JPS58135962A - 免疫複合体内の隔離抗原または抗体の高感度イムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血清におｉる与えられた抗原または抗体の存
在の測定（定量）の方法に関するものである。更に詳し
くは、本発明は、免疫複合体における抗ＷＸまたは抗体
の存在を検出（測定）する方法に関するものである０本
発明は、詳しくは、試料における抗原または抗体の存在
の測定、そのなかで少量で免疫複合体の形態で存在する
該抗原または抗体（範囲ｐｇ−ｍ、！ｉ＋／［）の測定
（定量）に関するものである。

免疫複合体は、多くの感染、自動免疫、および新生物発
生性−病（異常組織の発生）−病（ｎｅｏｐｌａｓｔｉ
ｃ　ｄｉｓ＠ａｓｅｓ　）において病原性の役割をもつ
。（Ｅ、　Ｖ、バーネダト、Ｄ、Ｗ、クヌントソン。

Ｃ，にアブラス、Ｄ、Ｓ、チア、Ｉ、Ｓ、ヤング、　Ｍ
、Ｌリーブリング：循環免疫複合体：免疫化学、検出お
よび重要性＋　Ａｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、　
９１巻　４３０−４４０　、　　（１９７９）　：　Ｊ
、Ｌディーンスターク。

Ａ、　Ｋ、プバーン、Ｈ，Ｊ、アルタ−，８，Ｊ、ファ
インストーン、Ｒ，Ｈ，プルセル；非−人、非Ｂ肝炎に
おける循環免疫複合体＋　Ｌａｎｃ＠ｔ、　１巻、１２
６５−１２６７ページ、（１９７９）、Ｊ、Ｒ，グ７ン
ド、Ｅ。

マン、Ｅ、アルバート：急性肝炎Ｂ界面抗原−陽性肝炎
と関連した関節炎の病原論：循環免疫複合体の補体活性
化および特性化＊　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｙｅｓｔ。

５５巻、９３０−９３６ページ（１９７５）　：Ｖ、Ｅ
。

ジ冒ンズ、Ｅ、オルランズ：いくつかのヒトの疾病にお
ける抗原および抗体成分の特性化ならびに免疫複合体の
分＃Ｉ：レビＳ　−Ｉ　Ｊ−Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ＠ｔ
ｈｅム４４巻、２４９−２７０ページ（１９８１）ニル
Ｃ，ウィリアム、Ｊｒ、：ヒトの疾病における免疫複合
体＊　Ａｎｎ、　Ｒ＠ｖ　Ｍｅｄ、　３２巻　１３−２
８ページ（１９８１）、伝染性因子、自己抗原および腫
瘍抗原の各々に対応する抗原は、遊離型で生物学的液に
存在して匹るのみならず抗体と複合体化する。ゆえに抗
体からそれぞれの抗原の分離のための方法が開発されな
ければ、検出され得ない。

このような分離の方法は、すでに報告されている（Ａ、
Ｂ、ペレイラ、Ａ、Ｎ、テオフイリボウロス。

Ｆ、　Ｊ、デキリン＝ｌｉＩ相アンチ−Ｃ３での循環免
疫複合体の部分的特性化および検出＊　Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ・１２５４１１．７６３−７７０ページ（１９８
０）：＆ハイマー、Ｄ、Ｉ＃グリψり、Ｊ、Ｌ、アプル
ゾ：免疫複合体における抗原の検出ｅｓｃａｎｄ、　Ｊ
。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３巻、４４１−４４６ページ。

（１９８１）：Ｖ、Ｅ、ジ璽−ｙ　、（、Ｅ、　オに５
　ンズ：いぐつかのヒト病における抗原および抗体成分
の特性化ならびに免疫複合体の分Ｉ１１：レビ、−１Ｊ
、　Ｉｒｎｍｕｎｏｌ　＊　Ｍｅｔｈｏｄｓ　＊　４４
巻、２４９−２７８ページ、（１９８１））。もし多く
の被験体が分析されるために要するならば、実際面から
すると役に立たない。

抗体から分離することなしに免疫複合体内に抗原を同定
する定めの成功した試みは報告されているけれども（Ｖ
、　ｇ　ジ璽−ンズ、Ｅ、オルランズ：いくつかのヒト
疲病における抗原および抗体成分の特性化ならびに免疫
複合体の分ｌＩニレビュー。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｅ　４４巻
２４９−２７８ページ、（１（ｊ８１）：Ｓ、フスビイ
、Ｓ、Ｆ＃スペハーク、）Ｌ二−スセン、Ｎハイビイ、
　ｐ、ｏ、シ鼻ツ：可溶性免役複合体における抗原同定
への方法学的アブ党−チ；モデル研究＃　Ａｅｔａ、　
Ｐａｔｈ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄｓ　　８９巻、２５
５−２８０ページ（＋：Ｃカ二ングノ１ムールンドレス
：酵素一連結イムノソルベントアツセイによる循環免疫
複合体における特異抗原の同定：ヒト血清におけるボビ
ンＸ−カゼインＩｇＧ複合体の検出。

Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｉｍｔｎｕｎｏｌ、　１１４．５０４−
５０９゜（１９８１）Ｌ　このような好結果は、例外の
ように思われ、一般的な診断の目的にδ用できない。

感染因子（体）を含む免疫複合体は、感染往管保有し、
疾病の伝搬において含まれ得る０更に、疾病の永続化を
導く免疫応答の好ましくない調節には循環免疫複合体が
必要である。それゆえに免疫被合体内の医学的に意味の
ある隔離抗原の検出は、非常に重装であると思われ、お
よび最近の医学診断に用いられる多くの高感度のイムノ
アダセイに加えて必要であると思われる。

本発明の目的は、したがって、免疫複合体の形態で存在
している抗原もしくは抗体がある試料における与えられ
た抗原もしくは抗体の検出方法を提供することである。

特にＩｒｇ７／ｍより少ない製電で免疫複合体の形態で
存在する該試料中に、このような抗原または抗体音検出
できる方法を提供することが望ましい。

本発明の目的は、試料における抗原ま九は抗体の存在を
測定（定量）する方法を提供することであり、そのなか
で、このような抗原または抗体は、免疫複合体の形態で
存在しており、次の段階：ん　試料由来の免疫複合体を
解離緩衝液と接触させ、それによって該免疫複合体が存
在するならば抗原と抗体に解魅する： Ｂ、解離し九抗原および抗体を含む可能性のある該解離
緩衝液を除去する； Ｃ，タンパクと結合している同体支持体を抗原および抗
体を含む可能性のある解離緩衝液と接触させ、該緩衝液
を除去する； Ｄ、該固体支持体を洗浄する； Ｅ、該固体支持体の未占有位＋１ｔ−満たすタンパクを
加える； Ｆ、放射能標識された屯しくけ酵素標識された抗原また
は抗体を、該支持体に加え、結果として生じた塊を培養
し、洗浄する； Ｇ、固体支持体と会合した放射能もしくは酵素活性を測
定することからなる方法である。

好ましくけ、特に低濃度における抗原または抗体の検出
のために、免疫複合体を含む試料を、免疫複合体沈澱剤
ｃ例０分子ｔ６００−１００，０００のポリエチレング
リコール）と接触させ、生じた沈澱を上清から分嗜し、
免疫複合体を、中性好ましくは非−解離緩衝液（ｐＨ６
−８１と同じに接触することによって溶液の状態にする
。タンパク結合位置を有する固体支持体に適用し、それ
によって免疫複合体が存在する場合は、この位ｔＫ結合
する。固体支持体は回収し、洗浄し、段階ＡＫ基づいて
、解離緩衝液を免疫複合体を除去するためＫＺＪＩえ抗
原および抗体に解離させる。

方法の好ましい具体化を成し遂げるには、蘂−の段階と
して、混加物である他の成分、通常は他のタンパクから
、免疫複合体の分１１１１′に：含む。籍に、纂一段階
は、当該分野で一般的に知られている方法によって表わ
される血清から免疫複合体の除去を含む。本発明の好ま
しい具体化に基づいて、免疫複合体を固体支持体に吸収
させるかあるいはその逆で、同じものを含む血清から沈
澱させる。これは、ポリエチレングリコールによる沈澱
によって影響され、次いで免疫複合体を吸収する支持体
く免疫複合体を吸収させ、タンパクＡｔ−保有するぶど
う球ｍを便用することによってもしくはアガ□ ロースのような固体支持体と連結するタンパクＡを使用
によってイムノグロブリン以外のタンパクは、吸収され
ない。任意に免疫複合体に対する吸着剤として固体支持
体に連結するコングルチニンを使用することができる。

他の代替には固体支持体に連結する補体成分ＣＩｑ　　
ｔたは固体支持体に連結する免疫グロブリンの抗体の使
用を含む０更に、固体支持体に連結した適当な補体成分
、抗体に対する細胞ベアリングレセプター（ｃｅｌｌ　
ｂｅａｒｉｎｇｒ＠ｅ＊ｐｔｏｒｍ　）または免疫複合
体の補体成分に対しての抗体を使用することができる。

免疫複合体の分離は、次の報告に記載されている方法を
含む現在まで知られている方法によって行なう：Ｆｆｉ
Ｖ−バー　４　賃）　＊　ＯＷ、ｌ　Ｘ　９　ツノ７、
Ｃ，Ｋ。

アブラス、Ｄ、Ｓ、チア、Ｌ、Ｓ、ヤング、Ｍ、Ｒ，リ
ーブリンク；循環免疫複合体；免疫化学；検出および重
要性＊　Ａｎｎ、　Ｉｎｔ＠ｒｎ、　Ｍｅｄ、　９１巻
、４３〇−４４０ページ、（１９７９）。

ＫＰ、ディベイ、Ｌ、コルンゴールド；モノクロナルリ
ウマチ因子およびペルオキシダーゼ一連結タンパクＡ１
に用い□ての循環免疫複合体のための同相分析（ソリッ
ド−７エースアダセイ）、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ＠ｔｈｏｄｓ＊　４４巻、８７−
１００ページ（１９８１）。

Ａ、ガブリエル、　Ｊｒ、、　Ｖ、アンジエロ：免役複
合体の検出ＣＩｑ　およびモノクロナルリウマチ因子で
の放射免疫分析の使用ｘ　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅ
ｓｔｓ５９巻、９９０−１００１ページ（１９７７１゜
Ａ、　Ｂ、ベルアイラ、　Ａ、Ｎ、デオフィリボロス。

Ｆ、　Ｊ、デキノン：検出および固相アンチ（抗）Ｃ１
をもつ循環免疫複合体の部分的特性ｅ　Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ。

１２５１７６３−７７０ページ（１９８０）。

Ｐ、　＊ｆり、　Ｐ、−）（ランベルト：コングロチニ
ンｔｉはＣＩｑでコーティングされたポリメチルメタク
リレートビーズを用いての血清から可溶免疫複合体の精
Ｊｆ１１．　Ｃ１１ｎ、　Ｅｘｐ、　４ｍｒｎｕｎｏ１
．３７巻。

２９５−３０９ページ（１９７９）。

Ｒ，ハイマー、Ｄ、Ｌ、グリダク、Ｊ、Ｌ、アプルゾウ
：免疫複合体Ｖこおける抗原の検出＊　５ｃａｎｄ−Ｊ
。

Ｉｍｍｎｎｏｌ、、　１３巻、４４１−４４６ページ（
１９８１）。

Ｖ、　Ｅ、ジ冒ンズ、Ｅ、オルランズ：いくつかのヒト
疾病における抗原および抗体成分の４性化ならびに免疫
複合体の分離：レビｗ　−、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍ＠ｔｈｏｄｓ、　４４巻、２４９−２７８ページ（１
９８１）。

Ｒ，Ｃ，ウィリアム、Ｊｒ９．ヒト疾病における免疫複
合体＊　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、　３２巻、１３
−２８ページ＝（１９８１）。

これらの報告に明らかにされていることは・、これらｔ
引用することによって組み入れられる。

固体支持体へ免疫複合体の吸収上行なっ喪後、血清ｔそ
とから除去し、次いで過剰タンパクを除去するために固
体支持体を洗浄する。

洗浄は、固体支持体から免疫豪合体由米の抗原オ九は抗
体の解離を伴う。これ管実施するために１免疫複合体管
含む固体支持体を解離緩衝液と接触させ、固体支持体か
ら免疫複合体を除去し、抗原および抗体成分に解離させ
る。この目的上達する丸めに、解離緩衝液としては、尿
素、グアニジン＃１＃ＩＩ塩、チオシアン酸ナトリウム
およびカリウムのようなチオシアン酸塩、塩化マグネシ
ウム、ジ謬−ドサルチル酸リチウムを九は低いｐＨ値（
２ニー　３５　）もしくは高いｐＨ値（１０−１１，１
で用いる。特に好ましい（期待される）低いｐＨ値の溶
液としてはグリシン−塩酸、クエン酸−クエン酸塩、酢
酸、プロピオン酸およびその他類似物の水溶液が挙げら
れる。

特に好ましい（期待される）高いｐＨ値の溶液としては
、次のようなアルカリ物質：炭酸ナトリウム−重炭酸塩
ニホウ酸ナトリウム：トリス（ヒドロキシメチル）アオ
ノメタン、およびその他類似物の水溶液が挙げられる。

この目的のために用いられる他の緩衝液には、リチウム
塩を含む緩衝液（硫シアン酸リチウム）。

ヨー化物を含む緩衝液（ヨー化カリウム、ｉ！−化ナト
リウムおよびヨー化リチウム）、水酸化アンモニウム、
塩化アンモニウムのようなアンモニウム化合物およびそ
の他の類似物質を含む緩衝液が含まれる。

緩衝液としては、ｐＨ６−８であるアルカリまたはアル
カリ土類金属のチオシアン酸塩の水溶液管用いるのが好
ましい◇このような溶液は他の緩衝液成分の少量を含む
こともで自るし、もしくは含まない。一般的にこのよう
な溶液は、より効果的に、低いｐＨ値（２−３，５）も
しくは高いｐＨ値（１０−１１，５１の緩衝液よりも、
免疫複合体ｆ、−解債−ｊる。好ましい緩衝液は、存在
するＨイオンもしくはＯＨイオンの程度よりはむしろ塩
成分自体に事実１帰する。

緩衝液は、実質的に十分に固体支持体から免疫複合体を
解離させ、免疫複合体自体を抗原成分および抗体成分に
解離させるための一つの手段であ）、重要である。

任意に１試料由来の免疫複合体′ｆｔ１ｓｉｌ緩衝液と
接触することおよびそれによって、初めに固体支持体に
吸収させることなく免疫複合体管解離することによって
行なうことができる。

免疫複合体の解離は、一般的には１−４５℃の温度範囲
内で行なわれ、好ましくは室温である。

解離は、好ましくは、免疫複合体と接触することによっ
て成し遂げられ、たとえば、固体吸着剤に吸収された免
疫複合体を解離緩衝液と少なくても、２分間、好ましく
は少なくても５分間および一般的には５−１０分間接触
させる。その後、実質的に免疫複合体のない固体支持体
管解離緩衝液から分曜し、その緩衝液には試料中和含ま
れている免疫複合体由来の抗原または抗体が含まれてい
る可能性がある。

抗原または抗体を含む可能性のある解離緩衝液は、タン
パクと結合する固体支持体と接触せしめる。この目的の
ために、広範囲にわたる固体支持体が用いられる。この
目的の九めにまたとえば、ジアゾベンジルオキシメチル
ペーパー、ｔ＆はジアゾフェニルチオエーテルペーパー
のようなタンパク結合剤で処理したペーパー型物質管用
いる。

これらの剤による処理は、ペーパーをタンパクと結合で
きるようにする。任意に、ニトロセルロースシートまた
は同様の物質を用いることができる。

特に、ポリスチレン、ポリビニール（１１，ｔＪ［？、
ポリビニール、塩化ポリビニリデン、ポリアクリロニト
リル、ポリビニールアセテート）のようなプラスチダク
物質を固体吸着剤１として用いることが好ましい【期待
される）。用いられる他のプラス非常Ｋｍ＜ことは、こ
れらおよび他のタンパク吸収固体支持体を免疫複合体由
来の抗原または抗体を含む解離緩衝液と接触せしめた場
合、抗原および抗体に解離した解離緩衝液中にそれらの
成分共存しているにもかかわらず、不可逆的なタンパク
の耐着が生じ、固体支持体から免疫複合体を除去するこ
とができる。籍に、抗原または抗体タンパクが、解離緩
衝液中で多様の固体基質（Ｓｏｌｉｄｍｉｔｒｉｃ・１
）に付着し、解離緩衝液が存在するような環境のもとで
、固体基質へのタンパクの耐層を最小限和することはで
きず、このような基質に吸収されたタンパクの溶出をす
ることもできないという観察は注目すべきことである。

固体支持体で、免疫複合体から誘導された抗原を九は抗
体の吸収たよって、抗原または抗体の存在は、簡単なラ
ジオイムノア曹セイまたは標識免疫検査法によって測定
（定量］できる。

一般的に吉えば、固体支持体ｌ５Ｏ−４５℃の温度範囲
で、好ましくＦｉ１５−２５℃の温度範囲で、少なくて
も６０分間、好ましくは少なくても２時間、および一般
的には一夜、固体支持体に相互に別々に抗原および抗体
の最大吸収を確実にするために、抗原または抗体を含む
可能性のある解離緩衝液で処理する。この吸収のために
、固体吸着剤をタンパク結合剤で前処理することは、不
必要であることは、注目すべきである。固体吸着剤を抗
原または抗体を含む解離緩衝液で処理後、固体支持体を
外に付着し九物質を離すために洗浄するＯ 抗原または抗体によって未占有の固体吸着体上の位ｌｉ
１？、実質的に固体支持体上の有効な位置のすべてが占
有されるようにタンパクで満たす。放射能で標識したも
しくは酵素標識した抗体または抗原に基づいて、反応が
最初の免疫複合体から誘、、：１ 導され、前もって沈澱し九抗原もしくは抗体で生ずるこ
とを確実にし、その結果、このような放射屁標ａａｔ九
は酵素標識化合物の検出が、初めの免疫複合体から誘導
され九抗原または抗体の固体支持体に存在する種間を正
確に測定（検査）できる。

この目的のために、固体支持体上の未占有結今位置會占
有するために多様な物質を使用することができる。それ
らには、時にタンノ（りが含まれる。

結合位置を占有する物として次の物質：牛血清アルブミ
ン、ゲラチン、正常ヒト血清または動物血清（牛、子牛
、胎内牛、ニワトリなど）全円いることが好ましい（期
待される）。好ま１〜〈は、固体支持体を未占有タンパ
ク結合位置を飽和するために牛血清アルブミンの溶液で
培養する。

試料を、外に付着した物質の除去のため洗浄し死後、固
体支持体に結合している可能性のある抗原または抗体に
対応する放射能標識もしくは酵阜標識した抗体または抗
原金塊える。固体支持体に与えられ九抗原の存在を測定
（定量１することが望ましいならば、±こに放射能標識
または酵素標識し九抗体を加える０同係に、固体支持体
上に与えられた抗体の存在の測定（決足）することが望
ましいならば、そこに放射能標識または酵素標識し九抗
体を加える。どちらの場合においても、〃口見られた抗
原または抗体を、固体支持体上の抗原または抗体と培養
する。構成物を外に付着した物質ｔ−線除去る丸めに洗
浄した後、固体支持体を、放射能活性ま九は酵素活性の
検査する。

本発明の方法（手段）によって、免疫複合体の形轢での
抗原または抗体を含む試料から、１す講グラム量以下の
抗原または抗体を検出できる。この過程には、固体支持
体上の精製された抗原または抗体の沈澱は必要としない
。言いかえれば、与えられた試料において検出される抗
原ｔ＋は抗体に対応する精製した抗原またけ抗体に結合
している固体支持体に、試薬として使用できないし、使
用する必要もない。

本発明を実施するにあ九り、ペーパーを（タンパクと結
合できるように試薬で処理し九ペーパー）、固体支持体
として、使用することができる０タンパクと結合できる
ようにした活性化されたべ一ノ々−として、ジアゾベン
ジルオキシメチルペーパーおよびジアゾフェニルチオエ
ーテルペーパー２＞Ｉ’ｌｌに好ましい（期待される）
。それらは市販品で牛に入れることができる（例、シコ
ライヒルーシ誹エル社、＊−４，ニエー　ハンプシ今一
、）。

一般的に言えば、これらのペーパーまたはニトロセルロ
ースのような他のペーパーで行なう場合、牛血清アルブ
ミンによって供給されるようなタンパク結合位置占有体
で位＊’を満たすために抗原まえは抗体を含む解離緩衝
液とペーパーを接触させることが囁ましい、っこの段階
は通常、放＃ｆ能を標識または＃素標識した抗原または
抗体と固体支持体の接触の前にする。しかしながらこの
ような目的のためにプラスチック物質を用いる場合、放
射能標識または酵素標識した抗＠または抗体と接触させ
る前に、タンパクｆＬｉｔ吸着体で、グラスチックｔ−
前処理することは不必要である０むしろ、このような前
処理のかわりに、むしろタンパク位置吸着体および放射
能もしくは酵′Ａ標識抗原または抗体の混合物を使用で
きる。このような環境下に、固体支持体上の抗原または
抗体は、固体支持体上の未占有位置で好ましく結合して
いるタンパク位置吸層体にＪＡ９の放射）ＩＬもしくは
＃素標識抗原また＃−ｉ抗体と結合させる。

本発明會実施するに要す５培養の段階は、既知の方蔭で
、たとえば、標識抗体と抗原ｔｌ−３７−５０゛ＣＯｍ
度範囲で１−８時間または１８−３０℃の温度範囲で１
６−７２時間培養することによって行なわれる。

洗浄は通常、ｐＨ６−８で緩衝化水溶液、好ましくは約
ｐＨ７で等侵食塩水を用いて行なう。

操作の精度（感度）は、分離支持体（Ｓｓｐａｒａｔｉ
奮５ｕｐｐｏｒｔ　）に免疫支持体のひき続いて吸収、
免疫複合体結合位置に結合するようになりうる過剰の抗
体を錬去した場合、改善される。たとえは、血清に装置
の遊噛の抗体１含む可能性がある免疫複合体の＠態にお
ける抗原の検出において、もし、遊離の抗体が免疫複合
体と一体となって、分離支持体上の結合位置に結合する
ようになり、次いで解離緩衝液との接触によって解ｊｌ
後、段階Ｃに基づいて固体支持体とＷＩｆｉ離緩衝液の
接触前に解離緩価液から除去するならば、方法の精度（
感度）は改善される。抗原から過剰抗体の分−は、６−
８Ｍ尿Ｊｔ−含む溶ｆ夜でのイオン交換クロマトグラフ
ィーで達成される。イオン交換は、ＤＥＡＥセルロース
、ＣＭ−セルロースマタはセ７アデヴクスまたはアガロ
ースの同様な誘導体を用いて行なう。

これらＯａ離抗体の除去はこの工程を行なうにあたり、
必要でないと考えてよい。単に全体的な操作（方法）の
精度ＣＭＡ度）の改良に関することである。

本発明に係る工程は、実施例に述べられているような池
のタンパクの共存にもかかわらず成し遂げることができ
る。

図、１は、他のタンパクの有無Ｆでの肝炎Ｂ界面（５ｕ
ｒｆａｃｅ　）抗原存在の検出における発明の方法のＮ
ｉ１（感度）會示すグラフである。

因、２は、免疫複合体における肝炎Ｂ（界面）抗原の検
出における方法の高檀ｌｆ１感度）を示す。

この図は更に、非−ＦｊＶ離ｉＩ衝液を用いる１合、こ
の方法の低精度（感式）を示す。

本発明の方法は、免疫複合体１５にすべての４虐抗原も
しくは抗体の実質的な検出において有効である。免疫複
合体の形態で存在している場合に次の抗原の検出におい
て有効である：肝炎Ｂ界面（５ｕｒｆａｃ・）抗原、組
織適合抗原、インフルエンザへ１クロチニン　＆禽ベス
トウィルスへマクロチエン。伝染性エクトロメリアウイ
ルス抗原。

伝染性上皮腫ウィルス抗原、単純性庖疹ウィルス抗原、
伝染性牛気管炎つィルス抗原、馬鼻肺炎（ｅｑｕｉｎｅ
　Ｒｈ１ｎｏｐｎ＠ｔｕｎｏｎｉｔｉｓ　）ウィルス抗
原家蓄悪性カタルウィルス抗原、同じく次の抗原：痘苗
。

エプスタイン−バールウィルス、小児麻痺、風疹。

巨大細胞封入体、天然痘、単純性庖疹Ｉおよび置型、黄
熱およびその他：マレック病ウィルス、羊肺臓層症ウィ
ルス、＠汎白血球減少症ウィルス。

ミンク陽炎ウィルス、アフリカ馬ペストウィルス。

青舌病ウィルス、鱒感染性膵臓壊死ウィルス、鳥禽肉腫
ウィルス、鳥禽類白血病ウィルス、二−カダスル病ウィ
ルス、パラインフルエンザウィルス１、バラインフルエ
ンずウィルス２．パラインフルエンザウィルス４．流行
性耳下腺炎、犬ジステンパーウィルス、麻疹ウィルス、
呼吸シンクチウムウィルス。粘液ウィルス、ヒトインフ
ルエンザウィルスのようなＡ型ウィルス（例−Ａｏ／Ｐ
Ｒ８／３４、ＡＩ／ＣＡＭ／４６　、Ａ２／シンガポー
ル／１１５７３＊鳥禽ウィルス；Ｂ型ウィルス（例。

Ｂ／Ｌ・・／４０　）、狂犬病ウィルス、東方馬の流行
性脳貞つィルス；ベネズエラ馬の流行性脳炎ウィルス；
西方馬の流行性脳炎ウィルス：黄熱ウィルス、デング熱
１型ウィルス、デング熱２型ウィルス；デング熱３型ウ
イルス：デング熱４！！ウィルス；日本脳炎ウィルス、
キアサヌル森林ウィルス、ルービイシダイルウイルス：
ムルレイバーレ４Ｍ炎つ（ルス；オンスクヘモルハシク
フェーパーウイルス（１型および２型）：セントルイス
脳炎ウィルス；ヒト鼻ウィルス、ロ蹄病ウィルス：小児
麻痺ウィルス１型、２１１および３型；鳥類伝染性気管
支炎ウィルス：ヒト呼吸ウィルス；豚伝播性胃腸炎ウィ
ルス：リンパ球性脈絡膜髄膜炎ウィルス；う豐すウイル
ス（Ｌａ５ｓａ　ｖｉｒｕｓ　）　：　マチュポウィル
ス（Ｍａｃｈｕｐｏ　ｖｉｒｕｓ　）　：ビチンデウィ
ルス（Ｐｉｃｈｉｎａｅ　ｖｉｒｕｓ　）　：タカリベ
ウイルス（Ｔａｃａｒｉｂ＠ｖｉｒｕｓ）　：乳頭腫ウ
ィルス、肝炎人。

水痘帯状庖疹。

次のような寄生動植物および細菌の抗原の検出に対して
も有効である：マラリアを運ぶ生物体（Ｐ、ファルシパ
ルム、Ｐ、オパスなど）、住血ａ虫刺０回旋系状虫およ
び他のフイラリア寄生、トリバノゾーム、レイシ晶マニ
ア、シャガス病、アメオビアシイス、−二脂腸虫、およ
び類似のもの；乾癖、結核、梅毒、淋病など。

この方法は、免疫複合体の形態において結合している場
合、対応する抗体の検出においても有効である。

本発明を更に詳細に説明する九めに、次の実施例を示す
。

例１ − 解醋もしくは非解離緩衝液における抗原もしくは抗体に
結合するタンパク結合位置を含むかどうか測定（定量）
する九めに、リン酸緩衝液化食塩水（ｐＨ７，２）また
は８Ｍ尿素−０，０１Ｍリン酸塩（ｐＨ８，０）または
３Ｍチオシアン酸ナトリウムにおけるいろいろの肝炎Ｂ
界面抗原（ＨＢｓＡｇ　）　’にニトロセルロース・ペ
ーパー・シート上にプロツトする。各々の溶液の５μｌ
　ｔＰプローｙ）する。ニトロセルロースのペーパー・
シートは、未占有タンパク結合位置を飽和するために、
牛血宿アルブミンの溶液で培養する。

次Ｋ、処３１ｔ、７’ｊニトロセルロース・ペーパー・
シートを、１！６■−標識北枕−ＨＢｓＡｇ抗体と培養
し、過剰の標識化抗体を除去するために洗浄し、オート
ラジオグラフィする。

テスト板（ｔｅａｔ　５ｔｒｉｐａ　）は、各々の場合
におｆｆ４ＨＢｓＡｇがニトロセルロース拳ペーパーの
タンパク結合位置に結合していることを反映する（表わ
す）０解離緩衝液（８Ｍ尿素またはチオシアン酸ナトリ
ウム液］または非解離緩衝液（リン□ 酸緩衝液化食塩水）に存在する場合、ＨＢｓＡｇ抗原は
ペーパーに結合する。テストは、更にＨＢｉＡｇが１０
′″１末１グラムような低いレベルで検出可能であるこ
とを示す。テス）＃′ｉ９にＨＢｉＡｇｌｌｌＭｊｌＯ
。

−１０４ナノグラムで感實が喪い。

例２ 解離緩衝液に溶解した場合、抗原がプラスチダクの表面
に付着するようになるかどうか測定（決定）する九めに
１標識北枕体によって続いて検出するように、精製した
肝炎Ｂ界面抗原（ＨＢｓＡぎ）を連続的に３Ｍチオシア
ン酸ナトリウムで希釈する。混合物管室温で一夜培養す
る。ビーズを洗浄し　１１１１−標識化抗体と５９に牛
血清アルブミン溶液中で１時間４５℃のもとで培養し、
洗浄し、ガンマ−カウンターでカウントする。結果ｔ−
１ａ１曲１ｉＩＡにおいて図示する０ ３Ｍチオシアン酸ナトリウム中のＨＢｓＡｇの希釈液Ｋ
（４００μＩ／−）の各々に、他のタンパクの過剰ｔｍ
えた場合、検出の感度は、いくぶんか減少するけれども
、ＨＢｓＡｆｔ、検出することができる（曲＠Ｂ）。

とのむとは、興味ある特別の抗原の免疫複合体の他の免
疫複合体の混合本しくけ他のタンパクの混合は抗原の検
出を妨げるものではないと匹うことを示す。同様の結果
はＨＢｓＡｇ以外の抗原でも得られ、記載の方法が一般
的（全般的）であることを示唆する。

例３ 免疫複合体を含む隔＠ＨＢｓＡｇの検出。

ＨＢｓＡｇの既知ｔを含む免疫複合体を、３Ｍチオシア
ン酸ナトリウムもしくはリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７，
２）で連続的に希釈する。各々の希釈液にポリスチレン
ビーズを加える。室温で一夜培養し友後、ビーズは洗浄
し、５嘩牛血清アルブミンを含む溶液中で１３５Ｉ標繊
化抗体と混合し、１時間４５℃のもとで培養し、洗浄し
、ガンマ−カウンターでカウントする。結果は図２に示
す：曲線Ａは解離緩衝液（３Ｍチオシアン酸ナトリウム
）だけで免疫複合体と培養したビーズに対応するカラン
トラ表わす。解離緩衝液として３Ｍチオシアン酸ナトリ
ウムを用いる代りに８Ｍ尿素を用いても同様の結果が得
られる。

曲線Ｂは、リン酸緩衝液化溶液、弁解ＩＩＩ緩衝液で希
釈した免疫複合体を用い九場合、得られるカラントから
誘導されたグラフ！−表わす。

ラインＣはパダクグランドノイズを表わす。グラフは非
解離緩衝液管用いた場合、テストの実質的不感度を示す
。非解離緩衝液を用い九場合、抗原／抗体は免疫複合体
の形態でそのま★残るのではないかと考えられる。緩衝
化溶液をポリスチレンビーズと接触させる場合、抗原も
しくは抗体はポリスチレンビーズに吸収されるが、しか
し、免疫複合体の形態にある。たとえば、ＩＩＩ　Ｈ−
標識化抗体に通常有効である抗原位置はすでに免疫複合
体の抗体によって占有されている。２．３の未占有位蓋
だけが１１８１標識化抗体に役立つように残っている。

これらの抗原の存在は広く未検出のｔま残っており、図
２にはつき９と示される。

これらの結果から血清における免疫複合体としての隔離
抗原を九は抗体の存在を検出する方法のみならず、他の
タンパクの共存にもかかわらず、事性次藁で抗原または
抗体はナノグラム量で検出１１６°　　　　　　　　　
　　　　　以下余白例４ ヒト血清標本における免疫複合体の検出例肝炎Ｂウィル
ス（ＨＢＶ）の保有者もしくは健康な血液供給者からの
血清試料（２５０ａＪ）をポリエチレングリコール６０
００（ＰＥＧ）（３００１１／Ｉ）の溶液と最終のＰＥ
Ｇのレベルが５係になるように混合する。免疫複合体を
含むと期待される沈澱を遠心外−によって小さな固まシ
（ベレ曹ト）にする。上澄みは吸引し、ペレダトを中性
（１）Ｈ６−８）食塩水（２５０ｍｇ）に溶解し、タン
パクＡｔ−もつブドウ球菌の５０１懸濁液の同容蓋と混
合する。室晶で培養後、吸収した免疫複合体をもつバク
テリアを遠心分離によって分別し、緩衝化食塩水（ｐＨ
７３で洗浄し、３Ｍチオシアン酸ナトリウムで溶出する
０溶出液におけるＩ（ＢｓＡｇをセルロース誘導体のシ
ートにプロ曹卜することによって、もしくはポリスチレ
ンビーズへの吸収径検出する。

セルロースもしくはプラスチ噌りの表面上の遊離抗原の
検出は、培養による結果からなる放射能で標識した抗体
を用いての前述の実施例の方法および支持体上の放射能
標識抗体の検出がなされる。

結果は正常血液に存在しないオリジナル試料におけろ免
疫複合体の存在を明らかにする。

【図面の簡単な説明】

図１は、他のタンパクの有無下での肝炎Ｂ界面（Ｓｕｒ
ｆａｃｅ）抗原存在の検出における発明の方法の精度（
感度）を示すグラフであり、図２は、免疫複合体におけ
る肝炎Ｂ（界面）抗原の検出における方法の高精度（感
度）を示すグラフである。 曲線Ａおよび曲線Ｂは例２例３に記載 されており、曲線Ｃはバックグラウンドノイズを表わす
。 特許出願人 二ニー曹−り　プラダド　センター インコーホレイティド 特許出厘代理人 弁理士　青　木　　　　朗 弁１士　西　舘　和　之 弁理士　石　１）　　　敬 弁理士　山　口　昭　之 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　ｌ。 Ｈａｓ　ＡＱ　　４　／Ｌ　　　　［ｎｇ／ｍ＋）手続
補正書（方式） 昭和５８年３月ｅ七日 特許庁長官若杉和夫殿 １、事件の表示 昭和５７年　特許顧　　第２０２２６０号２、発明の名
称 免疲複合体内の隔離抗ａｔ九は抗体の 鳥感度イムノアッセイ ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ４、代理人 ６、補正の対象 （１１願書の「出願人の代表者」の欄 （２１姿任状 ４、図面の簡単な説明 １３１図　面 ７、補正の内容 （１１、＋２１　　別紙の通り （２）図面の浄書Ｃ内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）訂正願書　　　　　　　　１通 （２）委任状及び訳文　　　　　　　　各１通（３）浄
書図面　　　　　　　　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原もしくは抗体が免疫複合体の形態にある試料に
   おける抗原または抗体の存在を測定するに当た〕、 ん　免疫複合体を含む可能性のある試料由来の該免疫複
   合体を解離緩衝液と接触させ、それによって該免疫複合
   体が存在するならば、抗原と抗体に解離させるとと； ａ　抗原または抗体を含む可能性のある解離緩衝液をタ
   ンパクと結合する固体支持体を接触させ、該緩衝液を除
   去するとと； Ｃ０該固体支持体を洗浄すること； Ｄ、該固体支持体上の未占有位ｌ！ｆｔ−満たすタンパ
   クを加えるとと： Ｂ　放射能標識もしくは酵素４１Ｉｍされた抗原または
   抗体、を鍍固体支持体に顎え、該纏繊抗原ｉえは抗体は
   該固体支持体上の抗原または抗体に対応し、得られた塊
   を培養し、洗浄すること；Ｆ、固体支持体と会合し九酵
   素活性または放射能を測定することを含んでなる方法。 ｉ　段階Ｂの固体支持体がペーパー誘導体もしくはプラ
   スチ雫り物質である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、ｌ［体支持体が、ペーパー（セルロース）誘導体で
   ある特許請求の範ｉ！１票２項記載の方法□４、　　該
   ペーパーがニトロセルロースペーパーである特許請求の
   範囲第３項記載の方法。 ５、誼ヘーパーがジアゾペンジルオキシメチルヘーハー
   モシくハシアゾフェニルチオエーテルペーパーである特
   許請求の範ｉ！！＃Ｉ３項記載の方法０６、固体支持体
   がプラスチック物質である特許請求の範５ｌＩ２項記載
   の方法。 ７、該プラスチックがポリスチレンである特許請求の範
   １１８１纂６項記嬢の方法。 ８、該プラスチックがポリビニール物質である特許請求
   の範Ｉ！ｉ＠６項記載の方法〇９、該プラスチダクがポ
   リオレフィンである特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０、段階Ｂの固体支持体がペーノ（−誘導体であり、
   段階Ｄｔ段階Ｅの前に行なう特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 １１、段階りおよびＥＶ同時に行なう特許請求の範囲第
   ６項記載の方法。 １２、段階Ｅを放射能標識抗体または抗原を用いて行な
   い、段階Ｆｔ−ラジオーイムノアダセイまたはオートラ
   ジオグラフィを用いて行なう特許請求の範囲′ａ１項記
   載の方法。 １３、段階Ｅｔ酵素標識もしくは抗体管用いて行ない、
   ｊＰ＃Ｆは酵素標識イムノアダセイ金用いて行なう特許
   請求の範囲１１１１項記載の方法。 １４、段階Ａの前に、免疫複合体を含むと可能性のある
   混合物ｔ１タンノ（りと結合する分離支持体と接触せし
   め、それによちて該免疫複合体が存在するならば、該分
   離支持体に吸収させ、混加物にある物質から分離し、次
   いで、解離緩衝液を免疫複合体を含む該分離支持体く加
   える特許請求の範囲第１項記載の方法。 １５、免疫複合体を含む可能性のある試料を初めに選択
   的タンパク沈澱剤で処理し、もし免疫複合体が存在する
   ならば、それによって沈澱させ、沈澱は上澄みから分離
   し、沈＃を該支持体と接触せしめる前に、中性、非゛−
   解離緩衝液と接触することによって免疫複合体を特徴と
   する特許請求の範囲ｊｉｌ１１４項記載の方法。 １６、該支持体がタンパク（至）を有するブドウ球菌か
   らなる特許請求の範囲第１４項記載の方法ｎ１７、　Ｍ
   支持体がタンパク（２）を有するブドウ球菌からなる特
   許請求の範囲第１５項記載の方法。 １８、該緩衝液がアルカリもしくはアルカリ土類金属チ
   オシアネート（ｐＨ６−８１からなる特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 １９、＃緩衝液がアルカリもしくはアルカリ土類金属チ
   オシアネー）（ｐＨ６−８）からなる特許請求の範囲ｇ
   １４項記載の方法。 頭、該緩衝液がアルカリもしくはアルカリ土類金属チオ
   シアネー）　（ｐＨ６−８１からなる特許請求の範囲第
   １５項記載の方法。 ２１、＃試料が肝炎Ｂ（界面）抗原免疫複合体を含むＩ
   ＃軒請求の範囲第１項記載の方法。 ２２、該試料が肝炎Ｂ（界面）抗原を含む特許請求の範
   囲第１４項記載の方法。 ２３、該試料が肝炎Ｂ（界面）抗原を含む特許請求の範
   囲＠１５項記載の方法。