PL182061B1 - Sposób wykrywania wytwarzania aktywnego przeciwcialaoraz sposób wykrywania obecnosci niespecyficznych wskazników infekcji w próbce krwi PL PL PL - Google Patents
Sposób wykrywania wytwarzania aktywnego przeciwcialaoraz sposób wykrywania obecnosci niespecyficznych wskazników infekcji w próbce krwi PL PL PLInfo
- Publication number
- PL182061B1 PL182061B1 PL96322209A PL32220996A PL182061B1 PL 182061 B1 PL182061 B1 PL 182061B1 PL 96322209 A PL96322209 A PL 96322209A PL 32220996 A PL32220996 A PL 32220996A PL 182061 B1 PL182061 B1 PL 182061B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- sample
- antibodies
- lymphocytes
- infection
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 22
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 title description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 106
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 90
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 58
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 56
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 37
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 34
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 29
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 16
- -1 sheets Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 14
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 36
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical group C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 claims description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 4
- 229940121819 ATPase inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000362 adenosine triphosphatase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 claims 1
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 claims 1
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 22
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 7
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 7
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 5
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- HRDVWDQQYABHGH-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-N,N-dimethylaniline hydrochloride Chemical compound Cl.CN(C)c1ccc(cc1)-c1ccc(cc1)N(C)C HRDVWDQQYABHGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 4
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 4
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000003622 anti-hsv Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 2
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 description 2
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007687 exposure technique Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000037801 influenza A (H1N1) Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
1. Sposób wykrywania wytwarzania aktywnego przeciwciala w reakcji na docelowy antygen w prób- ce krwi przez kontaktowanie jej ze stalym podlozem i obróbke w postaci unieruchomionej na stalym podlozu majacym postac w szczególnosci czastek, arkuszy, zelów, filtrów, membran, pasków mikromiareczkowych, probówek lub plytek, a zwlaszcza plytek Elisa, znam ienny tym , ze kontaktowanie ze stalym podlozem, w obecnosci lub przy braku inhibitora syntezy protein, porcji wymienionej próbki lub ewentualnie limfocy tów, bezposrednio wyizolowanych z wymienionej próbki prowadzi sie w takich warunkach, które umozli wiaja wytwarzanie i wydzielanie przeciwciala przez limfocyty, najkorzystniej w temperaturze okolo 37°C, w atmosferze 5% dwutlenku wegla w czasie jednej do kilku, w szczególnosci do 4 godzin; nastepnie wykry wa sie w srodowisku roztworu przeciwciala z wymienionymi antygenami na fazie stalej, nastepnie przez porównanie wymienionych wiazan przeciwciala w obecnosci lub przy braku inhibitora syntezy protein, oznacza sie ilosci wydzielania aktywnego przeciwciala wobec wspomnianych antygenów. 19. Sposób wykrywania obecnosci niespecyficznych wskazników infekcji w próbce krwi, przez pod- danie jej obróbce w postaci unieruchomionej na stalym podlozu majacym postac w szczególnosci czastek, arkuszy, zelów, filtrów, membran, pasków mikromiareczkowych, probówek lub plytek, a zwlaszcza plytek Elisa, znamienny tym, ze kontaktowaniu ze stalym podlozem, w obecnosci lub przy braku inhibitora synte- zy protein, porcje wymienionej próbki lub ewentualnie limfocytów bezposrednio wyizolowanych z wymie- nionej próbki poddaje sie w takich warunkach, które umozliwiaja wytwarzanie i wydzielanie przeciwciala przez limfocyty, najkorzystniej w temperaturze okolo 37°C, w atmosferze 5% dwutlenku wegla w czasie kilku, w szczególnosci jednej lub kilku, zwlaszcza do 4 godzin; nastepnie wykrywa sie w srodowisku roz- tworu wiazanie wskazników infekcji z partnerem wiazania, a w koncu oznacza sie ilosci wskazników infek- cji przez porównanie wspomnianego wskaznika infekcji w obecnosci lub przy braku inhibitora syntezy pro- tein wymienionych wiazan przeciwciala. PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania wytwarzania aktywnego przeciwciała oraz sposób wykrywania obecności niespecyficznych wskaźników infekcji w próbce krwi. W szczególności wynalazek dotyczy wykrywania syntezy aktywnego przeciwciała w próbkach krwi w odpowiedzi na infekcję lub szczepienie itd. za pomocą modyfikowanego badania immunosorbentem łączonym z enzymem (ELISA).
Badanie ELISA od dawna jest stosowane do wykrywania i mierzenia przeciwciała (lub antygenu). Najczęściej badanie ELISA jest stosowane jako badanie serologiczne, ale jest ono również używane do badania immunochemicznych właściwości antygenów lub przeciwciał i często znajduje zastosowanie na przykład do oceniania i charakteryzowania reakcji odpornościowej, do badania produkcji przeciwciał przez kultury komórek, w technice hybrydomów itd.
Ze względu na swą czułość, prostotę i łatwość oraz szybkość przeprowadzania, technika ta została szeroko przyjęta jako narzędzie diagnostyczne i jest obecnie rutynowo stosowana w laboratoriach klinicznych do wykrywania przeciwciał w surowicy lub plazmie czynników infekcyjnych, po zakażeniu lub szczepieniu. Przykładowo wiele testów na zakażenie wirusem HIV polega na wykrywaniu przeciwciał tego wirusa w surowicy lub plazmie pacjenta przy zastosowaniu badania ELISA.
Z uwagi jednak na to, że ponieważ taki prosty test serologiczny ELISA mierzy obecność docelowego przeciwciała w próbce, nie można przeprowadzić rozróżnienia pomiędzy syntezą antyciała zachodzącą w odpowiedzi na antygen a przeciwciałami już obecnymi na skutek infekcji z przeszłości lub biernego przeniesienia itd. Chociaż w pewnych przypadkach wystarczające jest uzyskanie informacji dotyczącej istnienia przeciwciała, w innych przypadkach pożądana jest możliwość określenia, czy wykryte docelowe przeciwciała są w ostry sposób syntetyzowane przez limfocyty w czasie badania, na przykład w trakcie szczepienia, albo w diagnozowaniu infekcji u dzieci, w celu odróżnienia od biernie przeniesionych przeciwciał matczynych. Nie można tego osiągnąć przy stosowaniu klasycznej metody ELISA.
Opracowano zatem inne sposoby, które umożliwiają wykrywanie zachodzącej syntezy przeciwciał. Można w związku z tym wspomnieć zwłaszcza o badaniu plamek odpornościowych w połączeniu z enzymem (ELISPOT) (zwanym również plamkowym badanie ELISA), jak podano na przykład w pracy ELISA i inne badania immunologiczne w fazie stałej, Czerkinsky i inni, wyd. D.M. Kenneny i S.J. Challacombe, 1988, rozdz. 10, 217-239, technika ta, oparta na metodzie ELISA, umożliwia zliczanie przeciwciał wydzielanych przez limfocyty
182 061 wobec jednego lub wielu docelowych antygenów. Zasadniczo badanie ELISPOT jest odmianą sposobu ELISA, przy którym wydzielające przeciwciała komórki (ASC) mogąbyć ujawniane przez hodowanie limfocytów w specjalnie zmodyfikowanych dołkach ELISA powleczonych docelowym antygenem i przez zatężenie standardowych odczynników ELISA kompleksami enzym-substrat, które tworzą zabarwiony osad (plamki) przy wydzielającej komórce. Planiki można zliczać, by otrzymać miarę liczby komórek wytwarzających przeciwciała. W pożywce hodowli mogą być zawarte inhibitory syntezy protein, aby potwierdzić, że wykiyte plamki są spowodowane przez syntezę nowo wytworzonych przeciwciał w czasie inkubacji in vitro.
Chociaż technika ELISPOT okazała się bardzo użyteczna w badaniu dynamiki humoralnych reakcji odpornościowych i jest używana do wykrywania spontanicznych ASC, które pojawiają się przejściowo w krążeniu obwodowym immunizowanych obiektów, niektóre właściwości tej metody nakładają ograniczenia na jej stosowanie w diagnostyce klinicznej. Po pierwsze, ponieważ dla każdej próbki trzeba zliczać poszczególne plamki, co jest czasochłonne i pracochłonne, sposób ten nie jest szczególnie dostosowany do analizowania dużych liczb próbek, jak to ma miejsce w klinicznym laboratorium diagnostycznym. Po drugie, określana jest tylko liczba komórek wydzielających przeciwciała w każdej próbce i ogólnie mówiąc wymaga to dużych objętości próbek, np. kilka mililitrów. Płytki ELISPOT są ponadto kosztowne, a badanie to nie jest łatwo zautomatyzować.
Widać zatem, że pomimo postępu w sposobach wykrywania przeciwciała nadal istnieje zapotrzebowanie na badanie, które jest proste, szybkie i tanie do przeprowadzenia, które niezawodnie umożliwia dokładne ilościowe oznaczenie spontanicznie wydzielanych przeciwciał, które jest zdolne do odróżniania syntezy nowo wytworzonych przeciwciał, a zwłaszcza które może być przeprowadzane na próbkach krwi do celów diagnostycznych. Sposób według niniejszego wynalazku wychodzi na przeciw wspomnianemu zapotrzebowaniu.
Sposób wykrywania wytwarzania aktywnego przeciwciała w reakcji na docelowy antygen w próbce łowi według wynalazku, przez poddanie tej próbki obróbce w postaci unieruchomionej na stałym podłożu mającym postać w szczególności cząstek, arkuszy, żelów, filtrów, membran, pasków mikromiareczkowych, probówek lub płytek, a zwłaszcza płytek Elisa, wyróżnia się tym, że kontaktowanie ze stałym podłożem, w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein, porcję wymienionej próbki lub ewentualnie limfocytów, bezpośrednio wyizolowanych z wymienionej próbki poddaje się w takich warunkach, które umożliwiają wytwarzanie i wydzielanie przeciwciała przez limfocyty, najkorzystniej w temperaturze około 37° C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla w czasie jednej do kilku, w szczególności do 4 godzin; następnie wykrywa się w środowisku roztworu przeciwciała z wymienionymi antygenami na fazie stałej następnie przez porównanie wymienionych wiązań przeciwciała w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein, oznacza się ilości wydzielania aktywnego przeciwciała wobec wspomnianych antygenów. Zgodnie z wynalazkiem korzystnie stosuje się stałe podłoże, które utrzymuje jeden lub więcej antygenów rozpoznawanych przez przeciwciało lub przeciwciała, które mają być wykrywane. Jako wspomniane stałe podłoże korzystnie stosuje się podłoże, które utrzymuje jedno lub więcej przeciwciał, które rozpoznają przeciwciało lub przeciwciała, które mają być wykrywane. Korzystnie stosuje się próbkę krwi o objętości mniejszej niż 1 ml.
Według jednej z postaci realizacji wynalazku jako próbkę krwi stosuje się krew oczyszczoną lub wzbogaconą lecz pobraną bezpośrednio od pacjenta.
Można też korzystnie stosować limfocyty bezpośrednio wyizolowane z próbki krwi.
Zgodnie z wynalazkiem, przed etapem kontaktowania z próbką stałe podłoże korzystnie blokuje się przed syntezą protein.
Jako wspomniany wyżej inhibitor syntezy protein korzystnie stosuje się w szczególności cykloheksimid o stężeniu 50-500 mg/ml.
Według jednej z postaci realizacji wynalazku, inhibitor syntezy protein stosuje się łącznie z inhibitorem ATPase.
Wspomniane wykrywanie przeciwciał można zgodnie z wynalazkiem prowadzić się przez badanie immunologiczne, a w szczególności przez badanie ELISA.
182 061
Ze stałym podłożem kontaktuje się zgodnie z wynalazkiem jeden lub wiele antygenów rozpoznawanych przez przeciwciało lub przeciwciała, które mają być wykrywane, unieruchomione na wymienionej fazie stałej. Można zgodnie z wynalazkiem kontaktować ze stałym podłożem jedno lub wiele przeciwciał, które rozpoznają przeciwciało lub przeciwciała unieruchomione na tym podłożu.
Zgodnie z wynalazkiem stosuje się rozpuszczalne medium stosowane do etapu wykrywania przeciwciała i odbiera sygnał wykrywalny spektrofotometrycznie.
Według jednej z postaci wykonania wynalazku stosuje się antygen kontroli negatywnej.
Według szczególnej postaci wynalazku wykrywa się wytwarzanie aktywnego przeciwciała wobec wirusa opryszczki.
Według jednej z postaci wykonania wynalazku podłoża stałe stosuje się w większej liczbie, przy czym każde z nich zawiera inny docelowy antygen.
Jak wspomniano na wstępie, przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania obecności niespecyficznych wskaźników infekcji w próbce krwi. Sposób ten polega podobnie jak opisano wyżej na poddaniu tej próbki obróbce w postaci unieruchomionej na stałym podłożu mającym postać w szczególności cząstek, arkuszy, żelów, filtrów, membran, pasków mikromiareczkowych, probówek lub płytek, a zwłaszcza płytek Elisa, kontaktuje się ze stałym podłożem, w obecności i przy braku inhibitora syntezy protein, porcję wymienionej próbki lub ewentualnie limfocytów bezpośrednio wyizolowanych z wymienionej próbki poddaje się w takich warunkach, które umożliwiają wytwarzanie i wydzielanie przeciwciała przez limfocyty, najkorzystniej w temperaturze około 37°C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla w czasie kilku, w szczególności jednej lub kilku, zwłaszcza do 4 godzin; następnie wykrywa się w środowisku roztworu wiązanie wskaźników infekcji z partnerem wiązania, a w końcu oznacza się ilości wskaźników infekcji przez porównanie wspomnianego wskaźnika infekcji w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein wymienionych wiązań przeciwciała.
Wynalazek, który zostanie szerzej opisany niżej i zilustrowany przykładami. Przy czym sposób ten zawiera w sobie kontaktowanie w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein porcji tej samej próbki lub opcjonalnie limfocytów bezpośrednio wyizolowanych z tej próbki z fazą stałą w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie i wydzielanie przeciwciał przez limfocyty;
wykrywanie w roztworze wiązania przeciwciał wobec wymienionych antygenów na fazie stałej; oraz porównywanie wymienionego wiązania przeciwciał w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein, aby otrzymać przez to oznaczenie ilość aktywnych przeciwciał wydzielanych w reakcji na wymienione antygeny.
Zastosowane tu określenie „wytwarzanie aktywnych przeciwciał” odnosi się do spontanicznie wydzielanych przeciwciał produkowanych przez limfocyty w próbce, które aktywnie wytwarzają przeciwciała w trakcie badania w konsekwencji zachodzącej aktywnej reakcji odpornościowej. We wszystkich przypadkach przeciwciała są zwrócone przeciw antygenom, które są prezentowane in vivo, a nie in vitro albo przed, albo podczas badania sposobem według wynalazku.
Zastosowany tu zwrot „wydzielanie aktywnych przeciwciał w reakcji na wymieniony antygen” ma oznaczać, że aktywnie wydzielane przeciwciała wiąźą się z antygenem stosowanym w tym badaniu, chociaż użyty antygen może nie być immunogenem stymulującym reakcję odpornościową w pierwszym rzędzie. Podczas gdy antygen stosowany w tym badaniu i immunogen, który stymulował lub stymuluje wytwarzanie przeciwciał in vivo wiązałby przeciwciała, które mają być wykrywane, na zasadzie identycznych lub bardzo podobnych determinant antygenowych, pod innymi względami antygen i immunogen mogą nie być identyczne. Chociaż zatem antygen stosowany w sposobie według wynalazku może być materiałem kontaktującym się z całością lub z niektórymi częściami danego immunogenu, np. pochodzącym od osobników zainfekowanych lub oczyszczonymi częściami tego samego lub podobnego materiału, antygen może być podobnie spreparowany syntetycznie, np. przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu z dodanymi lub usuniętymi częściami wobec rodzimego
182 061 antygenu. Mogą być stosowane proteiny pochodzące z fuzji lub cząsteczki wyrażające tylko odpowiednią determinantę antygenową.
Mówiąc ogólnie, sposób według wynalazku dotyczy inkubowania limfocytów z próbki krwi w kontakcie z odpowiednią powierzchnią ciała stałego w celu unieruchamiania przeciwciał, które mają być wykrywane, w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie i wydzielanie przeciwciał przez limfocyty, a następnie usuwania tych komórek i wykrywania wiązania przeciwciała z antygenem na tej fazie stałej. Przez porównanie poziomu wykrytego wiązania przeciwciała w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein można odróżnić i oznaczyć ilościowo syntezę nowo wytworzonych przeciwciał.
Niespodziewanie sposób według wynalazku umożliwia stosowanie niewielkich objętości próbki krwi (np. objętości rzędu μΐ, mniejszej niż 1 ml) bezpośrednio do wykrywania spontanicznego wytwarzania przeciwciał przez niestymulowane limfocyty bez uprzedniego etapu wstępnego hodowania limfocytów przed inkubacją za pomocą fazy stałej. Inaczej mówiąc, limfocyty z próbki są wykorzystywane bezpośrednio w sposobie badania według wynalazku bez uprzedniej obróbki lub stymulacji, np. stymulacji in vitro przez antygen. Przeciwciała wydzielane przez limfocyty w czasie próbkowania mogąbyć wykrywane. W ten sposób nawet stosując takie małe objętości próbek spontanicznie zachodzącą syntezę przeciwciał w odpowiedzi na antygen testowy można korzystnie odróżnić od aktywacji limfocytów. Ponadto limfocyty są badane w sytuacji, gdzie wydzielają one spontanicznie przeciwciała bez stymulowania komórek do objawiania jakiejkolwiek pamięci. Pozostaje to w kontraście do innych opublikowanych sposobów, które wykorzystują stymulację antygenową in vitro do zwiększenia czułości badania. Z drugiej strony przedmiotowy wynalazek wykorzystuje spontaniczne wydzielanie przeciwciał, by wykrywanie przeciwciał we krwi mogło być wskazaniem zachodzącej infekcji przez antygen testowy. Limfocyty plazmy będą wydzielać przeciwciała na antygen testowy w pierwszych kilku tygodniach od infekcji lub szczepienia itd. Wykrycie takich przeciwciał sposobem według przedmiotowego wynalazku umożliwia diagnozowanie lub określanie infekcji albo tez można kontrolować reakcję przeciwciał na szczepienie itd. Jest to szczególnie użyteczne u dzieci i noworodków, gdzie ważne jest odróżnienie świeżo syntetyzowanych przeciwciał od biernie przeniesionych przeciwciał matki. Ta sama próbka krwi może być analizowana na przeciwciała wobec kilku różnych czynników powodujących infekcję albo w oddzielnych próbach, albo w tej samej próbie przy użyciu wielu odpowiednich antygenów. Powstaje zatem możliwość użycia odpowiednich kontaktujących antygenów zgodnych z syndromem klinicznym, pojawiającym się u pacjenta. W diagnozowaniu infekcji ważna jest również możliwość odróżniania zachodzącej syntezy przeciwciał od przeciwciał już istniejących z wcześniejszej infekcji. Powtórne przywoływanie pamięci immunologicznej przez stymulację antygenową in vitro nie jest zgodne z badaniem mającym na celu identyfikację zachodzącej ostrej infekcji, a zatem znane sposoby oparte na stymulacji antygenowej nie mają tej zalety. Ponadto stosowanie etapu stymulacji antygenowej stanowiłoby kompromis wobec korzystnego czynnika czasowego badania według wynalazku, które jest przeprowadzane bardzo szybko w porównaniu ze znanymi sposobami.
Antygeny, na które są zwrócone przeciwciała wykrywane sposobem według wynalazku, obejmują zarówno antygeny bakteryjne jak i antygeny wirusowe. Klinicznie ważne antygeny obejmują, ale bez ograniczenia tylko do nich, antygeny na przykład wirusa Herpes Simplex, Cytomegalovirus, wirusa braku odporności u ludzi (HIV) oraz każdego z wirusów Hepatitis. Wykrywanie takich antygenów może być wykorzystywane do szybkiego określenia, czy pacjenci są zainfekowani, np. w celu masowego badania krwi lub w celu oznaczenia i/lub kontrolowania infekcji. Sposób ten jest szczególnie użyteczny dzięki swej prostocie i może być używany wtedy, gdy brak jest skomplikowanego wyposażenia, np. w sytuacjach polowych.
Użyte tu określenia „wykrywanie” i „oznaczanie ilości” obejmują zarówno ilościową jak i jakościową ocenę poziomu wytwarzania przeciwciał w sensie uzyskania bezwzględnej wartości ilości przeciwciał wytwarzanych w próbce jak również wskaźnika, stosunku, procentu lub podobnego wyrażenia poziomu produkcji przeciwciał oraz ocen semiilościowych lub semijakościowych.
182 061
Główną zaletą przedmiotowego wynalazku jest to, że potrzebna jest próbka o tylko bardzo małej objętości, np. 50-500 μϊ, korzystnie 100-300 μϊ, a zwykle 100-200 μϊ, krwi lub produktu krwi w objętości porównywalnej z całym źródłem krwi w przeciwieństwie do klasycznych testów diagnostycznych, które zwykle wymagają kilku mililitrów surowicy. Jest to szczególnie użyteczne w przypadku pobierania próbek krwi od noworodków, ponieważ sposób według wynalazku wymaga objętości tylko rzędu mikrolitrów.
Próbka krwi, zasadniczo próbka krwi obwodowej, może być wykorzystywana bezpośrednio, chociaż może być korzystne najpierw wyizolowanie limfocytów z tej próbki. Można to przeprowadzić stosując standardowe sposoby znane w tej dziedzinie. Przykładowo mogą być korzystnie stosowane różne preparaty pełnej krwi, np. krew heparynizowaną krew EDTA itd., takie jakie są rutynowo wytwarzane w laboratoriach klinicznych. Chociaż nie jest to ważne, może być przeprowadzony rozpad erytrocytów obecnych w próbce, np. przy użyciu pospolitych sposobów krótkotrwałego wystawienia na działanie wody destylowanej lub chlorku amonowego, albo przez stosowanie innych znanych technik hemolizy. Należy zauważyć, że wszystkie preparaty wzbogacone lub oczyszczone muszą zawierać limfocyty występujące w pełnej krwi, z której preparat ten został wytworzony, aby umożliwić wykrywanie spontanicznej produkcji przeciwciał. Jeżeli jest to pożądane, limfocyty mogą być oddzielane np. przez zastosowanie standardowych mediów oddzielania limfocytów, np. Lymphoprep (Nyegaard Co., Oslo, Norwegia) lub przy użyciu oddzielania immunomagnetycznego (IMS), albo podobnego systemu oddzielania na bazie fazy stałej lub innych pospolitych technik. W przypadku IMS lub podobnych technik oddzielania faza stałą np. kuleczki magnetyczne powleczone przeciwciałem specyficznym dla pewnego zestawu leukocytów, może być używana do selektywnego oddzielania użytecznych limfocytów. Jeżeli stosowane są oddzielone limfocyty, komórki te mogą być przepłukane przed użyciem przy zastosowaniu metod przemywania statycznego. Zaobserwowano jednakże, że nie jest wymagane silne płukanie komórek. Przy braku silnego płukania można polepszyć żywotność komórek i przyspieszyć ten sposób.
Próbka krwi obrobiona jak podano powyżej, jeśli trzebą lub oddzielone limfocyty są korzystnie kontaktowane następnie z fazą stałą niosącą odpowiedniego partnera wiązanią by unieruchomić wykrywane przeciwciało lub przeciwciała. Korzystnie partnerem wiązania jest testowy antygen lub antygeny rozpoznawane przez wykrywane przeciwciało lub przeciwciała. W każdym przykładzie realizacji przedmiotowy wynalazek stanowi sposób wykrywania produkcji aktywnego przeciwciała w próbce krwi, który to sposób zawiera:
kontaktowanie w obecności lub przy braku inhibitora syntezy proteiny porcji wymienionej próbki lub ewentualnie limfocytów bezpośrednio wyizolowanych z tej próbki z fazą stałą niosącą jeden lub więcej antygenów rozpoznawanych przez to przeciwciało lub przeciwciałą które mają być wykrywane;
wykrywanie w roztworze wiązania przeciwciała z wymienionymi antygenami; oraz porównywanie wymienionego wiązania przeciwciała w obecności lub przy braku inhibitora syntezy proteiny, aby przez to uzyskać oznaczenie ilości wydzielania aktywnego przeciwciała w odpowiedzi na wymienione antygeny.
Mogą być również wykorzystywani alternatywni partnerzy wiązanią np. proteina A, proteina G lub przeciwciałą które rozpoznają i wiążą się z przeciwciałem, które ma być wykrywane. W tym ostatnim przypadku nie jest wymagane silnie specyficzne wiązanie, ponieważ specyficzność jest wprowadzana w tym przykładzie realizacji sposobu badania przez późniejsze wiązanie antygenów, które łączą się specyficznie z przeciwciałami, które mają być wykrywane. Zatem we wszystkich przykładach realizacji powstaje specyficzny kompleks antygen-przeciwciało. Obecność takich kompleksów unieruchomionych na stałym podłożu jest sprawdzana w etapie wykrywanie sposobu według wynalazku. Fazą stałą mogą być dowolne znane podłoża lub osnowy, które są obecnie szeroko stosowane lub proponowane do unieruchamianią oddzielania itd. Mogą one mieć postać cząstek, arkuszy, żelów, filtrów, membran lub pasków mikromiareczkowych, probówek lub płytek itd., a korzystnie mogąbyć wykonane z materiału polimerowego. Jednakże dla łatwej obsługi i uproszczenia korzystnie można stosować wzorcowe płytki i dołki mikromiareczkowe, korzystnie wzorcowe płytki ELISA.
182 061
Faza stała może być również modyfikowana, aby umożliwić wykrywanie przeciwciał specyficznych wobec pewnego zakresu różnych antygenów. Przykładowo zatem krążki lub paski itd. z odpowiedniego materiału w fazie stałej, np. nitrocelulozy lub podobnego materiału, mogą być powlekane różnymi antygenami i dodawane równocześnie do mikromiareczkowego dołka łub innego odpowiedniego naczynia nie zawierającego żadnego kontaktującego antygenu. Następnie sposoby wykrywania wiązania przeciwciała można wykorzystywać do rozróżniania pomiędzy różnymi antygenami. Zestawy krążków, z których każdy jest powleczony odpowiednimi antygenami, odpowiadającymi pewnemu stanowi lub syndromowi klinicznemu, mogą być wykorzystywane do oznaczenia, który z podejrzewanych czynników powoduje chorobę. Krążki te byłyby następnie indywidualnie obrabiane w oddzielnych dołkach. Jest to procedura szczególnie oszczędzająca materiał, ponieważ badania mogąbyć przeprowadzane w celu równoczesnego badania wielu różnych antygenów (albo od tego samego czynnika infekcyjnego, albo od różnych czynników odpowiadających danemu syndromowi lub stanowi klinicznemu w każdym przypadku) przy wykorzystaniu tej samej niewielkiej objętości krwi. Alternatywne podejście polega na wykorzystywaniu wielu próbek krwi w oddzielnych dołkach, z których każdy jest powleczony innymi partnerami wiązania, np. antygenami lub przeciwciałami, i na odpowiednim przeprowadzeniu badania.
Sposoby wiązania partnera wiązania, np. antygenu, z fazą stałą są również bardzo dobrze znane i szeroko opisywane w literaturze. Wiele standardowych procedur powlekania antygenem opisano np. w opracowaniu EL1SA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects; 1988; wyd. D.M. Kemeny & S.J. Challacombe, John Wiley & Sons. Jeżeli jest to potrzebne, płytki mogąbyć płukane i blokowane, znowu przy użyciu standardowych technik. Przykładowo zatem wzorcowe płytki mikromiareczkowe, np. płytki EL1SA, mogą być powlekane partnerem wiązania przez inikubowanie płytek przez noc w temperaturze 4°C w odpowiednim buforze, np. w solance buforowanej fosforanem (PBS), zawierającej partnera wiązania, np. przy stężeniach 0,01-150 pg/ml proteiny, po czym przeprowadza się blokowanie przy użyciu odpowiednich czynników blokujących (zwykle pożywka hodowli komórkowej) i inkubację np. przy 37°C przez 1-5 godzin. Po usunięciu roztworu blokującego płytki są gotowe do użycia.
Korzystnie jednak materiały potrzebne do przeprowadzania sposobu według wynalazku mogą być dostarczane w postaci zestawu, gdzie stałe podłoże jest dostarczane gotowe z powleczeniem partnerem wiązania i po odpowiednim zablokowaniu.
Jak wspomniano powyżej, etap kontaktowania zawiera inkubowanie próbki lub oddzielonych limfocytów w obecności fazy stałej w warunkach, które umożliwiają syntezę i wydzielanie przeciwciała. Korzystnie można zastosować standardowe warunki inkubacji EL1SPOT, jak opisano np. w publikacji Czerkinsky i in., 1988 (powyżej). Zwykle próbkę lub komórki inkubuje się przy 37°C z 5% CO2 w powietrzu, kiedy medium, w którym inkubowane są komórki, oparte jest na CO2 jako części systemu buforowania. Można również stosować medium niezależne od CO2, w którym działają alternatywne systemy buforowania, takie jak media wykorzystujące znany składnik HEPES.
W takich przypadkach komórki są inkubowane przy 37°C, przez co dodatkowo upraszcza się badanie i wymagania odnośnie skomplikowanego sprzętu. Czasy inkubacji mogąbyć różne, ale zwykle potrzeba przynajmniej 1-2 h. Stwierdzono, że czasy inkubacji 2-6 h, np. 2-4 h, dają dobre wyniki, chociaż w pewnych sytuacjach mogą być pożądane dłuższe czasy inkubacji, np. do 12 lub 24 h lub przez noc. Media odpowiednie do inkubacji są znane w tej dziedzinie i obejmują wszelkie standardowe media do hodowania kultur komórkowych, np. zmodyfikowane przez Dulbecco medium Eagle (DMEM) lub RPMI, albo znane media kultur komórkowych z zastosowaniem HEPES, jak niezależny od CO2 system buforowania zawierający odpowiednie surowice, np. surowicę z płodów bydlęcych (FCS) lub inne składniki, np. glutaminę, zależnie od potrzeb. Ewentualne dodatkowe składniki w medium mogą obejmować antybiotyki, np. gentamycynę, penicylinę, sterptamycinę itd., inne aminokwasy, czynniki wzrostu itd.
182 061
Może być pożądane rozcieńczenie próbki/zawiesiny komórek przed etapem kontaktowania i korzystnie można stosować pewien zakres rozcieńczeń komórek/próbki. Rozcieńczanie będzie zwykle przeprowadzane przy użyciu pożywki hodowli jako rozcieńczalnika.
W celu odróżnienia zachodzącej syntezy przeciwciała przeprowadza się inkubację w obecności lub przy braku inhibitora syntezy proteiny. Przed inkubacją do części porcji próbki/komórki dodaje się inhibitor, by blokować proteiny, a zatem syntezę przeciwciała. Natomiast części są inkubowane bez inhibitora. Można zastosować dowolny z ogólnie znanych inhibitorów syntezy protein, np. cykloheksimid. Można zastosować stężenia 10-5000 pg/ml, np. 50-500 pg/ml cykloheksimidu.
Korzystne jest również stosowanie inhibitora ATPase, takiego jak azydek sodowy, lub innego podobnego inhibitora wraz z inhibitorem syntezy protein, aby szybko i całkowicie zatrzymać metabolizm komórkowy.
Po inkubacji próbka/komórki są usuwane z fazy stałej. Można to zwykle zrealizować przez przemywanie odpowiednim medium, np. buforem, takim jak PBS. Stwierdzono jednakże, że silne przemywanie nie jest pożądane.
Następnie fazę stałą poddaje się etapowi wykrywania wiązania przeciwciała. Etap wykrywania w sensie odczytywania sygnału odbywa się w roztworze. Można zastosować dowolny ze znanych środków wykrywania wiązania przeciwciała, jeżeli tylko wytwarzany jest sygnał możliwy do odczytania w roztworze; przykładowo środki polegające na fluorescencji, chemiluminescencji, kolorymetrii lub reakcji enzymatycznej, by wytworzyć sygnał nadający się do wykrycia. Korzystniej jednak jako środek wykrywania można zastosować badanie immunologiczne, np. badanie sorbentu immunologicznego z wiązaniem enzymowym (ELISA).
Techniki badań immunologicznych, a zwłaszcza ELISA, są znane w tej dziedzinie i są opisane w literaturze (patrz np. ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects; 1988, wyd. D.M. Kemeny & S.J. Challacombe, John Wiley & Sons).
Po usunięciu próbki/komórek można dodać sprzężenie enzym-przeciwciało, na przykład w sposobie wykrywania ELISA, które wiąże się z przeciwciałem związanym z antygenem na fazie stałej. Podobnie, jeżeli przeciwciało, które ma być wykrywane, jest związane z fazą stałą niespecyficznie poprzez partnera wiązania, np. przez przeciwciało wobec przeciwciał innych gatunków, wówczas można dodać sprzężenie enzym-antygen, które będzie wiązać się specyficznie z unieruchomionym przeciwciałem, które ma być wykrywane. Następnie dodaje się podłoże enzymu w celu wywołania sygnału możliwego do wykrycia. Według przedmiotowego wynalazku stosuje się korzystnie podłoże rozpuszczalne, dające sygnał wykrywalny w roztworze. Jest to korzystne, ponieważ ułatwia i upraszcza manipulowanie i obróbkę dużej liczby próbek i pozwala na ocenę produkcji przeciwciała, chociaż jak już wspomniano powyżej, bezwzględne oznaczenie ilościowe nie jest konieczne, a jeżeli jest to pożądane, można otrzymać wynik jakościowy lub półilościowy. Dla wygody podłoże można wybrać tak, aby dawało sygnał wykrywalny spektrofotometrycznie, który może być po prostu odczytywany przez odczyt absorbancji, np. przy użyciu standardowego czytnika płytek ELISA. Można faktycznie zastosować standardowe odczynniki ELISA, co jest korzystne, ponieważ badanie według wynalazku jest wtedy kompatybilne z istniejącymi sposobami i technikami rutynowo stosowanymi w laboratoriach klinicznych. Można jednak stosować inne systemy wykrywania/generowania sygnału, które dają sygnały wykrywane przez fluorescencję, chemiluminescencję itd.
Można również stosować immunoenzymatyczne metody wzmacniana, aby polepszyć sygnał i zwiększyć czułość, np. stosując metody awidynowo-biotynowe, takie jak system Extravidin dostępny z firmy Sigma. W kombinacji z kompleksem peroksydaza-awidyna jako odczynniki ELISA stosowane są biotynylowane wtórne przeciwciała. Ponieważ jedna cząsteczka awidyny jest zdolna do wiązania kilku cząsteczek biotyny, stosowanie kompleksów awidyna-biotyna z peroksydazą zwiększa powierzchniowe stężenie cząsteczek peroksydazy, dzięki czemu sposób te ma nawet większą czułość.
Materiały i środki potrzebne do etapu inkubacji (kontaktowania) komórek i do etapu wykrywania wiązania przeciwciała mogą być również korzystnie dostarczane w zestawie wraz z fazą stałą powleczoną partnerem wiązania. Informacja uzyskana z badania według wy
182 061 nalazku może być uzupełniona przez stosowanie innych metod badawczych. Dodatkowe i użyteczne dane o uprzednio istniejących przeciwciałach w surowicy/plaźmie można otrzymać w klasycznym teście ELISA. Dodatkowo po oddzieleniu limfocytów od próbki krwi, kiedy jest to przeprowadzone, pozostały płyn plazmowy można wykorzystać do wykrywania uprzednio istniejących przeciwciał z wykorzystaniem tej samej fazy stałej powleczonej partnerem wiązania, która była użyta w badaniu według wynalazku.
W celu określenia, iż sposób badania według wynalazku działa pewnie, można zastosować odpowiednie środki kontrolne. Po pierwsze porównanie pomiędzy dołkami zablokowanymi przed syntezę protein i dołkami odblokowanymi zapewni, że wynalazek rejestruje wytwarzanie przeciwciała przez badane komórki a nie jedynie uprzednio istniejące przeciwciała z krwi obwodowej. W przypadku stosowania oczyszczonych preparatów limfocytowych w charakterze próbki zapewni to, że śladowe ilości przechwyconych przeciwciał z krwi obwodowej w próbce limfocytowej nie będą fałszować badania. Po drugie, aby mieć pewność, że rejestrowana różnica pomiędzy sygnałami z dołków blokowanych i dołków nie blokowanych nie jest spowodowana przez sporadycznie i niespecyficznie (ubocznie) uaktywniane limfocyty, stosuje się antygen kontroli negatywnej. Antygen ten będzie pochodzić od czynnika infekcyjnego, który najprawdopodobniej jest odpowiedzialny za ostrą chorobę pacjenta, np. tetanus texoid. Liczby takich ubocznie aktywowanych limfocytów będą w każdym razie niezależnie od okoliczności znacznie mniejsze niż potrzebne do uzyskania pozytywnego wyniku testu przy użyciu sposobu według wynalazku. Wynalazek uwzględnia ten fakt.
Jak wspomniano powyżej, dzięki swej łatwości i prędkości działania oraz prostocie badanie według wynalazku nadaje się do diagnozowania lub do innych zastosowań klinicznych lub weterynaryjnych, np. w hodowli ryb. Oprócz małej objętości próbek dalsza zaleta polega na tym, że potrzebna jest tylko jedna próbka a nie pary surowic pobierane w odstępie 2-3 tygodnie, jak to jest konieczne w większości konwencjonalnych testów serologicznych. Nie potrzeba skomplikowanego oprzyrządowania, a badanie można łatwo zautomatyzować. Ponadto można łatwo badać różne izotypy immunoglobuliny.
Wspomniany powyżej sposób badania według wynalazku stanowi jeden sposób badania obecności lub stopnia zachodzącej infekcji na zasadzie analizy spontanicznej reakcji specyficznych przeciwciał na określony antygen. Sposób ten wyraźnie dotyczy oceny warunków choroby, które są znane i dla których dostępne są antygeny związane z danym immunogenem, a więc jest specyficzny znacznik infekcji. Jednakże w pewnych warunkach klinicznych specyficzna choroba lub infekcja może nie być identyfikowana i/lub może nie być dostępny odpowiedni antygen do stosowania w tym badaniu. W takich przypadkach badanie może być zmodyfikowane, aby badać obecność lub stopień niespecyficznych wskaźników infekcji. Przykładowo próbki zawierające limfocyty, np. próbki pełnej krwi lub oczyszczone albo wzbogacone preparaty limfocytowe z niej, mogą być badane pod względem swej produkcji znaczników infekcji, np. cytokinów lub interferonów, np. interferonu γ.
Patrząc z innego jeszcze aspektu wynalazek daje sposób wykrywania obecności niespecyficznych wskaźników infekcji w próbce krwi, który to sposób obejmuje:
kontaktowanie, w obecności lub przy braku inhibitora syntezy proteiny, porcji wymienionej próbki lub ewentualnie limfocytów bezpośrednio wyizolowanych z tej próbki, z fazą stałą w warunkach, które umożliwiają produkcję i wydzielanie wskaźników infekcji przez te limfocyty;
wykrywanie w roztworze wiązania wskaźników infekcji z partnerem wiązania na fazie stałej; oraz porównywanie wymienionego wiązania wskaźnika infekcji w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein, przez co otrzymuje się oznaczenie ilości wskaźników infekcji w wymienionej próbce.
Do stosowania tego sposobu faza stała może być wyposażona w odpowiednie cząsteczki wychwytowe, np. przeciwciała wobec wskaźników infekcji do wykrywania. Do wykrywania obecności wymienionych wskaźników infekcji unieruchomionych na fazie stałej można stosować sposoby opisane powyżej, np. przy użyciu znakowanych przeciwciał lub ligandów. Według tego sposobu specyficzne znaczniki mogą być identyfikowane przez odpowiedni wy
182 061 bór unieruchamiającej cząstki lub cząsteczki detekcyjnej. Przykładowo wszelkie proteiny w próbce mogą być unieruchamiane na stałym podłożu, a wykrywanie może być przeprowadzane przy użyciu etykietowanego specyficznego przeciwciała lub ligandu. Alternatywnie można wykorzystać specyficznego partnera wiążącego do unieruchomienia danych wskaźników infekcji, które mogą być następnie odpowiednio znakowane, albo pozytywnie albo negatywnie, np. w poprzednim przypadku przez wiązanie z domeną istniejącą na wskaźniku infekcji, ale nie wyłącznie z tą cząsteczką, albo w drugim przypadku przez etykietowanie nie związanego partnera wiązania na fazie stałej. Zestawy do przeprowadzania tego sposobu również stanowią część przedmiotowego wynalazku.
Wynalazek zostanie teraz bardziej szczegółowo opisany w odniesieniu do następujących przykładów, gdzie sposób badania według wynalazku nazywany jest badaniem Plasmacute.
Przykład 1
Ogólna procedura
Komórki:
Pobierano heparynizowaną krew w różnym czasie po szczepieniu od ochotników, którym podano unieczynnioną szczepionkę grypy. Krew zmieszano z taką samą objętością PBS. Limfocyty oddzielono przez Lymphoprep (Nyegaard & Co., Oslo). Komórki przepłukano dwukrotnie w PBS, powtórnie zawieszono (rozcieńczenia) w modyfikacji Dulbecco medium Eagle z dodatkiem 20% FCS, 2 mM L-glutaminy, 100 RJ/ml penicyliny i 100 pg/ml sterptomycyny (Pen+Strep) = MEDIUM.
Roztwór zatrzymujący:
mg/ml cykloheksimidu dodanego do PBS zawierającego 100% azydku sodu.
ELISA i antygeny grypy:
W próbie klinicznej wykorzystano oczyszczone powierzchniowe antygeny z trzech szczepów wirusowych w szczepionce grypy, oznaczone tu w skrócie H3N2, H1N1 i B.
Płytki ELISA:
Płytki Greiner EIA 655001 F-form lub płytki Costar EIA 3590. Powlekanie 100 μΐ/dołek roztworem 10 pg/ml proteiny w PBS przez noc przy 4°C. Blokowanie za pomocą MEDIUM przez 1 hprzy temperaturze pokojowej. Jednorazowe przemycie za pomocą PBS.
Test:
100 μΐ rozcieńczeń zawiesin komórek w MEDIUM dodano do potrójnych dołków w dwóch równoległych zestawach dla każdego z trzech antygenów grypy. Jeden zestaw potrójnych dołków blokowano w fazie początkowej dodając 50 μΐ roztworu zatrzymującego. Inkubowano w różnych czasach przy 37°C w inkubatorze z 5% CO2 w powietrzu. Płytkę ELISA przemyto raz za pomocą PBS, następnie dwa razy za pomocą PBS z 0,05% Tween 20. 50 μΐ na dołek odpowiednio rozcieńczonego sprzężenia króliczej, przeciwludzkiej peroksydazy Ig (Sigma) dodano i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 1 h. Następnie płytkę wywołano stosując podłoże z dwuaminy ofenylenowej (OPD) i odczytano wartość absorbancji przy 492 nm.
Krew pobierana 11 dni po szczepieniu
Czas inkubacji komórek: 4 godziny, 0 godzin = dołki zablokowane.
0/4 h
0/4 h
Liczba komórek
6,6 104
6,6 103
H3N2 H1N1
264/522 199/490
238/290 143/194
B 352/527 331/353
Wszystkie pozycje są średnią z potrójnych dołków jako absorbancja x 1000. Zakres ± 10%.
Wniosek:
6,6 104 = 66.000 komórek daje znaczny wzrost sygnału przy inkubacji przez 4 h. Absorbancja H3N2 wzrasta do 98%, H1N1 do 153%, a B do 50%.
Jest to eksperyment reprezentatywny. Dodatkowe testy wykazały, że inkubacja komórek przez noc daje jeszcze wyraźniejsze rozróżnienie pomiędzy dołkami blokowanymi i nie blokowanymi przy absorbancjach powyżej 1000. System działa również przy krótszych czasach inkubacji, np. 2-3 h, 10-krotnie więcej komórek, np. 6,6 103 komórek/dołek może również, ale nie zawsze, dać wyraźniejsze rozróżnienie.
182 061
Przykład 2
Ogólna procedura
Heparynizowaną krew pobrano 7 dni po szczepieniu od ochotników, którym podano unieczynnioną szczepionkę grypy. Krew zmieszano z taką samą objętością PBS. Limfocyty oddzielono za pomocą Lymphoprep (Nyegaard & Co., Oslo). Komórki przemyto dwukrotnie w PBS, z powrotem zawieszono w modyfikacji Dulbecco medium Eagle z dodatkiem 20% FSC, 2 mM L-glutaminianu, Pen+Strep (jak poprzednio) = MEDIUM.
Roztwór zatrzymujący:
mg/ml cykloheksimidu dodany do PBS zawierającego 10% azydku sodu.
Antygeny testowe:
Oczyszczone antygeny powierzchniowe z trzech szczepów wirusów w szczepionce grypy użyto w próbie klinicznej, oznaczone tu w skrócie H3N2, H1N1 i B.
Antygen kontrolny: Tetanus texoid (bez adsorpcji glinu; Lederle).
Płytki ELISA:
Płytki Greiner EIA 655001 F-form lub płytki Costar EIA 3590. Powlekanie 100 μΐ/dołek roztworem 10 μg/ml proteiny w PBS przez noc przy 4°C, tetanus: 10 Lf/ml. Blokowanie za pomocą MEDIUM przez 1 h przy temperaturze pokojowej. Jednorazowe płukanie za pomocą PBS.
Badanie:
100 μΐ rozcieńczeń zawiesin komórek w MEDIUM dodano do potrójnych dołków w dwóch równoległych zestawach dla każdego z trzech antygenów grypy i kontrolnego antygenu tetanus. Jeden zestaw dołków blokowano w fazie początkowej dodając 50 μΐ roztworu zatrzymującego. Inkubowano przy 37°C w inkubatorze z 5% CO2 w powietrzu przez 3 h. Po inkubacji płytkę ELISA przemyto jednorazowo za pomocą PBS, następnie dwukrotnie za pomocą PBS z 0,05% Tween 20. 50 μΐ/dołek odpowiednio rozcieńczonego sprzężenia króliczej przeciwludzkiej peroksydazy Ig (Sigma) dodano i pozostawiono w temperaturze pokojowej przez 1 h. Następnie płytkę wywoływano przy użyciu podłoża z dwuaminy o-fenylenowej (OPD; Sigma) i odczytano wartość absorbancji przy 492 nm. [Test ten można zmodyfikować, by zwiększyć czułość przez dodatkowy etap przed podłożem przez użycie 1 h etapu ekstrawidina/peroksydaza (Sigma). Wymaga to zastosowania biotynylowanego roztworu sprzężonego zamiast roztworu sprzężonego peroksydazy (Sigma)].
Wynik reprezentatywnych eksperymentów:
(bez extravidyny):
dni po szczepieniu (2 obiekty; nr 1 i nr 2)
Czas inkubacji komórek: 3 h, 0 h = blokowane dołki
| Liczba komórek | H3N2 | H1N1 | B | Tetanus | |
| 0/3 h | 105 nr 1 | 063/410 | 055/269 | 206/258 | 046/050 |
| nr 2 | 045/077 | 048/242 | 182/207 | 040/046 |
Wszystkie pozycje są średnimi z potrójnych dołków jako absorbancja x 1000. Zakres ± 16%.
Obiektami są osoby kilkunastoletnie (16 lat). Wiadomo, że młodzi ludzie reagują szczególnie dobrze na szczepionkę grypy A/H1N1. Widać to wyraźniej powyżej. Oba obiekty nr 1 i nr 2 reagują dobrze. Jednakże zwykle osoby szczepione reagują różnie na różne składniki szczepionki, tak że można oczekiwać różnicy we wzroście absorbancji. Jest to tu demonstrowane, kiedy obiekt nr 1 reagował słabo na wirusa B, podczas gdy tylko nr 2 reagował znacznie na wirusa H1N1. Jak oczekiwano, żaden z obiektów nie reagował na tetanus texoid. Jeżeli jednak komórki były stymulowane in vitro przez texoid przez czas kilku dni, wówczas ich wcześniejsza pamięć immunologiczna (ze szczepienia w dzieciństwie) mogła spowodować wytworzenie przeciwciała na tetanus. W przypadku rzeczywistej infekcji w laboratorium diagnostycznym przy zastosowaniu wynalazku tylko jeden czynnik testowy/antygen będzie dawać sygnał pozytywny.
Przykład 3
Ogólna procedura:
182 061
Komórki:
Heparynizowaną krew pobrano 6 dni po szczepieniu od osoby dorosłej (mężczyzna w wieku 24 lat) oraz od dziecka (chłopiec w wieku 3 lat), którzy otrzymali unieczynnioną podjednostkową szczepionkę grypy. Limfocyty oddzielono jak opisano w przykładach 1 i 2. Komórki kontaktowano z fazą stała niosącą antygen H3N2, HI NI i B, jak opisano w przykładzie 1 i 2, przez 3 h przy 37°C i test przeprowadzono jak opisano (bez roztworu zatrzymującego lub antygenu kontrolnego stosowanego w tym doświadczeniu).
Tabela 1 przedstawia wyniki od tych dwóch osób, gdzie dla każdego antygenu są średnią z trzech dołków jako absorbancja x 1000.
Tabela 1
| Obiekt dorosły | Dziecko | ||||||
| Liczba komórek (tysiące) | A/H3N2 | A/H1N1 | B | Liczba komórek (tysiące) | A/H3N2 | A/H1N1 | B |
| 224 | 475 | 322 | 913 | 275 | 1268 | 97 | 10 |
| 112 | 189 | 193 | 567 | 138 | 951 | 65 | 10 |
| 56 | 93 | 62 | 162 | 69 | 672 | 51 | 20 |
Wyniki te pokazują, że małe dziecko, które miało tylko jeden wcześniejszy epizod grypy, infekcję A/H3N2, dało bardzo silną odpowiedź immunologiczną na składnik A/H3N2 w potrójnej szczepionce. Jak oczekiwano w przypadku tego dziecka nie było reakcji na składniki A/H1N1 i B. Takie małe dzieci zwykle wymagają dwóch dawek szczepionki w odstępstwie kilku tygodni, aby uzyskać zadowalającą reakcję immunologiczną Około 70.000 limfocytów, co odpowiada około 70 μΐ objętości pełnej krwi, wystarczyło do uzyskania wyraźnego wyniku pozytywnego. W przypadku obiektu dorosłego, który miał wiele epizodów grypy, reakcja nie była tak silna, niemniej była znaczna wobec wszystkich trzech składników szczepionki, chociaż w różnym stopniu. Dla składnika B potrzebne było w przybliżeniu 100.000 limfocytów, by otrzymać reakcję pozytywną, natomiast oba składniki A wymagały minimum 100.000 komórek, korzystnie 200.000 komórek.
Przykład 4
Wyktywanie opryszczki zwykłej typu 2 sposobem klasycznym i przez badanie Phasmacute.
Ogólna procedura
Kultura tkanek i analizy serologiczne
Materiał z genitaliów pięciu obiektów z objawami sugerującymi infekcję wirusem opryszczki narządów płciowych poddano procedurom rutynowej hodowli tkanek próbując wykryć powielającego się wirusa z próbek (przeprowadzono w Virus Laboratory, Haukeland University Hospital, Bergen). To samo laboratorium przeprowadziło rutynowe analizy serologiczne próbek surowicy przy użyciu dostępnych w handlu zestawów ELISA (Behringer Enzygnost z firmy Behringer, Niemcy), zawierających antygeny HSV, by wykryć IgG i IgM.
Oddzielanie limfocytów
Limfocyty izolowano przez odwirowanie z gradientem gęstości lymphoprep (Nycomed) heparynizowanej krwi z pięciu obiektów przejawiających symptomy sugerujące zakażenie wirusem opryszczki narządów płciowych, pobranej równocześnie z próbkami szpitalnymi. Komórki przemyto trzykrotnie w PBS i powtórnie zawieszono w pożywce hodowli DMEM zawierającej 20% FCS, 1 mM L-glutaminy, 50 lU/ml penicyliny i 50 pg/ml streptomycyny (DMEM/FCS). Żywotne komórki zliczono przez eliminację błękitu trypanowego (0,2%).
Badanie Plasmacute przy użyciu zestawów ELISA anty-HSV IgM i IgG Behringer Enzygnost
Anty-HSV IgM i IgG Behringer Enzygnost są dostarczane jako paski zawierające 8 dołków powleczonych antygenem pochodzącym ze stałych małpich komórek nerkowych zainfe
182 061 kowanych HSV i 8 dołków powleczonych antygenem kontrolnym z niezainfekowanych komórek. Paski te były blokowane przez 200 μΐ na dołek DMEM/FCS przy 37°C w 5% CO2 przez 1 h. Dodano 100 μΐ na dołek odpowiedniego rozcieńczenia limfocytów i inkubowano przez 3 h przy 37°C w 5% CO2. Wszystkie dalsze procedury przebiegały ściśle według instrukcji dostawcy zestawu. Płytki wywoływano przy użyciu roztworów sprzężonych, odczynników i buforów dostarczonych przez tego samego dostawcę. Podłoże, wodorochlorek czterometylobenzydyny (TMB), wymagało odczytania wartości przy 450 nm przy użyciu dostępnego czytnika płytek Titertek Multiskan MCC/340 (Flow Laboratories).
Badanie Plasmacute przy użyciu Bioelisa HSV-2 IgG
Zestaw Bioelisa IgG HSV-2 ELISA (BIOKIT, Hiszpania) dostarczany jest w postaci pasków zawierających 8 dołków, które są powleczone unieczynnionym antygenem HSV-2. Paski były blokowane za pomocą 200 μΐ/dołek DMEM/FCS przy 37°C w 5% CO2 przez 1 h. 100 μΐ na dołek odpowiedniego rozcieńczenia limfocytów dodano i inkubowano przez 3 h przy 37°C w 5% CO2. Wszystkie dalsze procedury były ściśle według instrukcji przekazanych przez dostawcę zestawu. Płytki wywołano przy użyciu roztworów sprzężonych, odczynników i buforu dostarczonych przez tego samego dostawcę. Podłoże, wodorochlorek czterometylobenzydyny (TMB), wymagał odczytania wartości przy 450 nm przy użyciu dostępnego czytnika płytek Titertek Multiskan MCC/340 (Flow Laboratories).
Badanie Plasmacute przy użyciu zestawu badawczego Bioelisa HSV IgM (Immunocapture)
Zestaw badawczy Bioelisa HSV IgM (Immunocapture) (BIOKIT, Hiszpania) dostarczany jest jako paski zawierające 8 dołków, które są powleczone króliczymi przeciwludzkimi przeciwciałami IgM. Paski te były blokowane przez 200 μΐ/dołek DMEM/FCS przy 37°C w 5% CO2 przez 1 h. 100 μΐ na dołek odpowiedniego rozcieńczenia limfocytów dodano i inkubowano przez 3 h przy 37°C w 5% CO2. Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Wiązane przeciwciało wykrywano za pomocą 100 μΐ/dołek peroksydazy chrzanowej znakowanej antygenem HSV (oczyszczony i unieczynniony HSV, który wprowadzono in vitro w fibroblasty ludzkie) i w celu zmniejszenia do minimum niespecyficznych reakcji z nieznakowanym antygenem kontrolnym złożonym z niezainfekowanych składników komórek (dostarczone wraz z zestawem), 10 μΐ antygenu HSV i 10 μΐ antygenu kontrolnego na pasek. Płytki odczytywano w czytniku płytek Titertek Multiskan MCC/340 przy 450 nm (Flow Laboratories).
Wyniki eksperymentu przedstawiono w tabeli 2.
Tabela 2
| Pacjent | Czas od wystąpienia objawów 2. (dnl) 8. £ | Podejrzewane zakażenie pierwotne/wtóme | Izolowanie wirusa | Przeciwciała surowicy | (Behnnger ELISA) | Badania komórek plazmatycznych | Przeciwciało wychwytowe Badanie komórek plazmatycznych | |||
| IgM | IgG | Behnnger IgM | Behnnger IgG | Bioelisa IgG | Bioehsa IgM | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 1 7 | 8 | 9 | 1 10 | 11 |
| 1 | 6 | K/40 | Infekcja pierwotna | -ve | - | linia graniczna | - | 205000 | 103000 | - |
| 2 | 6 | k/21 | Infekcja pierwotna | HSV-1 | - | + | - | 223000 | 111000 | - |
| 3 | 2 20 | M/47 | Infekcja wtórna | HSV-2 HSV-2 | + | + nb | 182000 | 48000 nb | 96000 | - |
182 061 cd. tabeli 2
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 1 | 7 | 8 1 | 1 9 | 1 10 1 | 11 |
| 4 | 5 19 | K/22 | Infekcja pierwotna | -ve | Linia graniczna nb | + nb | 60500 | 15000 40000 | 121000 20250 | <8000 40500 |
| 5 | 7 | k/21 | Infekcja pierwotna | -ve | - | - | - | - | - | - |
Tabela 2 zawiera podsumowanie danych dla pacjentów 1-5. Laboratorium diagnostyczne w szpitalu Uniwersytetu Haukeland próbowało wyizolować wirusa z próbek klinicznych oraz przeprowadziło rutynowe testy ELISA dla IgG i IgM surowicy przy użyciu zestawów ELISA z firmy Behringer Enzygnost. Ponadto typ wyizolowanego wirusa, przy czym - ve oznacza negatywny wynik izolowania. Wartości odcięcia badania ELISA dla surowicy są określone przy wytwarzaniu zestawu; + = OD > 0,2, linia graniczna = OD 0,1-0,2, zdefiniowane jako wynik dwuznaczny przez producentów zestawu do badań; a — = OD <0,1.
Dla badania Plasmacute użyliśmy OD > 0,2 jako pozytywne i zestawiliśmy w tabeli liczby limfocytów potrzebne do uzyskania takiej reakcji.
Tylko test Bioelisa IgG wymaga identyfikacji przeciwciał HSV2, natomiast inne będą oznaczać infekcję HSV (1 i/lub 2).
Wyniki
Pacjent 1 ma kliniczne symptomy pierwotnej infekcji HSV-2. Badania szpitalne nie pozwoliły na wyizolowanie wirusa z próbki klinicznej i nie znaleziono IgM przez standardowe badania ELISA. Przeciwciało IgG surowicy dla linii granicznej znaleziono przez standardowe szpitalne testy ELISA. Dla potwierdzenia tych wyników nie znaleziono żadnych komórek wytwarzających przeciwciało IgM w badaniu Plasmacute. Zarówno badanie Behringer IgG jak i badanie Bioelisa IgG Plasmacute wykryło komórki wytwarzające przeciwciało IgG wobec HSV. Potrzeba było 205.000 limfocytów do uzyskania absorbancji odcięcia w badaniu Behringer Plasmacute, a w badaniu Bioelisa potrzeba było 103.000 limfocytów do uzyskania absorbancji odcięcia.
Pacjent 2 przechodził infekcję pierwotną, co zostało potwierdzone przez wyizolowanie wirusa HSV typu 1. Nie wykryto IgM surowicy w laboratorium szpitalnym, ale wykryto przeciwciało IgG. W badaniu Plasmacute nie wykryto komórek wytwarzających IgM, jednakże zarówno badanie Behringer jak i badanie Bioelisa Plasmacute wykryło komórki wytwarzające IgG, przy czym potrzebne było odpowiednio 223.000 i 111.000 komórek.
Pacjent 3 miał nawrotną infekcję HSV-2, co zostało potwierdzone przez wyizolowanie wirusa HSV-2 z próbek klinicznych. IgG była obecna w próbce surowicy pobranej 2 dni po wystąpieniu symptomów klinicznych, jednakże w tym okresie nie wykryto IgM surowicy. W badaniu Plasmacute nie wykryto IgM w 2 dni po wystąpieniu objawów klinicznych, jednakże zarówno badanie Behringera jak i badanie Bioelisa Plasmacute wykryło komórki wytwarzające IgG (potrzeba było 48.000-96.000 komórek). Przeciwciała surowicy IgM wykryto w szpitalu w próbce surowicy pobranej 20 dni od wystąpienia symptomów klinicznych. Do wytworzenia absorbancji odcięcia w badaniu IgM Behringer potrzeba było 182.000 komórek, jednakże nie wykiyto żadnych komórek przez badanie Bioelisa IgM Plasmacute.
Pacjent 4 miał pierwotną infekcję HSV. W próbce klinicznej przesłanej do laboratorium szpitalnego nie wykiyto wirusa. Wykryto przeciwciała IgM surowicy na linii granicznej i stwierdzono pozytywne poziomy przeciwciał IgG surowicy. Zarówno przeciwciała IgM jak i przeciwciała IgG wykryto w badaniu Plasmacute przy użyciu zarówno zestawów Behringera jak i zestawów Bioelisa w próbkach krwi pobranych 5 i 19 (nie wykryto IgM w badaniu Behringera) dni od wystąpienia symptomów klinicznych. W badaniu Plasmacute potrzeba było mniej niż 8.000 komórek dla badania Bioelisa IgM, a 60.500 komórek było potrzebne do badania Behrinfer IgM, przy czym w obu badaniach potrzeba było mniej niż 100 μΐ heparynizowanej krwi.
182 061
Pacjent 5 podejrzewany był o pierwotną infekcję HSV. Jednakże nie wyizolowano żadnego wirusa w laboratorium i nie wykryto przeciwciał surowicy. W badaniu Plasmacute nie wykryto żadnych komórek wytwarzających przeciwciało IgG lub IgM wobec HSV.
Omówienie
Okazało się, że badanie Plasmacute działa dobrze zarówno przy pierwotnej jak i przy nawrotowej infekcji wirusa opryszczki. We wszystkich przypadkach badanie Plasmacute było przeprowadzone przynajmniej równie dobrze jak używane tu tradycyjne procedury ELISA. W szczególności w przypadku pacjenta 1, chociaż nie wyizolowano wirusa z próbki klinicznej i oceniano tylko dodatni wynik linii granicznej (tzn. niekonkluzyjny) w szpitalnym badaniu rutynowym, badanie Plasmacute (BioelisalgG i Behringer IgG) wykazało, że około 100.000 komórek i odpowiednio 200.000 komórek dało niedwuznaczny wynik pozytywny. Możliwe jest, że pacjent ten ma podwójną infekcję (HSV1 i HSV2), z czego tylko HSV1 otrzymano na miejscu przez wyizolowanie wirusa. Nie można jednak wykluczyć, że pozytywny wynik HSV2 (Bioelisa IgG) był spodowany serologiczną reakcję krzyżową. Dla dwóch odległych w czasie próbek od pacjenta 4, z których nie wyizolowano wirusa, badanie Plasmacute wykazało przesunięcie liczb limfocytów produkujących IgM i IgG specyficzne wobec opryszczki z wcześniejszej fazy do późniejszej fazy infekcji zgodnie ze znaną dynamiką przebiegu infekcji pierwotnej, co wyraźnie potwierdza aktywną reakcję immunologiczną. Test Bioelisa IgG Plasmacute był szczególnie czuły, ponieważ potrzeba było mniej niż 8.000 limfocytów dla otrzymania pozytywnego sygnału w pierwszych dwóch próbkach.
W doświadczeniu tym wykazaliśmy, że metoda Plasmacute działa w przypadkach klinicznych infekcji wirusowych u człowieka.
Przykład 5
Wiele płytek - powleczenie płytek nitrocelulozowych wychwytowymi przeciwciałami specyficznymi dla przeciwciał IgG, IgA i IgM.
Przykład ten przeprowadzono w celu ustalenia, czy w badaniu Plasmacute można stosować system wielopłytkowy do wykrywania przeciwciał o różnych specyficznościach.
Ogólna procedura
Heparynizowane próbki pełnej krwi pobrano od dwóch zdrowych dorosłych obiektów. Ponieważ obiekty nie były w ostrej fazie infekcji, skupiliśmy się na analizowaniu spontanicznego wydzielania przeciwciał IgG, IgM i IgA niezależnie od nich (nie znanej) specyficzności antygenowej.
Obiekt 1 użyto do stwierdzenia, czy system z zastosowaniem płytek powleczonych trzema różnymi antygenami można stosować w pojedynczym dołku w badaniu Plasmacute. Jeden dołek (nr 1).
Obiekt 2 wykorzystano do stwierdzenia, czy było osłabienie sygnału w obecności pewnej liczby płytek powleczonych tym samym antygenem. Trzy oddzielne dołki w badaniu Plasmacute (dołki nr 2, 3 i 4).
Oddzielanie limfocytów
Limfocyty izolowano przez wirowanie heparynizowanej krwi z gradientem gęstości z zastosowaniem lymphoprep (Nycomed). Komórki przemyto trzykrotnie w PBS i z powrotem wprowadzono do zawiesiny w pożywce hodowli w DMEM, zawierającej 20% FCS, 1 mM L-glutaminy, 50 lU/ml penicyliny i 50 μg/ml steroptomycyny (DMEM/FCS). Żywotne komórki zliczano przez eliminację błękitem trypanowym (0,2%).
Badanie Plasmacute przy użyciu płytek jako fazy stałej
Płytki z mieszanych estrów celulozy o wielkości porów 8 pm (Millipore SCWP 013 00) powleczono 10 μg/ml kozich przeciwciał antyludzkich specyficznych klasowo (Sigma, antyIgG 1-3382; anty-IgA 1-0884; anty-IgM 1-0759) rozcieńczonych w azydku PBS (0,001%) przez noc w temperaturze pokojowej. Płytki blokowano za pomocą DMEM/FCS przy 37°Ć w 5% CO2 przez 1 h. Limfocyty dodano do przezroczystego dołka przejściowego o wielkości porów 0,4 pm (Costar 3460) i płytki umieszczono pod spodem, po czym inkubowano przez 3 godziny przy 37°C w 5% CO2. Poszczególne płytki przeniesiono do oddzielnych dołków w płytce 24-dołkowej (Costar) i trzykrotnie przemyto za pomocą PBS oraz trzykrotnie za pomocą PBS Tween (0,05%). Związane przeciwciało wykrywano za pomocą 200 pl na dołek
182 061 sprzężonych przeciwciał koziej antyludzkiej peroksydazy specyficznej klasowo (Sigma IgG A-6029, IgA A-4165, IgM A-4290), rozcieńczonych w DMEM/FCS i inkubowanych przez 2 h przy temperaturze pokojowej. Płytki przemyto w celu usunięcia nie związanego przeciwciała, jak to opisano poprzednio i wywołano za pomocą 200 μΐ na dołek dwuwodorochlorku o-fenylenodwuaminy (OPD) (Sigma P-7288) w roztworze buforowym 0,05 M cytrynianu fosforanowego (pH 5,0). Trzydzieści minut po dodaniu podłoża wywoływanie zatrzymano stosując 100 μΐ na dołek IM H2SO4. 100 μΐ na dołek przeniesiono do 96-dołkowej płytki ELISA (płytki Greiner EIA 655001 forma F) i odczytano wartości OD w czytniku płytek Titertek Multiskan MCC/340 (Flow Laboratories) przy 492 nm.
Wyniki eksperymentu przedstawiono w tabeli 3, gdzie odczyt dla każdego wychwyconego przeciwciała jest średnią z trzech dołków jako absorbancja x 1000.
Tabela 3
| Obiekt 1 | Obiekt 2 | ||||||||||
| Dołek 1 | Dołek 2 | Dołek 3 | Dołek 4 | ||||||||
| Nr płytki | przeciwludzkie przeciwciało wychwytowe | OD (492 nm) | Nr płytki | przeciwludzkie przeciwciało wychwytowe | OD (492 nm) | Nr płytki | przeciwludzkie । przeciwciało wychwytowe | OD (492 nm) | Nr płytki | przeciwludzkie przeciwciało wychwytowe | OD (492 nm) |
| 1 IgG 405 2 IgA 140 3 IgM 85 4 IgG 410 5 IgA 125 6 IgM 64 7 IgG 375 8 IgA 168 9 IgM 61 Komórki | 1 IgG 148 2 IgG 182 3 IgG 112 4 IgG 157 5 IgG 142 6 IgG 123 7 IgG 144 8 IgG 125 Komórki | 1 IgA 182 2 IgA 202 3 IgA 221 4 IgA 263 5 IgA 190 6 IgA 209 7 IgA 172 8 IgA 151 Komórki | 1 IgM 82 2 IgM 107 3 IgM 124 4 IgM 145 5 IgM 119 6 IgM 127 7 IgM 138 8 IgM 134 Komórki |
Dołek 1 zawierał 2 miliony limfocytów, dołki 2-4 zawierały 1 milion limfocytów. ,,Komórki” ma oznaczać, który numer płytki był usytuowany najbliżej warstwy komórek.
Wyniki
Test z obiektem 1 wykazał, że nawet 9 płytek można by łatwo stosować w dołku zawierającym limfocyty. Reakcja na trzy płytki IgG, trzy płytki IgA i trzy płytki IgA była w celach praktycznych identyczna dla każdego zestawu, przez co pokazano, że rzeczywiste położenie płytki względem limfocytów wydzielających przeciwciało nie było krytyczne. Test z limfocytami dla obiektu 2 wykazał, że przynajmniej 8 identycznie powleczonych dołków można umieścić w jednym dołku zawierającym limfocyty, aby uzyskać rzeczywiście identyczne odczyty. Wynalazek umożliwia zatem przeprowadzenie wielu badań tego samego preparatu limfocytowego w jednym dołku.
182 061
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (19)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wykrywania wytwarzania aktywnego przeciwciała w reakcji na docelowy antygen w próbce kiwi przez kontaktowanie jej ze stałym podłożem i obróbkę w postaci unieruchomionej na stałym podłożu mającym postać w szczególności cząstek, arkuszy, żelów, filtrów, membran, pasków mikromiareczkowych, probówek lub płytek, a zwłaszcza płytek Elisa, znamienny tym, że kontaktowanie ze stałym podłożem, w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein, porcji wymienionej próbki lub ewentualnie limfocytów, bezpośrednio wyizolowanych z wymienionej próbki prowadzi się w takich warunkach, które umożliwiają wytwarzanie i wydzielanie przeciwciała przez limfocyty, najkorzystniej w temperaturze około 37°C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla w czasie jednej do kilku, w szczególności do 4 godzin; następnie wykrywa się w środowisku roztworu przeciwciała z wymienionymi antygenami na fazie stałej, następnie przez porównanie wymienionych wiązań przeciwciała w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein, oznacza się ilości wydzielania aktywnego przeciwciała wobec wspomnianych antygenów.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się stałe podłoże, które utrzymuje jeden lub więcej antygenów rozpoznawanych przez przeciwciało lub przeciwciała, które mają być wykrywane.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się podłoże, które utrzymuje jedno lub więcej przeciwciał, rozpoznających wykrywane przeciwciało lub przeciwciała.
- 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że stosuje się próbkę krwi objętości mniejszej niż 1 ml.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako próbkę krwi stosuje się krew noworodków lub niemowląt i porównuje się przeciwciała syntetyzowane z biernie przeniesionymi przeciwciałami matki.
- 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że jako próbkę krwi stosuje się krew oczyszczoną lub wzbogaconą lecz pobraną bezpośrednio od pacjenta.
- 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że stosuje się limfocyty bezpośrednio wyizolowane z próbki krwi.
- 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że przed etapem kontaktowania z próbką stałe podłoże blokuje się przed syntezą protein.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako inhibitor syntezy protein stosuje się cykloheksimid o stężeniu 50-500 mg/ml.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitor syntezy protein stosuje się łącznie z inhibitorem ATPase.
- 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykrywanie przeciwciał prowadzi się przez badanie immunologiczne.
- 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako badanie immunologiczne stosuje się badanie ELISA.
- 13. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że ze stałym podłożem kontaktuje się jeden lub wiele antygenów rozpoznawanych przez przeciwciało lub przeciwciała, które mają być wykrywane, unieruchomione na wymienionej fazie stałej.
- 14. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jedno lub wiele przeciwciał, które rozpoznają przeciwciało lub przeciwciała unieruchomione na wymienionej fazie stałej, kontaktuje się z wymienioną fazą stałą.
- 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalne medium stosowane do etapu wykrywania przeciwciała i odbiera sygnał wykrywalny spektrofotometrycznie.182 061
- 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się antygen kontroli negatywnej.
- 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykrywa się wytwarzanie aktywnego przeciwciała wobec wirusa opryszczki.
- 18. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się wiele faz stałych, z których każda zawiera inny docelowy antygen.
- 19. Sposób wykrywania obecności niespecyficznych wskaźników infekcji w próbce krwi, przez poddanie jej obróbce w postaci unieruchomionej na stałym podłożu mającym postać w szczególności cząstek, arkuszy, żelów, filtrów, membran, pasków mikromiareczkowych, probówek lub płytek, a zwłaszcza płytek Elisa, znamienny tym, że kontaktowaniu ze stałym podłożem, w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein, porcję wymienionej próbki lub ewentualnie limfocytów bezpośrednio wyizolowanych z wymienionej próbki poddaje się w takich warunkach, które umożliwiają wytwarzanie i wydzielanie przeciwciała przez limfocyty, najkorzystniej w temperaturze około 37°C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla w czasie kilku, w szczególności jednej lub kilku, zwłaszcza do 4 godzin; następnie wykrywa się w środowisku roztworu wiązanie wskaźników infekcji z partnerem wiązania, a w końcu oznacza się ilości wskaźników infekcji przez porównanie wspomnianego wskaźnika infekcji w obecności lub przy braku inhibitora syntezy protein wymienionych wiązań przeciwciała.* * *
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9503406.2A GB9503406D0 (en) | 1995-02-21 | 1995-02-21 | Detection of antibody production |
| PCT/GB1996/000392 WO1996026443A1 (en) | 1995-02-21 | 1996-02-21 | Detection of antibody production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL322209A1 PL322209A1 (en) | 1998-01-19 |
| PL182061B1 true PL182061B1 (pl) | 2001-10-31 |
Family
ID=10769981
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96322209A PL182061B1 (pl) | 1995-02-21 | 1997-08-14 | Sposób wykrywania wytwarzania aktywnego przeciwcialaoraz sposób wykrywania obecnosci niespecyficznych wskazników infekcji w próbce krwi PL PL PL |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6080552A (pl) |
| EP (1) | EP0811165B1 (pl) |
| JP (1) | JP3472929B2 (pl) |
| CN (1) | CN1098460C (pl) |
| AT (1) | ATE188551T1 (pl) |
| AU (1) | AU709591B2 (pl) |
| CA (1) | CA2213083C (pl) |
| CZ (1) | CZ289582B6 (pl) |
| DE (1) | DE69606024T2 (pl) |
| DK (1) | DK0811165T3 (pl) |
| ES (1) | ES2140821T3 (pl) |
| FI (1) | FI117911B (pl) |
| GB (1) | GB9503406D0 (pl) |
| GR (1) | GR3032740T3 (pl) |
| HU (1) | HU225687B1 (pl) |
| NO (1) | NO317151B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ301770A (pl) |
| PL (1) | PL182061B1 (pl) |
| PT (1) | PT811165E (pl) |
| RU (1) | RU2197733C2 (pl) |
| WO (1) | WO1996026443A1 (pl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0955544A1 (de) * | 1998-05-06 | 1999-11-10 | Hölzel Diagnostika Handels GmbH | Verfahren zum Erfassen von Primärsignalen bei der Zellkommunikation von Zellen des Immunsystems |
| GB9913819D0 (en) * | 1999-06-14 | 1999-08-11 | Plasmacute As | Assay |
| GB0325483D0 (en) * | 2003-10-31 | 2003-12-03 | Plasmacute As | Assay |
| US20050240353A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-10-27 | Hoffmann Technologies Corporation | Reagents, devices and methods for proteomic analysis with applications including diagnostics, vaccines, quality control and research |
| JP4412732B2 (ja) * | 2005-04-19 | 2010-02-10 | 独立行政法人国立高等専門学校機構 | リンパ球を利用した抗体検査方法および病原体特定方法 |
| DE102007052518A1 (de) * | 2007-10-29 | 2009-04-30 | Autoimmun Diagnostika Gmbh | Verfahren zur in vitro-Diagnose und/oder in vitro- Therapieverfolgung von Infektionen |
| AU2015257417A1 (en) | 2014-05-05 | 2016-11-03 | Cembre S.P.A. | Machine for the application and / or removal of connecting fasteners for rails |
| RU2756764C1 (ru) * | 2021-06-09 | 2021-10-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России) | Способ определения функциональной активности системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5019497A (en) * | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Lennart Olsson | Human squamous lung carcinoma cell specific antigens and antibodies |
| US4707443A (en) * | 1985-04-19 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Soluble interleukin-2 receptor as a disease indicator and a method of assaying the same |
| CA2011099A1 (en) * | 1989-04-19 | 1990-10-19 | Stephen C. Wardlaw | Determination of lymphocyte reactivity to specific antigens in blood |
| US5188942A (en) * | 1990-10-09 | 1993-02-23 | Consultants For Applied Biosciences, Inc. | Method for determining bluetongue virus antibodies in serum |
-
1995
- 1995-02-21 GB GBGB9503406.2A patent/GB9503406D0/en active Pending
-
1996
- 1996-02-21 PT PT96903122T patent/PT811165E/pt unknown
- 1996-02-21 AU AU47268/96A patent/AU709591B2/en not_active Ceased
- 1996-02-21 RU RU97115554/13A patent/RU2197733C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 EP EP96903122A patent/EP0811165B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-21 HU HU9801448A patent/HU225687B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 CZ CZ19972634A patent/CZ289582B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 CA CA002213083A patent/CA2213083C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-21 NZ NZ301770A patent/NZ301770A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 US US08/913,137 patent/US6080552A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-21 DE DE69606024T patent/DE69606024T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-21 CN CN96192047A patent/CN1098460C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-21 AT AT96903122T patent/ATE188551T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 ES ES96903122T patent/ES2140821T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-21 DK DK96903122T patent/DK0811165T3/da active
- 1996-02-21 WO PCT/GB1996/000392 patent/WO1996026443A1/en active IP Right Grant
- 1996-02-21 JP JP52549296A patent/JP3472929B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-08-14 PL PL96322209A patent/PL182061B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-08-20 NO NO19973823A patent/NO317151B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-08-20 FI FI973418A patent/FI117911B/fi not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-02-23 GR GR20000400440T patent/GR3032740T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1176000A (zh) | 1998-03-11 |
| FI117911B (fi) | 2007-04-13 |
| CZ289582B6 (cs) | 2002-02-13 |
| NO973823L (no) | 1997-10-20 |
| CA2213083A1 (en) | 1996-08-29 |
| GR3032740T3 (en) | 2000-06-30 |
| RU2197733C2 (ru) | 2003-01-27 |
| FI973418A (fi) | 1997-08-20 |
| US6080552A (en) | 2000-06-27 |
| CN1098460C (zh) | 2003-01-08 |
| NZ301770A (en) | 1999-04-29 |
| PT811165E (pt) | 2000-04-28 |
| EP0811165B1 (en) | 2000-01-05 |
| JPH11500226A (ja) | 1999-01-06 |
| DE69606024D1 (de) | 2000-02-10 |
| DE69606024T2 (de) | 2000-09-14 |
| CZ263497A3 (cs) | 1998-02-18 |
| HUP9801448A2 (hu) | 1998-10-28 |
| JP3472929B2 (ja) | 2003-12-02 |
| FI973418A0 (fi) | 1997-08-20 |
| NO317151B1 (no) | 2004-08-30 |
| AU4726896A (en) | 1996-09-11 |
| HU225687B1 (en) | 2007-06-28 |
| ES2140821T3 (es) | 2000-03-01 |
| GB9503406D0 (en) | 1995-04-12 |
| ATE188551T1 (de) | 2000-01-15 |
| HUP9801448A3 (en) | 2000-09-28 |
| WO1996026443A1 (en) | 1996-08-29 |
| NO973823D0 (no) | 1997-08-20 |
| CA2213083C (en) | 2007-12-04 |
| PL322209A1 (en) | 1998-01-19 |
| AU709591B2 (en) | 1999-09-02 |
| DK0811165T3 (da) | 2000-05-08 |
| EP0811165A1 (en) | 1997-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH03502241A (ja) | ヒト血清におけるｈｉｖ抗原を検出する酵素免疫検定法 | |
| NL7907939A (nl) | Gecombineerde heterogene specifieke bindingsproeven. | |
| EP0173295A1 (en) | Assay for simultaneous detection of antigen and antibody in given serum | |
| EP0644950A4 (en) | ASSAY FOR THE DETECTION OF HIV ANTIGEN AND HIV ANTIBODIES. | |
| JPH0343094A (ja) | 単純ヘルペスウイルス抗原の抽出または測定のための抽出組成物、抽出方法および診断試験キット | |
| JPH1078435A (ja) | 被検物質の免疫化学的測定における感度の上昇 | |
| PL182061B1 (pl) | Sposób wykrywania wytwarzania aktywnego przeciwcialaoraz sposób wykrywania obecnosci niespecyficznych wskazników infekcji w próbce krwi PL PL PL | |
| US20080206790A1 (en) | Assay for determining the presence or amount of newly synthesized antibodies | |
| JPH0743384B2 (ja) | アッセイ用水性洗浄液、診断試験キット及び単純ヘルペスウイルスの測定方法 | |
| US20100267009A1 (en) | Method for the in vitro diagnosis and/or in vitro therapy monitoring of infections | |
| Hofmann et al. | Immunoglobulins to tick‐borne encephalitis in the cerebrospinal fluid of man | |
| Kiefer et al. | Normalized enzyme-linked immunosorbent assay for determining immunoglobulin G antibodies to cytomegalovirus | |
| WO1995002186A1 (en) | New diagnostic assay for detection of syphilis | |
| JP3936678B2 (ja) | 抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及び抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法 | |
| Cubie | Evaluation of a new ELISA method for estimating rubella-specific IgM antibody | |
| JP2001302697A (ja) | ポリクローナル抗体及びその製造方法 | |
| JPH0382962A (ja) | Ｂ型肝炎ウィルスＣｏｒｅ抗原に対する抗体の検出方法 | |
| JPH02287258A (ja) | 体液中の感染症原因生物に対する抗体の測定方法およびそのための剤 | |
| MXPA96006583A (en) | Immunological method of determinac |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20110221 |