同定は、少なくとも1つのアリコートもしくはサブサンプル中の有益な父性対立遺伝子を同定することを含むことを特徴とする方法;さらに、母体細胞の遺伝物質がホモ接合性またはヘテロ接合性であるかを決定するのに先立ち、標的遺伝子座を選択することを含む方法;さらに、標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択することを含み、ここに、スクリーニングは、試験遺伝子座にて母体遺伝子型と異なる遺伝子型につき、アリコートをスクリーニングすることを含むことを特徴とする方法;試験遺伝子座の選択が、標的遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき、混合された母体および胎児核酸のサンプルをスクリーニングし、次いで、試験遺伝子座として、混合された母体および胎児核酸のサンプル中の非母体遺伝子型で標的遺伝子座を選択することを含むことを特徴とする方法;さらに、有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルを分析して、遺伝的変異を検出することを含む方法;さらに、有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルの一部分を収集することを含み、ここに、有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルの分析して、遺伝的変異を検出することは、アリコートもしくはサブサンプルの収集部分を分析することを含む方法;収集部分が、アリコートもしくはサブサンプルの均質部分である方法;収集部分がアリコートの非均質部分である方法;さらに、少なくとも2つのサブサンプルから有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートを収集し、次いで、増幅生成物を分析するのに先立ちアリコートを組み合わせることを含む方法;遺伝的変異が、染色体再編成、コピー数変異および多形性よりなる群から選択される胎児遺伝的変異である方法;分析が、有益な父性対立遺伝子を含むアリコート中の母系および父系遺伝した対立遺伝子の比を決定することを含み、ここに、比を分析して、遺伝的変異の存在を決定することを特徴とする方法;分析が、有益な父性対立遺伝子を含むアリコート中の対立遺伝子のコピー数を決定することを含み、ここに、対立遺伝子のコピー数を分析して遺伝的変異の存在を決定することを特徴とする方法;さらに、少なくとも2つのサブサンプルから有益な父性対立遺伝子を含むと同定された増幅生成物を分析して、モザイク現象または二卵性双胎の存在を検出することを含む方法;分析されたアリコートもしくはサブサンプルが胎児識別子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたアリコートもしくはサブサンプルではないが、胎児識別子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたアリコートと同一のサブサンプルからのものである方法;標的遺伝子座がすべて母体の遺伝子型にホモ接合性であるか、またはすべて母体の遺伝子型にヘテロ接合性であるか、または母体の遺伝子型にホモ接合性およびヘテロ接合性遺伝子座の混合物を含む方法;標的遺伝子座がすべて母体の遺伝子型にホモ接合性である方法;増幅生成物がゲノムDNAまたは相補的DNAを含む方法;母体の遺伝子型の決定が、SNPのパネルを用いて、母体細胞の源である同一の個体からの母体の遺伝物質のサンプルを遺伝子型決定することを含む方法;母体の遺伝物質の源が、血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、涙、唾液、頬側スワブおよび皮膚よりなる群から選択される方法;母体の遺伝物質源が、血液および頬側スワブよりなる群から選択される方法;母体および胎児核酸の混合物が、無細胞核酸の混合物である方法;母体および胎児の無細胞核酸サンプル源が、妊婦からの血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄またはダグラス窩穿刺である方法;単一のアリコートもしくはサブサンプル中の1を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定するか、あるいは1を超えるアリコートもしくはサブサンプル中の1を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定するか、あるいは1を超えるアリコートもしくはサブサンプル中の1つの試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含む方法;第1のアリコートもしくはサブサンプル中の有益な父性対立遺伝子の同定後に、少なくとも第2のサブサンプル中の第2の標的遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含む方法;サンプルを分割して、細胞のポアソンまたは非ポアソン分布を持つサブサンプルを生成する方法;サブサンプルの各々が、1個以下の細胞を含む方法;さらに、スクリーニングまたは遺伝子型決定に先立ち、2個以上のサブサンプルからのアリコートを貯蔵することを含む方法;貯蔵が、アリコートを含むウェルの行および列のインデックスシステム(indexed system)の使用を含む方法;さらに、サブサンプルへの分割に先立ち、胎児細胞につきサンプルを富化することを含む方法;富化が母体細胞を超える胎児細胞の差動増殖(differential expansion)を含む方法;増幅生成物の均質部分が、アリコートに分割される方法;および増幅生成物の非均質部分が、アリコートに分割される方法。
本発明のさらにもう一つの具体例は、単一の染色体に特異的な約5〜約100個のユニークなSNPを含む少なくとも1つの染色体特異的なパネルを含む、胎児対立遺伝子を検出するための一塩基多型(SNP)パネルであり、ここに、SNPの各々は、すべての主要な集団群を横切って測定された約30%〜約50%の範囲の頻度を有し;かつ、SNPパネル中のSNP合計数は約5〜約100個のSNPである。
本発明の具体例は、胎児対立遺伝子(すなわち、非母体対立遺伝子/有益な父性対立遺伝子)および胎児遺伝的変異を検出する方法および遺伝子型決定パネルに関する。
本発明の具体例は、胎児の性別に拘らず、および参照サンプルとして機能する父系核酸配列を必要とすることなく、胎児対立遺伝子および胎児遺伝的変異の検出を可能とする。好ましくは各細胞単位で、胎児細胞と母体細胞とを区別することにより、本発明の具体例は、母体血液中の胎児細胞の低存在比により課された資源制約を克服し、現在利用可能な方法よりもより広範囲の分析のために胎児のゲノムまたはトランスクリプトームの完全性を保存する。加えて、各細胞単位で胎児細胞を区別することにより、本発明の具体例は、モザイク現象および二卵性双胎の検出を可能とする。
本発明の好ましい具体例において、母体サンプルはホモ接合性の標的遺伝子座を同定するために遺伝子型決定され、引き続いて、ホモ接合性遺伝子は、胎児細胞を含むサンプル中の胎児のヘテロ接合性遺伝子座の存在を検出するために遺伝子型決定できる。別法として、ヘテロ接合性の標的遺伝子座を同定するために母体サンプルを遺伝子型決定し、引き続いて、胎児細胞を含むサンプル中の胎児のホモ接合性の遺伝子座の存在を検出するために遺伝子型決定できることは、本明細書に記載された具体例のいずれにおいても当業者により理解されるであろう。いくつかの具体例において、母体および胎児細胞の混合物は、母体細胞に対し胎児細胞について濃縮サンプルを生成するために得られ富化される。次いで、濃縮されたサンプルは、各サブサンプルが好ましくは1個のみの細胞を含むように、サブサンプルに分割される。次いで、これらの各サブサンプルは、各サブサンプルに対応する増幅生成物を生成するために増幅され、細胞に対応するゲノムへのアクセスを提供する。次いで、増幅生成物はアリコートを生成するために分割される。次いで、これらのアリコートは、各々、ヘテロ接合性またはホモ接合性遺伝子型決定を用いて、母体サンプル中でホモ接合性と従前に同定された少なくとも1つの遺伝子座にて非母体対立遺伝子につき個々にスクリーニングされるか、または母体サンプル中でヘテロ接合性と従前に同定された少なくとも1つの遺伝子座にて遺伝子型決定され、これは、そのアリコート中の非母体対立遺伝子、かくして、胎児ゲノムまたはトランスクリプトームの存在を示す。ヘテロ接合性遺伝子型の検出は、選択された遺伝子座でのみ非母体対立遺伝子につきスクリーニングすることにより達成され得る。次いで、さらなる分析は、胎児遺伝的変異を検出するために、完全な胎児のゲノムまたはトランスクリプトームを含む少なくとも1つのアリコートを用いて、対応するスクリーニングされていないアリコートにつき行われる。
本発明のもう一つの好ましい具体例において、母体サンプルは遺伝子型決定され、母体および胎児細胞の混合物が得られ、サンプルは胎児細胞につき濃縮され、前記のサブサンプルに分割される。母体サンプルがホモ接合性である少なくとも1つの標的遺伝子座のパネルは、サブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定のために選択される。各サブサンプルは、これらの遺伝子座の少なくとも1つにて個々にスクリーニングまたは遺伝子型決定され、ヘテロ接合性遺伝子型の検出は、再びサブサンプル中の非母体対立遺伝子の存在を示す。次いで、ヘテロ接合性のサブサンプル中の対立遺伝子の比の分析は、胎児のコピー数変異を検出するために行われる。
本明細書に用いた核酸とは、デオキシリボ核酸(例えば、DNA、mtDNA、gDNAまたはcDNA)、リボ核酸(例えば、RNAまたはmRNA)、または当該技術分野において知られたいずれかの他の核酸の変異体を意味する。
本明細書に用いた標的遺伝子座とは、母体の遺伝物質を含有するサンプルが検出可能な遺伝子型を有する、ゲノムまたはトランスクリプトームの遺伝子座を意味する。1を超える標的遺伝子座でのいくつかの具体例において、標的遺伝子座は、すべてホモ接合性の遺伝子座、すべてヘテロ接合性の遺伝子座、またはホモ接合性およびヘテロ接合性の遺伝子座の混合物よりなる。また、標的遺伝子座のパネルは、すべてホモ接合性の遺伝子座、すべてヘテロ接合性の遺伝子座、またはホモ接合性およびヘテロ接合性の遺伝子座の混合物を含むことができる。
本明細書に用いた試験遺伝子座とは、胎児の遺伝物質を含むサンプル中のさらなる遺伝子型決定のために選択された標的遺伝子座を意味する。
本明細書に用いた胎児識別子とは、サンプルまたはその一部分が起源において胎児であるいずれかの指標をいう。胎児識別子は、いずれの遺伝的変異または他の情報も含むことができる。胎児識別子の1例は、胎児対立遺伝子である。本明細書に用いた胎児対立遺伝子とは、遺伝源を胎児と同定する能力を提供する父性対立遺伝子をいう。父性対立遺伝子は、父系サンプル中に存在するいずれかの対立遺伝子である。しかしながら、本明細書に用いた有益な父性対立遺伝子は、(本明細書に用いた)非母体対立遺伝子または(本明細書に用いた)胎児対立遺伝子に等価ないずれかの対立遺伝子である。
本明細書に用いた遺伝的変異とは、核酸配列におけるいずれの変異も意味する。遺伝的変異は、単一塩基対変異から染色体変異、または当該技術分野における公知のいずれかの他の変異までの範囲であることができる。遺伝的変異は、単一配列反復、短鎖縦列反復配列、一塩基多型、転座、反転、欠失、重複またはいずれかの他のコピー数変異であることができる。いくつかの具体例において、染色体変異は染色体異常である。例えば、染色体変異は、異数性、反転、転座、欠失または重複であることができる。また、遺伝的変異はモザイクであることができる。例えば、遺伝的変異は、遺伝子疾患または遺伝子疾患についてのリスク因子(例えば、嚢胞性線維症、テイ−サックス病、ハンチントン病、アルツハイマー病および種々の癌)に関与しかねない。また、遺伝的変異は、いずれの突然変異、染色体異常または前記に引用された優先権書類に開示された他の変異(例えば、異数性、微小欠失または微小重複)も含むことができる。遺伝的変異は、表現型に対して、陽性、陰性または中立的な効果を持つことができる。例えば、染色体の変異は、有利な変異、有害な変異、または中立的な変異を含み得る。いくつかの具体例において、遺伝的変異は、疾病または障害についてのリスク因子である。いくつかの具体例において、遺伝的変異は所望の表現型の形質をコードする。
サンプル獲得(例えば、母体および胎児細胞の混合物を含む)
本発明の具体例における母体サンプル、混合された母体および胎児細胞のサンプル、および混合された母体および胎児の無細胞核酸のサンプルは、血液から得ることができる。いくつかの具体例において、約20〜40mLの血液が妊婦から得られる。血液サンプルは妊娠中のいずれの時点でも採取できる。例えば、いくつかの具体例において、母体サンプルは第1の三半期に採取される。他の具体例において、母体サンプルは第2の三半期に採取される。好ましい具体例において、血液は10〜18週の在胎期間で得られる。しかしながら、血液は、妊娠の早期、または18週の在胎期間後に得ることができる。採取期間は、追求される情報または妊娠管理の基準に依存して変更し得る。また、血液サンプルは、その日のいつでも採取できる。いくつかの具体例において、血液は朝に採取される。他の具体例において、血液は午後に採取される。
本発明の具体例における母体サンプル、混合された母体および胎児細胞のサンプル、および混合された母体および胎児の無細胞核酸のサンプルは、血液から得ることができる。いくつかの具体例において、約20〜40mLの血液が妊婦から得られる。血液サンプルは妊娠中のいずれの時点でも採取できる。例えば、いくつかの具体例において、母体サンプルは第1の三半期に採取される。他の具体例において、母体サンプルは第2の三半期に採取される。好ましい具体例において、血液は10〜18週の在胎期間で得られる。しかしながら、血液は、妊娠の早期、または18週の在胎期間後に得ることができる。採取期間は、追求される情報または妊娠管理の基準に依存して変更し得る。また、血液サンプルは、その日のいつでも採取できる。いくつかの具体例において、血液は朝に採取される。他の具体例において、血液は午後に採取される。
血液は、中心静脈カテーテルを介してアクセス可能な腕、脚または血液を含めた身体のいずれかの適当な領域から得ることができる。いくつかの具体例において、血液は処置または活動後に採取される。例えば、血液は婦人科内診後に採取できる。また、採取時期は、サンプル中に存在する胎児細胞数を増加させるように調整できる。例えば、血液は血管拡張を誘導する練習または処置後に採取できる。
血液は、採取後に種々の成分と組み合わせて、引き続いての技術のためのサンプルを保存または調製し得る。例えば、いくつかの具体例において、血液は、採取後に、抗凝血剤、細胞固定剤またはDNAまたはRNA保存剤で処理される。好ましい具体例において、血液は、EDTAまたはヘパリンのごとき抗凝血剤を含む真空採血管を用いて、静脈穿刺によって採取される。また、血液は、ヘパリン被覆注射器および皮下注射針を用いて採取できる。また、血液は、細胞培養に有用であろう成分と組み合せることができる。例えば、いくつかの具体例において、血液は、細胞培養培地または補足細胞培養培地(例えば、サイトカイン)と組み合わせる。
また、母体サンプルは、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、涙、唾液、頬側スワブ、皮膚または他の組織を含めた当該技術分野において知られた他の源から得ることができる。また、混合された母体および胎児細胞のサンプルおよび混合された母体および胎児の無細胞核酸のサンプルは、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄、ダグラス窩穿刺、リンパ節または骨髄を含めた当該技術分野において知られた他の源から得ることができる。例えば、いくつかの具体例において、混合された母体および胎児の無細胞核酸のサンプル源は、子宮頚部スワブである。好ましい具体例において、胎児の無細胞核酸はDNAを含む。もう一つの具体例において、胎児の無細胞核酸はRNAまたはcDNAを含む。
胎児細胞の富化
母体および胎児細胞の混合サンプル中の胎児細胞の低存在比に取り組むために、これらのサンプルは胎児細胞につき富化できる。赤血球は成熟の場合に除核されるが、未成熟の場合に核形成されるため、これらの特性を用いて、サンプル中の母体および胎児の赤血球を区別できる。サンプルは、ポジティブ選択、ネガティブ選択またはポジティブおよびネガティブ選択の組合せを介して胎児細胞につき富化できる。いくつかの具体例において、胎児細胞は直接的に捕捉される。他の具体例において、母体細胞が捕捉され、胎児細胞は残余サンプルから収集される。
母体および胎児細胞の混合サンプル中の胎児細胞の低存在比に取り組むために、これらのサンプルは胎児細胞につき富化できる。赤血球は成熟の場合に除核されるが、未成熟の場合に核形成されるため、これらの特性を用いて、サンプル中の母体および胎児の赤血球を区別できる。サンプルは、ポジティブ選択、ネガティブ選択またはポジティブおよびネガティブ選択の組合せを介して胎児細胞につき富化できる。いくつかの具体例において、胎児細胞は直接的に捕捉される。他の具体例において、母体細胞が捕捉され、胎児細胞は残余サンプルから収集される。
サンプルは、細胞の物性の差に基づいて胎児細胞につき富化できる。例えば、サンプルは、密度、細胞膜構造または形態学に基づいて胎児細胞につき富化できる。密度に基づいたいくつかの具体例において、FICOLLTM(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)、PERCOLLTM (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)、イオジキサノール(Axis Shield, Oslo, Norway)、NYCODENZR(Axis Shield, Oslo, Norway)またはショ糖のごとき密度勾配を用いる。細胞膜構造に基づいたいくつかの具体例において、溶解試薬(例えば、塩化アンモニウム)が用いられる。形態学に基づいたいくつかの具体例において、フローサイトメトリーまたはフィルターが用いられる。また、サンプルは、当該技術分野において知られた他の物理特性に基づいて胎児細胞につき富化できる。例えば、サンプルは、誘電または磁気特性に基づいて胎児細胞につき富化できる。さらに、サンプルは骨髄を収集することにより胎児細胞につき富化できる。
また、サンプルは、細胞の生化学的特性の差に基づいて胎児細胞につき富化できる。例えば、サンプルは抗原、核酸、代謝、遺伝子発現またはエピジェネティックな差に基づいて胎児細胞につき富化できる。抗原の差に基づいたいくつかの具体例において、磁場勾配中の抗体コンジュゲート磁気もしくは常磁性ビーズ、またはフローサイトメトリーでの蛍光性標識抗体を用いる。核酸の差に基づいたいくつかの具体例において、フローサイトメトリーが用いられる。代謝的な差に基づいたいくつかの具体例において、フローサイトメトリーまたはもう一つの選別技術により測定される色素取込み/排除が用いられる。遺伝子発現に基づいたいくつかの具体例において、サイトカインでの細胞培養が用いられる。エピジェネティックな差に基づいたいくつかの具体例において、細胞培養が用いられる。また、サンプルは当該技術分野において知られた他の生化学的特性に基づいて胎児細胞につき富化できる。例えば、サンプルは、pHまたは運動性に基づいて胎児細胞につき富化できる。さらに、いくつかの具体例において、1を超える方法を用いて、胎児細胞につき富化される。
本発明のいくつかの具体例において、サンプルは、塩化アンモニウムのごとき溶解試薬の使用を介して赤血球細胞を除去することにより、またはFICOLLTM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、PERCOLLTM (GE Healthcare Life Sciences Piscataway, NJ)またはショ糖のごとき密度勾配を用いる分離により、胎児細胞につき富化される。また、密度勾配を用いて、白血球画分を低減できる。さらに、得られた末梢血単核細胞(「PBMC」)は、Miltenyi Biotec (Gladbach, Germany)、Stemcell Technologies (Vancouver, BC, Canada)およびDynal Biotech/Invitrogen (Carlsbad, CA)のごとき製造からの磁気ビーズ分離技術を用いて、胎児細胞につき富化できる。ポジティブな富化またはネガティブな枯渇、または双方の組合せを用いて、PBMC中の胎児画分を富化できる。
胎児特異的表面マーカーは現在知られていないが、胎児細胞を1,000〜100,000個の母体細胞中で1個の胎児細胞までポジティブに富化することが示されたいくつかのマーカーが存在する。いくつかの具体例において、CD71、CD34、CD45またはCD235a細胞表面マーカーを用いて、胎児細胞を富化する。いくつかの具体例において、胎児細胞集団に見出されない細胞表面マーカーを用いて、成人細胞集団の枯渇により胎児細胞をネガティブに富化する。いくつかの具体例において、CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123およびCD61の組合せを用いて、成人細胞を枯渇する。また、フローサイトメトリー選別を用いて、蛍光標識にコンジュゲートした細胞表面マーカーまたは細胞内マーカーを使用して、胎児細胞につき富化し得る。細胞内マーカーは、胎児細胞において優先的に発現した細胞内タンパク質(例えば、胎児性ヘモグロビン)に対する、核染色または抗体を含み得る。
ヘモグロビンの酸化は、優先的に、磁場勾配を用いて、核形成された赤血球(NRBC)を富化する1つの方法であると同定されている(Zborowski, Biophys J 2003 84(4): 2638-2645)。加えて、白血球からの赤血球の分離を促進するか、またはPBMCから胎児細胞を富化するマイクロ流体装置が開発されている(Huang, Prenatal Diagnosis 2008 28: 892-899)。
本発明のいくつかの具体例において、サンプルは、培養中の母体細胞を超えて胎児細胞を差動増殖することにより、胎児細胞につき富化される。差動増殖は、WO2008/048931(ここに出典明示して本明細書の一部とみなす)に記載された無血清培地中の細胞刺激因子(SCF)の存在下の母体および胎児起源のCD34+細胞を含有する母体血液のサンプルからの細胞培養を含めた、当該技術分野において知られた多数の方法によって行うことができる。
本発明のいくつかの具体例において、母体および胎児細胞の混合物中の胎児細胞は、約1:2個、約1:5個、約1:10個、約1:100個、約1:1000個、約1:10000個、または約1:100000個の胎児:母体細胞まで、または前記の数値のいずれか2つにより定義される範囲まで富化される。
サブサンプルへの分割
(好ましくは、全ゲノム増幅(WGA)または全トランスクリプトーム増幅(WTA)を用いる)サブサンプル増幅、ホモ接合性またはヘテロ接合性遺伝子座についてのスクリーニングまたは遺伝子型決定に先立ち、サンプルは、サブサンプル増幅(例えば、WGAまたはWTA)後でさえ、サンプルからの染色体コピー数がサブサンプル中で保存されるように、少数の十分な細胞を含むサブサンプルに分割できる。サンプルはポアソン分布または非ポアソン分布と一致するサブサンプルに分割できる。いくつかの具体例において、サンプルは連続して分割される。例えば、サンプルは連続的に分割できる。他の具体例において、サンプルは並列に分割される。
(好ましくは、全ゲノム増幅(WGA)または全トランスクリプトーム増幅(WTA)を用いる)サブサンプル増幅、ホモ接合性またはヘテロ接合性遺伝子座についてのスクリーニングまたは遺伝子型決定に先立ち、サンプルは、サブサンプル増幅(例えば、WGAまたはWTA)後でさえ、サンプルからの染色体コピー数がサブサンプル中で保存されるように、少数の十分な細胞を含むサブサンプルに分割できる。サンプルはポアソン分布または非ポアソン分布と一致するサブサンプルに分割できる。いくつかの具体例において、サンプルは連続して分割される。例えば、サンプルは連続的に分割できる。他の具体例において、サンプルは並列に分割される。
いくつかの具体例において、サンプルを分割して、100μL、50μL、10μL、1000nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、30nL、10nL、3nLもしくは1nLのサブサンプル体積のまま、その体積未満または約その体積未満、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲のサブサンプル体積を供する。好ましくは、各サブサンプルは100nL以下の体積を含む。いくつかの具体例において、各サブサンプルは、約500、400、300、200もしくは100個以下の細胞、または前記の値のいずれか2つによって規定される範囲を含む。好ましくは、各サブサンプルは、約50、40、30、20もしくは10個以下の細胞または前記の値のいずれかの2つによって規定される範囲を含む。より好ましくは、各サブサンプルは、約5、4、3または2個以下の細胞を含む。いくつかの具体例において、各サブサンプルは1個以下の細胞を含む。
いくつかの具体例において、各サブサンプルは、平均500、400、300、200もしくは100個の細胞、または約その個数、あるいは前記の値のいずれかの2つによって規定される範囲を含む。好ましくは、各サブサンプルは平均約50、40、30、20もしくは10個の細胞、または前記の値のいずれかの2つによって規定される範囲を含む。より好ましくは、各サブサンプルは、平均5、4、3もしくは2個の細胞、または約その個数、あるいは前記の値のいずれかの2つによって規定される範囲を含む。いくつかの具体例において、各サブサンプルは、平均が約1個未満の細胞、約1個の細胞または約1〜2個の細胞、あるいは前記の値のいずれかの2つによって規定される範囲を含む。
サンプルの分割は、マイクロ流体装置中の個々の細胞の油分離を創製するオイルプラグ、ウェル中への析出または、平坦な基材に対する表面張力により固着させた独立滴の使用を含めた、当該技術分野において知られたいずれの方法によっても行われる。加えて、サブサンプルは、引き続いての反応に適切である緩衝液中で懸濁できる。例えば、サブサンプルは、単一工程細胞溶解に続いてサブサンプルのさらなる操作がない増幅を可能とする溶解およびPCR緩衝液を含む溶液中に懸濁できる。
サブサンプルの増幅
単一の細胞またはサブサンプル中の限定された量の遺伝物質を補うために、サブサンプル増幅を所望により行うことができる。例えば、核酸複製または細胞***を行うことができる。サンプルは、そのサンプルからの染色体コピー数がサブサンプル増幅後にサブサンプル中で保存されるように、少数の十分な細胞を含むサブサンプルに分割される。好ましい具体例において、サブサンプル増幅は、単一細胞を含有するサブサンプルに対して行われ、その結果、得られた増幅生成物は、母体または胎児の細胞のいずれかのゲノムまたはトランスクリプトームを表わす。例えば、サブサンプル増幅は、本明細書に記載されるごとく、マイクロウェルまたはオイルプラグによって分離された滴中に位置する個々の細胞に対して行うことができる。
単一の細胞またはサブサンプル中の限定された量の遺伝物質を補うために、サブサンプル増幅を所望により行うことができる。例えば、核酸複製または細胞***を行うことができる。サンプルは、そのサンプルからの染色体コピー数がサブサンプル増幅後にサブサンプル中で保存されるように、少数の十分な細胞を含むサブサンプルに分割される。好ましい具体例において、サブサンプル増幅は、単一細胞を含有するサブサンプルに対して行われ、その結果、得られた増幅生成物は、母体または胎児の細胞のいずれかのゲノムまたはトランスクリプトームを表わす。例えば、サブサンプル増幅は、本明細書に記載されるごとく、マイクロウェルまたはオイルプラグによって分離された滴中に位置する個々の細胞に対して行うことができる。
核酸複製は、当該技術分野において知られた核酸(例えば、タンパク質発現)についてのさらなるコピーの核酸、核酸を示すさらなるシグナル等を生成するいずれかの方法を用いて行うことができる。いくつかの具体例において、核酸複製は、WGA、WTAまたは標的核酸増幅技術を用いて行われる。他の具体例において、核酸複製は、INVADERR(Hologic, Inc., Bedford, MA)のごとき核酸配列を示すシグナルを生成する方法を用いて行われる。いくつかの具体例において、一部分だけの増幅配列が核酸テンプレートに相補的である。例えば、いくつかの具体例において、連続増幅生成物は、一部分の核酸テンプレートおよび一部分のシグナル配列を含む。核酸複製についての一般的技術は、等温または熱サイクルの複製を含み得る。いくつかの具体例において、核酸複製は、SNP遺伝子型決定に先立って行われる。しかしながら、核酸複製もSNP遺伝子型決定後に行うことができる。
また、細胞複製は、当該技術分野において知られたいずれの方法を用いても行うことができる。いくつかの具体例において、細胞は、本明細書に記載された方法に用いるさらなる核酸コピーを生成する培地および補足剤中で培養される。他の具体例において、細胞は培養され、1個以上の細胞が引き続いての分析における使用のためにそのままにされる。いくつかの具体例において、細胞複製はサブサンプルへの分割に先立ち行われる。好ましくは、細胞複製はサブサンプルへの分割後に行われる。
アリコートへの分割
サブサンプルの増幅後、増幅生成物はアリコートに分割できる。これらのアリコートは複数のアッセイに用いることができる。例えば、1つの具体例では、増幅生成物からの1以上のアリコートを用いて、胎児対立遺伝子の存在を検出し、一方、1以上の他のアリコートを用いて、胎児のゲノムまたはトランスクリプトームを含有する増幅生成物中の胎児の遺伝的変異の存在を検出する。いくつかの具体例において、胎児のゲノムまたはトランスクリプトームを含有すると同定されたアリコートは、遺伝的変異についての配列によってアッセイされる。例えば、アリコートは遺伝子疾患(例えば、ウィリアムズ症候群、ウルフ−ハーシュホーン症候群、ミラー−ディッカー症候群、スミス−マゲニス症候群、アンゲルマン症候群、ディジョージ症候群、プラーダー−ヴィリ症候群、ヤコブセン症候群、ネコ鳴き症候群、シャルコー−マリー−ツース病、マイクロ重複22q11.2症候群、嚢胞性線維症、テイ−サックス病、ハンチントン病、アルツハイマー病および種々の癌)に関連した遺伝的変異につきアッセイできる。
サブサンプルの増幅後、増幅生成物はアリコートに分割できる。これらのアリコートは複数のアッセイに用いることができる。例えば、1つの具体例では、増幅生成物からの1以上のアリコートを用いて、胎児対立遺伝子の存在を検出し、一方、1以上の他のアリコートを用いて、胎児のゲノムまたはトランスクリプトームを含有する増幅生成物中の胎児の遺伝的変異の存在を検出する。いくつかの具体例において、胎児のゲノムまたはトランスクリプトームを含有すると同定されたアリコートは、遺伝的変異についての配列によってアッセイされる。例えば、アリコートは遺伝子疾患(例えば、ウィリアムズ症候群、ウルフ−ハーシュホーン症候群、ミラー−ディッカー症候群、スミス−マゲニス症候群、アンゲルマン症候群、ディジョージ症候群、プラーダー−ヴィリ症候群、ヤコブセン症候群、ネコ鳴き症候群、シャルコー−マリー−ツース病、マイクロ重複22q11.2症候群、嚢胞性線維症、テイ−サックス病、ハンチントン病、アルツハイマー病および種々の癌)に関連した遺伝的変異につきアッセイできる。
増幅生成物の均質または非均質部分は、アリコートへの分割のために選択できる。いくつかの具体例において、増幅生成物の均質部分は順次(例えば、連続的に)分割される。他の具体例において、増幅生成物の均質部分は並列的に分割される。別法として、増幅生成物の非均質部分は、ポジティブ選択、ネガティブ選択またはポジティブおよびネガティブ選択の組合せを用いて、アリコートへの分割のために選択できる。例えば、いくつかの具体例において、ビーズ結合捕捉オリゴを用いて、アリコートへの分割のための所望の部分の増幅生成物を標的とする。他の具体例において、表面結合オリゴを用いて、所望でない部分の増幅生成物を除去する。増幅生成物の非均質部分は、本明細書に記載されたものを含めた、当該技術分野において知られたいずれかの物理的または生化学的特性に基づき選択できる。例えば、特定の電荷、サイズまたは染色体の同一性を持った一部分の増幅生成物は、アリコートへの分割のため選択できる。
サブサンプル増幅の所望の工程が行れないいくつかの具体例において、サブサンプルの一部分またはアリコートは引き続いての分析のために除去できる。
いくつかの具体例において、アリコートは2個以上のアリコートの群に貯蔵される。これは、本明細書に記載されたSNPに基づくまたは他の反応の数がNの因子と同程度まで低下するのを可能とし、ここに、Nは、各貯蔵中のアリコート数である。次いで、ポジティブな貯蔵(すなわち、母体の遺伝子型と異なる少なくとも1つの遺伝子型を持った貯蔵)からのアリコートは、アリコート毎に再試験して、胎児対立遺伝子を含有するアリコートを同定し得る。いくつかの具体例において、各貯蔵は、試験遺伝子座にて非母体対立遺伝子につき試験される。いくつかの具体例において、各貯蔵はそれぞれ2以上の試験遺伝子座にて非母体対立遺伝子につき試験される。
いくつかの具体例において、アリコートは、陽性の貯蔵内の陽性アリコートの源の同定を可能とするインデックス方式を用いて貯蔵される。例えば、2以上のアリコートを各増幅生成物から得て、N×Mに増幅されたアリコートのインデックスを付した貯蔵を形成し得る。少なくとも1つの胎児対立遺伝子を含有するウェルは、直角の縦座標系における陽性のNおよびM貯蔵の交差を位置させることにより同定できる。いくつかの具体例において、N(すなわち、N×Mインデックス中の行数)およびM(すなわち、N×Mインデックス中の列数)は、独立して約2〜約1000である。好ましくは、NおよびMは、独立して約8〜約100である。いくつかの具体例において、Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、32、36、40、48、50、56、60、64、70、72、80、84、88、90、96、100、192、288、384、480、576、672、768、864、960、1000の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下または約その数以下、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲である。いくつかの具体例において、Mは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、32、36、40、48、50、56、60、64、70、72、80、84、88、90、96、100、192、288、384、480、576、672、768、864、960、1000の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下または約その数以下、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲である。好ましい具体例において、増幅生成物の均質または非均質部分にインデックスを付して、ポジティブなアリコートの源の同定を可能とする。
親の遺伝子型の獲得または推測
親の遺伝子型は、非母体対立遺伝子の同定を支援するように得られるかまたは推測できる。今度は、非母体対立遺伝子に関する情報を用いて、アリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定するか、または遺伝子変異体につき胎児ゲノムを直接的に分析できる。例えば、父または母体の遺伝子型は、父または母体のサンプルを直接的に遺伝子決定することにより得ることができるか、または遺伝学的に関連する家族からのサンプルを遺伝子型決定することにより推測できる。しかしながら、好ましい具体例において、父の遺伝子型を得るかまたは推測する必要はない。例えば、好ましい具体例において、母体の遺伝子型だけが得られる。
親の遺伝子型は、非母体対立遺伝子の同定を支援するように得られるかまたは推測できる。今度は、非母体対立遺伝子に関する情報を用いて、アリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定するか、または遺伝子変異体につき胎児ゲノムを直接的に分析できる。例えば、父または母体の遺伝子型は、父または母体のサンプルを直接的に遺伝子決定することにより得ることができるか、または遺伝学的に関連する家族からのサンプルを遺伝子型決定することにより推測できる。しかしながら、好ましい具体例において、父の遺伝子型を得るかまたは推測する必要はない。例えば、好ましい具体例において、母体の遺伝子型だけが得られる。
いくつかの具体例において、父または母体の遺伝子型は、(本明細書に記載されたものを含めた)血液、血漿、血清、尿、頬側スワブ、唾液、涙、皮膚または父系核酸の他の源からの遺伝物質を遺伝子型決定することにより得られる。いくつかの具体例において、父または母体の遺伝子型は、無細胞核酸またはこれらの源の1つに由来した細胞から抽出された核酸を用いて得られる。また、父または母体の遺伝子型決定は、DNAに対して好ましくは行われるが、RNA、cDNAまたは当該技術分野において知られたいずれかの他の核酸に対して行うことができる。いくつかの具体例において、父または母体サンプルのテンプレートは(例えば、PCRに基づく方法を用いて)増幅および検出される。しかしながら、いくつかの具体例において、父または母体サンプルのテンプレートは(例えば、本明細書に記載された方法を用いて)増幅されない。
また、父および母体の遺伝子型は、データベース、試験報告または本明細書に記載された方法が行われた先の妊娠からの情報のごとき先の遺伝子試験中に生成された情報へのアクセスにより得ることができる。また、父または母体の遺伝子型は、血族の遺伝子型を用いて推測できる。例えば、遺伝学的に関連する親、兄弟、祖父母、おば、おじまたは子供の遺伝子型を用いて、父または母体の遺伝子型を推測できる。
当該技術分野における公知のいずれかの多形性を用いて、親サンプルを遺伝子型決定できる。例えば、SNP、ハプロタイプ、短鎖縦列反復配列(STR)または他の配列変異を遺伝子型決定できる。また、遺伝子またはエピジェネティックマーカーを用いて、親サンプルを遺伝子決定できる。例えば、コピー数変異(CNV)またはメチル化パターンを評価できる。
母体および胎児核酸の混合物中の少なくとも1つの非母体対立遺伝子の所望の同定
ホモ接合性の標的遺伝子座が母体サンプル中で同定された具体例において、母体および胎児核酸の混合物を所望により用いて、同一の遺伝子座にてヘテロ接合性遺伝子型を同定でき、これは、胎児の存在(すなわち、非母体対立遺伝子/有益な父性対立遺伝子)を示す。この所望の工程は、個体のアリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定するのに先立ち、好ましく行われる。母体および胎児核酸の混合サンプル中で非母体対立遺伝子につきスクリーニングし、それにより、ヘテロ接合性遺伝子座(従って、胎児対立遺伝子)を同定すると、アリコートおよびサブサンプルは、有益であると知られているSNPにつきより効率的にスクリーニングできる。好ましい具体例において、胎児の無細胞のDNAを用いて、非母体対立遺伝子につきスクリーニングし、ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。もう一つの具体例において、胎児の無細胞のRNAまたはcDNAを用いて、ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。
ホモ接合性の標的遺伝子座が母体サンプル中で同定された具体例において、母体および胎児核酸の混合物を所望により用いて、同一の遺伝子座にてヘテロ接合性遺伝子型を同定でき、これは、胎児の存在(すなわち、非母体対立遺伝子/有益な父性対立遺伝子)を示す。この所望の工程は、個体のアリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定するのに先立ち、好ましく行われる。母体および胎児核酸の混合サンプル中で非母体対立遺伝子につきスクリーニングし、それにより、ヘテロ接合性遺伝子座(従って、胎児対立遺伝子)を同定すると、アリコートおよびサブサンプルは、有益であると知られているSNPにつきより効率的にスクリーニングできる。好ましい具体例において、胎児の無細胞のDNAを用いて、非母体対立遺伝子につきスクリーニングし、ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。もう一つの具体例において、胎児の無細胞のRNAまたはcDNAを用いて、ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。
無細胞核酸は、妊婦からの血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄またはダグラス窩穿刺を含めた、当該技術分野における公知のいずれかの源から得ることができる。また、核酸を母体および胎児細胞の混合サンプルから抽出して、ヘテロ接合性遺伝子座を同定できる。好ましくは、DNAは母体および胎児細胞の混合サンプルから抽出される。しかしながら、RNAまたはcDNAは、母体および胎児細胞の混合サンプルから抽出できる。核酸は、血液、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄、ダグラス窩穿刺、リンパ節または骨髄を含めた当該技術分野における公知のいずれかの源から得られた細胞から抽出できる。他の具体例において、全血を用いて、全血を細胞、血漿または血清画分に分割せずに(または分割に先立ち)ヘテロ接合性遺伝子型を同定する。
いくつかの具体例において、母体および胎児核酸の混合サンプルからのアリコートの核酸テンプレートを増幅および検出して、(例えば、PCRに基づく方法を用いて)ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。しかしながら、いくつかの具体例において、混合サンプルからのアリコートの核酸テンプレートは増幅せずに、ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。
例えば、テンプレートと関連するシグナルのみが増幅される方法(米国特許第7,226,798号、第7,473,775号および第7,468,261号に記載されたABSCRIPTIONTM方法(Ribomed Biotechnologies, Inc., Carlsbad, CA)またはINVADERR化学に関連する方法(Hologic, Inc.))を使用できる。また、核酸テンプレートがシグナルまたはテンプレートの増幅なくして検出される方法(例えば、WO2005/01122(Adnavance Technologies, Inc., San Diego, CA)に記載されたDNA結合の化学的検出を含む方法)を使用できる。加えて、核酸テンプレートが増幅なくして配列決定される方法(例えば、Eidら, Science 2009 323(5910): 133-38に記載された配列決定方法)を使用できる。非母体対立遺伝子の同定用のテンプレートの源が、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブまたは当該技術分野における公知の核酸のいずれかの源を含むことができることは当業者により理解されるであろう。
例えば、テンプレートと関連するシグナルのみが増幅される方法(米国特許第7,226,798号、第7,473,775号および第7,468,261号に記載されたABSCRIPTIONTM方法(Ribomed Biotechnologies, Inc., Carlsbad, CA)またはINVADERR化学に関連する方法(Hologic, Inc.))を使用できる。また、核酸テンプレートがシグナルまたはテンプレートの増幅なくして検出される方法(例えば、WO2005/01122(Adnavance Technologies, Inc., San Diego, CA)に記載されたDNA結合の化学的検出を含む方法)を使用できる。加えて、核酸テンプレートが増幅なくして配列決定される方法(例えば、Eidら, Science 2009 323(5910): 133-38に記載された配列決定方法)を使用できる。非母体対立遺伝子の同定用のテンプレートの源が、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブまたは当該技術分野における公知の核酸のいずれかの源を含むことができることは当業者により理解されるであろう。
少なくとも1つの有益な父性対立遺伝子の存在についての少なくとも1つのアリコートまたはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定
次の工程は、サブサンプルまたはアリコートをスクリーニングまたは遺伝子決定して、非母体対立遺伝子を同定することである。一旦、(本明細書により詳細に記載された)SNPパネルが生成され、および母体の遺伝子サンプルがホモ接合性(別法として、ヘテロ接合性)である1組の標的遺伝子座が同定されたならば、試験遺伝子座または遺伝子座群を選択して、胎児対立遺伝子の存在につきサブサンプルまたはアリコートをスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。胎児対立遺伝子の存在を検出するために、試験遺伝子座は、非母体対立遺伝子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定される(すなわち、試験遺伝子座にてヘテロ接合性、または別法として、ホモ接合性遺伝子型を同定することによる)。いくつかの具体例において、増幅生成物のアリコートをアリコート毎にスクリーニングまたは遺伝子型決定して、ヘテロ接合性(または別法として、ホモ接合性の)遺伝子座を検出する。いくつかの具体例において、アリコートは、単一細胞から増幅された物質を含む。
次の工程は、サブサンプルまたはアリコートをスクリーニングまたは遺伝子決定して、非母体対立遺伝子を同定することである。一旦、(本明細書により詳細に記載された)SNPパネルが生成され、および母体の遺伝子サンプルがホモ接合性(別法として、ヘテロ接合性)である1組の標的遺伝子座が同定されたならば、試験遺伝子座または遺伝子座群を選択して、胎児対立遺伝子の存在につきサブサンプルまたはアリコートをスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。胎児対立遺伝子の存在を検出するために、試験遺伝子座は、非母体対立遺伝子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定される(すなわち、試験遺伝子座にてヘテロ接合性、または別法として、ホモ接合性遺伝子型を同定することによる)。いくつかの具体例において、増幅生成物のアリコートをアリコート毎にスクリーニングまたは遺伝子型決定して、ヘテロ接合性(または別法として、ホモ接合性の)遺伝子座を検出する。いくつかの具体例において、アリコートは、単一細胞から増幅された物質を含む。
サブサンプルまたはアリコートは母体サンプル中でホモ接合性と従前に同定された遺伝子座にて遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、母体サンプル中でホモ接合性と従前に同定された遺伝子座の遺伝子型は、非母体対立遺伝子の存在につきスクリーニングすることにより決定される。所望により、本明細書に記載されるごとく、非母体対立遺伝子につきアリコートまたはサブサンプルをスクリーニングするのに先立ち、混合された母体および胎児核酸(好ましくは、無細胞)のサンプルを用いて、混合核酸中の非母体対立遺伝子の存在を同定し、これは、胎児材料中の同一の遺伝子座にてヘテロ接合性遺伝子型の存在を示す。
他の具体例において、サブサンプルまたはアリコートは、母体サンプル中でヘテロ接合性と従前に同定された遺伝子座にて遺伝子型決定される。同一の遺伝子座についてのアリコートまたはサブサンプル中のホモ接合性遺伝子型の同定は、非母体、すなわち、胎児対立遺伝子の存在を示す。
本明細書に記載されたいずれの具体例におけるスクリーニングまたは遺伝子決定方法も、アリコートまたはサブサンプルのいずれかを用いて行い得ることは当業者により理解されるであろう。アリコートおよびサブサンプルは、本明細書に言及したものを含めて、当該技術分野における公知の多数の方法を用いて、胎児対立遺伝子につきスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。例えば、アリコートは、分子ビーコンまたは他の核酸に基づくSNP検出法を用いて、スクリーニングまたは遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、アリコート中の核酸テンプレートは(例えば、PCRに基づく方法を用いて)増幅および検出される。しかしながら、いくつかの具体例において、核酸テンプレートは(例えば、本明細書に記載された方法を用いて)増幅されない。さらに、当該技術分野における公知のいずれのマーカーを用いても、アリコートおよびサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。好ましい具体例において、SNP、ハプロタイプ、短鎖縦列反復配列(STR)、他の配列変化、コピー数変異(CNV)または母体サンプル中で遺伝子型決定されたエピジェネティックなマーカーが用いられる。
いくつかの具体例において、サブサンプルが1個以下の細胞を含むために、サブサンプルまたはアリコートのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、各細胞単位でできる。また、サブサンプルまたはアリコートは、本明細書に記載したものを含めた当該技術分野における公知の多数の方法を用いて、スクリーニングまたは遺伝子型決定できる。好ましくは、サブサンプルは、TAQMANRシステム(Foster City, CA)で定量的PCR(qPCR)を用いて、ヘテロ接合性対立遺伝子につきスクリーニングされる。所定の数のサブサンプルまたは細胞をスクリーニングして、ヘテロ接合性対立遺伝子を検出できる。例えば、表1に示されるごとく、1つの遺伝子座当たり約5個の胎児細胞が期待される場合に1:10,000個の胎児:母体細胞に富化したサンプル中の7つの遺伝子座を試験するために、所定の数のサンプルまたは細胞は、350,000個である。いくつかの具体例において、1遺伝子座当たりの胎児細胞数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250または300個の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲である。
少なくとも1つのアリコートまたはサブサンプル中の少なくとも1つの有益な父性対立遺伝子の同定
本明細書に記載されるごとく、ホモ接合性(または別法としてヘテロ接合性)SNPが母体の遺伝物質中で同定された後、これらのSNPをサブサンプルまたはアリコート中でスクリーニングまたは遺伝子型決定して、非母体対立遺伝子の存在を検出できる。第1の母体のホモ接合性/ヘテロ接合性SNPがアリコートまたはサブサンプル中でヘテロ接合性/ホモ接合性遺伝子型を生成しないならば、第2の母体のホモ接合性/ヘテロ接合性SNPを選択および遺伝子型決定できる。非母体対立遺伝子が検出されるか、または所定の数のSNPおよび/または細胞、サブサンプルまたはアリコートをスクリーニングされるまで、このプロセスを繰り返すことができる。また、このプロセスは、複数のアリコートもしくはサブサンプル、多重化SNPまたはそのいずれかの組合せを遺伝子型決定することを含むことができる。
本明細書に記載されるごとく、ホモ接合性(または別法としてヘテロ接合性)SNPが母体の遺伝物質中で同定された後、これらのSNPをサブサンプルまたはアリコート中でスクリーニングまたは遺伝子型決定して、非母体対立遺伝子の存在を検出できる。第1の母体のホモ接合性/ヘテロ接合性SNPがアリコートまたはサブサンプル中でヘテロ接合性/ホモ接合性遺伝子型を生成しないならば、第2の母体のホモ接合性/ヘテロ接合性SNPを選択および遺伝子型決定できる。非母体対立遺伝子が検出されるか、または所定の数のSNPおよび/または細胞、サブサンプルまたはアリコートをスクリーニングされるまで、このプロセスを繰り返すことができる。また、このプロセスは、複数のアリコートもしくはサブサンプル、多重化SNPまたはそのいずれかの組合せを遺伝子型決定することを含むことができる。
試験遺伝子座は、サンプル中に存在すれば、少なくとも1つの胎児対立遺伝子が検出されるように、スクリーニングまたは遺伝子型決定される。いくつかの具体例において、少なくとも1つの非母体対立遺伝子が検出されるまで、試験遺伝子座はスクリーニングまたは遺伝子型決定される。いくつかの具体例において、十分な細胞を遺伝子型決定して、非母体対立遺伝子を検出する指定の可能性を超えるまで、第1の試験遺伝子座は、アリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定される。非母体対立遺伝子が検出されないならば、十分な細胞を試行して非母体対立遺伝子を検出する指定の可能性を超えるまで、第2の試験遺伝子座は、アリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定される。非母体対立遺伝子が検出されないならば、試行された試験遺伝子座の数が混合サンプルからの非母体(かくして、胎児性)対立遺伝子を検出する指定の累積的可能性を超えるまで、さらなる遺伝子座はスクリーニングまたは遺伝子型決定される。
また、試験遺伝子座は、1を超える胎児対立遺伝子が検出されるまで、スクリーニングまたは遺伝子型決定できる。1を超える試験遺伝子座がスクリーニングまたは遺伝子型決定されるならば、胎児対立遺伝子(すなわち、母体の遺伝子型と異なる遺伝子型を持つ)にポジティブなさらなる各遺伝子座試験は、サブサンプルまたはアリコート中で胎児ゲノムを検出する確信を増加させる。加えて、所定の数の試験遺伝子座は、胎児の遺伝物質が存在しないかもしれないという事実を説明するように指定できる。いくつかの具体例において、所定の数の試験遺伝子座は、関連した組の変数につき胎児対立遺伝子を検出する累積的可能性の計算により決定される。例えば、表3に示されるごとく、約0.5の少数の対立遺伝子頻度を持つ7個のSNPを用いて、ヘテロ接合性の胎児対立遺伝子の存在を検出する可能性は、1−(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)=99.22%である。従って、表1に示すごとく、1:10,000個の胎児:母体細胞につき富化されたサンプルからの350,000個のアリコートもしくはサブサンプルについて、所定の数の試験遺伝子座は、約7個の試験遺伝子座であることができる。
試験遺伝子座は、個々にまたは複数にて、スクリーニングまたは遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、1つの試験遺伝子座は、単一のアリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定される。また、単一の試験遺伝子座は、複数のアリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。加えて、アリコートもしくはサブサンプルは、個々にまたは複数でスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、1を超える試験遺伝子座は、単一のアリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定される。加えて、1を超える試験遺伝子座も複数のアリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、パネル中の試験遺伝子座数は、胎児対立遺伝子をスクリーニングまたは遺伝子型決定するための2、3、4、5、6、7、8、9または10個の数そのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下の複数の試験遺伝子座、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲である。
いくつかの具体例において、母体および胎児核酸(好ましくは無細胞)の混合物中にヘテロ接合性(従って、非母体)遺伝子型を含むと同定された遺伝子座は、母体および胎児細胞の混合物に由来したサブサンプルを用いて、各サブサンプル単位でスクリーニングされる。次いで、保存されたアリコートおよびサブサンプルを用いて、さらなる遺伝子分析を行うことができる。しかしながら、胎児対立遺伝子の存在の検出における母体および胎児の無細胞核酸の利点にも拘らず、これらのサンプルは、胎児ゲノムもしくはトランスクリプトームの完全性の貯蔵、またはサンプルの捕捉を必要とする分析に適していない。これは、本明細書に記載された細胞に基づく方法を用いる利点の1つを強調する。
アリコートまたはサブサンプルの収集
胎児対立遺伝子を含むと同定されたアリコートまたはサブサンプルは、引き続いての分析のために収集できる。引き続いての分析のために収集されたアリコートは、胎児対立遺伝子につきスクリーニングするのに用いた同一のものであることができるか、または同一のサブサンプルからの異なるアリコートを用いて胎児対立遺伝子スクリーニングに用いたいずれの反応にも付されなかったアリコートを提供できる。いくつかの具体例において、アリコートまたはサブサンプルは、所望の核酸の品質、量または存在に基づいた収集のために選択される。例えば、アリコートまたはサブサンプルは、シグナルの相関性、シグナル強度、シグナル強度比、バックグラウンド測定に比較したシグナル、経時的プロットアッセイキネティックス、温度プロットアッセイキネティックス、または当該技術分野における公知の他の性能測定基準を用いて収集につき選択できる。いくつかの具体例において、父系と母体対立遺伝子とを区別するのに用いたマーカーまたは領域が収集される。しかしながら、他の具体例において、連関しないマーカーまたは領域は、さらなる分析のために収集される。
胎児対立遺伝子を含むと同定されたアリコートまたはサブサンプルは、引き続いての分析のために収集できる。引き続いての分析のために収集されたアリコートは、胎児対立遺伝子につきスクリーニングするのに用いた同一のものであることができるか、または同一のサブサンプルからの異なるアリコートを用いて胎児対立遺伝子スクリーニングに用いたいずれの反応にも付されなかったアリコートを提供できる。いくつかの具体例において、アリコートまたはサブサンプルは、所望の核酸の品質、量または存在に基づいた収集のために選択される。例えば、アリコートまたはサブサンプルは、シグナルの相関性、シグナル強度、シグナル強度比、バックグラウンド測定に比較したシグナル、経時的プロットアッセイキネティックス、温度プロットアッセイキネティックス、または当該技術分野における公知の他の性能測定基準を用いて収集につき選択できる。いくつかの具体例において、父系と母体対立遺伝子とを区別するのに用いたマーカーまたは領域が収集される。しかしながら、他の具体例において、連関しないマーカーまたは領域は、さらなる分析のために収集される。
いくつかの具体例において、所望の部分のアリコートまたはサブサンプルだけが、引き続いての分析のために収集される。例えば、いくつかの具体例において、ハイブリダイゼーションプローブを用いて、注目する染色体または領域から核酸配列だけを収集する。他の具体例において、全アリコート、サブサンプルまたはその均質部分は収集される。
遺伝的変異体についての少なくとも1つの胎児ゲノムの分析
本明細書に記載されるごとく所望により収集された、非母体対立遺伝子を有すると同定されたアリコートまたはサブサンプルをさらに分析して、例えば、染色体または遺伝的変異の存在につき試験できる。分析に用いたアリコートは、胎児対立遺伝子につきスクリーニングまたは遺伝子型決定された同一のアリコートであることができる。あるいは、分析に用いたアリコートは、同一のサブサンプルからの異なるアリコートであるが、胎児対立遺伝子につきいずれかのスクリーニングまたは遺伝子型決定に付されなかったものであることができる。胎児のゲノム全体またはその一部分は、さらなる分析のために選択できる。いくつかの具体例において、多形性は当該技術分野における公知の方法を用いて遺伝子型決定される。例えば、SNP、ハプロタイプまたはSTRは、PCR、および適当な場合には、キャピラリー電気泳動のごとき引き続いての検出方法を用いて遺伝子型決定できる。また、多形性は、配列決定方法を用いて遺伝子型決定できる。遺伝子型決定は好ましくは高処理技術を用いて行われる。例えば、いくつかの具体例において、マイクロアレイを用いて、SNPおよび/またはハプロタイプに関するデータを生成する。また、コピー数変異は、さらなる分析のために評価できる。例えば、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)を用いて、コピー数変異を検出できる。また、染色体再編成を評価できる。例えば、反転または転座は、配列決定、FISHまたはPCRのごとき方法を用いて検出できる。
本明細書に記載されるごとく所望により収集された、非母体対立遺伝子を有すると同定されたアリコートまたはサブサンプルをさらに分析して、例えば、染色体または遺伝的変異の存在につき試験できる。分析に用いたアリコートは、胎児対立遺伝子につきスクリーニングまたは遺伝子型決定された同一のアリコートであることができる。あるいは、分析に用いたアリコートは、同一のサブサンプルからの異なるアリコートであるが、胎児対立遺伝子につきいずれかのスクリーニングまたは遺伝子型決定に付されなかったものであることができる。胎児のゲノム全体またはその一部分は、さらなる分析のために選択できる。いくつかの具体例において、多形性は当該技術分野における公知の方法を用いて遺伝子型決定される。例えば、SNP、ハプロタイプまたはSTRは、PCR、および適当な場合には、キャピラリー電気泳動のごとき引き続いての検出方法を用いて遺伝子型決定できる。また、多形性は、配列決定方法を用いて遺伝子型決定できる。遺伝子型決定は好ましくは高処理技術を用いて行われる。例えば、いくつかの具体例において、マイクロアレイを用いて、SNPおよび/またはハプロタイプに関するデータを生成する。また、コピー数変異は、さらなる分析のために評価できる。例えば、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)を用いて、コピー数変異を検出できる。また、染色体再編成を評価できる。例えば、反転または転座は、配列決定、FISHまたはPCRのごとき方法を用いて検出できる。
いくつかの具体例において、母系および父系遺伝した対立遺伝子の比を決定して、遺伝的変異の存在を分析する。所望により、同一遺伝子座を用いて、胎児対立遺伝子の存在および遺伝的変異の存在を決定する。例えば、ヘテロ接合性の試験遺伝子座での対立遺伝子の強度は測定でき、2:1または1:2の強度比は、コピー数変異を示す。しかしながら、いくつかの具体例において、遺伝子座を用いて、胎児対立遺伝子の存在が遺伝的変異を決定するために用いた同一の遺伝子座ではないことを決定する。加えて、他の強度比(例えば、3:1、1:3、3:2、2:3、4:1および1:4)を用いてコピー数変異の存在を検出できることは、本明細書に記載された具体例のいずれにおいても当業者によって理解されるであろう。
いくつかの具体例において、染色体配列の過剰提示または提示不足を決定して、コピー数変異の存在を分析する。例えば、特定の染色体についてのユニークな配列読み取り数を測定し、母体または他の参照染色体と比較でき、1:1未満または1:1を超える比は、コピー数変異を示す。これらのユニークな配列読み取りの検出は、小規模(例えば、特定の遺伝子座につき設計されたプライマー対での配列決定)または大規模(例えば、全ゲノムの配列決定)方法を用いて行うことができる。また、特定の染色体領域についての配列読み取り数を測定し、母体および/または他の参照染色体領域と比較でき、1:1未満または1:1を超える比は、コピー数変異の存在を示す。
アリコートまたはサブサンプルは、個々にまたは少なくとも2つのアリコートもしくはサブサンプルの組合せサンプル中で分析し得る。いくつかの具体例において、アリコートまたはサブサンプルを本明細書に記載されたシグナル測定基準に基づいてランク付けし、好ましい組は、分析または貯蔵後の分析のために選択される。いくつかの具体例において、単離されたアリコートもしくはサブサンプルまたは貯蔵物は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)、定量的蛍光PCR(QF−PCR)、短鎖縦列反復配列(STR)分析または配列決定を用いて、遺伝子または染色体変化の存在につき試験される。しかしながら、本明細書に記載されたものを含めた当該技術分野における公知のいずれの技術を用いても、遺伝子または染色体の変異の存在につき試験できる。
各細胞単位でのアリコートもしくはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、モザイク現象(すなわち、同一個体からの細胞が異なる遺伝子プロフィールを有する状態)の検出を可能とする。例えば、サブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子決定して、モザイク染色体の変異を検出できる。いくつかの具体例において、モザイク現象につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたサブサンプル数は、約2〜約100個のサブサンプルである。いくつかの具体例において、スクリーニングまたは遺伝子型決定されたサブサンプル数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80または100の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲である。好ましい具体例において、スクリーニングまたは遺伝子型決定されたサブサンプル数は、約5〜約10個のサブサンプルである。所望により、同一遺伝子座を用いて、胎児対立遺伝子の存在およびモザイク現象の存在を決定する。例えば、ヘテロ接合性の試験遺伝子座の対立遺伝子の強度を測定でき、少なくとも1つのサブサンプル中の1:1の強度比および、少なくとも1つの他のサブサンプル中の2:1または1:2の強度比は、モザイク遺伝的変異の存在を示す。しかしながら、異なる遺伝子座を用いても、胎児対立遺伝子の存在およびモザイク現象の存在を決定できる。例えば、ホモ接合性の試験遺伝子座を用いて、胎児対立遺伝子を同定できる。次いで、ヘテロ接合性遺伝子座を検出でき、ヘテロ接合性遺伝子座での対立遺伝子の強度を測定でき、少なくとも1つのサブサンプル中の1:1の強度比および少なくとも1つの他のサブサンプル中の2:1または1:2の強度比は、再度、モザイク遺伝的変異の存在を示す。
いくつかの具体例において、モザイク現象は、性特異的染色体を用いて検出される。例えば、ヘテロ接合性X染色体試験遺伝子座での対立遺伝子を検出でき、少なくとも1つのサブサンプル中の1つの対立遺伝子の存在、および少なくとも1つの他のサブサンプル中の双方の対立遺伝子の存在は、モザイク異数性(例えば、モザイクターナー症候群)の存在を示す。もう一つの具体例において、ホモ接合性X染色体試験遺伝子座での対立遺伝子の存在を検出でき、少なくとも1つのサブサンプル中の1:1のX:Yの染色体強度比および少なくとも1つの他のサブサンプル中の2:1のX:Yの染色体強度比は、モザイク異数性(例えば、モザイククラインフェルター症候群)の存在を示す
また、各細胞単位でのアリコートもしくはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、二卵性双胎(すなわち、非同一の双子)の検出を可能とする。例えば、SNP遺伝子型決定は、胎児対立遺伝子を含有するサブサンプルに対して行うことができ、異なるSNP遺伝子型を持つ少なくとも2つのサブサンプルの存在は、二卵性双胎の存在を示す。いくつかの具体例において、二卵性双胎を検出するためにスクリーニングおよび遺伝子決定されるSNP数は、約1〜約20個のSNPである。いくつかの具体例において、スクリーニングまたは遺伝子型決定されるSNP数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18もしくは20の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下のSNP、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲である。好ましい具体例において、スクリーニングまたは遺伝子型決定されるSNP数は、約3〜約4個のSNPである。3個のSNPを用いる二卵性双胎の存在を検出する可能性は、約1−(0.5)(0.5)(0.5)=87.5%であり、一方、4個のSNPを用いる二卵性双胎の存在を検出する可能性は、約1−(0.5)(0.5)(0.5)(0.5)=93.75%である。
いくつかの具体例において、二卵性双胎からの胎児対立遺伝子を含むアリコートを貯蔵できる。例えば、第1の双子からの細胞を含むアリコートは、第2の双子からの細胞を含むアリコートと独立して貯蔵できる。いくつかの具体例において、第1および第2の双子からの貯蔵されたアリコートは、1以上のアレイ上に独立して配置し、本明細書に記載した遺伝子または染色体変異につき評価できる。
技術
たとえ、胎児DNAまたはRNAが母体および胎児の遺伝物質を含むサンプルの少数の画分中に存在したとしても、TAQMANR PCRのごとき標準SNP検出フォーマットを用いて、胎児のSNP対立遺伝子を検出することは依然として可能である。しかしながら、少数の対立遺伝子を検出するために、母体のシグナル重複が胎児特異的なシグナルを不明瞭にするのを防止するように蛍光検出を最適化することが必要であり得る。いくつかの具体例において、プローブ標識用の最適な蛍光色素を選択して、重複を最小化する。例えば、放射間の10%未満の重複を持つ標準的蛍光スペクトル(400〜700nm)を横切って分離される色素を選択できる。このように、胎児対立遺伝子からの少数のシグナル(10%未満のシグナル強度)でさえ、母体シグナル(90%のシグナル強度)によって不明瞭にされない。いくつかの具体例において、最適な蛍光フィルターを選定して、放射検出中の重複を最小化し、カスタム蛍光検出ハードウェアおよびソフトウェアを選定して、シグナルのクロストークを最小化する。いくつかの具体例において、デジタルPCRを用いて、シグナル−対−バックグラウンドを最適化する。
たとえ、胎児DNAまたはRNAが母体および胎児の遺伝物質を含むサンプルの少数の画分中に存在したとしても、TAQMANR PCRのごとき標準SNP検出フォーマットを用いて、胎児のSNP対立遺伝子を検出することは依然として可能である。しかしながら、少数の対立遺伝子を検出するために、母体のシグナル重複が胎児特異的なシグナルを不明瞭にするのを防止するように蛍光検出を最適化することが必要であり得る。いくつかの具体例において、プローブ標識用の最適な蛍光色素を選択して、重複を最小化する。例えば、放射間の10%未満の重複を持つ標準的蛍光スペクトル(400〜700nm)を横切って分離される色素を選択できる。このように、胎児対立遺伝子からの少数のシグナル(10%未満のシグナル強度)でさえ、母体シグナル(90%のシグナル強度)によって不明瞭にされない。いくつかの具体例において、最適な蛍光フィルターを選定して、放射検出中の重複を最小化し、カスタム蛍光検出ハードウェアおよびソフトウェアを選定して、シグナルのクロストークを最小化する。いくつかの具体例において、デジタルPCRを用いて、シグナル−対−バックグラウンドを最適化する。
対立形質の強度を測定するための他の潜在的なツールはS字曲線適合、および当該技術分野における公知の他の統計解析を含む。いくつかの具体例において、Ctシフトを測定して、遺伝子または染色体の変異を検出する。例えば、TAQMANR化学での胎児のSNPの検出のための単一細胞の封入は、検出されたSNPについての異常なコピー数、従って、対応する染色体のコピー数の同時の検出を可能とできる。SNPが染色体21上に存在すれば、SNP存在比は、Ct値、従って染色体21についてのコピー数と相関するであろう。反応が単一細胞を含むならば、その細胞中の染色体のコピー数はCtシフトによって検出できる。この例において、正常な母体細胞の存在比Ct値の使用は、1個の細胞当たり2つの染色体の正常なコピー数についてのCtを確立し、早期のサイクルに対するCtシフトは、コピー数変異の存在を示すであろう。
本明細書に記載のごとく、配列決定方法を用いて、胎児対立遺伝子につきスクリーニングできるおよび/または遺伝子または染色体の変異の存在を決定できる。いくつかの具体例において、ショットガン配列決定を別法として用いて、例えば、Xie and Tammi, BMC Bioinformatics 2009, 10(80)に記載されるようなコピー数変異(例えば、遺伝的変異に起因する)を検出し得る。いくつかの具体例において、全ゲノム配列決定を行い得る。
また、SNP遺伝子型決定は、qPCRとTAQMANR方法を含めた当該技術分野における公知のいずれの方法を用いても行うことができる。種々のSNP化学およびプラットフォームは、Life Technologies (TAQMANR) (Carlsbad, CA)、Illumina (GOLDENGATER) (San Diego, CA)、Millipore (AMPLIFLUORR) (Billerica, MA)およびDxS Ltd. (SCORPIONSTM) (Manchester UK)のごとき製造者から入手可能である。また、小型化したフォーマットは、BioTrove (OPENARRAYTM) (Woburn, MA) およびFluidigm (BIOMARKTM) (South San Francisco, CA)から入手可能である。
SNPパネル
SNPパネルを用いて、母体の遺伝子サンプル中の標的遺伝子座を同定できる。一旦これらの標的遺伝子座が同定されれば、それらを用いて、混合サンプル中の非母体対立遺伝子の存在を同定する。母体の遺伝子サンプルを遺伝子型決定して、標的遺伝子座を同定することは、高価でかつ時間がかかるため、SNPパネルは、できるだけ少数のSNPを含むように設計される。しかしながら、パネルは、混合サンプル中の胎児対立遺伝子の検出を可能とするために大きく十分な組の標的遺伝子座を同定するのに十分なSNPを依然として含まなければならず、これらのSNPは、胎児および母体細胞の混合物中の有限量の細胞を保存するのに十分に有益である。
SNPパネルを用いて、母体の遺伝子サンプル中の標的遺伝子座を同定できる。一旦これらの標的遺伝子座が同定されれば、それらを用いて、混合サンプル中の非母体対立遺伝子の存在を同定する。母体の遺伝子サンプルを遺伝子型決定して、標的遺伝子座を同定することは、高価でかつ時間がかかるため、SNPパネルは、できるだけ少数のSNPを含むように設計される。しかしながら、パネルは、混合サンプル中の胎児対立遺伝子の検出を可能とするために大きく十分な組の標的遺伝子座を同定するのに十分なSNPを依然として含まなければならず、これらのSNPは、胎児および母体細胞の混合物中の有限量の細胞を保存するのに十分に有益である。
SNPパネルのサイズは、パネル中のSNPの少数の対立遺伝子頻度に反比例する。本発明のいくつかの具体例において、目標は、母体および胎児細胞の混合サンプルからの約1〜約5個の胎児細胞を同定することである。この目標を達成するために評価すべきSNP数は、評価されるSNPの少数の対立遺伝子頻度、および遺伝子型決定される細胞数に依存する。今度は、評価すべき細胞数は、胎児細胞についての混合サンプルの富化の範囲に依存する。
従って、いくつかの具体例において、SNPパネルは、母体サンプルにおいてホモ接合性(または別法として、ヘテロ接合性)であって、母体および胎児の遺伝物質の混合サンプルにおいてヘテロ接合性(または別法として、ホモ接合性)である遺伝子座を同定するのに必要な試験数を最小化するように設計される。いくつかの具体例において、SNPパネルは、染色体特異的SNPパネル当たり約1〜約20個のホモ接合性の母体SNPを同定するように設計される。いくつかの具体例において、SNPパネルは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下のSNP、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲である。好ましい具体例において、SNPパネルは、染色体特異的SNPパネル当たり約5〜約10個のホモ接合性の母体SNPを同定するように設計される。より好ましくは、SNPパネルは、染色体特異的SNPパネル当たり約7個のホモ接合性の母体SNPを同定するように設計される。例えば、p2=0.25の場合にHWE中のSNPについて表2に示されるごとく、20個のSNPのパネルは、母体サンプルがホモ接合性である10個のSNPを同定することが必要とされる。
好ましくは少なくとも1つの対照染色体特異的SNPパネルを含むいくつかの染色体特異的SNPパネルを組み合わせて、母体の遺伝物質を遺伝子型決定するためのSNPパネルを作成できる。各染色体特異的パネルは、その染色体についての標的の組の遺伝子座を生成するように設計される。好ましくは、染色体特異的SNPパネルは、約5〜約100個のユニークなSNPを含む。好ましくは、染色体特異的パネル中のSNPの合計数は、約5〜約30個のユニークなSNPである。より好ましくは、染色体特異的パネル中のSNPの合計数は約20個のSNPである。いくつかの具体例において、染色体特異的パネル中のSNPの合計数は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95もしくは100の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下のSNP、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲である。
SNPパネルは、1以上の染色体特異的パネルを含み得る。染色体特異的SNPパネルは、常染色体染色体に位置したSNP、好ましくは臨床的に関連する症候群における異数性に感受性である染色体に位置したSNPを含むことができる。より好ましくは、染色体特異的SNPパネルは、染色体13、18および21、XおよびYに位置したSNPを含む。また、染色体特異的パネルは、対照の染色体特異的パネルであることができる。好ましくは、対照の染色体特異的パネルは、異数性に感受性ではなく、または異数性が生存能と不適合である場合の染色体に位置したSNPを含み、これは典型的には、より低い指標(例えば、染色体1、2、または3)により示されるより大きな染色体である。最も好ましくは、対照の染色体特異的パネルは、染色体1、2、または3に位置したSNPを含む。加えて、また、染色体特異的SNPパネルは、性特異的染色体に位置したSNPを含むことができる。いくつかの具体例において、パネルは特定の染色体に特異的ではない。いくつかの具体例において、対照は、染色体特異的SNPパネルではない。例えば、プライマーを用いて、対照として機能する染色体特異的領域を増幅できる。
いくつかの具体例において、SNPパネルは、染色体特異的パネルが、染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、XまたはY上のSNPについてのものである場合の1を超える染色体特異的パネルを含む。いくつかの具体例において、SNPパネルは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23個の染色体特異的パネル、あるいは前記の値のいずれかの2つによって規定される範囲を含む。いくつかの具体例において、パネル中のSNPの合計数は、染色体特異的パネル上のSNP数Nであり、ここに、Nは、SNPパネル中の染色体特異的パネル数である。
いくつかの因子は、遺伝子型決定パネルについての遺伝子座の選択において考慮できる。例えば、ハーディ−ヴァインベルク平衡(「HWE」)は、SNP対立遺伝子頻度の可能性を計算するとみなすことができる。いくつかの具体例において、選択されたSNP中の対立遺伝子の可能性は、以下の式:p2+2pq+q2=1により得られる。例えば、0.5のヘテロ接合性を持つSNPを選択できる。HWEにないSNPは遺伝的なSNPではないようであり、それらの有用性を制限し、または不完全な遺伝子型決定化学に起因し得るので、HWEが好ましい。
また、主要な公知のハプロタイプを横切るホモ接合性に支持される1つの対立遺伝子を持ったSNPを選択できる。いくつかの具体例において、0.25未満のホモ接合性の母体遺伝子型(ppまたはqq)および0.25を超える反対のホモ接合性遺伝子型を持ったSNPが選択される。
いくつかの具体例において、SNPは、すべての主要な集団群を横切って測定された少数の対立遺伝子につき約30%〜約50%の範囲の頻度を有する。好ましい具体例において、SNPは少数の対立遺伝子につき約49%〜約50%の範囲の頻度を有する。いくつかの具体例において、SNPは、少数の対立遺伝子につき30%、31% 32% 33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%もしくは50%の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下、あるいは前記の値のいずれか2つにより規定される範囲である頻度を有する。
本発明の具体例
本発明の1つの具体例は、胎児対立遺伝子を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得;胎児細胞につきサンプルを富化し;富化したサンプルをサブサンプルに分割し;サブサンプルに対し全ゲノム増幅を行い、増幅されたゲノム生成物を供し;増幅されたゲノム生成物をアリコートに分割し;母体細胞の遺伝物質が少数の対立遺伝子にホモ接合性である標的遺伝子座を同定し;標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択し;試験遺伝子座にて、非母体対立遺伝子(ヘテロ接合性遺伝子型)につきアリコートをスクリーニングし、ここに、非母体対立遺伝子(ヘテロ接合性遺伝子型)の存在は、増幅されたゲノム生成物中の胎児対立遺伝子の存在を示し;次いで、少なくとも1つの胎児対立遺伝子を同定することを含む。
本発明の1つの具体例は、胎児対立遺伝子を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得;胎児細胞につきサンプルを富化し;富化したサンプルをサブサンプルに分割し;サブサンプルに対し全ゲノム増幅を行い、増幅されたゲノム生成物を供し;増幅されたゲノム生成物をアリコートに分割し;母体細胞の遺伝物質が少数の対立遺伝子にホモ接合性である標的遺伝子座を同定し;標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択し;試験遺伝子座にて、非母体対立遺伝子(ヘテロ接合性遺伝子型)につきアリコートをスクリーニングし、ここに、非母体対立遺伝子(ヘテロ接合性遺伝子型)の存在は、増幅されたゲノム生成物中の胎児対立遺伝子の存在を示し;次いで、少なくとも1つの胎児対立遺伝子を同定することを含む。
本発明のもう一つの具体例は、胎児遺伝的変異を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得;胎児細胞につきサンプルを富化し;富化したサンプルをサブサンプルに分割し、各サブサンプルは1個以下の細胞を含み;母体細胞の遺伝物質が少数の対立遺伝子にホモ接合性である少なくとも1つの遺伝子座のパネルを同定し;標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択し;パネルから選択された試験遺伝子座にて非母体対立遺伝子(ヘテロ接合性遺伝子型)につきサブサンプルをスクリーニングし、ここに、非母体対立遺伝子(ヘテロ接合性遺伝子型)の存在は、サブサンプル中の胎児対立遺伝子の存在を示し;次いで、少なくとも1つの胎児対立遺伝子を同定し;次いで、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中の母系および父系遺伝した対立遺伝子の比を決定し、ここに、その比を分析して、遺伝的変異の存在を決定することを含む母体および胎児細胞の混合サンプル中の胎児対立遺伝子を同定する方法を含む。
本発明のもう一つの具体例は、胎児対立遺伝子を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得;サンプルをサブサンプルに分割し;サブサンプルに対して前増幅を行い、増幅生成物を供し;増幅生成物をアリコートに分割し;標的遺伝子座を選択し、母体細胞の遺伝物質が1組の標的遺伝子座にてホモ接合性またはヘテロ接合性であるかどうかを決定して、母体の遺伝子型を決定し;標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択し;試験遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型についてのアリコートをスクリーニングし、ここに、母体の遺伝子型と異なる遺伝子型の存在は、増幅生成物中の胎児対立遺伝子の存在を示し;次いで、少なくとも1つの胎児対立遺伝子を同定することを含む。
本発明のもう一つの具体例は、胎児対立遺伝子を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得;サンプルをサブサンプルに分割し;少なくとも1つの標的遺伝子座のパネルを同定し、母体細胞の遺伝物質が少なくとも1つの標的遺伝子座にホモ接合性であるかまたはヘテロ接合であるかを決定して、母体の遺伝子型を決定し;少なくとも1つの標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択し;パネルから選択された試験遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につきサブサンプルをスクリーニングし、ここに、母体の遺伝子型と異なる遺伝子型の存在は、サブサンプル中の胎児対立遺伝子の存在を示し;次いで、少なくとも1つの胎児対立遺伝子を同定することを含む。
本発明の具体例は、以下の1以上を含むことができ、また、含み得る:さらに、胎児細胞につきサンプルを富化することを含む方法;富化することが母体細胞を超える胎児細胞の差動増殖を含む方法;さらに、胎児対立遺伝子を含むと同定された、増幅生成物を分析して、胎児遺伝的変異を検出することを含む方法;胎児遺伝的変異が、異数性、微小欠失、微小重複および突然変異または他の遺伝的変異よりなる群から選択される方法;さらに、胎児対立遺伝子を含むと同定された、増幅生成物を分析して、モザイク現象の存在を検出する含む方法;さらに、胎児対立遺伝子を含むと同定された、増幅生成物を分析して、二卵性双胎の存在を検出することを含む方法;前増幅が全ゲノム増幅または全トランスクリプトーム増幅を含む方法;標的遺伝子座が母体の遺伝子型にホモ接合性である方法;標的遺伝子座が母体の遺伝子型にヘテロ接合性である方法;標的遺伝子座が母体の遺伝子型にホモ接合性およびヘテロ接合性の遺伝子座の混合物を含む方法;増幅生成物がゲノムDNAを含む方法;増幅生成物が相補的DNAを含む方法;母体の遺伝子型を決定することが、SNPのパネルを用いて、母体細胞の源であるのと同一個体からの母体の遺伝物質のサンプルを遺伝子型決定することを含む方法;母体の遺伝物質の源が、血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブおよび頬側スワブよりなる群から選択される方法;母体の遺伝物質の源が血液および頬側スワブよりなる群から選択される方法;試験遺伝子座の選択が、標的遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき母体および胎児無細胞核酸のサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定し、次いで、無細胞核酸のサンプル中の非母体の遺伝子型を用いて、試験遺伝子座として標的遺伝子座を選択することを含む方法;非母体の遺伝子型がホモ接合性である方法;非母体の遺伝子型がヘテロ接合性である方法;母体および胎児の無細胞核酸サンプル源が、妊婦からの血液、血清、血漿、尿または子宮頚部スワブである方法;単一アリコート中の1を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングすることを含む方法;1を超えるアリコート中の1を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングすることを含む方法;単一のアリコート中の1つの試験遺伝子座を選択およびスクリーニングすることを含む方法;1を超えるアリコート中の1つの試験遺伝子座を選択およびスクリーニングすることを含む方法;各サブサンプルが1個以下の細胞を含む方法;さらに、スクリーニングに先立ち2以上のアリコートの群を貯蔵することを含む方法;貯蔵がアリコートを含むウェルの行および列のインデックスシステムの使用を含む方法;行および列の数が独立して約2〜約1000である方法;行および列の数が独立して約8〜約100である方法;行および列の数が独立して約16〜約24である方法;少なくとも1つの標的遺伝子座が母体の遺伝子型にホモ接合性である方法;少なくとも1つの標的遺伝子座が母体の遺伝子型にヘテロ接合性である方法;パネルがホモ接合性およびヘテロ接合性の標的遺伝子座の混合物を含む方法;さらに、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中のシグナル強度を決定することを含み、ここに、シグナル強度を分析して、遺伝的変異の存在を決定する方法;さらに、母体対立遺伝子を含むサブサンプルと比較した、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中の染色体の配列の過剰提示または提示不足を決定することを含み、ここに、この過剰提示または提示不足を用いて、染色体の異数性、微小欠失または微小重複の存在を決定する方法;さらに、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中のシグナル強度を決定することを含み、ここに、シグナル強度を分析して、モザイク現象の存在を決定する方法;さらに、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中の対立遺伝子のコピー数を決定することを含み、ここに、対立遺伝子のコピー数を分析して、モザイク現象の存在を決定する方法;さらに、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中の対立遺伝子のコピー数を決定することを含み、ここに、対立遺伝子のコピー数を分析して、遺伝的変異の存在を決定する方法;母体の遺伝子型を決定することが、SNPのパネルを用いて、母体細胞の源である同一個体からの母体の遺伝物質のサンプルを遺伝子型決定することを含む方法;標的遺伝子座がホモ接合性であって、試験遺伝子座がヘテロ接合性である方法;標的遺伝子座がヘテロ接合であって、試験遺伝子座がホモ接合性である方法;パネルがホモ接合性およびヘテロ接合性の標的遺伝子座の混合物を含む方法;SNPのパネルが本明細書に記載されたSNPのパネルである方法;およびパネルが少なくとも5つの遺伝子座のパネルである方法。
本発明のもう一つの具体例は、有益な父性対立遺伝子を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得;所望により、胎児細胞につきサンプルを富化し;サンプルまたは富化したサンプルをサブサンプルに分割し;所望により、増幅生成物をアリコートに分割し;所望により、1組の標的遺伝子座を選択し;母体細胞の遺伝物質が1組の標的遺伝子座にてホモ接合性またはヘテロ接合であるかを決定して、母体の遺伝子型を決定し;所望により、標的遺伝子座の組から試験遺伝子座の選択し、ここに、所望により、選択は、標的遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき混合された母体および胎児核酸のサンプルをスクリーニングし、次いで、混合された母体および胎児核酸のサンプル中の非母体の遺伝子型で試験遺伝子座として、標的遺伝子座を選択することを含む;有益な父性対立遺伝子の存在につきアリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定し、ここに、所望により、スクリーニングは、少なくとも1つの標的または試験遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につきアリコートをスクリーニングすることを含み、母体の遺伝子型と異なる遺伝子型の存在は、アリコート中の有益な父性対立遺伝子の存在を示す;および少なくとも1つのアリコート中の少なくとも1つの有益な父性対立遺伝子の存在を同定することを含む。いくつかの具体例において、方法は、所望により有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートの一部分を収集し;次いで、有益な父性対立遺伝子を含むと同定された増幅生成物のアリコートまたは収集部分を分析して、遺伝的変異を検出することを含む。
本発明のいくつかの具体例は、染色体特異的パネルが染色体13、18および21、XおよびYよりなる群から選択される異数性に付された染色体対象に指向されるSNPパネル;および、さらに染色体1、2および3よりなる群から選択される対照染色体に指向される対照染色体特異的パネルを含むSNPパネルを含む。
前記に引用された優先権書類の少なくとも1つに用いたスクリーニングなる用語は、本明細書に記載されたスクリーニングおよび遺伝子型決定の方法を包含する。加えて、前記に引用された優先権書類の少なくとも1つに用いたホモ接合性およびヘテロ接合性の対立遺伝子なる用語とは、時々、本明細書中では、ヘテロ接合もしくはホモ接合性の遺伝子座または遺伝子座群、あるいはヘテロ接合性もしくはホモ接合性遺伝子型をいう。さらに、前記で引用された優先権書類の少なくとも1つに用いた前増幅なる用語とは、本明細書中ではサブサンプル増幅をいう。
本発明の精神から逸脱することなく、多数でかつ種々の変更をなすことができることは、当業者により理解されるであろう。本明細書に引用されたすべての参考文献を、記載された主題につき、その全てをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。以下の実施例は、例示目的だけに含まれ、本発明の範囲を限定することは意図されない。
実施例
実施例1 本発明の具体例の以下の実施例は、胎児サンプルのPCRに基づく検出に続く、WGAを含む。所望により母体および胎児細胞の富化した混合物である細胞をPBSのごとき緩衝液中に懸濁し、細胞溶解およびPCRに適当な化学を持った第2の緩衝液に分配させる。次いで、PCR適合性緩衝液中の細胞を、例えば、オイルプラグの導入により個々の反応に分配して、溶解およびPCR緩衝液に個々の細胞の油分離を創製する。本方法は、単一工程の細胞溶解を実行する化学、および封入後の試薬の添加なくして、標的核酸の増幅を好ましくは用いる。本方法は、好ましくは、DNA増幅に先立つDNA精製を含まない。次いで、名目上の単一細胞反応を熱サイクリング中または最終サイクルの終了にてのいずれかの胎児特異的蛍光プローブ検出、および胎児細胞を含むすべての成分(すなわち、1以上)の検出で、加熱および冷却の熱サイクリングに付される。好ましい場合において、1つの反応当たり1個の細胞を得るが、1個の胎児細胞および数個〜多数の母体細胞よりなる反応は、依然として、正確に胎児細胞の存在または不存在を同定するであろう。引き続いてのゲノム分析が等価な混入(すなわち、1つの胎児細胞および2つの母体細胞は、33%の純粋な胎児DNAを意味する)を許容する限り、1つの反応当たり1を超える細胞を許容可能である。ポジティブな各区画は、単一の共有容器に所望により貯蔵する。この貯蔵した胎児特異的な反応は、RNAおよびタンパク質の除去のごときDNA精製手順に付す。所望の精製後、核酸をいずれかの適合性化学を用いるWGAに付す。WGAのための方法は、以下のいずれかを含む:縮重オリゴヌクレオチドプライムポリメラーゼ連鎖反応(「DOP−PCR」)、連結媒介PCR(「LM−PCR」)、Φ−29ポリメラーゼでの鎖置換増幅(「SDA」)、または他の組合せプロトコール(Rubicon GenomicsまたはNuGen)。WGAに続いて、得られた増幅ゲノムDNAを遺伝子分析、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーションまたは全ゲノム配列決定(「CGH」)に用いる。BAC配列またはオリゴ配列を含めてCGHに用いられる多数の方法がある。また、標準キャピラリーに基づくサンガー配列決定を含めた配列決定、およびSolexa/Illumina (San Diego, CA)、Complete Genomics (Mountain View, CA)、Roche/454 (Branford, CT)および Life Technologies (SOLiDTM) (Carlsbad, CA)を含めた現在の「次世代」高処理配列決定プラットフォームについての種々の方法がある。
実施例1 本発明の具体例の以下の実施例は、胎児サンプルのPCRに基づく検出に続く、WGAを含む。所望により母体および胎児細胞の富化した混合物である細胞をPBSのごとき緩衝液中に懸濁し、細胞溶解およびPCRに適当な化学を持った第2の緩衝液に分配させる。次いで、PCR適合性緩衝液中の細胞を、例えば、オイルプラグの導入により個々の反応に分配して、溶解およびPCR緩衝液に個々の細胞の油分離を創製する。本方法は、単一工程の細胞溶解を実行する化学、および封入後の試薬の添加なくして、標的核酸の増幅を好ましくは用いる。本方法は、好ましくは、DNA増幅に先立つDNA精製を含まない。次いで、名目上の単一細胞反応を熱サイクリング中または最終サイクルの終了にてのいずれかの胎児特異的蛍光プローブ検出、および胎児細胞を含むすべての成分(すなわち、1以上)の検出で、加熱および冷却の熱サイクリングに付される。好ましい場合において、1つの反応当たり1個の細胞を得るが、1個の胎児細胞および数個〜多数の母体細胞よりなる反応は、依然として、正確に胎児細胞の存在または不存在を同定するであろう。引き続いてのゲノム分析が等価な混入(すなわち、1つの胎児細胞および2つの母体細胞は、33%の純粋な胎児DNAを意味する)を許容する限り、1つの反応当たり1を超える細胞を許容可能である。ポジティブな各区画は、単一の共有容器に所望により貯蔵する。この貯蔵した胎児特異的な反応は、RNAおよびタンパク質の除去のごときDNA精製手順に付す。所望の精製後、核酸をいずれかの適合性化学を用いるWGAに付す。WGAのための方法は、以下のいずれかを含む:縮重オリゴヌクレオチドプライムポリメラーゼ連鎖反応(「DOP−PCR」)、連結媒介PCR(「LM−PCR」)、Φ−29ポリメラーゼでの鎖置換増幅(「SDA」)、または他の組合せプロトコール(Rubicon GenomicsまたはNuGen)。WGAに続いて、得られた増幅ゲノムDNAを遺伝子分析、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーションまたは全ゲノム配列決定(「CGH」)に用いる。BAC配列またはオリゴ配列を含めてCGHに用いられる多数の方法がある。また、標準キャピラリーに基づくサンガー配列決定を含めた配列決定、およびSolexa/Illumina (San Diego, CA)、Complete Genomics (Mountain View, CA)、Roche/454 (Branford, CT)および Life Technologies (SOLiDTM) (Carlsbad, CA)を含めた現在の「次世代」高処理配列決定プラットフォームについての種々の方法がある。
実施例2 細胞からの胎児DNAの検出についての本発明の具体例の以下の実施例は、区別される反応チャンバーへの細胞の単離に続いてのWGA、次いで、PCR胎児対立遺伝子検出のための複数アリコートへの各反応の分離、次いで、遺伝子分析、例えば、CGHまたは配列決定のための胎児陽性反応の所望によるコンジュゲートアリコートの貯蔵を含む。所望により胎児および母体細胞の富化した混合物である細胞を細胞溶解およびWGAに適当な緩衝液および試薬を含有する単離された反応チャンバーに分配する。これは、複数段階の試薬添加を可能とするアクセスを含む毛細管またはプレート形式で水相および油相を交互にすることにおいてできる。プレート形式において、細胞を最初に200μl中の約100,000個の細胞として再懸濁し、96ウェルプレートのウェルに入れる。次いで、TECAN(Mannedorf, Switzerland)、LabCyte(Sunnyvale, CA)または他のものより提供されるもののごとき標準的なマイクロピペット技術を用いて、平均1、2、3、4または5個の細胞を含有する10nLの細胞懸濁液を、例えば、1,536または3,456ウェルを含む高密度プレートに移す。標準WGA化学を用いる。例えば、各10nLの細胞体積に、90nLのWGA用試薬を添加し、プレートを油によって密閉して、蒸発を防止し、WGA化学を進行させる。WGA後に、反応中にすべての細胞からの増幅された多数のコピーのゲノムを含有する25μlまでを第2の高密度プレートに移す。次いで、反応を含む胎児DNAを同定するためのプライマーおよびプローブを含有する、100nLまでのPCR試薬のアリコートを本明細書に開示されるごときSNPパネルからの標的遺伝子座を用いてスクリーニングする。所望により、貯蔵後に、CGHハイブリダイゼーションまたは配列決定を含めて、下流ゲノム解析のために、胎児DNAに陽性である反応を用いる。その反応は、CGHハイブリダイゼーションまたは配列決定に先立ち精製手順に付す。
実施例3 本発明の具体例の以下の実施例において、染色体21に位置したSNPをパネルにつき選択する。ハーディ−ヴァインベルク平衡(「HWE」)は、対立遺伝子頻度の可能性を計算するとみなされる。1つの対立遺伝子は主要な公知のハプロタイプを横切るホモ接合性において支持される。母体の遺伝子型は、0.25未満のホモ接合性(ppまたはqq)であって、反対のホモ接合性遺伝子型は0.25を超え、対立遺伝子の可能性は、以下の式:p2+2pq+q2=1により与えられる。SNPはメンデルの法則の様式で遺伝する。
実施例4 本発明の具体例の以下の実施例において、提案されたパネルは、HWEにてSNPを選択することを含み、ここに、p2およびq2の比は0.25であって、ヘテロ接合性は0.5である。これらの比を用いて、ホモ接合性の母体SNPを見出すには、母体サンプルがホモ接合性である10個のSNP(20×(0.25+0.25))を見出すために20個のSNPだけを統計的に必要とする。所与のいずれのホモ接合性SNPについても、胎児を含む集団は、0.5のヘテロ接合性である可能性を有するであろう。第1の母体のホモ接合性SNPについては、胎児のヘテロ接合性の可能性は、合計の可能性が0.5のために0.5である。第1および第2の母体のホモ接合性SNPについて、組み合わせた可能性は、1−(0.5×0.5)=0.75である。7つのSNPの組み合わせた可能性は、0.992である。
実施例5 以下の実施例は、本発明の具体例である。妊婦は14週間の在胎期間を示す。胎児が21番染色体トリソミーを有するかを検出するために、医師は、静脈穿刺および頬側スワブによって、各々、妊婦から30mL血液サンプルおよび上皮細胞を得る。
SNPのパネルを設計する。染色体1および21の各々20個のSNP(すなわち、40個の標的遺伝子座)をパネルにつき選択し、各SNPは、すべての主要な集団を横切って49%の小数の対立遺伝子頻度を有する。母体DNAを頬側スワブから抽出し、SNPパネルを用いて遺伝子型決定する。そのパネルからの20個のSNPはホモ接合性遺伝子型(すなわち、標的遺伝子座)を生成し、次いで、血液サンプルからの母体および胎児細胞の混合物中でさらに遺伝子型決定するために選択する。
血液サンプルは、FICOLLTM([位置])に続いて、Miltenyi磁気ビーズ(Gladbach, Germany)に付すことにより、1:10,000の胎児:母体細胞まで富化する。その富化した血液サンプルを、溶解緩衝液およびPCR試薬を含有する溶液に懸濁する。次いで、サンプルをオイルプラグと組合せ、サンプルが各々1個以下の細胞を含むサブサンプルに分割されるように、マイクロ流体装置に導入する。一旦、マイクロ流体装置内部に入ると、サブサンプルは後記のごとく、単一工程細胞溶解に続いてPCR増幅を受ける。
計算を行って、1:10,000の胎児:母体細胞の濃度では、49%の小数の対立遺伝子頻度を持つSNPにつき、約5個のヘテロ接合性遺伝子座を検出するために、50,000個の細胞をスクリーニングしなければならないことを決定する。
第1の組の50,000個のサブサンプル(従って、50,000個の細胞)を、TAQMANRシステムでの多重qPCRを用いて、染色体1および21の各々(すなわち、2つの遺伝子座の合計)に対する第1のSNPにつき、各サブサンプル単位で(従って、各細胞単位で)スクリーニングする。ヘテロ接合性遺伝子型は染色体1または21上のいずれのSNPについても同定されない。次いで、第2の組の50,000個のサブサンプルを、染色体1および21の各々に対する第2のSNPにつき各サブサンプル単位でスクリーニングする。染色体1上のSNPはヘテロ接合性であり(胎児対立遺伝子の存在を示す)、一方、染色体21上のSNPはホモ接合性である。次いで、第3の組の50,000個のサブサンプルを染色体1および21の各々に対して第3のSNPにつき各サブサンプル単位でスクリーニングする。今回は、染色体21上のSNPはヘテロ接合性であり、さらなる遺伝子型決定を行わない。
次いで、染色体21上の第3のSNPからの対立遺伝子の比を分析して、異数性の存在を検出する。母体由来の対立遺伝子(C)の父系由来の対立遺伝子(G)と比較した対立遺伝子の強度が、2:1(すなわち、CCG)であるために、21番染色体トリソミーを検出する。
実施例6 以下の実施例は、本発明の具体例である。胎児および成人の細胞は、胎児細胞の差動増殖に対するそれらの効果を評価するために、異なる因子の存在下で増殖させた。その因子は、50ng/mLの幹細胞刺激因子、5ng/nLのIL−3、5ng/mLのIL−6、1.5LVmLのEPO、100ng/mLのTPOおよび50ng/mLのFlt−3であった。細胞は、成人の動員ドナー末梢血から精製したCD34+陽性細胞、およびCambrex(Walkersville, MD)から購入した胎児の肝臓組織から精製したCD34+陽性細胞であった。細胞は、24ウェル組織培養プレートに1mL当たり10,000個の細胞で蒔いた。細胞は、湿潤チャンバー中の37℃、5%CO2にて6日間、50単位/mLのペニシリン、50μg/mLの硫酸ストレプトマイシンおよび前記のサイトカインの組合せを含むHPGM培地中で培養した。6日後に、細胞のアリコートを、血球計でマニュアルで計数し、合計細胞数を標準式を用いて計算した。さらなるアリコートを用い、VIALIGHTRアッセイキット(Cambrex, Walkersville, MD) を用いて、合計ATPレベル(合計細胞数との線形相関)をアッセイした。
測定されたすべての場合に、胎児細胞は成人細胞を超えて増殖させた(例えば、表4からの第4カラムを第7カラムと比較されたし)。表4の最終カラムは、いくらかの増殖条件についての胎児細胞−対−成人細胞の比を示す。比を測定したすべての場合に、胎児細胞は増殖後に、より多数であった。
実施例7 細胞からの胎児DNAの検出のための本発明の具体例の以下の実施例は、区別される反応チャンバーへの細胞の単離に続いてのWGA、および遺伝的変異の直接的検出を含む。所望により胎児および母体細胞の富化した混合物である細胞は、細胞溶解およびWGA用の適当な緩衝液および試薬を含有する単離された反応チャンバーに分配する。プレート様式において、細胞を200μl中の100,000個の細胞として最初に再懸濁し、96ウェルプレートのウェルに入れる。次いで、TECAN (Mannedorf, Switzerland)、LabCyte(Sunnyvale, CA)または他のものにより提供されたもののごとき標準マイクロピペット技術を用いて、平均1、2、3、4または5個の細胞を含有する10nLの細胞懸濁液を、例えば、1,536または3,456ウェルを含む高密度プレートに移す。標準的WGA化学を用いる。例えば、細胞体積の各10nLに、90nLのWGA用試薬を添加し、プレートは蒸発を防止するために油により密閉し、WGA化学を進行させる。WGA後に、胎児のDNA含有反応を同定するためのプライマーおよびプローブを含有するPCR試薬を添加して、本明細書に開示されたSNPパネルからの標的遺伝子座を増幅する。胎児DNAに陽性である反応を反応チャンバー中で捕捉プローブを用いて、直接的に検出する。標的ハイブリダイゼーション後に、ウェルを洗浄して、非標的DNAおよび未反応試薬を除去する。次いで、特異的にハイブリダイズした生成物を分子ビーコンのごとき標準化学を用いて検出する。次いで、胎児および母体配列の比を用いて、遺伝的変異を決定できる。
実施例8 以下の実施例は、本発明の具体例である。40mlの血液を妊婦から採取し、標準的な抗凝血剤(例えば、EDTA)と組み合せ、次いで、処理位置に輸送する。12mlの血漿を血液から取り出し、無細胞DNAを抽出する。全血またはPBMCのアリコートを母体の遺伝子型決定のために取り出す。
勾配富化は赤血球細胞溶解を含めた赤血球除去のために行う。磁気活性化細胞選別(MACS)を用いて、約500,000個未満の合計細胞の収率まで母体細胞を枯渇させる。細胞選別を用いて、約10,000個の細胞の合計収率のために胎児画分を富化する。細胞を適当な体積中の1反応当たりλ=約1個の細胞まで分割する。細胞を直接的に溶解し、恐らく中和溶液の添加を用いて、PCR適合溶液を創製する。WGA試薬を100nLの合計の反応体積につき各反応に添加する。WGAは、DNAの約10〜10,000の合計のゲノム等価物の合計につき進行させる(反応は最初に1つのゲノム等価物を含んだ)。WGA反応を停止させ、すべての反応を少なくとも1つの位置にてインデックスを付したアリコートに分割する。PCRをすべてのアリコートに対して行ない、(例えば、全血またはPBMCのアリコートを用いて得た遺伝子型に比較することにより)非母体対立遺伝子を検出する。非母体対立遺伝子を含有するWGA物質の元来の位置を同定し、これらの位置での体積を回収する。次いで、これらの体積を最終WGAにつき貯蔵して、aCGHに適するDNA量(例えば、約0.5〜1μg)を生成する。次いで、aCGHを行い、CNVを検出する。
Claims (38)
- 母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得;
該サンプルをサブサンプルに分割し;
胎児識別子の存在につき、サブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定し;次いで
少なくとも1つのサブサンプル中の胎児細胞からの少なくとも1つの該胎児識別子の存在を同定することを含むことを特徴とする胎児識別子の検出方法。 - さらに、少なくとも1つの該サブサンプルに対してサブサンプル増幅を行い、増幅生成物を供することを含むことを特徴とする請求項1記載の方法。
- さらに、該増幅生成物をアリコートに分割することを含み、
ここに、少なくとも1つの該胎児識別子の存在についてのサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、胎児識別子の存在につきアリコートをスクリーニングまたは遺伝子型決定することを特徴とする請求項2記載の方法。 - 該サブサンプル増幅が、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、標的核酸増幅、胎児識別子以外の核酸配列の増幅、核酸配列用の代理の生成および細胞***よりなる群から選択される方法を含むことを特徴とする請求項3記載の方法。
- 該サブサンプル増幅が、標的核酸増幅、胎児識別子以外の核酸配列の増幅、核酸配列用の代理の生成および細胞***を含むことを特徴とする請求項3記載の方法。
- さらに、該母体細胞の遺伝物質が、1組の標的遺伝子座にてホモ接合性またはヘテロ接合性であるかを決定して、母体の遺伝子型を決定することを含み、ここに、胎児識別子についてのアリコートもしくはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、少なくとも1つの標的遺伝子座にて該母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき該アリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含み、該母体の遺伝子型と異なる該遺伝子型の存在は、該増幅生成物中の有益な父性対立遺伝子の存在を示し、少なくとも1つの該胎児識別子の存在の同定は、少なくとも1つのアリコートもしくはサブサンプル中の有益な父性対立遺伝子を同定することを含むことを特徴とする請求項1または4記載の方法。
- さらに、該母体細胞の遺伝物質がホモ接合性またはヘテロ接合性であるかを決定するのに先立ち、該標的遺伝子座を選択することを含むことを特徴とする請求項6記載の方法。
- さらに、該標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択することを含み、ここに、該スクリーニングまたは遺伝子型決定は、該試験遺伝子座にて該母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき、アリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含むことを特徴とする請求項7記載の方法。
- 該試験遺伝子座の該選択が、標的遺伝子座にて該母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき、混合された母体および胎児核酸のサンプルをスクリーニングし、次いで、該試験遺伝子座として、混合された母体および胎児核酸の該サンプル中の非母体の遺伝子型で標的遺伝子座を選択することを含むことを特徴とする請求項8記載の方法。
- さらに、該有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルを分析して、遺伝的変異を検出することを含むことを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- さらに、該有益な父性対立遺伝子を含むと同定された該アリコートもしくはサブサンプルの一部分を収集することを含み、
ここに、該有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルを分析して遺伝的変異を検出することは、該アリコートもしくはサブサンプルの収集部分を分析することを含むことを特徴とする請求項10記載の方法。 - 該収集部分が、該アリコートもしくはサブサンプルの均質部分であることを特徴とする請求項11記載の方法。
- 該収集部分が、該アリコートもしくはサブサンプルの非均質部分であることを特徴とする請求項11記載の方法。
- さらに、少なくとも2つのサブサンプルからの該有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートを収集し、次いで、該増幅生成物を分析するに先立ち該アリコートを組み合わせることを含むことを特徴とする請求項10記載の方法。
- 該遺伝的変異が、染色体再編成、コピー数変異および多形性よりなる群から選択される胎児遺伝的変異であることを特徴とする請求項10記載の方法。
- 該分析が、該有益な父性対立遺伝子を含むアリコート中の母系および父系遺伝した対立遺伝子の比を決定することを含み、ここに、該比を分析して、遺伝的変異の存在を決定することを特徴とする請求項10記載の方法。
- 該分析が、該有益な父性対立遺伝子を含むアリコート中の対立遺伝子のコピー数を決定することを含み、ここに、対立遺伝子の該コピー数を分析して遺伝的変異の存在を決定することを特徴とする請求項10記載の方法。
- さらに、少なくとも2つの該サブサンプルからの該有益な父性対立遺伝子を含むと同定された増幅生成物を分析して、モザイク現象または二卵性双胎の存在を検出することを含むことを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- 分析されたアリコートが、該胎児識別子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたアリコートではないが、該胎児識別子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたアリコートと同一のサブサンプルからのものであることを特徴とする請求項10〜18のいずれか1記載の方法。
- 該標的遺伝子座がすべて、該母体の遺伝子型にホモ接合性であるか、または該母体の遺伝子型にヘテロ接合性であるか、または該母体の遺伝子型にホモ接合性およびヘテロ接合性遺伝子座の混合物を含むことを特徴とする請求項6記載の方法。
- 標的遺伝子座がすべて、該母体の遺伝子型にホモ接合性であることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 該増幅生成物がゲノムDNAまたは相補的DNAを含むことを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- 母体の遺伝子型の該決定が、SNPのパネルを用いて、該母体細胞の源である同一の個体からの母体の遺伝物質のサンプルを遺伝子型決定することを含むことを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- 該母体の遺伝物質の源が、血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、涙、唾液、頬側スワブおよび皮膚よりなる群から選択されることを特徴とする請求項23記載の方法。
- 該母体の遺伝物質の源が、血液および頬側スワブよりなる群から選択されることを特徴とする請求項23記載の方法。
- 母体および胎児核酸の該混合物が、無細胞核酸の混合物であることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 該母体および胎児の無細胞核酸サンプル源が、妊婦からの血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄またはダグラス窩穿刺であることを特徴とする請求項26記載の方法。
- 単一のアリコートもしくはサブサンプル中の1を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定するか、あるいは1を超えるアリコートもしくはサブサンプル中の1を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子決定するか、あるいは1を超えるアリコートもしくはサブサンプル中の1つの試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含むことを特徴とする請求項8または9記載の方法。
- 第1のアリコートもしくはサブサンプル中の有益な父性対立遺伝子の同定後に、少なくとも第2のサブサンプル中の第2の標的遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含むことを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- 該サンプルを分割して、細胞のポアソンまたは非ポアソン分布を持つサブサンプルを生成することを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- 該サブサンプルの各々が、1個以下の細胞を含むことを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- さらに、該スクリーニングまたは遺伝子型決定に先立ち、2個以上のサブサンプルからのアリコートを貯蔵することを含むことを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- 該貯蔵が、該アリコートを含むウェルの行および列のインデックスシステムの使用を含むことを特徴とする請求項32記載の方法。
- さらに、サブサンプルへの該分割に先立ち、該胎児細胞につき該サンプルを富化することを含むことを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- 該富化が、該母体細胞を超える該胎児細胞の差動増殖を含むことを特徴とする請求項34記載の方法。
- 該増幅生成物の均質部分が、該アリコートに分割されることを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- 該増幅生成物の非均質部分が、該アリコートに分割されることを特徴とする請求項6または9記載の方法。
- 単一染色体に特異的な約20〜約100個のユニークなSNPを含む少なくとも1つの染色体特異的パネルを含む、胎児対立遺伝子を検出するための一塩基多型(SNP)パネルであり、ここに、該SNPの各々は、すべての主要な集団群を横切って測定された約30%〜約50%の範囲の頻度を有し;該SNPの各々は、ハーディ−ヴァインベルク平衡にあって;SNPパネル中のSNPの合計数は、約5〜約100個のSNPであることを特徴とする該SNPパネル。
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