JP2012508586A - カンピロバクター属(Campylobacter)核酸を検出するための組成物、キットおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[0002]本出願は、その全体が本明細書に援用される、2008年11月14日出願の米国仮出願第61/114,547号に対する優先権の恩典を請求する。
[0034]用語「ターゲット配列」は、本明細書において、増幅しようとするターゲット核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。ターゲット核酸が元来、一本鎖である場合、用語「ターゲット配列」はまた、ターゲット核酸中に存在するようなターゲット配列に対して相補的である配列も指す。ターゲット核酸が元来、二本鎖である場合、該用語「ターゲット配列」は、センス(+)およびアンチセンス(−)鎖の両方を指す。ターゲット配列を選択する際に、当業者は、関連しない核酸または緊密に関連するターゲット核酸の間を区別するように、配列を選択すべきであることを理解するであろう。
[0051]用語「アンプリコン」または用語「増幅産物」は、本明細書において、ターゲット配列内に含有される配列に相補的であるかまたは相同である、増幅法中に生成される核酸分子を指す。これらの用語を用いて、一本鎖増幅産物、二本鎖増幅産物または二本鎖増幅産物の一方の鎖を指してもよい。
[0054]本明細書において、「標識」は、検出されるかまたは検出可能シグナルを導く、プローブに直接または間接的に連結された部分または化合物を指す。直接標識は、共有結合または非共有相互作用、例えば水素結合、疎水性およびイオン性相互作用、あるいはキレートまたは配位錯体の形成を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通じて起こってもよい。間接標識は、直接または間接的のいずれかで標識され、そして検出可能シグナルを増幅可能である、架橋部分または「リンカー」、例えば結合対メンバー、抗体またはさらなるオリゴマーの使用を通じて起こってもよい。標識には、任意の検出可能部分、例えば放射性核種、リガンド(例えばビオチン、アビジン)、酵素または酵素基質、反応性基、または発色団(例えば、色素、粒子、または検出可能な色を与えるビーズ)、発光化合物(例えば生物発光、燐光、または化学発光標識)、またはフルオロフォアが含まれる。標識は、混合物中の結合した標識プローブが、未結合標識プローブのものと異なる検出可能な変化、例えば不安定性または示差的な分解特性を示す、均質アッセイにおいて検出可能であってもよい。標識または標識プローブの未結合型から結合型を物理的に除去せずに、「均質検出可能標識」を検出してもよい(例えば、米国特許第5,283,174号、第5,656,207号、および第5,658,737号)。標識には、化学発光化合物、例えば標準的AEおよび誘導体を含むアクリジニウムエステル(「AE」)化合物が含まれる(例えば、米国特許第5,656,207号、第5,658,737号、および第5,639,604号)。合成、および核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法が周知である(例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1989),第10章;米国特許第5,658,737号、第5,656,207号、第5,547,842号、第5,283,174号、および第4,581,333号)。1より多い標識、および1より多い標識タイプが、特定のプローブ上に存在してもよいし、または検出は、検出可能シグナルを生じる化合物で各プローブが標識されている、プローブ混合物を用いてもよい(例えば、米国特許第6,180,340号および第6,350,579号)。
[0071]本明細書において、用語「相対的蛍光単位」(「RFU」)は、蛍光強度の測定値の恣意的単位である。RFUは、測定に用いた検出手段の特性に応じて多様である。
[0073]TMA増幅を用いる増幅法には、以下の工程が含まれる。簡潔には、増幅しようとしているターゲット配列を含有する一本鎖ターゲット核酸を提供する。当業者は、二本鎖核酸の慣用的な融解を用いて一本鎖ターゲット核酸を提供しうることを認識するであろう。ターゲット配列にハイブリダイズさせることによって、第一の増幅オリゴマーをターゲット核酸と接触させる。第一の増幅オリゴマーは、プライマーまたはプロモータープライマーであってもよい。次いで、適切な核酸ポリメラーゼが、ターゲット核酸ターゲット配列に相補的な核酸鎖増幅産物を生成する。ターゲット核酸がRNAである場合、RNAは、典型的には、分解され、新規に生成された増幅産物のみを残し、これは、第二の増幅オリゴマーによるハイブリダイゼーションに利用可能である。第一の増幅オリゴマーとしてプライマーを用い、次いで、第二の増幅オリゴマーはプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。適切な核酸ポリメラーゼは、新規に生成された増幅産物を用い、これに、プロモーターに基づくオリゴマーがプライマーとしてハイブリダイズして、ハイブリダイズしていないプロモーター配列の相補鎖を作製する。第二の増幅オリゴマーがプロモータープライマーである場合、第二の増幅オリゴマーがハイブリダイズする増幅産物の相補的コピーもまた生成される。プロモーターに基づく増幅の、ここで二本鎖となったプロモーター配列は、適切なRNAポリメラーゼによって用いられて、転写が開始し、そしてRNA転写物増幅産物が作製される。次いで、第一の増幅オリゴマープライマーが、転写された増幅産物にハイブリダイズすることも可能であり、そして工程は反復可能である。または、ターゲット核酸はRNAであり、そして第一の増幅オリゴマーはプロモーターに基づく増幅オリゴマーである。ここで、プロモーターに基づく増幅オリゴマーはプロモータープライマーである。適切なポリメラーゼは、RNAターゲット配列に相補的な第一の増幅産物を作製する。RNAターゲット核酸が分解され、そして第二の増幅オリゴマーが増幅産物にハイブリダイズする。適切なポリメラーゼは相補鎖を作製し、それによって二本鎖プロモーター配列を生成する。転写が開始され、そしてRNAが転写される。転写されたRNAは、元来のターゲット核酸に相補的であり、したがって、第二の増幅オリゴマーが再びハイブリダイズし、そして転写されたRNAを二本鎖にする。RNAは分解され、そして残ったDNA鎖には、第一の増幅オリゴマーがハイブリダイズする。増幅工程は反復可能である。ターゲット核酸がDNAである場合、第一の増幅オリゴマーはプロモータープライマーであり、そして第二の増幅オリゴマーはプライマーである。増幅は、一般的に、上述のように、そして当該技術分野に記載されるように進行する。例えば、TMAおよび転写関連増幅の他の変形を記載する、米国特許第4,868,105号;第5,124,246号;第5,130,238号;第5,399,491号;第5,437,990号;第5,554,516号;および第7,374,885号;ならびにPCT公報第WO 88/01302号;第WO 88/10315号および第WO 95/03430号を参照されたい。増幅された産物は、増幅中にリアルタイムで検出されてもよいし、または増幅反応終了時に検出されてもよい。検出は、いくつかの方法によって実行可能である。プローブに基づく検出法は、増幅産物中に含有されるターゲット配列に特異的に結合するターゲットハイブリダイズ配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブを用いる。結合したプローブから生じるシグナルの検出は、試料中のターゲット核酸の存在を示す。
[0075]核酸検出を多様な方法によって達成してもよい。検出法は、増幅された産物の一部に相補的であるターゲットハイブリダイズ配列を含む核酸プローブを用いて、そしてプローブ:産物複合体の存在を検出してもよいし、または増幅された産物と会合する検出可能シグナルを増幅可能なプローブ複合体を用いることによってもよい(例えば米国特許第5,424,413号;第5,451,503号;および第5,849,481号)。増幅された産物と特異的に会合する直接または間接的に標識されたプローブは、試料中のターゲット核酸の存在を示す検出可能シグナルを提供する。例えば、ターゲット核酸がC.ジェジュニ、C.ラリ、またはC.コリ16S rRNAである場合、増幅された産物は、C.ジェジュニ、C.ラリ、またはC.コリ・ターゲット配列中のまたはこれらに相補的な配列を含有するであろう。プローブが、直接または間接的に、増幅産物の一部に直接または間接的に結合して、試験試料中のC.ジェジュニ、C.ラリ、またはC.コリの存在を示すように、プローブを設定する。
[0079]C.ジェジュニ、C.ラリ、またはC.コリ配列の増幅および検出のための試料調製には、他の試料構成要素から、試料中に含有される生物を分離し、そして/または濃縮する方法、例えば空気、水または試料の他のタイプからの粒子状物質のろ過が含まれてもよい。試料調製には、細胞を破壊するかまたは細菌を溶解して、C.ジェジュニ、C.ラリ、またはC.コリ16S rRNAまたは16S rRNAをコードする遺伝子配列を含む細胞内内容物を放出するルーチンの方法が含まれてもよい。増幅前の試料調製には、他の試料構成要素からターゲット核酸を特異的にまたは非特異的に分離するターゲット捕捉の場合による工程が含まれてもよい。非特異的ターゲット捕捉法は、実質的に水性の混合物から核酸を選択的に沈降させ、核酸を支持体に付着させて、他の試料構成要素を洗い流す工程、C.ジェジュニ、C.ラリ、またはC.コリ核酸および他の試料構成要素を含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の方法を含んでもよい。
[0082]本明細書に記載するように、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリおよびカンピロバクター・コリ核酸を選択的に増幅しそして検出するのに好ましい部位を開示する。好ましい部位は、他のカンピロバクター属種および他の細菌(本明細書において、「最近縁(near neighbor)生物」、「検証(challenge)生物」または「除外物(exclusionaries)」)の増幅および/または検出に対して区別するよう選択される。これらの好ましい部位は、カンピロバクター属16S rRNAの領域内に見出される。感度、選択性および特異性が改善された、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリおよびカンピロバクター・コリ16S rRNAを増幅するために、これらの領域を含む特に好ましいオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットが同定されてきている。
[0090]以下の例は、本明細書記載のリアルタイムTMA実験において用いられる、典型的なアッセイ試薬、装置、プロトコル、条件等を記載する。逆に明記されない限り、試薬調製、装置準備およびアッセイプロトコルは、本質的に以下に示すように行った。本開示を所有する一般の当業者は、試薬、状態、装置およびアッセイ法を変化させることも可能であり、そしてこうした変動は、本開示の範囲内である。
[0095]C.ジェジュニ、C.ラリ、およびC.コリ・ターゲット核酸を区別可能に増幅し、そして検出するように、増幅および検出オリゴヌクレオチドを設定した。AF393202.1、gi:20378208(配列番号91)のヌクレオチド9〜82およびヌクレオチド44〜226に対応するカンピロバクター・ジェジュニ16S rRNAの2つの重複領域を用いて、いくつかのT7プロバイダー、ブロッカー、プライマー、およびトーチが、本明細書に記載するように、前記参照配列のこれらの領域内のより小さい配列にハイブリダイズするように設定した。これらのオリゴマーのターゲット・ハイブリダイズ配列はまた、C.ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにC.コリ、C.ラリまたはC.コリおよびC.ラリ・ターゲット核酸にもハイブリダイズする。さらに、この同じC.ジェジュニ16S rRNAの塩基対341〜426に対応する領域を用いて、いくつかのターゲット捕捉オリゴを設計した(表1〜3を参照されたい)。C.ジェジュニ、C.ラリ、およびC.コリの異なる株の選択的検出が最大になり、他の生物との交差反応の可能性が減少するように、これらのオリゴを設計した。
[00100]C.ウプサリエンシスおよびC.フィタスから区別する一方、C.ジェジュニ、C.コリおよびC.ラリ・ターゲット核酸に対する感度に関して、表6の増幅オリゴマーの組み合わせをさらに試験した。0、1E2、1E3および1E4コピーのC.ジェジュニ、C.ラリ、C.コリ、C.フィタス、またはC.ウプサリエンシス16S rRNAを用いて、各組み合わせを試験した。増幅オリゴは、5.0pM T7プロバイダー、0.5pMブロッカー、5.0pMプライマーおよび4.0pMトーチで存在した。陽性基準は、PTIプレート読み取り装置を用いると、1000RFUであった。増幅オリゴマー組み合わせは、わずか1E2コピーのC.ジェジュニ、C.ラリ、またはC.コリ・ターゲット核酸を増幅可能であった。T時間は、C.フィタス亜種フィタス、C.フィタス亜種ベネレアリスおよびC.ウプサリエンシスに関する増幅反応において、非常に低レベルでまたは非常に遅延してのいずれかで出現した。表7。オリゴ組み合わせ番号(2−8)および(2−22)は、これらのオリゴ組み合わせを含むウェル中、この二次スクリーニングアッセイにおいて、C.フィタス種またはC.ウプサリエンシス種のいずれとも反応せず、そしてC.ジェジュニ、C.コリ、およびC.ラリの非常に優れた検出があったため、続くスクリーニングのために選択された。
[00102]配列番号7、32、50および68増幅オリゴヌクレオチド組み合わせを用いて、3つのカンピロバクター属16S rRNAターゲット捕捉オリゴヌクレオチド(TCO)を試験した。ターゲット捕捉オリゴには、C.ジェジュニ16S rRNAの配列に基づく2つのカンピロバクター属TCO(配列番号71および73)および1つのゆらぎTCO(配列番号58)が含まれた。本アッセイにおいて、C.ジェジュニに基づくTCOのハイブリダイゼーションを提供するため、最初の加熱工程が含まれた。ゆらぎTCOは、加熱工程を必要としないが、3つすべてのTCOに関して同等の条件を維持するため、該工程を含んだ。
[00105]したがって、これらのアッセイから、ターゲット捕捉プローブ、配列番号73を用いて、増幅オリゴセット、配列番号7、32、50および68に対するさらなる試験を行うことを決定した。
[00106]感度試験。カンピロバクター・ジェジュニ(ATCC 33560)を反応あたり1E5コピーでアッセイした。溶解緩衝液を陰性対照として用いた。ターゲット捕捉のためにKingFisher96装置を用い、プライマーをアニーリングさせ、そして酵素を添加するためにEppendorfサーモミキサーを用いて、20の陽性(アッセイあたり1E5コピーのrRNA)を試験し、そして検出のためにPTI−FP−2(登録商標)FluoDiaプレート読み取り装置を用いた。20の陰性対照反応を含めた。ターゲット捕捉のためのインプットは1mLであり、ターゲット捕捉のためのアウトプットは100μLであり、このうち30μLを増幅に用いた。陽性基準を1000RFUに設定した。>95%陽性率で20の複製物のうち19が検出されるべきであった。最初の試験ラウンド後、19未満の複製物が陽性である場合、40のさらなる複製物が試験されるべきであった。この段階での感度に関する試験は、100%の陽性率および10%の偽陽性率を生じた。この段階で見られる偽陽性は、増幅プロセス中、非常に低レベルで、そして非常に遅延して出現した。陽性に関する1000RFU基準は最適化された基準ではなかったため、偽陽性は、真の偽陽性とは見なされない。これらの条件を、再び、さらなる周期の試験において評価した。結果を表10に示す。
[00109]さらなるT7プロバイダーオリゴマーを調製し、そして試験した。T7プロバイダーを以下の表12に示す。表12中のT7プロバイダーを各々、配列番号7、50および68、ならびにT7プロバイダーの1つを含むオリゴマー組み合わせで用いた。1つの条件において、ブロッカー(配列番号50)は含まれず、そしてしたがって、この反応における組み合わせは配列番号7、26、68であった。
[00114]緩衝ペプトン水(BPW)中の純粋培養溶解物を試験するため、オリゴマー組み合わせを用いた。試料調製デバイスは含まれなかった。すべての陽性対照はC.ジェジュニ(ATCC 33560)であり、そしてすべての陰性対照は溶解/BPWであった。すべての試料は、70:30の溶解溶液:BPW中である。増幅オリゴは、配列番号7、26、50および68である。ターゲット捕捉オリゴは配列番号73である。
[00119]C.ジェジュニ種ATCC 35925およびATCC 35920(ATCC、バージニア州マナサス)は、上記分析試験では検出されなかった。C.ジェジュニのこれらの株に関するターゲット配列内の関心対象の領域の配列決定に基づいて、各株が、トーチ・ハイブリダイゼーション領域に対応するヌクレオチド配列中に単一の点突然変異を含有することが決定された。点突然変異の位置は、各株で異なった(配列番号89〜90)。
[00124]原型カンピロバクター属アッセイの機能性を試験するため、20の鶏肉洗浄液を調製した。400mLの緩衝ペプトン水(BPW)を含む大きな密封可能プラスチック袋に、羽を除いたニワトリ全身死体(およそ2〜5ポンド)を入れることによって、洗浄液を得た。袋を振り、そして手で袋の外から押すことによって、BPWをニワトリ全体に行き渡らせた。すべての反応を4つの複製物中で行った。増幅オリゴ組み合わせ、配列番号7、26、50および67、ならびにターゲット捕捉オリゴ、配列番号73を用いて、500μLの洗浄液をアッセイすることによって、カンピロバクター属の直接検出を行った。カンピロバクター属および内部対照増幅オリゴを以下の濃度で用いた: 5pM T7プロバイダー、0.5pMブロッカー、5pMプライマーおよび8pMトーチ。比較のため、USDA推奨培養法と実質的に類似の培養法を用いてもまた、洗浄液をアッセイした。カンピロバクター・ジェジュニ、ATCC 33291は、反応あたり1E5コピーで、陽性対照であった。溶解緩衝液を陰性対照として用いた。アッセイは、ターゲット捕捉のためにKingFisher96装置を用い、プライマーをアニーリングし、そして酵素を添加するためにEppendorfサーモミキサーを用い、そして検出のためにPTI−FP−2(登録商標)FluoDiaプレート読み取り装置を用いた。ターゲット捕捉のためのインプットは500μLであり、ターゲット捕捉のためのアウトプットは100μLであり、このうち30μLを増幅に用いた。陽性基準を1000RFUに設定した。カンピロバクター属の増幅は、すべての洗浄液に関して、18.7分の平均および中央値T時間で見られた。偽陽性はまったく検出されなかった。表13。USDA培養法を用いると、これらの洗浄液のいずれにおいても、カンピロバクター属種の検出はなかった。
Claims (58)
- 試料中のカンピロバクター属(Campylobacter)ターゲット核酸を特異的に検出するための方法であって:
(a)少なくとも1つのカンピロバクター属ターゲット核酸を含有すると推測される試料を提供し;
(b)前記試料を少なくとも2つの増幅オリゴマーと接触させ、ここで、第一の前記増幅オリゴマーは、長さ15〜45ヌクレオチドであり、そしてGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド108〜150に対応するカンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして第二の前記増幅オリゴマーは、長さ15〜45ヌクレオチドであり、そしてGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド170〜226に対応するカンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含む;
(c)in vitro核酸増幅反応を行い、ここで、前記試料中に存在するC.ジェジュニ(C. jejuni)・ターゲット核酸、C.コリ(C. coli)・ターゲット核酸およびC.ラリ(C. lari)・ターゲット核酸のいずれかが、増幅産物を生成するためのテンプレートとして用いられる;そして
(d)前記増幅産物を検出する核酸検出反応を実行して、カンピロバクター属ターゲット核酸が前記試料中に存在するかどうかを決定する
工程を含む、前記方法。 - 試料中のカンピロバクター属ターゲット核酸を特異的に検出するための方法であって:
(a)少なくとも1つのカンピロバクター属ターゲット核酸を含有すると推測される試料を提供し;
(b)前記試料を、C.ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにC.コリ、C.ラリまたはC.コリおよびC.ラリ・ターゲット核酸に安定してハイブリダイズする少なくとも2つの増幅オリゴマーと接触させ、ここで、第一の前記増幅オリゴマーは、長さ15〜45ヌクレオチドであり、そしてGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド108〜150に対応するカンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして第二の前記増幅オリゴマーは、長さ15〜45ヌクレオチドであり、そしてGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド170〜226に対応するカンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含む;
(c)in vitro核酸増幅反応を行い、ここで、前記試料中に存在するターゲット核酸が、増幅産物を生成するためのテンプレートとして用いられる;そして
(d)前記増幅産物を検出する核酸検出反応を実行して、カンピロバクター属ターゲット核酸が前記試料中に存在するかどうかを決定する
工程を含む、前記方法。 - 前記の第一の前記増幅オリゴマーが: GenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド115〜150に対応する領域; GenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド115〜135に対応する領域; およびGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド125〜150に対応する領域からなる群より選択される、カンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定されたターゲットハイブリダイズ配列を含む、請求項1または2の方法。
- 前記の第二の前記増幅オリゴマーが配列番号7を含む、請求項3の方法。
- 前記の第二の前記増幅オリゴマーが: GenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド170〜212に対応する領域; GenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド184〜212に対応する領域; およびGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド170〜205に対応する領域からなる群より選択される、カンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定されたターゲットハイブリダイズ配列を含む、請求項1または請求項2の方法。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが、本質的に配列番号27からなるターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして5’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項5の方法。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが配列番号26を含む、請求項5の方法。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが、本質的に配列番号33からなるターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして5’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項5の方法。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが配列番号32を含む、請求項5の方法。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが、配列番号18〜33および84〜88からなる群より選択され、ここで、配列番号19、21、23、25、27、29、31および33が5’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項1または請求項2の方法。
- 前記の第二の増幅オリゴマーが、配列番号1〜14からなる群より選択される、請求項1または請求項2の方法。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号26からなる、請求項11の方法。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号32からなる、請求項11の方法。
- 前記の第二の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号7からなる、請求項1または請求項2の方法。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが、5’プロモーター配列をさらに含む、プロモーターに基づく増幅オリゴマーである、請求項1または請求項2の方法。
- 前記5’プロモーター配列が配列番号75である、請求項15の方法。
- 工程bが、前記試料とブロッカーオリゴマーを接触させる工程をさらに含む、請求項1または請求項2の方法。
- 前記ブロッカーオリゴマーが、本質的に配列番号50からなる、請求項17の方法。
- 前記検出反応が、前記増幅産物の部分にハイブリダイズするように設定された検出プローブオリゴマーと、前記増幅産物を接触させる工程を含む、請求項1または請求項2の方法。
- 前記検出がリアルタイム検出である、請求項19の方法。
- 前記検出オリゴマーが配列番号63〜68からなる群より選択される、請求項19の方法。
- 前記検出オリゴマーが、本質的に配列番号67からなる、請求項19の方法。
- 前記検出オリゴマーが、本質的に配列番号68からなる、請求項19の方法。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが、配列番号26、配列番号32、および配列番号84〜88からなる群より選択され、そして前記の第二の増幅オリゴマーが配列番号7である、請求項1または請求項2の方法。
- 前記検出反応が、配列番号67および配列番号68からなる群より選択される検出プローブオリゴマーと、前記増幅産物を接触させる工程を含む、請求項24の方法。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが配列番号26であり、そして工程bが、本質的に配列番号50からなるブロッカーと前記試料を接触させる工程をさらに含む、請求項25の方法。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが配列番号32であり、そして工程bが、本質的に配列番号50からなるブロッカーと前記試料を接触させる工程をさらに含む、請求項25の方法。
- カンピロバクター属ターゲット核酸を含有すると推測される前記試料と、ターゲット捕捉オリゴマーを接触させる工程をさらに含む、請求項1または請求項2の方法。
- 前記ターゲット捕捉オリゴマーが、配列番号58、71および73からなる群より選択される、請求項28の方法。
- 前記試料が、C.ジェジュニ、C.コリ、またはC.ラリに緊密に関連する1以上の細菌由来の核酸をさらに含有し、そして前記ターゲット核酸が、前記試料中で特異的に検出される、請求項1または請求項2の方法。
- 前記の1以上の細菌が:C.フィタス亜種フィタス(C. Fetus, ssp. fetus)、C.フィタス亜種ベネレアリス(C. fetus ssp venerealis)、C.ウプサリエンシス(C upsaliensis)、大腸菌(E. coli)、C.フェカリス(C. fecalis)、S.エンテリディス(S. enteridis)、H.ピロリ(H. pylori)、E.ブルナリス(E. vulnaris)、E.ヘルマニ(E. hermannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エドワージエラ・ホシナエ(Edwardsiella hoshinae)、P.ミリバリス(P. miribalis)、シトロバクター・ブラキ(Citrobacter brakii)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、A.ブツレリ(A. butzleri)、C.フィタス亜種フィタス、C.フィタス亜種ベネレアリス、およびC.ウプサリエンシスの少なくとも1つである、請求項30の方法。
- 工程cで、C.ジェジュニ、C.コリ、またはC.ラリに緊密に関連する1以上の細菌由来の核酸の存在下で、前記ターゲット核酸が特異的に増幅される、請求項1または請求項2の方法。
- 前記の1以上の細菌が:C.フィタス亜種フィタス、C.フィタス亜種ベネレアリス、C.ウプサリエンシス、大腸菌、C.フェカリス、S.エンテリディス、H.ピロリ、E.ブルナリス、E.ヘルマニ、エンテロバクター・クロアカ、エドワージエラ・ホシナエ、P.ミリバリス、シトロバクター・ブラキ、蛍光菌、シゲラ・フレックスネリ、エロモナス・ハイドロフィラ、A.ブツレリ、C.フィタス亜種フィタス、C.フィタス亜種ベネレアリス、およびC.ウプサリエンシスの少なくとも1つである、請求項32の方法。
- C.ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにC.コリ、C.ラリまたはC.コリおよびC.ラリ・ターゲット核酸に安定してハイブリダイズ可能である、少なくとも2つの増幅オリゴマーを含む、カンピロバクター属ターゲット核酸増幅アッセイにおいて使用するための組成物であって、第一の前記増幅オリゴマーは、長さ15〜45ヌクレオチドであり、そしてGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド108〜150に対応するカンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして第二の前記増幅オリゴマーは、長さ15〜45ヌクレオチドであり、そしてGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド170〜226に対応するカンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含む、前記組成物。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが: GenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド115〜150に対応する領域; GenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド115〜135に対応する領域; およびGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド125〜150に対応する領域からなる群より選択される、カンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定されたターゲットハイブリダイズ配列を含む、請求項34の組成物。
- 前記の第二の前記増幅オリゴマーが配列番号7を含む、請求項35の組成物。
- 前記の第二の前記増幅オリゴマーが: GenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド170〜212に対応する領域; GenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド184〜212に対応する領域; およびGenBank寄託番号AF393202.1、gi:20378208のヌクレオチド170〜205に対応する領域からなる群より選択される、カンピロバクター属16S rRNA遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定されたターゲットハイブリダイズ配列を含む、請求項34の組成物。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが、本質的に配列番号27からなるターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして5’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項37の組成物。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが配列番号26を含む、請求項37の組成物。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが、本質的に配列番号33からなるターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして5’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項37の組成物。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが配列番号32を含む、請求項37の組成物。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが、配列番号18〜33および84〜88からなる群より選択され、ここで、配列番号19、21、23、25、27、29、31および33が5’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項34の組成物。
- 前記の第二の増幅オリゴマーが、配列番号1〜14からなる群より選択される、請求項34の組成物。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号26からなる、請求項43の組成物。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号32からなる、請求項43の組成物。
- 前記の第二の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号7からなる、請求項34の組成物。
- 前記の第一の前記増幅オリゴマーが、5’プロモーター配列をさらに含む、プロモーターに基づく増幅オリゴマーである、請求項34の組成物。
- 前記5’プロモーター配列が配列番号75である、請求項47の組成物。
- ブロッカーオリゴマーをさらに含む、請求項34の組成物。
- 前記ブロッカーオリゴマーが、本質的に配列番号50からなる、請求項49の組成物。
- 前記の少なくとも2つの増幅オリゴマーによって、ターゲット核酸から生成された増幅産物の部分にハイブリダイズするよう設定された検出オリゴマーをさらに含む、請求項34の組成物。
- 前記検出オリゴマーが配列番号63〜68からなる群より選択される、請求項51の組成物。
- 前記検出オリゴマーが、本質的に配列番号67からなる、請求項51の組成物。
- 前記検出オリゴマーが、本質的に配列番号68からなる、請求項51の組成物。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが、配列番号26、配列番号32、および配列番号84〜88からなる群より選択され、そして前記の第二の増幅オリゴマーが配列番号7である、請求項34の組成物。
- 配列番号67および配列番号68からなる群より選択される検出オリゴマーをさらに含む、請求項55の組成物。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが配列番号26であり、そして前記組成物が配列番号50をさらに含む、請求項56の組成物。
- 前記の第一の増幅オリゴマーが配列番号32であり、そして前記組成物が配列番号50をさらに含む、請求項56の組成物。
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