IT202000012496A1 - Sonda per la rivelazione di infezioni batteriche - Google Patents
Sonda per la rivelazione di infezioni batteriche Download PDFInfo
- Publication number
- IT202000012496A1 IT202000012496A1 IT102020000012496A IT202000012496A IT202000012496A1 IT 202000012496 A1 IT202000012496 A1 IT 202000012496A1 IT 102020000012496 A IT102020000012496 A IT 102020000012496A IT 202000012496 A IT202000012496 A IT 202000012496A IT 202000012496 A1 IT202000012496 A1 IT 202000012496A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- probe
- sample
- dna
- bodipy
- detection
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 57
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 title description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 239
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 48
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 claims description 45
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 29
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 claims description 27
- 241000589986 Campylobacter lari Species 0.000 claims description 27
- 241001135528 Campylobacter upsaliensis Species 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 14
- QOFZZTBWWJNFCA-UHFFFAOYSA-N texas red-X Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(=O)(=O)NCCCCCC(=O)O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 QOFZZTBWWJNFCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 11
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims description 10
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 8
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 claims description 8
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 7
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 7
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 6
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 claims description 6
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 5
- CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N cascade blue Chemical compound C=1C2=CC=CC=C2C(NCC)=CC=1C(C=1C=CC(=CC=1)N(CC)CC)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 5
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 claims description 5
- XLXOKMFKGASILN-UHFFFAOYSA-N rhodamine red-X Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(=O)(=O)NCCCCCC(O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O XLXOKMFKGASILN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 5
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 4
- 239000010865 sewage Substances 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 3
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 claims description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 3
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 claims description 3
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 claims description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 2
- 239000003621 irrigation water Substances 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 63
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 45
- 102100025707 Cytosolic carboxypeptidase 3 Human genes 0.000 description 41
- 101000932588 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 3 Proteins 0.000 description 41
- 101001033009 Mus musculus Granzyme E Proteins 0.000 description 41
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 40
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 35
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 33
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 241000589874 Campylobacter fetus Species 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 14
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 241000186805 Listeria innocua Species 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 206010051226 Campylobacter infection Diseases 0.000 description 6
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 201000004927 campylobacteriosis Diseases 0.000 description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 5
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 4
- 241001602730 Monza Species 0.000 description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 239000006781 columbia blood agar Substances 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001135165 Arcobacter cryaerophilus Species 0.000 description 3
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 3
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- VUSHQLWDOJFSGF-UHFFFAOYSA-L disodium 3-carboxy-3,5-dihydroxy-5-oxopentanoate chloride Chemical compound [Na+].[Na+].Cl.[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O VUSHQLWDOJFSGF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 3
- 241001135164 Arcobacter butzleri Species 0.000 description 2
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000186780 Listeria ivanovii Species 0.000 description 2
- 241001120504 Listeria marthii Species 0.000 description 2
- 241000186807 Listeria seeligeri Species 0.000 description 2
- 241000186814 Listeria welshimeri Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO.OC1=CC=CC=C1 ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000015219 food category Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000003380 quartz crystal microbalance Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006158 Baird–Parker agar Substances 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 241001453245 Campylobacter jejuni subsp. jejuni Species 0.000 description 1
- 241000158918 Campylobacter lari subsp. lari Species 0.000 description 1
- 241001248433 Campylobacteraceae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 241001490623 Helicobacter suis Species 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033464 Reiter syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- YVIGPQSYEAOLAD-UHFFFAOYSA-L disodium;dodecyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCCCCCCCCOP([O-])([O-])=O YVIGPQSYEAOLAD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 244000078673 foodborn pathogen Species 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 235000014122 turkey meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
SONDA PER LA RIVELAZIONE DI INFEZIONI BATTERICHE
La presente invenzione riguarda una sonda nucleotidica specifica per Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari e Campylobacter upsaliensis, suoi usi e metodi per la rivelazione di detti microorganismi in un campione di interesse e kit comprendenti detta sonda e opportuni reagenti.
STATO DELLA TECNICA
Le zoonosi sono infezioni o malattie che possono essere trasmesse direttamente o indirettamente tra animali e umani.
Le zoonosi di origine alimentare sono causate, ad esempio, dal consumo di alimenti contaminati o dal contatto con animali infetti.
Le malattie di origine alimentare rappresentano una minaccia significativa e diffusa per la salute pubblica, in particolare per le persone molto giovani e anziane, nonch? per le donne in gravidanza e le persone sensibili a un sistema immunitario indebolito. Circa 246.571 casi umani di malattia di origine alimentare sono confermati con un tasso di 64,1 per 100.000 abitanti nell'Unione Europea. L'EFSA (2019) presenta il rapporto di casi umani confermati di 14 zoonosi, la maggior parte sono causati da Campylobacter spp., Salmonella, Yersinia, Listeria monocytogenes, Escherichia coli e Brucella. La campilobatteriosi ? stata la pi? comune dal 2005, con un numero maggiore di casi confermati e ospedalizzati.
Inoltre, i focolai generano costi sanitari di milioni di euro, problemi di salute pubblica e perdite di prodotti agricoli. In Europa, solo il costo della salute pubblica causato da questa malattia ? di 2,4 miliardi di euro all'anno (EFSA, 2014).
I patogeni umani si trovano comunemente nell'intestino di animali sani utilizzati per la produzione di alimenti. I rischi di contaminazione sono presenti dall'azienda agricola alla tavola e richiedono prevenzione e controllo durante l'analisi degli alimenti. Le autorit? sanitarie pubbliche hanno istituito misure e regolamenti rigorosi per i sistemi di controllo degli alimenti come il sistema di controllo dei punti critici di analisi dei pericoli (HACCP) al fine di prevenire la diffusione di questi agenti patogeni di origine alimentare a livello della trasformazione degli alimenti. L'HACCP ? un metodo di garanzia della sicurezza alimentare basato sull'applicazione di buone pratiche igieniche e identifica le misure di controllo necessarie nelle operazioni alimentari e nelle pratiche igieniche. Pertanto, il rilevamento di batteri patogeni di origine alimentare ? un parametro cruciale per la prevenzione e il controllo di alcuni punti pericolosi nella lavorazione degli alimenti.
Campylobacter ? un batterio Gram-negativo appartenente alla famiglia delle Campylobacteraceae, ben noto in tutto il mondo per essere un patogeno che causa gastroenterite nell'uomo.
Il Campylobacter ? un patogeno in grado di proliferare sia negli animali, in particolare pollame e suini, sia nell'uomo, sebbene con meccanismi di invasione simili ma non identici. Campylobacter jejuni e Campylobacter coli trovati nel tratto gastrointestinale di diverse specie animali rappresentano circa il 90% di tutti i Campylobacter batterici diagnosticati nell'uomo nell'UE. Oltre a queste specie, C. upsaliensis, C. lari e C. fetus sono anche responsabili di questa patogenicit?. In alcuni casi sporadici, Campylobacter pu? anche essere il precursore di malattie gravi, come la sindrome di Reiter, la sindrome del colon irritabile, la sindrome di Guillain-Barr? e la sindrome di Miller-Fisher, una forma di paralisi cronica e potenzialmente fatale.
Il regolamento n. 2073/2005 della Commissione europea che stabilisce criteri microbiologici per specifiche categorie alimentari ? stato modificato con il regolamento della Commissione (UE) 2017/1495 che ha aggiunto le carcasse di polli da carne come nuova categoria alimentare e ha introdotto un processo di criteri di igiene per Campylobacter. I criteri per Campylobacter spp. sono impostati come ?1000 CFU / g nella carcassa del pollo dopo il raffreddamento.
Invece, il regolamento UE n.2073/2005 per i prodotti alimentari sul mercato stabilisce criteri microbici per l'agente patogeno che deve essere assente in 25 g di campione. Dal 2005, Campylobacter spp. ha continuato ad essere il batterio della malattia gastrointestinale pi? comunemente riportato nell'uomo nell'Unione europea, con un numero di casi di campilobatteriosi umana di 246.517 (EFSA, 2019). Nonostante l'elevato numero di casi di campilobatteriosi umana, nei casi segnalati di mortalit? era bassa (0,03%). Tra il 2013 e il 2017 c'? stata una chiara stagionalit? nel numero di casi confermati di campilobatteriosi segnalati con un picco nei mesi estivi. Il rapporto EFSA 2019 ha evidenziato che per il 55% dei casi confermati di campilobatteriosi nell'UE, sono state attribuite alle specie: per il 83,9% C. jejuni, per il 10,3% C. coli, per il 0,1% C. lari, per lo 0,1% C. upsaliensis e per lo 0,1% C. fetus.
La campilobatteriosi si verifica dopo aver mangiato cibi contaminati. La fonte minore ? il latte e i prodotti lattiero-caseari, incluso il formaggio, presentano con un'incidenza inferiore allo 0,6%. Invece, la presenza di Campylobacter nella carne fresca ? elevata, il 37,5% per i polli da carne, il 28,2% per la carne di tacchino 23.8% per carne di pollame, 5.8% per la carne di suino e 0,5% per la carne bovina.
Il metodo standard ISO 10272-1: 2006 per la rilevazione di Campylobacter spp., recentemente sostituito dalla versione ISO 10272-1: 2017, non era ottimale per il rilevamento del batterio in matrici alimentari con una ricca flora microbica contaminante. Pertanto, sono state effettuate le seguenti modifiche principali: il metodo di rilevazione ? stato esteso per includere l'opzione di un secondo brodo di arricchimento (brodo Preston); la scelta di un brodo di arricchimento appropriato ? un passo importante. Il brodo Bolton (BB) ? in grado di rivitalizzare il Campylobacter spp. rispetto a Preston Broth. Di recente, sono stati condotti studi mirati a migliorare la selettivit? del brodo di arricchimento.
Nuovi metodi e mezzi per la rivelazione del Campylobacter spp., soprattutto che permettano di rilevare in modo specifico le specie di maggiore interesse dal punto di vista sanitario, sono di particolare interesse per le industrie alimentari e per la salute pubblica.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
L?obiettivo principale di questa invenzione ? fornire nuovi strumenti per l?analisi e la rilevazione di Campylobacter spp. per consentire una diagnosi veloce e sensibile della sua presenza in alimenti; o in campioni biologici umani o animali o anche in campioni ambientali. La presente invenzione fornisce mezzi e metodi per , un?analisi che dia una risposta veloce mantenendo bassi i costi, lo sviluppo di nuovi strumenti d?indagine che sostituiscano quelli attualmente a disposizione permettendo una riduzione del tempo impiegato e della complessit? della strumentazione di laboratorio e delle procedure, permettendo inoltre una miniaturizzazione dei dispositivi necessari per detta analisi con maggiore facilit? d?utilizzo e di portabilit? per lo sviluppo di un point of care (POC).
Infatti, i LOC (Lab on Chip) suscitano grande interesse in ambito agroalimentare e nel monitoraggio ambientale, per esempio per monitorare la sicurezza degli alimenti lungo la filiera alimentare e nel monitoraggio ambientale, per prevenire le contaminazioni ambientali.
La presente invenzione fornisce una sonda nucleotidica specifica per Camplylobacter jejuni, C. coli, C. upsaliensis e C. lari, che permette di identificare tali microorganismi in campioni di interesse in maniera rapida e specifica.
La presente invenzione, tramite la sonda avente SEQ ID NO 1, fornisce una alternativa pi? pratica al metodo classico di isolamento del Campylobacter effettuato con il metodo ufficiale ISO:10272- 2017 permettendo di effettuare una Ibridazione diretta della sonda senza la necessit? di ricorrere ad una amplificazione e fornisce risultati con alta specificit?, permettendo di ridurre il tempo di analisi per l?ottenimento del risultato.
Sono quindi oggetto dell?invenzione:
una sonda nucleotidica avente SEQ ID NO 1;
un metodo per la rilevazione di uno o pi? tra C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis in un campione comprendente:
un passaggio di estrazione di DNA da detto campione
un passaggio di ibridazione del DNA estratto da detto campione con la sonda nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 e
un passaggio di rivelazione dell?ibridazione di detta sonda a detto DNA, in cui la rivelazione di una avvenuta ibridazione di detta sonda a detto DNA ? indice della presenza di almeno una tra C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis in detto campione;
un elettrodo per biosensore su cui sono immobilizzate sonde oligonucleotidiche aventi SEQ ID NO 1;
un biosensore comprendente detto elettrodo;
un kit comprendente una o pi? aliquote di sonda oligonucleotidica avente SEQ ID NO 1 ed eventuali altri opportuni reagenti; e
l?uso della sonda come definita nella presente descrizione e nelle rivendicazioni o dell?elettrodo come definito nella presente descrizione e nelle rivendicazioni, o del biosensore come definit0 nella presente descrizione e nelle rivendicazioni o del kit come definito nella presente descrizione e nelle rivendicazioni per la rivelazione di C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis in un campione.
GLOSSARIO
Per ibridazione nella presente descrizione e nello stato della tecnica s?intende una tecnica che sfrutta la capacit? di acidi nucleici a singolo filamento, che presentino complementariet? parziale o totale tra loro di formare molecole a doppio filamento mediante l?appaiamento delle basi complementari. Un Saggio di ibridazione ? un esperimento in cui una popolazione ben caratterizzata di brevi sequenze di acidi nucleici a singolo filamento, o oligonucleotidi (denominati sonda), sono utilizzate per cercare sequenze bersaglio (complementari) in una popolazione sequenze di acidi nucleici utilizzate come bersaglio con le quali formare un doppio filamento.
La complementariet? delle basi secondo la presente descrizione e nello stato della tecnica definisce il grado col quale le sequenze di due molecole di acido nucleico a singolo filamento sono in grado di formare molecole a doppio filamento mediante appaiamento obbligatorio delle basi azotate descritto dalle regole di Watson-Crick (A appaiata a T o U; C appaiata a G).
Ibridazione in situ secondo la presente descrizione e nello stato della tecnica definisce una reazione di ibridazione in cui un oligonucleotide (sonda) marcato mediante legame di un nucleotide della sonda stessa con una molecola che permetta la rivelazione di molecole di acido nucleico bersaglio in un campione di interesse, permettendo quindi di rivelare la presenza o meno di dette molecole bersaglio, complementari a detta sonda, nel campione analizzato.
Microarray definisce una superficie solida sulla quale possono essere immobilizzate, secondo specifiche coordinate, molecole di interesse, in un formato a griglia ad alta densit? da utilizzare per particolari analisi. Un microarray a oligonucleotidi o a DNA ? costituito da numerose molecole di DNA o di oligonucleotidi, localizzate in posizioni predefinite sull?array, a distanza regolare, per fungere da sonde in un saggio di ibridazione. Ogni specifica posizione contiene diverse migliaia di copie identiche di un particolare oligonucleotide o DNA.
La stringenza di ibridazione secondo la presente invenzione e in letteratura ? il grado col quale le condizioni sperimentali di ibridazione tollerano la presenza di basi non appaiate nella molecola eteroduplex. Sono definite condizioni di alta stringenza, quelle condizioni in cui solamente le sequenze complementari al 100% possono appaiarsi. Sono invece definite condizioni di bassa stringenza quelle condizioni in cui possono formarsi eteroduplex tra filamenti di acidi nucleici anche con un numero significativo di basi non appaiate. La stringenza ? convenzionalmente attenuata mediante abbassamento della temperatura di appaiamento e/o aumento della concentrazione salina.
Temperatura di fusione (Tm). Temperatura alla quale il 50% della molecola dell?eteroduplex ? presente nella forma a doppio filamento ed il 50% in quella a singolo filamento.
Il termine funzionalizzazione nella presente invenzione ha il significato comunemente utilizzato in chimica, e indica l?incorporazione o il legame di un materiale, come ad esempio nanoparticelle o elettrodi, con uno o pi? gruppi funzionali rappresentati, nel caso della presente invenzione, da oligonucleotidi o sonde aventi SEQ ID NO 1, in cui detti oligonucleotidi o sonde possono a loro volta essere marcati come descritto nella presente descrizione.
CampyP3 nella presente descrizione indica una sonda o oligonucleotide di DNA a singolo filamento (ss DNA) avente SEQ ID NO 1.
CCP3 nella presente descrizione indica una sonda o oligonucleotide di DNA avente una sequenza complementare a SEQ ID NO 1.
ABBREVIAZIONI
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
Figura1 Allineamento sequenze di Campylobacter spp. tramite software Multalin.
Figura 2 Risultati di specificit? della sonda avente SEQ ID NO 1 dot blot Saggio immunoenzimatico e risultati chemiluminescenti. Nelle membrane a e b sono raffigurati i dati ottenuti con la sonda CampyP3-Dig (DNA avente SEQ ID NO 1 marcato con digossigenina) applicata al sistema immunoenzimatico nelle membrane c, d ed e sono raffigurati i dati ottenuti con la sonda CampyP3-Bio applicata al sistema basato sulla chemiluminescenza.
Nella membrana a ? rappresentato il dato del test della sensibilit?. Nella linea A e B ? depositata la sonda CCP3 a concentrazioni scalari ( Linea A1:100 ng / ?L, A2: 50 ng / ?L, A3: 10 ng / ?L, A4: 1 ng / ?L. CCP3 nella Linea B, B1: 0,1 ng / ?L B2: 0,01 ng / ?L B3: 0,001 ng / ?L B4: 0,0001 ng / ?L). Alla posizione A4 ? presente l?ultimo spot visibile. Questo indica che il limite di rilevamento ? 1 ng/?L.
Nella membrana b ? rappresentato il dato del test della specificit? nella linea A ? presente il controllo positivo (CCP3) e diversi controlli negativi come E. coli, S. enterica, H. pylori, Arc. butzleri. Nella linea B sono present? i controlli positivi, C. jejuni, C. coli, C. lari e C.upsaliensis, standardizzati a 100 ng/uL . Invece, nella linea C sono presenti C. jejuni, C. coli, C. lari e C.upsaliensis alla concentrazione di estrazione. Nella membrana c ? rappresentato il risultato del test della sensibilit?. Nella linea A e B la sonda CCP3 ? depositata a concentrazioni scalari (Linea A, A1: CCP31 ng / ?L A2: CCP30,5 ng / ?L A3: CCP30,2 ng / ?L A4: CCP30,1 ng / ?L. Linea B, B1: CCP3 0,05 ng / ?L, B2: CCP30,02 ng / ?L, B3: CCP30,01 ng / ?L, B4: CCP30,005 ng / ?L). Nella posizione A4 ? presente l?ultimo spot visibile. Questo indica che il limite di rilevamento con questo sistema ? di 0.1 ng/?L.
Nella membrana d il test della sensibilit? ? stato condotto anche con il DNA genomico di C. jejuni. Nella linea A sono state depositate diverse concentrazioni scalari di DNA. Il limite di rilevamento per il DNA genomico ? di 5 ng/?L.
Nella membrana e ? rappresentato il dato del test della specificit?. Nella linea A, B e C sono state depositate uguali concentrazioni scalari, rispettivamente per le sonde CCP3, PR (SEQ ID NO 4) e PE (SEQ ID NO 5). La sonda CCP3 ha confermato il dato ottenuto nella membrana c. Le sonde PR e PE che fungono da controlli negativi, non hanno dato positivit?.
Figura 3 Nella membrana a ? riportato il dato del test della sensibilit? con il metodo a chemiluminescenza, nella membrana b ? rappresentato il dato del test della sensibilit? con il sistema basato sulla chemiluminescenza-Si NPs. Nel grafico c ? comparata l?intensit? del segnale ottenuto tra i due metodi.
Figura 4 Sono riportati i risultati del test della specificit? in cui sono stati testati i DNA di diversi microorganismi. Le misurazioni dell?intensit? del segnale sono state ripetute tre volte. La media dei valori sono riportati nel seguente grafico. Dal grafico si denota la differenza dell?intensit? del segnale proveniente dai controlli positivi in grigio scuro e quelli dai campioni negativi in grigio chiaro.
Figura 5 Curve di calibrazione ottenute mediante misurazione del DPV di C. fetus (rombo), L. innocua (quadrato), E. coli (triangolo) e C. jejuni (cerchio).
Figura 6 composizione di un biosensore.
Figura 7 Risultati ottenuti mediante ibridazione della sonda avente SEQ ID NO 1 su DNA estratto da campioni di pollo. La figura riporta uno schema dell'analisi dei campioni di carne di pollo. Il campione di pollo ? stato trattato con la fase di arricchimento, il DNA ? stato estratto ed ? stato analizzato dal protocollo Si-NPs . In a) i risultati ottenuti; Fila A: A1: CCP30,1 ng / ?L, A2: 3SCB, A3: 10SCB; nella riga B, B1: 4SCB, B2: 5SCB B3: 6SCB.
Figura 8 Campioni alimentari tracciati nella linea di regressione di C. jejuni ottenuti da DPV, in ordinata ? indicato il delta della intensit? di corrente del picco anodico, in ascissa la concentrazione del DNA espressa in logaritmo.
LISTA DI SEQUENZE
SEQ ID NO 1
TAGTGGCGCACGGGTGAGTAAGGTATAGTTAATCTG SEQ ID NO 2 primer universale forward P1V1
GCGGCGTGCCTAATACATGC SEQ ID NO 3 primer universale reverse 518R
ATTACCGCGGCTGCTGG SEQ ID NO 4
PR CGTGCGCCACTACAGATTACCTTAAACTATCTCACC
La seguente sonda rappresenta la divisione della SEQ ID NO 1 scomposta in 6 parti, di cui ogni parte ? costituita da 6 basi. Le 6 parti della SEQ ID NO 1 sono state mescolate casualmente generando la sonda PR.
SEQ ID NO 5
PE AAGACGCGCATCTCTTTTTTCACCAGCGCGCTTTTC
La sonda PE rappresenta la sequenza di maggior probabilit? di ibridazione delle sonda SEQ ID NO 1, sul gene 16S dell? E. coli in cui 21 basi su 36 coincidono.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
La presente descrizione riguarda una sequenza nucleotidica definita in SEQ ID NO 1, e in particolare una sonda nucleotidica, o un oligonucleotide, avente SEQ ID NO 1. Caratteristica particolare di tale sonda o oligonucleotide, ? il fatto di avere una complementariet? del 100% ai nucleotidi in posizione 69-104 del gene per rRNA 16S di C. jejuni numero di accesso GenBank N.: NR_117760.1, ai nucleotidi in posizione 71-106 del gene per rRNA 16S di C. coli numero di accesso in GenBank N.: JX912505.1, ai nucleotidi in posizione 67-102 del gene per rRNA 16S di C. lari numero di accesso in GenBank N.: NR_115289.1, ai nucleotidi in posizione 55-90 del gene per rRNA 16S di C. upsaliensis numero di accesso in GenBank N.: NR_115289.1.
Questa particolare caratteristica permette l?utilizzo di detta sonda o oligonucleotide, nella rilevazione specifica di microorganismi appartenenti a una o pi? delle specie Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari e Campylobacter upsaliensis in campioni in cui si voglia verificare, ad esempio per motivi igienico sanitari, la presenza di tali microorganismi.
La complementariet? al 100% di detta sonda o oligonucleotide con regioni del gene per l?rRNA 16S nei microorganismi sopra elencati, permette di rilevare in maniera specifica la presenza di una o pi? delle suddette quattro specie nei campioni analizzati. La sonda o oligonucleotide avente SEQ ID NO 1 presenta le caratteristiche riportate di seguito in Tabella 1. Tutti i valori riportati rientrano nei parametri ottimali indicati dal software.
Tabella 1. Caratteristiche della sonda nucleica (Amplifix).
in cui,
-Tm ? la Temperatura di fusione
- % GC rappresenta la percentuale in G, guanina e C, citosina
-la stabilit? al 3?: indica la stabilit? di legame con una sonda complementare al 3? e dipende dai nucleotidi da cui ? composta la sequenza all?estremit? 3?.
- il poly-x: ? un indicatore per la formazione di sequenze ripetute in tandem che possono portare ad una ibridazione non specifica. Il valore deve essere il pi? possibile vicino allo 0.
- self dimer indica la possibilit? di ibridazione della sonda con se stessa
-self end dimer indica la possibilit? di formare strutture a forcina.
La specificit? della sonda ? stata valutata in silico tramite Amplifix, Fast PCR e BLAST.
Amplifix e FAST PCR sono programmi disponibili al pubblico che permettono di simulare l?ibridazione di sonde oligonucleotidiche rispetto ad una sonda nucleotidica complementare
Amplifix ha riscontrato positivit? per le sequenze corrispondenti ai batteri che presentano i seguenti numeri di accesso (Tab.2):
Tabella 2. Elenco dei microorganismi positivi all?ibridazione con una sonda di DNA avente SEQ ID NO 1
Amplifix, non ha riscontrato ibridazione per le sequenze corrispondenti ai batteri che presentano i seguenti numeri di accesso (Tab.3):
Tabella 3. Elenco dei microorganismi negativi all?ibridazione con una sonda di DNA avente SEQ ID NO.
I risultati ottenuti sono stati confermati anche con il programma Fast PCR6.1.
Il programma BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ? un software di allineamento per confrontare una sequenza di interesse (in questo caso la sonda CampyP3) con un database di sequenze conosciute ed indentificare quelle omologhe. Questa procedura viene eseguita per valutare se la sequenza della sonda ? identificativa solo per il genere e/o le specie di interesse. Il programma ha permesso di verificare che la sequenza ? specifica per il genere Campylobacter.
Analisi basate sulla tecnica del dot blot, utilizzando un metodo di rivelazione colorimetrico e di chemiluminescenza, e analisi basate sulla voltammetria hanno confermano la specificit? della sonda come descritta sopra. I test sono stati effettuati sui ceppi elencati nella Tabella 4.
Tabella 4. Ceppi di Campylobacter spp. ed altri ceppi da collezioni internazionali usati per i test di specificit?.
<A>DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganism und Zellkulturen GmbH (Braunschweigh, Germany).
<B >ICS: Isolated from Clinical samples (Hospital of Udine, Italia).
<C >ATCC: American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA).
<D >DI4A: Dipartimento di Scienze Agroalimentari, Ambientali e Animali (Udine, Italia). <E >DISTAM: Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (Milano, Italia).
Data la sua specificit? per le 4 specie di Campylobacter (C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis), la sonda o oligonucleotide avente SEQ ID NO 1, pu? essere utilizzata per la rivelazione di tali microorganismi in campioni di interesse utilizzando diverse metodologie note al tecnico del settore. A tale scopo, la sonda o oligonucleotide pu? essere legata, al 3? o al 5? o in qualsiasi posizione all?interno di esso, a una molecola che ne permetta la rivelazione mediante tali tecniche. ? quindi oggetto dell?invenzione, la sonda o oligonucleotide avente SEQ ID NO 1, in cui detta sonda (preferibilmente di DNA) ? marcata mediante legame al 3? al 5? o in qualsiasi posizione all?interno di esso con un gruppo chimico reporter, con un enzima, con un fluoroforo o con un gruppo tiolo (-SH) o un gruppo amminico (-NH2).
Secondo la presente invenzione, il gruppo chimico reporter pu? essere ad esempio scelto tra biotina, digossigenina, questi sono riconosciuti da avidina o streptavidina e anticorpi anti-Dig i quali possono essere marcati con l?enzima pu? essere fosfatasi alcalina o perossidasi, glucosidasi e ?-gattosidasi, il fluoroforo pu? essere Cascade blu(410), Pacific blu (455), Oregon green (488X), Bodipy FL-X (510), Fluorescene (520), 5,6FAM (518), OregonGreen (524), TET (536), Bodipy R6G-X (547), JOE (548), HEX (556), Cy3 (570), Rhodamine Red-X (580), TAMARA (580), Cy3.5 (596), ROX (605), Texas Red-X (614) Bodipy TR-X (617), Light Cycler 640 (640), Bodipy 630/650-x (650), Cy5 (667) e Cy5.5 (694).
Il marcatore legato alla sonda ne permette l?utilizzo mediante le tecniche di rivelazione che si ritengono pi? opportune a seconda del campione analizzato e dei mezzi a disposizione dell?utilizzatore.
? oggetto dell?invenzione, quindi, un metodo per la rilevazione di uno o pi? tra C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis in un campione comprendente
un passaggio di estrazione di DNA da detto campione
un passaggio di ibridazione del DNA estratto da detto campione con la sonda nucleotidica avente SEQ ID NO 1 secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte
un passaggio di rivelazione dell?ibridazione di detta sonda a detto DNA, in cui la rivelazione di una avvenuta ibridazione di detta sonda a detto DNA ? indice della presenza di almeno una tra C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis in detto campione.
Opzionalmente, il passaggio di estrazione del DNA sopra descritto pu? essere preceduto da uno o pi? tra
un passaggio di arricchimento batterico in detto campione,
un passaggio di concentrazione cellulare.
Secondo la presente invenzione l?arricchimento pu? essere realizzato mediante tecniche standard, ad esempio sottoponendo detto campione a coltura in Bolton broth o Preston broth.
Secondo la presente invenzione, detto passaggio di concentrazione pu? essere effettuato tramite centrifugazione o filtrazione.
Ove desiderato, tali passaggi possono essere ripetuti.
Ulteriormente, secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, detto DNA ? trattato con RNAsi prima di detto passaggio di ibridazione.
I passaggi di ibridazione e rivelazione possono essere effettuati mediante tecniche comunemente utilizzate quali, ad esempio, PCR , microarray, FISH, Southern blot, dot blot, qPCR, RT PCR, bioplexing o mediante l?utilizzo di biosensori.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, il metodo potr? essere realizzato effettuando ibridazione e rivelazione utilizzando tecniche di PCR, qPCR o RT-PCR. La PCR potr? essere realizzata utilizzando sonde o oligonucleotidi che amplifichino la regione codificante per l?rRNA 16S o cDNA ottenuto dall? mRNA comprendente la sequenza della sonda dell?invenzione come riportata nella figura 1. Il tecnico del settore, partendo dalle sequenza note del gene nei microorganismi sopra riportati e indicati nelle rivendicazioni potr? disegnare primer idonei a detta amplificazione.
Ad esempio, la sonda avente SEQ ID NO 1 pu? essere applicata per il riconoscimento di ampliconi ottenuti tramite la tecnica della PCR. I primer utilizzati possono essere primer universali per Batteri che amplificano il gene 16S, la regione amplificata dovr? comprendere la sequenza complementare alla suddetta sonda.
Ad esempio, possono essere utilizzati i primer universali noti, forward P1V1 avente SEQ ID NO 2 e il reverse 518R avente SEQ ID NO 3. Se il batterio appartiene a una delle quattro specie di Campylobacter indicate nella presente descrizione e nelle rivendicazioni, esso pu? essere identificato tramite ibridazione con la sonda dell?invenzione.
Secondo una ulteriore forma di realizzazione, la sonda avente SEQ ID NO 1 pu? essere usata nella tecnica della q-PCR come sonda fluorescente per quantificare solamente il DNA contenente la sequenza della sonda. Ci? significa per quantificare la presenza di Campylobacter spp., nel campione. Anche in questo caso possono essere utilizzati primer universali che amplificano la regione di interesse del gene codificante RNA 16S in Campylobacter, come la coppia di primer P1V1- 518R sopra indicati, oppure possono essere disegnati appositamente per contenere la sonda, ma dovranno sempre amplificare il gene 16S. In questo caso la sonda avente SEQ ID NO 1 dovr? essere marcata al 5? con un reporter e al 3? con un quencher.
I possibili reporter sono Cascade blu(410), Pacific blu (455), Oregon green (488X), Bodipy FL-X (510), Fluorescene (520), 5,6FAM (518), OregonGreen (524), TET (536), Bodipy R6G-X (547), JOE (548), HEX (556), Cy3 (570), Rhodamine Red-X (580), TAMARA (580), Cy3.5 (596), ROX (605), Texas Red-X (614) Bodipy TR-X (617), Light Cycler 640 (640), Bodipy 630/650-x (650), Cy5 (667) e Cy5.5 (694).
I possibili quencher possono essere quelli comunemente utilizzati, come ad esempio Dabcyl, RHQ-1, QYS-7 e BHQ-2.O
Secondo una ulteriore forma di realizzazione, l?ibridazione e la rivelazione possono essere realizzati mediante tecniche di Southern blotting o dot blot.
In questo caso, il DNA genomico estratto dal campione, opzionalmente pretrattato con RNAsi, ? denaturato ed ? trasferito su membrana secondo protocolli standard.
L?ibridazione con la sonda (opzionalmente marcata secondo opportune tecniche di marcatura qui descritte, e adatte alla rivelazione mediante blotting), ? effettuata in condizioni di ibridazione stringenti idonee ad una sonda 100% complementare.
Il tecnico del settore sapr? dedurre facilmente tali condizioni basandosi sulle caratteristiche chimico-fisiche della sonda indicate nella presente descrizione e sulle procedure standard di blotting.
In una forma di realizzazione non limitante, l?ibridazione potr? essere effettuata a 65?C in un opportuno buffer di ibridazione, opzionalmente aggiungendo 2-5% di formammide, e a diverse concentrazioni di SSC. I risciacqui potranno essere effettuati alla stessa temperatura abbassando gradualmente la concentrazione salina, ad esempio da 2XSSC, 1XSSC opzionalmente fino a 0.1XSSC.
L? ibridazione potr? essere rivelata ad esempio utilizzando una sonda marcata con digossigenina e utilizzando per la rivelazione colorimetrica usando la fosfatasi alcalina o anche chemiluminescenza usando la perossidasi di rafano, o con una sonda opportunamente marcata come sotto indicato.
La rivelazione dei risultati dell?ibridazione con la sonda avente SEQ ID NO 1 al DNA del campione pu? quindi essere realizzata mediante metodica enzimatica o fluorescenza, immunoenzimatica, immunofluorescenza, chemioluminescenza, elettrochimica (potenziometria, voltammetria, amperometria, impedenza), piezoelettrica, magnetica, fotoacustica, fototermica, termica, radioattiva e ottica (colorimetria, LSPR, SPR, SERS, RAMAN, OLED, Fibra ottica).
Conseguentemente, a seconda della metodologia scelta per l?ibridazione e la successiva rivelazione, la sonda avente SEQ ID NO 1 pu? essere marcata, al 3? o al 5? o all?interno, mediante il legame di una base del DNA di detta sonda, con gruppo chimico reporter, con un enzima, con un fluoroforo o con un gruppo tiolo (-SH) o un gruppo amminico (NH2) secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte sopra.
Il campione da analizzare pu? essere un qualsiasi campione in cui rivelare la presenza o meno di Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari o Campylobacter upsaliensis possa essere di interesse, come ad esempio un campione alimentare, un campione ambientale ed un campione biologico.
Un esempio di campione alimentare pu? essere rappresentato da latte o prodotti caseari di vario genere e carni fresche come pollame, pollo, tacchino, suino e bovino. Un esempio di campione ambientale pu? essere rappresentato da acque o liquami, come ad esempio acque di irrigazione, acque o liquami prelevati da allevamenti animali, o da campioni prelevati da ambienti di allevamento, locali dediti alla processazione alimentare o macchinari di processazione di carni o altri alimenti Un esempio di campione biologico pu? essere rappresentato da carni animali, da feci e sangue umani o animali (bestiame, pecore, cigni, animali domestici) o tamponi rettali umani.
Come detto sopra il metodo dell?invenzione pu? essere realizzato utilizzando tecniche di ibridazione e rivelazione come PCR, blotting, microarray, FISH, Southern blot, dot blot, qPCR, RT-PCR, bioplexing o mediante l?utilizzo di biosensori.
L?invenzione riguarda quindi anche un microarray comprendente la sonda avente SEQ ID NO 1 e, opzionalmente ulteriori sonde atte alla rivelazione di agenti patogeni. Il microarray pu? essere realizzato secondo qualsiasi insegnamento della tecnica nota.
I biosensori sono dei dispositivi che convertono un evento biologico o fisico in un segnale misurabile. Il biosensore ? costituito da due componenti, un biorecettore e un trasduttore. Il primo ha la funzione di riconoscimento dell?analita e quindi da questo dipende la selettivit?/specificit? del metodo. Il secondo elemento ha la funzione di trasdurre il segnale biologico, ovvero l?interazione tra analita e biorecettore, in un segnale elettrico. L?analita pu? essere una sequenza nucleotidica, una cellula, un antigene, un substrato o un tessuto. Sulla base di ci?, che si va a rilevare, viene scelto il biorecettore, il quale pu? essere una sonda nucleotidica, un anticorpo, un enzima o una cellula (Fig.6).
La scelta del trasduttore che pu? essere ottico, piezoelettrico o elettrochimico dipende dalla sensibilit?.
Secondo la presente invenzione, la sonda avente SEQ ID NO 1 pu? essere una sonda non marcata (sonda di cattura) applicabile a biosensori:
-ottici quali SPR (Surface Plasmon Resonance), LSPR (Localized surface plasmon resonance), fibra ottica, SERS (Surface Enhanced Raman Scattering), OLED (Organic Hight Emitting Diodes) e multiplex.
-piezoelettrico come la microbilancia a cristalli di quarzo (QCM)
-elettrochimici basati sulla amperometria, potenziometria, impedenza e su transistor elettrochimico organico.
Oppure una sonda marcata (sonda di rivelazione):
utilizzabile come sonda secondaria in sistemi a ?sandwich? quali OLED.
? quindi anche oggetto della presente invenzione un elettrodo per biosensore su cui sono immobilizzate sonde oligonucleotidiche aventi SEQ ID NO 1 secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte e un biosensore comprendente detto elettrodo.
Tale biosensore potr? essere, ad esempio, un biosensore ottico, un biosensore elettrochimico, piezoelettrico.
Esempi non limitanti di biosensori ottici sono biosensori a LSPR, a SPR, a spettroscopia RAMAN e SERS o OLED e in fibra ottica
Per i biosensori a LSPR possono essere utilizzate nanoparticelle (NPs) di vari metalli nobili funzionalizzate, per la tecnica a fibra ottica pu? essere utilizzata la sonda avente SEQ ID NO 1, di rilevamento, marcata, ad esempio, con biotina, coniugata con streptavidina legata alla perossidasi di rafano, per un sistema a chemiluminescenza, o con Cy5 per un sistema a fluorescenza.
Esempi non limitanti di biosensori elettrochimici sono ad esempio OECT (transistor elettrochimici organici) in cui si pu? funzionalizzare un elettrodo o il polimero conduttivo con la sonda avente SEQ ID NO 1.
La marcatura della sonda avente SEQ ID NO 1 pu? essere al terminale 3?o al 5? o in qualsiasi posizione all?interno della stessa.
Dal tipo di marcatura dipende il sistema di rilevamento come ? evidenziato nella Tabella 5.
Tabella 5. Tipi di marcatura per sonda nucleotidiche.
? anche oggetto dell?invenzione un kit comprendente aliquote di sonde oligonucleotidiche aventi SE1 ID NO 1 e uno o pi? reagenti per la loro rivelazione. Secondo una forma di realizzazione dette sonde possono essere marcate con un gruppo chimico reporter, con un fluoroforo o con un gruppo tiolo (-SH) o un gruppo amminico (-NH2) come sopra descritto.
? infine oggetto dell?invenzione un uso del kit, dell?elettrodo, del sensore o della sonda come definiti nella presente descrizione e nelle rivendicazioni per la rivelazione di C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis in un campione.
In forma esemplificativa, la sonda, l?elettrodo, il sensore e il metodo dell?invenzione, in qualsiasi forma di realizzazione fornita nella presente descrizione e nelle rivendicazioni, possono essere impiegate in:
campo alimentare per aumentarne il livello di sicurezza, attraverso il controllo e la gestione di punti critici delle fasi di produzione, trasformazione e di distribuzione. campo ambientale, in quanto la presenza di Campylobacter pu? essere rilevata in laghi e corsi d?acqua usati come fonte di irrigazione per i campi.
campo veterinario in quanto negli animali, tra i quali bovini, ovi-caprini e suini, pu? causare infezioni dell?apparato genitale (aborti, sterilit?), mammario (mastite) e digerente (enterite, epatite). Il rilevamento di Campylobacter ? importante specialmente negli allevamenti di pollame e suini perch?:
-si pu? decidere se intraprendere un trattamento antibiotico ove sia necessario, impedendo lo sviluppo di una forma di resistenza da parte del patogeno.
-tali patogeni possono fungere da fonte di contaminazione per gli alimenti e possono rappresentare un rischio per gli operatori
campo clinico velocizzando la diagnosi e decidere il trattamento antibiotico per i soggetti pi? a rischio e per i pazienti con infezioni extra-Intestinali per prevenire recidivit?.
I seguenti esempi sono volti ad indicare possibili forme di realizzazione dell?invenzione e forniscono dati sperimentali ottenuti nella caratterizzazione della sonda avente SEQ ID NO 1.
ESEMPI
1. PROTOCOLLI E RISULTATI DEI DIVERSI SISTEMI DI RILEVAMENTO AI QUALI ? STATA APPLICATA LA SONDA CAMPYP3 (SEQ ID NO 1)
1. 1 Preparazione dei campioni di DNA dei microorganismi testati per la prova di sensibilit? e specificit? della sonda CampyP3
I microorganismi usati per testare la specificit? della sonda sono elencati nella Tabella 4.
I controlli positivi, le specie di Campylobacter, corrispondenti al numero 1,2,3,4 sono rivitalizzati in brodo BHI (Brain Heart Infusion) (Oxoid, Milano, Italia).
Successivamente il Campylobacter spp. ? isolato sul terreno Columbia blood agar a cui ? stato aggiunto il 5% di sangue defibrinato di pecora (Oxoid, Milano, Italia).
Confermata la corrispondenza morfologica della colonia, questa viene isolata nuovamente sul terreno BHI agar per eseguire i diversi test di identificazione quali la colorazione di Gram, le caratteristiche morfologiche cellulari, il test dell? ossidasi e della catalasi.
Tutti i passaggi di incubazione del Campylobacter spp. avvengono a 37 ?C per 48 ore in condizioni specifiche di microarefilia (6% O2, 7% CO2, 7%H2 and 80% N2) che sono generate con Sachet Oxoid? CampyGen? 2.5 L (Oxoid, Milano, Italia).
I controlli negativi, Campylobacter fetus, C. cryaerophila, Helicobacter pylori, H. suis, Arcobacter butzleri corrispondenti al n. 5,6,7,8,9,10, sono coltivati in condizioni specifiche di microaerofilia (6% O2, 7% CO2, 7%H2 e 80% N2) generate dal Sachet Oxoid? CampyGen? 2.5 L. L? incubazione avviene a 37?C per 48 ore (Oxoid, Milano, Italia).
Il Lactobacillus plantarum, corrispondente al n.23, ? coltivato in condizioni standard di microaerofilia. La temperatura di incubazione ? di 30?C per 24 ore.
Invece, i restanti controlli negativi, Listeria monocytogenes, L. innocua , L. seeligeri, L. marthii, L. welshimeri, L. ivanovii, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, B. cereus RC3, B. subtilis, Salmonella enterica, Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae, corrispondenti dal n.11 al n.22 e il n.24 sono coltivati in condizioni di aerobiosi. Tutti i controlli sono stati incubati a 37?C per 24 ore, tranne il B. subtilis, Lactobacillus plantarum e Saccharomyces cerevisiae, corrispondenti al n. 20, 23, e 24 che hanno una temperatura ottimale di crescita a 30?C per 24 ore o 48 ore (vedere Tabella 4 sopra).
Tutti i controlli negativi sono rivitalizzati in BHI brodo e poi isolati sul terreno BHI agar per svolgere i test di identificazione gi? elencanti precedentemente; ad eccezione del S. cerevisiae che necessita di brodo Malt extract (Oxoid, Milano, Italia) per la rivitalizzazione e di terreno Malt extract agar per l?isolamento. Per alcune specie batteriche ? stato eseguito un ulteriore test di identificazione usando terreni selettivi appropriati. Le diverse specie di Listeria spp. sono state isolate su PALCAM Agar Base, S. aureus su Baird parker agar, S. enterica su X.L.D. Agar e Bacillus spp. su Brilliance? Bacillus Cereus Agar Base (Oxoid, Milano, Italia).
Una volta confermata l?identificazione del microorganismo si ? proceduto con l?estrazione del DNA.
1.1.1 Estrazione del DNA genomico
Preparazione Reagenti
-Breaking Buffer: 2% Triton, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM tris base, 1 mM EDTA -Lisozima: 0.1g/mL di lisozima in soluzione saccarosio al 25%
-TE buffer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.
-RNAsi 0.01g/mL
Colonie pure per ciascun batterio sono state stemperate in 2 mL di brodo BHI ed incubata a temperature, tempistiche e condizioni di aerobiosi o microaerobiosi specifiche per ogni batterio.
Per il lievito, invece, una colonia pura ? stata stemperata in 2 mL di brodo Malt extract ed incubata a 30?C per 48 ore.
Successivamente si ? proceduto nella seguente maniera:
1.Centrifugare il brodo contenenti le colture a 13000 rpm per 10 minuti
2.Eliminare il surnatante
3.Risospendere il pellet in 300 ?L di Breaking Buffer
4.Aggiungere 30 ?L di Lisozima (per i lieviti e per i batteri Gram negativi questo passaggio non ? necessario)
5.Trasferire in provette contenenti biglie di vetro del diametro di 0.5 mm (precedentemente preparate e sterilizzate)
6.Aggiungere 300 ?L di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico in rapporto 24:25:1
7.Agitare su vortex per 3 volte per 60 secondi ciascuna, con 1 minuti di pausa tra un trattamento e l?altro
8.Aggiungere 300 ?L di TE e agitare delicatamente per inversione
9.Centrifugare a 13000 rpm per 10 minuti
10.Prelevare il surnatante, contenente il DNA, evitando di prelevare la pellicola proteica interfasica
11.Aggiungere 1 mL di etanolo assoluto a -20?C e agitare per inversione
12.Centrifugare a 13000 rpm per 10 minuti
13.Eliminare il surnatante
14.Essiccare il pellet di DNA sotto vuoto per 2 ore, o in concentratore per 45 min, o in termostato a 37?C overnight
15.Risospendere in 50 ?L di H20 bidistillata sterile il DNA disidratato
16.Aggiungere 1 ?L di RNasi e incubare a 37?C per 1 ora
1.1.2 Lettura della concentrazione del DNA genomico
La concentrazione del DNA estratto e la sua qualit?, ? stata letta e analizzata allo spettrofotometro Nanodrop<TM >2000C. Tutti i campioni di DNA sono stati standardizzati a 100 ng/?L e stoccati a -20?C fino al loro utilizzo.
1.2 Applicazione della sonda a diversi sistemi di rilevamento basati su metodi di blottaggio.
1.2.1 Sistema di rilevamento immunoenzimatico
Protocollo per il test della sensibilit?
Preparazione della sonda CampyP3-Dig
-La sonda CampyP3 ? stata ordinata all?Az. Eurofins genomics modificata con l?aggiunta della digossigenina (Dig) all?estremit? 5? e nominata CampyP3-Dig.
- La sonda ? stata reidrata con acqua Milliq sterile con un volume indicato dall?azienda per ottenere una concentrazione di 100 pmol/?L
-La sonda ? stata standardizzata a 100 ng/?L in acqua Milliq sterile e stoccata a -20?C fino al suo utilizzo. La concentrazione ? stata controllata allo spettrofotometro Preparazione della sonda complementare CCP3 (usata come DNA target) per il test di sensibilit?
-La sonda complementare alla CampyP3, la sonda CCP3, ? stata ordinata dall?Az. Eurofins genomics.
- La sonda CCP3 ? stata reidrata con acqua Milliq sterile con un volume indicato dall?azienda per ottenere una concentrazione di 100 pmol/?L
-La sonda CCP3 ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, a diverse concentrazioni scalari: 100 ng/?L,50 ng/ ?L, 10 ng/?L, 1 ng/?L, 0.1 ng/?L, 0.01 ng/?L, 0.001 ng/?L e 0.0001 ng/?L. La concentrazione, fin dove possibile, ? stata controllata allo spettrofotometro
Preparazione dei reagenti
-Maleic acid buffer 10X: prepararlo alla concentrazione di lavoro 1X, diluire con acqua sterile (Roche, Monza, Italia)
-Blocking solution 1X: diluire 1:10 in Maleic acid buffer la blocking stock solution 10X (Roche, Monza, Italia). Tale soluzione ? da preparare al momento dell?uso.
-Ab- antiDIG: centrifugare la provetta contenente Anti-Digoxigenin-AP (Roche, Monza, Italia per 5 min a 10.000 rpm. Prelevare l?aliquota dal surnatante e diluirla 1:5000 in blocking solution 1X. Tale soluzione ? da preparare al momento dell?uso.
-COLOR SUBSTRATE SOLUTION: addizionare 100 ?L di NBT/BCIP (Roche) a 5 mL di DETECTION BUFFER gi? diluito con acqua sterile a 1X. Tale soluzione ? da preparare poco prima dell?uso e va protetta dalla luce.
-SSC 2X, 0.1% SDS (Sigma-Aldrich, Milano, Italia): 10 mL di SSC 20X (Roche, Monza, Italia) in 90 mL di acqua bi distillata e 0.1 g SDS, autoclavare.
-SSC 0.5X, 0.1% SDS: 2.5 mL di SSC 20X in 97.5 mL di acqua bidistillata e 0.1 g SDS, autoclavare.
1. IBRIDAZIONE
1.1Denaturare i campioni (le diverse concentrazioni di CCP3) a 95?C per 10 min e porre immediatamente in ghiaccio.
1.2. Depositare 1 ?L di ciascun campione sulla membrana di nylon carica positivamente.
1.3. Fissare il DNA tramite raggi UV (254nm) per 10 min
1.4. Preriscaldare 14 mL del buffer Dig Easy Hyb (Roche) a bagnomaria alla T? di ibridazione di 65 ?C
1.5. Versare 7 mL del buffer preriscaldato Dig Easy Hyb sulla membrana ed incubare a 65?C in agitazione per 30 min.
1.6. Denaturare 7 ?L di sonda CampyP3-Dig, standardizzata a 100 ng/?L, a 95? per 10 min e porre immediatamente in ghiaccio.
1.7. Addizionare 7 ?L di sonda CampyP3-Dig ai 7 mL del buffer Dig Easy Hyb rimanenti.
1.8. Eliminare 7 mL di buffer Dig Easy Hyb e aggiungere 7 mL del buffer Dig Easy Hyb con la sonda denaturata.
1.9. Lasciare la membrana a ibridare in agitazione overnight a 65?C.
2. LAVAGGI
Eliminare il reagente precedente ad ogni step di lavaggio.
2.1Lavare 2 volte la membrana per 10 min con 7 mL di SSC 1X con 0.1% SDS a temperatura ambiente e in agitazione
2.2 Lavare 2 volte la membrana per 15 min con 7 mL di SSC 0.1X con 0.1% SDS a temperatura ambiente e in agitazione
2.3 Lavare la membrana con 7 mL di Washing buffer 1X per 5? a temperatura ambiente e in agitazione.
3. RILEVAMENTO IMMUNOENZIMATICO
Eliminare il reagente precedente ad ogni step.
3.1 Incubare la membrana con 10 mL di Blocking solution 1X a temperatura ambiente e in agitazione.
3.2 Incubare la membrana con 10 mL di blocking solution 1X addizionato con un Ab anti-Dig diluito 1:5000 a temperatura ambienta in agitazione
3.3 Lavare 2 volte per 15 min con 7 mL di Washing buffer 1X a temperatura ambiente e in agitazione.
3.4 Equilibrare la membrana con 7 mL di Detection buffer 1X per 5 min in agitazione.
3.5 Incubare la membrana con 5 mL di Color substrate solution a temperatura ambiente, senza agitazione e protetta dalla luce.
3.6 Ogni 5 minuti controllare l?apparizione degli spot viola entro i 45 min.
Protocollo per il test di specificit?
Preparazione della sonda CampyP3-Dig
La sonda CampyP3 ? stata standardizzata a 100 ng/?L in acqua Milliq sterile e stoccata a -20?C fino al suo utilizzo. La sua concentrazione ? stata controllata allo spettrofotometro
Preparazione della sonda CCP3
La sonda CCP3 ? stata standardizzata a 100 ng/?L, 50 ng/?L 10 ng/?L 1 ng/?L 0.1 ng/?L 0.01 ng/?L 0.001 ng/?L 0.0001 ng/?L in acqua Milliq sterile e stoccata a -20?C fino al suo utilizzo. Le concentrazioni, fin dove era possibile, sono state controllate allo spettrofotometro.
Preparazione dei campioni di DNA batterici
I DNA C. jejuni, C.coli, C.lari, C. upsaliensis, C. fetus, H. pylori, Arc butzleri e S. enterica precedentemente estratti sono stati standardizzati a 100ng/ ng/?L.
Inoltre, i campioni di C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis e C. fetus sono stati utilizzati alle rispettive concentrazioni non standardizzate di 256 ng/?L, 206 ng/?L, 612 ng/?L, 386 ng/?L e 218 ng/?L.
Il protocollo applicato ? uguale a quello usato per il test di sensibilit?.
1.2.2 Sistema di rilevamento a chemiluminescenza
Protocollo per il test della sensibilit?
Preparazione della sonda CampyP3-Bio
-La sonda CampyP3 ? stata ordinata all?Az. Eurofins genomics modificata con l?aggiunta della biotina all?estremit? 5? ed ? nominata CampyP3-Bio.
- La sonda ? stata reidrata con acqua Milliq sterile con un volume indicato dall?azienda.
-La sonda ? stata standardizzata a 100 ng/?L in acqua Milliq sterile e stoccata a -20?C fino al suo utilizzo. La sua concentrazione ? stata controllata allo spettrofotometro. Preparazione della sonda complementare CCP3
-La sonda complementare alla CampyP3, la sonda CCP3, ? stata ordinata dall?Az. Eurofins genomics.
- La sonda CCP3 ? stata reidrata con acqua Milliq sterile con un volume indicato dall?azienda.
-La sonda CCP3 ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, a diverse concentrazioni scalari: 1 ng/?L, 0.5 ng/?L, 0.2 ng/?L, 0.1 ng/?L, 0.05 ng/?L, 0.02 ng/?L.0.01 ng/?L e 0.005 ng/?L.
Preparazione del campione di DNA di C. jejuni
-Il DNA del C. jejuni precedentemente estratto ? stato standardizzato a diverse concentrazioni: 100 ng/?L, 50 ng/?L, 10 ng/?L, 5 ng/?L e 1 ng/?L. Le concentrazioni di DNA sono state controllate allo spettrofotometro.
Preparazione reagenti e condizioni di sperimentazione
-buffer di ibridazione: 0.5M Na2HPO4, 0.5M NaH2PO4, 10mM EDTA, 1%SDS a pH 7.5 -washing Buffer (Meraudex, France). SSC 2X 0.1% SDS ?SSC 0.5X 0.1% SDS -1X wash solution (Thermofisher <Tm>, France): 40 mL 4X Wash buffer 120 mL di Milliq sterile
-agitazione 55 rpm
Didascalia
SSC: Sodio cloruro sodio citrato
SDS: Sodio dodecil solfato
Blocking solution: con proteina per saturare il sito non
specifico.
SSHPC: Coniugato streptavidina-perossidasi di rafano
stabilizzato
Hyb ?C: temperatura di ibridazione (specifica per la
sonda)
RT: temperatura ambiente
1? GIORNO
2?GIORNO
Protocollo per il test della specificit? Preparazione della sonda CampyP3-Bio
La sonda CampyP3-Bio ? stata standardizzata a 100 ng/?L in acqua Milliq sterile e stoccata a -20?C fino al suo utilizzo. La concentrazione della sonda ? stata controllata allo spettrofotometro.
Preparazione della sonda complementare CCP3
-La sonda CCP3 ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, a diverse concentrazioni: 1 ng/?L, 0.5 ng/?L, 0.2 ng/?L, 0.1 ng/?L, 0.05 ng/?L, 0.02 ng/?L.0.01 ng/?L e 0.005 ng/?L.
Preparazione di sonde nucleotidiche (PR e PE) che fungono da controlli negativi. -Sono state disegnate sonde complementari e simili alla sequenza della sonda CampyP3, da utilizzare come controlli negativi e sono state nominate PR e PE.
-Le sonde PR e PE sono stante ordinate ad una Az. Francese.
- Le sonde sono state reidratate con acqua Milliq sterile con un volume indicato dall?azienda.
-La sonda PR ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, a diverse concentrazioni: 1 ng/?L, 0.5 ng/?L, 0.2 ng/?L, 0.1 ng/?L, 0.05 ng/?L, 0.02 ng/?L.0.01 ng/?L e 0.005 ng/?L e stoccata a -20?C fino al loro utilizzo.
-La sonda PE ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, a diverse concentrazioni: 1 ng/?L, 0.5 ng/?L, 0.2 ng/?L, 0.1 ng/?L, 0.05 ng/?L, 0.02 ng/?L.0.01 ng/?L e 0.005 ng/?L e stoccata a -20?C fino al loro utilizzo.
Preparazione reagenti e condizioni di sperimentazione
-buffer di ibridazione: 0.5M Na2HPO4, 0.5M NaH2PO4, 10mM EDTA, 1%SDS a pH 7.5 -washing Buffer (Meraudex, France). SSC 2X 0.1% SDS ?SSC 0.5X 0.1% SDS -1X wash solution (Thermofisher <Tm>, France): 40 mL 4X Wash buffer 120 mL di Milliq
-agitazione 55 rpm
Il protocollo applicato ? uguale a quello usato per il test della sensibilit?.
1.2.3 Nuovo sistema di rilevamento a chemiluminescenza-Si NPs
Protocollo per il test della sensibilit?
Preparazione della sonda CampyP3-Bio
La sonda CampyP3-Bio ? stata standardizzata a 100 ng/?L in acqua Milliq sterile e stoccata a -20?C fino al suo utilizzo. La concentrazione della sonda ? stata controllata allo spettrofotometro
Preparazione della sonda complementare CCP3
-La sonda CCP3 ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, a diverse concentrazioni: 0.1 ng/?L, 0.05 ng/?L, 0.025 ng/?L, 0.0125 ng/?L, 0.006 ng/?L, 0.0031 ng/?L.0.0015 ng/?L e 0.00078 ng/?L.
Preparazione reagenti e condizioni di sperimentazione
-buffer di ibridazione: 0.5M Na2HPO4, 0.5M NaH2PO4, 10mM EDTA, 1%SDS a pH 7.5 -washing Buffer (Meraudex, France): SSC 2X 0.1% SDS ?SSC 0.5X 0.1% SDS -1X wash solution (Thermofisher <Tm>, France): 40 mL 4X Wash buffer 120 mL Milliq -agitazione 55 rpm
-Preparare le SiNPs a una concentrazione finale di 5x10<8 >/mL in 1X PBS. Prima dell?uso sonicare per 15 min.
Didascalia
SSC: Sodio cloruro sodio citrato
SDS: Sodio dodecil solfato
Blocking solution: con proteina per saturare
il sito non specifico.
SSHPC: Coniugato streptavidinaperossidasi di rafano stabilizzato
Hyb ?C: temperatura di ibridazione
(specifica per la sonda)
RT: temperatura ambiente
1? GIORNO
2?GIORNO
Protocollo per il test della specificit?
Preparazione della sonda CampyP3-Bio
La sonda CampyP3-Bio ? stata standardizzata a 100 ng/?L in acqua Milliq sterile e conservata a -20?C fino al suo utilizzo. La concentrazione della sonda ? stata controllata allo spettrofotometro.
Preparazione del campione di DNA di alcuni dei microorganismi presenti nella Tabella 4.
Tutti i DNA precedentemente estratti (Campylobacter jejuni subsp. Jejuni, C. coli, C. lari subsp.lari, C. upsaliensis, C. cryaerophila , Helicobacter pylori <1>, H. pylori <2>, Arcobacter butzleri , Listeria monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. marthii, L. welshimeri, L. ivanovii, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, B. cereus RC3, B. subtilis, Salmonella enterica, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum e Saccharomyces cerevisiae), sono stati standardizzati a 100 ng/?L in acqua Milliq sterile e stoccati a- 20?C fino al loro utilizzo.
Preparazione reagenti e condizioni di sperimentazione
-buffer di ibridazione: 0.5M NaH2PO4, 10mM EDTA, 1%SDS a pH 7.5
-washing Buffer (Meraudex, France). SSC 2X 0.1% SDS ?SSC 0.5X 0.1% SDS -1X wash solution (Thermofisher <Tm>, France): 40 mL 4X Wash buffer 120 mL Milliq -agitazione 55 rpm
-Preparare le SiNPs a una concentrazione finale di 5 x10<8 >/mL in 1X PBS. Prima dell?uso sonicare per 15 min.
Il protocollo applicato ? uguale a quello usato per il test della sensibilit?.
1.2.4 Risultati ottenuti con i sistemi di blottaggio
Nella Figura 2 sono raffigurati i dati ottenuti con la sonda CampyP3-Dig applicata al sistema immunoenzimatico.
Nella membrana a ? rappresentato il dato del test della sensibilit?. Nella linea A e B ? depositata la sonda CCP3 a concentrazioni scalari. Alla posizione A4 ? presente l?ultimo spot visibile. Questo indica che il limite di rilevamento ? 1 ng/?L.
Nella membrana b ? rappresentato il dato del test della specificit?.
Nella linea A alla posizione A1 ? presente lo spot del controllo CCP3. Dalla posizione A2 alla A5 sono stati depositati i diversi controlli negativi ad una concentrazione di 100 ng/?L. e correttamente non ? stato rilevato nessuno spot, in quanto la sonda CampyP3-Dig non si ? ibridato al DNA.
Nella linea B, sono state depositate le diverse specie di Campylobacter standardizzate a 100 ng/?L, ed ? stato rilevato solo lo spot per il C. jejuni alla posizione B1.
Invece nella linea C, sono state depositate le diverse specie di Campylobacter a concentrazioni maggiori. Il test ha presentato correttamente positivit? per C. jejuni, C. lari, C. coli e C. upsaliensis e non per C. fetus.
I dati riportati dimostrano la specificit? della sonda.
Nelle membrane c, d ed e sono raffigurati i dati ottenuti con la sonda CampyP3-Bio applicata al sistema basato sulla chemiluminescenza.
Nella membrana c ? rappresentato il risultato del test della sensibilit?. Nella linea A e B la sonda CCP3 ? depositata a concentrazioni scalari. Nella posizione A4 ? presente l?ultimo spot visibile. Questo indica che il limite di rilevamento con questo sistema ? di 0.1 ng/?L.
Nella membrana d il test della sensibilit? ? stato condotto anche con il DNA genomico di C. jejuni. Nella linea A sono state depositate diverse concentrazioni scalari di DNA. Il limite di rilevamento per il DNA genomico ? di 5 ng/?L.
Nella membrana e ? rappresentato il dato del test della specificit?. Nella linea A, B e C sono state depositate uguali concentrazioni scalari, rispettivamente per le sonde CCP3, PR e PE. La sonda CCP3 ha confermato il dato ottenuto nella membrana c. Le sonde PR e PE che fungono da controlli negativi, non hanno dato positivit?.
I dati riportati dimostrano che il sistema basato sulla chemiluminescenza aumenta la sensibilit? di 10 volte per il rilevamento della sonda CCP3 e di 20 volte il rilevamento del DNA genomico rispetto al saggio immunoenzimatico.
La specificit? della sonda CampyP3 ? confermata, anche applicata ad un sistema pi? sensibile. Infatti, non si ottiene positivit? pur testando corte sequenze di DNA ad elevata similarit? e che non risentono di un ingombro sterico rispetto ad un DNA genomico.
Membrana a) CCP3 in Riga A, A1: 100 ng / ?L, A2: 50 ng / ?L, A3: 10 ng / ?L, A4: 1 ng / ?L. CCP3 nella riga B, B1: 0,1 ng / ?L B2: 0,01 ng / ?L B3: 0,001 ng / ?L B4: 0,0001 ng / ?L. Membrana b) Riga A, A1: CCP3100 ng / ?L, A2: E. coli 100 ng / ?L, A3: H. pylori 100 ng / ?L, A4: Arc. butzleri 100 ng / ?L A5: S. enterica 100 ng / ?L. Riga B, B1: C. jejuni 100 ng / ?L B2: C. coli 100 ng / ?L B3: C. lari100 ng / ?L B4: C. upsaliensis ng / ?L B5: C. fetus 100 ng / ?L. Riga C, C1: C. jejuni 256 ng / ?L C2: C. coli 206 ng / ?L C3: C. lari 612 ng / ?L C4: C. upsaliensis 386 ng / ?L C5: C. fetus 218 ng / ?L. Membrana c) Riga A, A1: CCP31 ng / ?L A2: CCP30,5 ng / ?L A3: CCP30,2 ng / ?L A4: CCP30,1 ng / ?L. Riga B, B1: CCP30,05 ng / ?L, B2: CCP30,02 ng / ?L, B3: CCP30,01 ng / ?L, B4: CCP30,005 ng / ?L Membrana d) Riga A, A1: C. jejuni 100 ng / ?L A2 : C. jejuni 50 ng / ?L A3: C. jejuni 10 ng / ?L A4: C. jejuni 5 ng / ?L A5: C. jejuni 1 ng / ?L. Membrana e) CCP3 nella riga A A1: 0,8 ng / ?L A2: 0,4 ng / ?L A3: 0,2 ng / ?L A40,1 ng / ?L. PR nella riga B: B1: 0,8 ng / ?L B2: 0,4 ng / ?L b3: 0,2 ng / ?L b40,1 ng / ?L. PE nella riga C C1: 0,8 ng / ?L, C2: 0,4 ng / ?L, C3: 0,2 ng / ?L, C4 0,1 ng / ?L.
Nella Figura 3a ? riportato il dato del test della sensibilit? con il metodo a chemiluminescenza nella membrana a e il dato del test della sensibilit? con il sistema basato sulla chemiluminescenza-Si NPs nella membrana b. Le concentrazioni depositate, della sonda CCP3, per entrambi i metodi sono le medesime.
Nella membrana a il limite di rilevamento ? di 0.1 ng/?L ed ? visibile nella posizione A1. Il risultato conferma il limite di rilevamento gi? ottenuto nell?esperimento precedente (Fig. 2c e Fig. 2e linea A). Nella membrana b il limite di rilevamento ? visibile nella posizione B1 ed ? di 0.006 ng/?L.
Nella membrana c ? comparata l?intensit? del segnale ottenuto tra i due metodi. Il grafico conferma la maggior sensibilit? del sistema basato sulla chemiluminescenza-Si NPs che ? aumentato di 16 volte rispetto al metodo di chemiluminescenza e di 166 volte rispetto al metodo basato sul sistema immunoenzimatico.
La Figura 3 riporta i risultati chemiluminescenti senza e con NPs testati con sonda complementare CCP3. Membrana a) Riga A, A1: 0,1 ng / ?L, A2: 0,05 ng / ?L, A3: 0,025 ng / ?L, A4: 0,0125 ng / ?L; Riga B B1: 0,006 ng / ?L, B2: 0,0031 ng / ?L, B3: 0,0015 ng / ?L, B40,00078 ng / ?L. Membrana b) Fila A, A10,1 ng / ?L, A2: 0,05 ng / ?L, A3: 0,025 ng / ?L, A4: 0,0125 ng / ?L; Riga B, B1: 0,006 ng / ?L, B2: 0,0031 ng / ?L, B3: 0,0015 ng / ?L, B40,00078 ng / ?L. c) Confronto tra il valore ottenuto senza NPs (curva bassa) e con NPs (curva alta).
Nella Figura 4 sono riportati i risultati del test della specificit? in cui sono stati testati i DNA di diversi microorganismi (Tabella 4). Le misurazioni dell?intensit? del segnale sono state ripetute tre volte. La media dei valori sono riportati nel seguente grafico. Dal grafico si denota la differenza dell?intensit? del segnale proveniente dai controlli positivi in grigio scuro e quelli dai campioni negativi in grigio chiaro. I dati riportati dimostrano la specificit? della sonda.
1.3 Applicazione della sonda ad un biosensore elettrochimico (elettrodo Screen printed Au, SPAuE).
Protocollo per costruire la curva di calibrazione e per il test della sensibilit? e specificit?.
Preparazione della sonda
-La sonda CampyP3 ? stata ordinata all?Az. Eurofins genomics modificata con l?aggiunta del gruppo tiolo (SH) all?estremit? 5? per permetterne l?immobilizzazione su un elettrodo d?oro. La sonda ? stata nominata CampyP3-SH
-La sonda CampyP3-SH prima del suo utilizzo deve essere deprotetta con il seguente protocollo.
Aggiungere 200uL di TECP a 10mM (2.9 mg TCEP-HCl in 1mL di buffer TE 1X, pH 8) alla sonda disidratata. Mettere in agitazione per 1 ora a temperatura ambiente. Far precipitare la sonda aggiungendo 150 uL di NaAc a 3M (24.6g NaAc e 0.21g in 100 mL di Milliq), in seguito aggiungere Etanolo. Mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a -20?C. Centrifugare per 5 min a 13000rpm. Eliminare il surnatante e asciugare il pellet a temperatura ambiente. Reidratare la sonda con il volume prestabilito dall?Az. Eurofins.
-La sonda ? standardizzata a 10 ng/?L in PBS 1X e stoccata a -20?C fino al suo utilizzo.
Preparazione della sonda complementare CCP3 (usata come DNA target) per il test di sensibilit?
-La sonda complementare alla CampyP3, la sonda CCP3, ? stata ordinata dall?Az. Eurofins genomics.
- La sonda CCP3 ? stata reidrata con acqua Milliq sterile con un volume indicato dall?azienda per ottenere la concentrazione finale di 100 pmol/?L.
-La sonda CCP3 ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, a diverse concentrazioni scalari: 10000 pg/?L, 1000 pg/?L, 100 pg/?L, 10 pg/?L e 1 pg/?L. Preparazione dei DNA dei microorganismi per il test della specificit? e sensibilit? -Il DNA di C. jejuni, C. fetus, E. coli, L. innocua, precedentemente estratto ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, a diverse concentrazioni scalari: 10000 pg/?L, 1000 pg/?L, 100 pg/?L, 10 pg/?L e 1 pg/?L.
Preparazione dei reagenti
-H2SO4 0.5 M (96% acido solforico) preparato in acqua bidistillata sterile (Carlo Erba, Milano, Italia).
-PBS table, buffer 1X (0.0027 M KCl e 0.137 M NaCl, pH 7.4), solubilizzato in 200 mL di acqua bidistillata sterile (Sigma- Aldrich, Milano, Italia).
-6-Mercapto-1- hexanol (MCH) at 10 mM, (Sigma- Aldrich, Milano, Italia), solubilizzato in etanolo assoluto anidro (Carlo Erba, Milano, Italia) successivamente la soluzione MCH 1 mM ? stata preparata in tampone PBS sterile.
-Ferrocianuro di potassio (k4[Fe(CN)6-3H2O] )10 mM in tampone PBS sterile 1X (AnalytiCals, Milano, Italia)
Attrezzatura
-l?analisi elettrochimica ? stata effettuata utilizzando PGSTAT101 autolab potentiostat galvanostat e software NOVA 2.1 (Methrom-Autolab B.V., Netherlands)
-sono stati utilizzati elettrodi in oro screen-printed (SPAuEs) DropSens 220 AT (Au-Au-Ag/AgCl) (Metrohm- DropSens, Spain). La cella elettrochimica consiste di un elettrodo working in oro (WE), un elettrodo ausiliario in oro (CE) e un elettrodo in
argento di riferimento (RE). L?area di lavoro ha un diametro da 4 mm.
Programma di condizionamento
Potenziale iniziale 0 V
Massimo potenziale 1.3 V
Minimo potenziale -0.002 V
Potenziale di fine 0 V
Numero di scansioni 10
Tasso di scansione 0.1 V/s
Step 0.00198 V
Programma di misurazione della voltammetria a impulsi differenziali (DPV)
Potenziale iniziale -0.2 V
Potenziale di fine 0.4 V
Step 0.005 V
Modulazione di ampiezza 0.15 V
Tempo di modulazione 0.05s
Tempo di intervallo 0.5s
Tasso di scansione 0.01 V/s
1.3.1 Risultati
Risultati per il test della specificit? e sensibilit? del sistema
Nella Figura 5 in ordinata ? espresso il delta dell?intensit? del picco anodico e in ascissa le diverse concentrazioni di DNA testate (pg/uL) espresse in logaritmo. Le curve di calibrazione riportare sono per i seguenti microorganismi C. jejuni, C. fetus, E. coli e L. monocytogenes.
Valutazione della specificit?.
Dalla figura 5 si deduce che l?intensit? del picco anodico diminuisce proporzionalmente con l?aumentare della concentrazione del DNA target, C. jejuni, ibridato alla sonda (retta di regressione gialla). Invece, come ci si poteva aspettare non abbiamo un abbassamento rilevante dell?intensit? del picco anodico proporzionale alle concentrazioni di DNA per controlli negativi (C. fetus, E. coli e L. innocua). Ci? ? dovuto al fatto che il DNA non si ? ibridato alla sonda CampyP3-SH. Un parametro che conferma la specificit? del sistema ? il valore della pendenza di ciascuna retta: -21.591 per C. jejuni, -2.5257 per C. fetus, -4.181 per L. innocua e 6.299 per E. coli. La pendenza maggiore ?, giustamente, ottenuta con il DNA genomico del C. jejuni.
Altro valore da tenere conto ? quello dell?intercetta che per il C. jejuni ? -14.316, per il C. fetus ? 3.7687, per la L. innocua ? 1.9773 e per E. coli ? 9.563. Il valore dell?intercetta rappresenta l?abbassamento dell?intensit? di corrente alla pi? bassa concentrazione testata. Anche in questo caso, il maggior decremento, a parit? di concentrazioni, ? quello del C. jejuni.
Valutazione della sensibilit?.
Dal grafico in figura 5si evince che il limite di rilevamento ? di 10 pg/?L, pari a 1 Log perch? il segnale misurato per la pi? bassa concentrazione testata (1 pg/uL che ? pari a 0 Log) ? simile per i diversi microorganismi indipendentemente se sono controlli positivi o negativi.
2. ANALISI DEI CAMPIONI DI POLLO
2.1 Preparazione del campione
7 Campioni di carne fresca di pollo sono stati analizzati e nominati: 2SCB, 3SCB, 4SCB, 5SCB, 6SCB, 7SCB e 10SCB.
Protocollo
-Preparare la sospensione 1:10 del campione nel brodo di arricchimento, Bolton Broth.
-Incubare a 37?C per 4-6 ore in condizioni microaerofile specifiche ed in seguito incubare a 41.5?C per 44 ? 4 ore in condizioni microaerofile specifiche.
-Prelevare 2 mL di brodo per l?estrazione del DNA,
2.2 Estrazione del DNA da brodo di arricchimento
Preparazione Reagenti
-Lisozima: 0.1g/mL di lisozima in soluzione saccarosio al 25%
-Breaking Buffer: 2% Triton, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM tris base, 1 mM EDTA -TE buffer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.
-RNAsi 0.01g/mL
1. Preparare la sospensione 1:10 del campione di pollo nel brodo di arricchimento, Bolton Broth.
2. Incubare a 37?C per 4-6 ore in condizioni microaerofile specifiche ed in seguito incubare a 41.5?C per 44 ? 4 ore in condizioni microaerofile specifiche.
3. Prelevare 2 mL di Brodo e Centrifugare a 13000 rpm per 10 minuti
4.Eliminare il surnatante
5.Risospendere il pellet in 300 ?L di Breaking Buffer
6.Aggiungere 30 ?L di Lisozima
7.Trasferire in provette contenenti biglie di vetro del diametro di 0.5 mm 8.Aggiungere 300 ?L di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico in rapporto 24:25:1 sotto cappa e indossando guanti
9.Agitare per 3 volte su vortex per 60 secondi, con 2 minuti di pausa tra un trattamento e l?altro
10.Aggiungere 300 ?L di TE e agitare delicatamente per inversione 11.Centrifugare a 13000 rpm per 10 minuti
12.Prelevare il surnatante, contenente il DNA, evitando il trascinamento della pellicola proteica interfasica
13.Aggiungere 1 mL di etanolo assoluto a -20?C e agitare per inversione 14.Centrifugare a 13000 rpm per 10 minuti
15.Eliminare il surnatante
16.Essiccare il pellet sottovuoto per 2 ore, o in concentratore per 45 minuti, o in termostato a 37?C overnight
17.Risospendere in 50 ?L di H20 bidistillata sterile
18.Aggiungere 1 ?L di RNasi e incubare a 37?C per 1 ora
20. Conservare il DNA a -20?C prima del loro utilizzo.
2.2 Analisi tramite il sistema basato sulla chemiluminescenza-Si NPs Preparazione della sonda CampyP3
La sonda CampyP3- Bio ? stata standardizzata a 100 ng/?L in acqua Milliq sterile e stoccata a -20?C fino al suo utilizzo.
Preparazione della sonda complementare CCP3
-La sonda CCP3 ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, ad una concentrazione di0.1 ng/?L,
Preparazione del campione di DNA di pollo.
5 Campioni di pollo sono stati analizzati e sono nominati 3SCB, 4SCB, 5SCB, 6SCB e 10SCB.
Preparazione reagenti e condizioni di sperimentazione
-buffer di ibridazione: 0.5M Na2HPO4, 0.5M NaH2PO4, 10mM EDTA, 1%SDS a pH 7.5 -washing Buffer (Meraudex, France). SSC 2X 0.1% SDS ?SSC 0.5X 0.1% SDS -1X wash solution (Thermofisher <Tm>, France): 40 mL 4X Wash buffer 120 mL Milliq -agitazione 55 rpm
-Preparare le SiNPs a una concentrazione finale di 5 x10<8 >/mL in 1X PBS. Prima
dell?uso sonicare per 15 min.
Didascalia
SSC: Sodio cloruro sodio citrato
SDS: Sodio dodecil fosfato
Blocking solution: con proteine per saturare siti
aspecifici.
SSHPC: Stabilized Strepavidin-Horseradish
Peroxidase Conjugate
Hyb ?C: temperature di ibridazione (soecifica
per la sonda)
RT: temperatura ambiente
1? GIORNO
2?GIORNO
2.2.1 Risultati
I risultati ottenuti sono riportati in Figura 7.
Nella posizione A1 il controllo positivo CCP3. I risultati positivi sono stati ottenuti per i campioni posizionati in A2 e A3 e sono rispettivamente i campioni 3SCB e 10SCB. I campioni posizionati in B1, B2 e B3 corrispondono rispettivamente a 4SCB 5 SCB e 6SCB sono risultati negativi.
2.3 Analisi con il biosensore elettrochimico (Screen Printed Au Electrode, SPAuE)
Preparazione della sonda CampyP3-SH
La sonda CampyP3- SH ? stata standardizzata a 100 ng/?L in acqua Milliq sterile e stoccata a -20?C fino al suo utilizzo.
Preparazione dei DNA dei microorganismi
Il DNA di E. coli ? stata standardizzata, in acqua Milliq sterile, a: 10 ng/?L. Usato come controllo negativo alla concentrazione pi? elevata.
Preparazione del campione di DNA di pollo
3 Campioni di pollo sono stati analizzati e nominati 2SCB, 3SCB e 7SCB.
2.3.1 Risultati
I risultati sono stati riportati nella Figura 8 in ordinata ? indicato il delta della intensit? di corrente del picco anodico, in ascissa la concentrazione del DNA espressa in logaritmo.
I campioni E. coli, 2SCB, 3SCB e 7SCB sono stati misurati e il valore ? stato inserito sulla curva di calibrazione (cerchi), precedentemente ottenuta, con le diverse concentrazione del C. jejuni.
Dal grafico si evince che i campioni che risultano positivi sono 2SCB e 3SCB.
L? E. coli risulta essere negativo in quanto il valore misurato non si posiziona sulla retta di calibrazione
Il campione 7SCB non ? da considerarsi positivo tenendo conto del limite di rilevamento del sistema che ? 10 pg/?L nonostante il valore cada sulla retta di calibrazione.
3. ANALISI MICROBICA dei CAMPIONI DI POLLO: ISO 10272-1:2006
per la validazione dei risultati ottenuti tramite chemiluminescenza-Si NPs e biosensore elettrochimico
7 Campioni di pollo sono stati analizzati e nominati: 2SCB 3SCB 4SCB 5SCB 6SCB 7SCB 10SCB.
Protocollo
1. Preparare la sospensione 1:10 del campione nel brodo di arricchimento, Bolton Broth.
2. Incubare a 37?C per 4-6 ore in condizioni microaerofile specifiche ed in seguito incubare a 41.5?C per 44 ? 4 ore in condizioni microaerofile specifiche.
3. Prelevare 10 ?L ed isolare su due terreni selettivi mCCDA e Skirrow addizionati ai supplementi appropriati ed incubare a 41,5?C per 44 ? 4 ore in atmosfera microaerofila.
4. Osservare la presenza di colonie tipiche; su mCCDA le colonie di Campylobacter sono spesso piatte, umide con la tendenza a sciamare e con un riflesso metallico. 5. Selezionare da ogni piastra almeno 5 colonie tipiche per i test di conferma e per l?isolamento su Columbia Blood Agar. Incubare a 41.5?C per 44 ? 4 ore in atmosfera microaerofila.
6. Procedere con i test di conferma:
- Test della motilit?
- Test dell?ossidasi
- Isolare una colonia su Columbia blood Agar ed incubare a 25.1?C in microaerofilia - Isolare una colonia su Columbia blood Agar ed incubare a 41.5 ?C in aerofilia 3.1 Risultati
Nella Tabella 5 sono riportati i dati dei campioni di pollo analizzati.
Dai risultati si evince che i campioni positivi alla presenza del Campylobacter sono 2SCB,3SCB,10SCB. Invece i campioni 4SCB 5SCB 6SCB 7SCB sono negativi in quanto i microorganismi isolati sono cresciuti sia in aerobiosi che a 25?C, condizioni di crescita intollerabili per le caratteristiche Campylobacter spp.
Quindi l?analisi ISO 10272-1:2006 applicata ai 7campioni di pollo ha confermato i dati ottenuti sia con il DOT-BLOT basato sulla chemiluminescenza-Si NPs sia con il biosensore elettrochimico.
Tabella 6. Presenza (+) o assenza (-) di Campylobacter spp. valutata con protocollo ISO10272-1:2006.
Campioni mCCDA SKR CAB Confirmation medium CAB Ossidasi Motilit?
4. CONCLUSIONE
Tenendo conto delle prove eseguite si pu? affermare che:
-La sonda CampyP3 ? specifica per: C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis.
Da notare che non sono stati ottenuti falsi positivi con l? E. coli che ? normalmente presente nel pollo; e con patogeni come H. pylori, Arc. butzleri, C. fetus e C. cryaerophila che hanno un genoma molto simile alle specie di Campylobacter target.
La sonda mantiene la sua specificit? anche testandola nelle condizioni peggiori. Ovvero con corte sequenze di DNA complementari e simili.
-La sonda CampyP3 ? in grado di riconoscere in modo specifico sia DNA target puri che DNA estratti da matrici complesse come i campioni alimentari. Quindi, essa non risente di possibili interferenze causate da impurit? nel campione di DNA alimentare. -I dati confermano che la sonda pu? essere applicata a diversi sistemi, mantenendo la sua specificit?.
-La sensibilit? della sonda varia a seconda del sistema di analisi a cui ? applicata
Claims (20)
1. Sonda nucleotidica avente SEQ ID NO 1.
2. Sonda nucleotidica secondo la rivendicazione 1 in cui detta sonda ha una complementariet? del 100% ai nucleotidi in posizione 69-104 del gene per rRNA 16S di C. jejuni numero di accesso GenBank N.: NR_117760.1, ai nucleotidi in posizione 71-106 del gene per rRNA 16S di C. coli numero di accesso in GenBank N.: JX912505.1, ai nucleotidi in posizione 67-102 del gene per rRNA 16S di C. lari numero di accesso in GenBank N.: NR_115289.1, ai nucleotidi in posizione 55-90 del gene per rRNA 16S di C. upsaliensis numero di accesso in GenBank N.: NR_115289.1.
3. Sonda nucleotidica secondo la rivendicazione 2 in cui detta sonda ? marcata con un gruppo chimico reporter, con un enzima, con un fluoroforo o con un gruppo chimico come un tiolo (-SH) o un gruppo amminico (-NH2).
4. Sonda nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui detto gruppo chimico reporter ? biotina o digossigenina, detto enzima ? fosfatasi alcalina, perossidasi glucosidasi o ?-gattosidasi, e detto fluoroforo ? Cascade blu(410), Pacific blu (455), Oregon green (488X), Bodipy FL-X (510), Fluorescene (520), 5,6FAM (518), OregonGreen (524), TET (536), Bodipy R6G-X (547), JOE (548), HEX (556), Cy3 (570), Rhodamine Red-X (580), TAMARA (580), Cy3.5 (596), ROX (605), Texas Red-X (614) Bodipy TR-X (617), Light Cycler 640 (640), Bodipy 630/650-x (650), Cy5 (667) o Cy5.5 (694).
5. Metodo per la rilevazione di uno o pi? tra C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis in un campione comprendente
un passaggio di estrazione di DNA da detto campione
un passaggio di ibridazione del DNA estratto da detto campione con la sonda nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 e un passaggio di rivelazione dell?ibridazione di detta sonda a detto DNA, in cui la rivelazione di una avvenuta ibridazione di detta sonda a detto DNA ? indice della presenza di almeno una tra C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis in detto campione.
6. Metodo secondo la rivendicazione 5 in cui detto passaggio di estrazione del DNA ? preceduto da uno o pi? tra
un passaggio di arricchimento batterico in detto campione, e/o
un passaggio di concentrazione delle cellule batteriche mediante centrifugazione e/o filtrazione
7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 o 6, in cui detto DNA ? trattato con RNAsi prima di detto passaggio di ibridazione.
8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 7 in cui detti passaggi di ibridazione e rivelazione sono effettuati mediante tecnica di PCR, blotting, microarray, FISH, Southern blot, dot blot, qPCR, RT-PCR, bioplexing o mediante biosensori.
9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 8 in cui detta rivelazione ? realizzata mediante metodica enzimatica, di fluorescenza, immunoenzimatica, di immunofluorescenza, di chemioluminescenza, elettrochimica, piezoelettrica, magnetica, fotoacustica, fototermica, termica, radioattiva o ottica.
10. Metodo secondo la rivendicazione 9 in cui detta metodica elettrochimica ? scelta tra potenziometria, voltammetria e impedenza e detta metodica ottica ? scelta tra colorimetria, LSPR, SPR, SERS, RAMAN, OLED e Fibra ottica.
11. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 10 in cui detta sonda ? modificata mediante legame di una base di DNA con un gruppo chimico reporter, con un fluoroforo o con un gruppo tiolo SH o con un gruppo amminico NH2.
12. Metodo secondo la rivendicazione 11 in cui detto gruppo chimico reporter ? biotina o digossigenina, detto enzima ? fosfatasi alcalina, perossidasi glucosidasi o ?gattosidasi e detto fluoroforo ? Cascade blu(410), Pacific blu (455), Oregon green (488X), Bodipy FL-X (510), Fluorescene (520), 5,6FAM (518), OregonGreen (524), TET (536), Bodipy R6G-X (547), JOE (548), HEX (556), Cy3 (570), Rhodamine Red-X (580), TAMARA (580), Cy3.5 (596), ROX (605), Texas Red-X (614) Bodipy TR-X (617), Light Cycler 640 (640), Bodipy 630/650-x (650), Cy5 (667) o Cy5.5 (694).
13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 12 in cui detto campione ? un campione alimentare, un campione ambientale, o un campione biologico
14. Metodo secondo la rivendicazione 13 in cui detto campione alimentare ? scelto tra
latte, prodotti casearie carni fresche di pollame, pollo, tacchino, suino e bovino; in cui detto campione ambientale ? scelto tra acque o liquami, come acque di irrigazione, acque o liquami prelevati da allevamenti animali, o da campioni prelevati da ambienti di allevamento, locali dediti alla processazione alimentare o macchinari di processazione di carni o altri alimenti, detto campione biologico ? scelto tra carni animali, da feci e sangue umane o animali, come bestiame, pecore, cigni, animali domestici, o tamponi rettali umani.
15. Elettrodo per biosensore su cui sono immobilizzate sonde oligonucleotidiche aventi SEQ ID NO 1.
16. Elettrodo secondo la rivendicazione 15 in cui dette sonde sono marcate con un gruppo chimico tiolico o amminico.
17. Biosensore comprendente un elettrodo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 15 o 16.
18. Kit comprendente una o pi? aliquote di sonda oligonucleotidica avente SEQ ID NO 1 e uno o pi? reagenti per la loro rivelazione.
19. Kit secondo la rivendicazione 18 in cui detta sonda ? modificata mediante legame di una base di DNA con un gruppo chimico reporter, con un fluoroforo o con un gruppo tiolo SH o con un gruppo amminico NH2.
20. Kit secondo la rivendicazione 19 in cui detto gruppo chimico reporter ? biotina o digossigenina, detto enzima ? fosfatasi alcalina, perossidasi glucosidasi o ?gattosidasi e detto fluoroforo ? Cascade blu(410), Pacific blu (455), Oregon green (488X), Bodipy FL-X (510), Fluorescene (520), 5,6FAM (518), OregonGreen (524), TET (536), Bodipy R6G-X (547), JOE (548), HEX (556), Cy3 (570), Rhodamine Red-X (580), TAMARA (580), Cy3.5 (596), ROX (605), Texas Red-X (614) Bodipy TR-X (617), Light Cycler 640 (640), Bodipy 630/650-x (650), Cy5 (667) o Cy5.5 (694).
20. Uso della sonda come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 o dell?elettrodo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 16, o del biosensore come definito nella rivendicazione 17 o del kit come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 20 per la rivelazione di C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis in un campione.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102020000012496A IT202000012496A1 (it) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Sonda per la rivelazione di infezioni batteriche |
| PCT/IB2021/054241 WO2021240299A1 (en) | 2020-05-27 | 2021-05-18 | Probe for the detection of bacterial infections |
| EP21732975.4A EP4158071A1 (en) | 2020-05-27 | 2021-05-18 | Probe for the detection of bacterial infections |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102020000012496A IT202000012496A1 (it) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Sonda per la rivelazione di infezioni batteriche |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT202000012496A1 true IT202000012496A1 (it) | 2021-11-27 |
Family
ID=72561857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT102020000012496A IT202000012496A1 (it) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Sonda per la rivelazione di infezioni batteriche |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4158071A1 (it) |
| IT (1) | IT202000012496A1 (it) |
| WO (1) | WO2021240299A1 (it) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080028633A (ko) * | 2006-09-27 | 2008-04-01 | 홍경표 | 살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단키트 및 이를 이용한 검출방법 |
| JP2010022336A (ja) * | 2008-07-24 | 2010-02-04 | Hokkaido Univ | 培養併用ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により生きているカンピロバクター菌を迅速かつ特異的に計数するための遺伝子プローブ及びその方法 |
| WO2010057069A1 (en) * | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection campylobacter nucleic acid |
-
2020
- 2020-05-27 IT IT102020000012496A patent/IT202000012496A1/it unknown
-
2021
- 2021-05-18 WO PCT/IB2021/054241 patent/WO2021240299A1/en unknown
- 2021-05-18 EP EP21732975.4A patent/EP4158071A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080028633A (ko) * | 2006-09-27 | 2008-04-01 | 홍경표 | 살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단키트 및 이를 이용한 검출방법 |
| JP2010022336A (ja) * | 2008-07-24 | 2010-02-04 | Hokkaido Univ | 培養併用ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により生きているカンピロバクター菌を迅速かつ特異的に計数するための遺伝子プローブ及びその方法 |
| WO2010057069A1 (en) * | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection campylobacter nucleic acid |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DATABASE EMBL [online] 4 November 2019 (2019-11-04), "Campylobacter fetus strain 21B43_Ps51 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.", XP002801891, retrieved from EBI accession no. EM_STD:MN614393 Database accession no. MN614393 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021240299A1 (en) | 2021-12-02 |
| EP4158071A1 (en) | 2023-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kokkinos et al. | Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of Salmonella in food | |
| Gurjar et al. | Real-time multiplex PCR assay for rapid detection and toxintyping of Clostridium perfringens toxin producing strains in feces of dairy cattle | |
| Gao et al. | Recombinase polymerase amplification-based assay for rapid detection of Listeria monocytogenes in food samples | |
| Wang et al. | Development of multiple cross displacement amplification label-based gold nanoparticles lateral flow biosensor for detection of Listeria monocytogenes | |
| Yamazaki et al. | Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of Vibrio parahaemolyticus in naturally contaminated seafood samples | |
| Churruca et al. | Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in chicken meat samples by real-time nucleic acid sequence-based amplification with molecular beacons | |
| Wei et al. | Rapid and sensitive detection of Vibrio parahaemolyticus in sea foods by electrochemiluminescence polymerase chain reaction method | |
| Afshari et al. | Genotyping of Clostridium perfringens isolated from broiler meat in northeastern of Iran | |
| Osek et al. | Listeria monocytogenes in foods—From culture identification to whole‐genome characteristics | |
| Kumar | Modern trends to investigate foodborne Listeriosis | |
| El Baaboua et al. | A review of current knowledge and gaps about campylobacter methods: from culture to characterization | |
| CN116949197A (zh) | 四种常见隐孢子虫raa检测方法的建立 | |
| CN111020039B (zh) | 空肠弯曲杆菌种特异性分子靶标及其快速检测方法 | |
| CN111518931A (zh) | 牛奶中3种致病菌多重pcr诊断试剂盒 | |
| IT202000012496A1 (it) | Sonda per la rivelazione di infezioni batteriche | |
| CN108707682A (zh) | 一种用于检测沙门氏菌活性的荧光raa引物、探针及检测方法 | |
| Yang et al. | A real-time PCR assay for the detection and quantitation of Campylobacter jejuni using SYBR Green I and the LightCycler. | |
| JP2010081889A (ja) | 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー | |
| CN105256041B (zh) | 对亲水气单胞菌o44，o24，o25和o28特异的核苷酸及应用 | |
| Hossain et al. | DNA-based methods for species identification in food forensic science | |
| CN113832241A (zh) | 一种rpa-lfs快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法 | |
| Souza et al. | Development and evaluation of a single tube nested PCR based approach (STNPCR) for the diagnosis of plague | |
| EP3156501A1 (en) | Method for detecting escherichia coli and carrier for detecting escherichia coli | |
| KR20110101612A (ko) | 그람양성 식중독 유발 세균 검출용 올리고뉴클레오타이드 및 이의 용도 | |
| KR102009326B1 (ko) | cpa와 cpe 타겟 유전자를 통해 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트 개발 |