JPH0743384B2 - アッセイ用水性洗浄液、診断試験キット及び単純ヘルペスウイルスの測定方法 - Google Patents
アッセイ用水性洗浄液、診断試験キット及び単純ヘルペスウイルスの測定方法Info
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- JPH0743384B2 JPH0743384B2 JP2504783A JP50478390A JPH0743384B2 JP H0743384 B2 JPH0743384 B2 JP H0743384B2 JP 2504783 A JP2504783 A JP 2504783A JP 50478390 A JP50478390 A JP 50478390A JP H0743384 B2 JPH0743384 B2 JP H0743384B2
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、洗浄溶液及び単純ヘルペスウイルスの検出へ
のその使用に関する。特に、この溶液は、抗原とその抗
体との複合体から未複合化物質を分離することにより単
純ヘルペスウイルス抗原を検出するのに使用される。本
発明は、診断法に有用である。また、本発明は、洗浄溶
液を含んでなる診断試験キットに関する。
のその使用に関する。特に、この溶液は、抗原とその抗
体との複合体から未複合化物質を分離することにより単
純ヘルペスウイルス抗原を検出するのに使用される。本
発明は、診断法に有用である。また、本発明は、洗浄溶
液を含んでなる診断試験キットに関する。
背景技術 近年、イムノアッセイは、感染症に罹っているかを検出
するのに使用されるようになった。このアッセイに有効
であるためには、高度の信頼性をもって特定の生体を検
出しなければならない。ほとんどの場合、これには、そ
の生体に特有の抗原を単離することと、その生体に特有
の抗原と対応する抗体とを反応させることが必要であ
る。試験が商業的に成功するには、比較的安価で、簡単
に使用でき、そして迅速であることも必要である。
するのに使用されるようになった。このアッセイに有効
であるためには、高度の信頼性をもって特定の生体を検
出しなければならない。ほとんどの場合、これには、そ
の生体に特有の抗原を単離することと、その生体に特有
の抗原と対応する抗体とを反応させることが必要であ
る。試験が商業的に成功するには、比較的安価で、簡単
に使用でき、そして迅速であることも必要である。
イムノアッセイにより検出できるこのような生体の一つ
に、単純ヘルペスウイルスがある。ワクチン接触や種々
の抗ウイスル剤を用いて治療により種々のウイルスが抑
制されることが多くなってきているが、単純ヘルペスウ
イルス（以下、「HSV」と称する）による感染は依然と
して重大な問題である。HSVは、主に口の周囲に生じる
１型と、人体の性器の周辺に生じる２型の二つの型に分
類される。HSV感染から生じる重大な結果をもたらすの
は、皮膚感染とウイルス脳炎の二種類にすぎない。
に、単純ヘルペスウイルスがある。ワクチン接触や種々
の抗ウイスル剤を用いて治療により種々のウイルスが抑
制されることが多くなってきているが、単純ヘルペスウ
イルス（以下、「HSV」と称する）による感染は依然と
して重大な問題である。HSVは、主に口の周囲に生じる
１型と、人体の性器の周辺に生じる２型の二つの型に分
類される。HSV感染から生じる重大な結果をもたらすの
は、皮膚感染とウイルス脳炎の二種類にすぎない。
HSV感染の広範に広がる性質から、原因となるウイルス
を検出する迅速で、簡単で、そして信頼性のある試験方
法にかなりの関心が持たれている。しかしながら、既知
の診断法では、HSVとは区別のできない類似のウイルス
がいくつかある。したがって、HSV−１又はHSV−２に有
効な診断試験は、これらのウイルスのみに特異的であ
り、そしてEBウイルス、サイトメガロウイルス、水痘−
帯状疱疹ウイルス又は他のフローラ等のウイルスに対し
て感受性があってはならない。
を検出する迅速で、簡単で、そして信頼性のある試験方
法にかなりの関心が持たれている。しかしながら、既知
の診断法では、HSVとは区別のできない類似のウイルス
がいくつかある。したがって、HSV−１又はHSV−２に有
効な診断試験は、これらのウイルスのみに特異的であ
り、そしてEBウイルス、サイトメガロウイルス、水痘−
帯状疱疹ウイルス又は他のフローラ等のウイルスに対し
て感受性があってはならない。
HSVは、電気泳動、凝集及び酵素結合イムアッセイ（ELI
SA）をはじめとした種々の分析手法を用いて検出されて
きた。HSV抗原とその抗体の間の免疫複合体が形成され
る技法では、検出感度を向上させるために通常未複合化
物質から複合体が分離される。分離は、濾過、遠心分離
又はアフィニティークロマトグラフィーにより行うこと
ができる。ほとんどの場合、複合体をある種の方法で不
溶化し、そして蒸留水、りん酸緩衝液又は非イオン性界
面活性剤を含有する多数の溶液で洗浄して、未複合化物
質を除去している。
SA）をはじめとした種々の分析手法を用いて検出されて
きた。HSV抗原とその抗体の間の免疫複合体が形成され
る技法では、検出感度を向上させるために通常未複合化
物質から複合体が分離される。分離は、濾過、遠心分離
又はアフィニティークロマトグラフィーにより行うこと
ができる。ほとんどの場合、複合体をある種の方法で不
溶化し、そして蒸留水、りん酸緩衝液又は非イオン性界
面活性剤を含有する多数の溶液で洗浄して、未複合化物
質を除去している。
例えば、米国特許第4,535,057号には、単純ヘルペスウ
イルス抗原のようなウイルス抗原の固相アッセイが記載
されている。このアッセイでは、抗体−抗原複合体を、
トウィーン20の商品名で市販されている非イオン性界面
活性剤を含有するりん酸緩衝生理食塩水で数回洗浄して
いる（前記特許第21欄、第66〜67行参照）。このような
溶液のpHは、一般的に7.0〜7.5である。
イルス抗原のようなウイルス抗原の固相アッセイが記載
されている。このアッセイでは、抗体−抗原複合体を、
トウィーン20の商品名で市販されている非イオン性界面
活性剤を含有するりん酸緩衝生理食塩水で数回洗浄して
いる（前記特許第21欄、第66〜67行参照）。このような
溶液のpHは、一般的に7.0〜7.5である。
上記の洗浄溶液は、通常免疫学的な方法で使用されてい
るが、アッセイの感度の向上とHSV検出における望まし
くないバックグランドシグナルの減少が引き続き必要と
されている。
るが、アッセイの感度の向上とHSV検出における望まし
くないバックグランドシグナルの減少が引き続き必要と
されている。
発明の開示 本発明は、単純ヘルペスウイルスのアッセイに有効な水
性洗浄液であって、pHが約９〜約11.5でアルコールアミ
ン又はその塩と非イオン性界面活性剤を必須のものとし
て含んでなる水性洗浄液を用いることによって分析操作
中で既知の洗浄液を使用する場合の欠点を克服できる。
性洗浄液であって、pHが約９〜約11.5でアルコールアミ
ン又はその塩と非イオン性界面活性剤を必須のものとし
て含んでなる水性洗浄液を用いることによって分析操作
中で既知の洗浄液を使用する場合の欠点を克服できる。
さらに、本発明により、 A.単純ヘルペスウイルス抗原を含有する疑いのある生物
学的被検体を、前記抗原の抗体と接触させて免疫複合体
を生成し、 B.前記の水性洗浄液を用いて未複合化物質を複合体から
分離し、そして C.前記被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標と
して複合体の存在を測定する、ことを含んでなる単純ヘ
ルペスウイルスの測定方法が提供される。
学的被検体を、前記抗原の抗体と接触させて免疫複合体
を生成し、 B.前記の水性洗浄液を用いて未複合化物質を複合体から
分離し、そして C.前記被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標と
して複合体の存在を測定する、ことを含んでなる単純ヘ
ルペスウイルスの測定方法が提供される。
また、本発明によれば、 （ａ）前記の洗浄液と、そして （ｂ）単純ヘルペスウイルス抗原に対する抗体、を含ん
でなる単純ヘルペスウイルスの測定に有効な診断試験キ
ットが提供される。
でなる単純ヘルペスウイルスの測定に有効な診断試験キ
ットが提供される。
本発明のHSVアッセイは、迅速で、信頼性があり、そし
て容易に使用できる。例えば、室温で約30分未満でアッ
セイを行うことができる。本発明のHSVアッセイは、例
えば、HSV細胞若しくはHSV感染細胞又はHSV細胞膜若し
くはHSV感染細胞膜から抽出された抗原の検出に用いる
と非常に信頼性が高い。
て容易に使用できる。例えば、室温で約30分未満でアッ
セイを行うことができる。本発明のHSVアッセイは、例
えば、HSV細胞若しくはHSV感染細胞又はHSV細胞膜若し
くはHSV感染細胞膜から抽出された抗原の検出に用いる
と非常に信頼性が高い。
このアッセイは、非常に感度が高く、バックグランドが
低く、そして抗原−抗体複合体を含有する固体支持体へ
の抗体の非特異的結合を最小限に抑えることができる。
これらの利点は、pHが約９〜約11.5であり、アルコール
アミン又はその塩と非イオン性界面活性剤を含んでなる
本発明の特定の水性洗浄液を用いることにより達成され
る。
低く、そして抗原−抗体複合体を含有する固体支持体へ
の抗体の非特異的結合を最小限に抑えることができる。
これらの利点は、pHが約９〜約11.5であり、アルコール
アミン又はその塩と非イオン性界面活性剤を含んでなる
本発明の特定の水性洗浄液を用いることにより達成され
る。
発明を実施するための最良の形態 本発明は、洗浄水溶液並びに標準的な医学的手法及び微
生物学的手法を用いて患者から得た生物学的被検体中の
HSVの存在を測定する方法に関する。生物学的被検体と
しては、例えば、患者の頚部、尿道、眼、咽喉又は肛門
から得られるスワブ被検体及び滑液又は外傷に由来する
流体等の体液が挙げられる。このようにして得られた生
物学的被検体は、測定すべき抗原を含んだHSV又はHSV感
染細胞を含有する疑いがある。
生物学的手法を用いて患者から得た生物学的被検体中の
HSVの存在を測定する方法に関する。生物学的被検体と
しては、例えば、患者の頚部、尿道、眼、咽喉又は肛門
から得られるスワブ被検体及び滑液又は外傷に由来する
流体等の体液が挙げられる。このようにして得られた生
物学的被検体は、測定すべき抗原を含んだHSV又はHSV感
染細胞を含有する疑いがある。
本発明は、ウイルス細胞若しくはウイルス感染細胞又感
染細胞膜そのものを検出するのに使用できるが、ウイル
ス細胞又はウイルス感染細胞を効果的に溶解して比較的
短時間で感染のよいアッセイを行うのに十分な抗原を放
出させることが好ましい。
染細胞膜そのものを検出するのに使用できるが、ウイル
ス細胞又はウイルス感染細胞を効果的に溶解して比較的
短時間で感染のよいアッセイを行うのに十分な抗原を放
出させることが好ましい。
本発明で検出できる抗原は、HSV−１かHSV−２のいずれ
か一方か、両方の株に存在する。本発明により、ビリオ
ンの糖タンパク質を抽出そして検出することができる。
か一方か、両方の株に存在する。本発明により、ビリオ
ンの糖タンパク質を抽出そして検出することができる。
抗原の抽出は、米国特許第4,430,4370号及び同4,661,34
9号並びにヨーロッパ特許第0183383号に記載されている
ものをはじめとして、いずれの抽出手法又は試薬を用い
ても行うことができる。
9号並びにヨーロッパ特許第0183383号に記載されている
ものをはじめとして、いずれの抽出手法又は試薬を用い
ても行うことができる。
好ましい抽出組成物のpHは、約8.5〜約12である。所望
のpHは、適当な緩衝液か塩基を用いて得ることができ
る。ある種の緩衝液は、塩基がアルカリ性条件を提供す
るだけでなく緩衝能力を有するに十分な強さを有してい
る。他の緩衝液はこのような十分な強さを有しておら
ず、強塩基（水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム等）
を使用して所望のpHとし、次いでその後緩衝液を使用し
てpHを維持する。
のpHは、適当な緩衝液か塩基を用いて得ることができ
る。ある種の緩衝液は、塩基がアルカリ性条件を提供す
るだけでなく緩衝能力を有するに十分な強さを有してい
る。他の緩衝液はこのような十分な強さを有しておら
ず、強塩基（水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム等）
を使用して所望のpHとし、次いでその後緩衝液を使用し
てpHを維持する。
抽出組成物は、一種以上のアルコールアミン又はその塩
を少なくとも約0.05モル濃度、好ましくは約0.1〜約１
のモル濃度で含んでなる。有効なアルコールアミンとし
ては、エタノールアミン、ジエタノールアミン、プロパ
ノールアミン、トリエタールアミン及びそれらの塩（塩
酸塩、硫酸塩、酢酸塩、ピクリン酸塩及びシュウ酸塩
等）が挙げられる。他のアルコールアミンは、当業者に
は容易に明らかとなろう。アルコールアミン類やそれら
の塩類の混合物を必要に応じて用いることができる。
を少なくとも約0.05モル濃度、好ましくは約0.1〜約１
のモル濃度で含んでなる。有効なアルコールアミンとし
ては、エタノールアミン、ジエタノールアミン、プロパ
ノールアミン、トリエタールアミン及びそれらの塩（塩
酸塩、硫酸塩、酢酸塩、ピクリン酸塩及びシュウ酸塩
等）が挙げられる。他のアルコールアミンは、当業者に
は容易に明らかとなろう。アルコールアミン類やそれら
の塩類の混合物を必要に応じて用いることができる。
また、組成物は、アルキルフェノールと酸化エチレンと
の縮合生成物である一種以上の非イオン性界面活性剤も
含んでいる。アルキルフェノールとしては、フェノール
に炭素数１〜20の線状又は分岐状アルキル基の付いたも
のが好ましい。オクチルフェノールが最も好ましい。一
般的に、これらの化合物は、５〜約35個の酸化エチレン
基を有している。これらの非イオン界面活性剤は、公知
の手法及び原料を用いて容易に調製できるが、多くのも
のは市販されている。
の縮合生成物である一種以上の非イオン性界面活性剤も
含んでいる。アルキルフェノールとしては、フェノール
に炭素数１〜20の線状又は分岐状アルキル基の付いたも
のが好ましい。オクチルフェノールが最も好ましい。一
般的に、これらの化合物は、５〜約35個の酸化エチレン
基を有している。これらの非イオン界面活性剤は、公知
の手法及び原料を用いて容易に調製できるが、多くのも
のは市販されている。
他の有効な非イオン性界面活性剤として、トリトン（Tr
iton）（商標）、例えば、トリトンＸ−100（商標）及
びトリトンN101（商標）又はブリジェ（Brij）（商標）
等のポリオキシエチレンエーテル、トウィーン（Twee
n）（例えば、トウィーン−20）の商標で販売されてい
るポリオキシエチレンソルビタン誘導体、及びタージト
ール（Tergitol）（例えば、タージトールNPX及びター
ジトールNP−７）の商標で販売されているポリグリコー
ルエーテルが挙げられるが、これらには限定されない。
他の有用な物質については、特に界面活性剤についての
標準的な文献、マクカッチョンの乳化剤と洗浄剤（McCu
tcheon's Emulsifiers and Detergents）、1986年
版、マクカッチョン・ディビジョン、パブリッシング
社、米国ニュージャージー州グレン・ロックを参照する
ことにより当業者には容易に明らかとなろう。
iton）（商標）、例えば、トリトンＸ−100（商標）及
びトリトンN101（商標）又はブリジェ（Brij）（商標）
等のポリオキシエチレンエーテル、トウィーン（Twee
n）（例えば、トウィーン−20）の商標で販売されてい
るポリオキシエチレンソルビタン誘導体、及びタージト
ール（Tergitol）（例えば、タージトールNPX及びター
ジトールNP−７）の商標で販売されているポリグリコー
ルエーテルが挙げられるが、これらには限定されない。
他の有用な物質については、特に界面活性剤についての
標準的な文献、マクカッチョンの乳化剤と洗浄剤（McCu
tcheon's Emulsifiers and Detergents）、1986年
版、マクカッチョン・ディビジョン、パブリッシング
社、米国ニュージャージー州グレン・ロックを参照する
ことにより当業者には容易に明らかとなろう。
一種以上の非イオン界面活性剤が、抽出組成物中に、総
組成物重量に対して少なくとも約１重量％、好ましくは
約４〜約10重量％の量で存在する。
組成物重量に対して少なくとも約１重量％、好ましくは
約４〜約10重量％の量で存在する。
抽出組成物の第三の必須成分は、コール酸、その塩又は
誘導体の一種以上である。有用な物質としては、コール
酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、デオキ
シコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸カリウ
ム、コール酸アンモニウム及び当業者にとって容易に明
らかとなる他の物質が挙げられるが、これらには限定さ
れない。これらのうち、デオキシコール酸ナトリウムが
最も好ましい。この成分は、組成物中に、総組成物重量
に対して少なくとも約0.2重量％、好ましくは約0.5〜約
５重量％の量で存在する。
誘導体の一種以上である。有用な物質としては、コール
酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、デオキ
シコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸カリウ
ム、コール酸アンモニウム及び当業者にとって容易に明
らかとなる他の物質が挙げられるが、これらには限定さ
れない。これらのうち、デオキシコール酸ナトリウムが
最も好ましい。この成分は、組成物中に、総組成物重量
に対して少なくとも約0.2重量％、好ましくは約0.5〜約
５重量％の量で存在する。
抽出組成物には、陰イオン界面活性剤も、総組成物重量
に対して少なくとも約0.1重量％、好ましくは約0.2〜約
１重量％の量で含まれる。有用な陰イオン界面活性剤と
しては、硫酸アルキルアニオン及びアルカリ金属（例え
ば、リチウム、ナトリウム又はカリウム）又はアンモニ
ウムカチオンを含有する水溶性又は分散性化合物が挙げ
られるが、これらには限定されない。ここで、上記アル
キルは、炭素原子数が約６〜20個のものである。アルキ
ルは、炭素原子数６〜12個（線状又は分岐状ヘキシル、
オクチル、デシル、２−メチルヘキシル及びドデシル基
等）のものが好ましい。また、アリール核に炭素原子を
６〜10個有するアリールスルホン酸又はその塩（上記し
たもの）も有効である。陰イオン界面活性剤の代表例と
しては、ドデシル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナト
リウム、ドデシル硫酸ルビジウム、デシル硫酸ナトリウ
ム、ヘキシル硫酸リチウム、オクチル硫酸カリウム及び
デシル硫酸リチウムが挙げられる。
に対して少なくとも約0.1重量％、好ましくは約0.2〜約
１重量％の量で含まれる。有用な陰イオン界面活性剤と
しては、硫酸アルキルアニオン及びアルカリ金属（例え
ば、リチウム、ナトリウム又はカリウム）又はアンモニ
ウムカチオンを含有する水溶性又は分散性化合物が挙げ
られるが、これらには限定されない。ここで、上記アル
キルは、炭素原子数が約６〜20個のものである。アルキ
ルは、炭素原子数６〜12個（線状又は分岐状ヘキシル、
オクチル、デシル、２−メチルヘキシル及びドデシル基
等）のものが好ましい。また、アリール核に炭素原子を
６〜10個有するアリールスルホン酸又はその塩（上記し
たもの）も有効である。陰イオン界面活性剤の代表例と
しては、ドデシル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナト
リウム、ドデシル硫酸ルビジウム、デシル硫酸ナトリウ
ム、ヘキシル硫酸リチウム、オクチル硫酸カリウム及び
デシル硫酸リチウムが挙げられる。
抽出組成物の任意成分として、アルキル金属塩、アンモ
ニウム塩又はアルカリ土類金属塩等の一種以上の無機塩
がある。塩の代表例としては、塩化ナトリウム（最も好
ましい）、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カル
シウム、硫酸アンモニウム、硫酸バリウム及び当業者に
とって容易に明らかとなる他の物質が挙げられるが、こ
れらには限定されない。塩は、少なくとも0.3モル濃度
で存在するのが好ましく、約0.5〜約２モル濃度で存在
するのがより好ましい。
ニウム塩又はアルカリ土類金属塩等の一種以上の無機塩
がある。塩の代表例としては、塩化ナトリウム（最も好
ましい）、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カル
シウム、硫酸アンモニウム、硫酸バリウム及び当業者に
とって容易に明らかとなる他の物質が挙げられるが、こ
れらには限定されない。塩は、少なくとも0.3モル濃度
で存在するのが好ましく、約0.5〜約２モル濃度で存在
するのがより好ましい。
抗原の抽出は、いずれかの適当な手法を用いて行うこと
ができる。この目的のために特別に設計した適当な抽出
装置を用いて行うのが好ましい。このような装置は、米
国特許第4,746,614号に記載されているもの等、当該技
術分野において多数開示されている。
ができる。この目的のために特別に設計した適当な抽出
装置を用いて行うのが好ましい。このような装置は、米
国特許第4,746,614号に記載されているもの等、当該技
術分野において多数開示されている。
生物学的被検体（濾過済又は未濾過）は、多数の分析手
法のいずれを用いてヘルペス抗原（感染細胞そのものか
ビリオンそのものから抽出）の存在を測定してもよい。
このような手法としては、培養法、カウンター免疫電気
泳動及び血清試験が挙げられ、好ましくないとはいえ、
場合によっては、これらの単に一つの手法が選ばれるか
もしれない。
法のいずれを用いてヘルペス抗原（感染細胞そのものか
ビリオンそのものから抽出）の存在を測定してもよい。
このような手法としては、培養法、カウンター免疫電気
泳動及び血清試験が挙げられ、好ましくないとはいえ、
場合によっては、これらの単に一つの手法が選ばれるか
もしれない。
HSV抗原は、免疫学的に一種以上の適当な抗体と反応さ
せて免疫複合体を生成するイムノアッセイを用いて検出
することが好ましい。HSV−１若しくはHSV−２のいずれ
か一方又は両方から抗原を検出できる。好ましくは両方
が同時に検出される。本発明の洗浄液を用いて複合体か
ら未複合化物質を分離した後、適当な放射性、比色性、
螢光性又は酵素標識試薬を用いて複合体を検出する。あ
る場合には、この試薬は抗原に対する標識抗体であり、
そして他の場合には、標識抗抗体は、抗原に対して反応
性のある未標識抗体に対するものである。
せて免疫複合体を生成するイムノアッセイを用いて検出
することが好ましい。HSV−１若しくはHSV−２のいずれ
か一方又は両方から抗原を検出できる。好ましくは両方
が同時に検出される。本発明の洗浄液を用いて複合体か
ら未複合化物質を分離した後、適当な放射性、比色性、
螢光性又は酵素標識試薬を用いて複合体を検出する。あ
る場合には、この試薬は抗原に対する標識抗体であり、
そして他の場合には、標識抗抗体は、抗原に対して反応
性のある未標識抗体に対するものである。
好ましい実施態様では、複合体はある種の固体支持体
（塗布済又は未塗布）上に固定させ、適当な検出操作を
行う。他のアッセイでは、複合体の形成中に互いに凝集
するある種の標識化又は未標識化粒子に複合体の少なく
とも一種の反応体（抗体等）を付着させるとき免疫複合
体が凝集する。凝集アッセイは、ヨーロッパ特許公開第
0183215号公報で説明されている。
（塗布済又は未塗布）上に固定させ、適当な検出操作を
行う。他のアッセイでは、複合体の形成中に互いに凝集
するある種の標識化又は未標識化粒子に複合体の少なく
とも一種の反応体（抗体等）を付着させるとき免疫複合
体が凝集する。凝集アッセイは、ヨーロッパ特許公開第
0183215号公報で説明されている。
有用なアッセイとしては、例えば、競争イムノアッセ
イ、ラジオイムノアッセイ（放射免疫沈澱を含む）又は
酵素結合免疫吸着剤アッセイ（又は、一般的に「ELIS
A」と呼ばれているもの）が挙げられる。このようなア
ッセイの手法は、一般的に、米国特許第4,430,437号及
び列挙できないほど多数の他の従来技術に記載されてい
る。使用するHSV抗体は、好ましくはビリオン又は細胞
から抽出される一方の抗原に対するものでも、数種の抗
原に対するものでもよい。一実施態様では、抗体は、HS
V−１かHSV−２の単一糖タンパク質に向けられる。他の
実施態様では、異種の抗体の混合物が、HSV−１及びHSV
−２の両方に由来する糖タンパク質の数種の抗原に対す
るものである。さらに、第三実施態様である好ましい態
様では、HSV−１とHSV−２の両方に由来する特異的糖タ
ンパク質と反応する単一抗体が使用される。このアッセ
イで使用される抗体は、購入又は公知の方法も用いて調
製できるポリクローナル抗体か、モノクローナルであ
る。モノクローナル抗体が好ましい。このような抗体の
一つは、モノクローナルで、且つハイブリドーマ細胞系
283−2A1−1D4−2C3（ATCC寄託第HB−9684号）から標準
的な操作法を用いて得られる。
イ、ラジオイムノアッセイ（放射免疫沈澱を含む）又は
酵素結合免疫吸着剤アッセイ（又は、一般的に「ELIS
A」と呼ばれているもの）が挙げられる。このようなア
ッセイの手法は、一般的に、米国特許第4,430,437号及
び列挙できないほど多数の他の従来技術に記載されてい
る。使用するHSV抗体は、好ましくはビリオン又は細胞
から抽出される一方の抗原に対するものでも、数種の抗
原に対するものでもよい。一実施態様では、抗体は、HS
V−１かHSV−２の単一糖タンパク質に向けられる。他の
実施態様では、異種の抗体の混合物が、HSV−１及びHSV
−２の両方に由来する糖タンパク質の数種の抗原に対す
るものである。さらに、第三実施態様である好ましい態
様では、HSV−１とHSV−２の両方に由来する特異的糖タ
ンパク質と反応する単一抗体が使用される。このアッセ
イで使用される抗体は、購入又は公知の方法も用いて調
製できるポリクローナル抗体か、モノクローナルであ
る。モノクローナル抗体が好ましい。このような抗体の
一つは、モノクローナルで、且つハイブリドーマ細胞系
283−2A1−1D4−2C3（ATCC寄託第HB−9684号）から標準
的な操作法を用いて得られる。
有用な固相イムノアッセイでは、抽出された糖タンパク
質抗原は、吸着によるか、あるいは遊離アミン又はスル
フヒドリル基と反応する粒子上の反応性基との共有結合
反応により、高分子小粒子上に「捕捉（capture）」さ
れる。次に、捕捉された抗原を適当な抗体と反応させ
て、結合免疫複合体を生成する、未複合物質は、微孔質
膜フィルターを用いて分離する。
質抗原は、吸着によるか、あるいは遊離アミン又はスル
フヒドリル基と反応する粒子上の反応性基との共有結合
反応により、高分子小粒子上に「捕捉（capture）」さ
れる。次に、捕捉された抗原を適当な抗体と反応させ
て、結合免疫複合体を生成する、未複合物質は、微孔質
膜フィルターを用いて分離する。
好ましいイムノアッセイは、抽出抗原を塗布又は未塗布
微孔質膜フィルター上に捕捉することにより行う。この
微孔質膜フィルターは、未複合物質を得られる免疫複合
体から分離するのにも使用される。別のイムノアッセイ
は、界面活性剤塗布微孔質膜を用いて行われる。微孔質
膜が以下の実施例２に示すような未塗布又は未処理ナイ
ロン物質であることが最も好ましい。
微孔質膜フィルター上に捕捉することにより行う。この
微孔質膜フィルターは、未複合物質を得られる免疫複合
体から分離するのにも使用される。別のイムノアッセイ
は、界面活性剤塗布微孔質膜を用いて行われる。微孔質
膜が以下の実施例２に示すような未塗布又は未処理ナイ
ロン物質であることが最も好ましい。
一般的に、本発明の方法の好ましい実施態様では、ある
種の固体支持体（好ましくは、上記した膜又はビーズ）
を使用して、以下のように行う。抽出抗原を、ガラス、
セルロース材料、セラミック材料又は高分子材料糖の固
定支持体と接触させる。この支持体は、好ましくないイ
ンキュベーション又は他の調整を行うことなく抽出抗原
が急速に結合するいずれかの天然又は合成高分子物質で
構成されていることが好ましい。有用なポリマーとして
は、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポ
リエチレンイミン、セルロール材料及びエチレン系不飽
和ビニルモノマー並びに他の当該技術分野において公知
の材料から製造される付加重合体が挙げられる。一般的
に、膜が正に帯電している場合には、カチオン基が第四
級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、第四級スル
ホニウム塩、第四級ピリジニウム塩、第四級ピリミジニ
ウム塩又は第四級イミダゾリウム塩であり、これらのう
ち第四級アンモニウム塩が好ましい。
種の固体支持体（好ましくは、上記した膜又はビーズ）
を使用して、以下のように行う。抽出抗原を、ガラス、
セルロース材料、セラミック材料又は高分子材料糖の固
定支持体と接触させる。この支持体は、好ましくないイ
ンキュベーション又は他の調整を行うことなく抽出抗原
が急速に結合するいずれかの天然又は合成高分子物質で
構成されていることが好ましい。有用なポリマーとして
は、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポ
リエチレンイミン、セルロール材料及びエチレン系不飽
和ビニルモノマー並びに他の当該技術分野において公知
の材料から製造される付加重合体が挙げられる。一般的
に、膜が正に帯電している場合には、カチオン基が第四
級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、第四級スル
ホニウム塩、第四級ピリジニウム塩、第四級ピリミジニ
ウム塩又は第四級イミダゾリウム塩であり、これらのう
ち第四級アンモニウム塩が好ましい。
好ましい実施態様では、粒子と膜の両方が抽出抗原を捕
捉する微孔質膜に粒子を担持したものを利用する。
捉する微孔質膜に粒子を担持したものを利用する。
支持体の形状は、ビーズ、ゲル、フィルム又は膜等のい
ずれかの適当な形態でよい。本明細書で開示されるよう
な微孔質膜が好ましい。一般的には、この膜の平均孔径
は、約0.1〜約20μｍである。
ずれかの適当な形態でよい。本明細書で開示されるよう
な微孔質膜が好ましい。一般的には、この膜の平均孔径
は、約0.1〜約20μｍである。
本明細書で開示される支持体は、アッセイを行うために
他の器具（ボトル、試験管、スワブ、ビーカー又はカッ
プ）と組み合わせて使用することができる。また、好ま
しくは、支持体は、アッセイを行うことができ、そして
全ての流体を収容することのできる使い捨て試験装置に
嵌め込んだ微孔質膜である。試験装置の有用な形状は、
米国特許第3,825,410号、同3,888,629号、同3,970,429
号及い同4,446,232号をはじめとして当該技術分野にお
いて公知である。特に有用な装置が、ヨーロッパ特許公
開第0280558号公報に記載されている。
他の器具（ボトル、試験管、スワブ、ビーカー又はカッ
プ）と組み合わせて使用することができる。また、好ま
しくは、支持体は、アッセイを行うことができ、そして
全ての流体を収容することのできる使い捨て試験装置に
嵌め込んだ微孔質膜である。試験装置の有用な形状は、
米国特許第3,825,410号、同3,888,629号、同3,970,429
号及い同4,446,232号をはじめとして当該技術分野にお
いて公知である。特に有用な装置が、ヨーロッパ特許公
開第0280558号公報に記載されている。
抗原が支持体と接触すると直ちに、抗原が支持体に結合
する。結合は直接でもよい。このことは、抗原が、支持
体に付着している結合性生物学的化合物（抗体等）を介
しては結合していないことを意味しているが、上記の結
合性化合物を介して間接的に結合していてもよい。未結
合物質は、本発明の洗浄液（以下で述べる）を用いて洗
い流すことができる。
する。結合は直接でもよい。このことは、抗原が、支持
体に付着している結合性生物学的化合物（抗体等）を介
しては結合していないことを意味しているが、上記の結
合性化合物を介して間接的に結合していてもよい。未結
合物質は、本発明の洗浄液（以下で述べる）を用いて洗
い流すことができる。
接触の約10分以内、好ましくは10〜120秒以内に、結合
抗原を、HSV抗原の適当な抗体（又はその混合物）と接
触させて、支持体上に免疫複合体を形成する。アッセイ
を使い捨て試験装置を用いて行う場合には、支持体は抗
原が粒子に結合するにつれて流体と被検体中の未複合物
質が通過できる微孔質膜であることができる。
抗原を、HSV抗原の適当な抗体（又はその混合物）と接
触させて、支持体上に免疫複合体を形成する。アッセイ
を使い捨て試験装置を用いて行う場合には、支持体は抗
原が粒子に結合するにつれて流体と被検体中の未複合物
質が通過できる微孔質膜であることができる。
好ましい実施態様では、抗原に対する抗体を標識して検
出を行う。有用な標識が当該技術分野において公知であ
り、適当な手法及び装置を用いて直接又は間接的に検出
できる化学的化合物又は生物学的化合物並びに化学的又
は特異的結合反応により検出可能な種を生成して検出す
ることができる化合物が挙げられる。有用な標識として
は、例えば、ラジオアイソトープ、酵素、補酵素、酵素
インヒビター、螢光化合物、化学発光化合物、リン光性
化合物、補因子、ビオチン又はその誘導体、アビジン又
はその誘導体、フェリチン、磁性粒子、染色粒子及び当
業者にとって容易に明らかとなる他の標識が挙げられ
る。ラジオアイソトープ又は酵素が好ましい標識であ
る。標識は、公知の手法を用いて抗体に付着できる。標
識が直接検出可能でない場合には、反応生成物又は特異
的結合生成物を検出可能にするためにさらに試薬又は化
合物が必要となる。例えば、標識がビオチンである場合
には、酵素と結合して検出可能な種を生成するするアビ
ジンと反応できる。標識が、グルコースオキシダーゼ、
ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファタ
ーゼ等の酵素の場合、基質及び色素生成試薬も必要であ
る。ペルオキシダーゼとアルカリ性ホスファターゼが特
に有用である。
出を行う。有用な標識が当該技術分野において公知であ
り、適当な手法及び装置を用いて直接又は間接的に検出
できる化学的化合物又は生物学的化合物並びに化学的又
は特異的結合反応により検出可能な種を生成して検出す
ることができる化合物が挙げられる。有用な標識として
は、例えば、ラジオアイソトープ、酵素、補酵素、酵素
インヒビター、螢光化合物、化学発光化合物、リン光性
化合物、補因子、ビオチン又はその誘導体、アビジン又
はその誘導体、フェリチン、磁性粒子、染色粒子及び当
業者にとって容易に明らかとなる他の標識が挙げられ
る。ラジオアイソトープ又は酵素が好ましい標識であ
る。標識は、公知の手法を用いて抗体に付着できる。標
識が直接検出可能でない場合には、反応生成物又は特異
的結合生成物を検出可能にするためにさらに試薬又は化
合物が必要となる。例えば、標識がビオチンである場合
には、酵素と結合して検出可能な種を生成するするアビ
ジンと反応できる。標識が、グルコースオキシダーゼ、
ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファタ
ーゼ等の酵素の場合、基質及び色素生成試薬も必要であ
る。ペルオキシダーゼとアルカリ性ホスファターゼが特
に有用である。
特に好ましい実施態様では、標識がペルーオキシダーゼ
であり、そしてアッセイのある時点で、過酸化水素及び
適当な色素形成試薬を添加して、検出可能な色素を生成
する。有用な色素生成試薬としては、例えば、テトラメ
チルベンジジン及びその誘導体、並びにトリアリールイ
ミダゾールロイコ染料等のロイコ染料（米国特許第4,08
9,747号に記載されているようなもの）又はペルオキシ
ダーゼ及び過酸化水素の存在下で反応して色素を生成す
る他の化合物（即ち、ペルオキシダーゼの触媒作用で反
応して色素を生成する化合物）が挙げられる。
であり、そしてアッセイのある時点で、過酸化水素及び
適当な色素形成試薬を添加して、検出可能な色素を生成
する。有用な色素生成試薬としては、例えば、テトラメ
チルベンジジン及びその誘導体、並びにトリアリールイ
ミダゾールロイコ染料等のロイコ染料（米国特許第4,08
9,747号に記載されているようなもの）又はペルオキシ
ダーゼ及び過酸化水素の存在下で反応して色素を生成す
る他の化合物（即ち、ペルオキシダーゼの触媒作用で反
応して色素を生成する化合物）が挙げられる。
別の実施態様では、HSV抗体を標識せず、そして形成さ
れ支持体に結合した抗体−抗原複合体を、HSV抗体に特
異的で検出のために適当に標識した（上記した方法で）
第二抗体（以下で説明する）を用いて検出を行う。
れ支持体に結合した抗体−抗原複合体を、HSV抗体に特
異的で検出のために適当に標識した（上記した方法で）
第二抗体（以下で説明する）を用いて検出を行う。
アッセイで用いる抗体は、支持体上での非特異的相互作
用を減少させる一種以上のブロッキングタンパク質との
混合物の形態で供給できる。有用なタンパク質は周知で
あり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウシ胎児血清
及びブタガンマグロブリンが挙げられる。有用なブロッ
キング組成物の一つは、非免疫ブロッキングタンパク質
及び両性界面活性剤を含有している。
用を減少させる一種以上のブロッキングタンパク質との
混合物の形態で供給できる。有用なタンパク質は周知で
あり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウシ胎児血清
及びブタガンマグロブリンが挙げられる。有用なブロッ
キング組成物の一つは、非免疫ブロッキングタンパク質
及び両性界面活性剤を含有している。
支持体に結合した免疫複合体の生成を早めるために、抗
体と抗原を、一般的に、約15〜約30℃の温度で10分以下
インキュベーションする。このインキュベーションは、
室温で（即ち、18〜25℃）で５分まで行うことが好まし
い。
体と抗原を、一般的に、約15〜約30℃の温度で10分以下
インキュベーションする。このインキュベーションは、
室温で（即ち、18〜25℃）で５分まで行うことが好まし
い。
インキュベーション後で、且つ抗体−抗原接触の約10分
以内に、結合複合体を一回以上、水性洗浄液で洗浄す
る。このような洗浄の少なくとも一回は、本発明の洗浄
液（以下で説明する）を用いて行う。
以内に、結合複合体を一回以上、水性洗浄液で洗浄す
る。このような洗浄の少なくとも一回は、本発明の洗浄
液（以下で説明する）を用いて行う。
HSV抗体が標識されている場合について上記で説明した
実施態様では、洗浄後のアッセイ手法として、適当な試
薬を添加後に標識を直接又は間接的に検出する。これ
は、結合複合体を洗浄後、比較的迅速になされる。必要
に応じて、試薬に悪影響がなければ、インキュベーショ
ンを行って検出を早めてもよい。次に、適当な時間のあ
とに、標準装置と標準手法を用いて標識を検出する。
実施態様では、洗浄後のアッセイ手法として、適当な試
薬を添加後に標識を直接又は間接的に検出する。これ
は、結合複合体を洗浄後、比較的迅速になされる。必要
に応じて、試薬に悪影響がなければ、インキュベーショ
ンを行って検出を早めてもよい。次に、適当な時間のあ
とに、標準装置と標準手法を用いて標識を検出する。
HSV抗体が未標識の場合、結合を洗浄後、未標識抗体に
対する抗体と接触させる。この第二抗体（即ち、抗抗
体）を、上記した標識のいずれかで適当に標識し、そし
て上記してブロッキング組成物とともに供給することが
できる。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルで
もよく、そして購入したものでも、公知の手法で調製し
たものでもよい。
対する抗体と接触させる。この第二抗体（即ち、抗抗
体）を、上記した標識のいずれかで適当に標識し、そし
て上記してブロッキング組成物とともに供給することが
できる。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルで
もよく、そして購入したものでも、公知の手法で調製し
たものでもよい。
この接触後、得られる粒子に結合した抗原−抗体−抗体
複合体を約10分以下、約15〜約30℃の温度でインキュベ
ーションする。インキュベーションは、室温で約５分ま
で行うことが好ましい。
複合体を約10分以下、約15〜約30℃の温度でインキュベ
ーションする。インキュベーションは、室温で約５分ま
で行うことが好ましい。
さらなる洗浄を行って未複合物質を除去し、そして適当
な酵素基質又は他の必要な試薬を添加して検出可能な種
を生成する。結合抗原−抗体−標識抗体複合体は、次
に、標準的な放射性、比色性、螢光性又は他の検出法を
用いて支持体上で検出する。
な酵素基質又は他の必要な試薬を添加して検出可能な種
を生成する。結合抗原−抗体−標識抗体複合体は、次
に、標準的な放射性、比色性、螢光性又は他の検出法を
用いて支持体上で検出する。
本発明の洗浄液は、本発明の方法を通じて一回以上使用
することができ、上記したようにバックグランドを低く
し、そして感度を高めることができる。さらに、本発明
の洗浄液を少なくとも一回、好ましくは最初の洗浄工程
で使用するならば、標準的な洗浄液を使用することもで
きる。
することができ、上記したようにバックグランドを低く
し、そして感度を高めることができる。さらに、本発明
の洗浄液を少なくとも一回、好ましくは最初の洗浄工程
で使用するならば、標準的な洗浄液を使用することもで
きる。
本発明の水性洗浄液のpHは、約９〜約11.5であり、好ま
しくは約10〜約11である。一種以上の適当な緩衝液又は
強塩基を用いてこのpHとすることができる。有用な塩基
としては、アルカリ金属水酸化物又はアンモニウム水酸
化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化ア
ンモニウム及び他の当該技術分野において公知のもの
等）が挙げられるが、これらに限定されない。場合によ
っては、所望のレベルまでpHを上昇させるのに緩衝液で
十分なことがあるが、他の場合には、pHを上昇させるの
に強塩基を使用後、緩衝液でpHを維持する必要がある。
例えば、アルコールアミン又はその塩を使用し、そして
約9.5を超えるpHが望ましいときには、溶液のpHを上昇
させるのには水酸化ナトリウム等の強塩基が必要であ
る。
しくは約10〜約11である。一種以上の適当な緩衝液又は
強塩基を用いてこのpHとすることができる。有用な塩基
としては、アルカリ金属水酸化物又はアンモニウム水酸
化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化ア
ンモニウム及び他の当該技術分野において公知のもの
等）が挙げられるが、これらに限定されない。場合によ
っては、所望のレベルまでpHを上昇させるのに緩衝液で
十分なことがあるが、他の場合には、pHを上昇させるの
に強塩基を使用後、緩衝液でpHを維持する必要がある。
例えば、アルコールアミン又はその塩を使用し、そして
約9.5を超えるpHが望ましいときには、溶液のpHを上昇
させるのには水酸化ナトリウム等の強塩基が必要であ
る。
洗浄液は、実質的にアルコールアミン又はその塩からな
り、約0.05モル濃度から、好ましくは約0.1〜約１モル
濃度である。有用なアルコールアミンとしては、エタノ
ールアミン、ジエタノールアミン、プロパノールアミ
ン、トリエタノールアミン及びそれらの塩（塩酸塩、硫
酸塩、酢酸塩、ピクリン酸塩及びシュウ酸塩等）が挙げ
られる。他のものは当業者には容易に明らかとなろう。
必要に応じて、アルコールアミン類又はそれらの塩類の
混合物を使用することができる。エタノールアミン又は
その塩が特に好ましい。
り、約0.05モル濃度から、好ましくは約0.1〜約１モル
濃度である。有用なアルコールアミンとしては、エタノ
ールアミン、ジエタノールアミン、プロパノールアミ
ン、トリエタノールアミン及びそれらの塩（塩酸塩、硫
酸塩、酢酸塩、ピクリン酸塩及びシュウ酸塩等）が挙げ
られる。他のものは当業者には容易に明らかとなろう。
必要に応じて、アルコールアミン類又はそれらの塩類の
混合物を使用することができる。エタノールアミン又は
その塩が特に好ましい。
また、洗浄液は、一種以上の水溶性又は水分散性の非イ
オン界面活性剤も含んでおり、この量は総溶液重量に対
して少なくとも約0.05重量％、好ましくは約0.1〜約２
重量％である。有用な界面活性剤としては、トリトン
（Triton）（商標）（例えば、トリトン（商標）Ｘ−10
0）として販売されているもの又はブリジェ（Brij）
（例えば、ブリジェ30）の商標で販売されているもの等
のポリオキシエチレンエーテル、トウィーン（Tween）
（例えば、トウィーン−20、トウィーン21、トウィーン
40）の商標で販売されているポリオキシエチレンソルビ
タン、タージトール（Tergitol）（例えば、タージトー
ルNP−７）の商標で販売されているポリグリコールエー
テルが挙げられるが、これらに限定されない。
オン界面活性剤も含んでおり、この量は総溶液重量に対
して少なくとも約0.05重量％、好ましくは約0.1〜約２
重量％である。有用な界面活性剤としては、トリトン
（Triton）（商標）（例えば、トリトン（商標）Ｘ−10
0）として販売されているもの又はブリジェ（Brij）
（例えば、ブリジェ30）の商標で販売されているもの等
のポリオキシエチレンエーテル、トウィーン（Tween）
（例えば、トウィーン−20、トウィーン21、トウィーン
40）の商標で販売されているポリオキシエチレンソルビ
タン、タージトール（Tergitol）（例えば、タージトー
ルNP−７）の商標で販売されているポリグリコールエー
テルが挙げられるが、これらに限定されない。
特に有用な非イオン界面活性剤は、上記したポリエチレ
ンエーテル及びポリオキシエチレンソルビタン、とりわ
けトウィーン20（商標）である。他の有用な物質につい
ては、特に界面活性剤についての標準的な文献、「マク
カッチョンの乳化剤と洗浄剤（McCutcheon's Emulsifi
ers and Detergents）」、1986年版、マクカッチョン
・ディビジョン、パブリッシング社、米国ニュージャー
ジー州グレン・ロックを参照することにより当業者には
容易に明らかとなろう。
ンエーテル及びポリオキシエチレンソルビタン、とりわ
けトウィーン20（商標）である。他の有用な物質につい
ては、特に界面活性剤についての標準的な文献、「マク
カッチョンの乳化剤と洗浄剤（McCutcheon's Emulsifi
ers and Detergents）」、1986年版、マクカッチョン
・ディビジョン、パブリッシング社、米国ニュージャー
ジー州グレン・ロックを参照することにより当業者には
容易に明らかとなろう。
本発明の代表的な洗浄液とその調製を、以下の実施例１
で説明する。
で説明する。
単純ヘルペスウイルスの好ましい測定方法は、 A.使い捨て試験装置内で生物学的被検体から抽出された
HSV抗原を含有する疑いのある溶液と固体支持体とを抗
原が固体支持体に結合することができるのに十分な時間
接触させ、 B.本発明の水性洗浄液を用いて結合抗原から未結合物質
を洗い出し、 C.結合抗原をそれに対する抗体と接触させて固体支持体
に結合した免疫複合体を形成し、 D.水性洗浄液（好ましくは本発明のもの）を用いて、複
合体から未複合化物質を分離し、そして E.前記被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標と
して結合複合体の存在を測定することを含む。
HSV抗原を含有する疑いのある溶液と固体支持体とを抗
原が固体支持体に結合することができるのに十分な時間
接触させ、 B.本発明の水性洗浄液を用いて結合抗原から未結合物質
を洗い出し、 C.結合抗原をそれに対する抗体と接触させて固体支持体
に結合した免疫複合体を形成し、 D.水性洗浄液（好ましくは本発明のもの）を用いて、複
合体から未複合化物質を分離し、そして E.前記被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標と
して結合複合体の存在を測定することを含む。
本発明の洗浄液は、必要に応じて、一種以上の他の試
薬、診断器具又は他の有用な材料も含まれている診断試
験キットの一部分として供給することができる。一般的
には、キットは、HSV抗原に対する少なくとも抗体（標
識化又は未標識化）を含んでいる。また、抗抗体（必要
に応じて）、抽出組成物、抽出装置、試験装置、色素生
成試薬又は組成物、ピペット、使用説明書、スワブ及び
アッセイを行うのに有用な他の構成部材をも含むことが
できる。構成部材は、いずれかの適当な方法で梱包し、
一個以上の梱包又は容器で供給できる。
薬、診断器具又は他の有用な材料も含まれている診断試
験キットの一部分として供給することができる。一般的
には、キットは、HSV抗原に対する少なくとも抗体（標
識化又は未標識化）を含んでいる。また、抗抗体（必要
に応じて）、抽出組成物、抽出装置、試験装置、色素生
成試薬又は組成物、ピペット、使用説明書、スワブ及び
アッセイを行うのに有用な他の構成部材をも含むことが
できる。構成部材は、いずれかの適当な方法で梱包し、
一個以上の梱包又は容器で供給できる。
下記の材料、組成物及び溶液を実施例で使用した。実施
例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範
囲は実施例には限定されない。
例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範
囲は実施例には限定されない。
抗体の調製 単純ヘルペスウイルスに対するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞を、ケーラー（Ｋhler）等
〔ネーチャー（Nature）、256、495〜497（1975）〕に
記載されている公知の手法を用いて調製した。HSV−１
とHSV−２との両方に共通の糖タンパク質の抗原決定基
に対して反応性のあるモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞系が生じた。このハイブリドーマ細胞
系は、ATCC第HB−9684号として寄託した。
生するハイブリドーマ細胞を、ケーラー（Ｋhler）等
〔ネーチャー（Nature）、256、495〜497（1975）〕に
記載されている公知の手法を用いて調製した。HSV−１
とHSV−２との両方に共通の糖タンパク質の抗原決定基
に対して反応性のあるモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞系が生じた。このハイブリドーマ細胞
系は、ATCC第HB−9684号として寄託した。
抗原の調製 正対照として使用するための抗原を調製するために、HS
V−１株ＦとHSV−２株Ｇを別々にHEPG−２細胞（ATCC第
CCL−23号）中で増殖させた。感染細胞は、低速遠心分
離でペレット化した。ペレットを、コレックス（Core
x）管中で、15mlの容量までりん酸緩衝生理食塩水に再
懸濁した。再懸濁細胞を超音波破砕し、アミノメチルト
リオキサレン（500mg/ml）に15分間暴露後、一定に撹拌
しながら紫外線を15分間照射した。
V−１株ＦとHSV−２株Ｇを別々にHEPG−２細胞（ATCC第
CCL−23号）中で増殖させた。感染細胞は、低速遠心分
離でペレット化した。ペレットを、コレックス（Core
x）管中で、15mlの容量までりん酸緩衝生理食塩水に再
懸濁した。再懸濁細胞を超音波破砕し、アミノメチルト
リオキサレン（500mg/ml）に15分間暴露後、一定に撹拌
しながら紫外線を15分間照射した。
試験装置の正対照ウエルにはHSV−１抗原及びHSV−２抗
原（UV不活性化及び洗浄剤で溶解したもの）が入ってお
り、ウシ胎児血清アルブミン（0.1重量％）と親水性ポ
リマー（５重量％）との混合物の形態で試験ウエルの濾
過膜に取り込んだ。
原（UV不活性化及び洗浄剤で溶解したもの）が入ってお
り、ウシ胎児血清アルブミン（0.1重量％）と親水性ポ
リマー（５重量％）との混合物の形態で試験ウエルの濾
過膜に取り込んだ。
抗体複合体の調製 単純ヘルペスウイルスに対するモノクローナル抗体を、
ヨシタケ等、ユーロ・ジェイ・バイオケム（Eur.J.Bioc
hem.）、101、395（1979）に記載されている方法を用い
て、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた。得られ
た結合体を、α−カゼイン（0.5重量％）、トウィーン2
0非イオン性界面活性剤（0.1重量％）、チメロサール防
腐剤（0.01重量％）及びｐ−メトキシフェノール（100
ミリモル濃度）を含有するブロッキング組成物と混合
後、無菌濾過した。この溶液の最終抗体濃度は1.5μg/m
lであった。これをウシ血清アルブミン（１重量％）と
ともに保存した。試験装置の負対照ウエル用の複合体
は、上記した手法を用いて調製したクレアチンキナーゼ
に対するペルオキシダーゼ標識抗体であった。
ヨシタケ等、ユーロ・ジェイ・バイオケム（Eur.J.Bioc
hem.）、101、395（1979）に記載されている方法を用い
て、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた。得られ
た結合体を、α−カゼイン（0.5重量％）、トウィーン2
0非イオン性界面活性剤（0.1重量％）、チメロサール防
腐剤（0.01重量％）及びｐ−メトキシフェノール（100
ミリモル濃度）を含有するブロッキング組成物と混合
後、無菌濾過した。この溶液の最終抗体濃度は1.5μg/m
lであった。これをウシ血清アルブミン（１重量％）と
ともに保存した。試験装置の負対照ウエル用の複合体
は、上記した手法を用いて調製したクレアチンキナーゼ
に対するペルオキシダーゼ標識抗体であった。
ロイコ染料生成組成物 この組成物は、過酸化水素（10ミリモル濃度）、２−
（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−4,5−ビ
ス（４−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料
（0.005重量％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１重量
％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃
度）及びジエチレントリアミン五酢酸（10ミリモル濃
度）を含有するものであった。
（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−4,5−ビ
ス（４−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料
（0.005重量％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１重量
％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃
度）及びジエチレントリアミン五酢酸（10ミリモル濃
度）を含有するものであった。
過酸化水素溶液 過酸化水素（10重量％）、ジエチレントリアミン五酢酸
（0.005重量％）及び防腐剤（0.01重量％）を含有する
水溶液を調製した。
（0.005重量％）及び防腐剤（0.01重量％）を含有する
水溶液を調製した。
抽出組成物 下記の成分を水中で混合することにより抽出組成物を調
製した：ノニデットNP−40（Nonidet NP−40）非イオ
ン性界面活性剤（５重量％、商標）、デオキシコール酸
ナトリウム（0.75重量％）、ドデシル硫酸ナトリウム陰
イオン界面活性剤（0.4重量％）及び塩化ナトリウム
（１モル濃度）。この組成物のpHを12N水酸化ナトリウ
ムで10.75に調整した。
製した：ノニデットNP−40（Nonidet NP−40）非イオ
ン性界面活性剤（５重量％、商標）、デオキシコール酸
ナトリウム（0.75重量％）、ドデシル硫酸ナトリウム陰
イオン界面活性剤（0.4重量％）及び塩化ナトリウム
（１モル濃度）。この組成物のpHを12N水酸化ナトリウ
ムで10.75に調整した。
りん酸緩衝生理食塩水 この溶液（0.05モル濃度）は、塩化ナトリウム（0.15モ
ル濃度）、りん酸二水素ナトリウム（0.01モル濃度）及
びりん酸水素ナトリウム（pH7.2、0.04モル濃度）から
調製した。
ル濃度）、りん酸二水素ナトリウム（0.01モル濃度）及
びりん酸水素ナトリウム（pH7.2、0.04モル濃度）から
調製した。
ブロッキング組成物 α−カゼイン（0.5重量％）、トウイーン20（0.1重量
％）、ｐ−メトキシフェノール（100ミリモル濃度）及
び防腐剤（0.01重量％）を含有する水性ブロッキング組
成物を調製した。
％）、ｐ−メトキシフェノール（100ミリモル濃度）及
び防腐剤（0.01重量％）を含有する水性ブロッキング組
成物を調製した。
３個の試験ウエルを有する使い捨て試験装置をアッセイ
に用いた。この試験装置の各試験ウエルには、未塗布ナ
イロン微孔質膜〔バイオダインＡ（Biodyne Ａ）（商
標）〕が付いているものであった。
に用いた。この試験装置の各試験ウエルには、未塗布ナ
イロン微孔質膜〔バイオダインＡ（Biodyne Ａ）（商
標）〕が付いているものであった。
実施例１ 洗浄溶液 下記の物質を水中で混合することにより本発明の洗浄液
を調製した：トウィーン20非イオン界面活性剤（商標、
0.1重量％）及びチメロサール防腐剤（0.01重量％）、
エタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃度）及びチメロサ
ール防腐剤（0.01重量％）。溶液のpHは、12N水酸化ナ
トリウムを添加することにより10.75まで上昇させた。
を調製した：トウィーン20非イオン界面活性剤（商標、
0.1重量％）及びチメロサール防腐剤（0.01重量％）、
エタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃度）及びチメロサ
ール防腐剤（0.01重量％）。溶液のpHは、12N水酸化ナ
トリウムを添加することにより10.75まで上昇させた。
実施例２ HSV−１及びHSV−２のアッセイ この実施例では、HSV−１かHSV−２又はそれらの両方を
含有する患者からの被検体を用いた本発明を説明する。
被検体は、各患者について２本のスワブを用いていくつ
かの診療所と病院で種々の患者から得た。１本のスワブ
は、診療所又は病院でシュアセル（Surecell）（商標）
試験装置において本発明を実施するのに使用し、そして
第二のスワブは、標準的な培養法を用いる追試に使用し
た。
含有する患者からの被検体を用いた本発明を説明する。
被検体は、各患者について２本のスワブを用いていくつ
かの診療所と病院で種々の患者から得た。１本のスワブ
は、診療所又は病院でシュアセル（Surecell）（商標）
試験装置において本発明を実施するのに使用し、そして
第二のスワブは、標準的な培養法を用いる追試に使用し
た。
各患者由来の第一のスワブを、抽出管に置き、そして上
記した抽出組成物（１μ）を添加した。スワブを抽出
溶液中で１〜２分間かきまぜ、その後得られた抽出物
を、フィルター装置〔上層としてポリエステルプラグ、
中間層として10μmHDC〔商標、ポール社（Pall Cor
p.）〕及び下層として５μｍロプロダイン（Loprodyn
e）（商標）フィルター（ポール社製）〕から構成され
ている〕を通して予備濾過した。
記した抽出組成物（１μ）を添加した。スワブを抽出
溶液中で１〜２分間かきまぜ、その後得られた抽出物
を、フィルター装置〔上層としてポリエステルプラグ、
中間層として10μmHDC〔商標、ポール社（Pall Cor
p.）〕及び下層として５μｍロプロダイン（Loprodyn
e）（商標）フィルター（ポール社製）〕から構成され
ている〕を通して予備濾過した。
次に、予備濾過した抽出物（200ml）を各試験装置の各
ウエルに配置して、HSV抗原をウエルの膜に吸着させ
た。
ウエルに配置して、HSV抗原をウエルの膜に吸着させ
た。
試験ウエルを実施例１の洗浄液（120μ）で洗浄し、
そして上記した過酸化水素溶液（120μ）を各ウエル
に添加して非特異的オキシダーゼを除去した。ウエルを
再び洗浄液（120μ）で洗浄した。上記したブロッキ
ング組成物に標識抗クレアチンキナーゼ複合体（３μg/
ml）を含ませた試料（40μ）を、各試験装置の負対照
ウエルに添加した。抗HSV結合物の試料（40μ）を各
装置の他の２つのウエルに添加した。
そして上記した過酸化水素溶液（120μ）を各ウエル
に添加して非特異的オキシダーゼを除去した。ウエルを
再び洗浄液（120μ）で洗浄した。上記したブロッキ
ング組成物に標識抗クレアチンキナーゼ複合体（３μg/
ml）を含ませた試料（40μ）を、各試験装置の負対照
ウエルに添加した。抗HSV結合物の試料（40μ）を各
装置の他の２つのウエルに添加した。
室温で５分間インキュベーションして抗体−抗原複合化
を行った後、ウエルを実施例１の洗浄溶液で２回（毎回
200μ）洗浄した。
を行った後、ウエルを実施例１の洗浄溶液で２回（毎回
200μ）洗浄した。
上記したロイコ染料組成物（40μ）を各試験ウエルに
添加し、そして室温で５分間インキュベーションした
後、膜上の赤みがかった色素の存在を、検体中のHSV抗
原の存在の指標として評価した。試験した患者試料につ
いての感度（真の陽性を真の陽性と偽の陰性との合計で
割ったもの）は83％であり、特異性（真の陰性と偽の陽
性との合計で割ったもの）は100％であった。この方法
による全ての陽性の結果は、培養法による結果により確
認された。
添加し、そして室温で５分間インキュベーションした
後、膜上の赤みがかった色素の存在を、検体中のHSV抗
原の存在の指標として評価した。試験した患者試料につ
いての感度（真の陽性を真の陽性と偽の陰性との合計で
割ったもの）は83％であり、特異性（真の陰性と偽の陽
性との合計で割ったもの）は100％であった。この方法
による全ての陽性の結果は、培養法による結果により確
認された。
実施例３〜５ 比較例 単純ヘルペスウイルスに関して、本発明の洗浄液を、本
発明の範囲外の３種の洗浄液と比較した。
発明の範囲外の３種の洗浄液と比較した。
材料 実施例3:洗浄液を実施例１と同様に調製した。
実施例4:トウィーン20の代わりにタージトール７（商
標、0.1重量％）を使用した以外は、洗浄液は実施例１
のものと同様であった。
標、0.1重量％）を使用した以外は、洗浄液は実施例１
のものと同様であった。
実施例5:トウィーン20の代わりにトリトン（商標）Ｘ−
100（0.1重量％）を使用した以外は、洗浄液は実施例１
のものと同様であった。
100（0.1重量％）を使用した以外は、洗浄液は実施例１
のものと同様であった。
対照A:この洗浄液は、塩化ナトリウム水溶液（１モル濃
度、pH6.86）であった。
度、pH6.86）であった。
対照B:この洗浄液はエタノールアミン塩酸塩（１モル濃
度）、塩化ナトリウム（0.26モル濃度）及びトウィーン
20非イオン界面活性剤（商標、0.1重量％）を含有して
おり、そしてpHは８であった。
度）、塩化ナトリウム（0.26モル濃度）及びトウィーン
20非イオン界面活性剤（商標、0.1重量％）を含有して
おり、そしてpHは８であった。
対照C:この洗浄液は塩化ナトリウム（１モル濃度）とト
リトン（商標）Ｘ−100非イオン界面活性剤（0.1重量
％）を含有しており、そしてpHは6.86であった。
リトン（商標）Ｘ−100非イオン界面活性剤（0.1重量
％）を含有しており、そしてpHは6.86であった。
アッセイ 試験試料を下記のようにして調製した。抗原と細胞を含
有するHSV細胞溶菌液（上記したもの）（40μ）（希
釈率1:40）を、上記した抽出組成物（3960μ）と混合
し、そして室温で２分間インキュベーションした。この
混合物を、フィルター装置〔上層としてポリエステルプ
ラグ、中間層として10μmHDC〔商標、ポール社（Pall
Corp.）〕及び下層として５μｍロプロダイン（Loprody
ne）（商標）フィルター（ポール社製）〕から構成され
ている〕を通して予備濾過し、そして試料（200μ）
を、シュアセル（商標）試験装置の各試験ウエルに添加
した。１個のウエルを負対照として使用し、そして他の
２個のウエルをアッセイ用の試験ウエルとして使用し
た。
有するHSV細胞溶菌液（上記したもの）（40μ）（希
釈率1:40）を、上記した抽出組成物（3960μ）と混合
し、そして室温で２分間インキュベーションした。この
混合物を、フィルター装置〔上層としてポリエステルプ
ラグ、中間層として10μmHDC〔商標、ポール社（Pall
Corp.）〕及び下層として５μｍロプロダイン（Loprody
ne）（商標）フィルター（ポール社製）〕から構成され
ている〕を通して予備濾過し、そして試料（200μ）
を、シュアセル（商標）試験装置の各試験ウエルに添加
した。１個のウエルを負対照として使用し、そして他の
２個のウエルをアッセイ用の試験ウエルとして使用し
た。
抽出組成物のみを含有するバックグランド試料（各200
μ）も、試験装置に添加した。
μ）も、試験装置に添加した。
各洗浄液（120μ）を装置の試験ウエルに添加後、過
酸化水素溶液（120μ）を添加し、二度目の洗浄（120
μ）を行った。次に、上記したブロッキング溶液にペ
ルオキシダーゼ標識抗HSV複合体（1.5μg/ml）を含有せ
しめた溶液（40μ）を、各装置の試験ウエルに添加し
た。ペルオキシダーゼ標識抗クレアチンキナーゼ複合体
を含有する溶液（40μ、３μｇ）を、各負対照ウエル
に添加した。室温で５分間インキュベーションした後、
各ウエルを洗浄液（毎回120μ）で２回洗浄した。上
記したロイコ染料生成組成（40μ）を各ウエルに添加
後、室温でさらに５分間インキュベーションした。試験
ウエルの膜上の色素濃度を目視し、０から10まで段階付
けした。０は色素濃度が観察されない場合であり、10は
最も高い濃度である。結果を下記の表に示す。アッセイ
の結果は、各装置についての２個の試験ウエルの平均を
表す。
酸化水素溶液（120μ）を添加し、二度目の洗浄（120
μ）を行った。次に、上記したブロッキング溶液にペ
ルオキシダーゼ標識抗HSV複合体（1.5μg/ml）を含有せ
しめた溶液（40μ）を、各装置の試験ウエルに添加し
た。ペルオキシダーゼ標識抗クレアチンキナーゼ複合体
を含有する溶液（40μ、３μｇ）を、各負対照ウエル
に添加した。室温で５分間インキュベーションした後、
各ウエルを洗浄液（毎回120μ）で２回洗浄した。上
記したロイコ染料生成組成（40μ）を各ウエルに添加
後、室温でさらに５分間インキュベーションした。試験
ウエルの膜上の色素濃度を目視し、０から10まで段階付
けした。０は色素濃度が観察されない場合であり、10は
最も高い濃度である。結果を下記の表に示す。アッセイ
の結果は、各装置についての２個の試験ウエルの平均を
表す。
これらの結果から明らかなように、低いpH（即ち、９未
満）を有する洗浄液は、シグナルが高いばかりでなく、
バックグランドも許容できないほど高い。実施例３〜５
の洗浄液は、許容濃度を示すとともに、バックグランド
も低かった。
満）を有する洗浄液は、シグナルが高いばかりでなく、
バックグランドも許容できないほど高い。実施例３〜５
の洗浄液は、許容濃度を示すとともに、バックグランド
も低かった。
さらなる実験により、トリトン（商標）Ｘ−100を含有
する洗浄液が極めて良好の貯蔵安定性を示すことが分か
った。
する洗浄液が極めて良好の貯蔵安定性を示すことが分か
った。
以上本発明を好ましい実施態様を引用しながら詳細に説
明したが、本発明の精神及び範囲内で変更及び修正がで
きることが理解されるであろう。
明したが、本発明の精神及び範囲内で変更及び修正がで
きることが理解されるであろう。
Claims (5)
- 【請求項１】pH9〜11.5であり、そしてアルコールアミ
ン又はその塩と非イオン界面活性剤を必須のものとして
有する単純ヘルペスウイルスのアッセイ用水性洗浄液。 - 【請求項２】pH10〜11である請求の範囲第１項に記載の
洗浄液。 - 【請求項３】A.単純ヘルペスウイルス抗原を含有する疑
いのある生物学的被検体を、前記抗原の抗体と接触させ
て免疫複合体を形成し、 B.pH9〜11.5であり、そしてアルコールアミン又はその
塩と非イオン界面活性剤を必須のものとして有する水性
洗浄液を用いて未複合物質を前記複合体から分離し、そ
して C.前記被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標と
して前記複合体の存在を測定する、ことを含んでなる単
純ヘルペスウイルスの測定方法。 - 【請求項４】前記未複合物質を前記複合体から分離する
ための微孔質膜を含んでなる使い捨て試験装置を用いて
全体又は一部分を行う請求の範囲第３項に記載の方法。 - 【請求項５】（ａ）pH9〜11.5であり、そしてアルコー
ルアミン又はその塩と非イオン界面活性剤を必須のもの
として有する洗浄液と、 （ｂ）単純ヘルペスウイルス抗原に対する抗体とを含ん
でなる単純ヘルペスウイルスの測定用診断試験キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/308,844 US5124245A (en) | 1989-02-09 | 1989-02-09 | Wash composition, test kit and their use to determine a herpes simplex viral antigen |
| US308,844 | 1989-02-09 | ||
| PCT/US1990/000607 WO1990009594A2 (en) | 1989-02-09 | 1990-01-06 | Wash composition, test kit and their use to determine a herpes simplex viral antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03502248A JPH03502248A (ja) | 1991-05-23 |
| JPH0743384B2 true JPH0743384B2 (ja) | 1995-05-15 |
Family
ID=23195623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2504783A Expired - Lifetime JPH0743384B2 (ja) | 1989-02-09 | 1990-01-06 | アッセイ用水性洗浄液、診断試験キット及び単純ヘルペスウイルスの測定方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5124245A (ja) |
| EP (1) | EP0409978B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0743384B2 (ja) |
| KR (1) | KR910700461A (ja) |
| CA (1) | CA2026007A1 (ja) |
| DE (1) | DE69003618T2 (ja) |
| FI (1) | FI904936A0 (ja) |
| MX (1) | MX170741B (ja) |
| WO (1) | WO1990009594A2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5759774A (en) * | 1988-05-18 | 1998-06-02 | Cobe Laboratories, Inc. | Method of detecting circulating antibody types using dried or lyophilized cells |
| JP2875552B2 (ja) * | 1989-09-05 | 1999-03-31 | エーザイ株式会社 | 非特異吸着排除の抗体測定方法及び測定試薬 |
| US5248595A (en) * | 1991-10-08 | 1993-09-28 | Eastman Kodak Company | Wash composition, test kit and method for determination of microorganisms associated with periodontal diseases |
| US5384240A (en) * | 1992-11-25 | 1995-01-24 | Akzo Nobel, N.V. | Base dissociation assay |
| ATE170631T1 (de) * | 1993-02-17 | 1998-09-15 | Dade Behring Inc | Verfahren und zusammensetzung zur verminderung der effekte von endogener alkalischer phosphatase |
| JP2717940B2 (ja) * | 1994-11-04 | 1998-02-25 | 三洋化成工業株式会社 | 改良された免疫分析用洗浄液 |
| US5639626A (en) * | 1994-11-15 | 1997-06-17 | Chiron Diagnostics Corporation | Reagents for specific binding assays |
| US5981296A (en) * | 1997-02-18 | 1999-11-09 | Dade Behring Inc. | Stabilization of particle reagents |
| KR100523685B1 (ko) | 1997-08-04 | 2005-10-26 | 가부시끼가이샤 센탈 세메 가가꾸 겐꾸쇼 | Ｃ형 간염 바이러스의 코어 영역의 아미노산 서열을 인지하는 모노클로날 항체 |
| US20030082294A1 (en) * | 2001-10-31 | 2003-05-01 | Laurakay Bruhn | Surface treatment method for bio-arrays |
| US7790203B2 (en) * | 2005-12-13 | 2010-09-07 | Lowder Tom R | Composition and regimen for the treatment of herpes simplex virus, herpes zoster, and herpes genitalia epidermal herpetic lesions |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1531360A (fr) * | 1966-09-16 | 1968-07-05 | Agronomique Inst Nat Rech | Procédé pour la sélection et le fractionnement de structures cellulaires par l'adipate d'éthanolamine |
| US4452734A (en) * | 1980-02-11 | 1984-06-05 | Merck & Co., Inc. | Herpes subunit vaccine |
| US4497899A (en) * | 1982-04-12 | 1985-02-05 | Abbott Laboratories | Immunoassay for Chlamydia trachomatis antigens |
| US4535057A (en) * | 1982-07-26 | 1985-08-13 | Amf Incorporated | Immunoassay employing monoclonal herpes simplex antibody and biotin-avidin detection system |
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