KR100968901B1 - 핵산의 증폭방법 - Google Patents

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Abstract

주형 핵산이 서로에 대해 실질적으로 동일한 서열을 가진 경우, 목적 영역이 ICAN 반응에서 동일한 서열을 통해 단일 서열 내에 중합되는 래더 구조인 산물을 생성하도록, 프라이머는 이들 서열 사이의 영역에 고안된다. 특정 염기 서열을 함유하는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 래더 구조를 가지는 증폭산물이 명확하게 형성될 수 있으므로, ICAN 반응에서 반응 속도, 증폭 효율 및 감도는 향상될 수 있다.
핵산, 증폭, 래더, 프라이머, 프로브

Description

핵산의 증폭방법{Method of Amplifying Nucleic Acid}
본 발명은 임상의학 분야에서 유용한 목적핵산의 검출방법, 및 유전공학 분야에서 유용한 DNA 합성방법에 관한 것이다. 본 발명은 주형인 핵산을 증폭하는 방법 및 상기 방법에 따라 증폭된 목적핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
DNA 합성은 유전공학분야의 연구에 있어서 다양한 목적을 위해 사용되고 있다. 단쇄 DNA (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 합성을 제외한 대다수의 DNA 합성은 DNA 중합효소를 사용하는 효소방법을 사용하여 수행된다.
예를 들어, PCR (polymerase chain reaction) 방법에 따르면, 수반하는 증폭 사이클 동안 단일나선의 목적 분자 (single-stranded target molecule)를 재생하기 위해서는, 고온 및 저온에서 반응을 수차례 반복할 필요가 있다. 상기 기재한 바와 같이 반응은 온도에 의해 제한되므로, 반응 시스템은 불연속적인 단계 또는 사이클을 사용하여 수행될 필요가 있다.
따라서, 이 방법은 시간 동안 내내 광범위한 온도를 엄격하게 조정할 수 있는 값비싼 온도 사이클러 (thermal cycler)의 사용을 필요로 한다. 더욱이, 상기 반응은 온도를 2개 또는 3개의 기정된 온도로 조정하는데 필요한 시간을 필요로 한다. 시간의 손실은 사이클 수에 비례하여 증가한다.
이후, 등온 조건 (isothermal condition) 하에서 수행될 수 있는 핵산 증폭방법은 상기 기재된 문제점들을 해결하기 위하여 개발되어 왔다.
등온 조건 하에서 수행될 수 있는 방법의 예시는 SDA (Strand Displacement Amplification) 방법 (예를 들어, 특허문헌 1 참조), RCA (Rolling Circle Amplification) 방법 (예를 들어, 특허문헌 2 참조), LAMP (Loop-mediated isothermal AMPlification) 방법 (예를 들어, 특허문헌 3 참조), ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) 방법 (예를 들어, 특허문헌 4 참조), 및 여러 가지의 변형된 SDA 방법 (예를 들어, 특허문헌 5 내지 8 참조)을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오티드 합성 또는 핵산 증폭의 등온방법의 반응에서, 프라이머로부터의 신장 (extension) 및 프라이머로부터의 신장을 수반하는 단일나선 신장 산물로의 (또는 원래 목적 서열로의) 프라이머 어닐링 (annealing)은 고정된 온도에서 배양한 반응 혼합물에서 나란히 일어난다.
특허문헌 1에 기재된 SDA 방법은 DNA 중합효소 및 제한적 엔도뉴클레아제 (restriction endonuclease)를 사용하여 이중나선의 치환을 통해 샘플 내의 목적핵산 서열 (및 그의 상보적인 나선)을 증폭하는 방법이다. 상기 방법은 증폭에 사용되는 4개의 프라이머를 필요로 하는데, 이 중 2개는 제한적 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위를 함유하도록 제작될 필요가 있다. 상기 방법은 다량으로 DNA를 합성하 기 위한 기질 (substance)로서 변형된 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 사용을 필요로 한다. 변형된 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트는 α-위치에서 인산기의 산소원자가 황원자로 치환된 (α-S) 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트를 예로 들 수 있다.
특허문헌 2에 기재된 RCA 방법은 원형의 DNA를 주형으로 사용하는 핵산 증폭방법이다. 생성된 증폭산물은 증폭된 부분이 여러 번 반복되고 새로운 주형으로 사용되는 서열을 가진다. 그 결과, 최종 증폭산물은 "브랜칭 (branching)"이라고 불리우는 분지형 구조 (branched structure)를 가진다. RCA 방법에 있어서, 화학적 부반응 (side reaction)에서, 래더-유사 증폭산물 (ladder-like amplfication product)의 생성 억제는 증폭 효율을 증가시키는데 있어 중요하다 (예를 들어, 비특허 문서 1 참조).
특허문헌 3에 기재된 LAMP 방법은 증폭을 위하여 4개의 프라이머를 필요로 한다. 생성된 증폭산물은 증폭될 목적 부분이 반복되는, 다양한 크기를 가진 래더-유사 DNA이다. DNA에서, 목적 부분은 번갈아서 서로에 대해 연결되어 있다.
특허문헌 4에 기재된 ICAN 방법은 키메릭 (chimeric) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 핵산 증폭방법이다.
특허문헌 5에 기재된 SDA 방법은 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 핵산 증폭방법이다. 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 RNA 및 DNA로 구성되어 있으며, 필수성분으로, DNA가 적어도 3' 말단에 위치한 구조를 가진다.
특허문헌 6에 기재된 변형된 SDA 방법은 튀어나온 3' 말단 (3'-protruding terminus)을 생성하는 제한효소의 사용을 필요로 한다.
특허문헌 7에 기재된 변형된 SDA 방법은 적어도 두 쌍의 프라이머의 사용을 필요로 한다.
특허문헌 8에 기재된 변형된 SDA 방법은 적어도 두 쌍의 프라이머와 적오ㄷ 하나의 변형된 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 사용을 필요로 한다.
등온 핵산 증폭방법은 상기 기재한 바와 같이 개발되어 왔으나, 증폭 효율, 검출 감도 및 그 등가물에 관련된 문제점을 여전히 가지고 있다. 이후, 개선된 등온 핵산 증폭반응이 상기 문제점을 해결하기 위하여 개발되었다 (예를 들어, 특허 문헌 9 내지 11 참조).
특허문헌 9에 기재된 방법은 하기 성분을 사용하는 핵산 증폭방법이다: RNA 중합효소를 위한 프로모터 또는 역전사 프라이머 혹은 핵산 증폭용 프라이머의 5' 말단에 부착된 그의 일부분을 가지며, 적어도 5개의 뉴클레오티드를 함유하는 5' 말단에 부착된 임의의 올리고뉴클레오티드를 더 가지는 프라이머; 및 프라이머에 RNA 중합효소를 위한 프라이머의 일부분 또는 업스트림 (upstream) 부분에 어닐링하는 세번째 프라이머.
특허문헌 10에 기재된 방법은 적어도 2개의 상보적인 프라이머 또는 적어도 2개의 프라이머 쌍을 사용하는 핵산 증폭방법이다. 상기 방법은 생산된 증폭산물의 양이 복수개의 프라이머 또는 복수개의 프라이머 쌍을 사용하여 증가하는 방법이다. 생산성을 증가시키기 위해서 더 많은 프라이머 또는 프라이머 쌍을 사용하는 것이 필요하다.
특허문헌 11에 기재된 방법은 하기 기재된 것을 조합하여 사용하는 특허문헌 12에 기재된 방법이다: 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 프라이머가 하이브리다이제이션하는 위치까지 주형 핵산 3'의 일부분으로 하이브리다이제이션하는 업스트림 올리고뉴클레오티드 프라이머. 상기 방법에 따라, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형 나선에 하이브리다이제이션하는 서열로만 구성된다.
상기 기재된 통상적인 등온 핵산 증폭방법은 여전히 많은 문제점을 가지고 있다. 그러므로, 효율적이면서 고도로 민감한 방법이 바람직하다.
특허문헌 1: JP-B 7-114718
특허문헌 2: WO 97/19193
특허문헌 3: WO 00/28082
특허문헌 4: WO 00/56877
특허문헌 5: US 5,824,517
특허문헌 6: WO 99/09211
특허문헌 7: WO 95/25180
특허문헌 8: WO 99/49081
특허문헌 9: WO 95/03426
특허문헌 10: WO 95/25180
특허문헌 11: JP-A 2003-52380
비-특허문헌 1: Hafner, G.J. et al., BioTechniques, vol. 30 (2001) p. 852-867
본 발명에 의해 해결되어야 할 과제
본 발명의 주요 목적은 샘플 내 목적핵산이 고도의 감도를 가지면서 특이적으로 증폭함으로써 목적핵산을 증폭하는 방법 및 상기 방법을 위한 조성물 및 키트를 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자는 상기 기재된 문제점을 해결하기 위하여 집약적으로 연구하여 왔다. 그 결과, 본 발명자는 실질적으로 동일한 서열이 주형인 핵산 내에 존재하고, 프라이머가 서열 간의 영역 내에 존재하는 서열에 대하여 고안된 경우, 래더-유사 산물이 ICAN 반응에서 생성된다는 것을 발견하였다. 래더-유사 산물에서, 목적 영역은 동일한 서열을 통해 한 방향으로 중합된다. 본 발명자는 ICAN 방법의 감도, 증폭 효율 및 반응 속도가 증폭산물을 래더-유사 산물로 명확하게 전환함으로써 증가될 수 있다는 것도 발견하였다. 전환은 특정 뉴클레오티드 서열을 함유한 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행된다. 그리하여, 본 발명이 완성되었다.
본 발명의 첫번째 관점은
(A) (a) 주형인 핵산, 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 나선 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소, 적어도 두 개의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 적어도 하나의 래더 (ladder)-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 RNase H; 또는
(b) 주형인 핵산, 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 나선 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소, 적어도 두 개의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 RNase H
로부터 선택된 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및
(B) RNase H에 의한 신장된 나선의 절단 반응 뿐 아니라, DNA 중합효소에 의한 나선 치환 반응 및 신장된 나선을 합성하는 반응, 주형인 핵산으로의 프라이머의 특이적인 어닐링 (annealing)이 일어나는 고정된 온도 조건하에서, 래더-유사 증폭산물을 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 배양하는 단계 포함하는, 핵산의 증폭방법에 관한 것으로:
여기서, (b)의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 하나는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 사용되며,
각 키메라 올리고뉴클레오티드 프라이머는 디옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나 뿐 아니라 리보뉴클레오티드를 함유하고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3' 말단부 (terminal side) 또는 말단에 위치하며,
키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 적어도 하나의 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 적어도 하나의 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며,
래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 영역까지 뉴클레오티드 서열 3' 및/또는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 주형인 핵산의 영역에 상보적인 서열을 가지며, 5'측에서, 주형인 핵산에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'에 뉴클레오티드 서열; 주형인 핵산에서, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상응하는 부분의 5' 영역에서 5' 말단에 해당하는 뉴클레오티드 서; 또는 두 서열 모두에 상보적인 서열을 가진다.
첫번째 관점에 따라, 주형인 핵산은 RNA일 수 있고, 핵산은 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 역전사 활성을 가진 DNA 중합효소 및 상기 핵산을 역전사 산물로 전환하기 위한 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 미리 처리될 수 있다.
첫번째 관점에 따라, 단계 (A)의 반응 혼합물은 역전사 활성을 가지는 DNA 중합효소를 더 함유할 수 있다.
첫번째 관점에 따라, 주형인 핵산은 mRNA일 수 있다.
첫번째 관점에 따라, 역전사 활성 및 나선 치환 활성을 가지는 단일 DNA 중합효소가 사용될 수 있다.
본 발명의 두번째 관점은 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유한, 상기 첫번째 관점의 방법을 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 세번째 관점은 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유한, 상기 첫번째 관점의 방법을 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 네번째 관점은
(a) 첫번째 관점의 방법에 따라 목적핵산을 증폭하는 단계; 및
(b) 상기 단계에서 증폭된 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는, 목적핵산의 검출방법에 관한 것이다.
삭제
본 발명의 효과
본 발명은 통상적인 등온 핵산 증폭방법보다 우수한 증폭방법뿐 아니라, 상기 방법을 위해 사용되는 조성물 및 키트를 제공한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 디옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide) (dN으로도 언급됨)는 당 부분이 D-2-디옥시리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 그의 예시는 염기 부분으로 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 티민을 가지는 것을 포함한다. 더욱이, 디옥시리보뉴클레오티드는 7-디아자구아노신 (7-deazaguanosine)과 같이 변형된 염기를 가지는 디옥시리보뉴클레오티드, 고정화 (immobilization)에 사용될 수 있는 작용기를 가진 디옥시리보뉴클레오티드 및 디옥시이노신 뉴클레오티드와 같은 디옥시리보뉴클레오티드 유사체도 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide) (N으로도 언급됨)는 당 부분이 D-리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 리보뉴클레오티드는 염기 부분으로 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 티민을 가지는 것을 포함한다. 리보뉴클레오티드는 α-위치에서 인산기의 산소원자가 황원자 (S)로 치환된 변형된 리보뉴클레오티드 ((α-S) 리보뉴클레오티드로도 언급됨)와 같은 변형된 리보뉴클레오티드 또는 다른 유도체도 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 (chimeric oligonucleotide primer)는 프라이머의 3'-말단부 또는 3'말단에 위치한 리보뉴클레오티드를 가지며, 본 발명의 방법에 따라 핵산 나선을 신장하는데 사용될 수 있고, RNase H를 사용하여 절단될 수 있으며, 나선 치환 반응에 영향을 주는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 언급한다. 본 발명에 따른 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 디옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 군에서 선택된 것을 최소한 하나 함유할 뿐 아니라, 리보뉴클레오티드를 함유한다. 프라이머는 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 함유하는 올리고리보뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열 중 일부분에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, "실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열"은 사용된 반응 조건에서 주형인 DNA에 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 3'-말단부 (3'-terminal side)는 핵산 (예를 들어, 프라이머)의 중앙에서 3' 말단까지의 부분을 언급한다. 유사하게, 5'-말단부 (5'-terminal side)는 핵산의 중앙에서 5' 말단까지의 부분을 언급한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 업스트림 영역 (upstream region)은 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열의 5' 말단까지 5'인 주형 나선의 영역을 언급하며, 여기서, 주형 나선은 사용되는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상응한다. 그러므로, 이는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열의 3' 말단까지 3'인 주형 나선에 상보적인 나선의 영역에 해당한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 래더 형성을 위한 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 방법에 사용된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서의 올리고뉴클레오티드 서열; 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상응하는 부분의 5' 말단의 업스트림 영역 (예를 들어, 5' 말단까지의 5')에 해당하는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열; 또는 두 서열 모두에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 언급한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머의 5'측에서 래더 형성을 위하여 상기 언급된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것을 언급한다.
뉴클레오티드 서열 상의 위치는 하기 기재된 대로 본 명세서에서 표시된다: 본 발명의 방법에서 사용된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단 또는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링하는 주형 나선에서의 위치에 해당하는 위치는 "0"으로 정의된다. 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3' 말단에 대한 위치는 정수 "+1", "+2" 등으로 표시된다. 주형인 핵산에서 위치 "0"의 업스트림으로 1 뉴클레오티드의 위치는 "-1"로 정의된다. 업스트림 쪽의 위치는 정수 "-1", "-2" 등으로 표시된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, RNase H (리보뉴클레아제 H)는 주형인 핵산에 어닐링하는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 생성된 이중나선 DNA에 작용하는 것일 수 있고, 프라이머의 리보뉴클레오티드 부분에서 그것을 특이적으로 절단할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, DNA 중합효소는 주형으로 RNA 나선을 사용하여 RNA 나선에 상보적인 DNA 나선을 합성하는 효소 (RNA-의존성 DNA 중합효소) 또는 주형으로 다른 DNA 나선을 사용하여 새로운 DNA 나선을 합성하는 효소 (DNA-의존성 DNA 중합효소)를 언급한다. DNA 중합효소는 상기 언급된 활성을 가지는 변종 효소 및 자연적으로 발생하는 DNA 중합효소를 포함한다. 예를 들어, 상기 효소는 나선 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 중합효소, 및 역전사효소 활성 또는 RNase H 활성을 부가적으로 가지는 DNA 중합효소를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "나선 치환 활성 (strand displacement activity)"는 주형 나선에 어닐링하는 상보적인 나선을 배출하기 위하여 DNA 나선을 치환하면서, 주형인 핵산의 서열을 기초로 한 DNA 중복 (duplication)과 함께 진행될 수 있는, 나선 치환에 영향을 줄 수 있는 활성을 언급한다. 또한, 나선 치환에 의해 주형인 핵산에서 배출된 DNA 나선은 본 명세서에서 "치환된 나선 (displaced strand)"로 언급된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "역전사 활성 (reverse transcription activity)"은 주형으로 RNA 나선을 사용하여 RNA 나선에 상보적인 DNA 나선을 합성할 수 있는 활성을 언급한다.
(1) 본 발명의 목적핵산의 증폭방법
RNase H 및 DNA 중합효소와 병행하여 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써 본 발명의 방법을 수행하는 것이 가능하다. 택일적으로, DNA 중합효소의 RNase H 활성이 나타나는 조건 하에서, RNase H 활성을 가진 DNA 중합효소를 사용하는 것이 가능하다.
핵산은 본 발명의 방법에 따른 등온 조건 하에서 성공적으로 증폭된다. "성공적인 (successively)"이란 반응이 반응 혼합물 또는 반응 혼합물의 조성물에서 변화없이 진행하는 것을 의미한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, "등온 (isothermal)"이란 효소 및 핵산 나선이 하기 기재된 대로 각 단계에서 작용하는 실질적으로 고정된 온도의 조건을 의미한다.
본 발명의 목적핵산을 증폭하는 방법의 일 구현예에서, 핵산을 증폭하기 위한 대표적인 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 역전사 산물을 수득하기 위하여, 주형인 핵산을 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 역전사 활성을 가진 DNA 중합효소 및 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 처리하는 단계;
(b) 역전사 산물, 나선 치환 활성을 가진 DNA 중합효소, 적어도 두 개의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및
(c) RNase H에 의해 신장된 나선을 절단하는 반응뿐 아니라, DNA 중합효소에 의해 나선치환 반응 및 신장된 나선을 합성하는 반응이 일어나는 고정된 온도 조건 하에서, 래더-유사 증폭산물을 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 배양하는 단계.
각 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 디옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나뿐 아니라, 리보뉴클레오티드를 함유하며, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단부 또는 3' 말단에 위치한다.
키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 적어도 하나의 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 영역까지 뉴클레오티드 서열 3' 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라임에 상보적인 주형인 핵산의 영역에 상보적이며, 그의 5'측에서, 주형인 핵산에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측의 뉴클레오티드 서열; 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상응하는 부분의 5' 말단의 업스트림인 영역 (예를 들어, 5' 말단까지의 5')에 상응하는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열; 또는 두 서열 모두에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예에서, 핵산을 증폭하기 위한 대표적인 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 주형인 핵산, 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 역전사효소 활성을 가지는 DNA 중합효소, 나선 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소, 적어도 두 개의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이며 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및
(b) RNase H에 의한 신장된 나선의 절단 반응뿐 아니라, DNA 중합효소에 의한 나선 치환 반응 및 신장된 나선을 합성하는 반응, 주형인 핵산으로의 프라이머의 특이적인 어닐링 (annealing)이 일어나는 고정된 온도 조건하에서, 래더-유사 증폭산물을 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 배양하는 단계.
각 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 디옥시리보뉴크레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나뿐 아니라, 리보뉴클레오티드를 함유하고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3' 말단부 또는 3' 말단에 위치한다.
키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 적어도 하나의 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 영역까지 뉴클레오티드 서열 3' 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 주형인 핵산의 영역에 상보적이며, 그의 5'측에서, 주형인 핵산에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측의 뉴클레오티드 서열; 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상응하는 부분의 5' 말단의 업스트림인 영역 (예를 들어, 5' 말단까지의 5')에 상응하는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열; 또는 두 서열 모두에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 핵산을 증폭하기 위한 대표적인 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 주형인 핵산, 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 나선 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소, 적어도 두 개의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이며 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및
(b) RNase H에 의한 신장된 나선의 절단 반응뿐 아니라, DNA 중합효소에 의한 나선 치환 반응 및 신장된 나선을 합성하는 반응, 주형인 핵산으로의 프라이머의 특이적인 어닐링 (annealing)이 일어나는 고정된 온도 조건하에서, 래더-유사 증폭산물을 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 배양하는 단계.
각 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 디옥시리보뉴크레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나뿐 아니라, 리보뉴클레오티드를 함유하고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3' 말단부 또는 3' 말단에 위치한다.
키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 적어도 하나의 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 영역까지 뉴클레오티드 서열 3' 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 주형인 핵산의 영역에 상보적이며, 그의 5'측에서, 주형인 핵산에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측의 뉴클레오티드 서열; 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상응하는 부분의 5' 말단의 업스트림인 영역 (예를 들어, 5' 말단까지의 5')에 상응하는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열; 또는 두 서열 모두에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진다.
상기 기재된 구현예에서, 주형인 핵산이 단일나선 핵산이라면, 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 나선에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지고; 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 나선에 상보적인 나선에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 즉 상기 나선에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 가지며; 래더-형성 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 나선에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지고, 그의 5'측에서, ⅰ) 상기 나선에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측의 뉴클레오티드서열, ⅱ) 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 또는 ⅲ) 두 서열 모두에 상보적인 서열을 가진다. 주형인 핵산이 이중나선 핵산인 경우, 유사한 방식으로 나선 중 하나에 대해 프라이머를 고안할 수 있다는 것도 언급될 필요가 없다.
상기 기재된 구현예 중 어떤 것에서도, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 치환될 수 있다. 상기 경우, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 기능을 보충할 수 있다. 그러므로, 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 래더 형성에 기여할 수 있는 동안 사용되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 예를 들어, 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 사용될 수 있다. 상기 경우, 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'측에서 주형인 핵산에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측의 뉴클레오티드 서열; 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역에 해당하는 뉴클레오티드 서열; 또는 두 서열 모두에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진다.
PCR 방법에 사용되는 dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP의 혼합물) 또는 그 등가물은 상기 방법에서 신장 반응의 기질로 사용되는 뉴클레오티드 트리포스페이트로 사용되는 것이 바람직하다 할 수 있다. 또한, dUTP도 기질로 사용될 수 있다. dNTP는 사용되는 DNA 중합효소에 대한 기질로 사용될 수 있는 한, dITP와 같은 뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 7-데아자-dGTP (7-deaza-dGTP)와 같은 dNTP (디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트)의 유사체를 포함한다. dNTP의 유도체 또는 dNTP의 유사체도 사용될 수 있다. 아미노기를 가진 dUTP와 같이 작용기를 가진 유도체가 함유될 수 있다. 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 방법에서 사용된다. 예를 들어, 통상적인 합성방법에 따라 DNA 합성기 (synthesizer)를 사용하여 프라이머를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에서 주형으로 사용되는 핵산 (DNA 또는 RNA)은 핵산을 함유할 수 있는 샘플이라면 어느 것에서라도 제조 또는 분리할 수 있다. 택일적으로 샘플은 본 발명의 핵산 증폭방법에서 직접적으로 사용될 수 있다. 핵산을 함유할 수 있는 샘플의 예시는 전혈 (whole blood), 혈청, 연막 (buffy coat), 오줌, 대변, 뇌척수액, 정장 (seminal fluid), 침, 조직 (예를 들어, 종양조직 또는 림프절), 및 세포배양액 (예를 들어, 포유동물 세포배양액 또는 박테리아 세포배양액)과 같은 유기체 유래 샘플; 비로이드, 바이러스, 박테리아, 진균, 효모, 식물 및 동물과 같이 핵산을 함유하는 샘플; 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로 감염되거나 오염된 것으로 추측되는 샘플; 및 토양 또는 오수와 같이 유기체를 함유할 수 있는 샘플을 포함하나, 그에 국한되는 것은 아니다. 샘플은 공지된 방법에 따라 상기 언급된 샘플을 가공하여 수득된 핵산-함유 준비물 (nucleic acid-containing preparation)일 수 있다. 예를 들어, 세포 파괴 산물 또는 상기 산물을 분별하여 수득한 샘플, 샘플 내 핵산, 또는 특정 핵산 분자집단 (예를 들어, mRNA)이 풍부한 샘플은 본 발명에 따른 준비물로 사용될 수 있다. 공지된 방법에 따라 샘플 내에 함유된 핵산을 증폭하여 수득한 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 사용하는 것도 바람직할 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 예를 들어, 핵산-함유 준비물은 계면활성제, 초음파 파쇄, 유리 비드를 사용한 흔들기/교반, 또는 프렌치 가압기 (french press)를 사용한 용해를 이용하여 상기 기재된 물질로부터 준비될 수 있다. 몇몇 경우, 핵산을 정제하기 위하여 준비물을 더 공정하는 것이 유리하다 (예를 들어, 내인성 뉴클레아제가 존재하는 경우). 몇몇 경우, 핵산은 페놀 추출, 크로마토그래피, 이온 교환, 겔 전기영동 또는 밀도-구배 원심분리와 같은 공지된 방법을 사용하여 정제된다.
RNA에서 유래한 서열을 가진 핵산을 증폭하는 것이 바람직하다면, 본 발명의 방법은 주형으로 RNA를 사용하여 역전사 반응에 의해 합성한 cDNA를 주형으로 사용하여 수행할 수 있다. 샘플 내 전체 RNA, mRNA, tRAN 또는 tRNA와 같은 RNA 분자 집단, 및 특정 RNA 분자 종을 포함한, 역전사 반응에 사용되는 프라이머를 만들 수 있는 RNA라면 어떤 것이라도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
주형으로 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하는 활성을 가진 효소라면 어떤 것이라도 제한없이 역전사 반응에 사용될 수 있다. 그의 예시는 AMV RTase (avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase), M-MLV RTase (Molony murine leukemia virus-associated reverse transcriptase), 및 RAV-2 RTase (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase)와 같은 다양한 근원에서 유래한 역전사 효소를 포함한다. 또한, 역전사 활성을 가진 DNA 중합효소가 부가적으로 사용될 수 있다. 고온에서 역전사 활성을 가지는 효소가 본 발명의 목적에 바람직하다. 예를 들어, 서머스 (Thermus) 속의 박테리아에서 유래한 DNA 중합효소 (예를 들어, Tth DNA 중합효소), 바실러스 (Bacillus) 속에서 유래한 DNA 중합효소 또는 그 등가물이 사용될 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 예를 들어, B. st 유래 DNA 중합효소 (Bst DNA 중합효소) 및 Bca DNA 중합효소와 같은, 바실러스 속 고온성 세균 (thermophilic bacteria)에서 유래한 DNA 중합효소가 바람직하다. 예를 들어, Bca DNA 중합효소는 역전사 반응을 위하여 망간 이온을 필요로 하지 않는다. 더욱이, 이는 고온의 조건 하에서, 주형 RNA의 이차적 구조 형성울 억제하면서 cDNA를 합성할 수 있다. 역전사 효소활성을 가지는, 자연적으로 생성되는 효소 및 상기 효소의 변종 모두 활성을 가지는 한 사용될 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 바람직하게는 약 6 뉴클레오티드 내지 약 50 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 10 뉴클레오티드 내지 약 40 뉴클레오티드, 더 더욱 바람직하게는 약 12 뉴클레오티드 내지 약 30 뉴클레오티드가 본 발명의 방법에 따른 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머로 사용될 수 있다. 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 사용되는 반응 조건하에서, 주형인 핵산에 어닐링할 수 있도록 주형 핵산에 상보적인 것이 바람직하다. 프라이머는 RNase H에 의해 인지되는 서열을 함유하며, 이는 3' 말단 또는 3' 말단부에서 하기 기재된 단계에 사용된다.
본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 예를 들어, 하기 일반식으로 표시되는 구조를 가진 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따른 DNA 합성방법에서 프라이머로 사용될 수 있다:
일반식: 5'-dNa-Nb-dNc-3'
(상기 일반식에서, "dN"은 디옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 나타내고, "N"은 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 나타내는데, 여기서, 뉴클레오티드의 유사체 또는 뉴클레오티드의 유도체 (변형된 뉴클레오티드)는 기능이 손상되지 않는 한, 각 뉴클레오티드에 대하여 함유되고, "dNa"에서 몇몇 dN은 N에 의해 치환된다.)
본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 상기 기재된 일반식에서, 예를 들어, "a"는 5 이상의 정수, 바람직하게는 6 이상의 정수, 더욱 바람직하게는 8 이상의 정수이고; "b"는 1 이상의 정수, 예를 들어, 1 내지 15의 정수, 바람직하게는 1 내지 10의 정수, 더욱 바람직하게는 1 내지 7의 정수, 더 더욱 바람직하게는 1 내지 5의 정수이고; "c"는 0일 수 있거나, c는 1 이상의 정수, 바람직하게는 0 내지 5의 정수, 더욱 바람직하게는 0 내지 3의 정수이다.
본 발명의 방법에 따라, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 래더-유사 증폭산물을 수득하는데 사용될 수 있다. 디옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나는 프라이머용으로 사용되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로서, 5'측에서, 주형인 핵산에 상응하는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측의 뉴클레오티드 서열; 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역에 해당하는 뉴클레오티드 서열; 또는 두 서열 모두에 상보적인 첨부된 뉴클레오티드 서열을 가진 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 주형으로 RNA가 사용된다면, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역전사를 위한 프라이머로 사용될 수 있다. 사용되는 반응 조건 하에서, 주형 RNA에 어닐링할 수 있다면 특별한 제약이 있는 것은 아니다. 프라이머는 특정 주형 RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 프라이머 (특수한 프라이머), 올리고-dT (디옥시티민) 프라이머 및 무작위적 서열을 가진 프라이머 (랜덤 프라이머 (random primer))일 수 있다. 특이적인 어닐링 면에서, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열의 일부분에 상보적인 서열의 한부분의 길이는 6 뉴클레오티드 이상인 것이 바람직하며, 9 뉴클레오티드 이상인 것은 더욱 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 합성 면에서, 길이는 100 뉴클레오티드 이하인 것이 바람직하며, 30 뉴클레오티드 이하인 것은 더욱 바람직하다. RNA를 이용한 역전사 반응에 사용될 수 있는 한 특별한 제약이 있는 것은 아니다.
사용되는 조건 하에서, 래더-유사 패턴으로 DNA 나선의 신장에 기여할 수 있는 한, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대한 특별한 제약이 있는 것은 아니다. 프라이머는 주형인 핵산에 상응하는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측의 뉴클레오티드 서열; 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역에 해당하는 뉴클레오티드 서열; 또는 두 서열 모두에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지는 것이 바람직하다. 본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 상보적인 서열의 길이는 약 3 내지 약 100 뉴클레오티드인 것이 바람직하고, 약 4 내지 약 50 뉴클레오티드인 것은 더욱 바람직하며, 약 5 내지 약 20 뉴클레오티드인 것은 더 더욱 바람직하다.
본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 상보적인 서열은 +20 위치 내지 -100 위치로부터 선택된 3 이상의 올리고뉴클레오티드이고, 바람직하게는 +15 위치 내지 -80 위치, 더욱 바람직하게는 +10 위치 내지 -60 위치, 더 더욱 바람직하게는 +5 위치 내지 -40 위치이다. 상기 뉴클레오티드 서열의 예시는 -1 위치, -11 위치, 또는 -21 위치에서 사직하는 영역을 포함하나, 그에 국한되는 것은 아니다.
기능을 나타내는 한, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링하는 부분에 있어서 특별한 제약이 있는 것은 아니다. 상기 부분은 전체적으로 오버랩하는 부분 또는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 1 내지 40 뉴클레오티드의 거리로, 그에 근접한, 또는 그에서 하나 이상의 뉴클레오티드로 오버랩하는 부분일 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 GC 함량은 40% 이상인 것이 바람직하다.
더욱이, 본 발명의 방법에 사용되는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 기질을 함유할 수 있다. 즉, DNA 중합효소의 활동에 의해 3' 말단으로부터의 중합효소 신장 반응에 영향을 주기 위한 프라이머의 기능이 파괴되지 않는 한, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체는 본 발명의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 함유될 수 있다. 복수개 타입의 뉴클레오티드 유사체가 조합하여 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 뉴클레오티드 유사체의 예시는 디옥시이노신 뉴클레오티드, 디옥시유라실 뉴클레오티드, 7-디아자구아닌 (7-deazaguanine)과 같은 변형된 염기를 가진 뉴크레오티드 유사체 및 그 등가물을 포함하나, 그에 국한되는 것은 아니다. 더욱이, 본 발명에 따라 사용된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 디옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 상기 기재된 대로 기능이 보유되는 한 고정화를 위한 작용기의 첨가 또는 표지된 화합물의 첨가와 같은 다양한 변형 중 하나를 가지는 뉴클레오티드 유사체를 함유할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 프라이머 내 삽입은 프라이머 자체의 고차 구조의 형성을 억제하는데 효과적이며, 주형에 어닐링된 형태를 안정화시키는데 효과적이다.
본 발명의 방법에 사용된 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들어, 포스포라미다이트 (phosphoramidite) 방법에 따라 Applied Biosystems Inc. (ABI)의 DNA 합성기를 사용하여 임의의 뉴클레오티드 서열을 가지도록 합성될 수 있다. 택일적으로, 포스페이트 트리에스테르 방법, H-포스포네이트 방법 및 티오포스포네이트 방법을 포함한, 어떤 방법이라도 합성을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 주형인 핵산 내에 본래부터 존재하는 뉴클레오티드 서열을 이용하여 래더-유사 증폭산물을 수득하는 것이 가능하다. 상기 경우, 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 래더 형성을 수행하는 것이 가능하다. 본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 예를 들어, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 하나의 업스트림 또는 5'측의 뉴클레오티드 서열이 다른 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 또는 5'측의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 경우, 래더-유사 증폭산물은 상기 위치에 대한 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안함으로써 효율적으로 수득할 수 있다. 검출 감도 및 검출 속도는 래더 형성을 수행함으로써 증가된다.
키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 또는 5'측에서 주형인 핵산에서 상보적인 뉴클레오티드 서열은 GC 함량, 근접한 서열, 프라이머로부터의 거리, 증폭될 길이, 반응 조건 및 그 등가물에 따라 임의로 선택될 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 예를 들어, 서열은 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단을 0의 위치로 정의할 경우 +20 내지 -100의 영역이고, 바람직하게는 +15 내지 -80, 더욱 바람직하게는 +10 내지 -60, 더 더욱 바람직하게는 +5 내지 -40이다. 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 또는 5'측에서 주형인 핵산에서 상보적인 뉴클레오티드 서열은 GC 함량, 근접한 서열, 프라이머로부터의 거리, 증폭될 길이, 반응 조건 및 그 등가물에 따라 임의로 선택될 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 상보성은 70% 이상인 것이 바람직하다.
본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 본 발명의 방법에서 사용된 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 구현예와 같이, 하기 구현예에서 사용된 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 언급하도록 기재된다.
예를 들어, A12-205R (서열번호 3)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7)의 5' 말단의 1 내지 12 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 30 위치에서 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)에 상보적인 영역에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 30 위치에서 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상응하는 서열을 구성한다.
예를 들어, A12-215R (서열번호 5)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7)의 5' 말단의 1 내지 12 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역까지 10-뉴클레오티드 서열 3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드에서 시작하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. A12-215R의 23 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 205RN3 (18)의 1 내지 8 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, A12-223R (서열번호 5)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7)의 5' 말단의 1 내지 12 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 열번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)에 상보적인 영역까지 18-뉴클레오티드 서열 3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 18번째 업스트림 뉴클레오티드에서 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18)의 첫번째 업스트림 뉴클레오티드까지의 서열에 상응하는 서열을 구성한다. A12-223R은 205RN3 (18) 가까이에 있다.
예를 들어, A12(-10)-215R (서열번호 8)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7)의 5' 말단의 11 내지 22 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-11 내지 -22)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역까지 10-뉴클레오티드 서열 3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드에서 시작하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. A12(-10)-215R의 23 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 205RN3 (18)의 1 내지 8 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, A12(-20)-215R (서열번호 9)DPTJ, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7)의 5' 말단의 21 내지 32 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-21 내지 -32)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역까지 10-뉴클레오티드 서열 3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드에서 시작하는 여역에 상응하는 서열을 구성한다. A12(-20)-215R의 23 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 205RN3 (18)의 1 내지 8 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, A12(6)-215R (서열번호 10)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7)의 1 내지 6 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -6) 및 5'측에서 6-뉴클레오티드 서열 (+5 내지 0)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역까지 10-뉴클레오티드 서열 3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 8-뉴크레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드에서 시작하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. A12(6)-215R의 23 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 205RN3 (18)의 1 SOW8 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, A12(12)-215R (서열번호 11)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7)의 5'측에서 12-뉴클레오티드 서열 (+11 내지 0)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 10-뉴클레오티드 서열3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드에서 출발하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. A12(12)-215R의 23 내지 30 위치의 뉴클레오티드는 205RN3 (18)의 1 내지 8 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, A6(-10)-215R (서열번호 14)에서, 1 내지 6 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7)의 5' 말단의 11 내지 16 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-11 내지 -16)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 7 내지 24 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역까지 10-뉴클레오티드 서열 3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 7 내지 24 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드에서 시작하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. A6(-10)-215R의 17 내지 24 위치의 뉴클레오티드는 205RN3 (18)의 1 내지 8 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, A9(-10)-215R (서열번호 15)에서, 1 내지 9 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7)의 5' 말단의 11 내지 19 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-11 내지 -19)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 10 내지 27 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역까지 10-뉴클레오티드 서열 3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 7 내지 27 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드에서 시작하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. A9(-10)-215R의 20 내지 27 위치의 뉴클레오티드는 205RN3 (18)의 1 내지 8 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, (A12)241RN3 (서열번호 19)에서, 1 내지 7 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 160FN3 (18) (서열번호 17)의 5' 말단의 1 내지 7 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -7)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 8 내지 21 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 241RN3 (서열번호 18)DP 상보적인 영역에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 8 내지 21 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상응하는 서열을 구성한다.
예를 들어, ALDH2-TH1 (서열번호 25)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN-ALDH2-F (서열번호 21)의 5' 말단의 1 내지 12 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 29 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN-ALDH2-R (서열번호 22)의 5'측에서 15-뉴클레오티드 서열에 상보적인 주형인 핵산의 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 여역까지 2-뉴클레오티드 서열 3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 이는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 15-뉴클레오티드 서열까지 두번째 업스트림 뉴클레오티드에서 시작하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. ICAN-ALDH2-R의 2 내지 16 위치의 뉴클레오티드는 ALDH2-TH1의 15 내지 29 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, ALDH2-TH2 (서열번호 26)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN-ALDH2-F (서열번호 21)의 5' 말단의 1 내지 12 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 29 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN-ALDH2-R (서열번호 22)의 5'측에서 6-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역까지 10-뉴클레오티드 서열 3'에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 29 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 6-뉴클레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드에서 시작하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. ICAN-ALDH2-R의 2 내지 7 위치의 뉴클레오티드는 ALDH2-TH2의 23 내지 28 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, ALDH2-TH3 (서열번호 27)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN-ALDH2-F (서열번호 21)의 5' 말단의 1 내지 12 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 28 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN-ALDH2-R (서열번호 22)에 상보적인 서열까지 2 내지 17 뉴클레오티드 3' 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 28 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 2 내지 17 뉴클레오티드 업스트림 서열에 상응하는 서열을 구성한다.
예를 들어, R2(-13)A12-1 (서열번호 35)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 F2 (서열번호 31)의 5' 말단의 1 내지 12 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 29 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 R2 (서열번호 32)에 상보적인 서열까지 13 내지 29 뉴클레오티드 3' 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 29 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 13 내지 29 뉴클레오티드 업스트림 서열에 상응하는 서열을 구성한다.
예를 들어, R2(-13)A12-2 (서열번호 36)에서, 1 내지 12 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 F2 (서열번호 31)의 5' 말단의 13 내지 24 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 13 내지 29 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 R2 (서열번호 32)에 상보적인 서열까지 13 내지 29 뉴클레오티드 3' 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 13 내지 29 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 13 내지 29 뉴클레오티드 업스트림 서열에 상응하는 서열을 구성한다.
예를 들어, A6-215R (서열번호 47)에서, 1 내지 6 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 B134FN3 (서열번호 12)의 5' 말단의 1 내지 6 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -6)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 7 내지 24 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (16) (서열번호 13)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역까지 10-뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 7 내지 24 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드로부터 시작하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. 205RN3 (16)의 1 내지 8 위치의 뉴클레오티드는 A6-215R의 17 내지 24 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
예를 들어, A9-215R (서열번호 48)에서, 1 내지 9 위치의 뉴클레오티드는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 B134FN3 (서열번호 12)의 5' 말단의 1 내지 9 뉴클레오티드 업스트림 영역 (-1 내지 -9)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성하고, 10 내지 27 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (16) (서열번호 13)의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열에 상보적인 영역 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역까지 10-뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 구성한다. 달리 말하자면, 7 내지 24 위치의 뉴클레오티드는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측에서 8-뉴클레오티드 서열까지 열번째 업스트림 뉴클레오티드로부터 시작하는 영역에 상응하는 서열을 구성한다. 205RN3 (16)의 1 내지 8 위치의 뉴클레오티드는 A6-215R의 20 내지 27 위치의 뉴클레오티드와 겹쳐진다.
실시예 2-(1)-(A)에 사용된, 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머간의 위치적 상관관계는 도 1에 나타난 바와 같다.
중온성 및 열-저항성 RNase H를 포함한 어떠한 RNase H라도 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 02/22831의 실시예 8에 기재된 방법에 따라 준비된 서모코커스 리트랄리스 (Thermococcus litralis) 유래의 RNase HⅡ (이하, Tli RNase HⅡ로 기재됨) 및 WO 02/22831의 실시예 7에 기재된 방법에 따라 준비된 아르캐오그로부스 펄지더스 (Archaeoglobus fulgidus) 유래의 RNase HⅡ (이하, Afu RNase HⅡ로 기재됨)는 하기 구현예에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 열-저항성 RNase H의 예시는 바실러스 속의 고온성 세균, 서머스 속의 박테리아, 피로코커스 속의 박테리아, 서모토가 속의 박테리아, 아르캐오글로부스 속의 박테리아, 및 그 등가물 유래의 RNase H 뿐만 아니라, 상용화된 RNase H, Hybridase™ 내열성 RNase H (Epicentre Biotechnologies)를 포함하나, 그에 국한되는 것은 아니다. 더욱이, 자연적으로 생기는 RNase H 및 그 변종 모두 바람직하게 사용될 수 있다.
나선 치환 활성을 가진 DNA 중합효소라면 어떠한 것이라도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 그의 예시는 대장균 (Escherichia coli: E. coli)에서 유래한 DNA 중합효소 Ⅰ의 큰 단편 (Klenow 단편) 뿐만 아니라, 바실러스 스티아로더모필러스 (이하, B. st로 기재됨) 및 바실러스 칼도테넥스 (이하, B. ca로 기재됨)와 같은 바실러스 속의 고온성세균에서 유래한 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 중합효소를 포함한다. 중온성 및 열-저항성 DNA 중합효소 모두 본 발명에 따라 바람직하게 사용될 수 있다.
B. ca는 약 70℃의 적정 성장온도를 가지는 고온성세균이다. 상기 박테이라에서 유래한 Bca DNA 중합효소는 DNA-의존성 DNA 중합효소 활성, RNA-의존성 DNA 중합효소 (역전사 활성), 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성 및 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 가진 것으로 알려져 있다. 효소는 원천에서 정제한 효소이거나 유전공학 기술을 이용하여 생산된 재조합 단백질일 수 있다. 효소는 유전공학기술 또는 다른 방법에 의해 치환, 결실, 첨가, 또는 삽입과 같은 변형을 겪게 될 수도 있다. 상기 효소의 예시는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Bca DNA 중합효소인 BcaBEST DNA 중합효소 (Takara Bio)를 포함한다. 상기 효소는 본 명세서에 기재된 미생물을 사용하여 일본특허 2978001호에 기재된 방법에 따라 준비될 수 있다.
어떤 DNA 중합효소는 특정 조건하에서, RNase H 활성과 같은 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 그러한 DNA 중합효소는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일 관점에서, DNA 중합효소는 RNase H 활성가 나타나는 특정 조건, 예를 들어, Mn2 +의 존재하에서 사용될 수 있다. 상기 경우, 본 발명의 방법은 RNase H의 첨가없이 수행될 수 있다. 그러므로, Bca DNA 중합효소는 Mn2 +를 함유한 버퍼에서 RNase 활성을 나타낼 수 있다. 상기 기재된 관점이 Bca DNA 중합효소의 사용을 제한하는 것은 아니다. 서머스 서모필러스 (Thermus thermophilus) 유래의 Tth DNA 중합효소와 같이 부가적으로 RNase H 활성을 가지는 것으로 알려진 DNA 중합효소는 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다; 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머가 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 작용할 수도 있거나; 래더-유사 증폭산물이 주형인 핵산에서 상보적인 뉴클레오티드 서열을 이용하여 수득될 수 있다. 어느 경우에라도, 목적된 증폭산물을 효과적으로 수득하기 위하여, 랜덤 프라이머의 존재하에 반응을 수행함으로써 반응을 안정시키는 것이 가능하다. 랜덤 프라이머에 관하여 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 예를 들어, 길이가 6 내지 9 뉴클레오티드인 랜덤 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.
(2) 본 발명의 조성물
본 발명은 본 발명의 핵산 증폭방법을 위해 사용되는 조성물 및 상기 기재된 본 발명의 핵산을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 조성물은 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기 (1)에 기재된 DNA 중합효소 및 RNase H를 포함할 수 있다. 조성물은 완충성분, 마그네슘 염, dNTP 및 증폭반응을 수행하기 위해 필요한 성분과 같은 그 등가물을 더 함유할 수 있다. 더욱이, 변형된 디옥시리보뉴클레오티드 또는 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체를 함유할 수 있다. 택일적으로, 완충성분 및 다른 첨가물이 사용될 수 있다.
특히 바람직한 관점에서, 조성물은 본 발명의 핵산 증폭방법을 위하여 상기 나열된 다양한 성분의 적정량을 함유할 수 있다. 증폭반응은 적합한 온도, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 래더-형성 올리고뉴클레오티드를 조성물에 첨가함으로써만이 수행될 수 있다. 증폭대상이 사전에 알려진 것이라면, 조성물은 대상을 증폭하기에 적합한 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는 것이 바람직하다.
(3) 본 발명의 키트
본 발명은 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 핵산을 증폭하기 위한 방법에 사용되는 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 키트는 포장된 형태이고, 나선 치환 반응에서 DNA 중합효소, RNase H, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용에 대한 사용서를 함유하고 있다. 또한, 나선 치환 활성을 가진 DNA 중합효소, RNase H 및 나선 치환 반응을 위한 버퍼를 함유한 키트는 본 발명에 방법을 위하여 사용되는 것이 바람직하다. 택일적으로, 나선 치환 활성을 가지는 상용화된 DNA 중합효소 및/또는 RNase H는 상기 사용서에 따라 선택되고 사용될 수 있다. 택일적으로, 키트는 RNA가 주형으로 사용될 경우 이용되는 역전사 반응을 위한 시약을 함유할 수 있다. DNA 중합효소는 상기 (1)에 기재된 대로 본 발명에 따라 사용되는 DNA 중합효소로부터 선택될 수 있다. RNase H는 상기 (1)에 기재된 RNase H로부터 선택될 수 있다.
"사용서 (instruction)"는 키트를 이용하는 방법, 예를 들어, 나선 치환 반응, 권장된 반응 조건 및 그 등가물을 위한 시약 용액을 준비하는 방법을 기술하는 인쇄된 물질이다. 사용서는 팜플렛 또는 리프렛 형태의 지침서 매뉴얼, 키트에 붙여진 라벨, 및 카트를 함유하는 패키지 표면의 설명서를 포함한다. 지침서는 인터넷과 같은 전자 미디어를 통해 제공되거나 공개되는 정보도 포함한다.
본 발명의 키트는 완충성분으로 바이신, 트리신, HEPES, 포스페이트 또는 트리스-하이드로클로라이드를 함유한 반응 버퍼 및 어닐링 용액도 함유할 수 있다. 택일적으로, 키트는 나선 치환 활성을 가진 DNA 중합효소 및 RNase H를 함유할 수 있다. 더욱이, 키트는 변형된 디옥시리보뉴클레오티드 또는 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체를 함유할 수 있다.
목적핵산을 검출하기 위한 방법에서 사용되는 키트는 상기 기재된 증폭반응을 위한 시약 및 지침서 외에도, 목적핵산을 증폭하기에 적합한 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 증폭된 목적핵산을 검출하기 위한 시약도 함유할 수 있다.
(4) 본 발명의 핵산을 검출하기 위한 방법
본 발명의 핵산을 검출하기 위한 방법을 사용하여 샘플 내 목적핵산을 검출하는 것이 가능하다. 일 구현예에서, 검출 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상기 (1)에 기재된 본 발명의 핵산을 증폭하기 위한 방법에 따라서 목적핵산을 증폭하는 단계; 및
(b) 상기 단계에서 증폭된 목적핵산을 검출하는 단계.
RNA가 단계 (a)에서 주형으로 사용된다면, 역전사 반응 및 핵산 증폭반응은 하나 또는 두 개의 단계로 수행될 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 예를 들어, AMV RTase, M-MLV RTase 또는 RAV-2 RTase와 BcaBEST DNA 중합효소의 조합은 역전사 효소와 나선-치환형 DNA 중합효소의 조합으로 사용되는 것이 바람직하다. 택일적으로, 역전사 활성 및 나선 치환 활성을 가진 DNA 중합효소가 사용될 수 있다. 예를 들어, BcaBEST DNA 중합효소가 바람직하게 사용될 수 있다.
점 돌연변이 또는 SNP (single nucleotide polymorphism)와 같이 유전자 내의 특정 뉴클레오티드에 대한 정보는 본 발명의 목적핵산 검출방법을 사용하여 획득할 수 있다. 상기 구현예에서, 사용되는 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단 부분은 구별되는 목적 뉴클레오티드 서열 내의 특정 뉴클레오티드 주변에 위치할 수 있다.
또한, 목적핵산은 완충성분으로 바이신, 트리신, HEPES, 포스페이트 또는 트리스를 함유한 반응 버퍼; 및 스페르미딘 (spermidine) 또는 프로필렌디아민을 함유한 어닐링 용액을 사용하여, 본 발명의 검출방법에 따라 핵산 샘플의 극소량에서도 높은 감도로 검출될 수 있다. 상기 경우, 사용되는 RNase H 및 DNA 중합효소는 특정한 것에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 서모코커스 속 박테리아 유래의 RNase H 및 BcaBEST DNA 중합효소의 조합이 바람직하다. RNase H 및 BcaBEST DNA 중합효소의 바람직한 단위수 (unit number)는 효소 타입에 따라 다양할 것으로 사료된다. 상기 경우, 첨가되는 효소의 양 및 버퍼의 조성물은 지수에 있는 대로, 증폭산물의 양 또는 검출 감도 상의 증가를 사용하여 조정될 수 있다.
본 발명의 검출방법에 따라, dUTP는 목적핵산의 증폭 동안 기질에 삽입될 수 있다. 그러므로, dUTP가 기질로 사용된다면, 우라실 N-글리코시데이즈 (uracil N-glycosidase: UNG)를 사용하는 증폭산물을 분해함으로써, 증폭산물의 캐리-오버 오염 (carry-over contamination)에 기인한 가양성 (false positive)을 방지하는 것이 가능하다.
공지된 핵산 검출방법은 (b) 단계에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 전기영동에 의해 특정 크기를 가지는 반응산물의 검출, Smart Cycler (Takara Bio)를 이용한 실시간 검출, Rotor 유전자 (Corbett Research) 또는 그 등가물, 또는 프로브를 이용한 하이브리다이제이션에 의한 검출이 사용될 수 있다. 더욱이, 조합에서 마그네틱 비드를 이용하는 검출방법이 바람직하게 사용될 수 있다. 반응 혼합물은 목적핵산의 증폭단계에서 생성된 피로인산을 마그네슘 염과 같은 불용성 기질로 전환하여 탁하게 만들어질 수 있고, 그 다음 탁도가 측정될 수 있다.
EtBr과 같은 형광 기질은 대개 전기영동을 이용한 검출에 사용된다. 프로브를 이용한 하이브리다이제이션은 전기영동에 의한 검출과 조합될 수 있다. 프로브는 방사성 동위원소 또는 바이오틴 혹은 형광 기질과 같은 비-방사성 기질로 표지될 수 있다. 실시간 검출이 실행될 수 있다면, SYBR Green (Takara Bio)과 같은 착색제가 바람직하게 사용될 수 있다. 부가적으로, (a) 단계에서 표지된 뉴클레오티드의 사용은 표지된 뉴클레오티드가 삽입되는 증폭산물의 검출을 용이하게 할 수 있거나, 라벨을 이용하는 검출을 위한 신호를 증진시킬 수 있다. 형광성 편광 방법, 형광에너지 전이 또는 그 등가물도 검출을 위하여 사용될 수 있다. 목적핵산은 적합한 검출 시스템을 구성함으로써 자동적으로 검출되거나 정량될 수 있다. 또한 하이브리드 크로마토그래피 방법을 이용하여 육안으로 검출하는 것이 바람직하게 사용될 수 있다.
퀸칭 상태를 야기하는 거리에 위치한 2개 이상의 형광성 기질로 표지된, 리보뉴클레오티드 (RNA) 프로브, 또는 리보뉴클레오티드 및 디옥시리보뉴클레오티드로 구성된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프로브는 본 발명의 검출방법에서 사용될 수 있다. 상기 프로브는 형광을 방출하지 않는다. 프로브에 상보적인 목적핵산으로부터 증폭된 DNA에 어닐링될 때, RNase H는 프로브를 분해한다. 그런 다음, 프로브에서 형광성 기질 간의 거리가 증가하여, 형광을 방출하게 된다. 그러므로, 방출은 목적핵산의 존재를 나타낸다. RNase H가 본 발명의 핵산 증폭방법에 사용된다면, 목적핵산은 반응 혼합물에 프로브를 첨가하는 것만으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 형광성 기질 ROX (Applied Biosystems) 또는 FAM (Applied Biosystems)과 Eclipse (Epoch Biosciences)의 조합은 프로브를 표지하는데 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 프로브는 정상적인 하이브리다이제이션 조건하에서, 본 발명의 핵산 증폭방법에 따라 증폭된 목적핵산에 하이브리다이제이션할 수 있는 한, 특정한 것에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 증폭산물의 특이적인 검출 면에서, 엄격한 것으로 해당분야의 숙련된 기술을 가진 자에게 알려진 조건하에서 하이브리다이제이션하는 프로브가 바람직하다. 엄격한 하이브리다이제이션 조건은 에를 들어, T. Maniatis et al. (eds.), Molecular Cloning" A Laboratory Manual 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory에 기재되어 있다. 특히, 엄격한 조건은 다음과 같이 예시된다: 0.5% SDS 함유 6 X SSC (1 X SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M 구연산나트륨, pH 7.0), 5 X Denhardt's (0.1% BSA (bovine serum albumin), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% Ficoll 400) 및 연어 정자의 DNA 100 μg/ml에서, 하룻밤 (overnight)에 4시간 동안 사용되는 프로브의 Tm값 보다 약 25℃ 낮은 온도에서 배양. 상기 기재된 대로 표지를 가지는 프로브는 목적핵산의 검출을 촉진하기 위한 프로브로 사용될 수 있다.
증폭된 부분이 서로서로 연결된 래더-유사 증폭산물은 본 발명의 핵산 검출방법에 따라 명확하게 생성된다. 래더-유사 증폭산물에서, 다수의 증폭된 부분은 같은 방향으로 임의의 뉴클레오티드 서열을 통해 중합된다. 증폭산물은 전기영동에 의한 증폭산물의 분석을 통해 래더-유사 밴드로 관찰된다. 래더-유사 증폭산물의 생성은 증폭될 영역, 영역의 크기, 인접한 영역, 사용되는 키멜릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 반응 조건 및 그 등가물에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 검출방법에 따라, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 키멜릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 증폭된 부분이 서로서로 연결된 중합체를 생성하는데 사용될 수 있다. 래더-유사 증폭산물에서, 다수의 증폭된 부분은 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'측 또는 업스트림 부분에 상보적인 서열 및 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 통해 동일한 방향으로 서로서로 연결되어 있다. 더욱이, 본 발명의 방법에 따라, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 하나의 업스트림 또는 5'측에서 주형 핵산의 뉴클레오티드 서열이 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 또는 5'측의 뉴클레오티드 서열에 상보적이라면, 목적핵산은 그 부분에 대한 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안함으로써 고감도로 검출할 수 있다.
래더-유사 증폭산물은 복수개의 증폭된 부분을 함유한다. 그러므로, 예를 들어 적합한 프로브의 많은 복제본과 하이브리다이제이션할 수 있다. 래더-유사 증폭산물에서 목적핵산서열 간에 존재하는 개재서열 및/또는 목적핵산의 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이제이션하는 것은 프로브와 같은 것으로 바람직하게 사용될 수 있다. 강력한 신호가 그에 따라 방출되므로, 증폭된 부분을 함유하는 핵산이 검출된다면 본 발명은 유용하다. 제한효소 절단 또는 그 등가물을 조합하여 사용함으로써 래더-유사 증폭산물에서 단량체로 증폭된 부분 또는 그의 일부분을 수득하는 것이 가능하다.
본 발명의 등온 핵산 증폭방법은 온도 사이클러와 같은 장치의 사용을 필요로 하지 않는다. PCR 및 그 등가물을 위한 dNTP와 같은 시약이 상기 방법에 적용될 수 있으므로, 통상적인 방법에 비해 관리비용을 경감시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 예를 들어 검출이 일상적으로 수행되는 유전자하기PCR보다 짧은 시간에 더 많은 양의 증폭산물을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 방법은 용이하고, 빠르며, 민감한 유전자 검출방법으로 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 2-(1)-(A)에 사용된, 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 간의 위치적 상관관계를 나타낸 것이다. (a)는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 나타낸 것이고, (b) 내지 (d)는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 나타낸 것이고, (e)는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 나타낸 것이다. (b) 내지 (d)에서 각각의 부분 1은 (e)의 5' 업스트림 부분의 상보적인 나선에서 부분 1에 상응하는 서열을 가진다.
도 2는 다양한 카피수 (copy number)에 대한 증폭 곡선을 나타낸 것이다. 도 2에서 가로 축은 카피수를 나타낸다. 도 2에서, a, b, c, d, e 및 f는 각각 주 형의 105 카피, 104 카피, 103 카피, 102 카피, 101 카피, 및 100 카피를 이용하여 얻은 증폭 곡선을 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 자세히 설명하는 것으로, 그 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
비교예 1
실시예에서 열-저항성 RNase H의 단위수는 다음과 같이 계산하였다.
폴리(rA) 용액 및 폴리(dT) 용액을 준비하기 위하여, 폴리(rA) (Amersham Biotech) 또는 폴리(dT) (Amersham Biotech) 1mg을 1 mM EDTA 함유 40 mM Tris-HCl (pH 7.7)에 용해시켰다.
폴리(rA) 용액 (최종농도: 30 μg/ml) 및 폴리(dT) 용액 (최종농도: 20 μg/ml)을 20 mM HEPES-KOH (pH 7.8), 100 mM 칼륨 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드 및 0.01% BSA에 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 폴리(rA)-폴리(dT) 용액을 준비하기 위하여, 1/100 부피의 400 mM 마그네슘 아세테이트를 거기에 첨가하였다.
적절하게 희석한 효소용액 8 μl을 폴리(rA)-폴리(dT) 용액 800 μl에 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 20분 동안 반응시켰다. 그 변화를 관찰하기 위하여, 흡광도 (A260)을 시간 동안 내내 측정하였다. 특히, 효소반응에 의해 폴리(rA)-폴리(dT) 하이브리드에서 방출된 뉴클레오티드의 농도는 흡광도의 차이에 준하여 결정하였다. RNase H 1 유닛은 하기 식에 따라 계산된 20분 동안 뉴클레오티드 1 nM의 방출에 해당하는 A260을 증가시키는 효소의 양으로 정의하였다"
유닛 = 분당 흡광도의 변화 x 57.1 x 희석 비율
실시예 1
(1) 주형 RNA의 준비
RT-ICAN을 위해 주형으로 사용되는 RNA 전사체 (transcript)는 in vitro 전사에 의해 합성된다.
in vitro 전사에서 주형으로 사용되는 플라스미드 DNA는 인공적인 합성 유전자 제조 커미션 서비스 (Takara Bio)에 의해 합성되었다. 사스 (중증급성호흡기증후군) 코로나 바이러스 (GenBank Acc. No.: AY278741)의 게놈 서열의 18133 위치 내지 18362 위치의 서열 (서열번호 1)이 사용되었다. 플라스미드로 삽입되는 HindⅢ 및 BamHI에 대한 인식 서열은 각각 서열의 5' 말단 및 3' 말단으로 삽입되었다. 이 단편은 pBluescriptII SK (+)의 HindⅢ 장소 및 BamHI 장소 사이에 삽입되었다. T7 RNA 중합효소를 사용하는 in vitro 전사를 위한 주형으로 사용되는, 선형 DNA를 수득하기 위하여, 생성된 플라스미드를 BamHI으로 절단하였다.
in vitro 전사를 위하여 MEGAscript T7 카트 (Ambion)를 사용하였다. in vitro 전사에서, DNase I 처리 및 RNA 정제는 키트에 첨부된 지침서에 따라 수행하 였고, 합성된 RNA의 농도는 OD260에 준하여 측정하였다. RNA 희석 버퍼 (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 10 mM NaCl, E. coli 16S+23S rRNA 30 μg/ml (Boehringer Ingerheim))를 이용하여 100 내지 105 복제본/μl의 농도로 적정된 RNA 용액은 RT-ICAN을 위한 주형으로 사용하였다.
(2) 2-단계 RT-ICAN의 검사
(A) 검사 1
역전사 프라이머의 5' 말단에서, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림에 어닐링하는 서열의 부착에 따른 효과를 검사하였다.
역전사 프라이머로서, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드를 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용에 의한 RT-ICAN의 감도 및 검출 속도 상의 변화를 검사하였다.
실시예 1-(1)에서 준비된 RNA 주형의 농도는 OD260의 값에 준하여 계산하였고, 100, 101, 102 ,103 , 104 또는 105 복제본/μl으로 적정되었다. 최종농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 10 μl 가 준비되었다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼륨 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 역전사 프라이머인 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2), 프라이머 A12-205R (서열번호 3), 프라이머 215R (서열번호 4), 프라이 머 A12-215R (서열번호 5) 또는 프라이머 A12-223R (서열번호 6) 1 pM, RTase M-MLV (Takara Bio) 12.5 U 및 다양한 복제본를 가지는 주형 RNA 중 어느 한 RNA 1 μl.
반응 혼합물은 개인용 온도 사이클러 (Takara Bio)에 넣고, 45℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 4℃로 냉각하였다. 역전사 반응 이후, 최종 농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 15 μl를 냉각시킨 반응 혼합물에 첨가하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 134FN3 (18) (서열번호 7) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 205RN3 (18) 각각 25 pM, BcaBEST 11 U (Takara Bio), WO 02/22831의 실시예 8에 기재된 방법에 따라 준비한 Tli RNase HII 0.05 U, 및 SYBR Green (Takara Bio). ICAN 반응은 실시간으로 증폭산물을 검출하기 위하여 Rotor 유전자 (Corbett Research)를 사용하여 55℃에서 수행하였다. 또한, 반응산물은 3% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동에 의해 검출하였다.
그 결과, 프라이머 205RN3 (18)를 이용한 역전사를 통한 RT-ICAN의 감도는 104 복제본이였다. 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 같은 위치에서 가지는 역전사 프라이머 A12-205R을 사용했을 때, 감도는 예를 들어, 2차의 크기 (magnitude)에 의해 증가된 102 복제본이었다. 또한, 105 복제본에 대한 검출 속도는 약 2분까지 증가하였다.
유사하게, 프라이머 215R DNA를 이용한 역전사에 의한 RT-ICAN의 감도는 103 복제본이었다. 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 같은 위치에서 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12-215R을 역전사를 위하여 사용했을 때, 감도는 예를 들어, 3차의 크기에 의해 증가된 100 복제본이었다. 또한, 105 복제본에 대한 검출 속도는 약 2분까지 증가하였다.
더욱이, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12-223R을 역전사를 위하여 사용했을 때, 감도는 101 복제본이었다.
상기 기재된 바와 같이, 감도 및 검출 속도 상의 증가는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 같은 위치에서 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 역전사를 위하여 사용되었을 때, 프라이머가 어닐링하는 주형 RNA의 부분에 관계없이 관찰되었다.
(B) 검사 2
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 그의 일부분의 업스트림 영역에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열 (-1 내지 -12, -11 내지 -22, -21 내지 -32, +5 내지 -6, +11 내지 0)의 위치가 변하는 동안, 역전사 프라이머로 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 유사한 검사를 수행하였다.
먼저, 실시예 1-(1)에서 준비한 주형 RNA의 농도를 OD260 값에 준하여 계산하고, 100, 101, 102 ,103 , 104 또는 105 복제본/μl으로 적정되었다.
최종농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 10 μl 가 준비되었다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼륨 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 역전사 프라이머인 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 프라이머 215R, 프라이머 A12-215R, 프라이머 A12(-10)-215R (서열번호 8), 프라이머 A12(-20)-215R (서열번호 9), 프라이머 A12(6)-215R (서열번호 10), 또는 프라이머 A12(12)-215R (서열번호 11) 1 pM, RTase M-MLV (Takara Bio) 50 U 및 다양한 복제본를 가지는 주형 RNA 중 어느 한 RNA 1 μl.
반응 혼합물은 개인용 온도 사이클러 (Takara Bio)에 넣고, 45℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 4℃로 냉각하였다. 역전사 반응 이후, 최종 농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 15 μl를 냉각시킨 반응 혼합물에 첨가하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 B134FN3 (16) (서열번호 12) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 205RN3 (16) (서열번호 13)각각 25 pM, BcaBEST 11 U (Takara Bio), WO 02/22831의 실시예 8에 기재된 방법에 따라 준비한 Tli RNase HII 0.05 U, 및 SYBR Green (Takara Bio). ICAN 반응은 실시간으로 증폭산물을 검출하기 위하여 Rotor 유전자 (Corbett Research)를 사용하여 55℃에서 수행하였다. 또한, 반응산물은 3% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동에 의해 검출하였다.
그 결과, 프라이머 215R을 이용한 역전사를 통한 RT-ICAN의 감도는 102 복제본이였다. 예를 들어, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 같은 위치에서 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12-215R을 사용했을 때, 감도는 1차의 크기에 의해 증가된 101 복제본이었다. 또한, 105 복제본에 대한 검출 속도는 약 3분까지 증가하였다.
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-11 내지 -22)에 어닐링하는 5' 말단에서 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12(-10)-215R이 사용되었을 때, 감도는 프라이머 215R을 사용했을 때와 동일한 102 복제본이었다. 105 복제본에 대한 검출 속도는 약 2분까지 증가하였다. 102 내지 105 복제본의 검출은 프라이머 215R을 사용한 경 우보다 더 양이 많았다 (상관계수: 0.997).
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-21 내지 -32)에 어닐링하는 5' 말단에서 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12(-20)-215R이 사용되었을 때, 감도는 1차의 크기에 의해 증가된 101 복제본이었다. 또한, 105 복제본에 대한 검출 속도는 약 2.5분까지 증가하였다.
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 일부분 및 업스트림 영역에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12(6)-215R, 또는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 일부분에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12(12)-215R이 사용되었을 때, 검출 감도 및 검출 속도 상의 증가도 상기 기재된 프라이머의 경우와 같이 관찰되었다.
상기 기재한 바와 같이, 감도 및 검출 속도 상의 증가는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열의 위치를 변화시키는 동안, 각 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 관찰되었다.
(C) 검사 3
역전사 프라이머인 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 6-, 9-, 또는 12-뉴클레오티드 서열 (-11 내지 -16, -11 내지 -19, 또는 -11 내지 -22)을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 RT-ICAN의 감도 및 검출 속도를 검사하였다.
먼저, 실시예 1-(1)에서 준비한 주형 RNA의 농도를 OD260 값에 준하여 계산하고, 100, 101, 102 ,103 , 104 또는 105 복제본/μl으로 적정되었다.
최종농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 10 μl 가 준비되었다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼륨 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 역전사 프라이머인 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 프라이머 215R, 프라이머 A6(-10)-215R (서열번호 14), 프라이머 A9(-10)-215R (서열번호 15), 또는 프라이머 A12(-10)-215R 1 pM, RTase M-MLV (Takara Bio) 50 U 및 다양한 복제본를 가지는 주형 RNA 중 어느 한 RNA 1 μl.
반응 혼합물은 개인용 온도 사이클러 (Takara Bio)에 넣고, 45℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 4℃로 냉각하였다. 역전사 반응 이후, 최종 농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 15 μl를 냉각시킨 반응 혼합물 10 μl에 첨가하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 B134FN3 (16) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 205RN3 (16) 각각 25 pM, BcaBEST 11 U (Takara Bio), Tli RNase HII 0.05 U, 및 SYBR Green. ICAN 반응은 실시간으로 증폭산물을 검출하기 위하여 Rotor 유전자 (Corbett Research)를 사용하여 55℃에서 수행하였다. 또한, 반응산물은 3% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동에 의해 검출하였다.
그 결과, 프라이머 215R을 이용한 역전사를 통한 RT-ICAN의 감도는 103 복제본이였다. 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-11 내지 -16)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 6-뉴클레오티드 서열을 같은 위치에서 가지는 동일한 위치에 대한 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A6(-10)-215R을 사용했을 때, 감도는 예를 들어, 1차의 크기에 의해 증가된 102 복제본이었다. 또한, 105 복제본에 대한 검출 속도는 약 1분까지 증가하였다.
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-11 내지 -22)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 같은 위치에서 가지는 동일한 위치에 대한 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12(-10)-215R을 사용했을 때, 감도는 예를 들어, 2차의 크기에 의해 증가된 101 복제본이었다. 또한, 105 복제본에 대한 검출 속도는 약 2.5분까지 증가하였다.
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-11 내지 -22)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12(-10)-215R을 사용했을 때, 감도는 예를 들어, 2차의 크기에 의해 증가된 101 복제본이었다. 또한, 105 복제본에 대한 검출 속도는 약 3분까지 증가하였다.
상기 기재된 바와 같이, 뉴클레오티드에 부착된 다양한 수를 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 중에서, 감도 및 검출 속도 상의 증가는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트립 영역에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 6 뉴클레오티드 또는 그 이상의 서열을 가진 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 관찰하였다. 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 어닐링된 뉴클레오티드 서열의 수가 많을수록 더 좋은 효과를 유발한다는 것을 확인하였다.
(D) 검사 4
RT-ICAN의 검출 속도 및 정량은 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머, A12-215R을 사용하여 검사하였다.
먼저, 실시예 1-(1)에 의해 준비된 주형 RNA의 농도는 OD260의 값에 준하여 계산하였고, 100, 101, 102 ,103 , 104 또는 105 복제본/μl으로 적정되었다. 최종농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 10 μl 가 준비되었다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼륨 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 프라이머 205RN3 (18) (서열번호 2), 프라 이머 A12-215R 1 pM, RTase M-MLV (Takara Bio) 50 U 및 다양한 복제본를 가지는 주형 RNA 중 어느 한 RNA 1 μl.
반응 혼합물은 개인용 온도 사이클러 (Takara Bio)에 넣고, 45℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 4℃로 냉각하였다. 역전사 반응 이후, 최종 농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 15 μl를 냉각시킨 반응 혼합물 10 μl에 첨가하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 B134FN3 (16) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 205RN3 (16) 각각 25 pM, BcaBEST 11 U (Takara Bio), Tli RNase HII 0.05 U, 및 SYBR Green. 매 사이클(1분)마다 실시간으로 증폭산물을 검출하기 위하여, Rotor 유전자 (Corbett Research)를 사용하여 ICAN 반응을 55℃에서 수행하였다. 또한, 반응산물은 3% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동에 의해 검출하였다.
증폭 곡선은 표 2에 나타낸 바와 같다. 표 2에 나타난 바와 같이, 101 내지 105 복제본은 정량적으로 검출되었다 (상관계수: 0.992). 10 복제본까지의 저하에 대한 반응의 상승은 10 사이클 이내에 관찰되었다.
더욱이, 크로마토그래피 스트립 (strip) 상의 개발에 의한 프로브 하이브리다이제이션 방법을 통하여 증폭산물도 관찰되었다.
크로마토그래피 스트립 (strip) 상의 개발에 의한 프로브 하이브리다이제이 션 방법을 통한 증폭산물의 관찰은 첨부된 지침서에 기재된 검출 방법에 따라 Takara Bed-Side ICAN blaIMP 검출 키트에 함유된 검출 셋트를 사용하여 수행하였다. 검출에 있어서, FITC-표지 프로브 SARS-BNI-B (서열번호 16)을 함유한 프로브 용액을 프로브로 사용하였고, 키트에 함유된 blaMP 프로브 용액 및 IC 프로브 용액은 사용하지 않았다.
그 결과, 100 내지 105 복제본을 가지는 반응으로부터 증폭산물에 해당하는 붉은 빛을 띈 보라색 라인이 관찰되었으며, 이는 특정 증폭을 나타낸다.
(3) 1-단계 RT-ICAN의 검사
(A) 검사 1
래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 서열을 가지는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용에 따른 효과를 검사하였다.
RT-ICAN의 감도 및 검출 속도는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -7)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 7-뉴클레오티드 서열을 가지는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 검사하였다.
7-뉴클레오티드 서열이 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단에 부착한 결과, 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단에서 유래한 12 뉴클레오티드의 서열은 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업 스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 서열을 구성하였다. 역전사 반응 및 ICAN 반응은 동일한 튜브에서 동시에 수행되었다.
먼저, 실시예 1-(1)에서 준비된 주형 RNA의 농도는 OD260의 값에 준하여 계산하였고, 100, 101, 102 ,103 , 104 또는 105 복제본/μl으로 적정되었다. 다양한 복제수를 가지는 주형 RNA 중 어느 한 RNA 1 μl을 최종농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 24 μl 에 첨가하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼륨 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머로 프라이머 160FN3 (서열번호 17) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머로 프라이머 241RN3 (서열번호 18), 또는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머로 프라이머 (A12)241RN3 (서열번호 19) 각 25 pM, RTase M-MLV (Takara Bio) 50 U, BcaBEST 11 U (Takara Bio), Tli RNase HII 0.05 U 및 SYBR Green (Takara Bio). 실시간 방식으로 증폭산물을 검출하기 위하여, Rotor 유전자 (Corbett Research)를 사용하여 반응 혼합물을 45℃에서 5분 동안 배양하고, 55℃에서 45분 동안 배양하였다. 또한, 반응산물은 3% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동에 의해 검출하였다.
그 결과, 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머로 프라이머 241RN3를 사용한 RT-ICAN의 감도는 105 복제본이었다. 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -7)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 7-뉴클레오티드 서열을 가지는 프라이머 (A12)241RN3를 사용했을 때, 감도는 예를 들어, 2차 의 크기에 의해 증가된 103 복제본이었다. 또한, 105 복제본에 대한 검출 속도는 약 1분까지 증가하였다.
상기 기재된 바와 같이, 래더-형성 프라이머인 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 서열을 가지는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 감도 및 검출 속도 상의 증가를 관찰하였다.
(B) 검사 2
1-단계 RT-ICAN 반응에 대한, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 영향을 검사하였다.
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 역전사 반응과 ICAN 검출이 동일한 튜브에서 동시에 수행되는 1-단계 RT-ICAN 반응 시스템에 첨가하고, 감도 및 검출 속도를 검사하였다.
먼저, 실시예 1-(1)에서 준비된 주형 RNA의 농도는 OD260의 값에 준하여 계산하였고, 100, 101, 102 ,103 , 104 또는 105 복제본/μl으로 적정되었다. 다양한 복제수를 가지는 주형 RNA 중 어느 한 RNA 1 μl을 최종농도에서 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼륨 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머로 프라이머 134FN3 (서열번호 20) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머로 프라이머 205RN3 각 25 pM, RTase M-MLV (Takara Bio) 50 U, BcaBEST 11 U (Takara Bio), Tli RNase HII 0.05 U 및 SYBR Green (Takara Bio)하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 24 μl; 또는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 프라이머 A12-223R 2.5 pM을 더 함유하는 반응 혼합물 24 μl에 첨가하였다. 실시간 방식으로 증폭산물을 검출하기 위하여, Rotor 유전자 (Corbett Research)를 사용하여 반응 혼합물을 45℃에서 5분 동안 배양하고, 55℃에서 45분 동안 배양하였다. 또한, 반응산물은 3% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동에 의해 검출하였다.
그 결과, 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 프라이머 A12-223R을 첨가하지 않은 1-단계 RT-ICAN의 감도는 103 복제본이였다. 프라이머 A12-223R을 첨가하였을 때, 감도는 예를 들어, 1차의 크기에 의해 증가된 102 복제본이었다. 또한, 103 복제본에 대한 검출 속도는 약 4분까지 증가하였다.
상기 기재된 바와 같이, 1-단계 RT-ICAN 반응에 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 첨가한 결과, 감도 및 검출 속도 상의 증가가 관찰되었다.
실시예 2
(1) 사이클링 프로브 방법에 따른 실시간 검출 시스템을 사용한 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자 (ALDH2)에서 다형성 검출에 대한 영향 검사
ICAN 반응 및 사이클링 프로브 방법을 사용한 실시간 검출로 다형성의 검출에 대한 영향을 검사하였다. 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 효소를 코딩하는 유전자는 검출되는 대상으로 선택되었다. 487 위치에서 글루탐산 (GAA)이 라이신 (AAA)으로 대체되는 SNP는 상기 유전자의 엑손 12에 존재하며, 알코올-흡수와 관련된 경향에서 개체간의 차이에 깊이 관련되어 있고, 발암형상에도 깊이 관여되어 있다.
ICAN 반응 시스템에서 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자의 다형성을 검출하기 위하여, DNA 합성기 (Applied Biosystems)를 사용해서 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 해당하는 프라이머 ICAN-ALDH2-F (서열번호 21) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 해당하는 프라이머 ICAN-ALDH2-R (서열번호 22)를 합성하였다. 야생형 ALDH2 wG를 검출하기 위한 프로브 (서열번호 23) 및 돌연변이형 ALDH2 mA를 검출하기 위한 프로브 (서열번호 24)를 합성하였다. 야생형 ALDH2 wG를 검출하기 위한 프로브는 3' 말단에 부착된 퀸칭 라벨인 이클립스 (Epoch Bioscience) 및 5' 말단에 부착된 형광 라벨인 ROC 라벨 (Applied Biosystems)을 가지는 DNA-RNA-DAN-타입 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 돌연변이형 ALDH2 mA를 검출하기 위한 프로브는 3' 말단에 부착된 퀸칭 라벨인 이클립스 (Epoch Bioscience) 및 5' 말단에 부착된 형광 라벨인 FAM 라벨 (Applied Biosystems)을 가지는 DNA-RNA-DAN-타입 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
또한, 프라이머 ICAN-ALDH2-R 주변에 고안된 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12- 뉴클레오티드 서열을 가지는 하기 각각의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다: ALDH2-TH1 (서열번호 25; 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN-ALDH2-R에 관한 -1 내지 +15); ALDH2-TH2 (서열번호 26; 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN-ALDH2-R에 관한 -9 내지 +6); 및 ALDH2-TH2 (서열번호 27; 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN-ALDH2-R에 관한 -17 내지 -2).
QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)를 사용하여, 항응고제로 EDTA를 사용하는 것에 대한 사전 동의를 얻은 다음 수집된 혈액 샘플로부터 주형인 게놈 DNA를 준비하였다.
ICAN 반응을 위한 반응조건은 다음과 같다. 간단하게, 최종농도에서 하기 성분을 함유하는 최종부피가 25 μl인 반응 혼합물을 준비하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 5 mM 마그네슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.04% 프로필렌디아미드, 0.11% BSA, 각 dNTP 600 μM, BcaBEST DNA 중합효소 4 U, Tli RNase HII 100 U, 프라이머 ICAN-ALDH2-F 및 프라이머 ICAN-ALDH2-R 각각 50 pM, 프로브 ALDH2 wG 5.5 pM, 프로브 ALDH2 mA 6 pM, 주형인 게놈 DNA 100 ng, 및 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 ALDH2-TH1, ALDH2-TH2 또는 ALDH2-TH3 1 pM 첨가 또는 미첨가 무균수. 반응 혼합물을 Smart Cycler (Takara Bio)에 넣고, 70℃에서 5분 동안 처리한 다음, 56℃에서 60분 동안 반응시켰다. 56℃에서 배양하는 동안 1분 간격으로 형광 강도를 측정하였다.
또한, 프라이머 ALDH2-F (서열번호 28) 및 ALDH2-R (서열번호 29) 쌍 및 주형인 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 생성된 증폭산물은 Microcon-30 (Millipore)를 사용하여 정제한 다음, Eco 57I를 사용하여 절단하여 3% Nusive 3:1 아가로즈 겔 (Takara Bio) 상에서 전기영동하였다.
PCR은 TaKaRa ExTaq (Takara Bio)을 사용하여 수행하였다. 상세히 설명하자면, 먼저 최종농도에서 하기 성분을 함유하는 최종부피 50 μl의 반응 혼합물을 준비하였다: 1X ExTaq 버퍼, 각 dNTP 200 μM, ExTaq 1.25 U, 프라이머 ALDH2-F 및 ALDH2-R 각각 10 pM, 주형 핵산으로 준비된 게놈 DNA 5 μl, 및 정제수. 반응 혼합물을 Thermal Cycler SP (Takara Bio)에 넣고, 94℃에서 30CH 동안 가열한 다음, 94℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 30초의 사이클을 30회 빈복하였다.
Eco 57I는 CTGAAG를 인식하는 제한요소이다. 이는 야생형 알데하이드 디하이드로저네이즈 2에서 유래한 증폭산물은 절단하지만, 돌연변이형에서 유래한 증폭산물은 절단하지 못한다.
Eco 57I를 사용한 PCR RFLP에 따라 3개의 단편 (절단 또는 비절단 증폭산물)이 관찰되는 게놈 DNA 샘플 (예를 들어, 이형접합체 (heterozygotic)로 간주됨)이 사용되었을 때, 하기 표 1 및 2에 나타난 바와 같이, ALDH2-Th1, ALDH2-Th2 또는 ALDH2-Th3의 첨가에 따라 Ct 수치 상의 감소가 관찰되었으며, 이는 반응성의 증가를 나타낸다. Ct 수치는 샘플에 대한 증폭 곡선이 역치선과 교차하는 지점이다 (100). ALDH2-Th1 또는 ALDH2-Th2가 첨가될 때 (ALDH2-Th3의 경우는 제외), FAM에서 방출되는 형광 강도 상의 증가가 관찰되었고, 이는 검출 효율 상의 증가를 나타낸다.
Ct 수치 상의 변화
미첨가 ALDH2-TH1 ALDH2-TH2 ALDH2-TH3
ROX (야생형) 30.3-33.03 21.01-23.87 21.06-27.37 22.91-24.05
FAM (돌연변이) 36.45-40.44 22.9-28.0 25.65-27.98 24.83-34.71
형광 강도
미첨가 ALDH2-TH1 ALDH2-TH2 ALDH2-TH3
ROX (야생형) 350-340 330-350 350-370 340-380
FAM (돌연변이) 150-245 285-370 370-380 145-250
Eco 57I를 사용한 PCR RFLP에 따라 2개의 단편 (절단 증폭산물)이 관찰되는 게놈 DNA 샘플 (예를 들어, 야생형에 대하여 이형접합체 (heterozygotic)로 간주됨)이 사용되었을 때, 프로브 ALDH2 wG에서 방출된 ROX 형광 시그널만이 관찰되었다. Eco 57I를 사용한 PCR RFLP에 따라 1개의 단편 (비절단 증폭산물)이 관찰되는 게놈 DNA 샘플 (예를 들어, 돌연변이 형에 대하여 동종접합성 (homozygotic)으로 간주됨)이 사용되었을 때, 프로브 ALDH2 mA에서 방출된 6-FAM 형광 시그널만이 관찰되었다. 위와 같은 경우, Ct 수치 상의 감소가 관찰되었고, 이는 반응성의 증가를 나타낸다. Ct 수치는 샘플에 대한 증폭 곡선이 역치선과 교차하는 지점이다 (100).
(2) ALDH2 다형성에 있어서 반응 시스템에 첨가된 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단에 부착된 뉴클레오티드 서열의 영향 검사
실시예 2-(1)에 기재된 바와 ICAN 반응 및 사이클링 프로브 방법을 사용하여 실시간 검출을 통한 다형성의 검출에 대한 영향과 관련하여, 검출되는 대상으로 선정된 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 효소를 코딩하는 유전자의 검출에 대한 반응 시스템에 첨가되는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단에 부착된 뉴클레오티드 서열의 영향을 검사하였다.
실시예 2-(1)에서와 같이, ICAN 반응 시스템을 통해 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자에서의 다향성을 검출하기 위하여, 프라이머 ICAN-ALDH2-F, 프라이머 ICAN-ALDH2-R, 야생형 ALDH2 wG를 검출하기 위한 프로브 및 돌연변이형 ALDH2 mA를 검출하기 위한 프로브를 사용하였다. 야생형 ALDH2 wG를 검출하기 위한 프로브는 3' 말단에 부착된 퀸칭 라벨인 이클립스 및 5' 말단에 부착된 형광 라벨인 ROC 라벨을 가지는 DNA-RNA-DAN-타입 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 돌연변이형 ALDH2 mA를 검출하기 위한 프로브는 3' 말단에 부착된 퀸칭 라벨인 이클립스 및 5' 말단에 부착된 형광 라벨인 FAM 라벨을 가지는 DNA-RNA-DAN-타입 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
또한, 프라이머 ICAN-ALDH2-R의 주변에 고안된 프라이머 ICAN-ALDH2-F의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 ALDH2-TH2 (키메릭 프라이머 ICAN-ALDH2-R에 관한 -9 내지 +6), 및 제거되는 프라이머 ALDH2-TH2의 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 프라이머 ALDH2-TH4를 합성하였다.
QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)를 사용하여, 항응고제로 EDTA를 사용하는 것에 대한 사전 동의를 얻은 다음 수집된 혈액 샘플로부터 주형인 게놈 DNA를 하고, RFLP 타이핑을 통해 이형접합체인 것으로 확인된 것을 사용하였다.
ICAN 반응을 위한 반응조건은 하기 기재한 바와 같다. 간략하게, 최종농도에서 하기 성분을 함유하는 최종부피 25 μl의 반응 혼합물을 준비하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 5 mM 마그네슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.04% 프로필렌디아미드, 0.11% BSA, 각 dNTP 600 μM, BcaBEST DNA 중합효소 4 U, Tli RNase HII 100 U, 프라이머 ICAN-ALDH2-F 및 ICAN-ALDH2-R 각각 50 pM, 프로브 ALDH2 wG 5.5 pM, 프로브 ALDH2 mA 6 pM, 주형인 게놈 DNA 100 ng, 및 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 ALDH2-TH2 또는 ALDH2-TH4 1 pM 첨가 또는 미첨가 무균수. 반응 혼합물을 Smart Cycler (Takara Bio)에 넣고, 70℃에서 5분 동안 처리한 다음, 56℃에서 60분 동안 반응시켰다. 56℃에서 배양하는 동안 1분 간격으로 형광 강도를 측정하였다.
하기 표 3 및 4에 나타난 바와 같이, 반응 시스템에 ALDH2-TH2를 첨가한 것에 따라 Ct 수치 상의 감소가 관찰되었고, 이는 반응성의 증가를 나타낸다. Ct 수치는 샘플에 대한 증폭 곡선이 역치선과 교차하는 지점이다 (100). 또한, ROX 및 FAM에서 유래한 형광 강도 상의 증가도 관찰되었고, 이는 검출 효율의 증가를 나타낸다. 반면, ALDH2-TH4를 반응 시스템에 첨가한 경우, Ct 수치 또는 형광 강도 상의 변화는 관찰되지 않았다. 즉, ALDH2-TH2의 5' 말단에 부착된 프라이머 ICAN-ALDH2-F의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 12-뉴클레오티드 서열이 결여된 ALDH2-TH4가 반응 시스템에 첨가되었을 때, ALDH2-TH2에 대하여 관찰된 반응성 및 검출 효율 상의 증가는 관찰되지 않았다.
Ct 수치 상의 변화
미첨가 ALDH2-TH2 ALDH2-TH4
ROX (야생형) 28.2 23.9 27.2
FAM (돌연변이형) 34.08 24.7 34.8
형광 강도
미첨가 ALDH2-TH2 ALDH2-TH4
ROX (야생형) 310-320 410-420 350-360
FAM (돌연변이형) 270-290 465-475 230-240
(3) 레지오넬라의 검출에 있어서 반응 시스템에 첨가된 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단에 부착된 뉴클레오티드 서열의 영향 검사
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트립 영역 (-1 내지 -12 또는 -13 내지 -24)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 첨가하고, ICAN 반응의 검출 속도 상의 변화를 검사하였다.
ICAN 반응 및 사이클링 프로브 방법을 사용하여 실시간 검출에 대한 효과를 검사하였다. 검출되는 대상으로 레지오넬라 Mip (레지오넬라 프뉴모필라 (Legionella pneumophila), 대식세포 감염력 증진제 (Mip); GenBank Acc. No.: AF095215)을 선정하였다.
ICAN 반응 시스템을 통해 레지오넬라 Mip를 검출하기 위하여, DNA 합성기 (Applied Biosystems)를 사용해서 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 F2 (서열번호 31) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 R2 (서열번호 32)를 합성하였다. Mip 유전자 Mip4g12을 검출하기 위한 프로브 (서열번호 33)를 합성하였다. Mip 유전자 Mip4g12을 검출하기 위한 프로브는 3' 말단에 부착된 퀸칭 라벨인 이클립스 및 5' 말단에 부착된 형광 라벨인 FAM 라벨을 가지는 DNA-RNA-DAN-타입 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
또한, 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 주변에 고안된 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12 또는 -13 내지 -24)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴크레오티드 서열을 가지는 하기 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 각각을 합성하였다: R2(-13) (서열번호 34; 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 있어서 -13 내지 -29); R2(-13)A12-1 (서열번호 35; 5' 말단에 부착된 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)의 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 있어서 -13 내지 -29); 및 R2(-13)A12-2 (서열번호 36; 5' 말단에 부착된 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-13 내지 -24)의 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 있어서 -13 내지 -24).
EnviroAmp™ (Perkin Elmer)에 부착된 레지오넬라 프뉴모필라 콘트롤 DNA를 주형인 게놈 DNA로 사용하였다.
ICAN 반응을 위한 반응조건은 하기 기재한 바와 같다. 간략하게, 최종농도에서 하기 성분을 함유하는 최종부피 25 μl의 반응 혼합물을 준비하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 5 mM 마그네슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.04% 프로필렌디아미드, 0.11% BSA, 각 dNTP 500 μM, BcaBEST DNA 중합효소 2 U, Tli RNase HII 100 U, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 F2 및 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 R2 각각 25 pM, 프로브 Mip4g12 5 pM, 주형인 콘트롤 DNA 200 복제본, 및 R(13)A12-1 또는 R(13)A12-2 1 pM 첨가 또는 미첨가 무균수. 반응 혼합물을 Smart Cycler (Takara Bio)에 넣고, 70℃에서 5분 동안 처리한 다음, 53℃에서 90분 동안 반응시켰다. 53℃에서 배양하는 동안 1분 간격으로 형광 강도를 측정하였다.
그 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다. 표 5에 나타난 바와 같이, 반응 시스템에 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 R(13)A12-1 또는 R(13)A12-2의 첨가에 따라 Ct 수치 상의 감소가 관찰되었다. Ct 수치는 샘플에 대한 증폭 곡선이 역치선과 교차하는 지점이다 (100).
미첨가 R(13)A12-1 R(13)A12-2
FAM 74.17-81.12 44.11-54.61 48.03-55.89
실시예 3
(1) ICAN 반응에 대한 각각 ICAN 프라이머의 업스트립 주형인 핵산의 영역의 상보적인 서열의 영향 (1)
6-뉴클레오티드 상보적인 서열을 각각 ICAN 프라이머의 5' 말단의 업스트림 주형인 핵산의 영역으로 삽입하고, ICAN 반응에 대한 영향을 검사하였다. 인간 c-Ki-ras 2 유전자 (GenBank Acc. No.: L00045)를 검출되는 대상으로 선정하였다.
각각 ICAN 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역에 명확한 상보적 서열이 없는 주형, 및 6-뉴클레오티드 상보적 서열을 가진 주형을 하기 과정에 따라 준비하였다.
각각 프라이머의 5' 말단에 부착된 상보적인 서열을 가지는 프라이머인 프라이머 c-Ki-ras/12F (서열번호 37) 및 프라이머 rasT1R (서열번호 38), 또는 프라이머 rasT14F (서열번호 39) 및 프라이머 rasT4R (서열번호 40) 뿐 아니라, 주형인 인간 게놈 (Clontech사에서 구매)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 생성된 단편은 블런트 말단 (blunt-end)을 가지고 있으며, 플라스미드 pUC118 (Takara Bio)의 HincII 자리로 삽입하였다. 생성된 플라스미드에서, 프라이머 c-Ki-ras/12F 또는 프라이머 rasT14F의 방향이 pUC118에 어닐링하는 M13 프라이머 M4 (Takara Bio)의 것과 동일한 플라스미드를 선별하였다. 그 결과, 각각 ICAN 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역에 명확한 상보적 서열이 없는 플라스미드 T7 및 6-뉴클레오티드 상보적 서열 CGCGCG를 가진 플라스미드 T16을 수득하였다.
준비된 플라스미드 DNA의 농도는 OD260의 값에 준하여 계산하였고, 100, 101, 102 ,103 , 104 또는 105 복제본/μl으로 적정되었다. 다양한 복제수를 가지는 주형 DNA 중 어느 한 DNA 1 μl을 최종농도에서 하기 성분을 함유하는 함유하는 반응 혼합물 24 μl에 첨가하였다: 32 mM HEPES-KOH (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 c-Ki-ras/12FN3 (서열번호 41) 및 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 c-Ki-ras/12RN3 (서열번호 42) 각각 30 pM, BcaBEST DNA 중합효소 2.8 U, 및 WO 02/22831의 실시예 7에 기재된 방법에 따라 준비된 Afu RNase HII 2.2 U. 반응 혼합물을 개인용 온도 사이클러 (Takara Bio)에 넣고, 55℃에서 60분에서 반응시켰다. 3% 아가로즈 겔에 전기영동하여 증폭산물을 검출하였다.
그 결과, 각각 ICAN 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역에 명확한 상보적 서열이 없는 플라스미드 T7을 주형으로 사용했을 때, 목적 영역의 크기에 해당하는 밴드만이 103 복제본의 안정된 감도를 가진 증폭산물로 관찰되었다. 반면에, 각각 ICAN 프라이머의 5' 말단에 근접한 업스트림 영역에 상보적인 서열 CGCGCG를 가진 플라스미드 T16을 주형으로 사용했을 때, 통상의 래더-유사 패턴으로 고분자량 산물 뿐 아니라 목적 영역의 크기에 해당하는 밴드가 10 복제본의 안정된 감도를 가지는 것으로 관찰되었는데, 이는 감도 상의 증가를 나타낸다. 래더-유사 산물을 겔에서 절단한 다음, pUC118의 HincII 자리로 서브클로닝하고, 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 그런 다음, 래더-유사 산물에서, 목적 영역이 각각의 ICAN 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역에서 상보적인 서열 CGCGCG를 통해 같은 방향으로 서로에 대해 연결되어 있다는 것을 발견하였다.
상기 기재한 바와 같이, 목적 영역을 중합하는 반응은 각각 ICAN 프라이머의 5' 말단 업스트림 영역의 상보적인 서열에 기인하여 진행되었는데, 이는 감도 상의 증가를 나타낸다.
(2) ICAN 반응에 대한 각각 ICAN 프라이머의 업스트립 주형인 핵산의 영역의 상보적인 서열의 영향 (2)
ICAN 반응에 대한, 각각 ICAN 프라이머의 5' 말단의 업스트림 주형인 핵산 영역의 3-뉴클레오티드 서열의 영향을 검사하였다. 고노코커스 cppB (임균 (neisseria gonorrhoeae) 잠적 플라스미드 단백질 (cppB); GenBank Acc. No.: M10316) 유전자를 검출되는 대상으로 선정하였다.
주형은 하기 과정에 따라 준비하였다.
프라이머 PJDBF (서열번호 43) 및 프라이머 PJDBR (서열번호 44) 뿐만 아니라 주형인 고노코커스 게놈 (Summit Pharmaceuticals International Corporation에서 구매)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 생성된 단편은 블런트 말단을 가지고 있으며, 플라스미드 pUC118 (Takara Bio)의 HincII 자리로 삽입되었다. 생성된 플라스미드에서, 프라이머 PJ율의 방향이 pUC118에 어닐링하는 M13 프라이머 M4 (Takara Bio)의 것과 동일한 플라스미드를 선별하였다. 그 결과, 플라스미드 Cp13을 수득하였다.
주형으로 플라스미드 Cp13을 사용하여 삽입된 영역을 증폭하기 위하여, 프라이머 PJDB0FN3 (서열번호 45) 및 프라이머 PJDB0RN3 (서열번호 46)을 고안하였다. 상기 경우, 프라이머 PJDB0FN3에 대한 목적 영역의 STJS은 프라이머 PJDB0RN3의 5' 말단에 근접한 업스트림 3-뉴클레오티드 서열 GAC에 상보적인 서열인 서열 GTC를 함유하지 않는다. 서열은 프라이머 PJDB0FN3의 5' 말단의 업스트림 뉴클레오티드 위치 34에 존재하였다. ICAN에 대한 3-뉴클레오티드 서열의 영향을 검사하였다.
상기 기재된 바와 같이 준비된 플라스미드 DNA의 농도는 OD260의 값에 준하여 계산하였고, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ,106, 107 또는 108 복제본/μl으로 적정되었다. 다양한 복제수를 가지는 주형 DNA 중 어느 한 DNA 1 μl를 최종농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 24 μl에 첨가하였다: 32 mM HEPES-KOH (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 PJDB0FN3 및 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 PJDB0RN3 각각 30 pM, BcaBEST (Takara Bio) 2.8 U, 및 Afu RNase HII 2.2 U. 반응 혼합물을 개인용 온도 사이클러 (Takara Bio)에 넣고, 55℃에서 60분에서 반응시켰다. 3% 아가로즈 겔에 전기영동하여 증폭산물을 검출하였다.
그 결과, 통상의 래더-유사 패턴으로 고분자량 산물뿐 아니라 목적 영역의 크기에 해당하는 밴드가 고감도 (102 복제본)를 가지는 것으로 관찰되었다. 래더-유사 산물을 겔에서 절단한 다음, pUC118의 HincII 자리로 서브클로닝하고, 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 그런 다음, 래더-유사 산물에서, 목적 영역이 각각의 ICAN 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역에서 3-뉴클레오티드 상보적 서열 GAC 및 GTC를 통해 통상적인 패턴에 의해 같은 방향으로 서로에 대해 연결되어 있다는 것을 발견하였다. 래더-유산 증폭산물은 통상적인 패턴으로 목적 영역 사이에 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 PJDB0FN3의 업스트림 34-뉴클레오티드 영역과 ICAN 프라이머 사이에 목적 영역을 함유하였다.
상기 기재한 바와 같이, 목적 영역을 중합하는 반응은 각각 ICAN 프라이머의 5' 말단 업스트림 영역의 3-뉴클레오티드 상보적 서열에 기인하여 진행되었는데, 이는 고감도 증폭을 가능하게 한다. 증폭산물이 프로브를 이용한 하이브리다이제이션에 의해 검출될 경우, 프로브 위치는 ICAN 프라이머의 5' 말단의 업스트림 영역의 상보적 서열과 ICAN 프라이머 간의 영역 또는 각각 ICAN 프라이머 간의 영역에서 선택될 수 있다.
실시예 4
역전사 프라이머로 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -6, -1 내지 -9 또는 -1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 6-, 9-, 또는 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, RT-ICAN의 감도 및 검출 속도를 검사하였다.
먼저, 실시예 1-(1)에서 준비된 주형 RNA의 농도는 OD260의 값에 준하여 계산하였고, 100, 101, 102 ,103 , 104 또는 105 복제본/μl으로 적정되었다.
최종농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 10 μl을 준비하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼륨 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 역전사 프라이머인 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 215R (서열번호 47), 프라이머 A9-215R (서열번호 48) 또는 프라이머 A12-215R 1 pM, RTase M-MLV (Takara Bio) 50 U, 및 다양한 복제수를 가지는 주형 RNA 중 어느 한 RNA 1 μl.
반응 혼합물은 개인용 온도 사이클러 (Takara Bio)에 넣고, 45℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 4℃로 냉각하였다. 역전사 반응 이후, 최종 농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 15 μl를 냉각시킨 반응 혼합물 10 μl에 첨가하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 B134FN3 (16) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 205RN3 (16) 각각 25 pM, BcaBEST (Takara Bio) 11 U, Tli RNase HII 0.05 U, 및 SYBR Green. 실시간으로 증폭산물을 검출하기 위하여, Rotor 유전자 (Corbett Research)를 사용하여 ICAN 반응을 55℃에서 수행하였다. 또한, 반응산물은 3% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동에 의해 검출하였다. 또한, 반응산물은 3% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동에 의해 검출하였다.
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -6)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 6-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A6-215R을 사용했을 때, 감도는 102 복제본이었다. 6-뉴클레오티드 서열의 부착은 0.9분까지 검출 속도를 증가시켰다.
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -9)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 9-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A9-215R을 사용했을 때, 감도는 102 복제본이었다. 9-뉴클레오티드 서열의 부착은 1.6분까지 검출 속도를 증가시켰다.
두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12-215R을 사용했을 때, 감도는 102 복제본이었다. 9-뉴클레오티드 서열의 부착은 3.7분까지 검출 속도를 증가시켰다.
상기 기재한 바와 같이, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 어닐링하는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단에 부착된 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 많을수록 더 좋은 영향을 유발한다는 것을 확인하였다.
실시예 5
역전사 프라이머인 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12 또는 -1 내지 -18)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12- 또는 18-올리고뉴클레오티드 서열을 가지는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 RT-ICAN의 감도를 검사하였다.
먼저, 실시예 1-(1)에서 준비된 주형 RNA의 농도는 OD260의 값에 준하여 계산하였고, 100, 101, 102 ,103 , 104 또는 105 복제본/μl으로 적정되었다.
최종농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 10 μl을 준비하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼륨 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 역전사 프라이머인 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 205RN3 (18), 프라이머 A12-205R 또는 프라이머 A18-205R (서열번호 49) 1 pM, RTase M-MLV (Takara Bio) 50 U, 및 다양한 복제수를 가지는 주형 RNA 중 어느 한 RNA 1 μl.
반응 혼합물은 개인용 온도 사이클러 (Takara Bio)에 넣고, 45℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 4℃로 냉각하였다. 역전사 반응 이후, 최종 농도에서 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물 15 μl를 냉각시킨 반응 혼합물 10 μl에 첨가하였다: 32 mM HEPES-KOH 버퍼 (pH 7.8), 100 mM 칼슘 아세테이트, 1% 디메틸 설폭사이드, 0.11% BSA, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 각 dNTP 500 μM, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 B134FN3 (18) 및 첫번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 205RN3 (18) 각각 25 pM, BcaBEST (Takara Bio) 11 U, 및 Tli RNase HII 0.05 U. 개인용 온도 사이클러를 사용하여 ICAN 반응을 55℃에서 수행하였다. 반응산물은 3% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동에 의해 검출하였다.
그 결과, 프라이머 205RN3를 사용하는 역전사를 통한 RT-ICAN의 감도는 102 복제본이였다. 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -18)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 18-뉴클레오티드 서열을 가지는 동일한 위치에 대한 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A18-205R 또는 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역 (-1 내지 -12)에 어닐링하는 5' 말단에 부착된 12-뉴클레오티드 서열을 가지는 동일한 위치에 대한 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 A12-205R을 사용했을 때, 감도는 예를 들어, 1차의 크기에 의해 증가된 101 복제본이었다. 또한, A12-205R 또는 A18-205R을 사용한 증폭에 의해, 통상의 래더-유사 패턴으로 프라이머의 업스트림 영역의 어닐링 서열을 통한 연결에 의해 생성되는 증폭산물을 수득하였다.
상기 기재한 바와 같이, 두번째 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 업스트림 영역에 어닐링하는 뉴클레오티드의 수가 변한다 할지라도, 영역을 통한 래더-유사 증폭은 발생하며, 이로 인해 감도가 증가하게 되었다.
본 발명은 통상적인 등온 핵산 증폭방법에 비하여 우수한 증폭방법을 제공할 뿐 아니라, 상기 방법에 사용되는 프라이머를 함유한 조성물 및 키트를 제공한다.
서열목록
서열목록 1: DNA로 역전사되는 SARS 코로나바이러스 게놈 RNA의 일부분. "뉴클레오티드 1 내지 5는 HindIII 제한 부위- 뉴클레오티드 238 내지 242는 BamHI 제한 부위."
서열목록 2: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여, 그리고 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 205RN3 (18)로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 3: mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 A12-205R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 4: mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 5: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여, 그리고 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 A12-215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 6: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여, 그리고 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 A12-223R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 7: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 134FN3 (18)로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이 다."
서열목록 8: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여, 그리고 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 A12(-10)-215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 9: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여, 그리고 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 A12(-20)-215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 10: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여, 그리고 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 A12(6)-215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 11: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여, 그리고 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 A12(12)-215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 12: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 B134FN3 (16)로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 14 내지 16은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다." "5'-말단은 비오틴으로 표지되어 있다."
서열목록 13: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 205RN3 (16)로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 14 내지 16은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이 다."
서열목록 14: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여, 그리고 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 A6(-10)-215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 15: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여, 그리고 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 A9(-10)-215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 16: SARS 코로나바이러스 게놈의 증폭된 일부분을 검출하기 위하여 SARS-BNI-B로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프로브. "5-말단은 FITC로 표지되어 있다."
서열목록 17: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 160FN3로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 18: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 241RN3로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 12 내지 14는 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 19: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 (A12)241RN3로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 21은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 20: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 134RN3 (16)로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 14 내지 16은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 21: 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 ICAN-ALDH2-F로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 22: 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 ICAN-ALDH2-R로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 23: 본연의 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자의 증폭된 일부분을 검출하기 위하여 ALDH2 wG 프로브로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프로브. "뉴클레오티드 11은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다." "5'-말단은 ROX로 표지되어 있고, 3'-말단은 이클립스로 표지되어 있다."
서열목록 24: 돌연변이 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자의 증폭된 일부분을 검출하기 위하여 ALDH2 mA 프로브로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프로브. "뉴클레오티드 11은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오 티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다." "5'-말단은 FAM으로 표지되어 있고, 3'-말단은 이클립스로 표지되어 있다."
서열목록 25: 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자를 증폭하기 위하여 ALDH2-TH1으로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 26: 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자를 증폭하기 위하여 ALDH2-TH2로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 27: 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자를 증폭하기 위하여 ALDH2-TH3으로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 28: 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자를 증폭하기 위하여 ALDH2-F로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머.
서열목록 29: 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자를 증폭하기 위하여 ALDH2-R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머.
서열목록 30: 인간 알데하이드 디하이드로저네이즈 2 유전자를 증폭하기 위하여 ALDH2-TH4으로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 31: 레지오넬라 프뉴모필라 mip 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 F2로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 15 내지 17은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 32: 레지오넬라 프뉴모필라 mip 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 R2로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 15 내지 17은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 33: 레지오넬라 프뉴모필라 mip 유전자의 증폭된 일부분을 검출하기 위하여 Mip4g12로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프로브. "뉴클레오티드 4는 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다." "5'-말단은 FAM으로 표지되어 있고, 3'-말단은 이클립스로 표지되어 있다."
서열목록 34: 레지오넬라 프뉴모필라 mip 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 R2(-13)로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 35: 레지오넬라 프뉴모필라 mip 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 R2(-13)A12-1로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 36: 레지오넬라 프뉴모필라 mip 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 R2(-13)A12-2로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 37: 인간 c-Ki-ras2 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 c-Ki-ras/12F로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머.
서열목록 38: 인간 c-Ki-ras2 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 rasT1R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머.
서열목록 39: 인간 c-Ki-ras2 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 rasT14F로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머.
서열목록 40: 인간 c-Ki-ras2 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 rasT4R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머.
서열목록 41: 인간 c-Ki-ras2 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 c-Ki-ras/12FN3로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 42: 인간 c-Ki-ras2 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 c-Ki-ras/12RN3로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 43: 임균 cppB 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 PJDBF로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 44: 임균 cppB 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 PJDBR로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 45: 임균 cppB 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 PJDB0FN3로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 46: 임균 cppB 유전자의 일부분을 증폭하기 위하여 PJDB0RN3로 표시되는 고안된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 15 내지 17은 리보뉴클레오티드이고- 다른 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다."
서열목록 47: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 A6- 215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 48: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 A9-215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열목록 49: SARS 코로나바이러스 게놈의 일부분을 증폭하기 위하여 A18-215R로 표시되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> A method for nucleic acid amplification <130> 664878 <150> JP 2003-412326 <151> 2003-12-10 <160> 49 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A portion of SARS coronavirus genomic RNA reverse transcripted to DNA. "nucleotide 1 to 5 is HindIII restriction site- nucleoti de 238 to 242 is BamHI restriction site." <400> 1 aagctttctc tatgatgggt ttcaaaatga attaccaagt caatggttac cctaatatgt 60 ttatcacccg cgaagaagct attcgtcacg ttcgtgcgtg gattggcttt gatgtagagg 120 gctgtcatgc aactagagat gctgtgggta ctaacctacc tctccagcta ggattttcta 180 caggtgttaa cttagtagct gtaccgactg gttatgttga cactgaaaat aacacaggat 240 cc 242 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 205RN3(1 8) for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of S ARS coronavirus genome. "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotide s- other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 2 agttgcatga cagcccuc 18 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A12-205R for synt hesizing cDNA from mRNA. <400> 3 aaacatatta ggagttgcat gacagccctc 30 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as 215R for synthesi zing cDNA from mRNA. <400> 4 cagcatctct agttgcat 18 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A12-215R for synt hesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronav irus genome. <400> 5 aaacatatta ggcagcatct ctagttgcat 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A12-223R for synt hesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coronav irus genome. <400> 6 aaacatatta ggagtaccca cagcatctct 30 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 134FN3(1 8) to amplify a portion of SARS coronavirus genome. "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonuc leotides." <400> 7 atcacccgcg aagaagcu 18 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A12(-10)-215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS co ronavirus genome. <400> 8 gggtaaccat tgcagcatct ctagttgcat 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A12(-20)-215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS co ronavirus genome. <400> 9 tgacttggta atcagcatct ctagttgcat 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A12(6)-215R for s ynthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS coro navirus genome. <400> 10 ggtgataaac atcagcatct ctagttgcat 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A12(12)-215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS cor onavirus genome. <400> 11 ttcgcgggtg atcagcatct ctagttgcat 30 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as B134FN3( 16) to amplify a portion of SARS coronavirus genome. "nucleotide s 14 to 16 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonu cleotides." "5'-end is labeled with biotin." <400> 12 atcacccgcg aagaag 16 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 205RN3(1 6) to amplify a portion of SARS coronavirus genome. "nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonuc leotides." <400> 13 agttgcatga cagccc 16 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A6(-10)-215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS cor onavirus genome. <400> 14 gggtaacagc atctctagtt gcat 24 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A9(-10)-215R for synthesizing cDNA from mRNA, and to amplify a portion of SARS cor onavirus genome. <400> 15 gggtaaccac agcatctcta gttgcat 27 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe designated as SARS-BNI-B for det ecting an amplified a portion of SARS coronavirus genome. "5'-en d is labeled with FITC." <400> 16 aagccaatcc acgcacgaac 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 160FN3 t o amplify a portion of SARS coronavirus genome. "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleot ides." <400> 17 cgttcgtgcg tggatugg 18 <210> 18 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 241RN3 t o amplify a portion of SARS coronavirus genome. "nucleotides 12 to 14 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleot ides." <400> 18 tagctggaga ggua 14 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as (A12)241 RN3 to amplify a portion of SARS coronavirus genome. "nucleotide s 18 to 21 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonu cleotides." <400> 19 tgacgaatag ctggagaggu a 21 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as 134FN3(1 6) to amplify a portion of SARS coronavirus genome. "nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonuc leotides." <400> 20 atcacccgcg aagaag 16 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as ICAN-ALD H2-F to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides ar e deoxyribonucleotides." <400> 21 agttgggcga gtacgggcug 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as ICAN-ALD H2-R to amplify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides ar e deoxyribonucleotides." <400> 22 cagaccctca agccccaaca 20 <210> 23 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide probe designated as ALDH2 wG probe for detecting an amplified a portion of native human aldehy de dehydrogenase 2 gene. "nucleotides 11 is ribonucleotide- othe r nucleotides are deoxyribonucleotides." "5'-end is labeled with ROX, and 3'-end is labeled with Eclipse." <400> 23 ggcatacact gaag 14 <210> 24 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide probe designated as ALDH2 mA probe for detecting an amplified a portion of mutant human aldehy de dehydrogenase 2 gene. "nucleotides 11 is ribonucleotide- othe r nucleotides are deoxyribonucleotides." "5'-end is labeled with FAM, and 3'-end is labeled with Eclipse." <400> 24 ggcatacact aaag 14 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH1 to ampl ify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene. <400> 25 cccggccact ccgcagaccc tcaagcccc 29 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH2 to ampl ify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene. <400> 26 cccggccact ccagccacca gcagaccc 28 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH3 to ampl ify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene. <400> 27 cccggccact ccaggctccg agccacca 28 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide PCR primer designated as ALDH2-F to am plify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene. <400> 28 cagggtcaac tgctatgatg t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide PCR primer designated as ALDH2-R to am plify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene. <400> 29 agcccccaac agaccccaat c 21 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as ALDH2-TH4 to ampl ify a portion of human aldehyde dehydrogenase 2 gene. <400> 30 agccaccagc agaccc 16 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as F2 to am plify a portion of Legionella pneumophila mip gene. "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonuc leotides." <400> 31 atggggcttg caatguc 17 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as R2 to am plify a portion of Legionella pneumophila mip gene. "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonuc leotides." <400> 32 agtagctaat gatgugg 17 <210> 33 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide probe designated as Mip4g12 p robefor detecting an amplified a portion of Legionella pneumophil a mip gene. "nucleotides 4 is ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonucleotides." "5'-end is labeled with FAM, and 3'-e nd is labeled with Eclipse." <400> 33 aatggctgca ac 12 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R2(-13) to amplif y a portion of Legionella pneumophila mip gene. <400> 34 ccaatgctat aagacaa 17 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R2(-13)A12-1 to a mplify a portion of Legionella pneumophila mip gene. <400> 35 aacagctgca gtccaatgct ataagacaa 29 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R2(-13)A12-2 to a mplify a portion of Legionella pneumophila mip gene. <400> 36 caccaatttc atccaatgct ataagacaa 29 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide PCR primer designated as c-Ki-ras/12F to amplify a portion of human c-Ki-ras2 gene. <400> 37 gactgaatat aaacttgtgg 20 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide PCR primer designated as rasT1R to amp lify a portion of human c-Ki-ras2 gene. <400> 38 aaactattgt tggatcatat tcg 23 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide PCR primer designated as rasT14F to am plify a portion of human c-Ki-ras2 gene. <400> 39 gcgcggactg aatataaact tgtgg 25 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide PCR primer designated as rasT4R to amp lify a portion of human c-Ki-ras2 gene. <400> 40 aaacgcgcgc tattgttgga tcatattcg 29 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as c-Ki-ras /12FN3 to amplify a portion of human c-Ki-ras2 gene. "nucleotide s 18 to 20 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonuc leotides." <400> 41 gactgaatat aaacttgugg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as c-Ki-ras /12RN3 to amplify a portion of human c-Ki-ras2 gene. "nucleotide s 18 to 20 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyribonuc leotides." <400> 42 ctattgttgg atcatatucg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as PJDBF to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene. <400> 43 ctttgcttca atgcctcgtt 20 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as PJDBR to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene. <400> 44 catcacgcac cgaagcc 17 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as PJDB0FN3 to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene. "nucle otides 18 to 20 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyri bonucleotides." <400> 45 ctttgcttca atgcctcguu 20 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as PJDB0RN3 to amplify a portion of Neisseria gonorrhoeae cppB gene. "nucle otides 15 to 17 are ribonucleotide- other nucleotides are deoxyri bonucleotides." <400> 46 catcacgcac cgaagcc 17 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A6-215R to amplif y a portion of SARS coronavirus genome. <400> 47 aaacatcagc atctctagtt gcat 24 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A9-215R to amplif y a portion of SARS coronavirus genome. <400> 48 aaacatattc agcatctcta gttgcat 27 <210> 49 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as A18-205R to ampli fy a portion of SARS coronavirus genome. <400> 49 aaacatatta gggtaaccag ttgcatgaca gccctc 36

Claims (9)

  1. (A) 하기 (a) 또는 (b)로부터 선택된 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및
    (a) 주형인 핵산, 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 나선 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소, 적어도 두 개의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 적어도 하나의 래더(ladder)-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 RNase H; 또는
    (b) 주형인 핵산, 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 나선 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소, 적어도 두 개의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 RNase H, 여기서 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 하나는 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 작용하며,
    상기 각 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 (i) 디옥시리보뉴클레오티드, 및 디옥시이노신 뉴클레오티드, 디옥시우라실 뉴클레오티드 및 7-데아자구아닌 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 유사체로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나, 및 (ii) 리보뉴클레오티드를 함유하고, 상기 리보뉴클레오티드는 상기 프라이머의 3' 말단(terminus) 또는 3'-말단측(terminal side)에 위치하며,
    상기 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 제1 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 주형인 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상동하는 제2 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며,
    상기 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 주형인 핵산에서 상기 제1 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상보적인 영역 또는 그 영역에서 3' 측의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지고, 5' 측에, 주형인 핵산에 상동하는 제2 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 측의 뉴클레오티드 서열; 주형인 핵산에서 상기 제2 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머에 상동하는 부분의 5' 말단에서 5' 측 방향의 영역에 해당하는 뉴클레오티드 서열; 또는 두 서열 모두에 상보적인 서열을 가지며,
    (B) 주형인 핵산으로의 프라이머의 특이적인 어닐링(annealing), DNA 중합효소에 의한 신장된 나선의 합성반응 및 나선 치환반응 및 RNase H에 의한 신장된 나선의 절단반응이 일어나는 일정한 온도 조건하에서, 래더-유사 증폭산물을 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 배양하는 단계를 포함하는 핵산의 증폭방법.
  2. 제1항에 있어서, 주형인 핵산이 RNA이고 상기 핵산을 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 역전사 활성을 가지는 DNA 중합효소 및 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 미리 처리하여 상기 핵산을 역전사 산물로 전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (A)의 반응 혼합물이 역전사 활성을 가지는 DNA 중합효소를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 주형인 핵산이 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 주형인 핵산이 RNA이고 상기 핵산을 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 역전사 활성을 가지는 DNA 중합효소 및 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 미리 처리하여 상기 핵산을 역전사 산물로 전환시키되, 여기서 역전사 활성 및 나선 치환 활성을 가지는 단일 DNA 중합효소가 상기 역전사 활성을 가지는 DNA 중합효소 및 단계 (A)의 나선 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소로서 작용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는, 제1항에 정의된 핵산의 증폭방법을 위한 조성물.
  7. 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 적어도 하나의 래더-형성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는, 제1항에 정의된 핵산의 증폭방법을 위한 키트.
  8. (a) 제1항에 정의된 핵산의 증폭방법에 따라 목적 핵산을 증폭하는 단계; 및
    (b) 상기 단계에서 증폭된 목적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는, 목적 핵산의 검출방법.
  9. 삭제
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