JP2011520124A - ウイルスを検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを記述することを目的とするものであり、限定を意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上明確に別段の記載がなければ、複数表記を包含する。
本明細書において使用される「抗体」は、Fab、F(ab’)2、Fd及び一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異的抗体、二機能性抗体及びこれらの誘導体を含む、クラスIgG、IgM、IgA、IgD若しくはIgEの抗体又はこれらの断片若しくは誘導体を意味し得る。抗体は、所望のエピトープ又は所望のエピトープから得られる配列に対して十分な結合特異性を示す、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製された抗体又はこれらの混合物であり得る。ポリクローナル抗体は、ヒト、ヤギ、ウサギ又はヒツジなどの哺乳類起源のものであり得る。抗体は、キメラ抗体でもあり得る。抗体は、本分野において公知の1つ又はそれ以上の化学的、ペプチド又はポリペプチド部分の付着によって誘導化され得る。抗体は、化学的部分と連結させ得る。抗体は、特異的な結合要素であり得る。
ポリペプチド及び固体支持体を参照するために本明細書において使用される「付着された」又は「固定化された」とは、ポリペプチドと固体支持体間の結合が結合、洗浄、分析及び除去の条件下で安定であるのに十分であることを意味する。結合は、共有又は非共有であり得る。共有結合は、ポリペプチドと固体支持体間で直接形成され得、又は架橋剤によって、又は固体支持体若しくはプローブ若しくは両分子の何れかの上に特異的な反応性基を含めることによって形成され得る。非共有結合は、静電的、親水的又は疎水的相互作用の1つ又はそれ以上であり得る。非共有結合に含まれるのは、ストレプトアビジンなどの分子の支持体への共有的付着及びビオチン化されたポリペプチドのストレプトアビジンへの非共有結合である。固定化は、共有的相互作用と非共有的相互作用の組み合わせも含み得る。
本明細書において使用される「エピトープ」又は「抗原」は、ポリペプチドの抗原決定基を意味し得る。エピトープは、当該エピトープに特有である空間的立体構造中に3つのアミノ酸を含み得る。エピトープは、少なくとも5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸を含み得る。空間的立体構造を調べる方法は本分野において公知であり、X線結晶解析及び二次元核磁気共鳴が含まれる。抗原は、直鎖エピトープでもあり得る。抗原は、組換え又は合成であり得る。
本明細書において使用される「断片」は、基準ペプチド又はポリペプチドの一部を意味し得る。
2つ又はそれ以上のポリペプチド配列に関して本明細書において使用される「同一の」又は「同一性」とは、当該配列が同一である残基の指定されたパーセントを指定された領域上に有することを意味し得る。パーセントは、2つの配列を最適に並置し、指定された領域にわたって2つの配列を比較し、両配列中に同一の残基が存在する位置の数を求めて、合致した位置の数を与え、指定された領域中の位置の総数で合致した位置の数を除し、結果に100を乗じて、配列同一性のパーセントを得ることによって計算され得る。2つの配列が異なる長さであり又は並置が1つ若しくはそれ以上のずれた末端をもたらし、及び指定された比較の領域が単一の配列のみを含む場合には、単一の配列の残基は計算の分母に含められるが、分子には含められない。
本明細書において使用される「指標試薬」は、外部手段によって検出することができる測定可能なシグナルを生成することができる標識を含み、及び特定のポリペプチドに対する特異的結合要素に連結又は付着され得る組成物であり得る。指標試薬は、特定のポリペプチドに対する特異的な結合対の抗体要素であり得る。指標試薬は、ビオチン若しくは抗ビオチン、アビジン、若しくはビオチン、炭水化物若しくはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター若しくは受容体分子、酵素補因子及び酵素又は酵素阻害剤及び酵素などのハプテン・抗ハプテン系を含むあらゆる特異的結合対の要素でもあり得る。
本明細書において使用される「標識」又は「検出可能な標識」は、標識が付着されている分子の定量的な又は相対的な直接又は間接的測定を可能にするシグナルを生成することができる部分を意味し得る。標識は、マイクロタイタープレート、粒子、微粒子又は顕微鏡スライド;酵素;酵素基質;酵素阻害剤;補酵素;酵素前駆体;アポ酵素;蛍光性物質;顔料;化学発光化合物;発光性物質;発色性物質;磁気物質;又は金コロイドなどの金属粒子;125I、131I、32P、3H、35S又は14Cなどの放射性物質;ニトロフェニルリン酸などのリン酸化されたフェノール誘導体、ルシフェリン誘導体又はジオキセタン誘導体などの固体であり得る。酵素は、脱水素酵素;還元酵素若しくは酸化酵素などの酸化還元酵素;アミノ;カルボキシル、メチル、アシル又はリン酸基などの官能基の転移を触媒する転移酵素;エステル、グリコシド、エーテル若しくはペプチド結合などの結合を加水分解し得る加水分解酵素;脱離酵素;異性化酵素;又は連結酵素であり得る。酵素は、別の酵素にも連結され得る。
本明細書において使用される「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列を意味し得、天然、合成又は天然及び合成の修飾若しくは組み合わせであり得る。
本明細書において使用される「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」は、その起源若しくは操作のために、自然状態で若しくはライブラリーの形態で伴われるポリヌクレオチドの全部若しくは一部を伴わず又は自然状態で結合されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに結合されている、少なくともゲノム、半合成又は合成起源のポリペプチドを意味し得る。組換えポリペプチドは、HBVの指定された核酸配列から必ずしも翻訳され得ない。組換えポリペプチドは、組換え発現系の化学的合成若しくは発現を含むあらゆる様式でも作製され得、又はHBVから単離され得る。
本明細書において使用される「固体支持体」、「固相」又は「固体基材」は、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロース片、膜、ラテックス粒子などの微粒子及びその他であり得る。固体支持体は重要でなく、当業者によって選択され得る。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁気若しくは非磁気ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラス又はシリコンチップ及びヒツジの赤血球は、全て適切な例である。固体支持体上にペプチドを固定化するための適切な方法には、イオン性、疎水性、共有的相互作用などが含まれる。固体支持体は、不溶性である又はその後の反応によって不溶性となり得るあらゆる物質でもあり得る。固体支持体は、捕捉試薬を惹き付け及び固定化するその固有の能力に関して選択され得る。あるいは、固体支持体は、捕捉試薬を惹きつけ及び固定化する能力を有するさらなる受容体を保持し得る。さらなる受容体には、捕捉試薬自体と反対に帯電した帯電物質又は捕捉試薬に連結された帯電物質と反対に帯電した帯電物質が含まれ得る。さらに別の例として、受容体分子は、固体支持体上に固定され(に付着され)、及び特異的な結合反応を通じて捕捉試薬を固定化する能力を有するあらゆる特異的な結合要素であり得る。受容体分子は、アッセイの実行前に又はアッセイの実行の間に、捕捉試薬の固体支持体材料への間接的な結合を可能にする。従って、固体支持体は、プラスチック、誘導化されたプラスチック、磁性又は非磁性金属、試験管のガラス又はシリコン表面、マイクロタイターのウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び当業者に公知の他の構成であり得る。
本明細書において使用される「特異的結合要素」は、特異的結合対の様子を意味し得る。特異的結合対は、分子の1つが、化学的又は物理的手段を通じて、第二の分子に特異的に結合する2つの異なる分子であり得る。特異的結合要素は免疫反応性であり得、特定のポリペプチドに結合することができる、抗体、抗原又は抗体/抗原複合体であり得る。
本明細書において使用される「実質的に同一な」とは、8から100又はそれ以上の残基の領域にわたって、第一及び第二の配列が50%から99%同一であることを意味し得る。
ポリペプチドに関して本明細書において使用される「変形物」は、(i)8から100又はそれ以上のアミノ酸であり得る参照ポリペプチドの一部;又は(ii)基準ポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドを意味し得る。変形物は、タンパク分解、リン酸化又は他の翻訳後修飾などの異なってプロセッシングされたポリペプチドでもあり得る。
標的を検出する方法が本明細書において提供される。標的は、タンパク質、核酸又は核タンパク質などのあらゆる検出可能な分子であり得る。標的は、別の分子と複合体を結合することが可能であり得、これは、標的の感度又は検出を減少させ得る。標的を複合体から追放することによって、標的の感度又は検出を増加させることが望ましい場合があり得る。標的は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、植物、動物又はあらゆる他の生物又は癌又はサイトカインであり得る。標的の存在は、生物、癌又はサイトカインの指標であり得る。例えば、標的は、ウイルス又はウイルス感染の指標であり得る。
(1)B型肝炎ウイルスタンパク質
タンパク質は、HBVタンパク質又はその変形物であり得る。HBVタンパク質は、「Kimura T, et al, J Clin Microbiol 2002 Feb;40(2):439−45」(その内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。)に開示されているように、HBVコア抗原(HBcAg)、HBVコア関連抗原(HBcrAg)又はHBVe抗原(HBeAg)であり得る。HBVタンパク質は、HBV外被の一部を形成することが可能であり得るHBV表面抗原タンパク質(HBsAg)でもあり得る。HBsAgは、HBV粒子の表面上に露出され得る。HBsAgは、エピトープを含み得、エピトープは抗原性であり得又は免疫監視の標的であり得る。エピトープは、変異体エピトープであり得る。また、HBsAgは、グリコシル化され得る。
HBsAgは、中央HbsAG(M−HBsAg)であり得る。M−HBsAgは第一の部分及び第二の部分を含み得、約281アミノ酸の全長を有し得る。第一の部分はpreS2領域を含み得、M−HBsAgの最初の55アミノ酸であり得る。第二の部分は226アミノ酸の長さであり得、S−HBsAgの配列を含み得る。M−HBsAgは表1に記載されている配列又はその変形物を含み得る。M−HBsAgの第一の部分はエピトープも含み得る。エピトープは、抗体によって結合されることが可能であり得る。抗体は、抗M−HBsAg特異的抗体であり得る。
HBsAgは、小HbsAG(S−HBsAg)でもあり得る。S−HBsAgは約226アミノ酸長であり得、S領域を含み得る。S−HBsAgは、野性型S−HBsAgであり得る。S−HBsAgは表2に記載されている配列又はその変形物を含み得る。S−HBsAgはエピトープも含み得、エピトープは米国特許第5,925,512号又は米国特許第7,141,242号(これらの内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。)に開示されている「a」決定基の一部であり得る。S−HBsAgのアミノ酸100から160はエピトープも含み得る。
タンパク質は、HCVタンパク質又はその変形物であり得る。HCVタンパク質はGenBank受付番号P27958に記載されているポリタンパク質を含み得る。HCVタンパク質はコア又はヌクエオキャプシドタンパク質を含み得、ポリタンパク質の最初の191アミノ酸を含み得る。コアタンパク質は抗原を含み得、コア抗原、NS3、NS4又はNS5であり得る。
タンパク質は、HIVタンパク質又はその変形物であり得る。HIVタンパク質は、gag−polポリタンパク質又はgag−polポリタンパク質前駆体(Pr180gag−pol)であり得る。HIVタンパク質は、pol前駆体又はgag前駆体(Pr55gag)でもあり得る。HIVタンパク質は、p17(ミリスチル化されたgagタンパク質)、p24(主要な構造タンパク質)、p7(核酸結合タンパク質)又はp9(プロリンリッチタンパク質)Pr55gagタンパク質切断産物も含み得る。HIVタンパク質は、gp160外被ポリタンパク質前駆体又はgp120(外被糖タンパク質)若しくはgp41(膜貫通タンパク質)などのgp160切断産物も含み得る。
標的は、ウイルス性であり得るタンパク質、核酸又は核タンパク質に結合ことが可能であり得る抗体でもあり得る。抗体は、タンパク質又は核タンパク質の抗原を結合することが可能であり得る。抗体は、タンパク質、核酸又は核タンパク質に対する対象の免疫反応によって作製され得る。
試料中の標的を検出する方法が本明細書において提供される。標的は第一の結合対に結合され得、これは標的を検出する感度を低下させ得る。標的/第一の結合対複合体を追放することは、標的を遊離状態にし、標的の検出を容易にし得る。例えば、第一の結合対は標的タンパク質の抗原を塞ぎ得る。第一の結合対から標的タンパク質を追放することによって、抗原はより容易に検出可能となり得る。標的/第一の結合対複合体を追放すると、第一の結合対は試料から除去され得る。試料は、標的を結合することが可能であり得る第二の結合対と接触させ得る。標的/第二の結合対複合体が検出され得、試料中のこの複合体の存在は標的の存在の指標であり得る。標的/第二の結合対複合体の量は、試料中の標的の量の指標でもあり得る。追放及び検出工程は、少なくとも2つ組みで実施され得る。追放、除去及び検出工程は、少なくとも2つ組みでも実施され得る。
(1)第一の結合対
標的は、タンパク質、核酸、核タンパク質又は他のこのような分子であり得る第一の結合対に結合され得る。第一の結合対タンパク質は、標的又は標的の抗原に結合することが可能であり得る抗体であり得る。抗体は、標的に対する対象の免疫応答の結果であり得る。
標的/第一の結合対複合体は、低PHであり得る追放因子を使用することによって追放され得る。pHは、2から6であり得る。このpHは、1から2のpHを有する溶液を使用することによって達成され得る。溶液は、50mMから1Mのグリシン濃度を有するグリシン試薬であり得る。低pHは、塩酸又は酢酸を使用することによっても達成され得る。追放因子による破壊後に、試料は、500mMから2MTrisであり得る中和剤を用いて中和され得、7から12のpHを有し得る。追放因子は、10から13のpHであり得る高いpHでもあり得る。高いpHは、ボラート、リン酸、ジエチルアミン又はトリエチルアミンを使用することによって達成され得る。
試料中の標的から第一の結合対を追放すると、試料は標的に結合することが可能であり得る第二の結合対と接触させることができる。標的が第一の結合対から追放されると、第二の結合対は標的にさらに容易に結合することが可能であり得る。接触は、標的/第二の結合タンパク質複合体の形成に十分な時間及び条件下で行い得る。接触工程は、標的/第一の結合対複合体の追放と同時に行われ得る。
第二の結合対は標識を含み得、指標試薬の一部であり得る。第二の結合対は固体支持体にも付着され得る。
第二の結合対は、HBVタンパク質の抗原を結合することが可能であり得る。第二の結合対は、50−80、116−34、H166、H57、H40、H53若しくはH35モノクローナル抗HB抗体又は類似の抗体であり得る。
第二の結合対はHCV第二の結合対であり得、HCVタンパク質の抗原に結合することが可能であり得る。第二の結合対は、13−959−270、14−1269−281、14−1287−252、14−153−234、14−153−462、14−1705−225、14−1708−269、14−1708−403、14−178−125、14−188−104、14−283−112、14−635−225、14−726−217、14−886−216、14−947−104、14−945−218、13−975−157、14−1350−210、107−35−54、110−81−17、CII−3、CII−7、CII−10、CII−14若しくはCII−15抗HCVタンパク質モノクローナル抗体又は類似の抗体であり得る。
第二の結合対はHIV標的に結合することが可能であり得、米国特許公開2002/0606636号A1(その内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。)に開示されているような120A−270、115B−151、117−289、108−394、115B−303又は103−350モノクローナル抗体又は他の抗体であり得る。
標的を第二の結合対と接触させると、標的/第二の結合対複合体が検出され得る。これは、標的/第二の結合対複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、試料を第二の結合対と接触させ、標的/第二の結合対複合体からの検出可能なシグナルのレベルを測定することによって達成され得る。試料中で検出されたシグナルのレベルは標的の存在の指標となり得、標的の量の指標ともなり得る。シグナルのレベルは、試料中の標的の量に比例し得る。シグナルのレベルは、対照と比較され得る。試料中の標的/第二の結合タンパク質複合体から検出されるシグナルの、対照と比較されたレベルの差は、標的の存在又は量の指標であり得る。検出工程は、一工程の捕捉/検出操作の第一の温置工程など、追放及び接触工程と一緒に実施され得る。
標的を含む試料は、患者から単離され得る。試料は、ヒトなどの動物から単離された生物学的組織又は流体であり得る。試料は、生検又は剖検試料、組織学的な目的のために採取された凍結切片などの組織の切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘膜、毛髪又は皮膚でもあり得る。試料は、外植片又は動物若しくは患者の組織に由来する一次細胞培養若しくは形質転換された細胞培養物でもあり得る。試料は、動物から細胞の試料を取り出すことによって提供され得るが、以前に単離された(例えば、別の者によって、別の時点で、及び/又は別の目的のために単離された)細胞を使用することによっても達成され得る。保存組織(治療又は転帰歴を有するものなど)も使用され得る。試料は、血液、血液画分、滲出物、腹水液、唾液、脳脊髄液、子宮頚管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、胃腸分泌物、気管支分泌物、痰、細胞株、組織試料又は***からの分泌物でもあり得る。
患者は、ウイルス(B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスであり得る。)に感染し得る。感染は、HBV潜在型感染などの潜在型感染であり得る。
本明細書では、標的を検出するために使用され得るキットが提供される。キットは、追放因子、第二の結合対を含み得、及び第二の結合対を含む指標試薬を含み得る。キットは、第一の結合対結合試薬も含み得る。キットは、試料からのタンパク質を結合するのに適した固体支持体も含み得る。キットは、陽性対照として使用するために既知濃度で標的を含む組成物も含み得る。
本実施例は、標的/免疫複合体を崩壊させた際に標的タンパク質を検出することが標的を検出する感度を増加させることを示し、これらの結果を以前の検査と比較する。処理された試料及び非処理試料中でのレベルを測定するために、実施例1の一般的な検出方法を使用した。免疫複合体を解離させるための処理方法は、表6に見出され、本実施例における全ての検査に対して使用された。免疫複合体の解離を用いるアッセイにおいて使用された試料容量は250μLであった。免疫解離検査結果の分析において、HBsAgを含有する処理された(追放された)試料及び非処理(追放なし)試料から測定されたシグナルのレベルを互いに比較し、それらのそれぞれのCO値とも比較した。
この実施例は、標的/抗体免疫複合体を破壊した際に標的タンパク質を検出することが、磁気微粒子及びKingFisher(KF)装置を使用するアッセイフォーマットにおいて、免疫複合体を含有する試料中での標的の検出を向上させることを示す。KingFisherは、96ウェルプレートのウェルからウェルへ磁気微粒子を移動させるマイクロタイタープレート試料プロセッサである。使い捨てのカバー又はチップコームで覆われた12の磁石が存在する。コームから磁石を吸引することによって微粒子をウェル中に放出させることができ、コーム中に磁石を挿入することによって微粒子を取り出すことができる。KF装置上で試料を処理する前に、試料と試薬がプレートに添加される。装置の系列を選択し、KF上でプレートを処理した。1つのマイクロタイタープレートで、合計12の試料を検査することができた。列AからHに、試料及び試薬を添加した。アッセイの最後の工程において、ARCHITECTPretrigger溶液を含有するウェルに、結合された試料及び連結物を有する微粒子を添加した。プレートをマイクロタイタープレートリーダーまで移動され、引き金を引き、シグナルを測定した。
Claims (24)
- (a)試料を提供すること;
(b)標的/第一の結合対複合体を追放すること;及び
(c)前記試料を第二の結合対と接触させること(標的/第二の結合対複合体の存在は、前記試料中の標的の存在の指標である。);
を含む、試料中の標的(該標的は第一の結合対に結合されている。)を検出するための方法。 - 第一の結合対が抗体である、請求項1に記載の方法。
- 第二の結合対が抗体である、請求項1に記載の方法。
- 標的がタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- (b)及び(c)が同時に実施される、請求項1に記載の方法。
- 標的/第二の結合対複合体を検出することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (b)及び(c)及び検出が同時に実施される、請求項6に記載の方法。
- 追放された第一の結合対を試料から除去することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第一の結合対が抗体結合試薬を使用することによって除去される、請求項8に記載の方法。
- 抗体結合試薬が抗ヒトIgである、請求項9に記載の方法。
- 抗体結合試薬が微粒子に付着されている、請求項9に記載の方法。
- 第二の結合対がタンパク質の抗原に結合する、請求項4に記載の方法。
- 抗原が直鎖エピトープである、請求項12に記載の方法。
- 抗原がウイルス抗原である、請求項12に記載の方法。
- ウイルスがB型肝炎ウイルスである、請求項14に記載の方法。
- 抗原が表面抗原である、請求項15に記載の方法。
- 試料が急性又は慢性B型肝炎ウイルス感染を有する患者から単離される、請求項15に記載の方法。
- 試料が潜在性B型肝炎ウイルス感染を有する患者から単離される、請求項15に記載の方法。
- ウイルスがC型肝炎ウイルスである、請求項14に記載の方法。
- ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項14に記載の方法。
- 試料が少なくとも20μLの容量を有する、請求項1に記載の方法。
- (b)及び(c)が少なくとも2つ組みの試料に対して実施される、請求項1に記載の方法。
- 試料のpHを2ないし6に減少させること、試料の温度を60℃ないし110℃に増加させること及びジスルフィド結合を還元することができる因子を添加することからなる群から選択される方法によって追放が実施される、請求項1に記載の方法。
- 50mMから1Mの濃度でグリシンを含む溶液を用いて試料のpHが減少され、及び溶液のpHが1から2である、請求項23に記載の方法。
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