JP2003520578A - 環境サンプルからの核酸の入手方法、得られた核酸、および新規化合物の合成における用途 - Google Patents

環境サンプルからの核酸の入手方法、得られた核酸、および新規化合物の合成における用途

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クルトワ，ソフイー
カペラノ，カルムラ
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バル，マリア
スゾノ，グナデイ
テユフイル，カリーヌ
フロステガード，アサ
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アバンテイス・フアルマ・エス・アー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、環境サンプルからの核酸の製造方法、より詳しくは、サンプルからの核酸のライブラリーの入手方法に関する。本発明はまた、該方法により得られた核酸ライブラリーの核酸、及び新規化合物（特に、治療上関心のある新規化合物）の合成におけるそれらの用途に関する。本発明は更に、該核酸を入手するための方法で用いる新規手段（例、新規ベクター）、及び該核酸を含む該ベクターまたは組換え宿主細胞の新規製造方法に関する。最後に、本発明は、該方法により得られた核酸のライブラリーにおける関心のある核酸の検出方法、及び該方法により検出された核酸、及び該核酸にコードされるポリペプチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、環境サンプルからの核酸の製造方法、より詳しくは、サンプルから
の核酸の集団（コレクション）の入手方法に関する。本発明はまた、該方法によ
り得られた核酸または核酸の集団、および新規化合物（特に、治療上関心のある
新規化合物）の合成におけるそれらの用途に関する。
【０００２】 本発明はまた、核酸を入手するための前記方法で用いる新規手段（例えば、新
規ベクター）、および本発明の核酸を含むそのようなベクターまたは組換え宿主
細胞の新規製造方法に関する。
【０００３】 本発明はまた、前記方法により得られた核酸の集団における関心のある核酸の
検出方法、およびそのような方法により検出された核酸、およびそのような核酸
にコードされるポリペプチドに関する。
【０００４】 本発明はまた、前記方法により得られた及び検出された核酸、特に、抗生物質
、例えばβ−ラクタム、アミノグリコシド、ヘテロ環ヌクレオチドまたはポリケ
チドの生合成経路に関与する酵素をコードする核酸、およびこれらの核酸にコー
ドされる酵素、これらの核酸の発現手段により製造されたポリケチド、そして最
後に、そのような核酸の発現手段により製造されたポリケチドの薬理学的に活性
な量を含む医薬組成物に関する。
【０００５】 放線菌類によるストレプトマイシンの産生の発見以来、治療上関心のある新規
化合物、特に新規抗生物質の探索においては、土壌微生物により産生された代謝
産物のスクリーニング方法の利用が増えている。
【０００６】 そのような方法は、主として、土壌微生物叢の生物を分離し、特別に適合化さ
れた栄養培地内でそれらを培養し、ついで、予め１以上の分離および／または精
製工程に適宜付された細胞ライセート内または培養上清内に存在する産物におけ
る薬理学的活性を検出することを含む。
【０００７】 このように、地上（ｔｅｌｌｕｒｉｃ、地球上）微生物叢を構成する生物のイ
ンビトロでの分離および培養のための方法は、現在までに、約４０，０００種の
分子の特徴づけを可能にしており、それらの約半数は生物活性を示している。
【０００８】 主な産物、例えば、抗生物質（ペニシリン、エリスロマイシン、アクチノマイ
シン、テトラサイクリン、セファロスポリン）、抗癌剤、抗コレステロール血症
剤または農薬は、そのようなインビトロ培養方法により特徴づけられている。
【０００９】 現在までに公知の微生物由来の治療上関心のある産物の大部分（約７０％）は
、放線菌類、特に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に由来
する。しかし、他の治療用化合物、例えば、テイコプラニン、ゲンタマイシンお
よびスピノシンは、培養がより困難な属の微生物、例えば、ミクロモノスポラ（
Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、アクチノマデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒ
ａ）、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ）、ストレプトスポランギウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒｏｎｇｉｕｍ
）、キタサトスポリア（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ）またはサッカロモノス
ポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）から分離されている。
【００１０】 しかし、実際に示されているところによれば、土壌微生物叢の微生物により合
成される新規天然物の特徴づけは依然として限られたものに過ぎず、それは１つ
には、インビトロ培養工程が、通常は、既に公知の生物の選択を引き起こすから
である。
【００１１】 このように、関心のある新規化合物を同定するための地上微生物のインビトロ
での分離および培養のための方法は、多数の制限を有する。
【００１２】 例えば、放線菌類では、既に公知の抗生物質が再発見される割合が約９９％で
ある。特に、蛍光顕微鏡検査技術は、土壌１ｇ中の１０１０個を超える細菌細胞
の計数を可能にしているが、培地上での接種後に単離されうるのは、これらの細
菌の０．１％〜１％に過ぎない。
【００１３】 ＤＮＡ組換え動力学的（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）技術の手助けにより、１２，００
０〜１８，０００の細菌種が土壌１ｇ中に含有されうることを示すことが可能と
なっているが、一方、非真核微生物は、現在のところ、すべての生息場所を考慮
しても、５０００種が記載されているに過ぎない。
【００１４】 分子生態学的研究により、環境ＤＮＡから多数の１６Ｓ ｒＤＮＡ新規配列を
増幅しクローニングすることが可能となっている。
【００１５】 これらの研究の結果、既に特徴づけされている細菌門の数は３倍になった。
【００１６】 現時点では、細菌は４０個の門に細分されており、それらのいくつかは、培養
不可能な細菌のみよりなる。これらの最近の結果は、現在までに未利用のままの
微生物の生物多様性の広さを証明している。
【００１７】 最近の研究においては、特に、産業上関心のある（特に、治療上関心のある）
化合物の分離および特徴づけの前のインビトロ培養の工程を含む、土壌微生物叢
の生物多様性の利用に対する多数の障害を克服するための試みがなされている。
【００１８】 例えば、適当な場合には、土壌サンプル中に含有される生物の分離の前に、地
上生物からＤＮＡを抽出する工程を含む方法が開発されている。
【００１９】 予めインビトロで培養することなく細菌細胞を細胞溶解した後、このようにし
て抽出されたＤＮＡを、宿主生物のトランスフェクトに用いられるベクター内に
クローニングして、土壌細菌に由来するＤＮＡのライブラリーを構築する。
【００２０】 組換えクローンのこれらのライブラリーを使用して、治療上関心のある化合物
をコードする遺伝子の存在を検出したり、あるいはこれらの組換えクローンによ
る治療上関心のある化合物の産生を検出する。
【００２１】 しかし、先行技術において記載されている、土壌微生物叢のＤＮＡを直接利用
するための方法は、前記工程のそれぞれの実施中の欠点を示しており、これらの
欠点は、得られる及び利用可能な遺伝物質の量および質を相当に損なう性質のも
のである。
【００２２】 土壌サンプルに由来するＤＮＡのライブラリーを構築するための工程のそれぞ
れに関する先行技術を、本出願人により確認され本発明により克服された技術的
な欠点と共に、以下に詳しく説明する。
【００２３】 １．土壌サンプルからＤＮＡを抽出する工程 １．１ 環境ＤＮＡの直接的抽出 これは、実質的には、環境サンプルに対して通常は該サンプル中の生物の予備
的ｉｎ ｓｉｔｕ細胞溶解の後に直接行うＤＮＡ抽出技術を用いる方法である。
【００２４】 そのような技術は、淡水および海水の両方からの水性媒体に由来するサンプル
に対して用いられている。それらは、一般には、種々の濾過装置上での大容積の
水の濾過、例えば、通常の膜濾過、接線（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）もしくは回転
濾過または限外濾過よりなる、自由な形態または粒子の形態で存在する細胞を予
備濃縮する第１工程を含む。
【００２５】 該細孔径は０．２２〜０．４５ｍｍであり、大容積の処理による目詰まりを避
けるために予備濾過を要することも多い。
【００２６】 第２段階では、集めた細胞を、酵素的および／または化学的処理により、小容
積の溶液中、フィルター上で直接的に細胞溶解する。
【００２７】 この技術は、例えば、Ｓｔｅｉｎら，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７８（３）：５９１−５９９の研究により例
示されており、該著者は、海洋プランクトンの古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅ
ｒｉａ）からの転写伸長因子（ＥＦ２）をコードする及びリボソームＤＮＡをコ
ードする遺伝子のクローニングを記載している。
【００２８】 土壌または堆積物のサンプルからのＤＮＡの直接的抽出の技術も既に記載され
ており、それらは、ｉｎ ｓｉｔｕで行う物理的、化学的または酵素的細胞溶解
に基づくものである。
【００２９】 例えば、米国特許第５ ８２４ ４８５号（Ｃｈｒｏｍａｘｏｍｅ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）は、グアニジウム イソチオシアナートに基づく熱細胞溶解バ
ッファーの添加によりサンプルに直接的に行う細菌の化学的細胞溶解を記載して
いる。
【００３０】 国際特許出願ＷＯ ９９／２０７９９（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、プロテアーゼおよびＳＤＳを含
有する抽出バッファーを使用する細菌のｉｎ ｓｉｔｕ細胞溶解の工程を記載し
ている。
【００３１】 サンプルに対して数サイクルの凍結・融解を行い次いで該融解サンプルの高圧
プレスを行うような他の技術も用いられている。超音波処理、超音波での加熱お
よび熱ショックの一連の工程を用いる細菌細胞溶解の技術も用いられている（Ｐ
ｉｃａｒｄら．１９９２）。
【００３２】 しかし、ＤＮＡの直接的抽出のための前記の先行技術は、量的および質的な点
で、有効性に非常にばらつきがある。
【００３３】 例えば、該サンプルのｉｎ ｓｉｔｕ化学的または酵素的処理は、形態学的特
徴の不均質性による細胞溶解工程に固有の種々の微生物の選択的抵抗性のため、
ある範疇の微生物のみを細胞溶解するという欠点を有する。
【００３４】 例えば、グラム陽性細菌は、熱ＳＤＳ界面活性剤での処理に抵抗性であり、一
方、実質的に全てのグラム陰性細胞は細胞溶解される。
【００３５】 また、前記の直接的抽出プロトコールのいくつかは、該サンプルの無機質粒子
上への抽出核酸の吸着を促進して、入手可能なＤＮＡの量を有意に減少させる。
【００３６】 さらに、先行技術のプロトコールのいくつかは、採取されたサンプル中の微生
物を細胞溶解するための機械的処理工程を開示しているが、そのような機械的細
胞溶解工程は、抽出バッファー中の液体媒体中で系統的に行われ、それは、サン
プル中に存在する微生物の多様性に対する最大の利用可能性を可能にする微粒子
形態の出発サンプルの良好な均質化を可能にしない。ガラスビーズを使用して、
粗土壌サンプル上で粉砕試験も行われているが、抽出されたＤＮＡの量は少なか
った。
【００３７】 液体媒体中のｉｎ ｓｉｔｕ機械的細胞溶解の第１工程は、抽出されうるＤＮ
Ａの量に対して負の影響を及ぼすことが、本発明において観察されている。
【００３８】 また、組換えベクター内のクローニングに直接使用されうるＤＮＡの量は、そ
の抽出の後の精製工程に左右される。
【００３９】 先行技術においては、抽出されたＤＮＡを次いで、例えば、ポリビニルポリピ
ロリドンを使用することにより、あるいは酢酸アンモニウムまたは酢酸カリウム
の存在下での沈殿により、あるいは塩化セシウム勾配上での遠心分離により、あ
るいは特にヒドロキシアパタイト担体、イオン交換カラムまたは分子ふるい上の
クロマトグラフィー技術により、あるいはアガロースゲル上での電気泳動技術に
より精製する。
【００４０】 既に記載されているＤＮＡ精製技術は、特に、環境ＤＮＡを抽出するための前
記技術と組合せた場合には、除去が困難な初期サンプル由来の阻害性化合物と該
ＤＮＡとの共精製（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）につながりやすい。
【００４１】 阻害性化合物と該ＤＮＡとの共抽出は必然的に精製工程数の増加を招き、これ
は、最初に抽出されたＤＮＡの相当な喪失につながり、同時に、該サンプル中に
最初に含まれていた遺伝物質の多様性およびその質を減少させる。
【００４２】 本発明のもう１つの目的は、一方では、予備精製プロトコールの欠点を克服す
ること、および初期サンプル中のＤＮＡの最適レベルの多様性の維持を可能にす
るＤＮＡ精製工程を開発すること、そして他方では、その製造を定量的に促進す
ることにあった。
【００４３】 最も詳しくは、ＤＮＡの精製に対する定性的および定量的改良は、後記に説明
するとおり、それが本発明の直接的ＤＮＡ抽出方法と後続の精製方法との組合せ
を用いた場合に最高となる。
【００４４】 １．２．環境ＤＮＡの間接的抽出 そのような技術は、実際のＤＮＡ抽出工程の前に、地上微生物叢中の種々の生
物を出発サンプルのその他の構成成分から分離する第１工程を含む。
【００４５】 最新技術においては、土壌サンプルからの微生物画分の予備分離は、通常、そ
れを液体媒体中で粉砕することによる（例えば、Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒ
または乳鉢のような装置を使用することによる）該サンプルの物理的分散を含む
。
【００４６】 化学的分散、例えば、イオン交換樹脂上での分散または非特異的界面活性剤（
例えば、デオキシコール酸ナトリウムまたはポリエチレングリコール）を使用す
る分散も、既に記載されている。どのような分散方法であろうと、固体サンプル
を水、リン酸バッファーまたは食塩溶液に懸濁すべきである。
【００４７】 該物理的または化学的分散工程の後、該サンプル中に含まれる細胞の及びこの
サンプル粒子の分離を可能にする密度勾配上での遠心分離を行うことが可能であ
り、ほとんどの土壌粒子より低い密度を細菌が有すると理解される。
【００４８】 あるいは、該物理的分散工程の後、低速遠心分離の工程または細胞水ひの工程
を行うことができる。
【００４９】 ついで、該ＤＮＡを、分離された細胞から、いずれかの利用可能な細胞溶解方
法により抽出することが可能であり、前記１．１節に記載の精製方法を含む多数
の方法により精製することが可能である。特に、該細胞溶解を制御するために、
低融点アガロース中に該細胞を加えることが可能である。
【００５０】 しかし、本出願人に公知の先行技術に記載されている方法は、ＤＮＡの最終的
な質および量に有意な影響を及ぼす出発サンプルの望ましくない構成成分が抽出
ＤＮＡ含有画分中に存在するため、満足しうるものではない。
【００５１】 後記のとおり、本発明は、先行技術の方法において見出される技術的課題を解
決するために提示するものである。
【００５２】 ２．抽出されたＤＮＡの分子特徴づけ 環境サンプル（特に、土壌サンプル）からのＤＮＡライブラリーを構築したい
場合には、抽出および精製されたＤＮＡ源の質および多様性を、それを適当なベ
クター内に挿入する前に確認するのが好都合である。
【００５３】 抽出および精製されたＤＮＡのそのような分子特徴づけの目的は、該ＤＮＡ抽
出物中に存在する種々の細菌分類群の比率を表すプロフィールを得ることにある
。抽出および精製されたＤＮＡの分子特徴づけは、種々の抽出および精製工程の
実施中に人為産物が導入されたか否か、および適当な場合には、抽出および精製
されたＤＮＡの元の多様性が、サンプル（特に、土壌サンプル）中に最初に存在
した微生物多様性を表すか否かを判定することを可能にする。
【００５４】 本出願人が知る限りにおいては、先行技術は、該環境から抽出されたＤＮＡに
直接適用される種々の細菌群に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用する
定量的ハイブリダイゼーションン方法を利用するものである。
【００５５】 残念なことに、そのようなアプローチは、比較的に低感度であり、少量で存在
する分類群または属の検出を可能にしない。
【００５６】 先行技術においては、ＭＰＮ−ＰＣＲまたは競合的定量的ＰＣＲのような定量
的ＰＣＲ法も記載されている。しかし、これらの技術は大きな欠点を有する。
【００５７】 例えば、ＭＰＮ−ＰＣＲは、希釈および反復の回数が多いため実施が面倒であ
り、そのため、多数のサンプルまたはプライマーペアには不適となる。
【００５８】 さらに、競合的定量的ＰＣＲは、標的ＤＮＡに特異的であり更には該競合自体
に偏り又は人為産物を誘導しない競合体の構築が必要であるため、実施が困難で
ある。
【００５９】 したがって、本発明では、予め抽出および精製されたＤＮＡの質の試験および
この精製された出発ＤＮＡから調製されたクローンのライブラリーの構築の価値
の判定を可能にし迅速、簡便かつ高信頼性である、環境サンプルに由来するＤＮ
Ａのライブラリーを予備スクリーニングするための方法を提示する。
【００６０】 ３．環境サンプルから抽出および精製されたＤＮＡをクローニングするための ベクター 先行技術においては、環境サンプルから予め抽出されたＤＮＡをクローニング
するための多数のベクターが既に記載されている。
【００６１】 例えば、国際特許出願ＷＯ ９９／２０７９９の記載によれば、ウイルスベク
ター、ファージ、プラスミド、ファジミド、コスミド、ホスミド、ＢＡＣ（細菌
人工染色体）タイプまたはバクテリオファージＰ１のベクター、ＰＡＣタイプ（
バクテリオファージＰ１に基づく人工染色体）のベクター、ＹＡＣ（酵母人工染
色体）タイプのベクター、酵母プラスミド、または安定にゲノムＤＮＡを維持し
発現しうる他の任意のベクターを使用することができる。
【００６２】 ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９９／２０７９９の実施例１は、ＢＡＣタイプのベクタ
ー内へのクローニングによるゲノムライブラリーの構築を記載している。
【００６３】 本出願人が知る限りにおいては、環境サンプル由来のＤＮＡライブラリーは、
接合型のベクターでは未だ有効に製造されておらず、そのような技術は、本発明
の教示により初めて、当業者に利用可能かつ再現性あるものとなった。
【００６４】 ４．宿主細胞 先行技術においては、環境サンプルから抽出および精製されたＤＮＡに由来す
るＤＮＡのインサートを含有するベクターを収容するために使用可能なものとし
て、多数の宿主細胞が記載されている。
【００６５】 例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９９／２０７９９には、多数の適当な宿主細胞
、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、特に、株ＤＨ １０
Ｂまたは株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６、株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ １７７６（ＡＴＣＣ番号３１．５３７）、大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＤＨ５αおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２
７．３２５）が挙げられている。
【００６６】 このＰＣＴ特許出願はまた、他の適当な宿主細胞、例えば、エンテロバクター
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエ
ラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ（Ｓｃｈｉｇｅ
ｌｌａ）、またはバシラス型の株、例えば、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）およびバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｓ）属の細菌を挙げている。
【００６７】 米国特許第５ ８２４ ４８５号は特に、ストレプトマイセス・リビダンス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ６６株または酵母細胞、例
えばサッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を挙
げている。
【００６８】 ５．環境サンプル由来のＤＮＡライブラリーにおける関心のある遺伝子の特徴 づけ ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９９／２０７９９は、それぞれ、溶血素を産生するクロ
ーン、エスクリンを加水分解するクローンまたはオレンジ色素を産生するクロー
ンである、バシラス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）のＤＮＡライブラリーに属
する種々のクローンの表現型の同定を記載している。
【００６９】 ｐｈｏＡ酵素をコードするトランスポゾンの使用に基づく突然変異誘発技術は
、次いで突然変異誘発クローンを単離し、観察される表現型をもたらす配列を特
徴づけることを可能にした。
【００７０】 Ｓｔｅｉｎら（１９９６）の前記文献は、海洋プランクトンである古細菌のゲ
ノムＤＮＡライブラリーの或るクローンにより保持されたベクター内に挿入され
たＤＮＡを増幅するための、リボソームＤＮＡに対する特異的プライマーの使用
、およびそのようにして増幅されたＤＮＡ内のいくつかのコード配列の同定を記
載している。
【００７１】 Ｂｏｒｓｃｈｅｒｔ Ｓ．ら（１９９２）の文献は、バシラス・サチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノム内の１以上の対応遺伝子を同定す
るために、公知ペプチドシンテターゼの保存領域にハイブリダイズするプライマ
ーのペアを使用する、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）のゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを記載している。
【００７２】 この技術は、サーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）生合成オペロンを保持す
る約２６ｋｂの染色体ＤＮＡ断片を検出することを可能にした。
【００７３】 Ｋａｈ−Ｔｏｎｇ Ｓ．ら（１９９７）の文献は、ＩＩ型ポリケチドの生合成
経路をもたらすオペロンの保存配列にハイブリダイズするプライマーを使用する
、土壌由来のＤＮＡのライブラリーのスクリーニングを記載しており、ＰＫＳ−
β遺伝子に属する配列の、このＤＮＡライブラリーにおける同定を示している。
この文献はまた、ポリケチドの生合成をもたらすオペロン内に天然で見出される
ＰＫＳ−βサブユニットの配列が、該ＤＮＡライブラリー内で見出される種々の
同様の配列で置換されたハイブリッド発現カセットの構築を記載している。
【００７４】 同様に、Ｈｏｎｇ−Ｆｕら（１９９５）の文献は、ポリケチドの生合成をもた
らすオペロンの種々のオープンリーディングフレームを含有する発現カセットの
構築を記載しており、そのような種々の発現カセットは、ストレプトマイセス・
ケリコロール（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のゲノム内
に天然で一緒には見出されないオープンリーディングフレームを合体させること
により人工的に構築されている。この文献は、種々の細菌株由来のオープンリー
ディングフレームの、該人工発現カセットにおける組合せが、バシラス・サチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバシラス・セレウス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）に対する比較的大きな抗生物質活性ならびに種々の
構造的特徴を有するポリケチドの産生を可能にすることを示している。
【００７５】 ポリケチドは、生物活性の大きな多様性を有する種々の構造の天然物の大きな
ファミリーの一部を形成する。ポリケチドとしては、例えば、テトラサクリンお
よびエリスロマイシン（抗生物質）、ＦＫ５０６（免疫抑制剤）、ドキソルビシ
ン（抗癌剤）、モネンシン（コクシジウム増殖阻止剤）およびアベルメクチン（
抗寄生虫剤）が挙げられる。
【００７６】 これらの分子は、アシルチオエステル（一般には、アセチル、プロピオニル、
マロニルまたはメチルマロニルチオエステル）間の縮合の反復サイクルを触媒す
るポリケチドシンターゼとして公知の多機能酵素により合成される。各縮合サイ
クルは、成長中の炭素鎖上にβ−ケト基の形成をもたらし、それは次いで、適宜
、１以上の一連の還元工程を受けうる。
【００７７】 ポリケチドに対する多大な臨床的関心、それらの共通の生合成メカニズム、お
よびポリケチドシンターゼをコードする遺伝子のグループ間で認められる高度な
保存性を考慮して、遺伝子工学による新規ポリケチドの開発に対する関心が増大
している。
【００７８】 例えば、メデルホジン（ｍｅｄｅｒｒｈｏｄｉｎ）Ａまたはジヒドログラナチ
ルホジン（ｄｉｈｙｄｒｏｇｒａｎａｔｉｒｈｏｄｉｎ）のような新規人工ポリ
ケチドが遺伝子工学により製造されている。遺伝子工学により得られた新規ポリ
ケチド分子の大多数は、対応する天然ポリケチドとは構造上非常に異なる。
【００７９】 関心のある新規ポリケチド（特に、公知ポリケチドより広い又は他方ではより
選択的である、それらの天然ホモログと比較して増加したレベルの抗生物質活性
または異なる抗生物質活性スペクトルを有する、特に、治療上関心のあるポリケ
チド）を得ることが必要とされていることが、先行技術から明らかである。
【００８０】 後記のとおり、この要求は本発明により部分的に満たされる。
【００８１】 （発明の記載） 本発明は、第１に、環境サンプルに由来するＤＮＡのライブラリーを構築する
ための方法に関する。そのようなサンプルとしては恐らく、手当たり次第に列挙
すると、水性媒体（淡水または海水）、土壌のサンプル（土壌の表層、下層土ま
たは堆積物）、または付随微生物叢を含有する真核生物のサンプル、例えば、植
物、昆虫または海洋生物に由来し付随微生物叢を有するサンプルが挙げられるで
あろう。
【００８２】 環境サンプル（特に、土壌サンプル）からのＤＮＡのライブラリーを構築する
ための方法の開発は、関心のある核酸の含量が初めの設定目標を満たすＤＮＡラ
イブラリーを得るために実施が必ず最適化されなければならない決定的に重要な
工程を含む。
【００８３】 第１の決定的に重要な工程は、サンプル中に最初に含まれる核酸（すなわち、
主に、このサンプルの微生物叢が構成される種々の生物中に含まれる核酸）を抽
出し次いで精製することを含む。
【００８４】 抽出されたＤＮＡの精製の質は、得られる結果を決定する因子である。
【００８５】 環境サンプル由来の核酸のライブラリーを構築するための第２の重要な工程は
、抽出および精製された核酸の遺伝的多様性の評価である。出発サンプル中に最
初に存在する生物の系統発生的多様性が少なくとも部分的に考慮されることを確
認するための、抽出および精製されたＤＮＡの簡便かつ信頼しうる予備スクリー
ニングのための工程の開発は、核酸ライブラリー自体の構築のための抽出および
精製された初期ＤＮＡ源の使用の価値などを判定すること、あるいは、それとは
逆に、該核酸の抽出および精製の時点で導入された過剰な人為産物のために核酸
ライブラリーの構築を継続しないと決定することを有効に可能にする。また、該
ライブラリーを構築するためにベクター内に導入されたインサートの質が決定因
子であることが、本発明において確認された。例えば、環境サンプルから抽出お
よび精製されたＤＮＡを切断するための制限酵素の使用は、得られるインサート
の構造内に人為産物または「偏向（バイアス、ｂｉａｓ）」を導入する性質のも
のであることが確認された。特に、培養不可能な生物に大多数の場合は由来する
土壌または他の環境から抽出されたＤＮＡは、自明のこととしてＧおよびＣ塩基
の含量が未知であり更にはこれらの生物の起源に応じて様々な分子から構成され
る。
【００８６】 第３の決定的に重要な工程は、選択された長さの核酸を組込みうるベクター内
への、抽出および精製された核酸の挿入であり、それは、一方では、与えられた
宿主細胞のゲノム内へのそれらのトランスフェクションまたは組込みを可能にし
、他方では、適宜、そのような宿主細胞内でのそれらの発現を可能にする。
【００８７】 達成される目的が、産業上関心のある化合物（特に、医薬上または農業上関心
のある化合物）の完全な生合成経路を導きうる完全なオペロンのクローニングお
よび同定にある場合には、大きな核酸（すなわち、１００ｋｂより大きなサイズ
のもの）を組込みうるベクターが、関心のあるベクターとなる。
【００８８】 定義 本発明の目的においては、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌ
クレオチド」なる語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列だけではなく、一本鎖または二
本鎖の形態の２ヌクレオチドを超えるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ配列をも意味
する。
【００８９】 「ライブラリー」または「集団（コレクション）」なる語は、本明細書におい
ては、環境サンプルに由来する抽出された、そして適当な場合には精製された核
酸のセット（組）、組換えベクターのセット（該セットの組換えベクターのそれ
ぞれは、前記の抽出された、そして適当な場合には精製された核酸のセットに由
来する核酸を含む）、または前記の抽出された、そして適当な場合には精製され
た核酸のセットに由来する１以上の核酸を含む組換え宿主細胞のセット（該核酸
は、１以上の組換えベクターに保持されているか又は該組換え宿主細胞のゲノム
内に組込まれている）に関して用いられている。
【００９０】 「環境サンプル」なる表現は、手当たり次第に列挙すると、水性起源、例えば
淡水または海水に由来するサンプル、または土壌の表層、堆積物もしくは土壌の
下層（下層土）に由来する地上サンプル、および付随微生物叢（この付随微生物
叢は、関心のある生物を構成する）を有し植物、海洋生物もしくは昆虫に由来す
る、多細胞性でありうる真核生物のサンプルを示す。
【００９１】 本発明において、「オペロン」なる語は、転写および／または翻訳を調節する
ためのシグナルの特有のセット（組）により転写および／または翻訳が共調節さ
れるオープンリーディングフレームのセットを意味する。本発明において、オペ
ロンはまた、該転写および／または翻訳を調節するための前記シグナルを含みう
る。
【００９２】 本発明の目的においては、「代謝経路」または「生合成経路」なる表現は、第
１の化学種から第２の化学種への変換をもたらす一連の同化または異化生化学的
反応を意味する。
【００９３】 例えば、抗生物質の生合成経路は、主要代謝産物を該抗生物質の中間産物に、
そして次いで抗生物質に変換する一連の生化学反応よりなる。
【００９４】 「発現が望まれるヌクレオチド配列に対して作動的に連結した調節配列」なる
語は、関心のある配列の発現が可能となるよう、発現が望まれる関心のあるヌク
レオチド配列に対して該転写調節配列が位置することを意味し、該発現の調節は
、該調節ヌクレオチド配列と相互作用する因子に左右される。
【００９５】 もう１つの術語学によれば、発現が望まれる関心のあるヌクレオチド配列が、
該転写調節ヌクレオチド配列の「制御下」に配置されるということも可能である
。
【００９６】 本発明の目的においては、「単離（分離）（された）」なる語は、生物学的物
質が、その元の環境（それが天然で位置する環境）から取り出されていることを
示す。
【００９７】 例えば、生物（ウイルス、細菌、真菌、酵母、植物または動物）中に天然状態
で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていない。その天然
環境から分離された同じポリペプチド、または同じポリヌクレオチドのうち、該
生物のゲノム内にそれが天然で挿入されている隣接核酸から分離されたポリヌク
レオチドは、単離されている。
【００９８】 そのようなポリヌクレオチドはベクター内に含有されることが可能であり、お
よび／または、そのようなポリヌクレオチドは組成物中に含有されることが可能
であり、そのような場合でも、単離された形態のままである。なぜなら、該ベク
ターまたは組成物は、その天然環境を構成しないからである。
【００９９】 「精製（された）」なる語は、他の化合物が存在する場合を除き、該物質が絶
対的に純粋な形態で存在することを要求するものではない。むしろ、これは相対
的な定義である。
【０１００】 ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、出発物質が少なくとも１桁、好まし
くは２または３、優先的には４または５桁精製された後は、精製された形態にあ
る。
【０１０１】 本発明の目的においては、ヌクレオチドまたはアミノ酸の２つの配列間の「同
一性の割合（％）」は、２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウ越しに比
較することにより決定することができる。
【０１０２】 したがって、該比較ウィンドウ内の該ヌクレオチドまたはポリペプチド配列の
部分は、それらの２つの配列の最適なアライメントを得るために、参照配列と比
較して付加または欠失（例えば、「ギャップ」）を含みうる（該参照配列はこれ
らの付加または欠失を含まない）。
【０１０３】 該割合（％）は、それらの２つの比較配列に関して同一核酸塩基または同一ア
ミノ酸残基が観察される位置の数を求め、ついで、それらの２つの塩基またはア
ミノ酸残基間に同一性が存在する位置の数を該比較ウィンドウ内の位置の総数で
割り算し、ついでその商に１００を掛け算して配列同一性の割合（％）を得るこ
とにより算出される。
【０１０４】 該比較のためのそれらの配列の最適アライメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ社，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｏｃｔｏ
ｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージに含まれる公知アルゴリズ
ムを用いるコンピューターにより達成されうる。
【０１０５】 例えば、配列同一性の割合（％）は、専らデフォルトパラメーターを用いるＢ
ＬＡＳＴソフトウェア（１９９６年３月のＢＬＡＳＴバージョン１．４．９、１
９９８年２月のＢＬＡＳＴ ２．０．４．および１９９８年９月のＢＬＡＳＴ
２．０．６．）を使用して求めることができる（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０ ２１５：４０３−４１０，Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓ
ｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ ２５：３３８９
−３４０２）（Ａｌｔｓｃｈｕｌらの、参照「リクエスト（ｒｅｑｕｅｓｔ）」
配列に類似／相同な配列に関するＢｌａｓｔ検索）。使用するリクエスト配列お
よびデータベースは、ペプチドまたは核酸性のものであってもよく、任意の組合
せが可能である。
【０１０６】 環境サンプルに由来する核酸の抽出および精製 １．核酸の直接的抽出 土壌のサンプル中に含まれる生物に由来する核酸のライブラリーを得るために
は、一方では、該サンプル中の種々の生物が後続の核酸抽出工程に利用可能にな
る条件を作ることが重要であり、他方では、土壌サンプルの処理の初期工程が該
サンプル中の生物の最高の機械的細胞溶解を可能にして、これらの生物の核酸（
主にゲノムおよびプラスミドＤＮＡ）が、後続の抽出工程に使用するバッファー
に直接的に接近可能となるようにすることが重要であることが、本発明により示
されている。
【０１０７】 例えば、土壌サンプルからの微生物に由来する核酸の最高の利用可能性は、微
粒子を得るために、予備乾燥土壌サンプルを乾燥粉砕することにより達成された
ことが、本発明により示されている。このように、本出願人は、いずれかの後続
の処理の前の土壌サンプルの乾燥が、粗土壌サンプルの凝集の有意な減少をもた
らし、その結果、適当な粉砕処理を行った場合には微粒子形態でのその後続の砕
解を促進することを確認した。
【０１０８】 驚くべきことに、本出願人は、乾燥土壌サンプルの微粒子が、出発土壌サンプ
ル中に最初に存在する生物の遺伝的多様性を性質上表しうる最適な質の核酸の抽
出に好ましい物理的特性を併せ持つことを示した。特に、本発明の核酸の直接的
抽出の方法が、稀有微生物（例えば、ある稀有なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）または芽胞形成微生物）に由来するＤＮＡの抽出を可能にす
ることが示されている。
【０１０９】 本発明の目的においては、該土壌サンプルの「微粒子」なる語は、約５０μｍ
の平均サイズ（すなわち、平均して４５〜５５μｍ）を有するサンプルに由来す
る粒子を意味する。
【０１１０】 本発明では、予備乾燥または予備脱水され、ついで、２μｍ〜５０μｍの平均
サイズを有する微粒子が得られるまで粉砕された土壌サンプルから、該微粒子を
得、得られた微粒子を液体緩衝媒体に再懸濁させる。
【０１１１】 そのような液体緩衝（バッファー）媒体は、核酸抽出バッファー、特に、当業
者によく知られた通常のＤＮＡ抽出バッファーよりなりうる。
【０１１２】 微粒子への該土壌サンプルの粉砕は、最初の土壌サンプル中に存在する生物の
ほとんどを機械的に細胞溶解させるという、ならびにこの機械的処理により細胞
溶解されない生物を最適な後続の化学的および／または酵素的細胞溶解工程に利
用可能にするという二重の機能を有する。
【０１１３】 したがって、本発明の第１の対象は、生物を含有する土壌サンプルからの核酸
の集団の製造方法であって、予備乾燥または予備脱水された土壌サンプルを粉砕
することにより微粒子を得、該微粒子を液体緩衝（バッファー）媒体に懸濁させ
る第１工程（Ｉ−ａ））を含む製造方法よりなる。
【０１１４】 十分に好ましい様態においては、該粉砕工程は、メノウまたはタングステンビ
ーズを備えた装置を使用して又はタングステンリングを備えた装置を使用して行
う。これらの装置が好ましいのは、メノウまたはタングステンのような物質の硬
度が、前記で特定されたサイズの微粒子の産生を有意に促進するからである。こ
のため、それよりはるかに低効率であることが判明しているガラスビーズを備え
た粉砕装置の使用は、好ましくは、選択されないか、または回避されるであろう
。
【０１１５】 該土壌サンプルの乾燥または分級は、当業者に公知のいずれかの方法により行
うことができる。例えば、該粗土壌サンプルを室温で２４〜４８時間にわたり乾
燥させることができる。
【０１１６】 既に示されているとおり、該液体緩衝媒体は、該微粒子中に存在するＤＮＡを
抽出するための媒体よりなりうる。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、
１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１％（重量／容積）ポリビニルピロリドンをｐＨ９
．０でそれぞれ含有するＴＥＮＰとして公知の抽出バッファーが、最も好ましく
使用されるであろう。
【０１１７】 また、土壌サンプルからの核酸集団の製造方法は、予備乾燥または予備脱水さ
れた土壌サンプルを粉砕することにより微粒子を得る工程の後に、該微粒子中に
存在する核酸を抽出する工程Ｉ−（ｂ）が続くことにより特徴づけられる。
【０１１８】 該核酸の抽出は、望ましくない土壌構成成分および／または化合物の共抽出を
伴い、したがって次いで、抽出された核酸の精製が必要となるというのが、一般
的な見解であり、そのような後続の精製工程は、望ましくない土壌構成成分およ
び／または化合物の除去を可能にするのに十分な程度に選択的である必要があり
、かつ、予備抽出されたＤＮＡの量における少ない損失をもたらすのに十分な収
量を与える必要がある。
【０１１９】 前記の選択性および収量の基準を満たす土壌サンプルの微粒子から抽出された
ＤＮＡを精製する工程は、抽出されたＤＮＡを、それぞれ、組合された２つの連
続的なクロマトグラフィー工程、分子ふるい上のクロマトグラフィーおよび陰イ
オン交換クロマトグラフィーで処理することを含むことが、本発明により示され
ている。
【０１２０】 前記方法のもう１つの特徴によれば、該核酸を抽出する工程Ｉ−（ｂ）の後に
、抽出された核酸を以下の２つのクロマトグラフィー工程： ・該核酸を含有する溶液をモレキュラーシーブ上に通過させ、ついで、核酸に
富む溶出画分を回収する工程、 ・核酸に富む溶出画分を陰イオン交換クロマトグラフィー担体上に通過させ、
ついで、該核酸を含有する溶出画分を回収する工程により精製する工程Ｉ−（ｃ
）が続く。
【０１２１】 前記クロマトグラフィー工程の性質および順序は、予備乾燥または予備脱水さ
れた土壌サンプルの微粒子から予備抽出されたＤＮＡを精製する工程に関する良
好な選択性および優れた収量に必須のものである。
【０１２２】 非常に有利な様態においては、前記核酸精製工程における「モレキュラーシー
ブ」型のクロマトグラフィー担体は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ４００
ＨＲ型のクロマトグラフィー担体または同等の特性のクロマトグラフィー担体
よりなる。
【０１２３】 十分に好ましい様態においては、抽出されたＤＮＡを精製するために第２工程
で使用する陰イオン交換クロマトグラフィー担体は、Ｅｌｕｔｉｐ（登録商標）
型の担体または同等の特性のクロマトグラフィー担体である。
【０１２４】 該乾燥土壌サンプルの微粒子を得る工程Ｉ−（ａ）、該微粒子中に存在する核
酸を抽出するＩ−（ｂ）、および前記のクロマトグラフィー工程により精製する
Ｉ−（ｃ）を組合せることにより、本発明では、該サンプル中に最初に含まれて
いた生物の細胞を予め精製することなく土壌からＤＮＡを直接的に抽出し、それ
と同時に、先行技術の方法で認められる例えばフミン酸のような土壌混入物の共
抽出を回避することが可能である。
【０１２５】 フミン酸のような混入物は、精製が望まれる核酸の分析および後続の使用を著
しく妨げる。
【０１２６】 また、前記方法では、土壌サンプル中に最初に存在した核酸の遺伝的多様性の
実質的に完全な集団を得るために、該土壌サンプルの微粒子を得る工程Ｉ−（ａ
）中に機械的に細胞溶解されない生物内に含まれる核酸を得ることが可能である
。したがって、該土壌サンプルの微粒子は、化学的、酵素的または物理的細胞溶
解処理あるいは化学的、酵素的または物理的処理の組合せの後続工程に付されう
る。
【０１２７】 第１態様では、本発明の土壌サンプルからの核酸の集団の製造方法はまた、工
程Ｉ−（ａ）の後に、 ・液体バッファー中の土壌懸濁液を超音波処理により処理する工程、 ・該核酸を抽出し回収する工程が続くことにより特徴づけられうる。
【０１２８】 好ましい様態においては、超音波による処理には、Ｂｉｏｂｌｏｃｋ社により
販売されている６００Ｗ Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ
装置のようなチタン・マイクロポイント（ｍｉｃｒｏ−ｐｏｉｎｔ）型の装置ま
たはＣｕｐ Ｈｏｒｎ型のソニケーターを使用する。
【０１２９】 十分に好ましい様態においては、該超音波処理工程を７〜１０分間にわたり１
５Ｗの出力で行い、それは超音波処理の連続的サイクルを含み、該超音波処理自
体は各サイクルの持続時間の５０％にわたり行う。
【０１３０】 第２の態様では、前記方法は、工程Ｉ−（ａ）の後に、 ・液体緩衝媒体中の土壌懸濁液を超音波処理により処理する工程、 ・超音波処理後、リゾチームまたはアクロモペプチダーゼ（ａｃｈｒｏｍｏｐ
ｅｐｔｉｄａｓｅ）の存在下で該懸濁液を３７℃でインキュベートする工程、 ・ＳＤＳを添加し、ついで該核酸を遠心分離し沈殿させる工程、 ・沈殿した核酸を回収する工程が続くことにより特徴づけられうる。
【０１３１】 好ましくは、リゾチームのおよびアクロモペプチダーゼの存在下でのインキュ
ベーションの工程は、それらの酵素のそれぞれの最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌで、
好ましくは３７℃で３０分間にわたり行う。
【０１３２】 好ましくは、該ＳＤＳは、最終濃度１％で、６０℃の温度で１時間のインキュ
ベーション時間にわたり使用し、ついで遠心分離および沈殿を行う。
【０１３３】 第３の態様では、前記土壌サンプルからの核酸の集団の製造方法はまた、工程
Ｉ−（ａ）の後に、 ・激しい混合（ボルテックス）の工程およびそれに続く単純な攪拌の工程によ
り、該土壌懸濁液をホモジナイズ（均質化）する工程、 ・該均質懸濁液を凍結させ、ついで融解する工程、 ・融解後、該懸濁液を超音波処理で処理する工程、 ・超音波処理後、リゾチームおよびアクロモペプチダーゼの存在下、該懸濁液
を３７℃でインキュベートする工程、 ・ＳＤＳを加え、ついで該核酸を遠心分離し沈殿させる工程、 ・該核酸を回収する工程が続くことにより特徴づけられる。
【０１３４】 好ましくは、土壌微粒子の懸濁液を該ボルテックス機上で混合し、ついで２時
間の持続時間にわたり円回転攪拌機上での穏やかな攪拌によりホモジナイズし、
ついでそれを−２０℃で凍結させる。
【０１３５】 好ましくは、融解後かつ該超音波処理工程前に、該懸濁液を再び、ボルテック
ス機で１０分間にわたり激しく攪拌する。
【０１３６】 言うまでもなく、好ましくは、核酸の直接的抽出のための前記方法の実施形態
により抽出された核酸を、モレキュラーシーブ上の第１通過、およびそれに続く
、モレキュラーシーブ上でのクロマトグラフィー後に得られた溶出画分の、陰イ
オン交換クロマトグラフィー担体上の後続の通過よりなる精製工程により精製す
る。
【０１３７】 ２．核酸の間接的抽出 本発明の、環境サンプルからの核酸の集団の製造方法の第２実施形態では、こ
のサンプル中に含まれる生物を該サンプルのその他の巨大構成成分から分離する
ことを可能にする性質のものである第１処理に、該環境サンプルを付す。
【０１３８】 本発明の核酸の集団の製造方法のこの第２実施形態は、前記の本発明方法の第
１実施形態では得ることが実質的に不可能な大きな核酸の製造を促進し、該微粒
子を得るために行う機械的細胞溶解工程はまた、該土壌サンプル中の核酸または
該土壌サンプル中の生物中に含まれる核酸を物理的に分解するという効果を有す
る。
【０１３９】 産業上関心のある化合物の生合成を指令しうる同じオペロンに属するコード配
列のすべてを少なくとも部分的に含む核酸を単離し特徴づけることを目的として
、大きな核酸の製造が本出願人により研究されている。
【０１４０】 好ましくは、本発明の土壌サンプルからの核酸の集団の製造方法の第２実施形
態を行うことにより、１００ｋｂより大きな、好ましくは、２００、２５０また
は３００ｋｂより大きなサイズの核酸、そして最も好ましくは、４００、５００
または更には６００ｋｂより大きなサイズの核酸を得る。
【０１４１】 本発明の環境サンプルからの核酸の集団の製造方法のこの第２実施形態は、前
記の特徴を有する核酸を得ることを意図した４つの連続的な工程の組合せよりな
る。
【０１４２】 該環境サンプルが土壌サンプルである場合には、土壌サンプルを液体媒体内に
分散させることにより懸濁液を得るための第１工程は、該細胞の有意な機械的細
胞溶解を引き起こすことなく、サンプル中に含まれる生物の入手可能性を促進す
ることが、本発明により示されている。
【０１４３】 前記土壌サンプルの分散液を得る第１工程は、該サンプル中の生物を、外部媒
体に接近可能にし、また、該サンプル中の生物および該巨大構成成分の部分解離
を可能にする。したがって、それは、該サンプル中に最初に含まれる生物の後続
の、このサンプルのその他の構成成分からの分離を可能にする。
【０１４４】 該環境サンプルが、例えば、植物、海洋生物または昆虫に由来する場合には、
該付随微生物叢の生物を該方法の後続の工程に利用可能にするために、粉砕によ
る予備処理が必要である。
【０１４５】 本方法は、密度勾配上での遠心分離により、該生物を、前記で得られたその他
の無機および／または有機構成成分から分離する工程を含む。ついで、このよう
にして分離された生物を、細胞溶解の工程およびそれに続く該核酸の抽出の工程
に付す。
【０１４６】 驚くべきことに、密度勾配上での遠心分離の工程は、該サンプル懸濁液中に含
まれる土壌粒子中の生物の細胞を分離することを可能にする。実際、該細胞の一
部は該勾配相において該巨大粒子と共に運び去られると予想されたであろう。ま
た、密度勾配上での土壌サンプルの遠心分離が、出発サンプル中に存在する生物
の多様性を代表する生物の集団を水性相／勾配界面において見出すことを可能に
することは、これまで決して示されていなかった。なぜなら、これらの生物は体
積、密度および形状において非常に様々でありうるからである。それらは水性相
内、または水性相／密度勾配界面、または密度勾配自体の中に見出される、と理
論的には推測されうるであろう。
【０１４７】 したがって、使用する密度勾配の密度（１．２〜１．５ｇ／ｍｌ、好ましくは
１．３ｇ／ｍｌの密度勾配の密度）より小さい又は大きい密度を有する生物は回
収され得ず、その結果、有効に分離された生物の代表例に偏向が生じ、そのため
、抽出された核酸の多様性にも偏向が生じたであろう、と当業者は予想しうるで
あろう。
【０１４８】 また、該方法の１つの特定の実施形態においては、（特に放線菌類の）芽胞の
発芽の工程を行う。その目的は、回収される放線菌ＤＮＡの量を有意に増加させ
ることにある。
【０１４９】 該最終工程は、塩化セシウム勾配上でこのようにして抽出された核酸を精製す
る工程よりなる。
【０１５０】 驚くべきことに、該塩化セシウム勾配上での核酸の精製は、該密度勾配を構成
する物質の相当な又は更には完全な除去を可能にする。この特徴は、精製された
核酸の後続の使用に関する決定因子である。なぜなら、該密度勾配は、ベクター
内への該抽出核酸の酵素の触媒活性を適宜阻害しうる強力な酵素阻害因子である
ことが公知であるからである。
【０１５１】 この第２実施形態では、本発明の生物を含有する環境サンプルからの核酸の集
団の製造方法は、 （ｉ）該環境サンプルを液体媒体中に分散させることにより懸濁液を得、つい
で、得られた懸濁液を穏やかな攪拌によりホモジナイズ（均質化）する工程、 （ｉｉ）該生物を、工程（ｉ）で得られた該均質懸濁液のその他の無機および
／または有機構成成分から、密度勾配上の遠心分離により分離する工程、 （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で分離された微生物を細胞溶解し、該核酸を抽出する
工程、 （ｉｖ）塩化セシウム勾配上で該核酸を精製する一連の工程を含む。
【０１５２】 好ましくは、該土壌サンプルの懸濁液は、Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒのよ
うな装置または同等の特徴の装置による粉砕によりこのサンプルを分散させるこ
とにより得る。十分に好ましい様態においては、Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒ
のような装置中でそれぞれ１分間継続させる３回の連続的な粉砕操作の後に、該
サンプル懸濁液を得る。好ましくは、該粉砕操作のそれぞれの合間に、粉砕され
たサンプルを氷中で冷却する。
【０１５３】 好ましくは、ついで、Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ．社（Ｏｓｌｏ，
Ｎｏｒｗａｙ）により販売されている「Ｎｙｃｏｄｅｎｚ」型の密度クッション
上での遠心分離により、該生物を該土壌粒子から分離する。好ましい遠心分離条
件は、４℃、１０，０００×ｇで４０分間であり、好ましくは、それを、Ｋｏｎ
ｔｒｏｎ社により販売されている「ローターＴＳＴ ２８．３８」型の振動（ｓ
ｗｉｎｇ−ｏｕｔ）バケットを備えたローター中で行う。
【０１５４】 ついで、上部水相と下部Ｎｙｃｏｄｅｎｚ相との相間部に遠心分離後に位置す
る生物の輪状体を取り出し、遠心分離により洗浄し、ついで細胞ペレットを適当
なバッファー中に取る。
【０１５５】 前記工程（ｉｉ）で分離された生物の細胞溶解の工程（ｉｉｉ）は、当業者に
公知のいずれかの方法で行うことができる。
【０１５６】 好ましくは、リゾチームおよびアクロモペプチダーゼの存在下、ｐＨ８．０の
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中、好ましくは３７℃で１時間
、該細胞を細胞溶解する。
【０１５７】 該ＤＮＡの実際の抽出は、好ましくは、プロテイナーゼＫの存在下でラウリル
サルコシル（該溶液の最終重量の１％）の溶液を加え該最終溶液を３７℃で３０
分間インキュベートすることにより行うことができる。
【０１５８】 ついで、工程（ｉｉｉ）で抽出された核酸を塩化セシウム勾配上で精製する。
好ましくは、塩化セシウム勾配上で該核酸を精製する工程は、例えばＫｏｎｔｒ
ｏｎ６５．１３型のローター上、３５，０００ｒｐｍで３６時間の遠心分離によ
り行う。
【０１５９】 本発明の、生物を含有する土壌サンプルからの核酸の集団の製造方法の１つの
特定の態様では、該核酸は、専らとまではいかなくとも主としてＤＮＡ分子より
なる。
【０１６０】 もう１つの態様では、該核酸を、アガロースブロック中に含まれる生物、また
は密度勾配上で分離された生物をアガロースブロック内に加え細胞溶解（例えば
、化学的および／または酵素的細胞溶解）した後に回収することができる。
【０１６１】 本発明のもう１つの対象は、本発明の核酸の集団の製造方法の工程ＩＩ−（ｉ
ｖ）で得られた又は工程（ｃ）もしくは本発明の核酸の集団の製造方法の後続工
程で得られた核酸よりなる核酸の集団よりなる。
【０１６２】 本発明はまた、前記の核酸の集団に含まれることを特徴とする核酸に関する。
【０１６３】 第１態様では、本発明の集団を構成するそのような核酸は、少なくとも１つの
オペロンまたはオペロンの一部をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴
とする。
【０１６４】 最も好ましくは、そのようなオペロンは、代謝経路の全部または一部をコード
する。
【０１６５】 実施例９は、ストレプトマイセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）株からのゲノムＤＮＡライブラリーの構築、およびそれ
ぞれシャトルコスミドｐＯＳ７００ＩおよびｐＯＳ７００Ｒ内へのそのクローニ
ングを記載している。組込み型ベクターｐＯＳ７００Ｉ内に調製されたＤＮＡラ
イブラリーにおいては、新規クローンが、ピューロマイシンの生合成経路をもた
らすオペロンに属するヌクレオチド配列を含有することが、本発明により示され
ている。同様に、ピューロマイシンの生合成経路をもたらすオペロンのヌクレオ
チド配列を含有する１２個のクローンが、複製型ベクターｐＯＳ７００Ｒ内で調
製されたＤＮＡライブラリー内で同定されている。
【０１６６】 特に、得られたライブラリーの或る組込み型および複製型コスミドは、制限エ
ンドヌクレアーゼＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶでの消化後、ピューロマイシンの生
合成経路をひきおこすオペロンの配列の全部を含有しうる１２ｋｂの断片を有す
る。
【０１６７】 したがって、もう１つの態様では、本発明の核酸は、ピューロマイシンの生合
成経路をもたらすオペロンのヌクレオチド配列を少なくとも部分的に含有する。
【０１６８】 後記実施例２は、リンデンに汚染された土壌から出発する、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＳＫ−ベクターにおける本発明の方法のＤＮＡライブラリーの構築を記
載している。
【０１６９】 該組換えベクターを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０
Ｂ細胞内にトランスフェクトし、ついで該形質転換細胞を、リンデンの存在下、
適当な培地内で培養した。該ライブラリーの形質転換細胞上のクローンのスクリ
ーニングは、スクリーニングされたクローン１０，０００個中３５個がリンデン
分解性表現型を有することを示すことを可能にした。これらのクローン内のｌｉ
ｎＡ遺伝子の存在は、この遺伝子に特異的なプライマーによるＰＣＴ増幅により
確認した。
【０１７０】 したがって、もう１つの態様では、本発明はまた、リンデンの生物分解を引き
起こす代謝経路に関するヌクレオチド配列を含有する核酸に関する。
【０１７１】 したがって、前記のとおり、本発明の生物を含有する土壌サンプルからの核酸
の集団の製造方法、および前記核酸の集団の構成核酸を含有する組換えベクター
の集団の製造方法が、オペロン内に含まれるヌクレオチド配列の単離および特徴
づけに十分に適していることが、明らかに示されている。
【０１７２】 オペロンの形態で調節される生合成経路に関与するコードヌクレオチド配列を
本発明が同定しうることの追加的な証明については、後記においても説明する。
これは、治療上大きな関心（特に抗生物質に関する関心）が持たれている分子を
代表例として持つ分子のファミリーに属する、ポリケチドの生合成経路に関与す
るポリケチドシンターゼをコードする配列のクローニングおよび特徴づけに関す
るものである。
【０１７３】 したがって、本発明の対象はまた、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列のすべてを含むことを特徴とする、本発明の核酸の集団の構成核酸である。
【０１７４】 第１態様においては、本発明の核酸の集団の構成核酸は原核生物に由来する。
【０１７５】 第２態様においては、本発明の核酸の集団の構成核酸は、細菌またはウイルス
に由来する。
【０１７６】 第３態様においては、本発明の核酸の集団の構成核酸は真核生物に由来する。
【０１７７】 特に、そのような核酸は、真菌、酵母、植物または動物に由来することを特徴
とする。
【０１７８】 土壌から抽出された核酸の集団の分子特徴づけ 先行技術に関する説明の節に記載されている環境サンプルから抽出および精製
されたＤＮＡのライブラリーを特徴づけるための種々の技術的欠点を克服するた
めに、本出願人は、前記方法から得られた核酸を定性的かつ半定量的に特徴づけ
るための簡便かつ信頼しうる方法を開発した。
【０１７９】 したがって、本発明の方法は、１６Ｓ型のリボソームＤＮＡの配列の内部に位
置する７００ｂｐ断片を普遍的に増幅し、ついで種々の特異性のオリゴヌクレオ
チドプローブで該増幅ＤＮＡをハイブリダイズさせ、最後に、該サンプルのハイ
ブリダイゼーション強度を既知の配列または起源のＤＮＡの外部検量範囲と比較
することよりなる。
【０１８０】 該オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションの前の増幅は、比
較的稀な微生物の属または種を定量することを可能にする。さらに、普遍的プラ
イマーでの増幅は、該ハイブリダイゼーション中に、一連の広範なオリゴヌクレ
オチドプローブを使用することを可能にする。
【０１８１】 したがって、本発明の対象はまた、核酸の集団、特に、環境サンプル、好まし
くは土壌サンプルに由来する核酸の集団に含まれる核酸の多様性を測定するため
の方法であって、 ・試験する核酸の集団の核酸を、細菌１６ＳリボソームＤＮＡのいずれかの配
列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーのペアと接触させる工程
、 ・少なくとも３つの増幅サイクルを行う工程、 ・１つのオリゴヌクレオチドプローブまたは複数のオリゴヌクレオチドプロー
ブ（各プローブは、細菌の界、目、亜綱または属に共通の１６ＳリボソームＤＮ
Ａの配列に特異的にハイブリダイズする）を使用して、該増幅核酸を検出する工
程、 ・適当な場合には、前記検出工程からの結果を、検量範囲を構成する既知配列
の核酸に関する該プローブまたは前記の複数のプローブを使用した場合の検出結
果と比較する工程を含んでなる方法である。
【０１８２】 好ましくは、１６ＳリボソームＲＮＡの遺伝子の保存領域に普遍的にハイブリ
ダイズするプライマーの第１ペアは、それぞれ、プライマーＦＧＰＳ ６１２（
配列番号１２）およびＦＧＰＳ ６６９（配列番号１３）よりなる。
【０１８３】 本発明のプライマーの好ましいペアの第２の実施形態は、普遍的プライマー６
３ｆ（配列番号２２）および１３８７ｒ（配列番号２３）のペアよりなる。
【０１８４】 核酸集団の核酸の多様性の測定方法の１つの特定の実施形態では、特定の細菌
界、目、亜綱または属に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイ
ゼーションの工程の前に、普遍的プライマーのペアを使用する増幅工程を、考慮
中の核酸集団からの核酸がそれぞれの中に挿入された組換えベクターの集団上で
行うことができる。
【０１８５】 集団内に含まれる核酸の多様性のそのような測定方法は、特に、本明細書の教
示に従い得られた核酸の集団に適用される。
【０１８６】 したがって、実施例３は、生物を含有する土壌サンプルからの核酸の集団の製
造方法であって、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配上での該細胞の分離の前に土壌サンプル
を分散させ、該細胞を細胞溶解し、ついで塩化セシウム勾配上で該ＤＮＡを精製
することによるＤＮＡの間接的抽出の工程を含む方法を詳細に示している。
【０１８７】 このようにして得られた核酸の集団を、得られたままで、またはコスミド型の
ベクター内のインサートの形態で、１６Ｓ ｒＤＮＡに対する前記普遍的プライ
マーを使用する増幅方法において使用し、ついで該増幅ＤＮＡを、表４に示す配
列番号１４〜配列番号２１の配列のオリゴヌクレオチドプローブを使用する検出
の工程に付した。
【０１８８】 該結果が示すところによると、本発明の生物を含有する土壌サンプルから出発
する核酸の集団の製造方法は、全地上微生物叢の１４％を超えるＤＮＡ（すなわ
ち、土壌１ｇ当たり２×１０８細胞）の入手を可能にし、一方、培養されうる全
微生物叢は該全微生物集団の僅か２％に相当するに過ぎない。
【０１８９】 本発明により製造された核酸の集団の系統発生的多様性を測定するために、該
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４７個の配列を単離し配列決定した。これらの配列は
、それぞれ、配列番号６０〜配列番号１０６のヌクレオチド配列に対応する。
【０１９０】 配列番号６０〜配列番号１０６の配列を含む核酸も本発明の一部を構成し、配
列番号６０〜配列番号１０６の配列を含む核酸に対して少なくとも９９％、好ま
しくは、９９．５％または９９．８％の核酸同一性を有する核酸も同様である。
そのような配列は、特に、ＤＮＡライブラリーのクローンをスクリーニングする
ためのプローブとして使用することが可能であり、また、それにより、該ライブ
ラリーのクローンから、関心のあるコード配列に接近している可能性がある配列
（例えば、抗生物質代謝産物、例えばポリケチドの生合成経路に関与する酵素を
コードする配列）を含有するクローンを同定するためのプローブとして使用する
ことが可能である。
【０１９１】 本発明により得られたＤＮＡライブラリーからの１６Ｓ ｒＲＮＡの配列と、
ＲＤＰデータベース（Ｍａｉｄａｋ Ｂ．Ｌ．，Ｃｏｌｅ Ｊ．Ｒ．，Ｐａｒｋ
ｅｒ Ｃ．Ｔ．，Ｇａｒｒｉｔｙ Ｇ．Ｍ．，Ｌａｒｓｅｎ Ｎ．，Ｌｉ Ｂ．
，Ｌｉｂｕｒｎ Ｔ．Ｇ．，ＭｃＣａｕｇｈｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｏｌｓｅｎ Ｇ．
Ｊ．，Ｏｖｅｒｂｅｅｋ Ｒ．，Ｐｒａｍａｎｉｋ Ｓ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ
．Ｍ．，Ｔｉｅｄｊｅ Ｊ．Ｍ．，Ｗｏｅｓｅ Ｃ．Ｒ．（１９９９）“Ａ ｎ
ｅｗ ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ＲＤＰ（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａ
ｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｖｏｌ．２７：１７１−１７３）中の配列との比較は、本発明の核酸の集団内に
含まれる核酸が、α−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリア、δ−プロ
テオバクテリア、γ−プロテオバクテリア、放線菌類、およびアシドバクテリウ
ム（ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に関連した属に由来するとの判定を可能に
した。表７および図７の系統樹に示すこれらの結果は、本発明の方法により得ら
れたＤＮＡライブラリー内に含まれる核酸の大きな系統発生的多様性を説明する
ものである。
【０１９２】 クローニングおよび／または発現ベクター 本発明により得られた核酸の集団に含まれる核酸のそれぞれは、クローニング
および／または発現ベクター内に挿入することができる。
【０１９３】 この目的には、先行技術において公知のいずれかのタイプのベクター、例えば
、ウイルスベクター、ファージ、プラスミド、ファジミド、コスミド、ホスミド
、ＢＡＣタイプのベクター、Ｐ１バクテリオファージ、ＢＡＣタイプのベクター
、ＹＡＣタイプのベクター、酵母プラスミドまたは先行技術において当業者に公
知の他のいずれかのベクターを使用することができる。
【０１９４】 本発明では、ＤＮＡライブラリーの核酸の安定な発現を可能にするベクターが
有利に使用されるであろう。この目的には、そのようなベクターは、好ましくは
、該ゲノムインサートに作動的に連結していて該ＤＮＡインサートの少なくとも
一部の発現の開始および／または調節を可能にする転写調節配列を含む。
【０１９５】 前記から分かるとおり、本発明は、工程ＩＩ−（ｉｖ）もしくは工程Ｉ−（ｃ
）または本発明の生物を含有する土壌サンプルからの核酸の集団の製造方法の他
のいずれかの後続工程において得られた核酸をクローニングおよび／または発現
ベクター内に挿入することを特徴とする、組換えベクターの集団の製造方法に関
する。
【０１９６】 クローニングおよび／または発現ベクター内にそれらを挿入する前に、本発明
の核酸の集団の構成核酸を、例えば、制限エンドヌクレアーゼで適宜消化した後
のアガロースゲル上での電気泳動により、それらのサイズに応じて分離すること
ができる。
【０１９７】 もう１つの態様では、本発明の核酸の集団の構成核酸の平均サイズを、該クロ
ーニングおよび／または発現ベクター内へのそれらの挿入の前に物理的破壊の工
程を行うことにより、実質的に均一のサイズにすることが可能である。
【０１９８】 核酸の物理的または機械的破壊のそのような工程は、溶液内、直径約０．４ｍ
ｍの金属チャネル（例えば、そのような直径を有するシリンジ針のチャネル）内
にこれらの核酸を連続的に通過させることよりなりうる。
【０１９９】 該核酸の平均サイズは、この場合には、３０〜４０ｋｂ長でありうる。
【０２００】 本発明に好ましいベクターの構築は、図２５（接合組込み型コスミド）および
図２６（組込み型ＢＡＣ）に図式的に示されている。
【０２０１】 本発明のＤＮＡライブラリーまたは集団内に含まれる核酸を挿入するために有
利に使用されうるクローニングおよび／または発現ベクターは、特に、欧州特許
ＥＰ ０ ３５０ ３４１および米国特許第５ ６８８ ６８９号に記載のベク
ターであり、そのようなベクターは、放線菌株の形質転換に特に適している。そ
のようなベクターは、挿入ＤＮＡ配列に加えて、付着配列ａｔｔ、および放線菌
株内で機能的なインテグラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｉｎｔ配列）を含有す
る。
【０２０２】 しかし、あるクローニングおよび／または発現ベクターは欠点を有し、それら
の理論的機能的容量は実際には達成されなかったことが、本発明で認められてい
る。
【０２０３】 したがって、先行技術のベクター内、特に、欧州特許ＥＰ ０ ３５０ ３４
１に記載のベクター内に含有される組込み系は、該細菌染色体内への、該ライブ
ラリーからのＤＮＡインサートの良好な組込みを実際には可能にしないことが判
明した。
【０２０４】 該細菌染色体内へのそのようなベクターの組込みの機能的欠損が、これらのベ
クター内に存在するインテグラーゼ遺伝子の発現の欠損によるものであったとい
う仮定から出発して、本出願人は、該開始転写プロモーターを、インテグラーゼ
転写産物の数を有意に増加させうる転写プロモーターで置換することにより該イ
ンテグラーゼ遺伝子の発現を増加させることを最初に試みた。
【０２０５】 その結果は期待はずれなものであり、該染色体内へのこれらのベクターの組込
みの機能は改善されなかった。
【０２０６】 驚くべきことに、このファミリーの組込みベクターに含有されるインテグラー
ゼ発現の問題点は転写産物の発現の量にあるのではなく、該転写産物の安定性に
あることが、本発明により示された。
【０２０７】 第２の仮定に従い、本出願人は、該インテグラーゼ転写産物の安定性の欠損が
、対応するメッセンジャーＲＮＡの転写の終結の欠損により引き起こされること
を示すことができた。
【０２０８】 したがって、本出願人は、与えられたサイズのメッセンジャーＲＮＡを得るた
めに、該ベクターのインテグラーゼをコードする配列の下流に位置する終結部位
を挿入した。該ベクターのインテグラーゼをコードするヌクレオチド配列の下流
の追加的な終結シグナルの挿入は、コスミドタイプおよびＢＡＣタイプの組込み
型ベクターのファミリーを得ることを可能にした。
【０２０９】 好ましくは、該終結部位は付着部位ａｔｔの下流に配置する。
【０２１０】 また、本出願人は、本発明の方法により得られた核酸集団の構成核酸を挿入す
るために有利に使用されうる新規接合型ベクターおよびコスミドタイプの新規複
製型ベクターおよびＢＡＣタイプの新規接合型ベクターを開発した。
【０２１１】 平均サイズのＤＮＡ断片の挿入が望ましい場合には、約５０ｋｂの最大サイズ
を有するインサートを収容しうるコスミドタイプのベクターが好ましく使用され
る。
【０２１２】 そのようなコスミドベクターは、特に、初期土壌サンプル内に含まれる生物の
機械的細胞溶解による直接ＤＮＡ抽出の第１工程を含む本発明の方法により得ら
れた核酸集団の構成核酸を挿入するのに適している。
【０２１３】 大きな核酸、特に、１００ｋｂのサイズより大きな又は更には２００、３００
、４００、５００または６００ｋｂより大きな核酸の挿入が望ましい場合には、
そのようなサイズのＤＮＡインサートを収容しうるＢＡＣタイプのベクターが優
先的に使用される。
【０２１４】 ＢＡＣタイプのそのようなベクターは、特に、第１工程が、初期土壌サンプル
中に含まれる生物の予備分離および該土壌サンプルからの巨大構成成分の除去に
よる該ＤＮＡの間接的抽出よりなる本発明の方法により得られた核酸集団の構成
核酸を挿入するのに適している。
【０２１５】 特に、ＢＡＣタイプのベクターは、オペロンのヌクレオチド配列を少なくとも
部分的に含有する大きな核酸を挿入するのに有利に使用される。
【０２１６】 したがって、本発明の組換えクローニングおよび／または発現ベクターの集団
の製造方法はまた、該クローニングおよび／または発現ベクターがプラスミド型
のものであることにより特徴づけられる。
【０２１７】 もう１つの態様では、そのような方法は、該クローニングおよび／または発現
ベクターがコスミドタイプのものであることにより特徴づけられる。
【０２１８】 第１態様では、それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において複製型である及びス
トレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において組込み型であるコスミ
ドでありうる。そのような定義に対応する十分に好ましいコスミドは、実施例３
に記載のｐＯＳ７００１である。
【０２１９】 さらにもう１つの態様では、該コスミドベクターはストレプトマイセス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において接合型および組込み型である。
【０２２０】 一般に、「接合起点（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）」として公知
の細胞酵素装置により認識される単位をヌクレオチド配列内に含むコスミドタイ
プまたはＢＡＣタイプの接合型ベクターは、自動化が困難な面倒な形質転換技術
に頼ることを避けたいどのような場合にも使用される。
【０２２１】 例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞により最初に保持されていたベクターを
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞内にトランスフェクトす
る場合には、通常、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロトプ
ラストを形質転換する工程の前に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
）細胞内に含有される組換えベクターを回収し、それを精製する工程を要する。
各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンがその表現の機会を有するためには、ストレ
プトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）内への１０００個の大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）クローンの集合体のトランスフェクションに約８
０００個のクローンの製造を要すると一般に考えられている。
【０２２２】 逆に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により保持されたベクターをストレプトマイセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞内に接合させることによるトランスフェク
ションの工程は、それらの微生物のそれぞれの同数のクローンを要し、該接合工
程は、「クローンからクローンに」生じ、更に、例えばポリエチレングリコール
の存在下のプロトプラストの形質転換により遺伝物質を導入する工程に関連した
技術的問題点を含まない。
【０２２３】 ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）におけるＤＮＡライブラリ
ーの構築を最適化するために、該接合工程の最大有効性を可能にする性質のコス
ミドタイプおよびＢＡＣタイプの新規接合型ベクターを本発明で開発した。
【０２２４】 特に、本発明の新規接合型ベクターは、末端において該受容細菌内に導入され
るベクターのＤＮＡの末端に選択マーカー遺伝子を配置することにより構築され
ている。先行技術の接合型ベクターに対するこの改良は、該ベクターＤＮＡのす
べてを従って関心のある挿入ＤＮＡのすべてを受容した受容細菌だけの正の選択
を可能にする。
【０２２５】 ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において接合型および組込
み型である本発明で好ましいコスミドは、実施例５に記載のコスミドｐＯＳＶ３
０３、ｐＯＳＶ３０６およびｐＯＳＶ３０７である。
【０２２６】 もう１つの態様では、本発明の組換えベクターの集団の製造方法は、大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の両方
において複製型であるコスミドを使用して行う。そのようなコスミドは、好まし
くは、実施例６に記載のコスミドｐＯＳ７００Ｒである。
【０２２７】 更にもう１つの態様では、前記方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレ
プトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において複製型でありストレプトマ
イセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において接合型であるコスミドで行うこと
ができる。
【０２２８】 そのような複製型および接合型コスミドは、ベクターｐＯＳＶ３０３の構築の
ために実施例５に記載のＲＫ２のような適当な導入源を挿入することにより、本
発明の複製型コスミドから得ることができる。
【０２２９】 本発明の組換えベクターの集団の製造方法のもう１つの有利な実施形態では、
ＢＡＣタイプのクローニングおよび／または発現ベクターを使用する。
【０２３０】 第１態様では、該ＢＡＣタイプのベクターはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）において組込み型および接合型である
【０２３１】 十分に好ましい様態においては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）において組込み型および接合型であるそのようなＢＡＣベクターは、実施
例８に記載のベクターＢＡＣ ｐＯＳＶ４０３、そうでなければ実施例１５に記
載のＢＡＣ ｐＭＢＤ−１、ｐＭＢＤ−２、ｐＭＢＤ−３、ｐＭＢＤ−４、ｐＭ
ＢＤ−５およびｐＭＢＤ−６である。
【０２３２】 本発明の対象はまた、以下の組換えベクター： ａ）本発明の核酸集団の構成核酸を含むベクター、 ｂ）既に記載されているとおりの、挿入されるＤＮＡ断片に対する制限エンド
ヌクレアーゼの作用の関与を回避する方法により得られたベクターから選ばれる
ことを特徴とする組換えベクターである。
【０２３３】 十分に好ましい様態においては、本発明はまた、以下のベクター： ・コスミドｐＯＳ７００Ｉ、 ・コスミドｐＯＳＶ３０３、 ・コスミドｐＯＳＶ３０６、 ・コスミドｐＯＳＶ３０７、 ・コスミドｐＯＳ７００Ｒ、 ・ベクターＢＡＣ ｐＯＳＶ４０３、 ・ベクターＢＡＣ ｐＭＢＤ−１、 ・ベクターＢＡＣ ｐＭＢＤ−２、 ・ベクターＢＡＣ ｐＭＢＤ−３、 ・ベクターＢＡＣ ｐＭＢＤ−４、 ・ベクターＢＡＣ ｐＭＢＤ−５、 ・ベクターＢＡＣ ｐＭＢＤ−６から選ばれるベクターに関する。
【０２３４】 本発明はまた、本発明の方法のいずれか１つにより得られた組換えベクターの
集団に関する。
【０２３５】 本発明の組換えクローニングおよび／または発現ベクターの製造方法 組換えクローニングおよび／または発現ベクターを製造するためにベクター内
にＤＮＡを挿入するための通常の技術は、通常、挿入するＤＮＡおよび該レシピ
エントベクターの両方と共に制限エンドヌクレアーゼをインキュベートし、それ
により、挿入するＤＮＡと該ベクターＤＮＡとの間に適合性末端を作製して、該
組換えベクターの産生を可能にする最終連結工程の前にそれらの２つのＤＮＡの
集合を可能にする第１工程を含む。
【０２３６】 しかし、そのような通常の技術は、特にクローニングおよび／または発現ベク
ター内に大きな核酸を挿入することを望む場合には、注目すべき欠点を有する。
【０２３７】 特に、ベクター内に挿入されることが意図されるＤＮＡ断片に対する制限酵素
の前作用は、このＤＮＡのサイズを、該ベクター内へのその挿入の前にかなり減
少させる傾向にある。言うまでもなく、該ベクター内へのその挿入の前の該ＤＮ
Ａのサイズの有意な減少は、該コード配列のすべてを、そして場合によっては、
発現されて産業上関心のある代謝産物（特に、治療上関心のある化合物）の完全
な生合成経路を構成するオペロンの調節配列をも含有する傾向にあるＤＮＡの大
きな断片をクローニングしたい場合には特に不利な状況である。
【０２３８】 先行技術の欠点を克服するために、挿入されるＤＮＡ上で制限エンドヌクレア
ーゼを該ベクター内へのその導入の前に使用しない、組換えクローニングおよび
／または発現ベクターを製造するための２つの方法を本発明で開発した。したが
って、そのような方法は、該コード配列のすべてを、および適当な場合には、生
合成経路をもたらす完全なオペロンの調節配列をも少なくとも部分的に含有する
傾向にある長いＤＮＡ断片をクローニングするのに十分に適している。
【０２３９】 第１態様では、本発明のクローニングおよび／または発現ベクターを製造する
ための１つの方法は、該クローニングおよび／または発現ベクター内への核酸の
挿入が、 ・適当な制限エンドヌクレアーゼを使用して、選択されたクローニング部位で
該クローニングおよび／または発現ベクターを開裂する工程、 ・その開いたベクターの遊離３’末端において第１ホモポリマー核酸を付加す
る工程、 ・該ベクター内に挿入される核酸の遊離３’末端において、該第１ホモポリマ
ー核酸に相補的な配列を有する第２ホモポリマー核酸を付加する工程、 ・互いに相補的な配列の第１および第２ホモポリマー核酸をハイブリダイズさ
せることにより、該ベクターの核酸と核酸とを集合させる工程、 ・連結により該ベクターを閉じる工程を含むことを特徴とする。
【０２４０】 そのような方法は後記実施例１０および１３に記載されている。
【０２４１】 好ましくは、前記方法は、以下の特徴を別々に又は組合せて含みうる： ・該第１ホモポリマー核酸はポリ（Ａ）またはポリ（Ｔ）配列のものである； ・該第２ホモポリマー核酸はポリ（Ｔ）またはポリ（Ａ）配列のものである。
【０２４２】 十分に好ましい様態においては、該ホモポリマー核酸は、２５〜１００ヌクレ
オチド塩基、好ましくは２５〜７０ヌクレオチド塩基の長さを有する。
【０２４３】 前記の組換えクローニングおよび／または発現ベクターの製造方法は、ＢＡＣ
タイプのベクター内のＤＮＡライブラリーの構築に特に適している。したがって
、前記の組換えベクターの製造方法の１つの有利な実施形態においては、該方法
はまた、挿入される核酸のサイズが少なくとも１００ｋｂ、好ましくは、少なく
とも２００、３００、４００、５００または６００ｋｂであることを特徴とする
。
【０２４４】 したがって、そのような製造方法は、本発明の方法により得られた核酸集団に
含まれる核酸の挿入に特に適している。
【０２４５】 クローニングおよび／または発現ベクター内への大きなＤＮＡ断片の挿入を可
能にするために、該ベクター内への挿入が意図されるＤＮＡに対する制限エンド
ヌクレアーゼの使用を省くことを可能にする第２の方法を本発明で開発した。
【０２４６】 本発明の組換えクローニングおよび／または発現ベクターのそのような製造方
法は、該クローニングおよび／または発現ベクター内に核酸を挿入する工程が、 ・突出３’配列を除去し突出５’配列をフィルインする（埋める）ことにより
、該集団の核酸の末端上に平滑末端を作製する工程、 ・適当な制限エンドヌクレアーゼを使用して、選択されたクローニング部位に
おいて該クローニングおよび／または発現ベクターを開裂する工程、 ・相補的オリゴヌクレオチドアダプターを付加する工程、 ・突出３’配列を除去し突出５’配列をフィルインすることにより、該ベクタ
ー核酸の末端において平滑末端を作製し、ついで、該ベクターの再環化を妨げる
ために５’末端を脱リン酸化する工程、 ・該集団の核酸を該ベクター内に連結により挿入する工程を含むことを特徴と
する。
【０２４７】 好ましくは、該突出３’配列の除去は、クレノウ酵素のようなエキソヌクレア
ーゼを使用して行う。
【０２４８】 好ましくは、該突出５’配列のフィルインは、４種のヌクレオチド三リン酸の
存在下、ポリメラーゼ、最も好ましくはＴ４ポリメラーゼを使用して行う。
【０２４９】 前記のとおりの、該突出３’配列を除去し該突出５’配列をフィルインするこ
とによる組換えクローニングおよび／または発現ベクターの製造方法は、コスミ
ドタイプのベクターからのＤＮＡライブラリーの構築に特に適している。
【０２５０】 組換えベクターを得るためのそのような方法は実施例１２に記載されている。
【０２５１】 本発明の組換えベクターを製造するための１つの特定の方法においては、１以
上の稀有制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、実施例１０の教示に従い、挿入
されるＤＮＡのクローニング部位において該ベクターに付加する。オリゴヌクレ
オチドのこの付加は、該インサートの後続の回収を促進し、この場合、その開裂
を伴わない。
【０２５２】 宿主細胞 本発明の核酸または組換えベクターでのトランスフェクションまたは形質転換
には任意の型の宿主細胞を使用することが可能であるが、特に、原核性または真
核性宿主細胞、生理的、生化学的および遺伝的特性が十分に特徴づけられている
宿主細胞であって、その代謝産物の製造のための培養条件がよく知られており大
規模で容易に培養されうる宿主細胞が好ましく使用される。
【０２５３】 好ましくは、本発明の核酸または組換えベクターを受容する宿主細胞は、該核
酸が由来する環境サンプル中に最初に含まれる供与生物に系統発生的に近い。
【０２５４】 最も好ましい様態においては、本発明の宿主細胞は、該環境サンプル、特に該
土壌サンプル中に最初に存在する供与生物における類似した又は少なくとも近い
コドン使用頻度を有するべきである。
【０２５５】 関心のある所望のヌクレオチド配列を保持しやすいＤＮＡ断片のサイズは様々
でありうる。したがって、１ｋｂの平均サイズを有する遺伝子にコードされる酵
素は、小さなサイズのインサートを使用して発現させることが可能であり、一方
、二次代謝産物の発現は、それよりはるかに大きな断片（例えば、４０ｋｂ〜１
００ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂまたは６００ｋｂ以上）の、該
宿主生物内での維持を要するであろう。
【０２５６】 したがって、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の宿主細胞は、大
きなＤＮＡ断片のクローニングのための好ましい選択肢に相当する。
【０２５７】 最も好ましい様態においては、ＢＡＣベクター内へのクローニングのためのプ
ロトコールが最適化されている、ＤＨ１０Ｂとして公知でありＳｈｉｚｕｙａら
（１９９２）に記載されている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株
が使用されるであろう。
【０２５８】 しかし、本発明のＤＮＡライブラリーを構築するためには、大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の他の株、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｕｒ
ｅ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２９４（Ａ
ＴＣＣ番号３１４４６）株を有利に使用することができる。
【０２５９】 さらに、本発明の組換えベクターで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をトランスフ
ェクトすることによるＤＮＡライブラリーの構築も可能であり、バシラス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）、テルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、コリネバクテリウム（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）またはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）のような種々の原核
細胞の遺伝子の発現がＰＣＴ特許出願ＷＯ ９９／２０７９９に記載されている
。
【０２６０】 一般には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞が、すべての場合において、本発
明の組換えベクターが有効に維持されうる一過性宿主を構成し、該遺伝物質が容
易に操作され安定に収容されうる。
【０２６１】 また、可能な限り広い分子多様性を発現させる目的には、バシラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ア
スペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ま
たはニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）細胞の
ような他の宿主細胞も有利に使用されうる。
【０２６２】 また、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）細胞が成功裏のうちに使用され、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）を補足する発現系を構成しうることが、本発明により示されている
。
【０２６３】 ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の遺伝学を研究す
るためのモデルを構成し、多数の二次代謝産物の異種発現のための宿主として使
用されている。ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ）は、ストレプトマイセス・ケリコロール（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フラジエ（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）およびストレプトマイセス・グリセオ
クロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ
ｓ）のような他の放線菌類と同様に、複雑な生合成経路（例えば、ポリケチド生
合成経路または非常に多様な構造の分子のクラスを代表する非リボソームポリペ
プチドの生合成のための経路）の全部または一部の発現に要求される調節系およ
び前駆体分子を有する。
【０２６４】 ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）はまた、高い形質転換効率で外来ＤＮＡを受け入れるという利点を有する
。
【０２６５】 したがって、本発明はまた、本発明の方法により製造された核酸集団の構成成
分である本発明の核酸を含む組換え宿主細胞、または前記の組換えベクターを含
む組換え宿主細胞に関する。
【０２６６】 第１の態様では、それは、原核生物または真核生物に由来する組換え宿主細胞
でありうる。
【０２６７】 好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は細菌であり、最も好ましくは、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から
選ばれる細菌である。
【０２６８】 もう１つの態様では、本発明の組換え宿主細胞は、酵母または糸状菌であるこ
とを特徴とする。
【０２６９】 本発明はまた、組換え宿主細胞の集団であって、該集団の構成宿主細胞のそれ
ぞれは、前記のとおりの生物を含有する土壌サンプルからの核酸の集団の製造方
法により製造された核酸集団に由来する核酸を含むことを特徴とする集団に関す
る。
【０２７０】 本発明はまた、組換え宿主細胞の集団であって、該集団の構成宿主細胞のそれ
ぞれが、本発明の組換えベクターを含むことを特徴とする集団に関する。
【０２７１】 該インサートのサイズが大きいため、最大形質転換効率を得る必要がある。こ
の目的のためには、該ベクターの部位特異的組込みを促進するためにｐＳＡＭ２
インテグラーゼを構成的に発現するストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の受容株が好ましい。この場合、強力な
プロモーターの制御下のｉｎｔ遺伝子が該染色体内に組込まれる。インテグラー
ゼの過剰産生は切除現象を何ら誘発しない（Ｒａｙｎａｌら，１９９８）。
【０２７２】 産生される抗生物質の耐性に関する遺伝子を該インサートが含有しない場合、
またはこの遺伝子が発現されない若しくは低い度合いでしか発現されない場合に
は、該インサートからの新規代謝産物の産生はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）に対して毒性となりうるであろう。ストレプトマイセス・アン
ボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）が産生
する抗生物質に対してそれが抵抗するのを可能にする種々の遺伝子の能力が研究
されている（Ｇｏｕｒｍｅｌｅｎら，１９９８；Ｐｅｒｎｏｄｅｔら，１９９９
）。これらの遺伝子のいくつかは、広域スペクトルの耐性を付与する傾向にある
ＡＢＣ型の輸送体をコードしている。これらの遺伝子は、ストレプトマイセス・
リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）宿主株内に導入し
、該宿主株内で過剰発現させることができる。
【０２７３】 逆に、該ライブラリー内の耐性遺伝子の存在を検出するために、抗生物質に過
敏な株を使用することができる（Ｐｅｒｎｏｄｅｔら，１９９６）。特に、抗生
物質産生微生物においては、これらの耐性遺伝子は、しばしば、該抗生物質の生
合成経路の遺伝子に関連している。耐性クローンの選択は、該クローンにより産
生された新規代謝産物の検出のための更に複雑な試験の前の第１の選別を容易に
行うことを可能にしうる。
【０２７４】 ポリケチドシンターゼをコードする新規ヌクレオチド配列の単離および特徴づ け 本発明では、本発明の方法により製造された核酸集団に由来する核酸インサー
トをそれぞれが含有する組換えベクターの集団で宿主細胞をトランスフェクトし
た後に、組換え宿主細胞の集団を得た。
【０２７５】 より詳しくは、本発明の方法（この場合、土壌サンプルに含まれる生物からの
ＤＮＡの間接的抽出の工程を行う）により得られたＤＮＡ断片を、まず、組込み
型コスミドｐＯＳ７００Ｉ内にクローニングした。
【０２７６】 組込み型コスミドｐＯＳ７００Ｉ内にＤＮＡ断片を挿入する工程は、本発明の
方法に従い行った。この場合、ホモポリマーポリヌクレオチドテイル ポリ（Ａ
）およびポリ（Ｔ）を、それぞれ、該ベクター核酸の及び挿入されるＤＮＡ断片
の３’末端に付加した。
【０２７７】 このようにして構築した組換えベクターをラムダファージヘッド内に包膜し、
得られたファージを使用して、当業者のよく知られた技術に従い大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）細胞に感染させた。
【０２７８】 約５０００個の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）クローンのライ
ブラリーを得た。
【０２７９】 クローンのこのライブラリーを、ポリケチド生合成経路に関与する酵素である
β−ケトアシルシンターゼとしても公知のＩ型ＰＫＳ酵素をコードするヌクレオ
チド配列に特異的なプライマーのペアでスクリーニングした。
【０２８０】 ここで、ポリケチドは、チロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）、モネンシン、ベルメク
チン、エリスロマイシン、ドキソルビシンまたはＦＫ５０６のような医薬上関心
のある多数の分子を含む非常に構造的に多様な化学的範疇を構成することが思い
起こされる。
【０２８１】 ポリケチドは、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）として公知の酵素の作用によ
るアセタート分子の縮合により合成される。２つの型のポリケチドシンターゼが
存在する。ＩＩ型ポリケチドシンターゼは、一般には、多環式芳香族抗生物質の
合成に関与し、アセタート単位の反復縮合を触媒する。
【０２８２】 Ｉ型ポリケチドシンターゼは、大環状またはマクロライドポリケチドの合成に
関与し、モジュラー多機能酵素を構成する。
【０２８３】 それらの治療的関心を考慮すると、新規医薬化合物（特に、抗生物質活性を有
する新規医薬化合物）の製造に使用されうる新規ポリケチドシンターゼを単離し
特徴づけることが、最新技術において必要とされている。
【０２８４】 Ｉ型ポリケチドシンターゼをコードするヌクレオチド配列を選択的に増幅する
ＰＣＲプライマーを使用する前記の組換えクローンのライブラリーのスクリーニ
ングは、新規ポリケチドシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ
インサートを含有する組換えクローンを同定することを可能にした。これらの新
規ポリケチドシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、配列配列番号３３〜
配列番号４４および配列番号１１５〜配列番号１２０として記載されている。
【０２８５】 本発明のもう１つの対象は、ヌクレオチド配列配列番号３４〜配列番号４４お
よび配列番号１１５〜配列番号１２０の１つを含むことを特徴とする、新規ポリ
ケチドシンターゼＩをコードする核酸よりなる。
【０２８６】 好ましくは、そのような核酸は、単離および／または精製された形態である。
【０２８７】 本発明はまた、配列番号配列番号３４〜配列番号４４および配列番号１１５〜
配列番号１２０の１つを含むポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。
【０２８８】 本発明はまた、ヌクレオチド配列配列番号３４〜配列番号４４および配列番号
１１５〜配列番号１２０の１つを含むポリヌクレオチドから選ばれる核酸を含む
組換え宿主細胞、ならびにヌクレオチド配列配列番号３４〜配列番号４４および
配列番号１１５〜配列番号１２０の１つを含むポリヌクレオチドが挿入された組
換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【０２８９】 好ましくは、本発明の新規Ｉ型ポリケチドシンターゼをコードするＤＮＡイン
サートを含有する組換えベクターは、クローニングおよび発現ベクターである。
【０２９０】 好ましくは、前記の組換え宿主細胞は細菌、酵母または糸状菌である。
【０２９１】 土壌サンプルに含まれる生物に由来する新規ポリケチドシンターゼのアミノ酸
配列は、前記ヌクレオチド配列配列番号３４〜配列番号４４および配列番号１１
５〜配列番号１２０から推定した。それらは、アミノ酸配列配列番号４８〜配列
番号５９および配列番号１２１〜配列番号１２６の１つを含むポリペプチドであ
る。
【０２９２】 本発明はまた、配列配列番号４８〜配列番号５９および配列番号１２１〜配列
番号１２６から選ばれるアミノ酸配列を含む新規ポリケチドシンターゼに関する
。
【０２９３】 配列配列番号１２１〜配列番号１２６のポリペプチドをそれぞれコードする６
個のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列配列番号１１４も、
本発明の一部を構成する。
【０２９４】 配列配列番号１１４に相補的な配列を含有するａ２６Ｇ１コスミドのヌクレオ
チド配列配列番号１１３も、本発明の一部を構成する。
【０２９５】 また、ストレプトマイセス・ケリコロール（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏ
ｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＡＴＣＣ番号１０１．４７８）、ストレプトマイセス・ア
ンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）（Ｎ
ＲＲＬ番号２．４２０）、ストレプトマイセス・ラクタマンデュランス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔａｍａｎｄｕｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ番号２７．３
８２）、ストレプトマイセス・リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏ
ｓｕｓ）（ＡＴＣＣ番号１０９．６１０）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ番号６６３３）またはバシラス・リヘニフ
ォルニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎｉｓ）およびサッカロポ
リスポラ・エリスラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒｅａ
）のような純粋な細菌株に由来するゲノムＤＮＡを、本発明に従い抽出し、増幅
した。
【０２９６】 前記の細菌株のそれぞれからのＤＮＡのＰＣＲ増幅は、Ｉ型ポリケチドシンタ
ーゼの核酸配列に特異的なプライマーのペアを使用して行った。
【０２９７】 このようにして、新規細菌Ｉ型ポリケチドシンターゼ遺伝子を単離し特徴づけ
ることができた。これらは、核酸配列配列番号３０〜配列番号３２である。
【０２９８】 したがって、本発明の対象はまた、ヌクレオチド配列配列番号３０〜配列番号
３２の１つを含むポリヌクレオチドから選ばれる新規Ｉ型ポリケチドシンターゼ
をコードするヌクレオチド配列に関する。
【０２９９】 前記の新規Ｉ型ポリケチドシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む組
換えベクターは、本発明の一部を構成する。
【０３００】 本発明はまた、配列番号３０〜配列番号３２から選ばれるヌクレオチド配列を
含む新規Ｉ型ポリケチドシンターゼをコードする核酸を含有することを特徴とす
る組換え宿主細胞、および前記の組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する
。
【０３０１】 本発明の対象はまた、核酸配列番号３０〜３２を含む配列にコードされるポリ
ペプチド、より詳しくは、アミノ酸配列配列番号４７〜配列番号５０を含むポリ
ペプチドである。
【０３０２】 本発明の対象はまた、 ・配列配列番号３３〜配列番号４４および配列番号３０〜配列番号３２および
配列番号１１５〜配列番号１２０から選ばれるヌクレオチド配列を含むＩ型ポリ
ケチドシンターゼをコードする核酸を含む組換え宿主細胞を製造する工程、 ・適当な培地内で該組換え宿主細胞を培養する工程、 ・該培養上清または該細胞ライセートから該Ｉ型ポリケチドシンターゼを回収
し、適当な場合には精製する工程を含んでなる、本発明のＩ型ポリケチドシンタ
ーゼの製造方法である。
【０３０３】 前記の方法により得られた新規Ｉ型ポリケチドシンターゼは、これらのポリケ
チドシンターゼを認識する抗体が予め固定化されたイムノアフィニティークロマ
トグラフィーカラムへの結合により特徴づけられうる。
【０３０４】 本発明のＩ型ポリケチドシンターゼ、特に、前記の組換えポリケチドシンター
ゼはまた、例えば、当業者によく知られている逆相クロマトグラフィー技術また
は陰イオン交換もしくは陽イオン交換クロマトグラフィー技術のような高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術により精製することができる。
【０３０５】 本発明の組換えまたは非組換えポリケチドシンターゼは、抗体の製造に使用す
ることができる。
【０３０６】 もう１つの態様では、本発明の対象はまた、本発明のＩ型ポリケチドシンター
ゼまたはそのようなポリケチドシンターゼのペプチド断片を特異的に認識する抗
体である。
【０３０７】 本発明の抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでありうる。該モノクロ
ーナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．（１９７５），Ｎａ
ｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２５６：４９５に記載の技術に従うハイブリドーマ細胞から
製造することができる。
【０３０８】 該ポリクローナル抗体は、適当な場合には免疫アジュバント化合物（例えば、
完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニ
ウムまたはムラミルペプチドファミリーからの化合物）の存在下、哺乳動物、特
にマウス、ラットまたはウサギを本発明のＩ型ポリケチドシンターゼで免疫する
ことにより製造することができる。
【０３０９】 本発明の目的においては、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（
ａｂ’）２、またはＭａｒｔｉｎｅａｕら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
，Ｖｏｌ．２８０（１）：１１７−１２７もしくは米国特許第４ ９４６ ７７
８号に記載の可変部分を含有する一本鎖抗体フラグメント（ＳｃＦｖ）、および
Ｒｅｉｎｍａｎｎ ＫＡら（１９９７），ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒ
ｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１３（１１）：９３３−９４３もしくはＬｅｇｅｒ
Ｏ．Ｊら（１９９７），Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．８（１）：
３−１６に記載のヒト化抗体も、「抗体」に含まれる。
【０３１０】 本発明の抗体調製物は、特に、本発明のＩ型ポリケチドシンターゼの存在を検
出すること又は例えばそのような酵素を産生しうる細菌株の細胞ライセートもし
くは培養上清中のこのポリケチドシンターゼの量を定量することを単に意図した
定性的または定量的免疫学的試験において有用である。
【０３１１】 本発明のもう１つの対象は、サンプル中の本発明のＩ型ポリケチドシンターゼ
またはこの酵素のペプチド断片を検出するための方法であって、 ａ）本発明の抗体を該被検サンプルと接触させる工程、 ｂ）形成された可能性がある抗原／抗体複合体を検出する工程を含んでなる方
法よりなる。
【０３１２】 本発明はまた、 ａ）本発明の抗体、 ｂ）適当な場合には、形成した可能性がある抗原／抗体複合体を検出するのに
必要な試薬を含む、サンプル中の本発明のＩ型ポリケチドシンターゼを検出する
ためのキットまたは装置に関する。
【０３１３】 本発明のＩ型ポリケチドシンターゼに対する抗体は、当業者によく知られた方
法に従い、検出可能な同位体または非同位体標識を使用して標識することができ
る。
【０３１４】 ピューロマイシン生合成経路の配列、リンデンの生分解に関与するｌｉｎＡ遺
伝子の配列またはＩ型ポリケチドシンターゼをコードする配列のような、存在す
るのが望ましい標的配列にハイブリダイズするプライマーのペアを使用する本発
明のＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、前記で詳しく説明されている。
【０３１５】 したがって、本発明の対象は、本発明の組換え宿主細胞の集団における、与え
られたヌクレオチド配列の核酸、または与えられたヌクレオチド配列に構造的に
類似したヌクレオチド配列の核酸を検出するための方法であって、 ・組換え宿主細胞の集団を、その与えられたヌクレオチド配列にハイブリダイ
ズプライマーのペア、または与えられたヌクレオチド配列に構造的に類似したヌ
クレオチド配列にハイブリダイズするプライマーのペアと接触させる工程、 ・少なくとも３つの増幅サイクルを行う工程、 ・増幅された核酸を検出する工程を含むことを特徴とする方法である。
【０３１６】 所望の標的配列の機能として適した増幅条件に関しては、当業者は後記の実施
例を有利に参照することが可能である。
【０３１７】 もう１つの態様では、本発明はまた、本発明の組換え宿主細胞の集団における
、与えられたヌクレオチド配列の核酸、または与えられたヌクレオチド配列に構
造的に類似したヌクレオチド配列の核酸を検出するための方法であって、 ・組換え宿主細胞の集団を、与えられたヌクレオチド配列にハイブリダイズす
るプローブ、またはその与えられたヌクレオチド配列に構造的に類似したヌクレ
オチド配列にハイブリダイズするプローブと接触させる工程、 ・該プローブと該集団のベクター内に含まれる核酸との間で形成されうるハイ
ブリッドを検出する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【０３１８】 リンデンを分解しうるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在を検
出するために本発明のＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うために、関心
のある組換えクローンを、リンデンを分解するそれらの能力に対応するそれらの
表現型に基づいて検出した。この目的には、単離されたクローンおよび／または
調製されたＤＮＡライブラリーのクローンのセット（組）を、リンデンの存在下
で培地内で培養し、該リンデン分解を、該細胞の隣接（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ）環
境中の濁ったハロの形成により観察した。
【０３１９】 本発明はまた、本発明の組換え宿主細胞の集団内の１以上の組換え宿主細胞に
よる関心のある化合物の産生を同定するための方法であって、 ・該集団の組換え宿主細胞を適当な培地内で培養する工程、 ・培養した１以上の組換え細胞の培養上清または細胞ライセート内の関心のあ
る化合物を検出する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【０３２０】 本発明の対象はまた、本発明の組換え宿主細胞の集団において、関心のある化
合物を産生する組換え宿主細胞を選択するための方法であって、 ・該集団の組換え宿主細胞を適当な培地内で培養する工程、 ・培養した１以上の組換え宿主細胞の培養上清または細胞ライセート内の関心
のある化合物を検出する工程、 ・関心のある化合物を産生する組換え宿主細胞を選択する工程を含むことを特
徴とする方法である。
【０３２１】 本発明はまた、 ・前記方法により選択された組換え宿主細胞を培養する工程、 ・該組換え宿主細胞により産生された化合物を回収し、適当な場合には精製す
る工程を含むことを特徴とする、関心のある化合物の製造方法に関する。
【０３２２】 本発明はまた、前記方法により得られることを特徴とする関心のある化合物に
関する。
【０３２３】 本発明の関心のある化合物は、配列配列番号３３〜配列番号４４および配列番
号３０〜配列番号３２および配列番号１１５〜配列番号１２０から選ばれる配列
を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を発現させることにより製造されたポ
リケチドよりなりうる。
【０３２４】 本発明はまた、配列配列番号３３〜配列番号４４および配列番号３０〜配列番
号３２および配列番号１１５〜配列番号１２０から選ばれる配列を含む少なくと
も１つのヌクレオチド配列を発現させることにより製造されたポリケチドを含む
組成物に関する。
【０３２５】 前記の少なくとも１つのヌクレオチド配列を発現させることにより製造された
ポリケチドは、好ましくは、ポリケチドの合成に必要な種々の酵素が翻訳産物で
ある機能的オペロン内に含まれるいくつかのコード配列（前記配列の１つは、該
オペロン内に含まれ、該オペロンにおいて発現される）の活性の産物である。ポ
リケチドシンターゼをコードする本発明の核酸配列を含むそのようなオペロンは
、例えば、Ｂｏｒｃｈｅｒｔら（１９９２）の教示に従い構築することができる
。
【０３２６】 本発明はまた、薬理学的に活性な量の本発明のポリケチドと、適当な場合には
医薬上許容されるビヒクルとを含む医薬組成物に関する。
【０３２７】 そのような医薬組成物は、本発明によりＩ型ポリケチドシンターゼにより合成
された、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、少なくとも０．
０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の量のポリケ
チドの投与、例えば非経口投与に有利に適用されるであろう。
【０３２８】 本発明の医薬組成物は、経口的、直腸内、非経口的、静脈内、皮下または皮内
に投与することができる。
【０３２９】 本発明はまた、本発明によりＩ型ポリケチドシンターゼを発現させることによ
り得られたポリケチドの、医薬品、特に抗生物質活性を有する医薬品の製造のた
めの使用に関する。
【０３３０】 本発明はまた、後記の図面および実施例により例示されるが、これらは本発明
を何ら限定するものではない。
【０３３１】 図１は、実施例１に記載のプロトコール１、２、３ｎ、４ａ、４ｂ、５ａおよ
び５ｂに従い行う種々の細胞溶解工程のスキームを示す。
【０３３２】 図２は、種々の細胞溶解処理（プロトコール１〜５、図１を参照されたい）の
後に３００ｍｇの土壌番号３（Ｓｔ Ａｎｄｒｅ海岸）から抽出したＤＮＡの０
．８％アガロースゲル上での電気泳動を示す。Ｍ：ラムダファージ分子量マーカ
ー。
【０３３３】 図３は、処理１〜５（図１を参照されたい）の後に培養した放線菌類の種々の
属の比率を示す。ｃｆｕ（コロニー形成単位）値は、この群の細菌に選択的な培
地上で測定した。合計約４００個のコロニーを分析した。
【０３３４】 図４は、粉砕の前（Ｇ）または後（Ｇ＊）に種々の濃度で土壌に加えたＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化したラムダファージＤＮＡの回収を示す。処理Ｔ（熱ショック）
およびＳ（超音波処理）は追加的な細胞溶解処理である。ドットブロットハイブ
リダイゼーション後のホスホイメージャーでの分析により、該定量を行った。各
土壌のサンプルを、加えたラムダファージの各濃度に使用した。該土壌の特徴を
表１に示す。加えた１０〜１５μｇ ｐｆ ＤＮＡに対応するサンプルは処理し
なかった。
【０３３５】 図５は、プロトコール１、２、３、５ａおよび５ｂに従い土壌番号３から抽出
したＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。常在ストレプトスポランギウム種（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓｐｐ．）を標的化するために、プライマーＦＧＰ
Ｓ １２２およびＦＧＰＳ ３５０（表２）を使用した。該抽出ＤＮＡは、未希
釈で又は１０倍および１００倍の希釈度で使用した。Ｍ：１２３ｂｐの分子量マ
ーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、Ｃ：ＤＮＡを含まない増幅対照。
【０３３６】 図６は、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＯＳ４８
．３の芽胞または菌糸体を種々の濃度で該土壌に接種した後に抽出されたＤＮＡ
の量を示す。該土壌に加えた菌糸体の量は、発芽培地に接種した芽胞の数に対応
する。該芽胞の約５０％が発芽し、該発芽芽胞菌糸に含まれる細胞またはゲノム
の数は測定しなかった。したがって、接種した芽胞および菌糸体の量は、直接的
には比較され得ない。該抽出プロトコールは、プロトコール６（材料および方法
の節を参照されたい）に従い行った。記号（’）は、該抽出バッファー内にＲＮ
Ａが含まれていたことを示す。該標的ＤＮＡはプライマーＦＧＰＳ ５１６およ
びＦＧＰＳ ５１７でのＰＣＲにより増幅し、該定量は、プローブＦＧＰＳ ５
１８を使用するドットブロットハイブリダイゼーション後のホスホイメージャー
で行った。各土壌のサンプルを菌糸または芽胞の各濃度に使用した。該土壌の特
徴を表１に示す。
【０３３７】 図７は、該土壌ＤＮＡライブラリー内に含まれる１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を培養
参照細菌に対して配置するＮｅｉｇｈｂｏｕｒ Ｊｏｉｎｉｎｇアルゴリズムで
得られた系統樹を表す。グレーの表示：該ライブラリーのクローンのプールから
得られた配列。
【０３３８】 １００回の繰返しの再サンプリングの後のブートストラップ値が、集合点に示
されている。目盛り線は、部位当たりの置換の数を示す。Ｇｅｎｂａｎｋデータ
ベース内の配列のアクセス番号が括弧内に示されている。
【０３３９】 図８は、ベクターｐＯＳｉｎｔ１のスキームを表す。
【０３４０】 図９は、ベクターｐＷＥＤ１のスキームを表す。
【０３４１】 図１０は、ベクターｐＷＥ１５（ＡＴＣＣ番号３７５０３）のスキームを表す
。
【０３４２】 図１１は、ベクターｐＯＳ７００Ｉのスキームを表す。
【０３４３】 図１２は、ベクターｐＯＳＶ０１０のスキームを表す。
【０３４４】 図１３は、ベクターｐＯＳＶ３０３の構築中にプラスミドｐＯＳＶ０１０内に
挿入された「ｃｏｓ」部位を含有する断片を表す。
【０３４５】 図１４は、ベクターｐＯＳＶ３０３のスキームを表す。
【０３４６】 図１５は、ベクターｐＥ１１６のスキームを表す。
【０３４７】 図１６は、ベクターｐＯＳ７００Ｒのスキームを表す。
【０３４８】 図１７は、ベクターｐＯＳＶ００１のスキームを表す。
【０３４９】 図１８は、ベクターｐＯＳＶ００２のスキームを表す。
【０３５０】 図１９は、ベクターｐＯＳＶ０１４のスキームを表す。
【０３５１】 図２０は、ベクターｐＢＡＣ１１のスキームを表す。
【０３５２】 図２１は、ベクターｐＯＳＶ４０３のスキームを表す。
【０３５３】 図２２は、ＰＫＳ−１オリゴヌクレオチドでスクリーニングしたライブラリー
の陽性クローンを酵素ＢａｍＨＩおよびＤｒａＩで消化した後のライブラリーの
ＤＮＡの電気泳動ゲルを表す。
【０３５４】 図２３は、エス・アルボニガー（Ｓ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）野生型株の産生と
比較した場合の、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）組
換え体によるピューロマイシンの産生を示す。
【０３５５】 図２４は、土壌ＰＫＳと他のＰＫＳの保存された活性部位とのアライメントを
示す。各ペプチドに関する表示内容が示されている。該ベータ−ケトアシルシン
ターゼドメインは、ＧＣＧ ＰＩＬＥＵＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐ
ａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ）を使用して整列（アライン）させた
。
【０３５６】 図２５は、組込み型接合型コスミドの構築を示す。
【０３５７】 図２６は、組込み型接合型ＢＡＣの構築を示す。
【０３５８】 図２７は、ベクターｐＯＳＶ３０８の構築に関するスキームを示す。
【０３５９】 図２８は、ベクターｐＯＳＶ３０６の構築に関するスキームを示す。
【０３６０】 図２９は、ベクターｐＯＳＶ３０７に関するスキームを示す。
【０３６１】 図３０は、ベクターＰＭＢＤ−１の構築に関するスキームを示す。
【０３６２】 図３１は、プラスミドｐＭＢＤ−２の詳細な地図およびベクターｐＭＢＤ−３
の構築に関するスキームを示す。
【０３６３】 図３２は、プラスミドｐＭＢＤ−４の詳細な地図を示す。
【０３６４】 図３３は、プラスミドのｐＭＢＤ−１からのプラスミドｐＭＢＤ−５の構築に
関するスキームを示す。
【０３６５】 図３４は、ベクターｐＢＴＰ−３の詳細な地図を示す。
【０３６６】 図３５は、ベクターｐＭＢＤ−１からのベクターｐＭＢＤ−６の構築に関する
スキームを示す。
【０３６７】 図３６は、コスミドａ２６Ｇ１（そのＤＮＡ挿入体は、いくつかのポリケチド
シンターゼをコードするオープンリーディングフレームを含有する）の地図を示
す。
【０３６８】 図３７は、いくつかのポリケチドシンターゼをコードする種々のリーディング
フレームが配置されたコスミドａ２６Ｇ１のＤＮＡ挿入体（＋鎖）を表すスキー
ムである。
【０３６９】 （実施例） 実施例１：土壌サンプルからのＤＮＡの直接的抽出の工程を含む、生物を含有 する土壌サンプルからの核酸集団の製造方法 １．材料および方法 １．１ 土壌：この研究に使用した６つの土壌の特徴を表１に示す。
【０３７０】 粘土含量および有機物質含量の範囲は、それぞれ、９〜４７％および１．７〜
４．７％、ｐＨの範囲は４．３〜５．８である。
【０３７１】 土壌サンプルを深さ５〜１０ｃｍの表層から集めた。肉眼で認められるすべて
の根を除去し、必要に応じて該土壌を４℃で数日間保存し、ついでそれらを室温
で２４時間乾燥し、篩い（平均メッシュサイズ：２ｍｍ）にかけ、ついで４℃で
数ヶ月まで保存した。
【０３７２】 １．２ 細菌株および培養条件 該土壌サンプルに接種するために使用する栄養細胞、芽胞または菌糸を供給す
る細菌株および細胞外ＤＮＡを、それらの存在が詳細にモニターされうるように
選択した。
【０３７３】 多量の細胞外ＤＮＡを得るために、ラムダファージＣＩ８５７ Ｓａｍ７を含
有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１１９２ Ｈｆｒ Ｐ４Ｘ（ｍｅｔＢ）の溶原株
を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地上、３０℃で２時間、ついで４０
℃で３０分間、ついで３７℃で３時間培養した。該ラムダファージＤＮＡを、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｎ．Ｙ．に記載の技術に従い抽出した。
【０３７４】 炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のアビルレント株（ＳＴＥ
ＲＮＥ ７７００）を細菌細胞接種物として使用した。炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を「トリプチケース・ダイズブロス」（ＴＢＳ）（Ｂ
ｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎｓ，Ｆｒａｎｃｅ）培地上で約６時間増殖させ、
ＯＤ６００が０．６未満に維持されることを確認した。これらの条件は、芽胞の
形成を伴うことなく栄養細胞の成長を可能にする（Ｐａｔｒａら，（１９９６）
，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ
ｏｌ．１５：２２３−２３１）。ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＯＳ４８．３（Ｃｌｅｒｃ−Ｂａｒｄｉｎ
ら，未公開）の芽胞を、Ｒ２ＹＥ培地（Ｈｏｐｗｏｏｄら，（１９８５），Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏ
ｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）上の生物
培養から機械的に取り出した。ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ）ＯＳ４８．３の菌糸を予備発芽芽胞から得た。なぜなら、短い菌糸の
使用がＤＮＡの破壊およびそれに続く喪失を最小限に抑えると予想されたからで
ある。該芽胞をＴＥＳバッファー（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２
−アミノエタン−スルホン酸；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｉｍｉｅ，Ｆ
ｒａｎｃｅ（０．０５Ｍ；ｐＨ８）（Ｈｏｌｂｅｎ ＷＥら，（１９８８），Ａ
ＰＰＬ．Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．５４：７０３−７１１
）に懸濁させ、ついで熱ショック（５０℃で１０分間、ついで冷却流水下での冷
却、ついで等容積の予備発芽培地（１％ 酵母エキス、１％ カザミノ酸、０．
０１Ｍ ＣａＣｌ２）の添加）に付した。
【０３７５】 該溶液を、攪拌機上、３７℃でインキュベートした。Ｈｏｐｗｏｏｄら（１９
８５）の結果どおりに、発芽した芽胞の比率は約５０％と推定された。遠心分離
後、該ペレットをＴＥＳバッファーに再懸濁させ、３％ ＴＳＢ培地に加え、０
．１５のＯＤ４５０が得られるまで３７℃でインキュベートした（Ｈｏｐｗｏｏ
ｄら，（１９８５））。ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＳＷＮ ７３６およびストレプ
トスポランギウム・フラジル（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｆｒａｇ
ｉｌｅ）ＡＣ１２９６（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｕｓｈｉｎｏ，Ｍｏｓｃｏｗ）
を、ＨｉｃｋｅｙおよびＴｒｅｓｎｅｒ（１９５２）に記載の技術に従い培養し
た。
【０３７６】 ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の芽胞および菌糸
のＤＮＡは、後記の細胞溶解プロトコール６に従い（ただし、粉砕は行わなかっ
た）純粋培養から抽出し、一方、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓ
．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）およびストレプトスポランギウム・フラジル（
Ｓ．ｆｒａｇｉｌｅ）の芽胞は、化学的／酵素的細胞溶解（Ｈｉｎｔｅｒｍａｎ
ｎら，１９８１）により抽出した。
【０３７７】 １．３ 抽出バッファーの選択 Ｐｉｃａｒｄ（１９９２）により開発されたＴＥＮＰバッファー（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ｗｔ／ｖｏｌの
ポリビニルポリピロリドン）を使用した。後に、同様のバッファーが他の著者（
Ｃｌｅｇｇら，１９９７；Ｋｕｓｋｅら，１９９８；Ｚｈｏｕら，１９９６）に
より使用された。
【０３７８】 該ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡはヌクレアーゼ活性からＤＮＡを防御し、該ＮａＣ
ｌは分散効果をもたらし、該ＰＶＰＰはフミン酸およびその他のフェノール性化
合物を吸収する（Ｈｏｌｂｅｎら，（１９８８）；Ｐｉｃａｒｄら，（１９９２
））。
【０３７９】 この研究においては、このバッファーの抽出の有効性を、５．８〜８．３のｐ
Ｈ範囲および０．２〜６．３％の有機物質含量を有する２０個の異なる土壌を使
用して種々のｐＨ値（６．０〜１０．０）で評価した。これらの２０個の土壌（
その他の特徴は示されていない）は、この実験でのみ使用した。ＤＮＡの量は、
Ｒｉｃｈａｒｄ（１９７４）に記載されている及び後記で詳しく説明する比色手
段により測定した。
【０３８０】 １．４ ｉｎ ｓｉｔｕ細胞溶解およびＤＮＡ抽出のプロトコール ｉｎ ｓｉｔｕで土壌微生物を細胞溶解するための種々の技術の有効性を評価
するために、次第に工程数を増加させる幾つかのプロトコールを試験した。これ
らの実験では、常在土壌微生物叢を６個の土壌において標的化した。該土壌に予
め加えられたラムダファージＤＮＡに由来する回収されたＤＮＡの量および質を
分析することにより、遊離したＤＮＡに対する該細胞溶解処理の効果を研究する
ために、追加的な実験を行った。
【０３８１】 最適化されたプロトコール（プロトコール６と称される）を一旦開発したら、
このプロトコールを使用して、常在放線菌類に由来するＤＮＡおよび選択土壌に
接種されたグラム陽性菌に由来するＤＮＡを定量した。すべての場合において、
該土壌サンプルを乾燥させ、前記のとおりに篩いにかけた。
【０３８２】 粉砕後、０．５ｍｌのＴＥＮＰバッファーを２００ｍｇの乾燥重量の土壌に加
えた。ただし、プロトコール１においては、該バッファーを未粉砕土壌に加えた
。
【０３８３】 種々の細胞溶解処理（後記を参照されたい）のために、該土壌懸濁液を１０分
間にわたりボルテックスし、遠心分離（４０００×ｇで５分間）し、ついで該上
清のアリコート画分（２５μｌ）をゲル電気泳動（０．８％ アガロース）によ
り分析した。
【０３８４】 既知容積（一般には３５０μｌ）に相当する該上清のもう１つのアリコート画
分を、イソプロパノールで沈殿させた。
【０３８５】 ５つのアリコート画分（１ｇの土壌に由来するＤＮＡを代表するもの）を合わ
せ、１００μｌの無菌ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ
，ｐＨ８．０）に再懸濁させ、ついで精製（プロトコールＤ、後記を参照された
い）および定量を行った。これは、該全ＤＮＡのハイブリダイゼーション（ドッ
トブロット（Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ））により、あるいは該ＰＣＲ増幅産物のハイブ
リダイゼーション（ドットブロット）により行った（後記を参照されたい）。
【０３８６】 該ハイブリダイゼーションシグナルは、りん光イメージング（「ホスホイメー
ジング」技術、後記を参照されたい）により定量した。
【０３８７】 １．５ ｉｎ ｓｉｔｕ細胞溶解の方法の評価 次第に増加する細胞溶解処理工程（プロトコール２〜５ｂ）の後に抽出された
ＤＮＡの質および量を、抽出バッファーでの該土壌の洗浄後に得られた細胞外Ｄ
ＮＡの場合（プロトコール１；図１も参照されたい）と比較した。
【０３８８】 プロトコール１：細胞溶解処理無し ＴＥＮＰバッファーを未粉砕土壌に加え、ＤＮＡ抽出工程を前記のとおりに行
った。
【０３８９】 プロトコール２：土壌の粉砕およびそれに続くＤＮＡ抽出 ２つの異なるタイプの装置を使用して、該土壌を粉砕した。
【０３９０】 それらのそれぞれの有効性を比較するために、５ｇの乾燥土壌を、タングステ
ンリングを含有する粉砕機中で３０秒間にわたり、あるいは、６０分間まで変化
させて４回、乳鉢およびメノウビーズ（直径２０ｍｍ）を含有する土壌粉砕機中
で粉砕した。
【０３９１】 ついで該ＴＥＮＰバッファーを加え、該ＤＮＡを前記のとおりに抽出した。
【０３９２】 該ゲル電気泳動の結果は、タングステンリングを使用する３０分間の粉砕後に
得られるのと同等の抽出ＤＮＡ量を得るためには、メノウビーズを使用する４０
分間の粉砕が必要であることを示した。
【０３９３】 該ＤＮＡ断片のサイズ分布は、いずれの方法を用いた場合にも同様である。
【０３９４】 したがって、これらの処理は同等であるとみなされ、したがって、後記のプロ
トコールで用いる処理は明示されていない。
【０３９５】 プロトコール３〜５においては、該土壌の粉砕後の幾つかの他の細胞溶解処理
の有効性を、独立して又は種々の組合せにおいて試験した。
【０３９６】 プロトコール３ このプロトコールはプロトコール２と同じである。ただし、それは、５分間の
最大速度の半分に設定されたＵｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘタイプのミキサー（Ｊａ
ｎｋｅｒおよびＫｕｎｋｅｌ，ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）を使用する均質化の工程を含む。
【０３９７】 プロトコール４ａおよび４ｂ これらのプロトコールは、追加的な超音波処理工程以外はプロトコール３と同
じである。
【０３９８】 ２つのタイプのソニケーター装置、すなわち、チタンミクロポイントソニケー
ター（６００Ｗ Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ，Ｂｉｏ
ｂｌｏｃｋ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）（プロトコール４ａ）およびＣ
ｕｐ Ｈｏｒｎタイプのソニケーター（プロトコール４ｂ）を比較した。
【０３９９】 超音波を発生するＶｉｂｒａｃｅｌｌミクロポイントは、該土壌溶液に直接接
触させる。
【０４００】 Ｃｕｐ Ｈｏｒｎタイプの装置に関しては、該土壌溶液は、超音波の通過を媒
介する水浴内に配置されたチューブ内に供給される。
【０４０１】 それらの２つのソニケーターの最適条件を決定するために、予備実験を行った
（結果は示されていない）。
【０４０２】 抽出されたＤＮＡの量と断片のサイズに関する最良の歩み寄りは、５０％活動
（ａｃｔｉｖｅ）周期で電力を１５Ｗに調節しチタニウムミクロポイントおよび
Ｃｕｐ Ｈｏｒｎタイプのソニケーターでのそれぞれ７分間および１０分間の超
音波処理よりなる。
【０４０３】 プロトコール５ａおよび５ｂ チタンミクロポイントまたはＣｕｐ Ｈｏｒｎタイプの装置での超音波処理（
それぞれ、プロトコール４ａおよび４ｂ）の後、リゾチームおよびアクロモペプ
チダーゼを、該酵素のそれぞれが０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるまで加えた
。 該土壌懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートし、ついで最終濃度１％のラ
ウリルスルファートを加え、ついで該懸濁液を６０℃で１時間インキュベートし
、ついで前記のとおりに遠心分離し沈殿させた。
【０４０４】 前記のプロトコールに加えて、該土壌に予め加えたＨｉｎｄＩＩＩで消化され
たラムダファージＤＮＡに対する超音波処理（Ｃｕｐ Ｈｏｒｎ、プロトコール
４ｂを参照されたい）および熱ショック（液体窒素中で３０秒間、ついで沸騰水
中で３分間、それらの処理を３回繰返す）の効果を調べた（後記を参照されたい
）。
【０４０５】 先行技術においては、熱ショックは、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞溶解のための手段と
して示唆されている（Ｐｉｃａｒｄら（１９９２））。しかし、そのような処理
は該遊離ＤＮＡに有害な影響を及ぼすため（結果の節を参照されたい）、それは
前記のプロトコールには含めなかった。
【０４０６】 最適化されたプロトコール 種々の細胞溶解処理の評価の後、最適化されたプロトコールを決定した。それ
はプロトコール６と称される。プロトコール６は、超音波処理前に該土壌懸濁液
をボルテックス処理に付し次いで２時間にわたり回転盤上での回転により攪拌し
次いで−２０℃に凍結すること以外はプロトコール５ｂと同じである。
【０４０７】 融解後、該土壌懸濁液を超音波処理前に１０分間ボルテックスした。該土壌に
細菌細胞を接種する実験において、および常在放線菌類を定量する実験において
、プロトコール６を用いた（後記を参照されたい）。
【０４０８】 １．６ 顕微鏡による計数 細菌細胞を細胞溶解するための方法としての該土壌の粉砕の有効性を、顕微鏡
により調べた。
【０４０９】 ５ｇの乾燥粗土壌を、Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒ装置中、１．５分間にわ
たり５０ｍｌの無菌超純水と混合し、同時に、１ｇ（乾燥重量）の粉砕土壌（プ
ロトコール２）を１０分間の攪拌により１０ｍｌに懸濁させた。該土壌懸濁液を
系列希釈し、アクリジンオレンジを最終濃度０．００１％になるまで加えた。
【０４１０】 ２分後、該懸濁液を０．２μｍのブラックタイプのＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅブラ
ンドの膜で濾過した。各フィルターを、細胞溶解された無菌水でリンスし、１ｍ
ｌのイソプロパノールで１分間にわたり処理して該細菌を固定し、ついで再びリ
ンスした。
【０４１１】 該細菌細胞を、１００倍の対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａ
ｌエピ蛍光顕微鏡を使用して計数した。各土壌タイプに関して、３つのフィルタ
ーを計数し、少なくとも２００細胞をそれらの各フィルター上で計数した。
【０４１２】 １．７ 培養可能な放線菌類の計数およびコロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数 該細胞溶解処理（プロトコール１〜５）の後に生存した放線菌類を、土壌番号
３（Ｓａｉｎｔ Ａｎｄｒｅ海岸、表１を参照されたい）で詳しく検査した。
【０４１３】 発芽を誘発するための（Ｈａｙａｋａｗａら（１９８８））ＳＤＳ（０．０５
％）および酵母エキス（６％ 重量／容積）の溶液の１０倍希釈の後、該土壌懸
濁液を無菌水中で系列希釈し、４０℃で２０分間インキュベートし、ＨＶ培地（
Ｈａｙａｋａｗａら（１９８７））上に接種した。
【０４１４】 該ＨＶ培地をアクチジオン（５０ｍｇ／ｌ）およびナイスタチン（５０ｍｇ／
ｌ）で補足した。
【０４１５】 ２８℃で１５日間のインキュベーションの後、該放線菌コロニーを計数した。
【０４１６】 合計で約４００個のコロニーを検査した。該同定は、肉眼的および顕微鏡的な
形態学的特徴に基づいて、および該単離物のジアミノピメリン酸含量の分析に基
づいて行った（Ｓｈｉｒｌｉｎｇら，１９６６）；Ｓｔａｎｅｃｋら，１９７４
；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９３）。
【０４１７】 また、培養可能な細菌の全量（全ＣＦＵ）を、細胞溶解プロトコール１〜５の
それぞれに関して測定した。該土壌懸濁液を系列希釈し、ナイスタチンおよびア
クチジオン（それぞれ５０ｍｇ／ｌ）で補足されたＢｅｎｎｅｔｔ寒天培地（Ｗ
ａｋｓｍａｎら，１９６１）上に三重に接種した。
【０４１８】 各ペトリ皿を硝酸セルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で覆い、２８
℃で３日間インキュベートした。該膜上のコロニーを計数した後、該フィルター
を除去し、該ペトリ皿を２８℃で７日間にわたり再インキュベートし、ついで再
び計数した。
【０４１９】 １．８ 土壌に加えたラムダファージＤＮＡの回収 標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従い、該ラムダフ
ァージＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール−クロロホルム混合物で抽
出し、沈殿させ、ついで無菌超純水に再懸濁させた。
【０４２０】 土壌の乾燥重量１ｇ当たりのＤＮＡ ０、２．５、５、７．５、１０および１
５μｇ（μｇ ＤＮＡ／ｇ土壌乾燥重量）にそれぞれ対応する希釈物を、６０μ
ｌの容積で調製した。これらのＤＮＡ希釈物を５ｇのバッチの乾燥土壌に加え、
ついで、粉砕前にそれを５分間にわたり激しくボルテックスした。
【０４２１】 また、粉砕前に、該ラムダファージＤＮＡを、０、１０および１５μｇ ＤＮ
Ａ／ｇ土壌乾燥重量の濃度で土壌に加えた。
【０４２２】 粉砕後、該抽出バッファーを加え、プロトコール２（前記を参照されたい）に
従い該ＤＮＡを抽出した。
【０４２３】 １．９ ＲＮＡでの吸着部位の飽和 該土壌コロイドの核酸吸着部位の飽和が該ＤＮＡの回収レベルを増加させうる
か否かを判定するために、他の処理の前に、砂質配合土（土壌番号４）および粘
土質土壌（土壌番号５）をＲＮＡ溶液と共にインキュベートした。
【０４２４】 市販のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍｅｙｌａ
ｎ，Ｆｒａｎｃｅ）をリン酸バッファー（ｐＨ７．１）中で希釈し、篩いにかけ
られた乾燥土壌サンプル（２ｍｌ／ｇ土壌）に２０、５０および１００ｍｇ Ｒ
ＮＡ／ｇ土壌乾燥重量の最終濃度で加えた。
【０４２５】 該土壌懸濁液を含有するチューブを室温で２時間の回転により攪拌した。遠心
分離後、該土壌ペレットをオーブン（５０℃）内で一晩乾燥させた。ついで、細
胞溶解後に遊離されたＤＮＡの運命を模擬するために、該土壌に該ラムダファー
ジＤＮＡ（０、２０または５０μｇ／ｇ土壌乾燥重量）を加えた。
【０４２６】 該ＤＮＡをプロトコール２に従い抽出した。ついで、ＤＮＡの回収に対するＲ
ＮＡの添加の同じ効果が、該抽出バッファーに該ＲＮＡを直接加えることにより
達成されうることが確認された。
【０４２７】 該微生物を該土壌に接種する実験において、この簡略化された方法を粘土質土
壌番号５に用いた。
【０４２８】 ついで該ＲＮＡを、５０ｍｇ ＲＮＡ／ｇ土壌乾燥重量に対応する濃度で加え
た。
【０４２９】 １．１０ 抽出プロトコールの有効性の定性的および定量的測定 該ＤＮＡ（分解の不存在下）の質を、０．８％アガロースゲル上でのＤＮＡ溶
液のアリコート画分の電気泳動後のＤＮＡ泳動バンドの相対位置またはＤＮＡ断
片のサイズに基づき評価した。
【０４３０】 該蛍光強度は、該抽出収量の半定量的推定を可能にした。
【０４３１】 もう１つのアリコート画分を、ハイブリダイゼーション（ドットブロット）お
よびホスホイメージャーでの分析によるＤＮＡ含量の定量的測定に使用した。該
ドットブロット（ドットブロット）ハイブリダイゼーションプロトコールはＳｉ
ｍｏｎｅｔら（１９９０）により記載されている。
【０４３２】 該ハイブリダイゼーション膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎプラス，Ｌｉｆｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）を、６ｍｌの２０×Ｓ
ＳＣ、１ｍｌのデンハルト液、１ｍｌの１０％ ＳＤＳおよび５ｍｇのサケ***
ＤＮＡを含有する２０ｍｌの溶液中、少なくとも２時間プレハイブリダイズさせ
た。
【０４３３】 該ハイブリダイゼーションを、標識プローブの存在下、同じ溶液中で一晩行い
、ついでＳＳＣ ２×バッファー中、室温で５分間の該膜の２回の洗浄を行い、
ついで、ＳＳＣ ２×、０．１％ ＳＤＳバッファー中での３回目の洗浄、およ
びＳＳＣ １×、０．１％ ＳＤＳバッファー中、該ハイブリダイゼーション温
度で３０分間の４回目の洗浄を行った。
【０４３４】 該ハイブリダイゼーションシグナルをＢｉｏｒａｄ放射能分析イメージング系
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＢＩＯＲＡＤ，Ｉ
ｖｒｙ−ｓｕｒ−Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で定量した。
【０４３５】 常在微生物叢に由来するＤＮＡの全量を定量するために、プロトコール１〜５
に従い種々の土壌を抽出した。該未増幅ＤＮＡをドットブロットメンブレンに適
用し、普遍的（ユニバーサル）プローブＦＧＰＳ４３１（表２）を使用してハイ
ブリダイズさせた。
【０４３６】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子（Ａｍａｎｎら（１９９５）
）の１３９２−１４０６位にハイブリダイズするこのプローブを、ポリヌクレオ
チドＴ４キナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍｅｌａｎ，Ｆ
ｒａｎｃｅ）を使用して３２Ｐ ＡＴＰαでその末端で標識した。
【０４３７】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α ＤＮＡを使用して、検量線を作成した。該
土壌細菌への該計算の変換には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関してはコピーの平
均数（ｒｒｎ）が７であるという仮定から出発する単純化が必要であった。
【０４３８】 ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたラムダファージＤＮＡを使用して、該細胞外ＤＮ
Ａの回収を定量した。ラムダファージＤＮＡが加えられた土壌からの未増幅抽出
物を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されクレノウフラグメント（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍｅｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）の使用によりランダムに標識
されたラムダファージＤＮＡにハイブリダイズさせた。
【０４３９】 該精製ＤＮＡで作成された検量線を使用する補間法により、ＤＮＡの量を求め
た。
【０４４０】 また、プロトコール２（粉砕）に従い土壌１、２、３、４および６から抽出さ
れたＤＮＡの全量を、Ｒｉｃｈａｒｄ（１９７４）に記載の技術に従う比色手段
により定量した。
【０４４１】 簡単に説明すると、該ＤＮＡを濃ＨＣｌＯ４（ＨＣｌＯ４の最終濃度は１．５
Ｎであった）と混合した。２．５容積のこの溶液を１．５容積のＤＰＡ（ジフェ
ニルアミン，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）と混合し、該混合物
を室温で１８時間インキュベートし、ついで６００ｎｍのＯＤを測定した。該土
壌ＤＮＡ抽出物を、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）
）に従い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αから抽出されたＤＮＡで作成した標準
曲線に対して定量した。
【０４４２】 １．１１ ＰＣＲ増幅およびハイブリダイゼーションを用いるＤＮＡ定量技術 の開発 ＰＣＲ増幅には、ＤＮＡ Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ Ｏｎｃ
ｏｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を該製造業者の説明に従い使用した。
【０４４３】 該増幅のすべてに用いたＰＣＲプログラムは以下のとおりである：９５℃で３
分間の初期変性、ついで９５℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間
よりなる３５サイクル、ついで７２℃で３分間の最終的伸長。
【０４４４】 ストレプトスポランギウム・フラジル（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ
ｆｒａｇｉｌｅ）から単離し精製したＤＮＡを、１００ｆｇ〜１００ｎｇの濃
度で対照として使用した。
【０４４５】 この細菌属のＤＮＡを特異的に増幅するために、放線菌１６Ｓ ｒＤＮＡの配
列のアライメントの後、１６Ｓ ｒＤＮＡの一部に相補的なプライマーＦＧＰＳ
１２２およびＦＧＰＳ３５０（表２）を選択した。放線菌株（ストレプトマイセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトスポランギウム（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）および他の非常に類似した属）の集団上で、それらの特
異性を試験した。
【０４４６】 該ＰＣＲ産物を、オリゴヌクレオチドプローブＦＧＰＳ６４３（表２）にハイ
ブリダイズさせた。該土壌から抽出されたＤＮＡで得られた純度のレベルを模擬
するために、ストレプトスポランギウム・フラジル（Ｓ．ｆｒａｇｉｌｅ）から
の純粋なＤＮＡの対照を、細胞溶解プロトコール４ｂおよび５ｂに従う処理後に
得られ次いでプロトコールＤに従い精製された土壌抽出物と混合した。
【０４４７】 使用前に、該土壌抽出物を室温で３０分間にわたりＤＮアーゼ（１単位のＤＮ
アーゼ／ｍｌ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で処理した。ついで該ＤＮアーゼを６５℃
で１０分間の加熱により不活性化した。該不活性化の確認をＰＣＲにより行った
。フミン酸濃度は、市販のフミン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線に対して、分光測
光（ＯＤ２８０ ｎｍ）により測定した。
【０４４８】 未希釈、１０倍希釈および１００倍希釈のＤＮアーゼで処理した土壌溶液を、
該ＰＣＲ増幅前に、１００ｆｇ〜１００ｎｇのストレプトスポランギウム・フラ
ジル（Ｓ．ｆｒａｇｉｌｅ）ＤＮＡと混合した。もう１つの一連の実験において
は、非標的ＤＮＡの存在および該ＰＣＲ法に対するその影響を模擬するために、
次第に増加する濃度のストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＤＮＡ（１００ｐｇ〜１μｇ）を
、該ストレプトスポランギウム・フラジル（Ｓ．ｆｒａｇｉｌｅ）ＤＮＡに加え
た。
【０４４９】 １．１２ 粗ＤＮＡ抽出物の精製 ４つのＤＮＡ精製方法を比較した。該ＤＮＡを、プロトコール４ａに従い１ｇ
（乾燥重量の土壌）から抽出し、１００μｌのバッファーＴＥ８（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に再懸濁させた。
【０４５０】 プロトコールＡ ２つの連続的なＥｌｕｔｉｐ ｄ カラム（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃ
ｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｐｉｃａｒｄら，（１９９２）
）を介した溶出。
【０４５１】 プロトコールＢ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を介した溶出およびそれに続くＥｌｕｔｉｐ
ｄ カラム（Ｎｅｓｍｅら（１９９５））を介した溶出。
【０４５２】 プロトコールＣ １７．９％（重量／重量）のＰＥＧ ８０００（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａ
ｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１４．３％（重量／重量）の（ＮＨ４）２ＳＯ４ （Ｚａｓｌａｖｓｋｙら，（１９９５））による２相水性系を使用する分離。
【０４５３】 激しいボルテックス混合の後、それらの２相を室温で放置して分離させた。
【０４５４】 該相のそれぞれの１ｍｌをもう１つのチューブ内に移し、１００μｌの該サン
プルと混合し、４℃で一晩放置して分離させた。
【０４５５】 過剰の塩を除去するために、該下相を、過剰のＴＥ７．５バッファー（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）および１Ｍ ＭｇＣｌ２）の存
在下、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ膜を介して１時間透析した。
【０４５６】 プロトコールＤ Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ ＨＲカラム（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を介した溶出お
よびそれに続くＥｌｕｔｉｐ ｄ カラムを介した溶出。
【０４５７】 各プロトコールは、エタノールでの沈殿の工程により完了する。該ＤＮＡを１
０μｌのＴＥ ７．５バッファーい再懸濁させる。標準的なプロトコールを用い
て（後記を参照されたい）、該精製プロトコールの有効性を、該ＤＮＡ溶液の未
希釈アリコート画分ならびに１０倍および１００倍希釈アリコート画分のＰＣＲ
増幅により確認した。
【０４５８】 １．１３ 接種微生物からのＤＮＡの回収 該細胞、芽胞および菌糸を２回洗浄し、プレート上での計数により又は直接的
な顕微鏡的計数により計数した。５ｇのバッチの篩いにかけられた乾燥土壌（土
壌２、３および５）に、０、１０３、１０５、１０７および１０９芽胞／ｇ土壌
乾燥重量に対応する濃度のストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）の芽胞および菌糸の懸濁液１００μｌ、または０、１０７および１０９細
胞／ｇ土壌乾燥重量に対応する濃度の炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）栄養細
胞を接種した。
【０４５９】 ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）菌糸の量を、それ
らが由来する芽胞の数に基づいて計算した。該細菌懸濁液の添加後、該土壌サン
プルを激しく５分間にわたりボルテックスし、ついで粉砕した。該ＤＮＡを、プ
ロトコール６（後記を参照されたい）に従い抽出した。
【０４６０】 該細胞および芽胞から回収された並びに該土壌に接種された細菌菌糸体から回
収されたＤＮＡの量を定量するために、ＰＣＲ増幅およびそれに続くドットブロ
ットハイブリダイゼーションおよびりん光イメージング（ホスホイメージング）
を用いた。
【０４６１】 該ＤＮＡ抽出を、細胞溶解プロトコール６に従い行った。該ＰＣＲ増幅および
該ハイブリダイゼーションを、前記のとおりに行った。該プライマーおよびプロ
ーブは、１６Ｓ領域の外に位置する染色体領域上に標的化され、バックグラウン
ドシグナルを避けるためにそれぞれの生物に非常に特異的である。
【０４６２】 炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を接種した土壌には、プライマーＲ４９９
およびＲ５００を使用し（Ｐａｔｒａら（１９９６））、該増幅産物をオリゴヌ
クレオチドプローブＣ５０１（表２）にハイブリダイズさせた。
【０４６３】 ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）を接種した土壌に
関しては、プライマーＦＧＰＳ５１６およびＦＧＰＳ５１７を使用してＰＣＲ反
応を行い、該増幅産物をオリゴヌクレオチドプローブＦＧＰＳ５１８（表２）に
ハイブリダイズさせた。
【０４６４】 該増幅領域は、株ＯＳ４８．３（Ｃｌｅｒｃ−Ｂａｒｄｉｎら，未公開）を得
るために特別に構築されたカセットの一部である。
【０４６５】 該検量（校正）計数は、すべての場合において、該標的生物からの精製された
ＤＮＡを使用して得た。
【０４６６】 ２．結果 ２．１ 抽出バッファーの選択 該ＤＮＡ抽出バッファーの最適ｐＨを決定するために、２０個の異なる土壌を
使用した。すべての土壌に関して、該ＤＮＡ収量は、該バッファーｐＨが増加す
るにつれて増加する。該土壌のそれぞれについての最高値の割合（％）として算
出された各ｐＨに関する収量（±ｓｄ）は以下のとおりである：ｐＨ６．０：３
１±１３；ｐＨ７．０：４３±１６；ｐＨ８．０：６０±１４；ｐＨ９．０：８
２±１２；ｐＨ１０．０：９８±３。
【０４６７】 ２０個中１６個の土壌においては、ｐＨ１０．０で最高収量が得られたが、そ
の他の土壌においては、ｐＨ９．０で最高収量が得られた。しかし、ｐＨ１０．
０では、ｐＨ９．０の場合より多量の腐植質物質が遊離された（結果は示してい
ない）。したがって、後記の実験のすべてにおいてｐＨ９．０を選択した。
【０４６８】 ２．２ ＤＮＡ抽出プロトコールの有効性 いくつかのｉｎ ｓｉｔｕ細胞溶解プロトコールの有効性を評価するために、
常在土壌微生物からの全ＤＮＡを抽出し、定量した。土壌サンプル１〜６（表１
）を、材料および方法の節に記載のプロトコール１〜５に従い処理した（図１）
。
【０４６９】 該ＤＮＡ抽出後、該土壌懸濁液をイソプロパノールで沈殿させ、該再懸濁ペレ
ットのアリコート画分を第１工程においてゲル電気泳動により分析して、遊離さ
れたＤＮＡの質および量を評価した。
【０４７０】 しかし、細胞溶解工程の数が増加するにつれて、フミン酸のような化合物と該
ＤＮＡとの共抽出のため、該ＤＮＡ抽出物の色は、より濃くなった。
【０４７１】 これらの濃色粗抽出物のいくつかは、該アガロースゲル内で、予想された様態
では移動しない。
【０４７２】 したがって、定量前に、該粗ＤＮＡ溶液を精製した（プロトコールＢ）。種々
の細胞溶解処理の後に得られた精製された溶液のゲル電気泳動は、土壌３に関す
る実例として示されている（図２）。
【０４７３】 該着色ＤＮＡの強度の紫外線照射による視覚的比較は、該処理の有効性の半定
量的評価を可能にした。さらに、複数のサイズのＤＮＡ断片（不連続なバンド）
の移動（泳動）プロフィールの存在および長い断片の消失は、該ＤＮＡの分解が
生じていることを示している。
【０４７４】 粘土質土壌番号５からは、ＤＮＡを抽出することができなかった。
【０４７５】 プロトコール１〜５に従い抽出されたそれらの全土壌からのＤＮＡの、より厳
密な定量を、該１６Ｓ ｒＤＮＡ領域の高度に保存された配列に相補的なオリゴ
ヌクレオチドプローブ（プローブＦＧＰＳ４３１、表２）を使用して及び予めＰ
ＣＲ増幅を行うことなくドットブロットハイブリダイゼーションにより行った。
【０４７６】 該ＤＮＡは、それらの種々の細胞溶解工程のそれぞれの後の、粘土質土壌番号
５以外の全ての土壌の抽出物において検出された。
【０４７７】 該結果は、ゲル電気泳動後になされた評価と一致している。
【０４７８】 また、独立した定量方法と比較するために、プロトコール２に従い抽出された
ＤＮＡ（土壌番号５以外の全ての土壌からのもの）を、比色ＤＮＡ検出法（Ｒｉ
ｃｈａｒｄ，１９７４）を用いて定量した。
【０４７９】 この比色技術を用いて定量されたＤＮＡと、ドットブロットハイブリダイゼー
ション／ラジオイメージングにより得られた結果との間で、良好な相関性が見出
された（ｒ＝０．８８）。このことは、該土壌細菌のコピーの平均数（ｒｒｎ）
が７であるという仮定を裏付けるものである。
【０４８０】 該ハイブリダイゼーション（ドットブロット）は、細胞溶解処理（プロトコー
ル１）無しの抽出により測定された細胞外ＤＮＡの量が酸性土壌（番号６）に関
する４μｇ／ｇから土壌番号３に関する３６μｇ／ｇまでの範囲であることを示
した（表３）。
【０４８１】 該土壌の粉砕（プロトコール２）は、すべての土壌から抽出されるＤＮＡの量
を増加させた（例えば、土壌番号６に関する２６μｇ／ｇ土壌、および土壌番号
３に関する５９μｇ／ｇ土壌）（表３；図２）。
【０４８２】 ２つの粉砕処理（材料および方法の節を参照されたい）に関しては、該不連続
ＤＮＡ移動が該アガロースゲル上で検出され、このことは、該ＤＮＡ分子が部分
的に分解されたことを示している（図２）。
【０４８３】 該ＤＮＡ断片のサイズは２０〜０．２ｋｂである。最小断片のバンド強度は非
常に低く、このことは、該断片のほとんどが１ｋｂよりはるかに大きいことを示
している。
【０４８４】 プロトコール３は、該抽出バッファーを該土壌サンプルに加えた後の、Ｕｌｔ
ｒａ−ｔｕｒｒａｘ混合装置中での均質化の工程を含む。この工程は、それらの
土壌の２つ（砂質土壌番号３および酸性土壌番号６）に関するドットブロットハ
イブリダイゼーションにより測定した場合の抽出ＤＮＡの量の増加をもたらし、
一方、有機物質に富む２つの土壌（土壌番号１および番号２）は、より少量のＤ
ＮＡの産生をもたらした。
【０４８５】 プロトコール４ａおよび４ｂは、予備粉砕および予備均質化土壌からのＤＮＡ
の収量に対する２つのタイプの超音波処理の効果を評価することを可能にした。
【０４８６】 該超音波処理は、プロトコール３と比較して、土壌番号６を除き、該ＤＮＡ収
量に対して正の効果を及ぼさなかった。しかし、それらの２つのタイプのソニケ
ーターに関する細胞溶解の有効性は異なる。土壌２、３および４に関しては、チ
タンミクロポイントを使用した場合に、最大量の抽出ＤＮＡが得られ（表３；図
２）、一方、土壌番号１および６に関しては、Ｃｕｐ Ｈｏｒｎ装置を使用した
場合に、該ＤＮＡ収量はより高かった。
【０４８７】 また、該超音波処理工程の後に酵素的／化学的細胞溶解の工程を加えた場合（
プロトコール５ａおよび５ｂ）、矛盾する結果が得られた。ある場合には、抽出
されたＤＮＡ量は、プロトコール４ａおよび４ｂに従い回収されたＤＮＡ量より
多かったが、他の場合には、該収量はより低かった（表３）。
【０４８８】 ２．３ 微生物の直接的計数 アクリジンオレンジでの染色後の細菌細胞の総数の顕微鏡による計数を、粉砕
の前および後に、すべての土壌に関して行った。
【０４８９】 粉砕前では、土壌の乾燥重量１ｇ当たりの細菌の数は、熱帯土壌番号５におけ
る１．４×１０９（±０．４）から、Ｓａｉｎｔ−Ａｎｄｒｅ海岸から得られた
土壌（土壌番号３）における１０×１０９（±０．７）までの範囲であった（表
１）。
【０４９０】 粉砕後では、細胞数は、土壌番号１〜６に関する初期値のそれぞれ４５、７４
、７５、５４、３４および７５％であった。
【０４９１】 ２．４ 種々の属に属する培養可能な放線菌の計数 土壌番号における放線菌類の集団における修飾が、種々の細胞溶解処理後に認
められた（図３）。
【０４９２】 例えば、ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）のコロ
ニーは、細胞溶解処理を適用しなかった場合には（プロトコール１）、生存可能
な放線菌叢を支配し、同定されたコロニーの総数の６５％に相当した。粉砕後、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）コロニーの割合は５１％に低
下し、一方、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属に属するコ
ロニーの割合は１４％増加して４１％となった。
【０４９３】 該化学的／酵素的細胞溶解（プロトコール５ａおよび５ｂ）は、ストレプトマ
イセテス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）の細胞溶解に特に有効であるらしか
った。化学的／酵素的細胞溶解（プロトコール５ａおよび５ｂ）を含む全ての細
胞溶解処理を適用した場合には、１０６ ｃｆｕ／ｇ土壌以上を尚も含む放線菌
微生物叢は、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属に属する種
により支配され、一方、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）コロ
ニーはほとんど又は全く回収されなかった。
【０４９４】 ストレプトスポランギウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）、アクチ
ノマデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）、ミクロビスポラ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓ
ｐｏｒａ）、ダクチロスポランギウム（Ｄａｃｔｉｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）
およびアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）のような属に属する生物
は、粉砕、Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ装置での均質化および超音波処理後、該プ
レート上で少数見出されたが（同定されたコロニーの総数の２〜８％）、これら
の処理を化学的／酵素的細胞溶解と組合せた場合には、概ね存在しなかった。
【０４９５】 また、各細胞溶解処理（プロトコール２〜５）の後に残存した培養可能な細菌
の総数を、土壌番号４に関して調べた。該結果は、培養可能な細菌の数が、該細
胞溶解処理の強度と共には減少しないことを示している（すべての場合において
、そして、プロトコール１に従う場合のように処理を適用しない場合においても
、約２×１０６ ｃｆｕ／ｇ土壌）。
【０４９６】 これらの低いｃｆｕ値が得られたのは、おそらく、乾燥土壌を使用したから、
および最も耐性な細菌だけが該プレート上で増殖したからであろう。コロニーを
形成する放線菌類の数は、一般には、全ｃｆｕ（全細菌）の場合より大きい。な
ぜなら、該放線菌検出プロトコールに含まれる芽胞発芽工程が、該全細菌のコン
トロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）中に欠けていたからである。
【０４９７】 ２．５ 加えたラムダファージＤＮＡの回収 これらの実験の目的は、連続的な細胞溶解処理が裸のＤＮＡの回収に影響を及
ぼしうる様態を、およびこれらの連続的な細胞溶解処理がその分解に寄与したか
否かを評価することにあった。
【０４９８】 該ＤＮＡは、土壌内に何ヶ月も残存しうる既に死んだ生物から遊離した細胞外
ＤＮＡの画分（Ｗａｒｄら，１９９０）、または該処理の第１工程中に即座に細
胞溶解された生物から遊離したＤＮＡであり得た。この状況を模擬するために、
ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたラムダファージＤＮＡを種々の濃度で、粉砕の前お
よび後の土壌に加えた。粉砕に加えて、その他の細胞溶解処理（超音波処理（Ｃ
ｕｐ Ｈｏｒｎ装置、プロトコール４ｂを参照されたい）および熱ショック（材
料および方法の節を参照されたい））の組合せを試験した。
【０４９９】 抽出後、２５〜１５０ｎｇのラムダファージＤＮＡを含有することが理論的に
必要なアリコート画分をゲル電気泳動により分析した。土壌のタイプおよび量と
は無関係に、粉砕前に該ＤＮＡを該土壌サンプル内に接種した場合には、該ラム
ダファージに特異的なＤＮＡ断片を観察することができた。
【０５００】 該ＤＮＡを粉砕後に加え、追加的な細胞溶解処理工程無しで抽出した場合には
、試験した５個中４個の土壌の抽出物において該特異的ラムダファージＤＮＡプ
ロフィールが検出された。
【０５０１】 これらのすべての場合において、加えたＤＮＡの量と該アガロースゲル上のシ
グナルの強度との間に直接的な原因−結果の関係が得られた。しかし、該シグナ
ル強度は、分子量標準の場合との比較で予想されたシグナル強度より低かった
【０５０２】 さらに、いくつかの場合には、２３ｋｂのバンドが存在しなかった。このこと
は、長い断片が土壌粒子上に優先的に吸着されたか又は分解に対して短い断片よ
り感受性であったことを示している。
【０５０３】 非常に高い粘土含量により特徴づけられる熱帯土壌番号５のサンプルにおいて
は（表１）、バンドは全く検出されなかった。
【０５０４】 より厳密な定量のために、ドットブロットハイブリダイゼーション後、りん光
イメージング装置（ホスホイメージャー）上でＤＮＡの回収量を測定した。この
技術により、粉砕前に接種されたものを含む（ただし、ＤＮＡが全く検出されな
かった土壌番号５は除く）すべてのサンプルにおいて該ＤＮＡが検出された。
【０５０５】 その他のすべての土壌においては、抽出されたＤＮＡの量は、該接種物のサイ
ズが増加するにつれて増加する（図４ａ〜ｄ）。
【０５０６】 しかし、ラムダファージＤＮＡの回収量は低かった。粉砕が、適用した唯一の
細胞溶解処理であった場合には、該回収率は、このＤＮＡを粉砕前に加えた場合
には、加えたＤＮＡの０．６〜５．９％、このＤＮＡを粉砕後に加えた場合には
、加えたＤＮＡの３．６〜２４％であった。最高レベルの回収は、土壌番号２か
ら得られた。
【０５０７】 熱ショックおよび超音波処理により処理したサンプルのアリコート画分のゲル
電気泳動では、該ＤＮＡを粉砕後に加えた試験を含むいずれのサンプルにおいて
も、いずれのＤＮＡバンドも観察され得なかった。該ドットブロットハイブリダ
イゼーション実験はこれらの結果を立証した。
【０５０８】 熱ショックおよび超音波処理で処理した土壌懸濁液から得られたハイブリダイ
ゼーションシグナルは、いくらよく見ても低かった。
【０５０９】 最大量のＤＮＡ（１５μｇ ＤＮＡ／ｇ土壌乾燥重量）を示すサンプルは、得
られたシグナルがバックグラウンドレベルと実質的に異なる唯一のものであった
。
【０５１０】 熱ショックで処理したサンプルと、熱ショックおよび超音波処理で処理したサ
ンプルとの間では、相違は全く観察されなかった（または小さな相違が観察され
たに過ぎなかった）。このことは、熱ショックが該ＤＮＡに有害な影響を及ぼす
ことを示している。最良の回収は、最高有機物質含量を有する土壌番号２（表１
）で観察され、一方、粘土質土壌番号５からはＤＮＡは回収されなかった。
【０５１１】 土壌１ｇ当たり２０および５０μｇのラムダファージＤＮＡを接種した土壌番
号４および番号５の未粉砕サンプルで、追加的な実験を行った。
【０５１２】 該サンプルを、２８℃で１時間のインキュベーションの後または直ちに抽出し
、ついで該ＤＮＡ抽出物を精製し、分析した（ゲル電気泳動により行った）。
【０５１３】 該接種後１時間の土壌番号４のインキュベーションは、インキュベーション無
しで得られたものとは又は粉砕後に該ＤＮＡを加えた場合に既に観察されている
ものとは定性的または定量的に異なるプロフィールを与えなかった。
【０５１４】 これらの結果は、土壌ヌクレアーゼによる酵素的分解が低レベルのＤＮＡ回収
には関与していないと考えられることを示している。さらに、粉砕工程の不存在
は、土壌番号５からのＤＮＡの回収の増加を可能にせず、このことは、該粉砕に
よる該土壌の構造に対する変化が該コロイド上への該核酸の吸着を有意に増加さ
せないことを示している。
【０５１５】 ２．６ ＲＮＡによる吸着部位の飽和 該アガロースゲル上で得られたプロフィールのほとんどは、ＲＮＡ処理が行わ
れなかったこれまでのプロフィールとは有意に異ならない。
【０５１６】 例えば、使用したラムダファージＤＮＡ濃度およびＲＮＡ濃度には無関係に、
粘土に富む土壌番号５からは、バンドは全く検出されなかった。
【０５１７】 さらに、ＲＮＡで処理された砂質配合土（土壌番号４）においては、粉砕前に
該ＲＮＡを加えた場合には、ＨｉｎｄＩＩで消化されたラムダファージＤＮＡの
特異的バンドは検出不可能なままであった。
【０５１８】 粉砕後にＤＮＡを接種したサンプルから得られたバンドの強度は、該ＲＮＡ濃
度が増加するにつれて増加するが、このことは、該処理が正の効果を及ぼしうる
ことを示している。
【０５１９】 しかし、ハイブリダイゼーションおよびりん光イメージングによる分析の後の
結果は、その電気泳動の結果を立証しなかった。例えば、該粘土質配合土からの
ＤＮＡの回収に対する該ＲＮＡ処理の正の効果は、粉砕後にＤＮＡを加えた場合
には、明らかには現れなかった。
【０５２０】 一方、粘土に富む土壌（番号５）では、粉砕後に該ＤＮＡを加えた場合に、該
ＲＮＡの正の効果が見出された。
【０５２１】 該対照サンプルに関するハイブリダイゼーションシグナルはバックグラウンド
ノイズレベルと異ならないが、ＲＮＡで処理されたサンプルから、有意な量のＤ
ＮＡが遊離され、加えたＤＮＡの量が増加するにつれて及び該ＲＮＡ濃度が増加
するにつれて、該シグナルは増加した。
【０５２２】 しかし、最高ＲＮＡ濃度（１００ｍｇ／ｇ土壌乾燥重量）の場合でさえも、該
回収レベルは３％を決して超えなかった。
【０５２３】 ２．７ 粗ＤＮＡ抽出物の精製 試験した４つのプロトコールのうち、該未希釈ＤＮＡ抽出物（５０μｌのＰＣ
Ｒ混合物中、１μｌの抽出物）の最良の増幅は、該ＰＣＲ産物のゲル電気泳動に
より示されるとおり、Ｍｃｒｏｓｐｉｎ Ｓ４００カラムを介した溶出およびそ
れに続くＥｌｕｔｉｐ ｄ カラムを介した溶出の後に観察された。
【０５２４】 該２相水性系（プロトコールＣ）により精製されたＤＮＡは、未希釈ＤＮＡ抽
出物から出発する増幅後に、より少量のＰＣＲ産物を与えた。
【０５２５】 プロトコールＡまたはＢの使用後の増幅後の未希釈抽出物からは、増幅産物は
全く得ることができなかった。したがって、該ＰＣＲ増幅および／または該ドッ
トブロットハイブリダイゼーションを行うすべての実験には、プロトコールＢ（
材料および方法の節を参照されたい）を用いた。
【０５２６】 ２．８ ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションによる定量 第１工程は、反応チューブ内に最初に存在した標的ＤＮＡ分子の数にＰＣＲ産
物の量が比例するか否かを判定することであった。ストレプトスポランギウム・
フラジル（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｆｒａｇｉｌｅ）からのＤＮ
Ａを標的として使用した（材料および方法の節を参照されたい）。
【０５２７】 使用したプライマーは、プライマーＦＧＰＳ１２２およびＦＧＰＳ３５０（表
２）であった。該ＰＣＲ産物のゲル電気泳動は、該バンド強度が、該標的の濃度
が増加するにつれて増加することを示した。該ＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチド
プローブＦＧＰＳ６４３（表２）にハイブリダイズさせ、該シグナルを、りん光
イメージング（ホスホイメージング）により定量した。
【０５２８】 ｌｏｇ［標的の数］とｌｏｇ［ハイブリダイゼーションシグナルの強度］との
間に良好な相関性（ｒ２＝０．９８）が見出された。
【０５２９】 ついで、該ＰＣＲ増幅の有効性がフミン酸および非標的ＤＮＡにより損なわれ
るか否かを調べるために、研究を行った。ゲル電気泳動により分析した場合には
、種々の量の標的ＤＮＡに対応する、該ＰＣＲ産物の増加したバンド強度は、該
ＰＣＲ混合物５０μｌ中に８ｎｇまでの範囲の濃度でフミン酸を含有しＤＮアー
ゼ処理土壌抽出物が加えられたＤＮＡ溶液で該増幅を行った場合に維持された。
【０５３０】 該ＰＣＲ混合物中の２０ｎｇのフミン酸では、低レベルの標的ＤＮＡに対応す
するバンドは消失し、８０ｎｇのフミン酸濃度およびより高い濃度では、バンド
は全く可視化されなかった。
【０５３１】 増幅前にストレプトスポランギウム・フラジル（Ｓ．ｆｒａｇｉｌｅ）ＤＮＡ
をストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＤＮＡと混合し、１００ｐｇ〜１μｇの範囲でＰＣＲ
混合物５０μｌに加えて、該土壌微生物叢から遊離される非標的ＤＮＡを模擬し
た場合、ストレプトスポランギウム・フラジル（Ｓ．ｆｒａｇｉｌｅ）からの種
々の量の標的ＤＮＡは、予想される量のＰＣＲ産物を供給することを可能にした
。
【０５３２】 ２．９ 種々の細胞溶解処理後の常在土壌放線菌の定量 精製プロトコールＤを適用し、ついで前記のとおりのＰＣＲ増幅を行って、プ
ロトコール１、２、３、５ａおよび５ｂに従う抽出後の土壌番号３中のストレプ
トスポランギウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属に属する放線菌を
定量した（図５）。
【０５３３】 粉砕後（プロトコール２）、ハイブリダイゼーション（ドットブロット）およ
びラジオイメージングにより、この放線菌に由来する標的ＤＮＡの量を２．５±
１．３ｎｇ／ｇ乾燥土壌重量と推定した。
【０５３４】 ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に関して該ＤＮＡ含量が１
０ｆｇ／細胞であると仮定すると（Ｇｌａｄｅｋら，１９８４）、この値は約２
．５×１０５ゲノムに相当する。その他の細胞溶解処理の後に、同様の値が得ら
れた（それぞれプロトコール３および４ｂを用いた場合に、それぞれ２．６±１
．１および１．８±１．３ｎｇ ＤＮＡ／ｇ乾燥土壌）。
【０５３５】 ２．１０ 細菌が予備接種された土壌からのＤＮＡの回収の有効性 ３つの土壌（番号２、３および５）に、種々の濃度のストレプトマイセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の芽胞または菌糸を
接種した（材料および方法の節を参照されたい）。該土壌に加えた菌糸体の量（
図６ｂ）は、該発芽培地に接種した芽胞の数に対応する。これらの芽胞の約５０
％が発芽した。該発芽芽胞の菌糸における細胞の厳密な数は測定しなかった。し
たがって、該土壌に接種した芽胞および菌糸体の量は直接的には比較することが
できない。
【０５３６】 各土壌サンプルに関して、抽出プロトコール６、精製方法ＤおよびＰＣＲ増幅
とドットブロットハイブリダイゼーションおよびりん光イメージング（ホスホイ
メージング）との組合せを用いて、遊離された特異的標的ＤＮＡを計数した。加
えた芽胞の数が土壌番号３および番号５に関しては１０５を及び土壌番号２に関
しては１０７を超える場合には、抽出されたＤＮＡはバックグラウンドノイズか
ら明らかに区別されうる（図６ａ）。
【０５３７】 該菌糸体を加えた場合には、抽出されたＤＮＡは、土壌番号２および番号３に
関しては１０３ 芽胞／ｇ土壌に対応する量以上で、ならびに土壌番号５に関し
ては１０７ 芽胞／ｇ土壌に対応する量以上で検出されうる（図ｂ）。
【０５３８】 該検出レベルを超えると、該ハイブリダイゼーションシグナルは、接種細胞の
量が増加するにつれて増加する。
【０５３９】 該芽胞接種物に関しては、接種された細胞の数における１００倍の増加は、Ｄ
ＮＡ収量における１００倍近い増加につながる。この増加は、該菌糸体を特に土
壌番号２および番号３に接種した場合より明らかに低い（図６）。
【０５４０】 これに対して、ラムダファージＤＮＡを接種物として使用した場合に得られた
結果においては、該細菌細胞を接種物として使用した場合には、該ＤＮＡはまた
、その粘土に富む土壌（番号５）から回収された。しかし、後者の接種物に関し
てはまた、ＲＮＡでの処理は、芽胞および菌糸体の両方に関するこの土壌からの
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＤＮＡの回収を増加させた（
図６）。
【０５４１】 該土壌への栄養炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）細胞の接種
は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に関して得られたものと
同様の回収レベルを与えた。
【０５４２】 さらに、土壌番号５からのＤＮＡ回収のレベルはまた、この接種物に関するＲ
ＮＡでの処理の後に増加した。
【０５４３】 実施例２：リンデンで汚染された土壌を使用する低分子量ＤＮＡ（＜１０ｋｂ ）のライブラリーの構築、ならびにｌｉｎＡ遺伝子のクローニングおよび発現
本実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡライブラリーの構築を記載する
。それは、培養不可能な微生物叢から得られた小さな遺伝子のクローニングおよ
び発現を示す。
【０５４４】 リンデンは、分解に抵抗性であり環境中に残留する有機塩素系農薬である。好
気性条件下では、ｌｉｎＡ遺伝子によりコードされるデヒドロクロリナーゼによ
り生分解が触媒され、リンデンは１，２，４−トリクロロベンゼンに変換される
。ｌｉｎＡ遺伝子は、土壌から分離された２つの株、すなわち、日本で分離され
たスフィンゴモナス・パウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｏｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃ
ｉｍｏｂｉｌｉｓ）（ＳｅｅｎｏおよびＷａｄａ １９８９；Ｉｍａｉら，１９
９１；Ｎａｇａｔａら，１９９３）およびフランスで分離されたロダノバクター
・リンダニクラスチクス（Ｒｈｏｄａｎｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｎｄａｎｉｃｌａ
ｓｔｉｃｕｓ）（Ｔｈｏｍａｓら，１９９６，Ｎａｌｉｎら，１９９９）から同
定されているに過ぎない。
【０５４５】 しかし、遊離した塩化物イオンのアッセイおよびリンデンと接触した土壌から
のｌｉｎＡ遺伝子のＰＣＲ増幅などにより示されたリンデンの分解潜在性は、環
境中で、より広範囲に及ぶらしい（Ｂｉｅｓｉｅｋｉｅｒｓｋａ−Ｇａｌｇｕｅ
ｎ，１９９７）。
【０５４６】 １．土壌ＤＮＡの直接的抽出 乾燥土壌を、６個のタングステンビーズを備えたＲｅｓｔｃｈ遠心力グライン
ダー中で１０分間粉砕する。１０グラムの粉砕土壌を５０ｍｌのｐＨ９のＴＥＮ
Ｐバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ，１％ ｗ／ｖ ポリビニルポリピロリドン）に懸濁させ、１０分間のボルテ
ックスによりホモジナイズする。
【０５４７】 ４０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離の後、該上清を酢酸ナトリウム（３Ｍ
，ｐＨ５．２）で及びイソプロパノールで沈殿させ、ついで無菌ＴＥバッファー
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中に取る。ついで、抽
出されたＤＮＡをＳ４００モレキュラーシーブカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上
およびＥｌｕｔｉｐ ｄ イオン交換カラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ）上で、該製造業者の説明に従い精製し、ついでＴＥ中で保存す
る。
【０５４８】 ２．ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−における、該土壌から抽出され たＤＮＡのライブラリーの構築 ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−および該土壌から抽出されたＤＮＡ
のそれぞれを、ＤＮＡ １μｇ当たり１０単位の割合の酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化する（３７℃で２時間のインキュベーション
）。ついで該ＤＮＡを、ＤＮＡ ３００ｎｇ当たり１酵素単位の割合のＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の作用により、１５℃で一晩にわたり連結する（約
２００ｎｇのＤＮＡインサートおよび１００ｎｇの消化されたベクター）。エレ
クトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞ＥｌｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂ（商標）（Ｇｉ
ｂｃｏ ＢＲＬ）を該連結混合物（２μｌ）でエレクトロポレーション（２５μ
Ｆ，２００および５００Ω，２．５ｋＶ）（Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓ
ｅｒ）により形質転換する。
【０５４９】 ＬＢ培地内で１時間のインキュベーションの後、約１００コロニー／ディッシ
ュが得られるように該形質転換細胞を希釈し、ついで、アンピシリン（１００ｍ
ｇ／ｌ）、γ−ＨＣＨ（５００ｍｇ／ｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトシド，６０ｍｇ／ｌ）およびＩＰＴＧ（
イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド，４０ｍｇ／ｌ）で補足されたＬＢ培
地（１０ｇ／ｌ トリプトン，５ｇ／ｌ 酵母エキス，５ｇ／ｌ ＮａＣｌ）上
でプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートする。γ−ヘキサクロロシク
ロヘキサン（Ｍｅｒｃｋ−Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ）は水に不溶性であるため、Ｄ
ＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（Ｓｉｇｍａ）中で５０ｇ／ｌの溶液を調製す
る。
【０５５０】 このようにして、１０，０００個のクローンのライブラリーを得た。
【０５５１】 ３．ｌｉｎＡ遺伝子のクローニングおよび発現 該ライブラリーのスクリーニングを、該コロニーの周囲のリンデン分解ハロの
可視化により行った（該培地内に沈殿するリンデン）。スクリーニングした１０
，０００個のクローンのうち、３５個が、このように、リンデン分解活性を示し
た。これらのクローン内のｌｉｎＡ遺伝子の存在は、Ｔｈｏｍａｓら（１９９６
）に記載の特異的プライマーを使用するＰＣＲにより確認した。該インサート上
および該増幅産物上で行った消化は、スクリーニングした全てのクローンおよび
参照対照ロダノバクター・リンダニクラスチクス（Ｒ．ｌｉｎｄａｎｉｃｌａｓ
ｔｉｃｕｓ）の間で同一のプロフィールを示した。ｌｉｎＡ遺伝子を保持するク
ローンはまた、同じサイズ（約４ｋｂ）のインサートを有していた。
【０５５２】 このように、該土壌ＤＮＡは、異種宿主である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におい
てクローニングされ発現されうること、および培養が困難な微生物叢に由来する
遺伝子が発現されうることが示された。したがって、Ｓａｕ３ＡＩのような制限
酵素での、土壌から抽出されたＤＮＡの部分消化により調製されたライブラリー
も予想されうる。
【０５５３】 実施例３ 直接的ＤＮＡ抽出の工程を含む、土壌サンプルからの核酸の集団の製造方法 １．材料および方法 １．１ 土壌の細菌画分の抽出 ５ｇの土壌を、Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒ中の３×１分間の粉砕（各粉砕
の合間に氷中で冷却しながら行う）により、５０ｍｌの無菌０．８％ ＮａＣｌ
に分散させる。ついで該細菌細胞を、Ｎｙｃｏｄｅｎｚの密度クッション（Ｎｕ
ｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上の遠心分離によ
り該土壌粒子から分離する。遠心分離チューブ中、１．３ｇ．ｍｌ−１の密度を
有する１１．６ｍｌのＮｙｃｏｄｅｎｚ溶液（１０ｍｌの無菌水に懸濁させた８
ｇのＮｙｃｏｄｅｎｚ）を、既に得られた２５ｍｌの土壌懸濁液の下に配置する
。振動（ｓｗｉｎｇ−ｏｕｔ）バケットを備えたローター（ＴＳＴ ２８．３８
ローター，Ｋｏｎｔｒｏｎ）中の１０，０００×ｇ、４℃で４０分間の遠心分離
の後、該水相と該Ｎｙｃｏｄｅｎｚ相との間の相間部に位置する細胞環状体を取
り、２５ｍｌの無菌水で洗浄し、１０，０００×ｇで２０分間にわたり遠心分離
する。ついで該細胞ペレットを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ；１００ｍＭｎ ＥＤＴＡ（
ｐＨ８．０）溶液中に取る。
【０５５４】 Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒ中での該土壌の分散の前に、特に該土壌細菌芽
胞の発芽を可能にするために酵母エキスの溶液中での該土壌の富化の工程を含め
ることができる。例えば、５ｇの土壌を、０．８％ ＮａＣＬ−６％酵母エキス
の無菌溶液５０ｍｌ中、４０℃で３０分間インキュベートする。該粉砕中の泡の
形成を避けるために、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により該酵母エキス
を除去する。
【０５５５】 １．２ 土壌細菌細胞の細胞溶解 ・液体培地内での該細胞の細胞溶解および塩化セシウム勾配上での精製 該細胞を、５ｍｇ．ｍｌ−１のリゾチームと０．５ｍｇ．ｍｌ−１のアクロモ
ペプチダーゼとを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８
．０）溶液中、３７℃で１時間にわたり細胞溶解する。ついでラウリルサルコシ
ル（最終１％）およびプロテイナーゼＫ（２ｍｇ．ｍｌ−１）を加え、３７℃で
３０分間インキュベートする。ついで該ＤＮＡ溶液を、Ｋｏｎｔｒｏｎ ６５．
１３ローター上での３５，０００ｒｐｍで３６時間の遠心分離により塩化セシウ
ムの密度勾配上で精製する。用いる塩化セシウム勾配は、１．３８６０の屈折率
を有する１ｇ／ｍｌのＣｓＣｌでの勾配である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９
）。
【０５５６】 ・アガロースブロック内に加えた後の該細胞の細胞溶解 該細胞を、低融点の１．５％（重量／容積）Ｓｅａｐｌａｑｕｅ（Ａｇａｒｏ
ｓｅ Ｓｅａｐｌａｑｕｅ ＦＭＣ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＴＥＢＵ，Ｌｅ Ｐｅ
ｒｒａｙ ｅｎ Ｙｖｅｌｉｎｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を含有する等容積のアガロ
ースと混合し、１００μｌ ブロック内に注ぐ。ついで該ブロックを、細胞溶解
溶液：２５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０．３％ スクロース、５ｍｇ．ｍｌ−１ リ
ゾチームおよび０．５ｍｇ．ｍｌ−１ アクロモペプチダーゼ中、３７℃で３時
間インキュベートする。ついで該ブロックを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−５００ｍＭ
ＥＤＴＡ溶液中で洗浄し、１ｍｇ．ｍｌ−１のプロテイナーゼＫと１％ ラウリ
ルサルコシルとを含有する５００ｍＭ ＥＤＴＡ中、３７℃で一晩インキュベー
トする。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中での数回の洗浄の後、該ブロックを５００ｍＭ
ＥＤＴＡ中で保存する。
【０５５７】 このようにして抽出されたＤＮＡの量をパルスフィールド電気泳動により確認
する。
【０５５８】 抽出されたＤＮＡの量を、仔ウシ胸腺ＤＮＡの検量範囲に対して電気泳動ゲル
上で評価した。
【０５５９】 １．３ 土壌から抽出されたＤＮＡの分子特徴づけ 該土壌から抽出されたＤＮＡを、ＰＣＲハイブリダイゼーションにより特徴づ
ける。該方法は、第１段階において、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の普遍的に保存さ
れた領域上に位置するプライマーを使用して該ＤＮＡを増幅し、ついで該増幅Ｄ
ＮＡを既知の特異性の種々のオリゴヌクレオチドプローブ（表４）にハイブリダ
イズさせて、ゲノムＤＮＡの外部検量範囲に対して該ハイブリダイゼーションシ
グナルの強度を定量することを含む。
【０５６０】 該土壌から抽出されたＤＮＡおよび純粋培養から抽出されたゲノムＤＮＡを、
標準的なＰＣＲ増幅条件下、プライマーＦＧＰＳ ６１２−６６９（表１）で増
幅する。ついで該増幅産物を等容積の１Ｎ ＮａＯＨで変性させ、Ｎｙｌｏｎ膜
（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ）上で析出させ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの作用によりｇ３２Ｐで末
端において標識されたオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズさせる。６
ｍｌのＳＳＣ ２０×、１ｍｌのデンハルト液、１ｍｌの１０％ ＳＤＳおよび
５ｍｇの異種サケ***ＤＮＡを含有する２０ｍｌの溶液中の該膜のプレハイブリ
ダイゼーションの後、該ハイブリダイゼーションを、該プローブにより定められ
る温度で一晩行う。該膜をＳＳＣ ２×中、室温で５分間にわたり２回、ついで
ＳＳＣ ２× ０．１％ ＳＤＳ中で１回洗浄し、そしてもう一度、ＳＳＣ １
×、０．１％ ＳＤＳ中、該ハイブリダイゼーション温度で３０分間にわたり洗
浄する。該ハイブリダイゼーションシグナルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌ
ｙｓｔソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ，Ｉｖｒｙ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎ
ｃｅ）を使用して定量し、ＤＮＡの量を、該ゲノムＤＮＡから得た検量線の補間
法により評価する。
【０５６１】 ２．結果および考察 ２．１ 土壌の細菌画分の抽出および細胞溶解 ＤＮＡの抽出の前の、土壌粒子からの微生物細胞の分離は、該土壌中のＤＮＡ
の直接的抽出の方法より優れた多数の利点を有する代替手段である。特に、微生
物画分の抽出は、土壌中に遊離して存在する外部ＤＮＡで又は真核生物由来のＤ
ＮＡでＤＮＡ抽出物が汚染されるのを抑制する。とりわけ、該土壌の微生物画分
から抽出されたＤＮＡは、直接的細胞溶解により抽出されたＤＮＡより長いサイ
ズの断片およびより良好な完全性を有する（ＪａｃｏｂｓｏｎおよびＲａｓｍｕ
ｓｓｅｎ（１９９２））。さらに、該土壌粒子の分離は、腐植質およびフェノー
ル性化合物が該ＤＮＡ抽出物を汚染し次いでこれらの化合物がクローニング効率
を著しく損ないうるのを避けることを可能にする。
【０５６２】 該土壌からの細胞の抽出の決定因子である工程の１つは、土壌粒子の凝集体の
表面または内部に付着する細胞を解離させるための該土壌サンプルの分散である
。それぞれ１分間の３つの連続的な粉砕サイクルは、１分３０秒の単一の粉砕サ
イクルより良好な細胞抽出効率およびより多量の回収ＤＮＡを得ることを可能に
する。
【０５６３】 表５は、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配上の遠心分離後、生存可能な全微生物叢（アク
リジンオレンジでの染色後の顕微鏡検査による計数）、培養可能な全微生物叢（
固体１０％ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ−Ｓｏｊａ培地上での計数）、およびＨＶ寒
天培地上での培養可能な放線菌微生物叢（該芽胞の発芽を引き起こさせるための
、６％ 酵母エキス−０．０５％ ＳＤＳの溶液中、４０℃でのインキュベーシ
ョン後）上での抽出効率を示す。さらに、該抽出ＤＮＡを、液体培地内での該細
胞の細胞溶解（塩化セシウム勾配上での精製は伴わない）後、または（該アガロ
ースをβ−アガラーゼで消化した後の）アガロースブロック内に含まれる該細胞
の細胞溶解後に定量した。
【０５６４】 該結果は、全地上微生物叢の１４％以上がこの方法により回収されること（す
なわち、土壌１ｇ当たり２×１０８細胞）、および培養可能な全微生物叢が全微
生物集団の２％に相当するに過ぎないを示している。
【０５６５】 さらに、該細胞から抽出されたＤＮＡの量は、乾燥土壌１ｇ当たり３３０ｎｇ
である。土壌微生物細胞１個当たりのＤＮＡ含量を１．６〜２．４ｆｇと推定し
、抽出された細胞の量（土壌１ｇ当たり２×１０８細胞）を考慮すると、該細胞
の実質的にすべてが細胞溶解されること、およびこの細胞溶解がこのアプローチ
に大きな偏向をもたらさないことが推定されうる。
【０５６６】 該パルスフィールド電気泳動は、ＮｙｃｏｄｅｎｚおよびＣｓＣｌ勾配後に抽
出された土壌からのＤＮＡが１５０ｋｂのサイズまででありうること、および該
アガロースゲルブロック細胞溶解が、６００ｋｂを超える断片の抽出を可能にし
たことを示している。
【０５６７】 これらの結果は、直接ＤＮＡ抽出の方法の代替手段としての、環境ＤＮＡライ
ブラリーの構築のための培養から独立したこのアプローチの利点を証明している
。
【０５６８】 ２．２ 土壌から抽出されたＤＮＡの分子特徴づけ 土壌から抽出されたＤＮＡの分子特徴づけの目的は、該ＤＮＡ抽出物中に存在
する種々の細菌分類群の比率を表すプロフィールを得ることにある。また、それ
は、該土壌中に存在する微生物多様性の直接的可視化を伴わない直接的抽出方法
と比較して、該土壌の細胞反応の予備分離により誘発される抽出の偏向を見出す
ことを含む。特に、それらの形態学的構造（細胞直径、繊維状または芽胞形成形
態）と相関した、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配上での細胞の抽出に関する情報はほとん
ど集められていない。
【０５６９】 これまでの適当な方法は、以下のものに基づく。 ・環境から抽出されたＤＮＡに直接適用される、種々の細菌群に特異的なオリ
ゴヌクレオチドプローブを使用する定量的ハイブリダイゼーション。残念ながら
、このアプローチは、それほど高感度ではなく、少量で存在する分類群または属
の検出を可能にしない（Ａｍａｎｎ（１９９５））。 ・ＭＰＮ−ＰＣＲ（Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ）（Ｓｙｋｅ
ｓら（１９９２））または競合的定量的ＰＣＲ（Ｄｉｖｉａｃｃｏら（１９９３
））のような定量的ＰＣＲ。これらの各アプローチのそれぞれの欠点は、（ｉ）
多数の希釈および反復による労力を要するため、該技術は多数のサンプルまたは
プライマーペアには適さないこと、および（ｉｉ）標的ＤＮＡに特異的である及
び該競合において偏向を誘発しない競合体の構築を要することである。
【０５７０】 本発明により導入された方法は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の内部の７００ｂｐの
断片を普遍的に増幅すること、種々の特異性（界、目、亜綱または属に関するも
の）のオリゴヌクレオチドプローブでこの増幅産物をハイブリダイズさせること
、および該サンプルのハイブリダイゼーション強度を外部検量範囲と比較するこ
とを含む。ハイブリダイゼーション前の増幅は、相対的に少ない微生物の属また
は種を定量することを可能にする。さらに、普遍的（ユニバーサル）プライマー
での増幅は、該ハイブリダイゼーション中、一連の広範なオリゴヌクレオチドプ
ローブを使用することを可能にする。それは、十分に定義づけされた分類群に関
する種々の様態の細胞溶解（直接的または間接的抽出）の比較を可能にする。
【０５７１】 該結果は表６において比較される。
【０５７２】 それらは、それらの２つの抽出方法（直接的および間接的）の間で同様のプロ
フィールを示す。したがって、地上微生物叢画分の予備抽出は、試験した分類群
の間の真正の偏向を導入しないらしい。それらの２つの抽出アプローチの間の唯
一の有意な相違は、間接的抽出方法による抽出物における、γ−プロテオバクテ
リアに属するｒＤＮＡ配列の、より大きな存在量にあるであろう。
【０５７３】 さらに、酵母エキスの溶液中の該土壌サンプルのインキュベーションの有意な
効果が、芽胞形成土壌集団上で観察される（グラム＋、低い割合のＧＣおよび放
線菌類）。この工程は、該芽胞の発芽を引き起こし、第１に、このタイプの細胞
の、より良好な回収を決定的に可能にし、第２に、発芽細胞における、より大き
な細胞溶解有効性を可能にする。
【０５７４】 このアプローチは、通常は土壌中に見出される培養される微生物を使用して定
められる主要分類群に標的化される半定量分析を可能にする。分子的手段だけが
、種々の分類群の大きさを評価することを可能にする。なぜなら、培養方法は余
りにも限定的なものであり、使用する培地の特異性に左右されるからである。
【０５７５】 該結果は、大きな割合の該微生物集団が、記載されている系統発生群に表され
ていないことを示しており、したがって、このことは、これまでに培養されてい
ない又は培養可能ではない微生物から構成される新規群の存在を示している。
【０５７６】 したがって、ＤＮＡ抽出物の組成のより厳密な具体像を得るために、土壌から
抽出されたＤＮＡから出発する与えられた配列を使用して、新規プローブを定め
ることができる（未培養微生物から構成される新規系統，Ｌｕｄｗｉｇら（１９
９７））。
【０５７７】 実施例４：コスミドＰＯＳ７００Ｉの構築 ＰＯＳ７００Ｉの特徴 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で複製される。 ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）内で組込まれる。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｍｐＲ、ＨｙｇｒｏＲおよびストレプトマイセス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＨｙｇｒｏＲにおいて選択されうる。
【０５７８】 該コスミドの特性は、３０〜４０ｋｂの大きなＤＮＡ断片の挿入を可能にする
。それは、以下のものを含む。 １．ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）の誘導プロモーターｔｉｐＡ。 ２．要素ｐＳＡＭ２に特異的な組込み系。 ３．ハイグロマイシン耐性遺伝子。 ４．ｐＷＥＤ１５に由来するコスミドｐＷＥＤ１。
【０５７９】 １）ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）のｔｉｐＡ遺 伝子の誘導プロモーター ｔｉｐＡ遺伝子は、抗生物質チオストレプトンまたはノシヘプチドにより転写
が誘導される１９ＫＤのタンパク質をコードしている。ｔｉｐＡは良く調節され
る：指数期および定常期における誘導（２００×）（Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｔ，Ｈ
ｏｌｔ ＴＧ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＪ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９８９
；１７１：１４５９−６６）。
【０５８０】 ２）ハイグロマイシン耐性遺伝子 ・ハイグロマイシン：ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓ．ｈｙｇ
ｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）により産生される抗生物質。 ・該耐性遺伝子はホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）をコードしている。 ・使用する遺伝子は、ｈｙｇ遺伝子がそれ自体のプロモーターおよびＩＰＴＧ
誘導ｐｌａｃプロモーターの制御下にあるＢｌｏｎｄｅｌｅｔらにより構築され
たカセット（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔら；Ｇｅｎｅ １９９７；１
９０：３１５−７）に由来する。
【０５８１】 ３）部位特異的組込み系 要素ｐＳＡＭ２は、部位特異的組込み機構により染色体内に組込まれる。組込
みは、プラスミド（ａｔｔＰ）上および染色体（ａｔｔＢ）上に存在する２つの
同一の５８ｂｐの配列の間で生じる。
【０５８２】 ａｔｔＰ部位の近くに位置するｉｎｔ遺伝子は、ｐＳＡＭ２の部位特異的組込
みに関与し、その産物は、腸内細菌のテンペレートバクテリオファージのインテ
グラーゼとの類似性を有する。ａｔｔＰ付着部位とｉｎｔ遺伝子とだけを含有す
るｐＳＡＭ２断片は、全要素と同じ様態で組込まれうることが示されている（１
８／０５／１９８８のフランス国特許第８８ ０６６３８およびＲａｙｎａｌ
Ａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８ ２８：３３３−４２）。
【０５８３】 ４）コスミドｐＯＳ７００Ｉの構築 工程１ プロモーターＴｉｐＡを、７００塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片上
のプラスミドｐＰＭ９２７（Ｓｍｏｋｖｉｎａら，Ｇｅｎｅ １９９０；９４：
５３−９）から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化されたベクターｐＵ
Ｃ１８（Ｙａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，１９８５）内にクローニングした。
【０５８４】 工程２ ついで、このＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１８からｐＵＣ１９（
Ｙａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，１９８５）に移した。
【０５８５】 工程３ ｐＳＡＭ２のａｔｔＰ部位とｉｎｔ遺伝子とを保持する１５００塩基対のＢａ
ｍＨＩ−ＢａｍＨＩインサートを、図８に表されているｐＯＳｉｎｔ１（Ｒａｙ
ｎａｌ Ａら Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９８ ２８：３３３−４２）
から単離し、ｉｎｔ遺伝子がプロモーターＴｉｐＡの制御下に配置されるのを可
能にする配向で前ベクター（ｐＵＣ１９／ＴｉｐＡ）のＢａｍＨＩ部位内にクロ
ーニングした。
【０５８６】 工程４ ｉｎｔ遺伝子の５’側に位置するＢａｍＨＩ部位を、ＢａｍＨＩでの部分消化
およびそれに続くクレノウ酵素での処理により欠失させた。このようにして、Ｔ
ｉｐＡ−ｉｎｔ−ａｔｔＰを保持するＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ
９から単離し、ｐＢＲ３２２ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ内に導入した。
【０５８７】 工程５ ｐＨＰ４５Ωｈｙｇ（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔら，１９９７）か
らＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片で単離されたハイグロマイシンカセット
を、プロモーターＴｉｐＡの上流に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位内にクローニン
グした。
【０５８８】 工程６ ΩＨｙｇカセットとプロモーターＴｉｐＡとの間に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部
位を、部分ＨｉｎｄＩＩＩ消化の後のクレノウ処理により欠失させた。
【０５８９】 工程７ 前工程の後で得られたプラスミドは、クレノウ処理後にコスミドｐＷＥＤ１の
ＥｃｏＲＶ部位内にクローニングされたすべてのΩＨｙｇ／ＴｉｐＡ／ｉｎｔ
ａｔｔＰ要素を保持する単一のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離すること
を可能にする。図９に示すコスミドｐＷＥＤ１は、図１０に示すコスミドｐＷＥ
１５（Ｗａｈｌ ＧＭら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １
９８７ ８４：２１６０−４）から、ネオマイシン遺伝子とＳＶ４０起点とを保
持するＨｐａＩ−ＨｐａＩ断片の欠失により誘導される。
【０５９０】 ベクターｐＯＳ７００１の地図を図１１に示す。
【０５９１】 実施例５：ストレプトマイセスにおいて接合型および組込み型であるコスミド 、ベクターｐＯＳＶ３０３、ｐＯＳＶ３０６およびｐＯＳＶ３０７の構築 ５．１ ベクターｐＯＳＶ３０３の構築 パッケージングが、３０ｋｂより大きなクローンを選択すると仮定すると、イ
ンサートを全く含有しないのは該クローンの僅か１０〜１５％であり、したがっ
て、組換え体を選択するための系を有することは実際には必要ではなく、したが
って、より小さなベクターの構築が可能となる。
【０５９２】 構築 工程１：ベクターｐＯＳＶ００１ ＰｓｔＩで開裂されたプラスミドｐＵＣ１９内への、レプリコンＲＫ２（Ｇｕ
ｉｎｅｙら，１９８３）の導入起点ＯｒｉＴを保持する８００塩基対のＰｓｔＩ
−ＰｓｔＩ断片のクローニング。このクローニング工程は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）からストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）へ接合により移入可
能なベクターを得ることを可能にする。
【０５９３】 ベクターｐＯＳＶ００１の地図を図１７に示す。
【０５９４】 工程２：ベクターｐＯＳＶ００２ ハイグロマイシン耐性遺伝子が最後に導入されるよう、ストレプトマイセス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において選択されうるハイグロマイシンマーカー（
Ωｈｙｇカセット）を挿入して、該土壌ＤＮＡインサートを有するＢＡＣの完全
な導入が保証されうるようにする。
【０５９５】 ハイグロマイシン耐性遺伝子を保持するＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
としての、ｐＨＰ４５Ωｈｙｇから単離されたハイグロマイシンカセットのクロ
ーニング。この断片は、ベクターｐＯＳＶ００１のＰｓｔＩ部位（２０１位）内
にクローニングされる。Ｈｙｇｒｏマーカーが該接合中に最後に導入されるよう
、該導入の方向を考慮して、このＰｓｔＩ部位が選択された。ＰｓｔＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ末端は、「平滑末端」が生成しうるようＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノウフラグメントで処理した後に適合性となる。該Ωｈｙｇ断片の配向は、構築
の終了時に決定される。
【０５９６】 ベクターｐＯＳＶ００２の地図を図１８に示す。
【０５９７】 工程３：ベクターｐＯＳＶ０１０ プラスミドｐＯＳＶ００２から単離されハイグロマイシン耐性マーカーおよび
導入起点を含有するＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化されたプラスミドｐＯＳｉｎｔ１内にクローニングする。該部位の
配向は、該ハイグロマイシンマーカーが常に最後に導入されるような配向である
。
【０５９８】 図８に示されるプラスミドｐＯＳｉｎｔ１は、Ｒａｙｎａｌらの文献（Ｒａｙ
ｎａｌ Ａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８ ２８：３３３−４２）
に記載されている。
【０５９９】 この構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）におけるインテグラーゼの発現を可能にする。
【０６００】 工程４：「ｃｏｓ」部位の挿入 原理は、プラスミドｐＯＳＶ０１０内に「ｃｏｓ」部位を挿入して、図１２に
示すプラスミドｐＯＳＶ０１０内へのパッケージングを可能にすることである。
【０６０１】 「ｃｏｓ」断片の製造を図１３に示す。
【０６０２】 この断片はＰＣＲにより得る。λ（バクテリオファージラムダまたはコスミド
ｐＨＣ７９）の付着末端（ｃｏｓ）を保持する断片から出発して、該ｃｏｓ部位
に対して−５０／＋１３０の配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用してＰＣ
Ｒ増幅を行う。これらのオリゴヌクレオチドはまた、ＮｓｉＩクローニング部位
、ＰｓｔＩ（適合性）、ＸｈｏＩ部位、ＳａｌＩ（適合性）およびＥｃｏＲＶ（
「平滑末端」得るための部位）を含有する。
【０６０３】 稀有ＳｗａＩおよびＰａｃＩ部位の付加は、クローニングされたインサートの
単離および／またはマッピングを可能にする。
【０６０４】 該ＰＣＲ断片は、５’末端ではＰｓｔＩ部位により、３’末端ではＨｉｎｃＩ
Ｉ部位により境界が定められており、ｌａｃｌｑリプレッサーの欠失が生じるよ
う酵素ＮｓｉＩおよびＥｃｏＲＶで予備消化されたベクターｐＯＳＶ０１０（図
１２）内にクローニングされうる。
【０６０５】 ベクターｐＯＳＶ３０３の地図を図１４に示す。ベクターｐＯＳＶ３０３は、
ＮｓｉＩ部位、ＰｓｔＩ（適合性）、ＸｈｏＩ部位、ＳａｌＩ（適合性）または
ＥｃｏＲＶ部位（「平滑末端」を得るための部位）のようなクローニング部位を
含有する。
【０６０６】 ５．２ ベクターｐＯＳＶ３０６の構築 工程１：ベクターｐＯＳＶ３０８の構築 ベクターｐＯＳＶ３０８を、図２７に記載の方法に従い構築した。配列配列番
号１０７および配列番号１０８のプライマーのペアを使用して、Ｈｏｈｍ Ｂお
よびＣｏｌｌｉｎｓ（１９８０）に記載のコスミドベクターｐＨｃ７９から、ｃ
ｏｓ領域を含有する６４３ｂｐの断片を増幅した。
【０６０７】 この増幅されたヌクレオチド断片を、図２７に示すとおりに、Ｐｒｏｍｅｇａ
社により販売されているｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター内に直接的にクローニン
グして、ベクターｐＯＳＶ３０８を得た。
【０６０８】 工程２：ベクターｐＯＳＶ３０６の構築 本実施例の５．１節に記載のベクターｐＯＳＶ３０３の構築の工程３に記載の
とおりに、ベクターｐＯＳＶ０１０を構築した。
【０６０９】 ベクターｐＯＳＶ１０を酵素ＥｃｏＲＶおよびＮｓｉＩで消化して７８７４ｂ
ｐの断片を切り出し、ついでそれを精製した（図２８に記載のとおり）。
【０６１０】 つぎに、前記工程１）で得たベクターｐＯＳＶ３０８を酵素ＥｃｏＲＶおよび
ＰｓｔＩで消化して６１７ｂｐ断片を切り出し、ついでそれを精製した。
【０６１１】 つぎに、ベクターｐＯＳＶ３０８から得た６１７ｂｐのｃｏｓ断片を、ベクタ
ーｐＯＳＶ１０内に連結により組込んで、ベクターｐＯＳＶ３０６を得た（図２
８に記載のとおり）。
【０６１２】 ５．３ ベクターｐＯＳＶ３０７の構築 コスミドｐＯＳＶ３０７は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）、例えばストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のＳ１７−１株に
おける該コスミドの安定性を改善するようＬａｃｌｑ遺伝子を尚も含有する。
【０６１３】 ベクターｐＯＳＶ３０７を構築するために、ベクターｐＯＳＶ０１０を酵素Ｐ
ｖｕＩＩでの消化に付して８７６１ｂｐの断片を得、それを精製し、ついで脱リ
ン酸化した。
【０６１４】 つぎに、前記５．２節の工程１）に記載のとおりに得たベクターｐＯＳＶ３０
８を酵素ＥｃｏＲＩで消化して６６３ｂｐの断片を得、ついでそれを精製し、ク
レノウ酵素で処理した。
【０６１５】 このようにして処理したヌクレオチド断片を、連結後にベクターｐＯＳＶ０１
０内に組込んで、ベクターｐＯＳＶ３０７を得た（図２９に示すとおり）。
【０６１６】 実施例６：大腸菌−ストレプトマイセス複製型シャトルコスミドｐＯＳ７００ Ｒの構築 図１５に示すプラスミドｐＥＩ１６（Ｖｏｌｆｆら，１９９６）の断片を単離
し、クレノウ処理した。これらの断片は、プラスミドＳＣＰ２に由来する複製お
よび安定性に必要な配列を含有する。
【０６１７】 これらの２つの断片を、コスミドｐＷＥＤ１のＥｃｏＲＶ部位内に別々に挿入
して、２つの異なるクローンを得る。
【０６１８】 ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＨＰ４５Ωｈｙｇから単離した
ハイグロマイシンカセットを、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩの形態でＳ
ｃＰ２インサートを含有するｐＷＥＤ１コスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位内にクロ
ーニングした。それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の両方において選択されうるハイグロマイシン耐性を
付与する。
【０６１９】 ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の形質転換および
形質転換効率の測定 ＸｂａＩインサートを含有するコスミドは、ＰｓｔＩ ＥｃｏＲＩ断片を含有
するコスミドより不安定であることが判明した。したがって、後者のコスミド（
ｐＯＳ７００Ｒと称される）を選択した。
【０６２０】 ベクターｐＯＳ７００Ｒの地図を図１６に示す。
【０６２１】 実施例７：組込み型（ｐＯＳ７００Ｉ）および複製型ベクターの形質転換効率 可能性 チオスレプトン耐性マーカーを保持するプラスミドｐＴＯ１を組込むことによ
り、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）をチオスレプト
ンに対して耐性にする。
【０６２２】 チオストレプトンの存在下で培養したストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．
ｌｉｖｉｄａｎｓ）からのプロトプラストの調製。
【０６２３】 ベクターｐＯＳ７００Ｉでは、形質転換効率は、ＤＮＡ １μｇ当たり形質転
換体約３０００個である。
【０６２４】 ベクターｐＯＳ７００Ｒでは、形質転換効率は、ＤＮＡ １μｇ当たり形質転
換体約３０，０００個である。
【０６２５】 実施例８：ストレプトマイセスにおいて組込まれる接合型であるＢＡＣベクタ ーの構築 特徴： 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において複製される。 ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）との大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
の接合により導入されうる。 ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において組込まれる。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）において選択されうる。 大きなＤＮＡ断片の挿入が可能である。小さな断片に汚染されていない１００〜
３００ｋｂのサイズの土壌ＤＮＡが利用可能である必要があることを指摘すべき
である。この理由は、そのような小さな断片は非常に組込まれやすいことにある
。 インサートを保持するプラスミドを選択するためのスクリーニングを受けうる。
このスクリーニングは、自己閉環している及び消化されないベクターを除去する
ことにより、該ベクターと該挿入ＤＮＡとの、より高い比の達成を可能にして、
ライブラリーの作製のための、より良好なクローニング効率を与えうる。
【０６２６】 構築： 工程１：ベクターｐＯＳＶ００１ ＰｓｔＩで開裂されたプラスミドｐＵＣ１９内への、レプリコンＲＫ２（Ｇｕ
ｉｎｅｙら，１９８３）の導入起点ＯｒｉＴを保持する８００塩基対のＰｓｔＩ
−ＰｓｔＩ断片のクローニング。このクローニング工程は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）からストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）へ接合により移入可
能なベクターを得ることを可能にする。
【０６２７】 ベクターｐＯＳＶ００１の地図を図１７に示す。
【０６２８】 工程２：ベクターｐＯＳＶ００２ ハイグロマイシン耐性遺伝子が最後に導入されるよう、ストレプトマイセス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において選択されうるハイグロマイシンマーカー（
Ωｈｙｇカセット）を挿入して、該土壌ＤＮＡインサートを有するＢＡＣの完全
な導入が保証されうるようにする。
【０６２９】 ハイグロマイシン耐性遺伝子を保持するＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
としての、ｐＨＰ４５Ωｈｙｇから単離されたハイグロマイシンカセットのクロ
ーニング。この断片は、ベクターｐＯＳＶ００１のＰｓｔＩ部位（２０１位）内
にクローニングされる。Ｈｙｇｒｏマーカーが該接合中に最後に導入されるよう
、該導入の方向を考慮して、このＰｓｔＩ部位が選択された。ＰｓｔＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ末端は、「平滑末端」が生成しうるようＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノウフラグメントで処理した後に適合性となる。該Ωｈｙｇ断片の配向は、構築
の終了時に決定される。
【０６３０】 ベクターｐＯＳＶ００２の地図を図１８に示す。
【０６３１】 工程３：ベクターｐＯＳＶ０１０ プラスミドｐＯＳＶ００２から単離されハイグロマイシン耐性マーカーおよび
導入起点を含有するＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化されたプラスミドｐＯＳｉｎｔ１内にクローニングする。該部位の
配向は、該ハイグロマイシンマーカーが常に最後に導入されるような配向である
。
【０６３２】 図８に示されるプラスミドｐＯＳｉｎｔ１は、Ｒａｙｎａｌらの文献（Ｒａｙ
ｎａｌ Ａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８ ２８：３３３−４２）
に記載されている。
【０６３３】 この構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）におけるインテグラーゼの発現を可能にする。
【０６３４】 工程４：ベクターｐＯＳＶ０１４ 挿入された外来ＤＮＡを有するプラスミドを最終構築物において選択すること
を最後に可能にする「カセット」の付加。
【０６３５】 この「カセット」は、λファージＣｌリプレッサーをコードする遺伝子および
テトラサイクリン耐性遺伝子を保持する。この遺伝子は、該リプレッサーの標的
配列を、その非コード５’領域内に保持した。Ｃｌのコード領域内に位置するＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位内へのＤＮＡの挿入は、リプレッサーの無生成およびそれによ
るテトラサイクリン耐性の発現を招く。
【０６３６】 それは、Ｎｉｌｓｓｏｎらの文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
９８３，１１：８０１−３０）に記載のプラスミドｐＵＮ９９により保持されて
いる。
【０６３７】 ｐＯＳＶ０１０から単離され配列Ｉｎｔ、ａｔｔＰ、Ｈｙｇｒｏおよびｏｒｉ
Ｔを含有するＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＮ９９のＭｓｃＩ部位内に
クローニングする。
【０６３８】 ベクターｐＯＳＶ０１４の地図を図１９に示す。
【０６３９】 工程５：ベクターｐＯＳＶ４０３ならびに組込み型および接合型ＢＡＣベクタ ー ｐＢＡＣ１１（図２０に示される）内へのクローニングのこの最終工程は、最
終プラスミドＢＡＣ（細菌人工染色体）の特性、特に、非常に大きなＤＮＡイン
サートの受容能力を与える。
【０６４０】 既に記載されている要素および機能のセットを保持するベクターｐＯＳＶ０１
４のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を、ＮｏｔＩで消化されたプラスミドｐＢＡＣ１１
（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１）内にクローニングする。それらの末端を、クレノウ酵
素での処理により適合性にする。
【０６４１】 ベクターｐＯＳＶ４０３の地図を図２１に示す。図２１のスキームは、選択さ
れた配向を示す。
【０６４２】 工程６： ベクターｐＯＳＶ４０３はＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｓｉＩ部位を含有する。該
ＮｓｉＩ部位は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）においては
非常に稀有であり、ＰｓｔＩに対して適合性であるという利点を有する。一方、
該ＰｓｔＩ部位はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）においては
一般的であり、部分消化を行うために利用されうる。
【０６４３】 Ｃｌリプレッサー内にクローニングされてこのリプレッサーを不活性化するイ
ンサートを保持する組換えクローンは、テトラサイクリン耐性となる。該ＢＡＣ
が僅か１コピー／細胞の割合で存在すると仮定すると、２０μｇ／ｍｌの通常の
量より低いテトラサイクリン量（例えば、５μｇ／ｍｌの量）で組換えクローン
を選択する必要がある。これらの条件下、バックグラウンドノイズは存在しない
。
【０６４４】 また、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社により開発され販売された系を使用することが
可能であり、その場合、該ベクター内へのＤＮＡの挿入は、発現されると大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して毒性となるジャイレースインヒビターを不活性化する
。該断片は、ベクターｐＺＥｒＯ−２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ．ｃｏｍ／）から優先的に単離される。
【０６４５】 実施例９：組込み型コスミド（ｐＯＳ７００Ｉ）および複製型コスミド（ｐＯ Ｓ７００Ｒ）におけるストレプトマイセス・アルボニガーライブラリーの構築 １）ライブラリーの構築 該クローニング系の有効性を評価するために、ストレプトマイセス・アルボニ
ガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）のピューロマイシン生
合成経路を２つのシャトルコスミドｐＯＳ７００ＩおよびｐＯＳ７００Ｒ内にク
ローニングした。ピューロマイシン生合成経路の遺伝子は、約１５ｋｂのＢａｍ
ＨＩ ＤＮＡ断片により保持される。
【０６４６】 ストレプトマイセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｎ
ｉｇｅｒ）のゲノムＤＮＡを単離した。このＤＮＡの９０％は、パルスフィール
ド電気泳動による測定で２０〜１５０ｋｂの分子量を有する。
【０６４７】 それらの２つのコスミドを酵素ＢａｍＨＩ（単一のクローニング部位）で消化
した。
【０６４８】 ゲノムＤＮＡの部分ＢａｍＨＩ消化の条件を決定した（５０μｇのＤＮＡおよ
び１２単位の酵素、５分間の消化）。アガロースゲル電気泳動により該サイズを
確認した後、部分的に消化されたＤＮＡを該ベクター内に導入した。該連結にお
いて、１５μｇのゲノムＤＮＡ＋２μｇの該組込み型ベクターまたは５μｇの該
複製型ベクターを使用した。
【０６４９】 バクテリオファージラムダの頭部内への該ＤＮＡのインビトロ包膜のために、
各連結混合物を使用した。該包膜混合物（０．５ｍｌ）を力価測定した（組込み
型ベクターｐＯＳ７００Ｉ＝７．５×１０５コスミド／ｍｌ、複製型ベクター＝
５×１０４コスミド／ｍｌ）。
【０６５０】 該コスミドを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をトランスフェクトし、それに
より約２５，０００個のアンピシリン耐性クローンのライブラリーを作製した。
これらのクローンのすべてからのＤＮＡを単離し、定量した。
【０６５１】 該ライブラリーを試験するために、いくつかのクローンを選択し、該ＤＮＡを
精製し、ＢａｍＨＩで消化して、該インサートの存在およびサイズを確認した。
試験したクローンは、２０〜３５Ｋｂのストレプトマイセス・アルボニガー（Ｓ
．ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）インサートを含有する。
【０６５２】 ２）ピューロマイシン生合成経路を含有するクローンの同定 完全なピューロマイシン生合成経路を含有する傾向にあるクローンを、ピュー
ロマイシン耐性遺伝子である１．１ｋｂのｐａｃ遺伝子（Ｌａｃａｌｌｅら，Ｇ
ｅｎｅ １９８９；７９，３７５−８０）に対応するプローブでのハイブリダイ
ゼーションにより同定した。
【０６５３】 組込み型ベクターｐＯＳ７００Ｉにおいて作製したライブラリー 分析した２０００個のクローンのうち、９個のクローンが該プローブにハイブ
リダイズし、それらは約４０ｋｂのインサートを含有する。
【０６５４】 複製型ベクターｐＯＳ７００Ｒにおいて作製したライブラリー 分析した２０００個のクローンのうち、１２個のクローンが該プローブにハイ
ブリダイズし、それらは約４０ｋｂのインサートを含有する。
【０６５５】 Ｔｅｒｃｅｒｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１，１５７９−
９０）により公開されたデータを用いて、該全生合成経路を含有するクローンを
、適当なプローブでのハイブリダイゼーションの後に同定した。ある組込み型お
よび複製型コスミドは、ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶ消化の後に１２，３６０塩基対の
断片を含有し、これは、該全ピューロマイシン生合成経路を含有するインサート
の仮定につながる。
【０６５６】 ４）耐性クローンによるピューロマイシンの産生の確認（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕ ｌｅｎｃ） ａ）材料および方法 株および培養条件： ピューロマイシンの産生を確認するために、３個の耐性クローンを選択した。
それらは、組込み型ベクターｐＯＳ７００Ｉ（Ｇ２０）内のインサートまたは複
製型ベクター（Ｇ２１およびＧ２２）内のインサートを含有するストレプトマイ
セス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）組換え体に対応する。
【０６５７】 使用した培地がこの産生を可能にすることを保証するために、参照株を使用し
た。それらは、ピューロマイシンを産生するストレプトマイセス・アルボニガー
（Ｓ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）野生型株ＡＴＣＣ １２４６１、およびプラスミド
ｐＲＣＰ−１１（Ｌａｃａｌｌｅら，１９９２，ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎ
ａｌ，１１，７８５−７９２）内にクローニングされた完全なピューロマイシン
クラスターを含有するストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
）組換え体株（Ｇ２３）である。
【０６５８】 該株を、以下の組成を有する培地内に接種した。
【０６５９】 Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ細菌学的ペプトン ５ｇ／Ｌ最終培地 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ酵母エキス ５ Ｌｉｅｂｉｇ肉エキス ５ Ｐｒｏｌａｂｏグルコース １５ Ｐｒｏｌａｂｏ ＣａＣＯ３（１） ３ Ｐｒｏｌａｂｏ ＮａＣｌ ５ Ｄｉｆｃｏ寒天（２） １。 （１）３ｇのカルボナートを２００ｍｌの蒸留水と混合し、ついで別々に滅菌す
る。該添加は滅菌後に行う。 （２）該寒天を１００ｍｌの蒸留中で予め溶融し、ついでそれを該培地のその他
の成分に加える。 滅菌前にｐＨを７．２に調節する。 １２１℃で２５分間の滅菌。
【０６６０】 ５０μｇ／ｌのハイグロマイシンおよび５μｇ／ｌのチオスレプトンを、滅菌
後の培地に加えて、該ベクター上に存在するマーカー遺伝子によるインサートを
含有するクローニングに関する選択圧を維持する（該チオスレプトン耐性遺伝子
はプラスミドｐＲＣＰ１１により保持される）。
【０６６１】 ２５０ｍｌ 円錐フラスコ内に分注された５０ｍｌの液体培地に、該株のそれ
ぞれの芽胞および菌糸体の水性懸濁液２ｍｌを接種する。該培養を、２２０ｒｐ
ｍで攪拌しながら２８℃で４日間インキュベートする。ついで、２５０ｍｌ 円
錐フラスコ内に分注された５０ｍｌの生産培地に、これらの予備培養物２ｍｌを
接種する。使用した生産培地は、プリスチナマイシン（ｐｒｉｓｔｉｎａｍｙｃ
ｉｎ）の生産用に最適化された工業用培地（培地ＲＰＲ２０１）である。該培養
を、２２０ｒｐｍで攪拌しながら２８℃でインキュベートする。種々のインキュ
ベーション時間の後、各培養の円錐フラスコをｐＨ１１にし、ついで１容積のジ
クロロメタンで２回抽出する。該有機相を減圧下で濃縮乾固し、ついで該抽出物
を１０μｌのメタノール中に取る。ピューロマイシンの検出のために、Ｃ１８カ
ラム上の水−アセトニトリル ０．０５％ ＴＦＡ Ｖ／Ｖ勾配系中の、ダイオ
ードバー検出器を備えたＨＰＬＣにより、１００μｌの該メタノール溶液を分析
する。
【０６６２】 ｂ）結果 種々の株の培養からの比較ＨＰＬＣ分析は、野生型株の培養においては、２４
時間以上のインキュベーションの時点でのピューロマイシンの産生を示している
。コスミドｐＯＳ７００Ｉを含有するクローンＧ２０の培養においては、４８時
間以上の時点で、より低度ではあるが産生が明らかに検出されている（図２３）
。プラスミドｐＲＣＰ１１において該化合物をコードする完全なオペロンを含有
するクローンＧ２３においても、ピューロマイシンが微量で検出された。しかし
、コスミドｐＯＳ７００Ｒを含有するクローンＧ２１およびＧ２２の培養におい
ては、産生は全く認められなかった。該結果を図２３に示す。
【０６６３】 ｃ）結論 得られた結果は、コスミドｐＯＳ７００Ｉにおいて開発されたクローニング系
の、完全な生合成経路をストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）のような異種宿主においてそれ自身の調節配列の制御下で発現させるための
有効性を示しうる。さらに、これらのデータはまた、ピューロマイシンに対する
該クローンの耐性に基づいて得たライブラリーのスクリーニングの有効性を証明
している。なぜなら、それは、少数のクローンのなかから、該耐性遺伝子に関連
した生合成経路を発現しうる組換え体を同定することにつながるからである。そ
の他のクローンにおけるピューロマイシン産生の不存在は、おそらく、該耐性遺
伝子を含有するものの該化合物の合成に必要な何らかの調節、形質導入または転
写配列を欠くオペロンの一部だけがクローニングされたことにより説明されうる
であろう。
【０６６４】 実施例１０：ベクター内への土壌ＤＮＡのクローニング １）クローニングすべき土壌ＤＮＡの調製 種々のＤＮＡ断片を、それらの用途に応じて精製する必要がある。
【０６６５】 コスミド 該分子のサイズは３０〜４０ｋｂであるべきである。現段階では、該土壌から
抽出されたＤＮＡはサイズにおいて不均一であり、２００または３００ｋｂまで
の分子を含む。該サイズを均一化するために、該溶液を直径０．４ｍｍの針に通
過させることにより、該ＤＮＡを機械的に破壊する。３０ｋｂの範囲のサイズの
断片は、針内のこれらの反復通過による影響を受けず、したがって、特にサイズ
に基づく分離を行う必要はない。なぜなら、該粒子におけるパッケージングは、
それらの短いインサートを自動的に排除するからである。
【０６６６】 ＢＡＣ ＤＮＡの調製 １００〜３００ｋｂの断片が約５ｍｍのバンド内に濃縮される条件下、パルス
フィールド電気泳動（ＣＨＥＦ型）により、該土壌ＤＮＡを分離する。これは、
０．７％の通常のアガロースまたは１％の低融点のアガロースを含有するゲル内
で、１００秒のパルスタイム、１０℃の温度で２０時間にわたり泳動を行うこと
により得られる。
【０６６７】 ＤＮＡの回収 ２つの方法を用いる。それらの選択は、分離したい分子のサイズに基づき、１
５０ｋｂまでであるか、それより高いかによって決まる。
【０６６８】 １５０ｋｂまで ０．７％ アガロースゲルの多孔度は、臭化エチジウムが全く存在しない場合
には、電気溶出による該ＤＮＡの流出を可能にする。ついで、このＤＮＡは、該
分子の機械的断片化を避けるために、疎水性の拡大オリフィスピペッティング装
置を使用して取り扱われる。
【０６６９】 １００〜３００ｋｂ １００〜３００ｋｂのサイズの断片を含有するバンドを切り出す。該泳動には
、１％の低融点アガロースを含有するゲルを使用する。この特性は、該ＤＮＡが
許容しうる６５℃の温度で該ゲルを溶融させること、およびついでそれをアガラ
ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社により販売されているＡｇａｒａｓｅ）で該供給
業者の指示に従い４５℃の温度で消化することを可能にする。
【０６７０】 ２）組込み型コスミドｐＯＳ７００Ｉおよび複製型コスミドｐＯＳ７００Ｒの 使用 ポリＡポリＴテイルでの構築 原理 いずれかのクローニング部位で開裂されたコスミドベクターを、単種（ｍｏｎ
ｏｔｏｎｏｕｓ）ポリヌクレオチドを付加することにより、３’末端で修飾する
。さらに、クローニングするＤＮＡを、前記ポリヌクレオチドと対形成しうる単
種ポリヌクレオチドを付加することにより、３’末端で修飾する。
【０６７１】 クローニングするベクター−断片の組合せをこれらのポリヌクレオチドで作製
する。該ベクターのｃｏｓ配列は、ラムダファージカプシド内への該ＤＮＡのイ
ンビトロパッケージングを可能にする。
【０６７２】 ベクターの調製 使用するベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では自己複製しストレプトマ
イセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）内では組込まれるベクターである。
【０６７３】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではアンピシリン耐性に関して、ストレプトマイセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ではハイグロマイシン耐性に関して、選択を行う
。該コスミドを２つの可能な部位（ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ）の１つに
おいて開裂し、該３’末端をターミナルトランスフェラーゼで、該酵素供給業者
が５０〜１００ヌクレオチドの付加を予想する条件下、ポリＡで伸長させる。
【０６７４】 挿入するＤＮＡの調製 該ＤＮＡの３’末端を、該ベクターの場合に匹敵する伸長をもたらす条件下、
ターミナルトランスフェラーゼでポリＴで伸長させる。該製造業者により記載さ
れている実験的条件下、該ポリＡポリＴテイルは３０〜７０塩基長である。
【０６７５】 分子の集合およびインビトロ包膜 該分子の集合のために、挿入するＤＮＡ分子１個当たりベクター分子１個を混
合する。質量に基づく該ＤＮＡの濃度は５００μｇ．ｍｌ−１である。
【０６７６】 該混合物を包膜する。該トランスフェクション効率は、レシピエントとして使
用する株および挿入するＤＮＡに左右され、該試験ＤＮＡおよび株ＤＨ５αでは
ゼロであり、該効率は、ＳＵＲＥおよびＤＨ１０Ｂ株と比較しうるものであるが
、抽出すると、該ＤＮＡ収量は、該株ＤＨ１０Ｂの方が高い。
【０６７７】 脱リン酸化による構築 該土壌ＤＮＡを、突出３’配列を除去し突出５’配列をフィルインすることに
より、平滑末端化する。この操作は、クレノウ酵素、Ｔ４ポリメラーゼ、４種の
ヌクレオチド三リン酸で行う。該コスミドベクターをＢａｍＨＩで消化し、つい
でクレノウ酵素で消化して該末端を平滑化し、ついで脱リン酸化してその自己閉
環を防ぐ。連結後、該混合物を包膜し、トランスフェクトする（既に記載されて
いるとおりに行う）。
【０６７８】 ３）ｐＢＡＣの使用 原理 接合型であり組込み型であるプラスミドｐＢＡＣは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮ
ｓｉＩ部位をクローニング部位として含有する。これらの部位内へのＤＮＡ配列
の挿入は、テトラサイクリン耐性遺伝子の発現を抑制するラムダファージＣＩリ
プレッサーを不活性化する。したがって、該リプレッサーの不活性化は該細胞を
この抗生物質（５μｇ．ｍｌ−１）に対して耐性にする。これらの部位における
クローニングは、該ベクターを修飾し被クローン化ＤＮＡを調製することにより
促進される。
【０６７９】 ベクターの調製：ＨｉｎｄＩＩＩの実例 該ベクターが自己閉環しないようにするために、該ＨｉｎｄＩＩＩ部位を修飾
する。第１塩基（Ａ）を再挿入して、対応相手と対形成し得ない突出５’配列を
形成させる。該操作は、ｄＡＴＰの存在下、クレノウ酵素で行う。
【０６８０】 該クレノウ酵素での処理の前および後に該ベクターの自己連結を行うことによ
り、該操作の成功を確認する。等量の試験ＤＮＡでは、処理前には３０００クロ
ーンが得られ、処理後には６０クローンが得られる。
【０６８１】 ＤＮＡ（１００〜３００ｋｂのサイズ）の調製 ＤＮＡに平滑末端を付与する 突出３’配列を除去し、突出５’配列をフィルインすることにより、該ＤＮＡ
に平滑末端を付与する。この操作は、クレノウ酵素、Ｔ４ポリメラーゼ、４種の
ヌクレオチド三リン酸で行う。
【０６８２】 該末端の調製：ＨｉｎｄＩＩＩの実例 該ベクターへのＤＮＡの付加は、該ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ修飾配列を認識
するオリゴヌクレオチドにより行う。それらは、後続のクローニングを可能にす
る稀有制限部位（ＳｗａＩ；ＮｏｔＩ）を含有する。この技術は、Ｅｌｌｅｄｇ
ｅ ＳＪ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＪＴ，Ｒａｍｅｒ ＳＷ，Ｓｐｏｔｔｓｗｏｏｄ
Ｍ，Ｄａｖｉｓ ＲＷ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １
９９１ Ｍａｒ １；８８（５）：１７３１−５から導かれたものである。２つ
の相補的オリゴヌクレオチドを使用する。 オリゴ１：５’−ＧＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ
ＧＧＧ−３’（配列番号２５）。 オリゴ２：５’−ＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＡ
−３’（配列番号２６）。
【０６８３】 ハイブリダイゼーション後、それらを、ＡＴＰの存在下、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼで５’末端にてリン酸化する。このリン酸化工程は、既にリン酸化さ
れたオリゴヌクレオチドを使用することにより省略することができる。ベクター
内に挿入するＤＮＡとこの二本鎖アダプターとの連結は、非常の大過剰のアダプ
ター（挿入するＤＮＡ分子１個当たり１００個のアダプター分子）の存在下、Ｔ
４リガーゼで１４℃で１５時間にわたり行う。その過剰のアダプターはアガロー
スゲル電気泳動により除去し、関心のある分子は、それをアガラーゼで加水分解
することにより又は電気溶出により、該ゲルから回収する。
【０６８４】 ベクター−ＤＮＡ連結 該連結は、インサート分子１個当たり１０分子のベクターで、１４℃で１５時
間にわたり行う。
【０６８５】 形質転換 該受容株は株ＤＨ１０Ｂである。該形質転換はエレクトロポレーションにより
行う。テトラサイクリン耐性を発現させるために、該形質転換体を、抗生物質を
含有しない培地内で３７℃で１時間インキュベートする。５μｇ．ｍｌ−１のテ
トラサイクリンで補足されたゲル化ＬＢ培地上で一晩培養することにより、該ク
ローンを選択する。
【０６８６】 実施例１１：大腸菌とストレプトマイセスとの間のクローンからクローンの接 合 ｐＰＭ８０３を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓ１７．１とストレプトマ
イセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２１
との間の接合 導入 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
との間の接合を行うことが可能である（Ｍａｚｏｄｉｅｒら，１９８９）。いわ
ゆるドロップ（ｄｒｏｐ）技術（この技術においては、組換えベクターを含有す
る１０μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を１滴の受容ストレプトマイセス・
リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）と混合する）を進展させることによるこの
方法の応用は、クローンからクローンの形質転換を行うことを含み、一方、該操
作の終了時に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で構築したライブラリーのすべてがス
トレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）内に確実に導入される
ようにする。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のライブラリーがストレプトマイセス・
リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）において完全に表現されることを実際に確
実に行うためには、大量の形質転換は必然的にストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）形質転換クローンの増殖を招くであろう。さらに、この方法は
自動化が容易である。
【０６８７】 予備試験 ベクターｐＯＳＶ３０３を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓ１７．１とス
トレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２１との間の接合
。
【０６８８】 これらの条件下、６×１０６個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を２×１０６個
の予め発芽したストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）芽胞
と２０μｌの最終容積中で混合する。
【０６８９】 該方法の開発 ある放線菌から抽出されたＤＮＡは修飾され、その結果、制限処理されなけれ
ば或る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内には導入され得ないことが公知である。これら
のＤＮＡを受容する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ１０Ｂは、ｏｒｉＴだけを含
有するプラスミドをストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に移入し
得ず、したがって、そのようなプラスミドの構築が必要である。ＲＰ４の誘導体
は、染色体内への組込みによりそれに導入されるはずであり、該誘導体は、導入
起点ｏｒｉＴを含有する組換えクローンの導入を保証するのに必要なすべての機
能をトランスで付与しうる。
【０６９０】 実施例１２：大腸菌およびストレプトマイセス・リビダンスにおけるコスミド ライブラリーの構築：土壌ＤＮＡのクローニング 該目的は、標準的な実験条件下での培養方法が公知でない細菌（または他のい
ずれかの生物）の代謝遺伝子を入手するために、該微生物を培養する予備工程を
行うことなく大きなサイズの環境ＤＮＡのライブラリーを構築することにある。
【０６９１】 記載されている方法を用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
におけるＤＮＡライブラリーを作製した。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ス
トレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）シャトルコスミドｐＯ
Ｓ７００Ｉと土壌の細菌画分から抽出され精製されたＤＮＡとを使用して行った
。この最後の方法は、４０ｋｂの平均サイズを有する高純度のＤＮＡを得ること
を可能にする。また、該クローニングにおける該抽出ＤＮＡの部分消化を避ける
ために、該ＤＮＡの及び該ベクターの３’末端にポリヌクレオチドテイルを付加
するためのターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用に基づく、もう１つの方法
を採用した。
【０６９２】 ５μｇのＤＮＡを、実施例３に記載のプロトコールに従い６０ｍｇの「Ｓａｉ
ｎｔ−Ａｎｄｒｅ海岸」土壌から抽出し、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）で処理して該３’末端を単種ポリヌクレオチド（ポリＴ）で伸
長させた（実施例１０）。
【０６９３】 組込み型コスミドｐＯＳ７００Ｉは、プロトコールＢ１，Ｏｒｓａｙに従い製
造する。フェノール／クロロホルムの存在下の標準的精製工程の後、１分子のベ
クターと１分子の挿入ＤＮＡとを混合することにより、該ＤＮＡと該ベクターと
を集合させる。ついで該混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂをトラン
スフェクトするのに有用なラムダバクテリオファージ（Ａｍｅｒｓｈａｍキット
）の頭部内に包膜する。ついで該トランスフェクト化細胞を、アンピシリン（こ
の抗生物質に対して耐性の組換え体を選択するためのもの）の存在下のＬＢ寒天
培地上に接種する。
【０６９４】 約５０００個のアンピシリン耐性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンのライブラ
リーを得た。各クローンをマイクロプレートウェル（９６ウェル）内のＬＢまた
はＴＢ培地＋アンピシリン内に接種し、−８０℃で保存する。
【０６９５】 該ライブラリーの構築中に作製されたベクターｐＯＳ７００Ｉ内への該土壌断
片の挿入の部位の配列を分析した。このために、該ライブラリーのコスミド１７
個を精製し、該ベクター内に存在するＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位とＢａｍ
ＨＩ部位との間にハイブリダイズするプライマー配列５’ＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣ
ＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＣＧ ３’で配列決定する。
【０６９６】 得られた配列は、該結合部位におけるホモポリマーテイルの長さが１３〜６０
ポリ−ｄＡ／ｄＴと非常に様々であると推定することを可能にした。該テイル以
外では、このように作製された土壌断片の配列は５３〜７０％のＧ＋Ｃの比率を
有する。そのような比率は予想外であったが、土壌ＤＮＡの粗調製物に関して同
様の結果が既に報告されている（Ｃｈａｔｚｉｎｏｔａｓ Ａら，１９９８）。
【０６９７】 ４８または９６個のクローンを「プール」する方法を用いて、微生物的および
代謝的な富化度（ｒｉｃｈｎｅｓｓ）を分析した。ついでクローンのこれらの「
プール」から抽出したコスミドＤＮＡを使用して、ＰＣＲまたはハイブリダイゼ
ーション実験を行った。
【０６９８】 実施例１３：クローン化ＤＮＡにおける１６ＳリボソームＤＮＡの多様性 ａ）材料および方法 該ライブラリーのコスミドを、アルカリ細胞溶解によりプールから抽出し、つ
いで塩化セシウム勾配上で精製して、スーパーコイル形態のコスミドＤＮＡのバ
ンドを取り、該研究を妨げうる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）染
色体ＤＮＡを除去する。
【０６９９】 Ｓ１ヌクレアーゼ（５０単位、３７℃で３０分間）の作用による該コスミドの
線状化の後、該クローンプール内に含有される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を、Ｍａｒ
ｃｈｅｓｉら（１９９８）により定められた普遍的プライマー６３ｆ（５’−Ｃ
ＡＧＧＣＣＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣ−３’）および１３８７ｒ（５’−
ＧＧＧＣＧＧＷＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣ−３’）を使用して標準的増幅条件下で
増幅する。約１．５キロベースの増幅産物を、Ｑｉａｑｕｉｋゲル精製キット（
Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ついで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）内のベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に、該製造業者の
説明に従い直接的にクローニングする。ついで該インサートを、ベクターｐＣＲ
ＩＩのクローニング部位に特異的なプライマーＭ１３フォワードおよびＭ１３リ
バースを使用して増幅する。予想されるサイズ（約１．７ｋｂ）の増幅産物を、
酵素ＣｆｏＩ、ＭｓｐＩおよびＢｓｔＵＩ（０．１単位）を使用するＲＦＬＰ（
Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈｉｓｍ）により分析して、配列決定すべきクローンを選択する。得られた制限
プロフィールを、０．４ｍｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する２．５％ Ｍｅ
ｔａｐｈｏｒｅアガロースゲル（ＦＭＣ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上で分離する。
【０７００】 ついで、「Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出」キットで精製されたＰＣＲ産物を、Ｎ
ｏｒｍａｎｄ（１９９５）により定められた配列決定用プライマーと共に使用し
て、該１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を直接的に決定する。Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔ
ａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）データベース，バージョン７．０（Ｍａ
ｉｄａｋら（１９９９））において照合された原核性１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と該
配列とをＳＩＭＩＬＡＲＩＴＹ ＭＡＴＣＨプログラム（これは、該データベー
ス配列に対する類似性の値を得ることを可能にする）により比較することにより
、系統発生的分析が得られる。
【０７０１】 ｂ）結果 該ライブラリーにおいて表現される系統発生的多様性を測定するために、該１
６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４７個の配列を２８８個のクローンのプールから単離し
、ほぼ完全に配列決定した。該結果を表７に示す。
【０７０２】 該データベースの問合せによる該配列の分析は、該配列のほとんど（＞６１％
）が、同定された細菌種に対して９５％以下の類似性の割合（％）を有すること
を示している（表７）。分析した４７個の配列のうちの２８個の配列が、未培養
細菌を最も近い類縁体として有し、それらの配列は、該環境から抽出されたＤＮ
Ａから直接得られた。さらに、これらの配列の大多数は、非常に低い類似性度（
８８〜９５％）を有し、したがって２８個中１７個の配列は、それらの最も近い
類縁体に対して５％以上異なっている。
【０７０３】 系統発生群に分類されうる配列のうち、大多数の配列はプロテオバクテリア亜
綱ａに属する（８９〜９９％の類似性度を有する１８個の配列）。第２の群の配
列は、８４〜９９％の類似性度を有する９個の配列を含むプロテオバクテリア亜
綱ｇで表される。ｂ−プロテオバクテリアおよびｄ−プロテオバクテリアの群は
、それぞれ、低いＧ＋Ｃ％および高いＧ＋Ｃ％を有するファーミキューテス門で
あり、それぞれ、１、４、３および５個の配列を含む。１つの配列（配列ａ２２
．１（１９））だけが、定義されている主要細菌分類群のなかに分類することが
できなかった。その最も近い類縁体であるエロサーモバクター・マリアナス（Ａ
ｅｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉａｎａｓ）（８９％の類似性を有す
る）自体が、現時点では分類されていない海洋環境から単離された株である。最
後に、６個の配列はアシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｍ）／ホロ
ファガ（Ｈｏｌｏｐｈａｇａ）の群に分類されうる。この群は、２つの培養細菌
アシドバクテリウム・カプスラツム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｐｓ
ｕｌａｔｕｍ）およびホロファガ・フェチダ（Ｈｏｌｏｐｈａｇａ ｆｏｅｔｉ
ｄａ）だけにより代表されるという特有の特徴を有し、この全群は、環境サンプ
ル（主に、土壌からのもの）から抽出されたＤＮＡを使用する増幅およびクロー
ニングにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子だけが検出されている細菌から構成される
（Ｌｕｄｗｉｇら，（１９９７））。この群を構成する種々の配列間の低い類似
性値は、この群内の大きな異質性および多様性を予想することを可能にする。
【０７０４】 一連の結果を表７に示す。
【０７０５】 これらの結果は、該コスミドライブラリーに含有される配列が、系統発生的に
多様な微生物に由来するばかりではなく、とりわけ、これまでに分離されたこと
がない微生物にも由来すると考えられることを示している。
【０７０６】 増幅されたＤＮＡの配列決定の結果は、特徴づけられた配列が新規である土壌
サンプル中に存在する生物の系統樹の確立を可能にした。
【０７０７】 図７に示す系統樹は、ＭＡＳＥソフトウェア（ＦａｕｌｎｅｒおよびＪｕｒａ
ｋ，１９８８）による該配列のアライメントから作製され、Ｋｉｍｕｒａ２−パ
ラメーター法（１９８０）およびＮｅｉｇｈｂｏｕｒ Ｊｏｉｎｉｎｇアルゴリ
ズム（ＳａｉｔｏｕおよびＮｅｉ，１９８７）により修正されたものである。該
系統発生的分析は、該土壌ＤＮＡライブラリーにおいてクローニングされた１６
Ｓ ｒＤＮＡ配列と、ＢＬＡＳＴ ２．０ソフトウェア（Ａｔｓｃｈｕｌら，１
９９７）によりＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤ
Ｐ）データベース（バージョン７．０，ＳＩＭＩＬＡＲＩＴＹ−ＭＡＴＣＨプロ
グラム，Ｍａｉｄａｋら，１９９９）およびＧｅｎＢａｎｋベースにおいて照合
された原核性１６Ｓ ｒＤＮＡの配列との比較を可能にした。
【０７０８】 実施例１４：代謝的富化度を評価するための該ライブラリーの遺伝的予備選択 得られたライブラリーを代謝的多様性に関して特徴づけるために、および生合
成経路に関与しうる遺伝子を保持するインサートを含有するクローンを同定する
ために、Ｉ型ＰＫＳ遺伝子が検出され同定されるようにＰＣＲ法に基づく遺伝的
スクリーニング技術を本発明で開発した。
【０７０９】 １ 細菌株、プラスミドおよび培養条件 ストレプトマイセス・ケリコロール（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）ＡＴＣＣ１
０１４７８、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ）ＮＲＲＬ２４２０、ストレプトマイセス・ラクタマンデュランス（Ｓ．
ｌａｃｔａｍａｎｄｕｒａｎｓ）ＡＴＣＣ２７３８２、ストレプトマイセス・リ
モサス（Ｓ．ｒｉｍｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ１０９６１０、バシラス・サチリス（Ｂ
．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６６３３またはバシラス・リヘニフォルニス（Ｂ
．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＴＨＥ１８５６（コレクションＲＰＲ）を、該
ＰＣＲ実験のためのＤＮＡ源として使用した。ストレプトマイセス・リビダンス
（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４は、シャトルコスミドＰＯＳＩ７００に使用
する宿主株である。
【０７１０】 ゲノムＤＮＡ、プロトプラストおよび芽胞の懸濁液の製造、ならびにストレプ
トマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の形質転換のためには、Ｈｏ
ｐｗｏｏｄら（１９８６）に記載の標準的なプロトコールに従った。
【０７１１】 該ＰＣＲ産物のクローニングのための宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用し、シャトル
コスミドｐＯＳ７００Ｉのための宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｕｒ
ｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養条件、
プラスミドの製造、該ＤＮＡの消化およびアガロースゲル電気泳動は、標準的な
プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９６）に従い行った。
【０７１２】 ２．ＰＣＲプライマー プライマーペアａ１−ａ２およびｂ１−ｂ２がＮ．Ｂａｍａｓ−Ｊａｃｑｕｅ
ｓのチームにより定められ、それらの使用が、ＰＫＳＩをコードする遺伝子の研
究のための土壌ライブラリーの及び純粋な株からのＤＮＡのスクリーニングのた
めに最適化された。
【０７１３】
【表１】
【０７１４】 増幅条件： 純粋な株のＤＮＡからのＰＫＳ Ｉの研究の場合には、該増幅混合物は、最終
容積５０μｌ中に、５０〜１５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、２００μＭのｄＮＴＰ、
５ｍＭのＭｇＣｌ２（最終）、７％ ＤＭＳＯ、１×Ａｐｐｌｉｇｅｎｅバッフ
ァー、それぞれ０．４μＭの各プライマーおよび２．５ＵのＡｐｐｌｉｇｅｎｅ
Ｔａｑポリメラーゼを含有していた。用いた増幅条件は以下のとおりである：
９５℃で２分間の変性、６５℃で１分間のハイブリダイゼーション、７２℃で１
分間の伸長（第１サイクル）、ついで該温度を５８℃に減少させて３０サイクル
（Ｋ．Ｓｅｏｗら，１９９７に記載のとおり）。最後の伸長工程は７２℃で１０
分間行う。
【０７１５】 該ライブラリーのＤＮＡからのＰＫＳ Ｉの研究の場合には、該ＰＣＲ条件は
、４８個のクローンのプールから抽出された１００〜５００ｎｇのコスミドを使
用するａ１−ａ２ペアに関して前記したのと同じ条件である。
【０７１６】 ｂ１−ｂ２プライマーペアの場合には、９６個のクローンのプールに由来する
５００ｎｇのコスミドを使用した。該増幅混合物は、２００μＭのｄＮＴＰ、２
．５ｍＭのＭｇＣｌ２（最終）、７％ ＤＭＳＯ、１×Ｑｕｉａｇｅｎバッファ
ー、０．４μＭの各プライマーおよび２．５Ｕのホットスタート（ｈｏｔ−ｓｔ
ａｒｔ）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を含有していた。用いた増幅条件
は以下のとおりである：９５℃で２分間の変性、ついで３０サイクル：９５℃で
１分間の変性＋６５℃（第１サイクル）および６２℃（残りのサイクル）で１分
間のハイブリダイゼーション、７２℃で１分間の伸長、７２℃で１０分間の最終
伸長工程。
【０７１７】 ４８または９６個のクローンのプールからの陽性クローンの同定は、固形培地
上の対応親マイクロプレートのレプリカを使用して又は他の標準的な複製方法を
用いて行う。
【０７１８】 ３ サブクローニングおよび配列決定 同定されたクローンのＰＣＲ産物を、以下のプロトコールに従い配列決定する
。該断片をアガロースゲル（ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ））上で精製し、Ｔ
ＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングする。
サブクローンのプラスミドＤＮＡをＢｉｏｒｏｂｏｔ（Ｑｉａｇｅｎ）上でのア
ルカリ細胞溶解により抽出し、０．０２５μｍ ＶＳ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
上で２時間透析する。該サンプルを、ＡＢＩ ３７７ ９６シークエンサー（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で「普遍的（ユニバーサル）」および「リバース」
Ｍ１３プライマーで配列決定する。
【０７１９】 ４）結果 該ＰＣＲプライマーの明確化および実証 酵素活性部位を含む放線菌Ｉ型ＰＫＳの高度に保存された２つの領域を、縮重
プライマーでの相同遺伝子の増幅のために標的化した。これらの２つの領域は、
それぞれ、配列ＰＱＱＲ（Ｌ）（Ｌ）ＬＥおよびＶＥ（Ａ）ＨＧＴＧＴに対応す
る。
【０７２０】 マクロライドを産生する又は産生しない株、すなわち、ストレプトマイセス・
ケリコロール（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプ
トマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ）（スピラマイシンを生産）およびサッカロポリスポラ・エリスラ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）（エリスロマイシン
を生産）のＤＮＡで、プライマー（表８）を試験した。使用したプライマーとは
無関係に、約７００ｂｐの断片に相当する及び予想される断片の長さに対応する
バンドが、それらのすべての株で得られた。
【０７２１】 これらの結果は、ストレプトマイセス・ケリコロール（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌ
ｏｒ）におけるサイレント遺伝子の又は生産株のＰＫＳ Ｉ遺伝子に対するプラ
イマーａおよびｂの特異性を示している。
【０７２２】 ａ１−ａ２プライマーペアで得られたＰＣＲ産物の配列決定は、スピラマイシ
ンのマクロライド前駆体であるプランテノリドの生合成経路に属すると既に記載
されている（欧州特許出願番号ＥＰ ０ ７９１ ６５６）ＫＳ遺伝子の配列を
、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）株
から同定することを可能にした（２つの配列は記載されていない；Ｓｔｒａｍｂ
９およびＳｔｒａｍｂ１２（配列表を参照されたい））。
【０７２３】 サッカロポリスポラ・エリスラ（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）に関しては、該ス
クリーニング方法は、６−デオキシエリスロノリドＢのシンテターゼ１（ＤＥＢ
Ｓ１）をコードするＧｅｎｅｂａｎｋ（アクセッション番号Ｍ６３６７７）にお
いて既に公開されているモジュール１のＫＳの配列と同一であるＫＳの配列（ｓ
ａｃｅｒｙ１７）の同定を可能にした。該エリスロマイシン生合成経路と相関し
ないもう１つの配列を同定した。それを配列番号３２に示す。
【０７２４】 結論 種々の微生物からのＩ型ＰＫＳをコードする遺伝子の存在をＰＣＲにより分析
するための方法を開発した。Ｉ型ケト−シンテターゼドメインの高度に保存され
た構造は、コドンの選択に関するＧＣに偏向（バイアス）した縮重プライマーの
使用に基づくＰＣＲ法を生み出すことを可能にした。
【０７２５】 このアプローチは、Ｉ型ポリケチドの生合成経路に関与する遺伝子またはクラ
スターを同定する可能性を示している。これらの遺伝子のクローニングは、ポリ
ケチドハイブリッドを構築するために後に使用されうる集団の作製を可能にする
。同じ原理を他のクラスの抗生物質に適用することができる。
【０７２６】 ここで得られた結果はまた、サイレントクラスターに属しうる遺伝子の存在を
示している（配列番号３０〜３２）。
【０７２７】 サイレントクラスターの存在はストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）において既に立証されており、それらの発現は特異的または多形質
発現性調節体により誘発される（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉら；Ｕｍｅｙａｍａら
１９９６）。これらの結果は、いわゆるサイレント経路に属する遺伝子の検出が
実際に、該二次代謝産物の合成に必要な酵素的段階を該経路のその他の特異的酵
素と共に指令しうる活性な酵素をコードしていることを示唆している。
【０７２８】 ライブラリーのスクリーニング 生産株から有効性が確認されたプライマーペアを使用して、材料および方法の
節に記載の条件下で、スクリーニングを行った。
【０７２９】 ａ１−ａ２プライマーペアの存在下、４８または９６個のクローンのプールか
ら抽出されたコスミドＤＮＡから得られたＰＣＲ産物のサイズは約７００ｂｐで
あった。したがって、これは、予想された結果と一致している。
【０７３０】 得られたバンドの強度は様々であったが、標的ＤＮＡの各プールに関しては、
ただ１つの増幅バンドが存在した。
【０７３１】 これらの条件下、脱複製（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）後の９個の陽性クロ
ーンに対応する８群の標的ＤＮＡを検出した。
【０７３２】 第２プライマーペアｂ１−ｂ２で行ったスクリーニングは、それほど特異的で
ない増幅結果を与えた。なぜなら、その７００ｂｐのバンドと共に多数の付随（
サテライト）バンドが観察されたからである。それにもかかわらず、これらの陽
性クローンから出発する脱複製（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の後に、１４個
の陽性クローンに対応する９群の標的ＤＮＡが検出された。配列決定およびスト
レプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の形質転換の工程のため
に、該ＤＮＡを抽出した。
【０７３３】 該コスミドの分析 ＡＴに富む部位を認識する酵素ＤｒａＩでの、ＰＣＲにより同定されたコスミ
ドの消化は、２３ｋｂより大きな断片を遊離する（図２２）。これは、該ＰＣＲ
法が、高い割合のＧ＋Ｃを含有する土壌ＤＮＡを優先的に標的とすることを示唆
している。この結果は、該コドンの選択に使用したプライマー（これはＧＣに偏
向（バイアス）している）の縮重によるものである。該インサートは、コスミド
の場合に予想されたとおり、１つの場合（クローンａ９Ｂ１２）を除き２３ｋｂ
より大きなサイズであり、これは、該コスミドの或るレベルの不安定性を反映し
ているであろう。さらに、選択したすべてのクローンのうち、それらの２つ（Ｇ
Ｓ．Ｆ１およびＧＳ．Ｇ１１）だけが、同じ制限プロフィールを示し、このこと
は、該ライブラリーにおける低レベルの重複性を示している。
【０７３４】 選択したコスミドを、ＰＥＧ １０００の存在下のプロトプラストの形質転換
によりストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ）内に導入した。該形質転換効率は、使用したコスミドＤＮＡ １μｇ
当たり３０〜１０００形質転換体の範囲である。
【０７３５】 土壌ＰＫＳ Ｉ遺伝子の配列決定および系統発生的分析 純粋な株に関して開発されたＰＣＲ法を、該ライブラリーのコスミドに関して
記載されているとおりに用い、そのようにして２４個のクローンを同定した。
【０７３６】 ２つのプール（４８個のクローン）および８個の唯一（ユニーク）のクローン
のＤＮＡからの約７００ｂｐのＰＣＲ産物を、アガロースゲル上での精製の後に
クローニングし、配列決定した。これは１１個の配列の同定を可能にした。
【０７３７】 土壌ＰＫＳ Ｉの推定タンパク質配列の、種々の微生物の他のＰＫＳ Ｉに対
するアライメント（図２４）は、β−ケトアシルシンテターゼの活性部位のコン
センサス領域に対応する高度に保存された領域の存在を示している。
【０７３８】 「コドン優先（ｃｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」法（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ
ら，１９８４；Ｂｉｂｂら，１９８４）で得られた配列の分析は、単一のリーデ
ィングフレーム内のＧ＋Ｃに富むコドンの使用における強い偏向（バイアス）の
存在を示した。このリーディングフレームに従い推定されるタンパク質は、公知
Ｉ型ＫＳに対して強い類似性を示している（Ｂｌａｓｔプログラム）。特に、該
土壌からのＫＳの配列と該エリスロマイシンクラスターのＫＳの配列との類似性
は約５３％である。
【０７３９】 プールの脱複製（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）および唯一のクローンの同定
の後、このクローンから得られたＰＣＲ産物の配列は、該プールのものと同一で
あり、このことは、用いた方法の信頼性を証明している。
【０７４０】 クローンのＰＣＲ産物の配列の分析は、３つの異なるＫＳＩ遺伝子の、信頼さ
れうる同定を可能にした。これらの配列の１つ（配列番号３４）は、もう１つの
プールの配列に対して９８．７％の類似性を有し、このことは、それらが同一酵
素をコードしていることを示している。残りの２つの配列は異なるが、強い相同
性を示す。
【０７４１】 Ｉ型ＩＫＳをコードする遺伝子を含有する二次代謝産物の生合成経路の土壌Ｄ
ＮＡライブラリーにおけるクローニングおよび同定は、本発明において初めて記
載されるものである。
【０７４２】 該土壌配列におけるＧ＋Ｃの高い割合は、それらが、放線菌の場合に類似した
コドン使用頻度を有するゲノムに由来しうることを示唆している。
【０７４３】 文献から入手されるデータは限られたものであるが、Ｉ型ＰＫＳをコードする
遺伝子は、該ゲノム内のそれらの物理的体制、サイズおよび各遺伝子内に含有さ
れるモジュール数の点で非常に多様化されていることが公知である。
【０７４４】 単一のクローンに由来する幾つかのドメインの存在は、それらが不斉（非対称
）ポリケチドクラスターに属することを証明するものである。１つの場合には、
２つのクローンはコンティグーム（ｃｏｎｔｉｇｕｕｍ）を形成しているらしい
。なぜなら、それらは、ＫＳドメインの同一配列を共有しているからである。
【０７４５】 ＰＫＳＩの合成に関与する遺伝的領域のサイズは、ペニシリンの数ｋｂからパ
ラマイシンの約１２０ｋｂまでの範囲である。したがって、該コスミドインサー
トのサイズは、ほとんどの複合クラスターの発現には十分でないかもしれない。
【０７４６】 ＰＫＳ ＩＩと同様に反復して作用しうる及び芳香族ポリケチドの合成を制御
しうるＰＫＳ Ｉをコードする遺伝子が既に記載されている（Ｊａｅ−Ｈｙｕｋ
ら，１９９５）。土壌ＰＫＳ Ｉクラスターの研究は、この分野における更なる
新規性を提供しうる。
【０７４７】 ５．ポリケチドシンテターゼをコードする６個の遺伝子の同定 本実施例に記載のプロトコールに従い該コスミドライブラリーのスクリーニン
グを継続したところ、本発明者らは、ポリケチドシンターゼ型のポリペプチドを
コードする幾つかのオープンリーディングフレームを含有する３４０７１ｂｐの
挿入物を含有するコスミドクローンを同定した。
【０７４８】 より詳しくは、該ライブラリーをスクリーニングすることによりこのようにし
て同定されたコスミドは、ポリケチドシンターゼポリペプチドまたは非常に密接
に関連したポリペプチド、非リボソームシンターゼペプチドをコードする６個の
オープンリーディングフレームを含有する。
【０７４９】 該コスミドの完全なヌクレオチド配列は、配列表の配列配列番号１１３を構成
する。配列配列番号１１３に含有されるＤＮＡ挿入物は、種々のポリケチドシン
ターゼをコードするヌクレオチド配列の相補的ヌクレオチド配列（−鎖）を構成
する。
【０７５０】 ポリケチドシンターゼポリペプチドをコードするオープンリーディングフレー
ム（＋鎖）を含む図３６のコスミドに含有されるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配
列を、図３７に図示する。該配列は、配列表の配列配列番号１１４を構成する。
【０７５１】 さらに、このコスミドのＤＮＡ挿入物に含有される種々のオープンリーディン
グフレームの詳細な地図を図３７に示す。
【０７５２】 このコスミドのＤＮＡ挿入物に含有されるオープンリーディングフレームを含
むヌクレオチド配列の特性を、以下に詳しく説明する。
【０７５３】 ＯＲＦ１配列 ｏｒｆ１配列は、４６１５ヌクレオチド長の部分オープンリーディングフレー
ムを含む。この配列は、配列配列番号１１４のヌクレオチド１位から始まりヌク
レオチド４６１５位で終わる配列配列番号１１５を構成する。
【０７５４】 配列配列番号１１５は１５３７アミノ酸のＯＲＦ１ポリペプチドをコードし、
このポリペプチドは配列配列番号１２１を構成する。
【０７５５】 配列配列番号１２１のポリペプチドは、非リボソームシンターゼペプチドに関
連している。このポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいてアクセ
ッション番号「ｅｍｂ ＣＡＣＯ１６０４．１」で照会されるアナベナ（Ａｎａ
ｂａｅｎａ）ｓｐ．９０のシンターゼペプチドに対して３７％のアミノ酸同一性
度を有する。
【０７５６】 ＯＲＦ２配列 ｏｒｆ２ヌクレオチド配列は８３０１ヌクレオチド長であり、配列配列番号１
１４のヌクレオチド４６３３位から始まりヌクレオチド１２９３３位で終わる配
列配列番号１１６を構成する。
【０７５７】 ＯＲＦ２配列は２７６６アミノ酸のＯＲＦ２ペプチドをコードし、このポリペ
プチドは配列配列番号１２２を構成する。
【０７５８】 配列配列番号１２２のポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースからアク
セス番号「ｇｂ ＡＡＦ １９８１２．１」で照合されるスチグマテラ・オーラ
ンチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）のＭｔａＤ配列に
対して４１％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０７５９】 ＯＲＦ２ポリペプチドはポリケチドシンターゼを構成する。
【０７６０】 ＯＲＦ３配列 ｏｒｆ３ヌクレオチド配列は５２９２ヌクレオチド長であり、配列配列番号１
１７を構成する。配列配列番号１１７は、配列配列番号１１４のヌクレオチド１
２９３６位から始まりヌクレオチド１８２２７位で終わる配列に対応する。
【０７６１】 ヌクレオチド配列配列番号１１７は１７６３アミノ酸のＯＲＦ３ポリケチドシ
ンターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは本発明の配列配列番号１
２３を構成する。
【０７６２】 配列配列番号１２３のＯＲＦ３ポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース
からアクセス番号「ｇｂ ＡＡＦ １９８１０．１」で照合されるスチグマテラ
・オーランチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）のＭｔａ
Ｂ配列に対して４２％のアミノ酸同一性を有する。
【０７６３】 ＯＲＦ４配列 ｏｒｆ４ヌクレオチド配列は６４６２ヌクレオチド長であり、本発明の配列配
列番号１１８を構成する。
【０７６４】 ヌクレオチド配列配列番号１１８は、ヌクレオチド配列配列番号１１４のヌク
レオチド１８２２４位から始まりヌクレオチド２４６８５位で終わる配列に対応
する。
【０７６５】 ヌクレオチド配列配列番号１１８は２１５３アミノ酸のＯＲＦ４ポリケチドシ
ンターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは本発明の配列配列番号１
２４を構成する。
【０７６６】 配列配列番号１２４のＯＲＦ４ポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース
からアクセス番号「ｇｂ ＡＡＦ６２８８３．１」で照合されるソランギウム・
セルロスム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）のｅｐｏＤ配列に対
して４６％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０７６７】 ＯＲＦ５配列 ｏｒｆ５ヌクレオチド配列は５０８８ヌクレオチド長であり、本発明の配列配
列番号１１９を構成する。
【０７６８】 配列配列番号１１９は、ヌクレオチド配列配列番号１１４のヌクレオチド２４
６８２位から始まりヌクレオチド２９７６９位で終わる配列に対応する。
【０７６９】 ヌクレオチド配列配列番号１１９は１６９５アミノ酸のＯＲＦ５ポリケチドシ
ンターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは本発明の配列配列番号１
２５を構成する。
【０７７０】 配列配列番号１２５のＯＲＦ５ポリケチドシンターゼポリペプチドは、Ｇｅｎ
ｂａｎｋデータベースからアクセス番号「ｇｂ ＡＡＦ６２８８３．１」で照合
されるソランギウム・セルロシウム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉ
ｕｍ）のｅｐｏｄ配列に対して４３％のアミノ酸同一性を有する。
【０７７１】 ＯＲＦ６配列 ｏｒｆ６ヌクレオチド配列は４３０６ヌクレオチド長であり、本発明の配列配
列番号１２０を構成する。ヌクレオチド配列配列番号１２０は、配列配列番号１
１４のヌクレオチド２９７６６位から始まりヌクレオチド３４０７１位で終わる
配列に対応する。
【０７７２】 配列配列番号１２０は、ポリケチドシンターゼ型の１４３４アミノ酸のＯＲＦ
６ポリペプチドをコードする部分オープンリーディングフレームを含有し、この
ポリペプチドは本発明の配列配列番号１２６を構成する。
【０７７３】 配列配列番号１２６のポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースからアク
セス番号「ｇｂ ＡＡＦ６２８８３．１」で照合されるソランギウム・セルロス
ム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）のｅｐｏＤ配列に対して４３
％のアミノ酸同一性を有する。
【０７７４】 実施例１５：ストレプトマイセスにおける組込み型ＢＡＣタイプのシャトルベ クターの構築 ストレプトマイセスにおける組込み型および接合型ＢＡＣタイプのシャトルベ クターの構築 １５．１ ベクターｐＭＢＤ−１の構築 以下の工程に従い、ベクターＢＡＣ ｐＭＢＤ−１を得た。
【０７７５】 工程１： ベクターｐＯＳＶＯ１０を酵素ＰｓＴＩおよびＢｓｔＺ１７１での消化に付し
て、６．３ｋｂのヌクレオチド断片を得た。
【０７７６】 工程２： ベクターｐＤＮＲ−１を酵素ＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩで消化して、４ ４１
５ｋｂのヌクレオチド断片を得た。
【０７７７】 工程３： ベクターｐＯＳＶ０１７に由来する６．３ｋｂのヌクレオチド断片を、連結に
より、ベクターｐＤＮＲ−１に由来する４．１５ｋｂの断片と融合させて、ベク
ターｐＭＢＤ−１を得た（図３０に示すとおり）。
【０７７８】 １５．２ ベクターｐＭＢＤ−２の構築 ベクターｐＭＢＤ−２は、「φｃ３１ ｉｎｔ−Ωｈｙｇ」組込みボックスを
含有するＢＡＣタイプのベクターである。
【０７７９】 φｃ３１は、十分に位置決定された付着部位（ａｔｔＰ）を有する広い宿主ス
ペクトルのテンペレートファージである。φｃ３１ ｉｎｔ断片は、ストレプト
マイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｌｉｖｉｄａｎｓ）の染色
体内への該プラスミドの組込みを誘導しうるアクチノファージφｃ３１の最小断
片である。
【０７８０】 Ωｈｙｇは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス・リビダンス
（Ｓ．Ｌｉｖｉｄａｎｓ）におけるハイグロマイシン耐性を付与しうるΩインタ
ーポゾン（ｉｎｔｅｒｐｏｓｏｎ）の誘導体である。
【０７８１】 φｃ３１組込み系を含有するＢＡＣベクターは、Ｓｏｓｉｏら（２０００）お
よび１９９９年１２月２９日付け公開のＰＣＴ特許出願第９９／６７３４号に記
載されている。
【０７８２】 以下の工程に従い、ベクターＢＡＣ ｐｍＢＤ−２を構築した。
【０７８３】 工程１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）マルチコピープラスミドにおけるφｃ３１ｉ
ｎｔ Ωｈｙｇ組込みボックスの構築 まず、φｃ３１ｉｎｔ断片を、以下のプライマーのペアを使用してプラスミド
ｐＯＪ４３６から増幅する。
【０７８４】 ・プライマーＥＶφｃ３１Ｉ（配列番号１０９）（これは、該φｃ３１配列の
５’末端内へのＥｃｏＲＶ部位の導入を可能にする）およびプライマーＢＩＩφ
ｃ３１Ｆ（配列番号１１０）（これは、該φｃ３１配列の３’末端内へのＢｇＬ
ＩＩ部位の導入を可能にする）。
【０７８５】 Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ（１９９７）に記載のプラスミドｐＨＰ
４５ Ωｈｙｇの、ＢａｍＨＩ酵素を使用する消化により、該Ωｈｙｇ断片を得
た。
【０７８６】 次に、φｃ３１ ｉｎｔ−Ωｈｙｇ組込みボックスを、酵素ＢｇｌＩＩおよび
ＥｃｏＲＶで消化されたベクターｐＭＣＳ５内にクローニングした。
【０７８７】 工程２：ベクターｐＭＢＤ−２の構築 Ｆｒｅｎｇｅｎら（１９９９）に記載の細菌人工染色体ｐＢＡｃｅ３．６を酵
素ＮｈｅＩで消化し、ついで酵素Ｅｃｏポリメラーゼで処理した。
【０７８８】 次に、ベクターｐＭＣＳ５ φｃ３１ ｉｎｔ−Ωｈｙｇを酵素ＳｎａＢＩお
よびＥｃｏＲＶで消化して、該組込みボックスを回収した。
【０７８９】 ベクターｐＭＢＤ２の詳細な地図を図３１に示す。
【０７９０】 １５．３ ベクターｐＭＢＤ−３の構築 ベクターｐＭＢＤ−３は、選択マーカーΩｈｙｇを含む、ＢＡＣタイプの組込
み型（φｃ３１ ｉｎｔ）および接合型（ＯｒｉＴ）ベクターである。
【０７９１】 ベクターｐＭＢＤ−３の地図およびその構築方法を、図３１に示す。
【０７９２】 ｐａｃＩ制限部位を含有する配列配列番号１１１および配列番号１１２のプラ
イマーのペアを使用して、プラスミドｐＯＪ４３６から出発してＯｒｉＴ遺伝子
を増幅することにより、ベクターｐＭＢＤ−３を得た。
【０７９３】 プライマー配列番号１１１および配列番号１１２を使用して増幅されたヌクレ
オチド断片を、ＰａｃＩ酵素で予め消化されたベクターｐＭＢＤ２内にクローニ
ングした。ベクターｐＭＢＤ−３の構築に関するスキームを図３１に示す。
【０７９４】 １５．４ ベクターｐＭＢＤ−４の構築 ベクターｐＭＢＤ−４の詳細な地図を図３２に示す。
【０７９５】 ベクターｐＭＢＤ−４は、ベクターｐＣＹＴＡＣ２内にφｃ３１ ｉｎｔ−Ω
ｈｙｇ組込みボックスをクローニングすることにより得た。
【０７９６】 １５．５ ベクターｐＭＢＤ−５の構築 ベクターｐＭＢＤ−５の構築に関するスキームを図３３に示す。
【０７９７】 ベクターｐＭＢＤ−５は、図３３に示すベクターｐＭＢＤ−１の２つのｌｏｘ
Ｐ部位間に含まれるヌクレオチド断片を、ｐＢＴＰ３と称されるＢＡＣベクター
内に含有されるｌｏｘＰ部位で組換えることにより構築した。プラスミドｐＢＴ
Ｐ３の詳細な地図を図３４に示す。
【０７９８】 １５．６ ベクターｐＭＢＤ−６の構築 ベクターｐＭＢＤ−１の２つのｌｏｘＰ部位内に含まれるヌクレオチド断片を
ＢＡＣ ｐＢｅｌｏＢａｃ１１ベクターのｌｏｘＰ部位内に組換えることにより
、ベクターｐＭＢＤ−６を構築した（図３５に記載のとおり）。
【０７９９】
【表２】
【０８００】
【表３】
【０８０１】
【表４】
【０８０２】
【表５】
【０８０３】
【表６】
【０８０４】
【表７】
【０８０５】
【表８】
【０８０６】
【表９】
【０８０７】 （参考文献）
【０８０８】
【表１０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例１に記載のプロトコール１、２、３ｎ、４ａ、４ｂ、５ａおよ
び５ｂに従い行う種々の細胞溶解工程のスキームを示す。
【図２】 図２は、種々の細胞溶解処理（プロトコール１〜５、図１を参照されたい）の
後に３００ｍｇの土壌番号３（Ｓｔ Ａｎｄｒｅ海岸）から抽出したＤＮＡの０
．８％アガロースゲル上での電気泳動を示す。Ｍ：ラムダファージ分子量マーカ
ー。
【図３】 図３は、処理１〜５（図１を参照されたい）の後に培養した放線菌類の種々の
属の比率を示す。ｃｆｕ（コロニー形成単位）値は、この群の細菌に選択的な培
地上で測定した。合計約４００個のコロニーを分析した。
【図４】 図４は、粉砕の前（Ｇ）または後（Ｇ＊）に種々の濃度で土壌に加えたＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化したラムダファージＤＮＡの回収を示す。処理Ｔ（熱ショック）
およびＳ（超音波処理）は追加的な細胞溶解処理である。ドットブロットハイブ
リダイゼーション後のホスホイメージャーでの分析により、該定量を行った。各
土壌のサンプルを、加えたラムダファージの各濃度に使用した。該土壌の特徴を
表１に示す。加えた１０〜１５μｇ ｐｆ ＤＮＡに対応するサンプルは処理し
なかった。
【図５】 図５は、プロトコール１、２、３、５ａおよび５ｂに従い土壌番号３から抽出
したＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。常在ストレプトスポランギウム種（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓｐｐ．）を標的化するために、プライマーＦＧＰ
Ｓ １２２およびＦＧＰＳ ３５０（表２）を使用した。該抽出ＤＮＡは、未希
釈で又は１０倍および１００倍の希釈度で使用した。Ｍ：１２３ｂｐの分子量マ
ーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、Ｃ：ＤＮＡを含まない増幅対照。
【図６】 図６は、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＯＳ４８
．３の芽胞または菌糸体を種々の濃度で該土壌に接種した後に抽出されたＤＮＡ
の量を示す。該土壌に加えた菌糸体の量は、発芽培地に接種した芽胞の数に対応
する。該芽胞の約５０％が発芽し、該発芽芽胞菌糸に含まれる細胞またはゲノム
の数は測定しなかった。したがって、接種した芽胞および菌糸体の量は、直接的
には比較され得ない。該抽出プロトコールは、プロトコール６（材料および方法
の節を参照されたい）に従い行った。記号（’）は、該抽出バッファー内にＲＮ
Ａが含まれていたことを示す。該標的ＤＮＡはプライマーＦＧＰＳ ５１６およ
びＦＧＰＳ ５１７でのＰＣＲにより増幅し、該定量は、プローブＦＧＰＳ ５
１８を使用するドットブロットハイブリダイゼーション後のホスホイメージャー
で行った。各土壌のサンプルを菌糸または芽胞の各濃度に使用した。該土壌の特
徴を表１に示す。
【図７−ａ）】 図７は、該土壌ＤＮＡライブラリー内に含まれる１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を培養
参照細菌に対して配置するＮｅｉｇｈｂｏｕｒ Ｊｏｉｎｉｎｇアルゴリズムで
得られた系統樹を表す。グレーの表示：該ライブラリーのクローンのプールから
得られた配列。 １００回の繰返しの再サンプリングの後のブートストラップ値が、集合点に示
されている。目盛り線は、部位当たりの置換の数を示す。Ｇｅｎｂａｎｋデータ
ベース内の配列のアクセス番号が括弧内に示されている。
【図７−ｂ）】 図７は、該土壌ＤＮＡライブラリー内に含まれる１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を培養
参照細菌に対して配置するＮｅｉｇｈｂｏｕｒ Ｊｏｉｎｉｎｇアルゴリズムで
得られた系統樹を表す。グレーの表示：該ライブラリーのクローンのプールから
得られた配列。 １００回の繰返しの再サンプリングの後のブートストラップ値が、集合点に示
されている。目盛り線は、部位当たりの置換の数を示す。Ｇｅｎｂａｎｋデータ
ベース内の配列のアクセス番号が括弧内に示されている。
【図８】 図８は、ベクターｐＯＳｉｎｔ１のスキームを表す。
【図９】 図９は、ベクターｐＷＥＤ１のスキームを表す。
【図１０】 図１０は、ベクターｐＷＥ１５（ＡＴＣＣ番号３７５０３）のスキームを表す
。
【図１１】 図１１は、ベクターｐＯＳ７００Ｉのスキームを表す。
【図１２】 図１２は、ベクターｐＯＳＶ０１０のスキームを表す。
【図１３】 図１３は、ベクターｐＯＳＶ３０３の構築中にプラスミドｐＯＳＶ０１０内に
挿入された「ｃｏｓ」部位を含有する断片を表す。
【図１４】 図１４は、ベクターｐＯＳＶ３０３のスキームを表す。
【図１５】 図１５は、ベクターｐＥ１１６のスキームを表す。
【図１６】 図１６は、ベクターｐＯＳ７００Ｒのスキームを表す。
【図１７】 図１７は、ベクターｐＯＳＶ００１のスキームを表す。
【図１８】 図１８は、ベクターｐＯＳＶ００２のスキームを表す。
【図１９】 図１９は、ベクターｐＯＳＶ０１４のスキームを表す。
【図２０】 図２０は、ベクターｐＢＡＣ１１のスキームを表す。
【図２１】 図２１は、ベクターｐＯＳＶ４０３のスキームを表す。
【図２２】 図２２は、ＰＫＳ−１オリゴヌクレオチドでスクリーニングしたライブラリー
の陽性クローンを酵素ＢａｍＨＩおよびＤｒａＩで消化した後のライブラリーの
ＤＮＡの電気泳動ゲルを表す。
【図２３】 図２３は、エス・アルボニガー（Ｓ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）野生型株の産生と
比較した場合の、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）組
換え体によるピューロマイシンの産生を示す。
【図２４】 図２４は、土壌ＰＫＳと他のＰＫＳの保存された活性部位とのアライメントを
示す。各ペプチドに関する表示内容が示されている。該ベータ−ケトアシルシン
ターゼドメインは、ＧＣＧ ＰＩＬＥＵＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐ
ａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ）を使用して整列（アライン）させた
。
【図２５】 図２５は、組込み型接合型コスミドの構築を示す。
【図２６】 図２６は、組込み型接合型ＢＡＣの構築を示す。
【図２７】 図２７は、ベクターｐＯＳＶ３０８の構築に関するスキームを示す。
【図２８】 図２８は、ベクターｐＯＳＶ３０６の構築に関するスキームを示す。
【図２９】 図２９は、ベクターｐＯＳＶ３０７に関するスキームを示す。
【図３０】 図３０は、ベクターＰＭＢＤ−１の構築に関するスキームを示す。
【図３１】 図３１は、プラスミドｐＭＢＤ−２の詳細な地図およびベクターｐＭＢＤ−３
の構築に関するスキームを示す。
【図３２】 図３２は、プラスミドｐＭＢＤ−４の詳細な地図を示す。
【図３３】 図３３は、プラスミドのｐＭＢＤ−１からのプラスミドｐＭＢＤ−５の構築に
関するスキームを示す。
【図３４】 図３４は、ベクターｐＢＴＰ−３の詳細な地図を示す。
【図３５】 図３５は、ベクターｐＭＢＤ−１からのベクターｐＭＢＤ−６の構築に関する
スキームを示す。
【図３６】 図３６は、コスミドａ２６Ｇ１（そのＤＮＡ挿入体は、いくつかのポリケチド
シンターゼをコードするオープンリーディングフレームを含有する）の地図を示
す。
【図３７】 図３７は、いくつかのポリケチドシンターゼをコードする種々のリーディング
フレームが配置されたコスミドａ２６Ｇ１のＤＮＡ挿入体（＋鎖）を表すスキー
ムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 33/02 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８６ 35/00 37/06 ４Ｃ０８７ 37/06 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/10 9/10 Ｃ１２Ｐ 1/00 Ｚ Ｃ１２Ｐ 1/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 33/573 Ａ 33/573 Ｃ１２Ｒ 1:465 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シモネ，パスカル フランス国、エフ−69100・ビーユルバン ヌ、リユ・ピエール・ボワイアン、55 (72)発明者 クルトワ，ソフイー フランス国、エフ−94220・シヤラント ン・ル・ポン、リユ・ドウ・パリ、165 (72)発明者 カペラノ，カルムラ フランス国、エフ−94120・フオントネ ー・スー・ボア、リユ・ドウ・ヌイイー、 16 (72)発明者 フランク，フランソワ フランス国、エフ−91120・パレゾー、ブ ルバール・ドウ・ロゼール、76 (72)発明者 レナル，アラン フランス国、エフ−91440・ビユル・シユ ール・イベツト、アべニユー・デ・テイイ ユル、52 (72)発明者 バル，マリア ベネズエラ国、メリダ、メリダ・エスタ ド、アパルタメント・42、ピソ・４、エデ フイシオ・10、レスケマル・カルデナル・ キンテロ、アベニユー・カルデナル・キイ ンテラ (72)発明者 スゾノ，グナデイ フランス国、エフ−75002・パリ、リユ・ サン・ソブール、16 (72)発明者 テユフイル，カリーヌ フランス国、エフ−91400・オルセー、ブ ルバール・ドユブルイーユ、39／41 (72)発明者 フロステガード，アサ ノルウエー国、エヌ−1450・ネソドタンゲ ン、フレテバイ・スコーゴスビイ・７ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 BA67 CA03 CA09 CA20 DA06 DA08 DA11 DA12 EA06 FA15 GA16 HA03 HA12 4B050 CC01 CC03 DD01 EE10 LL01 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ06 QQ07 QQ13 QQ15 QQ19 QQ20 QQ98 QR56 QR62 QR75 QR76 QR80 QS24 QS25 4B064 AE41 AF54 CA05 CA06 CA19 CC24 DA01 DA02 4B065 AA26X AA50X AA50Y AA58X AA72X AB01 AC14 BA02 CA29 CA34 CA44 4C086 AA01 AA04 FA02 MA02 MA05 NA14 ZB32 ZB35 ZB37 4C087 AA01 AA03 BC01 BC15 BC30 CA11 CA12 CA13 CA22 MA01 NA14 ZB32 ZB35 ZB37 4H045 AA11 AA30 CA11 DA75 EA50 FA71

Claims (81)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物を含有する土壌サンプルからの核酸の集団の製造方法で
    あって、以下の順序の工程、すなわち、 Ｉ（ａ）予備乾燥または予備脱水された土壌サンプルを粉砕することにより微
    粒子を得、ついで該微粒子を液体緩衝媒体に懸濁させる工程、 （ｂ）該微粒子中に存在する核酸を抽出する工程、 （ｃ）該核酸を含有する溶液をモレキュラーシーブ上に通過させ、ついで、
    核酸に富む溶出画分を回収し、核酸に富む溶出画分を陰イオン交換クロマトグラ
    フィー担体上に通過させ、ついで、その精製された核酸を含有する溶出画分を回
    収する工程を含んでなる製造方法。
  2. 【請求項２】 生物を含有する環境サンプルからの核酸の集団の製造方法で
    あって、以下の順序の工程、すなわち、 ＩＩ（ｉ）該環境サンプルを液体媒体中に分散させることにより懸濁液を得、つ
    いで該懸濁液を穏やかな攪拌によりホモジナイズ（均質化）する工程、 （ｉｉ）該生物と、工程（ｉ）で得られた均質懸濁液のその他の無機および／
    または有機構成成分とを、密度勾配上の遠心分離により分離する工程、 （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で分離された生物を細胞溶解し、該核酸を抽出する工
    程、 （ｉｖ）塩化セシウム勾配上で該核酸を精製する工程を含んでなる製造方法。
  3. 【請求項３】 工程Ｉ−（ａ）の後に、液体バッファーに懸濁させた微粒子
    を超音波処理により処理する追加的工程が続く、請求項１記載の製造方法。
  4. 【請求項４】 工程Ｉ−（ａ）の後に、以下の追加的工程、すなわち、 ・液体バッファーに懸濁させた微粒子を超音波処理により処理する工程、 ・超音波処理後、リゾチームおよびアクロモペプチダーゼの存在下、該懸濁液
    を３７℃でインキュベートする工程、 ・ＳＤＳを加える工程、 ・該核酸を回収する工程が続く、請求項１記載の製造方法。
  5. 【請求項５】 工程Ｉ−（ａ）の後に、以下の追加的工程、すなわち、 ・激しい混合（ボルテックス）の工程およびそれに続く単純な攪拌の工程によ
    り、該微粒子をホモジナイズ（均質化）する工程、 ・該均質懸濁液を凍結させ、ついで融解する工程、 ・融解後、該懸濁液を超音波処理により処理する工程、 ・超音波処理後、リゾチームおよびアクロモペプチダーゼの存在下、該懸濁液
    を３７℃でインキュベートする工程、 ・ＳＤＳを加える工程が続く、請求項１記載の製造方法。
  6. 【請求項６】 該核酸がＤＮＡ分子である、請求項１〜５のいずれか１項記
    載の製造方法。
  7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法により得られた
    核酸をクローニングおよび／または発現ベクター内に挿入することを特徴とする
    、組換えベクターの集団の製造方法。
  8. 【請求項８】 クローニングおよび／または発現ベクター内に該核酸を挿入
    する前に、該核酸をそれらのサイズに応じて分離する、請求項７記載の製造方法
    。
  9. 【請求項９】 該クローニングおよび／または発現ベクター内への該核酸の
    挿入の前に、物理的な破壊により該核酸の平均サイズを実質的に均一にする、請
    求項７記載の製造方法。
  10. 【請求項１０】 該クローニングおよび／または発現ベクターがファスミド
    型のものである、請求項７記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】 該クローニングおよび／または発現ベクターがコスミド型
    のものである、請求項７記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】 それが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においては複製型であり
    ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）においては組込み型であるコ
    スミドである、請求項１１記載の製造方法。
  13. 【請求項１３】 それがコスミドｐＯＳ７００Ｉである、請求項１２記載の
    製造方法。
  14. 【請求項１４】 それが、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ）において接合型および組込み型であるコスミドである、請求項１記載の製造方
    法。
  15. 【請求項１５】 該コスミドが、コスミドｐＯＳＶ３０３、ｐＯＳＶ３０６
    およびｐＯＳＶ３０７から選ばれる、請求項１４記載の製造方法。
  16. 【請求項１６】 それが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセ
    ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の両方において複製型のコスミドである、請求
    項１１記載の製造方法。
  17. 【請求項１７】 それがコスミドｐＯＳ７００Ｒである、請求項１６記載の
    製造方法。
  18. 【請求項１８】 それが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセ
    ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において複製型でありストレプトマイセス（Ｓ
    ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において接合型であるコスミドである、請求項１１記
    載の製造方法。
  19. 【請求項１９】 該クローニングおよび／または発現ベクターがＢＡＣタイ
    プのものである、請求項７記載の製造方法。
  20. 【請求項２０】 それが、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ）において組込み型および接合型であるＢＡＣベクターである、請求項１９記載
    の製造方法。
  21. 【請求項２１】 該ベクターが、ＢＡＣベクターｐＯＳＶ４０３、ｐＭＢＤ
    −１、ｐＭＢＤ−２、ｐＭＢＤ−３、ｐＭＢＤ−４、ｐＭＢＤ−５およびｐＭＢ
    Ｄ−６から選ばれる、請求項２０記載の製造方法。
  22. 【請求項２２】 組換えクローニングおよび／または発現ベクターの製造方
    法であって、該クローニングおよび／または発現ベクター内に核酸を挿入する工
    程が、 ・適当な制限エンドヌクレアーゼを使用して、選択されたクローニング部位で
    該クローニングおよび／または発現ベクターを開裂する工程、 ・その開いたベクターの遊離３’末端において第１ホモポリマー核酸を付加す
    る工程、 ・該ベクター内に挿入される集団からの核酸の遊離３’末端において、該第１
    ホモポリマー核酸に相補的な配列を有する第２ホモポリマー核酸を付加する工程
    、 ・互いに相補的な配列の第１および第２ホモポリマー核酸をハイブリダイズさ
    せることにより、該ベクターの核酸と該集団の核酸とを集合させる工程、 ・連結により該ベクターを閉じる工程を含むことを特徴とする製造方法。
  23. 【請求項２３】 ・該第１ホモポリマー核酸がポリ（Ａ）またはポリ（Ｔ）
    配列のものであり、 ・該第２ホモポリマー核酸がポリ（Ｔ）またはポリ（Ａ）配列のものである、
    請求項２２記載の製造方法。
  24. 【請求項２４】 挿入される核酸のサイズが少なくとも１００キロベース、
    好ましくは、少なくとも２００キロベースである、請求項２２または２３記載の
    組換えベクターの製造方法。
  25. 【請求項２５】 挿入される核酸が、請求項１〜６のいずれか１項記載の製
    造方法により得られた核酸の集団に含まれる、請求項２２〜２４のいずれか１項
    記載の製造方法。
  26. 【請求項２６】 組換えクローニングおよび／または発現ベクターの製造方
    法であって、該クローニングおよび／または発現ベクター内に核酸を挿入する工
    程が、 ・突出３’配列を除去し突出５’配列をフィルインする（埋める）ことにより
    、該集団の核酸の末端上に平滑末端を作製する工程、 ・適当な制限エンドヌクレアーゼを使用して、選択されたクローニング部位に
    おいて該クローニングおよび／または発現ベクターを開裂する工程、 ・突出３’配列を除去し突出５’配列をフィルインすることにより、該ベクタ
    ー核酸の末端において平滑末端を作製し、ついで５’末端を脱リン酸化する工程
    、 ・相補的オリゴヌクレオチドアダプターを付加する工程、 ・該集団の核酸を該ベクター内に連結により挿入する工程を含むことを特徴と
    する製造方法。
  27. 【請求項２７】 挿入される核酸のサイズが少なくとも１００キロベース、
    好ましくは、少なくとも２００キロベースである、請求項２６記載の組換えベク
    ターの製造方法。
  28. 【請求項２８】 挿入される核酸が、請求項１〜６のいずれか１項記載の製
    造方法により得られた核酸の集団に含まれる、請求項２６または２７記載の製造
    方法。
  29. 【請求項２９】 該核酸を該クローニングおよび／または発現ベクター内に
    挿入する前に１以上の制限エンドヌクレアーゼで処理することなく、該核酸を、
    得られたままの状態で挿入する、請求項２２〜２８のいずれか１項記載の製造方
    法。
  30. 【請求項３０】 請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法により得られ
    た核酸よりなる核酸の集団。
  31. 【請求項３１】 請求項３０記載の核酸の集団に含まれる核酸。
  32. 【請求項３２】 少なくとも１つのオペロンまたはオペロンの一部をコード
    するヌクレオチド配列を含む、請求項３１記載の核酸。
  33. 【請求項３３】 該オペロンが代謝経路の全部または一部をコードする、請
    求項３２記載の核酸。
  34. 【請求項３４】 該代謝経路がポリケチド合成経路である、請求項３３記載
    の核酸。
  35. 【請求項３５】 配列配列番号３０〜４４および配列番号１１５〜１２０を
    含むポリヌクレオチドから選ばれる、請求項３４記載の核酸。
  36. 【請求項３６】 ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の全部を含む
    、請求項３１記載の核酸。
  37. 【請求項３７】 原核生物に由来する、請求項３１〜３６のいずれか１項記
    載の核酸。
  38. 【請求項３８】 細菌またはウイルスに由来する、請求項３７記載の核酸。
  39. 【請求項３９】 真核生物に由来する、請求項３１〜３３および３６のいず
    れか１項記載の核酸。
  40. 【請求項４０】 真菌、酵母、植物または動物に由来する、請求項３９記載
    の核酸。
  41. 【請求項４１】 以下の組換えベクター： ａ）請求項３５〜４０のいずれか１項記載の核酸を含むベクター、 ｂ）請求項２２〜２５および２９のいずれか１項記載の製造方法により得られ
    たベクター、 ｃ）請求項２６〜２９のいずれか１項記載の製造方法により得られたベクター
    から選ばれることを特徴とする組換えベクター。
  42. 【請求項４２】 コスミドｐＯＳ７００Ｉであることを特徴とするベクター
    。
  43. 【請求項４３】 コスミドｐＯＳＶ３０３であることを特徴とするベクター
    。
  44. 【請求項４４】 コスミドｐＯＳＶ３０６であることを特徴とするベクター
    。
  45. 【請求項４５】 コスミドｐＯＳＶ３０７であることを特徴とするベクター
    。
  46. 【請求項４６】 コスミドｐＯＳ７００Ｒであることを特徴とするベクター
    。
  47. 【請求項４７】 ＢＡＣベクターｐＯＳＶ４０３であることを特徴とするベ
    クター。
  48. 【請求項４８】 ベクターｐＭＢＤ−１であることを特徴とするベクター。
  49. 【請求項４９】 ベクターｐＭＢＤ−２であることを特徴とするベクター。
  50. 【請求項５０】 ベクターｐＭＢＤ−３であることを特徴とするベクター。
  51. 【請求項５１】 ベクターｐＭＢＤ−４であることを特徴とするベクター。
  52. 【請求項５２】 ベクターｐＭＢＤ−５であることを特徴とするベクター。
  53. 【請求項５３】 ベクターｐＭＢＤ−６であることを特徴とするベクター。
  54. 【請求項５４】 請求項７〜２１、２５および２８のいずれか１項記載の製
    造方法により得られた組換えベクターの集団。
  55. 【請求項５５】 請求項５４記載の組換えベクターの集団に含まれることを
    特徴とする組換えクローニングおよび／または発現ベクター。
  56. 【請求項５６】 請求項３１〜４０のいずれか１項記載の核酸または請求項
    ５５記載の組換えベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
  57. 【請求項５７】 原核性または真核性細胞である、請求項５６記載の組換え
    宿主細胞。
  58. 【請求項５８】 細菌である、請求項５７記載の組換え宿主細胞。
  59. 【請求項５９】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（Ｓｔ
    ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選ばれる細菌である、請求項５８記載の組換え宿主
    細胞。
  60. 【請求項６０】 酵母または糸状菌である、請求項５８記載の組換え宿主細
    胞。
  61. 【請求項６１】 組換え宿主細胞の集団であって、該集団の構成宿主細胞の
    それぞれが、請求項３０記載の核酸の集団からの核酸を含むことを特徴とする組
    換え宿主細胞の集団。
  62. 【請求項６２】 組換え宿主細胞の集団であって、該集団の構成宿主細胞の
    それぞれが、請求項４１または５５記載の組換えベクターを含むことを特徴とす
    る組換え宿主細胞の集団。
  63. 【請求項６３】 請求項６１または６２記載の組換え宿主細胞の集団におけ
    る、与えられたヌクレオチド配列の核酸、または与えられたヌクレオチド配列に
    構造的に類似したヌクレオチド配列の核酸を検出するための方法であって、 ・組換え宿主細胞の集団を、その与えられたヌクレオチド配列にハイブリダイ
    ズするプライマーのペア、または与えられたヌクレオチド配列に構造的に類似し
    たヌクレオチド配列にハイブリダイズするプライマーのペアと接触させる工程、 ・少なくとも３つの増幅サイクルを行う工程、 ・増幅された核酸を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
  64. 【請求項６４】 請求項６１または６２記載の組換え宿主細胞の集団におけ
    る、与えられたヌクレオチド配列の核酸、または与えられたヌクレオチド配列に
    構造的に類似したヌクレオチド配列の核酸を検出するための方法であって、 ・組換え宿主細胞の集団を、その与えられたヌクレオチド配列にハイブリダイ
    ズするプローブ、またはその与えられたヌクレオチド配列に構造的に類似したヌ
    クレオチド配列にハイブリダイズするプローブと接触させる工程、 ・該プローブと該集団のベクター内に含まれる核酸との間で形成されうるハイ
    ブリッドを検出する工程を含むことを特徴とする方法。
  65. 【請求項６５】 請求項６１または６２記載の組換え宿主細胞の集団内の１
    以上の組換え宿主細胞による関心のある化合物の産生を同定するための方法であ
    って、 ・該集団の組換え宿主細胞を適当な培地内で培養する工程、 ・培養した１以上の組換え細胞の培養上清または細胞ライセート内の関心のあ
    る化合物を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
  66. 【請求項６６】 請求項６１または６２記載の組換え宿主細胞の集団におい
    て、関心のある化合物を産生する組換え宿主細胞を選択するための方法であって
    、 ・該集団の組換え宿主細胞を適当な培地内で培養する工程、 ・培養した１以上の組換え宿主細胞の培養上清または細胞ライセート内の関心
    のある化合物を検出する工程、 ・関心のある化合物を産生する組換え宿主細胞を選択する工程を含むことを特
    徴とする方法。
  67. 【請求項６７】 ・請求項６６記載の方法により選択された組換え宿主細胞
    を培養する工程、 ・該組換え宿主細胞により産生された化合物を回収し、適当な場合には精製す
    る工程を含むことを特徴とする、関心のある化合物の製造方法。
  68. 【請求項６８】 請求項６７記載の製造方法により得られた関心のある化合
    物。
  69. 【請求項６９】 ポリケチドである、請求項６８記載の化合物。
  70. 【請求項７０】 配列配列番号３０〜４４および配列番号１１５〜１２０か
    ら選ばれる配列を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を発現させることによ
    り製造されることを特徴とするポリケチド。
  71. 【請求項７１】 請求項６９または７０記載のポリケチドを含んでなる組成
    物。
  72. 【請求項７２】 薬理学的に活性な量の請求項６９または７０記載のポリケ
    チドと、医薬上許容されるビヒクルとを含んでなる医薬組成物。
  73. 【請求項７３】 核酸の集団、特に、環境サンプル、好ましくは土壌サンプ
    ルに由来する核酸の集団に含まれる核酸の多様性を測定するための方法であって
    、 ・試験する核酸の集団の核酸を、細菌１６ＳリボソームＤＮＡのいずれかの配
    列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーのペアと接触させる工程
    、 ・少なくとも３つの増幅サイクルを行う工程、 ・１つのオリゴヌクレオチドプローブまたは複数のオリゴヌクレオチドプロー
    ブ（各プローブは、細菌の界、目、亜綱または属に共通の１６ＳリボソームＤＮ
    Ａの配列に特異的にハイブリダイズする）を使用して、該増幅核酸を検出する工
    程、 ・適当な場合には、前記検出工程からの結果を、検量範囲を構成する既知配列
    の核酸に関する該プローブまたは前記の複数のプローブを使用した場合の検出結
    果と比較する工程を含んでなる方法。
  74. 【請求項７４】 細菌１６ＳリボソームＤＮＡのいずれかの配列にハイブリ
    ダイズするプライマーのペアがプライマーＦＧＰＳ ６１２（配列番号１２）お
    よびプライマーＦＧＰＳ ６６９（配列番号１３）よりなる、請求項７３記載の
    方法。
  75. 【請求項７５】 細菌１６ＳリボソームＤＮＡのいずれかの配列にハイブリ
    ダイズするプライマーのペアがプライマー６３ｆ（配列番号２２）およびプライ
    マー１３８７ｒ（配列番号２３）よりなる、請求項７３記載の方法。
  76. 【請求項７６】 配列配列番号６０〜配列番号１０６に対して少なくとも９
    ９％のヌクレオチド同一性を有する配列から選ばれる１６Ｓ ｒＤＮＡヌクレオ
    チド配列を含んでなる核酸。
  77. 【請求項７７】 ・配列配列番号３３〜配列番号４４および配列番号３０〜
    配列番号３２および配列番号１１５〜配列番号１２０から選ばれるヌクレオチド
    配列を含むＩ型ポリケチドシンターゼをコードする核酸を含む組換え宿主細胞を
    製造する工程、 ・適当な培地内で該組換え宿主細胞を培養する工程、 ・該培養上清または該細胞ライセートから該Ｉ型ポリケチドシンターゼを回収
    し、適当な場合には精製する工程を含んでなる、Ｉ型ポリケチドシンターゼの製
    造方法。
  78. 【請求項７８】 配列配列番号４５〜５９および配列番号１２１〜配列番号
    １２６から選ばれるアミノ酸配列を含んでなるポリケチドシンターゼ。
  79. 【請求項７９】 請求項７８記載のポリケチドシンターゼに対する抗体。
  80. 【請求項８０】 サンプル中のＩ型ポリケチドシンターゼまたはこの酵素の
    ペプチド断片を検出するための方法であって、 ａ）請求項７９記載の抗体を該被検サンプルと接触させる工程、 ｂ）形成された可能性がある抗原／抗体複合体を検出する工程を含んでなる方
    法。
  81. 【請求項８１】 ａ）請求項７９記載の抗体、 ｂ）適当な場合には、形成した可能性がある抗原／抗体複合体を検出するのに
    必要な試薬を含んでなる、サンプル中のＩ型ポリケチドシンターゼを検出するた
    めのキット。
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