JP2015517317A - 双子の類型を鑑定する方法とシステム - Google Patents

双子の類型を鑑定する方法とシステム Download PDF

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Abstract

双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法とシステムを提供する。そのうち、双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法は、双子胎児の少なくとも一つの多型部位に対しタイピングを行うことで、胎児の多様型を獲得するステップと、前記胎児の多様型を両親の対応する多型部位と比較するステップと、比較した結果に基づき、前記双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定するステップを含む。

Description

本発明は生物医学分野に関する。具体的には、本発明は双子の類型を鑑定する方法とシステムに関し、より具体的に、本発明は双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法とシステムに関する。
通常、正常な女性は一回の***で一つの卵子を排出し、正常に受精した後一つの胚胎に発育される。しかし、時には単一受精卵は不明な原因で二つに分離されると同時に、独立に発育して二つの胚胎になり、即ち双子となる。このような単一受精卵から発育されてきた双子は同様な遺伝背景を有しているため、性別、顔立ち等は全く同じで、もし、その中の一つの胎児が遺伝性疾患を有している場合、もう一つの胎児も必ず同様な情況にある。通常、一卵性双生児は異なる分離時間により、その胎盤は一絨毛膜一羊膜性、一絨毛膜二羊膜性及び二絨毛膜二羊膜性の可能性がある。時に、女性は一回の***で一つ以上の卵子を排出し、もし、同時に排出された二つの卵子が全て正常に受精且つ胚胎に発育されれば、即ち、二卵性双生児になる。二卵性双生児はメンデルの移転法則に従って両親のゲノムをランダム的に受け継ぐため、所持する遺伝子の類型も完全に同じでないことから、異なる性別及び顔立ちを有する可能性があり、遺伝性疾患を所持する情況も異なる可能性がある。全世界において、双子の平均出生率は1：89で、既に生まれた双子に対し、性別と顔立ちに基づき一卵性双生児であるか否かについて初歩的な判定を行うことができるが、結果は確実ではなく、依然として血液型等他の遺伝要素に頼って判定を行う必要がある。一方、二卵性双生児も同じく二絨毛膜二羊膜性又は一絨毛膜二羊膜性である可能性があるため、Ｂモード超音波の結果に表す二絨毛膜二羊膜だけでは二卵性双生児であることを確定できない。羊水穿刺の結果に基づき、それぞれ二つの胎児に対し出産前診断を行うことができるとしても、このようなサンプリング方法は一定の確率の流産をもたらし、且つ二つの胎児に対しそれぞれ羊水穿刺を行う難度はやや大きく、失敗し易い。
目下、出産前に二卵性双生児を確定する方法は依然として改善の余地がある。
本発明の目的は、従来技術に存在する技術問題を解決することにある。
このため、本発明では双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する手段を提出した。
本発明の第一側面において、本発明は双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法を提出した。本発明の実施例に基づき、当該方法は、双子胎児の少なくとも一つの多型部位に対しタイピングを行うことで、胎児の多様型を獲得するステップと、前記胎児の多様型を両親の対応する多型部位と比較するステップと、比較した結果に基づき、前記双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定するステップを含む。当該方法を利用すれば、双子が二卵性双生児であるか否かを有効に確定することができる。STRを例として、妊婦自身のSTRタイピングに対照して血漿の中で父の遺伝であることを判定できるSTRタイピングを探し、もし、ある遺伝子座で父親由来のSTRがヘテロ接合で、且つ母親遺伝子座の何れも異なり、血漿の中で父親由来の二種類タイピングも全て検出されることができれば、二卵性双生児であると鑑定することができる。
本発明の実施例に基づき、上述した双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法は、さらに下記の付加的な技術特徴を有することができる。
本発明の一つの実施例において、双子胎児の少なくとも一つの多型部位に対し分類を行うことで、胎児の多様型を獲得するステップは、さらに、妊婦サンプルから胎児の核酸サンプルを抽出するステップと、前記胎児の核酸サンプルに対し、シーケンスライブラリを構築するステップと、前記シーケンスライブラリに対しシーケンシングを行うことにより、シーケンシング結果を得るステップと、前記シーケンシング結果に基づき、前記胎児の多様型を確定するステップを含む。これにより、妊婦からサンプルを効果的に抽出することで胎児の多様型を獲得し、さらに双子胎児が二卵性双生児であるか否かを効果的に確定することができる。
本発明の一つの実施例において、妊婦サンプルは妊婦末梢血、妊婦の尿液と乳液の中の少なくとも一種類で、好ましくは妊婦末梢血を前記妊婦サンプルにする。これにより、非侵襲的に妊婦からサンプルを抽出することで、胎児の多様型を獲得し、さらに、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを効果的に確定することができると同時に、胎児の発育にも不良な影響を与えない。
本発明の一つの実施例において、シーケンスライブラリを構築する前に、前記の胎児の核酸サンプルに対し増幅を行うことで、前記多型部位を含む増幅産物を得るようにし、且つ、得られた増幅産物をシーケンスライブラリの構築に用いる。好ましくは、前記増幅産物の長さは150bp以下である。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明の一つの実施例において、前記多型性はSTR、VNTR、RFLP、STS、SSCP、CAPS、SNPから選ばれた少なくとも一種類である。本発明の一つの実施例において、前記多型部位はvWA、TPOX、D3S1358、D16S539、D5S818、CSF1PO、D11S2368、D2S1338、D8S1179、D13S317、D21S1437、D16S3391、Penta E、D12S1064、D12S391、D6S1043、D19S433から選ばれた少なくとも一つのSTR多型部位である。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明の一つの実施例において、PCRを通じて前記胎児の核酸サンプルに対し増幅を行い、そのうち、vWAに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、1と2に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；TPOXに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、3と4に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D3S1358に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、5と6に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D16S539に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、7と8に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D5S818に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、9と10に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；CSF1POに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、11と12に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D11S2368に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、13と14に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D2S1338に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、15と16に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D8S1179に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、17と18に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D13S317に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、19と20に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D21S1437に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、21と22に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D16S3391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、23と24に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；Penta Eに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、25と26に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D12S1064に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、27と28に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D12S391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、29と30に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D6S1043に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、31と32に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D19S433に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、33と34に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとする。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明のもう一つの側面において、本発明は双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定するシステムを提出した。本発明の実施例に基づき、当該システムはタイピング装置と分析装置を備え、前記タイピング装置は双子胎児の少なくとも一つの多型部位に対しタイピングを行うことで、胎児の多様型を獲得するのに用い、前記分析装置は前記タイピング装置に連結され、且つ前記多様型を両親に対応する多様型と比較を行うことに適し、さらに、比較した結果に基づき、前記双子が二卵性双生児であるか否かを確定する。当該システムを利用すれば、前記双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法を効果的に実施することができる。これにより、双子が二卵性双生児であるか否かを効果的に確定することができる。STRを例として、妊婦自身のSTRタイピングに対照して血漿の中で父の遺伝であることを判定できるSTRタイピングを探し、もし、ある遺伝子座で父親由来のSTRがヘテロ接合で、且つ母親遺伝子座の何れも異なり、血漿の中で父親由来の二種類タイピングも全て検出されることができれば、二卵性双生児であると鑑定することができる。
本発明の実施例に基づき、上述した双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法は、さらに下記の付加的な技術特徴を有することができる。
本発明の一つの実施例において、タイピング装置は核酸抽出ユニット、ライブラリ構築ユニット、シーケンシングユニット、タイピング確定ユニットを備え、前記核酸抽出ユニットは妊婦サンプルから胎児の核酸サンプルを抽出するのに適し、前記ライブラリ構築ユニットは前記核酸抽出ユニットに連結され、且つ前記胎児の核酸サンプルに対しシーケンスライブラリの構築に適し、前記シーケンシングユニットは前記ライブラリ構築ユニットに連結され、且つ前記シーケンスライブラリに対しシーケンシングを行うことにより、シーケンシング結果を得ることに適し、前記タイピング確定ユニットは前記シーケンシングユニットに連結され、且つ前記シーケンシング結果に基づき、前記胎児の多様型を確定するのに適している。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明の一つの実施例において、前記タイピング装置はさらに増幅ユニットを備え、前記増幅ユニットはそれぞれ核酸抽出ユニット及びライブラリ構築ユニットに連結され、前記胎児の核酸サンプルに対し増幅を行うことにより、前記多型部位を含む増幅産物を得るようにし、且つ、得られた増幅産物をシーケンスライブラリの構築に用いることに適する。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明の一つの実施例において、前記多型性はSTR、VNTR、RFLP、STS、SSCP、CAPS、SNPから選ばれた少なくとも一種類である。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明の一つの実施例において、前記多型部位はvWA、TPOX、D3S1358、D16S539、D5S818、CSF1PO、D11S2368、D2S1338、D8S1179、D13S317、D21S1437、D16S3391、Penta E、D12S1064、D12S391、D6S1043、D19S433から選ばれた少なくとも一つのSTR多型部位である。
本発明の一つの実施例において、前記増幅ユニットにはプライマーを設置することで、PCRを通じて前記胎児の核酸サンプルに対し増幅を行うことができるようにする。そのうち、vWAに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、1と2に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；TPOXに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、3と4に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D3S1358に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、5と6に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D16S539に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、7と8に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D5S818に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、9と10に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；CSF1POに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、11と12に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D11S2368に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、13と14に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D2S1338に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、15と16に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D8S1179に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、17と18に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D13S317に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、19と20に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D21S1437に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、21と22に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D16S3391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、23と24に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；Penta Eに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、25と26に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D12S1064に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、27と28に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D12S391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、29と30に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D6S1043に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、31と32に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D19S433に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、33と34に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとする。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明の付加面と利点の一部は以下で説明し、もう一部は下記の説明から明らかになるか、又は本発明の実践により把握することができる。
本発明の前記と/又は付加の面と利点は、図面を参照しながら実施例について説明する過程でより明らかになり、容易に理解することができる。図中：
本発明の一つの実施例に基づき、双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定するフローチャートである。 本発明のもう一つの実施例に基づき、双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定するフローチャートである。 本発明の一つの実施例に基づき、双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定するシステムの構造概略図である。 本発明のもう一つの実施例に基づき、双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定するシステムの構造概略図である。 本発明の一つの実施例に基づいたジェノタイピング結果ゲル電気泳動図である。 本発明の一つの実施例に基づいたジェノタイピング結果ゲル電気泳動図である。
以下、図面を参照しながら本発明に係わる実施例について詳しく説明する。そのうち、一貫して同じ又は類似の符号で同じ又は類似のユニット、又は同じ又は類似する機能を有するユニットを表示する。以下、図面を参照して記載した内容は実施例の例示的なもののみで、本発明の解釈に用いるだけで、本発明を制限するものと理解してはいけない。
説明すべきものは、用語“第一”、“第二”は記載の目的で用いるもののみであり、相対的な重要性を暗示又は潜在的に技術特徴の数を指すことであると理解してはいけない。そのため、“第一”、“第二”を限定した特徴は一つ又はより多い当該特徴を明示又は潜在的に含むことができ、さらに、本発明の記載において、別の説明がなければ、“複数”の意味は二つ又は二つ以上である。
＜双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法＞
本発明は双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法を提出している。図1を参照すると、当該方法は下記のステップを含む。
双子胎児の少なくとも一つの多型部位に対しタイピングを行うことで、胎児の多様型を獲得するようにする（S100タイピングステップ）。
本発明の実施例に基づき、胎児の多様型を獲得する方法は、特別の制限を受けない。本発明の幾つかの実施例に基づき、妊婦から妊婦のサンプルを分離し、さらに、妊婦サンプルから胎児の核酸サンプルを抽出することで、胎児の核酸サンプルに対し、シーケンシングを行うことにより胎児の多様型を確定することができる。ここで、説明すべきものは、“胎児の核酸サンプル”について広義的に理解すべく、それは関心を持つ胎児多様型の如何なる核酸サンプルを含み、胎児の全ゲノム核酸サンプルであってもよく、核酸フラグメントを含む核酸サンプルであっても良く、完全に胎児の遺伝物質から構成されてもよく、胎児の遺伝物質と妊婦の遺伝物質を含む混合物であっても良い。
ここで、図2を参照されたい。本発明の幾つかの実施例に基づき、胎児の多様型を獲得するステップはさらに、下記のステップを含む。
妊婦のサンプルから胎児の核酸サンプルを抽出する（S101）。これにより、妊婦からサンプルを効果的に抽出し、さらに胎児の多様型を獲得することで、双子が二卵性双生児であるか否かをさらに有効に確定することができる。本発明の実施例に基づき、胎児の核酸サンプルを抽出するための妊婦サンプルの類型は特別な制限を受けない。本発明の幾つかの実施例に基づき、採用可能な妊婦サンプルは妊婦末梢血、妊婦の尿液と乳液から選ばれた少なくとも一種類で、好ましくは妊婦末梢血を前記妊婦サンプルにする。これにより、非侵襲的に妊婦からサンプルを取り出すことで、胎児の多様型を獲得し、さらに、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを効果的に確定することができると同時に、胎児の発育にも不良な影響を与えない。本発明の実施例に基づき、妊婦から核酸サンプルを抽出する方法と設備も特別な制限を受けず、商品化された核酸抽出キットを採用して行えばよい。
胎児の核酸サンプルを取得した後、取得した胎児の核酸サンプルに対し、シーケンスライブラリを構築することができる（S102）。核酸サンプルに対し、シーケンスライブラリを構築する方法とプロセスに関し、本分野の技術者は異なるシーケンシング技術に基づき適当に選択を行うことができるが、プロセスの詳細に関してはシーケンシング装置のメーカー、例えばイルミナ会社が提供した規定を参照し、例えばイルミナ会社のMultiplexing Sample Preparation Guide( Part#1005361; Feb 2010 )又はPaired-End SamplePrep Guide ( Part#1005063；Feb 2010 )を参照されたい。本発明の一つの実施例において、シーケンスライブラリを構築する前に、前記の胎児の核酸サンプルに対し増幅を行うことで、前記多型部位を含む増幅産物を得るようにし、且つ、得られた増幅産物をシーケンスライブラリの構築に用いる。好ましくは、前記増幅産物の長さは150bp以下である。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明の一つの実施例において、前記多型性はSTR、VNTR、RFLP、STS、SSCP、CAPS、SNPから選ばれた少なくとも一種類である。本発明の一つの実施例において、前記多型部位はvWA、TPOX、D3S1358、D16S539、D5S818、CSF1PO、D11S2368、D2S1338、D8S1179、D13S317、D21S1437、D16S3391、Penta E、D12S1064、D12S391、D6S1043、D19S433から選ばれた少なくとも一つのSTR多型部位である。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明の一つの実施例において、PCRを通じて前記胎児の核酸サンプルに対し増幅を行い、そのうち、vWAに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、1と2に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；TPOXに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、3と4に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D3S1358に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、5と6に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D16S539に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、7と8に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D5S818に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、9と10に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；CSF1POに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、11と12に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D11S2368に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、13と14に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D2S1338に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、15と16に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D8S1179に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、17と18に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D13S317に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、19と20に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D21S1437に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、21と22に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D16S3391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、23と24に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；Penta Eに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、25と26に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D12S1064に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、27と28に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D12S391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、29と30に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D6S1043に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、31と32に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D19S433に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、33と34に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとする。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。採用されたプライマーは下記の表で示された通りである。
シーケンスライブラリを構築した後、構築されたシーケンスライブラリに対しシーケンシングを行うことにより、シーケンシング結果を得るようにすることができる（S103）。シーケンスライブラリを獲得した後、シーケンシング装置を用いてシーケンスライブラリに対しシーケンシングを行うことにより、対応するシーケンシング結果が得られるが、当該シーケンシング結果は複数のシーケンシングデータから構成される。本発明の実施例に基づき、シーケンシングを行うことに用いる方法と設備は特別な制限を受けず、ジデオキシチェーンターミネーション法を含むが、それに限らない。好ましくは、ハイスループットのシーケンシング方法で、これらのシーケンシング装置のハイスループット、ディープシーケンシングの特徴を利用することにより、有核赤血球染色体異数性を確定する効率をさらに向上させた。これにより、後続のシーケンシングデータに対する分析、特に、統計・検査分析を行う時の精確性と正確度を向上させるが、ハイスループットのシーケンシング方法は次世代シーケンシング技術又は単一分子シーケンシング技術を含むが、これに限らない。次世代シーケンシングプラットホーム (Metzker ML. Sequencing technologies-the next generation. Nat Rev Genet. 2010 Jan;ll(l):31-46 ) はIllumina-Solexa ( GATM,HiSeq2000TM等）、ABI-SolidとRoche-454 (ピロリン酸シーケンシング）を含むが、これに限らない。単一分子シーケンシングプラットホーム（技術）はHelicos公司のtSMS技術( True Single Molecule DNA sequencing ) 、Pacific Biosciences公司の1分子リアルタイムシーケンシング（single molecule real-time (SMRTTM) )、及びOxford Nanopore Technologies公司のナノボアシーケンシング技術等（Rusk, Nicole (2009-04-01). Cheap Third-Generation Sequencing. Nature Methods 6 (4): 244-245 )を含むが、これに限らない。シーケンシング技術の絶えない進化にしたがって、本分野の技術として理解できるのは、さらに他のシーケンシング方法と装置を採用して全ゲノムのシーケンシングを行うことができる。本発明の具体的な実施例に基づき、Illumina-Solexa、 ABI-SOLiD、 Roche-454と単一分子シーケンシング装置から選ばれた少なくとも一種類を利用して前記全ゲノムシーケンスライブラリに対しシーケンシングを行うことができる。
シーケンシング結果を得た後、得られたシーケンシング結果に基づき、前記胎児の多様型を確定する（S104）。通常の情報分析方法を通じてシーケンシング結果に対し分析を行うことで、胎児の多型部位のタイピングを確定することができる。例えば、アライメントソフトを採用してシーケンシング結果を参照配列とアライメントすることで多型部位における胎児の多様型を確定することができる。例えば、SOAPソフトを採用してアライメントを行うことができるが、本発明の実施例に基づき、採用可能な参照配列は人類のゲノム配列である。本発明の実施例に基づき、用いる部位の数は必要に応じて選択することができる。タイピング方式は弾力的で、配列の長さに基づきタイピングを行うことができるだけではなく、ヌクレオチド配列に基づきタイピングを行うこともできる。本発明の実施例に基づき、直接的に胎児の遺伝情報により胎児に対し一卵性であるか否かを推定することができるが、判定結果は正確且つ確実である。本発明の実施例に基づき、タイピング方式はさらにPCRを用いることができ、配列を獲得した後、フラグメントの長さに基づき電気泳動を行う。結果の判定について、具体的なタイピング結果だけではなく、各種のタイピングがタイピング全体に占める割合にもよるのである。
胎児の多型部位のタイピングを確定した後、胎児の多様型を両親の対応する多型部位と比較することができる（S200、比較ステップ）。例えば、平行的に又は予め両親の全ゲノムサンプルに対しシーケンシングを行うことで、両親の多型部位のタイピングを確定し、且つ分析を行うことができる。比較した結果に基づき、前記双子胎児が二卵性双生児であるか否か確定する（S300、確定ステップ）。胎児の多型部位のタイピングを獲得した後、もし、ある遺伝子座で父親由来のタイピングがヘテロ接合で、且つ母親遺伝座の何れも異なり、且つ妊婦のサンプルにおいて、例えば、血漿の中で父親由来の二種類のタイピングも全て検出されることができれば、二卵性双生児であることを意味している。例えば、STRを例として、両親ゲノムDNAと妊婦血漿DNAに対しそれぞれ多型部位のタイピングを行い、妊婦自身のSTRタイピングに対照して血漿の中で父の遺伝であることを判定できるSTRタイピングを探し、もし、ある遺伝子座で父親由来のSTRがヘテロ接合で、且つ母親遺伝子座の何れも異なり、血漿の中で父親由来の二種類タイピングも全て検出されることができれば、二卵性双生児であることを意味している。
＜双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定するシステム＞
本発明のもう一つの側面において、本発明は双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定するシステム1000を提出しているが、図3を参照されたい。本発明の実施例に基づき、当該システムはタイピング装置100と分析装置200を備える。本発明の実施例に基づき、タイピング装置は双子胎児の少なくとも一つの多型部位に対しタイピングを行うことで、胎児の多様型を獲得するようにする。本発明の実施例に基づき、分析装置はタイピング装置に連結され、且つ前記胎児の多様型を両親に対応する多様型と比較を行うことに適し、さらに、比較した結果に基づき、前記双子が二卵性双生児であるか否かを確定する。本文で記載の術後“連結”について広義的に理解すべく、直接的に連結されてもよく、間接的に連結されても良く、上述した機能実現可能な連結であればよい。当該システムを利用して前記双子が二卵性双生児であるか否かを確定する方法を有効に実施することができる。これにより、双子が二卵性双生児である否かを有効に確定することができる。STRを例として、妊婦自身のSTRタイピングに対照して血漿の中で父の遺伝であることを判定できるSTRタイピングを探し、もし、ある遺伝子座で父親由来のSTRがヘテロ接合で、且つ母親遺伝子座の何れも異なり、血漿の中で父親由来の二種類タイピングも全て検出されることができれば、二卵性双生児であると鑑定することができる。
図4を参照されたい。本発明の一つの実施例において、タイピング装置100はさらに、核酸抽出ユニット101、ライブラリ構築ユニット102、シーケンシングユニット103、タイピング確定ユニット104を備える。本発明の実施例に基づき、核酸抽出ユニット100は妊婦サンプルから胎児の核酸サンプルを抽出するのに適する。ライブラリ構築ユニット102は核酸抽出ユニット101に連結され、且つ胎児の核酸サンプルに対しシーケンスライブラリの構築に適している。シーケンシングユニット103はライブラリ構築ユニット102に連結され、且つシーケンスライブラリに対しシーケンシングを行うことにより、シーケンシング結果を得ることに適する。タイピング確定ユニット104はシーケンシングユニット103に連結され、且つシーケンシング結果に基づき、前記胎児の多様型を確定するのに適している。
核酸サンプルに対し、シーケンスライブラリを構築する方法とプロセスに関し、本分野の技術者は異なるシーケンシング技術に基づき適当に選択を行うことができるが、プロセスの詳細に関してはシーケンシング装置のメーカー、例えばイルミナ会社が提供した規定を参照し、例えばイルミナ会社のMultiplexing Sample Preparation Guide( Part#1005361; Feb 2010 )又はPaired-End SamplePrep Guide ( Part#l005063； Feb 2010 )を参照されたい。
本発明の一つの実施例において、タイピング装置はさらに増幅ユニット（図中、示されていない）を備え、前記増幅ユニットはそれぞれ核酸抽出ユニット及びライブラリ構築ユニットに連結され、且つ前記胎児の核酸サンプルに対し増幅を行うことにより、前記多型部位を含む増幅産物を得るようにし、それに、得られた増幅産物をシーケンスライブラリの構築に用いることに適する。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。それに、本発明の一つの実施例において、シーケンスライブラリを構築する前に、前記の胎児の核酸サンプルに対し増幅を行うことで、前記多型部位を含む増幅産物を得るようにし、且つ、得られた増幅産物をシーケンスライブラリの構築に用いる。好ましくは、前記増幅産物の長さは150bp以下である。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
本発明の一つの実施例において、前記多型部位はvWA、TPOX、D3S1358、D16S539、D5S818、CSF1PO、D11S2368、D2S1338、D8S1179、D13S317、D21S1437、D16S3391、Penta E、D12S1064、D12S391、D6S1043、D19S433から選ばれた少なくとも一つのSTR多型部位である。本発明の一つの実施例において、前記増幅ユニットにはプライマーを設置することで、PCRを通じて前記胎児の核酸サンプルに対し増幅を行うことができるようにする。そのうち、vWAに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、1と2に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；TPOXに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、3と4に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D3S1358に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、5と6に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D16S539に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、7と8に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D5S818に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、9と10に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；CSF1POに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、11と12に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D11S2368に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、13と14に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D2S1338に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、15と16に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D8S1179に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、17と18に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D13S317に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、19と20に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D21S1437に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、21と22に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D16S3391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、23と24に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；Penta Eに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、25と26に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D12S1064に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、27と28に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D12S391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、29と30に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D6S1043に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、31と32に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；D19S433に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、33と34に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとする。これにより、双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定する効率をさらに向上させることができる。
他の既存の二卵性双生児の鑑定方法に比べ、本発明の実施例に係わる技術方案に基づけば、下記の利点があり、主に非侵襲的な標本採取、正確性と取得可能な遺伝情報量で現れている。
1) 本発明の実施例に係わる技術方案に基づけば、妊婦末梢血又は尿液等、できる限り非侵襲的又は低侵襲的な標本採取方式を採用することで、伝統的な羊水又は絨毛膜標本採取によりもたらす不便と流産リスクを避けた。
2) 本発明の実施例に係わる技術方案に基づけば、一種又は数種類の多型部位のタイピング結果を通じて、二卵性であるか否かに対し判定を行い、用いる部位の数は必要に応じて選択することができる。タイピング方式は弾力的で、配列の長さに基づきタイピングを行うことができるだけではなく、ヌクレオチド配列に基づきタイピングを行うこともできる。直接的に胎児の遺伝情報により胎児に対し一卵性であるか否かを推定することができるが、判定結果は正確且つ確実である。
3) 本発明の実施例に係わる技術方案に基づけば、臨床疾患の診断をより効果的に指導することができ、二卵性双生児が所持する遺伝物質は完全に同じでないため、ある疾患を判断する時に各胎児に対し単独的に判定を行う必要があり、もし、一卵性であると鑑定された場合には、誤診の可能性があり、ひいては胎児の遺伝発育に関する研究をより良く行い、よりよく妊婦末梢血中に遊離している胎児のDNAの生成メカニズム及び存在状態に対し研究を行い、非侵襲的な出産前の疾患診断をより良く指導することができる。
以下、実施例に合わせて本発明に対する解釈を行う。本分野に属する技術者は、以下の実施例は本発明の説明に用いるものだけで、本発明の範囲を限定するものと見なしてはないと理解すべきである。実施例で明記していない具体的な技術と条件は、本分野内の文献で記載した技術又は条件（例えば、J．サムブルック（J. Sambrook）ら著作、黄培堂らが訳した《分子クローニング実験マニュアル》、第三版、科学出版社）又は製品説明書に従って行う。使用される試薬又は装置については生産メーカーを明記していないが、何れも市場から購入可能な通常の製品で、例えばイルミナ会社から購入することができる。
＜実施例＞
一般的な方法
本発明に係わる双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法は、下記のステップ、即ち、
1．非侵襲的に胎児の遺伝物質を含む妊婦サンプルを採集し、その中に含まれた遺伝物質を抽出するステップと、
2．胎児両親のゲノムDNAを抽出と純化するステップと、
3．それぞれ両親の遺伝子型及び妊婦と胎児のゲノム混合物に対し多型部位のタイピングを行うステップと、
4．妊婦と胎児のゲノム混合物の中で現れた新しい多様型を父親ゲノムのタイピング結果と比較を行うことで、胎児のタイピングに対し判定を行う。胎児遺伝子型のタイピングを比較することにより、もし、胎児が異なる父親遺伝型を所持すれば、胎児は二卵性双生児であると判断するステップと、を含む。
双子を妊娠している妊婦の血漿を収集すると同時に、当該妊婦夫妻のゲノムDNAを収集したが、当該双子は移植した試験管ベビーで、且つ二卵性双生児であると臨床診断されている。親子鑑定に良く用いられる17対のSTR遺伝子座を選択し（vWA、TPOX、D3S1358、D16S539、D5S818、CSF1PC、D11S2368、D2S1338、D8S1179、D13S317、D21S1437、D16S3391、Penta E、D12S1064、D12S391、D6S1043、D19S433）、設計されたプライマーは表1に示されるとおりで、増幅産物のフラグメントは150bpより小さい条件を満たす。先ず、両親ゲノムDNAに対しSTRタイピングを行い、両親ゲノムDNAをテンプレートとし、それぞれPhusion（登録商標）ハイファイDNAポリメラーゼを用いて14対のプライマーに対しPCR増幅を行い、増幅システムは下記の通りである。
2 x Phusion PCR Master Mix 25μ1
順方向プライマー 5μ1
逆方向プライマー 5μ1
DNAテンプレート 15μ1
総体積 50μ1
PCR産物に対し12％PAGE電気泳動タイピングを行い（180v、2時間）、タイピング結果は図5に示される通りである。D6S1043、D19S433及びD12S391、この三つの遺伝子座で非特異性増幅がやや大きいほか、他の遺伝子座は全てタイピングに成功し、そのうち、父親はヘテロ遺伝子座で且つ母親の二種類のコピー数と何れも異なる遺伝子座は四対、即ち、D8S1179、vWA、D16S539、D11S2368がある。TIANamp Micro DNA Kit ( TIANGEN )から血漿サンプルDNAを抽出した後、通常のデーターベースを構築するが、具体的なプロセスは下記の通りである。
末端修復：
10 x T4ポリヌクレオチド・キナーゼ・バッファー 10μ1
dNTPs(10mM) 2μ1
T4 DNAポリメラーゼ 1μ1
Klenowフラグメント 0.1μ1
T4ポリヌクレオチド・キナーゼ 1μ1
DNA 85μ1
ddH20を100μ1まで補充する。
20℃で30分反応した後、PCR Purification Kit(QIAGEN)を使用して末端修復産物を回収する。回収したサンプルを最後に34μ1のEBバッファーに溶ける。
末端で塩基Aを添加する反応システム：
10 x Klenowバッファー 5μ1
dATP(lmM) 10μ1
Klenow (3 '-5' exo") 1μ1
DNA 34μ1
37℃で30分培養した後MinElute（登録商標）. PCR Purification Kit(QIAGEN)純化を経て、且つ45μ1のEBに溶け、末端添加塩基Aのサンプルが得られる。
コネクタ：
2x Rapid DNAライゲーションバッファー 50μ1
PEI Adapter oligomix(20uM) 1μ1
Τ4 DNAリガーゼ 4μ1
末端添加塩基A のDNAサンプル 45μ1
20℃で15分反応した後、PCR Purification Kit(QIAGEN)を使用してライゲーション産物を回収する。最後にサンプルを15μ1のEBバッファーに溶けてライゲーション産物が得られる。
PCR反応システム：
ライゲーション産物 15μ1
Phusion DNA Polymerase Mix 25μ1
PCR プライマー（10 pmol/μ1) 2.5μ1
タグN(10 pmol/μ1) 2.5μ1
UltraPureTM Water 5μ1
反応手順は下記の通りである。
PCR Purification Kit(QIAGEN)を使用してPCR産物を回収する。最後にサンプルを20μ1のEBバッファーに溶ける。
既に構築した血漿ライブラリをテンプレートとし、選択した四種類の候補STR遺伝子座に対しタイピングを行い、タイピング方法は前記と一致している。結果は図6に示されている。血漿サンプルが成功に増幅したvWA遺伝子座で、父親のゲノムはヘテロで、且つ二種類のコピー数は母親の遺伝子型の何れも異なり、血漿タイピングの結果から父親の二つの対立遺伝子が見られば、二つの胎児はそれぞれ父親の異なる対立遺伝子を遺伝し、二卵性双生児であると見なす。
本発明の実施例に係わる技術方案に基づけば、双子が二卵性双生児であるか否かを有効に確定することができる。
本発明の実施方式について既に詳細に記載したが、当分野の技術者は本発明の啓蒙下で、本発明の精神や趣旨、特許請求を逸脱しない範囲で本発明に対して種々の改変や変形を実施することができ、これらは、何れも本発明の保護範囲に属すると理解すべきである。本発明の全ての範囲は添付した請求の範囲及び如何なる同等物から提出する。
本明細書で記載した用語“一つの実施例に”、“幾つかの実施例”、“例示性実施例”、“例示”、“具体的な事例”、又は“幾つかの事例”等は当該実施例又は事例に合わせて説明した具体的な特徴、構造、材料又は特点で、本発明の少なくとも一つの実施例又は事例に含まれている。本明細書において、前記用語の例示的な説明は同じ実施例又は事例を指すとは限らず、それに、説明した具体的な特徴、構造、材料又は特点は如何なる一つ又は複数の実施例又は事例で適当な方式で合わせることができる。

Claims (15)

  1. 双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法であって、
    双子胎児の少なくとも一つの多型部位に対しタイピングを行うことで、胎児の多様型を獲得するステップと、
    前記胎児の多様型を両親の対応する多型部位と比較するステップと、
    比較した結果に基づき、前記双子胎児が二卵性双生児であるか否かを確定するステップと、を含む、
    ことを特徴とする双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定する方法。
  2. 双子胎児の少なくとも一つの多型部位に対しタイピングを行うことで、胎児の多様型を獲得するステップは、さらに、
    妊婦サンプルから胎児の核酸サンプルを抽出するステップと、
    前記胎児の核酸サンプルに対し、シーケンスライブラリを構築するステップと、
    前記シーケンスライブラリに対しシーケンシングを行うことにより、シーケンシング結果を得るステップと、
    前記シーケンシング結果に基づき、前記胎児の多様型を確定するステップと、を含む。
    ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
  3. 前記妊婦サンプルは妊婦末梢血、妊婦の尿液及び乳液から選択した少なくとも一種類である、
    ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
  4. 前記妊婦サンプルは妊婦末梢血である、
    ことを特徴とする請求項3に記載の方法。
  5. シーケンスライブラリを構築する前に、前記の胎児の核酸サンプルに対し増幅を行うことで、前記多型部位を含む増幅産物を得るようにし、且つ、得られた増幅産物をシーケンスライブラリの構築に用いる、
    ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
  6. 前記増幅産物の長さは150bp以下である、
    ことを特徴とする請求項5に記載の方法。
  7. 前記多型性はSTR、VNTR、RFLP、STS、SSCP、CAPS、SNPから選ばれた少なくとも一種類である、
    ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
  8. 前記多型部位はvWA、TPOX、D3S1358、D16S539、D5S818、CSF1PO、D11S2368、D2S1338、D8S1179、D13S317、D21S1437、D16S3391、Penta E、D12S1064、D12S391、D6S1043、D19S433から選ばれた少なくとも一つのSTR多型部位である、
    ことを特徴とする請求項7に記載の方法。
  9. PCRを通じて前記胎児の核酸サンプルに対し増幅を行い、
    そのうち、
    vWAに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、1と2に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    TPOXに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、3と4に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D3S1358に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、5と6に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D16S539に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、7と8に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D5S818に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、9と10に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    CSF1POに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、11と12に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D11S2368に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、13と14に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D2S1338に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、15と16に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D8S1179に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、17と18に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D13S317に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、19と20に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D21S1437に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、21と22に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D16S3391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、23と24に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    Penta Eに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、25と26に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D12S1064に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、27と28に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D12S391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、29と30に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D6S1043に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、31と32に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D19S433に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、33と34に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとする、
    ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定するシステムであって、
    タイピング装置と分析装置を備え、
    前記タイピング装置は双子胎児の少なくとも一つの多型部位に対しタイピングを行うことで、胎児の多様型を獲得するのに用い、
    前記分析装置は前記タイピング装置に連結され、且つ前記多様型を両親に対応する多様型と比較を行うことに適し、さらに、比較した結果に基づき、前記双子が二卵性双生児であるか否かを確定する、
    ことを特徴とする双子が二卵性双生児であるか否かを鑑定するシステム。
  11. 前記タイピング装置は核酸抽出ユニット、ライブラリ構築ユニット、シーケンシングユニット、タイピング確定ユニットを備え、
    前記核酸抽出ユニットは妊婦サンプルから胎児の核酸サンプルを抽出するのに適し、
    前記ライブラリ構築ユニットは前記核酸抽出ユニットに連結され、且つ前記胎児の核酸サンプルに対しシーケンスライブラリの構築に適し、
    前記シーケンシングユニットは前記ライブラリ構築ユニットに連結され、且つ前記シーケンスライブラリに対しシーケンシングを行うことにより、シーケンシング結果を得ることに適し、
    前記タイピング確定ユニットは前記シーケンシングユニットに連結され、且つ前記シーケンシング結果に基づき、前記胎児の多様型を確定するのに適している、
    ことを特徴とする請求項10に記載のシステム。
  12. 前記タイピング装置はさらに増幅ユニットを備え、
    前記増幅ユニットはそれぞれ核酸抽出ユニット及びライブラリ構築ユニットに連結され、且つ前記胎児の核酸サンプルに対し増幅を行うことにより、前記多型部位を含む増幅産物を得るようにし、それに、得られた増幅産物をシーケンスライブラリの構築に用いることに適する、
    ことを特徴とする請求項10に記載のシステム。
  13. 前記多型性はSTR、VNTR、RFLP、STS、SSCP、CAPS、SNPから選ばれた少なくとも一種類である、
    ことを特徴とする請求項12に記載のシステム。
  14. 前記多型部位はvWA、TPOX、D3S1358、D16S539、D5S818、CSF1PO、D11S2368、D2S1338、D8S1179、D13S317、D21S1437、D16S3391、Penta E、D12S1064、D12S391、D6S1043、D19S433から選ばれた少なくとも一つのSTR多型部位である、
    ことを特徴とする請求項13に記載のシステム。
  15. 前記増幅ユニットにはプライマーを設置することで、PCRを通じて前記胎児の核酸サンプルに対し増幅を行い、
    そのうち、
    vWAに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、1と2に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    TPOXに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、3と4に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D3S1358に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、5と6に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D16S539に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、7と8に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D5S818に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、9と10に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    CSF1POに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、11と12に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D11S2368に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、13と14に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D2S1338に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、15と16に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D8S1179に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、17と18に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D13S317に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、19と20に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D21S1437に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、21と22に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D16S3391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、23と24に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    Penta Eに対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、25と26に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D12S1064に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、27と28に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D12S391に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、29と30に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D6S1043に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、31と32に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとし；
    D19S433に対し前記PCRはSEQ ID NOを採用し、33と34に示されたオルゴヌクレオチドをプライマーとする、
    ことを特徴とする請求項14に記載のシステム。
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