CN101970634A - 具有改变性质的TS23α-淀粉酶变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有α-淀粉酶活性而且与亲本α-淀粉酶相比呈现改变了的性质的亲本α-淀粉酶的变体(突变体)，以及其使用方法。
Description
优先权
本申请要求2008年2月4日申请的系列号为61/026056和2008年6月6日申请的系列号为61/059,403的美国临时专利申请的优先权，其通过整体引入本文作为参考。
技术领域
本发明公开了涉及TS-23阿尔法-淀粉酶(α-淀粉酶)的变体的组合物和方法，相对于亲本淀粉酶，所述变体具有改变的生化性质和有利的性能特性。此处公开的变体适用于例如淀粉转化、乙醇生产、衣物和餐具洗涤、硬表面清洁、纺织品退浆和/或增甜剂生产。
背景技术
淀粉是直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物。直链淀粉是由α-1，4连接的葡萄糖单位的线性链组成，具有分子量(MW)从约60,000至约800,000。支链淀粉是分支多聚体，每24-30个葡萄糖单位其含有α-1，6分支点。其分子量可以高达1亿。
目前是通过酶催化过程从淀粉产生浓缩的葡萄糖糖浆形式的糖，所述催化过程涉及：(1)用α-淀粉酶将固体淀粉液化(或稀薄化)为具有约7-10平均聚合度的糊精，和(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)对产生的液化淀粉(即，淀粉水解物)的糖化作用。产生的糖浆具有高的葡萄糖含量。商业生产的大部分葡萄糖糖浆随后被酶促异构化为右旋葡萄糖/果糖混合物，称为异构糖浆(isosyrup)。
α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)是一组酶，其通过随机切割内在的α-1，4-糖苷键水解淀粉、糖原和有关的多糖。这一组酶具有多种重要的商业应用，例如在淀粉加工的初始阶段(液化)中、在纺织品的退浆中、在再循环纸的脱墨中、在纸和纸浆工业中的淀粉修饰、在湿玉米碾磨中、在乙醇生产中、在增甜剂(例如糖)生产中、在饮料工业中、在酿造中、在油矿、在动物饲料和在去污剂基质中作为清洁剂。例如，这些酶可以在餐具和洗衣过程中用于去除淀粉污渍。
α-淀粉酶分离自多种细菌、真菌、植物和动物来源。工业上，许多重要的α-淀粉酶分离自杆菌。一种表征过的α-淀粉酶是嗜碱性的杆菌物种TS-23菌株的α-淀粉酶，该菌株产生至少五类呈现淀粉水解活性的酶。(Lin 等人，1998，“Production and properties of a raw-starch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp.TS-23，”Biotechnol.Appl.Biochem.28：61-68)。虽然其在宽范围pH内(即，pH4.7至10.8)稳定，杆菌物种TS-23菌株的α-淀粉酶的最适宜pH为9。虽然该酶在较低温度例如15-20℃也有活性，但是其最适宜温度为45℃。
还是需要α-淀粉酶变体，该变体具有改变的生化特征，并且在工业应用中提供改善的性能。
发明内容
本发明公开了TS-23α-淀粉酶的变体(突变体)，该变体呈现改变了的性质，有利于多种工业过程，例如，淀粉的加工(例如淀粉液化、糖化等)，纺织品的加工(例如退浆)和作为洗涤剂的添加剂(例如用于清洁淀粉类污渍)。
这种改变包括但不限于在比活性、底物特异性、底物结合、底物裂解模式、热稳定性、氧化稳定性、Ca2+依赖性、pH/活性谱、pH/稳定性谱和其他目的性质上的改变。一个示例性改变的pH/稳定性谱是在低pH(例如pH＜6甚至pH＜5)和/或高pH(例如pH＞9)下提高的稳定性。
在本发明的一个方面，提供了亲本AmyTS23 α-淀粉酶的变体，其具有与亲本α-淀粉酶有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性的氨基酸序列，而且包含下列特征中的至少两个：(a)C末端的平截，(b)氨基酸201的取代，或(c)R180和S181残基的缺失，而且其中该变体具有α-淀粉酶活性(使用SEQ ID NO：1对氨基酸进行编号)。在一些实施方式中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO：1。在一些实施方式中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO：1有指定的同源性。
本发明的另一方面涉及手洗或自动洗涤的餐具洗涤组合物，包括杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体。该组合物可进一步包含表面活性剂、洗涤剂增效剂、络合剂、聚合物、漂白***、稳定剂、发泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污物悬浮剂、防尘污再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶增溶剂、晦暗抑制剂和香味剂中的一种或多种。该餐具洗涤组合物可以是用于手洗或自动洗涤餐具的组合物。
本发明的一个相关方面涉及洗衣洗涤剂添加剂，包含杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体。如上所述，该组合物可进一步包含表面活性剂、洗涤剂增效剂、络合剂、聚合物、漂白***、稳定剂、发泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污物悬浮剂、防尘污再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶增溶剂、晦暗抑制剂和香味剂中的一种或多种。该组合物也可包含表面活性剂、洗涤剂增效剂、络合剂、聚合物、漂白***、稳定剂、发泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污物悬浮剂、防尘污再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶增溶剂、荧光增白剂、织物调节剂和香味剂中的一种或多种。
进一步的方面涉及编码上述变体的核酸和包含这种核酸的载体。还涉及其中***了该核酸的细胞，例如通过载体、噬菌体或病毒***。这种分离的宿主细胞可以是微生物，例如细菌或真菌。细菌可以是革兰氏阳性菌，选自下组中：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(G.stearothermophilus，以前称作B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(S.murinus)；或革兰氏阴性细菌，其中所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)和假单胞菌属(Pseudomonas)物种。
其他方面涉及制备该变体多肽的方法和该变体多肽在多种工业工艺中(例如淀粉液化中)单独使用或与其他酶联合使用的用途，其他酶包括α-分解淀粉酶。一些方面涉及多种多肽用于洗衣或餐具洗涤的用途。还涉及用上述多种多肽清洁织物和/或其他硬表面的方法。另一个方面涉及此处描述的α-淀粉酶或任何该α-淀粉酶变体在织物退浆组合物中的用途，例如其中该组合物是水性溶液。还涉及用该组合物退浆织物的方法。
该变体多肽可任选地以无尘颗粒、微粒、稳定化液体或受保护的酶的形式存在。另一方面涉及洗涤剂添加剂或洗涤剂组合物，进一步包含选自下组的酶：纤维素酶、蛋白酶、酰基转移酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、环糊精葡聚糖转移酶(cyclodextrin glycotransferase)、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、角叉菜酶(carrageenase)及其任意组合。用于该组合物的其他淀粉酶包括两种或多种其他α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶或葡糖淀粉酶。
一些方面涉及水性溶液中的用于淀粉加工的组合物，包括杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体。还涉及使用这种组合物加工淀粉的方法。该方法和组合物可进一步包括葡糖淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶或其组合。又一个其他方面涉及在溶液或凝胶中的生物膜降解(例如水解)组合物，包括杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体，可选地进一步包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、抗微生物剂或其任意组合。还涉及用该组合物水解生物膜的方法。
另一方面涉及溶液中的糖化淀粉的组合物，包括杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体。所以，还涉及糖化淀粉的方法，包括将含有所述淀粉酶的组合物施用足以糖化淀粉的一段时间。
另一方面涉及在溶液中的液化淀粉的组合物，包括杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体。还涉及液化淀粉的方法，包括将该组合物施用足以液化淀粉的一段时间。
下面描述该组合物和方法的一些具体方面。
在一方面，提供了亲本AmyTS23 α-淀粉酶的变体，其中该变体具有与该亲本α-淀粉酶至少80％同一性的氨基酸序列，而且含有下列特征中的至少两个：
(a)C-末端的平截，
(b)残基201的取代，或
(c)残基R180和S181的缺失，
其中所述氨基酸残基是指SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方式中，变体具有α-淀粉酶活性。
在一些实施方式中，该变体与亲本α-淀粉酶具有至少90％同一性。在一些实施方式中，该变体与亲本α-淀粉酶具有至少95％同一性。在具体的实施方式中，该亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该变体进一步包括在选自下组中的一个或多个残基处的取代：残基87、残基225、残基272和残基282。
在另一方面，提供了亲本AmyTS23α-淀粉酶的变体，其中该变体具有与该亲本α-淀粉酶至少85％同一性的氨基酸序列，而且含有C-末端的平截。在一些实施方式中，该变体具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。与亲本淀粉酶相比，在冷水中该变体对淀粉污渍可以具有提高的清洁活性。
在一些实施方式中，该变体进一步包含R180和S181位点残基的缺失，其中氨基酸残基位点参考SEQ ID NO：1的氨基酸序列。与亲本淀粉酶相比，该变体可具有提高的洗涤剂稳定性。
在一些实施方式中，该变体进一步包含201位点残基的取代，其中氨基酸残基位点参考SEQ ID NO：1的氨基酸序列。与亲本淀粉酶相比，该变体可具有提高的氧化稳定性。该变体可具有取代M201L。
上述任何变体可进一步包括在选自下组中的一个或多个残基处的取代：残基87、残基225、残基272和残基282，其中氨基酸残基位点参考SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在一个相关的方面，提供了编码此处所述变体的核酸。在一些实施方式中，提供了包含在适宜启动子控制下的该核酸的表达载体。在一些实施方式中，提供了包含该表达载体的宿主细胞。
在一个相关的方面，提供了手洗或自动洗涤餐具的组合物，该组合物包含此处所述的变体和下列物质中的一种或多种：表面活性剂、洗涤剂增效剂、络合剂、聚合物、漂白***、稳定剂、发泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污物悬浮剂、防尘污再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶增溶剂、晦暗抑制剂和香味剂。
在一个相关的方面，提供了衣物洗涤剂添加剂，包含此处所述的变体和下列物质中的一种或多种：表面活性剂、洗涤剂增效剂、络合剂、聚合物、漂白***、稳定剂、发泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污物悬浮剂、防尘污再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶增溶剂、荧光增白剂、织物调节剂和香味剂。
在另一方面，提供了从织物去除淀粉的方法，包括：在亲本AmyTS23α-淀粉酶的变体存在下孵育织物，其中该变体具有与该亲本α-淀粉酶至少80％同一性的氨基酸序列，并包含下列特征中的至少两个：
(a)C-末端的平截，
(b)残基201的取代，或
(c)残基R180和S181的缺失，
其中所述氨基酸残基参照SEQ ID NO：1的氨基酸序列，而且其中该孵育从织物去除了淀粉。
在一个相关方面，提供了加工淀粉的方法，该方法包括在亲本AmyTS23α-淀粉酶的变体存在下孵育织物，其中该变体具有与该亲本α-淀粉酶至少80％同一性的氨基酸序列，并包含下列特征中的至少两个：
(a)C-末端的平截，
(b)残基201的取代，或
(c)残基R180和S181的缺失，
其中所述氨基酸残基参照SEQ ID NO：1的氨基酸序列，而且其中这种孵育水解了该淀粉。
本发明组合物和方法的这些和其他方面和实施方式将由于这里的公开和附图而变得明了。
附图说明
图1示出了亲本AmyTS23α-淀粉酶的氨基酸序列(全长、成熟的；SEQ ID NO：1)。
图2示出了AmyTS23t平截多肽的氨基酸序列(成熟的；SEQ ID NO：2)。黑体和下划线表示的残基表示SEQ ID NO：2位于R180、S181和M201的氨基酸残基。
图3示出了经优化的amyTS23基因的DNA序列(SEQ ID NO：3)。
图4示出了经优化的amyTS23t基因的DNA序列(SEQ ID NO：4)。
图5说明了AmyTS23和AmyTS23t的表达框。
图6是描述使用全长AmyTS23淀粉酶(AmyTS23fl)和OxAm对照进行样品清洁测定的结果的图。
图7是描述使用淀粉酶Amy TS23fl和OxAm对照进行的样品清洁测定结果的图。
图8是描述用淀粉酶AmyTS23t和OxAm对照进行的样品清洁测定结果的图。
图9是描述使用AmyTS23t和OxAm对照进行的样品清洁测定结果的图。
图10是描述在两种不同的衣物洗涤剂中AmyTS23t和AmyTS23tΔRS的经增加的稳定性研究的图。
图11是描述AmyTS23t、AmyTS23tΔRS和AmyTS23t(M201L+ΔRS)的氧化稳定性的图。
图12为描述AmyTS23tΔRS在液体洗涤剂中对稻米淀粉样品的性能的图。
图13是描述作为电荷改变的函数的剩余活性的图。
图14：描述了在本公开中引用的其它氨基酸和核苷酸序列。
具体实施方式
本文公开了涉及杆菌物种TS-23菌株的α-淀粉酶及其变体的组合物和方法。TS-23的变体具有改变的生化特性并在例如洗衣和餐具洗涤剂应用中呈现高性能。下面将详细描述这些变体的这些和其他特征以及使用这些变体的应用。
1.定义和缩写
在本详述中，应用下面的缩写和定义。除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”涵盖对复数形式的提及。因此，例如，提到“酶”时包括多个此类酶，而提到“该制剂”时包括一个或多个制剂以及本领域技术人员已知的其等价物，等等。
除非另有定义，否则此处使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员所通常理解的含义相同。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第二版，John Wiley 和Sons，纽约(1994)和Hale&Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，纽约(1991)为技术人员提供了许多此处使用术语的综合词典。
在某些方面，此处所述组合物和方法依赖于遗传工程和分子生物学领域中使用的常规技术和方法。下列资源包括了用于本发明组合物和方法的一般方法学的描述：Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(第二版，1989)；Kreigler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)和Ausubel等人编辑，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。这些常用参考书提供了本领域公知的定义和方法。但是，此本发明的组合物和方法不应限制于其描述的任何特定的技术、方案和试剂，因为这些都可以改变。虽然与此处描述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料都能够用于实施或者检测此处所公开的组合物和使用方法，但是在此仍然说明了优选的方法和材料。
当描述蛋白质和其编码基因时，通常基因名字是斜体而且没有大写的，而蛋白质名字通常不是斜体而且第一个字母大写。
此处引用的所有专利和公开，包括所有在这些专利和公开中公开的序列都明确地合并于此作为参考。
1.1.定义
如此处所用的术语“淀粉”指包含植物复杂多糖碳水化合物、包含具有通式(C6H10O5)x(其中X可以是任意数)的直链淀粉和支链淀粉的任何材料。该术语特别涉及包括但不限于谷物、草、块茎类和根的任何植物类材料，更具体地，是指小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、糠、木薯、小米、马铃薯、甜马铃薯和木薯淀粉。
此处使用的“淀粉酶”是能够催化淀粉降解的酶。淀粉酶是断裂淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，将α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切开淀粉分子内α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。与此不同，诸如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)等外切淀粉酶和如产麦芽糖(maltogenic)α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)的一些产物特异性淀粉酶从底物的非还原末端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖。此处使用的“淀粉酶”包括任何/所有淀粉酶，包括葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和野生型α-淀粉酶、例如芽孢杆菌属物种(例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)的淀粉酶。
此处使用的“杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶”和相似的短语是指来源于杆菌物种TS-23菌株的α-淀粉酶。编码该α-淀粉酶的基因可以是野生型基因或者编码该α-淀粉酶的密码子优化的多聚核苷酸。杆菌物种TS-23菌株成熟的α-淀粉酶为(氨基至羧基方向)(SEQ ID NO：1；图1)：
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如此处使用的“杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶变体”和相似的短语是指野生型杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶的变体/突变体，包括对杆菌物种TS-23菌株淀粉酶亲本(野生型，参照)氨基酸序列的序列取代、***和/或缺失。术语“变体”可以与术语“突变体”互换使用。杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶变体可包括与亲本信号序列相比在信号序列中的突变。另外，杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶变体可以是包含异源α-淀粉酶信号序列的融合蛋白的形式，例如来自地衣芽孢杆菌的信号序列(LAT)。
此处使用的短语“杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶亲本”“野生型杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶”“杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶参照”和相似的短语，是指杆菌物种TS-23菌株的多肽。为方便起见，该术语可以缩写为“亲本酶”“野生型酶”“亲本多肽”“参照多肽”等等。杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶亲本可包括在亲本多肽信号序列的突变。并且，杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶亲本可以是包含异源α-淀粉酶信号序列(例如来自地衣芽孢杆菌的信号序列，LAT)的融合蛋白。
“亲本核酸/多核苷酸”“野生型核酸/多核苷酸”或“参照核酸/多核苷酸”是指编码所述亲本多肽的核酸序列和与其互补的核酸。
“变体核酸/多核苷酸”是指编码变体多肽的核酸序列或与其互补的核酸，或对于亲本多核苷酸序列具有至少一个碱基的取代、***或缺失的多核苷酸序列或其互补核酸。具体来说，该核酸可包括那些与参照序列具有指定程度同源性，或能够与参照序列杂交的核酸，例如，能够在严紧条件(例如50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH7.0})或高严紧条件(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH7.0})下杂交。变体核酸可以优化为反映对于特定宿主生物优选的密码子的应用，所述宿主生物例如甲基营养酵母(例如毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)等)或丝状真菌(例如木霉菌属(Trichoderma)(例如里氏木霉(T.reesei))等或其他表达宿主(例如杆菌属、链霉菌属(Streptomyces)等。
在涉及细胞、核酸、蛋白质或载体时使用的术语“重组”，是指受试者已经通过引入异源的核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者指的是该细胞源自这样修饰过的细胞。所以，例如重组细胞表达在天然(非重组的)形式的细胞中未发现的基因，或者表达那些否则会异常表达、下调或者完全不表达的天然基因。
此处术语“回收的”、“分开的”和“分离的”用于指从与其天然相关的和天然存在的至少一种其它组分中分离出来的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。
如本文使用的，术语“纯化的”指物质(例如分离的多肽或多核苷酸)处于相对纯的状态，例如至少约90％纯，至少约95％纯，至少约98％纯，或甚至至少约99％纯。
术语“热稳定的”和“热稳定性”指该酶在暴露于升高的温度之后保持活性的能力。酶(例如α-淀粉酶)的热稳定性通过其半衰期(t1/2)测量，半衰期(t1/2)是以分钟、小时或天计算的时间，其间在定义的条件下损失一半酶活性。半衰期通过在暴露于升高的温度(即用升高的温度刺激)后测量残余的α-淀粉酶活性来计算。
“pH范围”指酶呈现催化活性的能力的pH值范围。
此处使用的“pH稳定的”和“pH稳定性”指在预定时间段内酶在宽pH范围下保持活性的能力(例如15分钟、30分钟、1小时等)。
如本文所使用，“氨基酸序列”与术语“多肽”“蛋白质”和“肽”同义，可互换使用。当这样的氨基酸序列呈现活性时，可称作“酶”。此处使用常规的单字母或三字母密码来表示氨基酸残基。
术语“核酸”包括DNA、RNA、异源双链核酸分子和能够编码多肽的合成分子。核酸可以是单链或双链，也可以是其化学修饰形式。此处术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用。因为遗传密码是简并性的，多于一个密码子可以用于编码一个特定的氨基酸，所描述的组合物和方法包括编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。
除非另外说明，核酸分别以5’至3’的方向从左写到右，氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左写到右。
“同源物”应指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定程度同一性的实体。用常规的序列比对工具(例如Clustal，BLAST等)比对，同源序列包括与主题序列具有至少约75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性的氨基酸序列。除非另外说明，通常，同源物包括与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。
如本文所使用，“杂交”是指核酸的一个链与互补链碱基配对的过程，如在点杂交技术和PCR技术中发生的。
如此处所使用的，“合成的”分子是由体外化学或酶促合成制备的，而不是通过生物制备。
如本文所使用，在涉及细胞时的术语“转化的”“稳定转化的”和“转基因的”意思是该细胞具有非天然的(例如异源的)核酸序列，该序列整合到细胞基因组中或者作为在多次传代中保持的游离质粒而被携带。
如本领域已知，在将核酸序列***到细胞中的上下文中，术语“引入”意思是“转染”或“转化”或“转导”。
“宿主株”或“宿主细胞”是其中已经引入了包括编码目的多肽(例如α-淀粉酶变体)的多核苷酸的表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体的生物。示例性的宿主株是细菌细胞。术语宿主细胞包括从细胞(例如杆菌物种细胞)制备的原生质体。
涉及多核苷酸或蛋白质时术语“异源的”指不是天然发生于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
涉及多核苷酸或蛋白质时术语“内源的“指天然发生于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
本文中使用的术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
术语“选择性标记”或“可选择标记”指能够在宿主中表达，使携带该基因的宿主容易选择的基因。选择性标记的实例包括但不限于抗生素(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势的基因，例如营养优势。
“培养”是指在适宜条件下在液体或固体培养基中生长微生物细胞群。培养包括含有颗粒淀粉的淀粉底物发酵生物转化为终产物(通常是在容器或反应器中)。
“发酵”是用微生物酶促和厌氧分解有机底物来产生更简单的有机化合物。虽然在厌氧条件下发生发酵，但是这并不意味着该术语仅仅限于严格厌氧条件，因为在氧存在的情况下也发生发酵。
“基因”是指涉及多肽产生的DNA片段，包括编码区、编码区之前和之后的区域，以及各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
“载体”是指设计了用来将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。
“表达载体”指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，该DNA序列有效连接能够影响其在适宜宿主中表达的适宜控制序列。这样的控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录的可选操纵子序列、编码mRNA上合适核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。
“启动子”是在结合RNA聚合酶以起始基因转录中涉及的调节序列。启动子可以是可诱导的启动子或组成型启动子。一个示例性启动子是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyL)启动子。
“有效连接的”指所述及的组分之间处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系(包括但不限于并列)中。例如，与编码序列有效连接的调节序列是以如下方式实现连接的，即，所述编码序列的表达受到控制序列的调控。
术语“在转录控制下”是指多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录，依赖于其有效连接到的有助于转录起始或促进转录的元件。
术语“在翻译控制下”是指多核苷酸序列(通常是RNA序列)翻译为多肽，依赖于其有效连接到的有助于翻译起始或促进翻译的元件。
“信号序列”是指结合到蛋白质的N末端部分的氨基酸序列，其有助于该蛋白质向细胞外的分泌。成熟形式的细胞外蛋白质缺乏在分泌过程中被切割下来的信号序列。
如本文所使用，“生物学活性”是具有特定生物学活性的序列，例如酶活性。在本发明的淀粉酶的情况下，该活性是α-淀粉酶活性。
“水硬度”是水中存在的矿物(例如钙和镁)的量度。
“糖化”指淀粉向葡萄糖的酶促转化。
“糊化”指通过烹饪形成粘稠悬浮体的淀粉分子的溶解。
“液化”是指其中糊化的淀粉水解为低分子量可溶糊精的淀粉转化阶段。
术语“聚合度(DP)”指已知糖的无水吡喃葡萄糖单元数量。DP1的例子是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合度大于3的聚合物。
对于淀粉转化，术语“终产物”或“目的终产物”指从淀粉底物酶促转化来的具体碳源衍生的分子。
如本文所使用的术语“干固体含量(ds)”指以％干重计，料浆中总固体的百分含量。
术语“料浆”指含有不溶固体的含水混合物。
术语“残余淀粉”指在含淀粉底物发酵或酶促水解之后在组合物中剩余的淀粉(可溶或不可溶)。
如本文使用的“再循环步骤”指醪液成分的再循环，醪液中可包括残余淀粉、酶和/或发酵含有淀粉的底物的微生物。
术语“醪液”指包括可以用于生产发酵产物(例如乙醇)的可发酵碳源(例如碳水化合物)的水性混合物。术语“发酵醪”和“醪液”可互换使用。
术语“釜馏物”指未发酵的固体和水的混合物，其是从发酵的醪液中除去乙醇之后的残留物。
术语“干酒糟(DDG)”和“具有可溶物的干酒糟(DDGS)”指谷物发酵的有用副产物。
如本文使用的“产乙醇微生物”指能够将糖或寡糖转化为乙醇的微生物。产乙醇微生物由于其能够表达一种或多种酶而能够产乙醇，所述酶可单独或一起将糖转化为乙醇。
如本文使用的术语“乙醇生产者”或“产乙醇微生物”指能够从己糖或戊糖产生乙醇的任何生物或细胞。一般来讲，产乙醇细胞含有乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的实例包括真菌微生物，例如酵母菌。优选的酵母菌包括Sacchromyces，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)。
对于淀粉酶及其底物，术语“接触”指将酶放置到足够靠近其底物的位置，以使该酶能够转化底物为终产物。接触可包括混合。
根据上下文，术语“源自”是指术语“起源于”、“基于”“得自”或“可得自”和“分离自”。
术语“酶转化”一般指通过酶(例如淀粉酶)作用的底物(例如淀粉)的修饰。
本文使用的术语“比活性”指在特定条件下每单位时间被酶制品转化为产物的底物的摩尔数。比活性用单位(U)/mg蛋白质表示。
术语“产率”指方法产生的终产物的量，例如表示为浓度、体积、量或起始材料百分比。
“ATCC”指美国标准菌种收藏所，位于维吉尼亚州马纳萨斯20108(ATCC)。
“NRRL”指美国农业研究菌种保藏中心，农业应用研究的国家中心(以前叫USDA，美国农业部北方地区研究实验室)，在伊利诺州皮奥里亚。
数值范围包括定义该范围的数值。
一般，标题是描述性的，而不应理解为限制。
1.2.缩写
除非另外说明，应用下面的缩写：
AE 醇乙氧基化物
AEO 醇乙氧基化物
AEOS 醇乙氧基硫酸盐
AES 醇乙氧基硫酸盐
AFAU 酸性真菌α-淀粉酶单位
AGU 葡糖淀粉酶活性单位
AOS α-烯烃磺酸盐
AS 醇硫酸盐
BAA 解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶
BLA 地衣芽孢杆菌(或LAT)
BSA 牛血清白蛋白
cDNA 互补DNA
CMC 羧甲基纤维素
DNA 脱氧核糖核酸
DP3 三亚基的聚合度
DPn n亚基的聚合度
DTMPA 二亚乙基三胺五乙酸
EC 进行酶分类的酶学委员会
EDTA 乙二胺四乙酸
EO 环氧乙烷
F&HC 织物和家居护理
FAU 真菌淀粉酶单位
GA 葡糖淀粉酶
gpg 每加仑颗粒
HFCS 高果糖玉米糖浆
HFSS 基于高果糖淀粉的糖浆
IPTG 异丙基-β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷
LAS 线性烷基苯磺酸酯
LOM 耐洗牢度试验仪(Launder-O-meter)
LU Liquiphon单位
MW 分子量
MWU 改良的Wohlgemuth单位
NOBS 壬酰基氧基苯磺酸盐
NTA 次氮基三乙酸
PCR 聚合酶链式反应
PEG 聚乙二醇
PVA 聚(乙烯醇)
PVP 聚(乙烯吡咯烷酮)
RNA 核糖核酸
SAS 次级烷烃磺酸盐
TAED 四酰基乙二胺
TCA 三氯乙酸
TSB 胰蛋白酶消化豆胨培养基
UFC 超滤浓缩
w/v 重量/体积
w/w 重量/重量
wt 野生型
1.3命名法
本发明的说明书和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规单字母和三字母密码。为了便于引用，用下列命名法描述本发明的组合物和方法的α-淀粉酶变体：
原始氨基酸：位置：替代氨基酸。
根据这种命名法，例如，在242位置用丙氨酸取代丝氨酸表示为：
Ser242Ala或S242A
30位的丙氨酸缺失表示为：
Ala30*或A30*或ΔA30
另外的氨基酸残基的***，例如赖氨酸的***，表示为：
Ala30AlaLys或A30AK。
连续氨基酸残基片段的缺失，例如氨基酸残基30-33，表示为(30-33)*或Δ(A30-N33)或Δ30-33。连续两个氨基酸的缺失，例如氨基酸残基R180-S181，表示为ΔRS或Δ180-181。
当一个特定的α-淀粉酶与其他α-淀粉酶相比时包含“缺失”，而且在这一位置进行了一个***时，表示为：
用*36Asp或*36D指在36位***天门冬氨酸。
多个突变用加号隔开，即：
用Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S
表示在30和34位分别用丙氨酸和谷氨酸替换天冬酰氨和丝氨酸。
当一个或多个备选氨基酸残基可以***在指定位置时，表示为：
A30N，E；或
A30N或A30E。
并且，当适宜于修饰的位点在此处鉴定出但没有指定的任何特定修饰时，应理解为任何氨基酸残基可以替代此位置的氨基酸残基。因此，例如，当提及位点30处的丙氨酸的修饰但是并未指明时，应理解为丙氨酸可以被缺失或取代为任何其他氨基酸，即下列氨基酸中的任何一个：
R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。
另外，“A30X”指下列替代中的任何一个：
A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y或A30V；
或简写为：A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。
如果用于编号的亲本酶已经含有正在讨论，在其位置建议进行替代的氨基酸残基，当例如N或V之一存在于野生型中的情况下，则用下列命名法：
“X30N”或“X30N，V”。所以，这意味着其他相关的亲本酶在位点30处被替代为“Asn”或“Val”。
1.4氨基酸残基特征
带电荷的氨基酸：
Asp，Glu，Arg，Lys，His
带负电荷的氨基酸(从带负电最多的残基开始排列)：
Asp，Glu
带正电荷的氨基酸(从带正电最多的残基开始排列)：
Arg，Lys，His
中性氨基酸：
Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Met，Cys，Asn，Gln，Ser，Thr，Pro
疏水氨基酸残基(最疏水的残基排在最后)：
Gly，Ala，Val，Pro，Met，Leu，Ile，Tyr，Phe，Trp，
亲水氨基酸(最亲水的残基排在最后)：
Thr，Ser，Cys，Gln，Asn
1.5同源性(同一性)
与另一序列具有一定百分比(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％)序列同一性的多核苷酸或多肽是指，两个序列相比对时，其碱基或氨基酸残基在比较的两条序列中相同的百分比。这种比对和百分比同源性或同一性可以使用本领域已知的任何适宜软件程序来测定，例如记载于CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编辑，1987，增刊30，7.7.18部分)中的那些。优选的程序包括Vector NTI AdvanceTM 9.0(Invitrogen Corp.Carlsbad，CA)、GCG Pileup program，FASTA(Pearson等人(1988)Proc.Natl Acad.Sci USA 85：2444-2448)和BLAST(BLAST Manual，Altschul等人，Natl Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，Md.，和Altschul等人，(1997)NAR.25：3389-3402)。另一个优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software，PA)，其优选使用缺省参数。另一个可用的序列软件程序是TFASTA数据搜索程序，可源自序列软件包6.0版(威斯康辛麦迪逊的威斯康辛大学遗传计算机组)。
同源性可以测定为两个序列间同一性的程度，表明第一序列从第二序列衍生而来。同源性适宜利用本领域已知的计算机程序测定，例如GCG程序包中提供的GAP(如上所述)。因此，可以以缺省计分矩阵鉴定和下列缺省参数使用GAP GCG v8：缺口建立罚分5.0和缺口延伸罚分0.3，分别用于核酸序列比较；缺口建立罚分3.0和缺口延伸罚分0.1分别用于蛋白质序列比较。GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol.48：443-453中描述的方法进行比对和计算同一性。
AmyTS23(SEQ ID NO：1)和例如另一种α-淀粉酶之间的结构性比对可以用于鉴定在其它α-淀粉酶(该α-淀粉酶与AmyTS23具有高度同源性，例如大约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％)中的等同/对应位点。得到这种结构性比对的一种方法是利用来自GCG程序包的Pile Up程序，使用缺口罚分的缺省值，即，缺口建立罚分3.0和缺口延伸罚分0.1。其它结构性比对的方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等人，FEBS Letters.224：第149-155页，1987)和反向线索(Huber，T.和Torda，A.E.，Protein Science.7(1)：第142-149页(1998))。
1.6 杂交
用于表征上述AmyTS23的寡核苷酸探针可适当地基于所研究α-淀粉酶的全长或部分核苷酸或氨基酸序列而制备。
检测杂交的适宜条件包括在5×SSC中预浸润并在40℃的如下溶液中预杂交1小时：20％甲酰胺溶液，5×Denhardt′s溶液，50mM磷酸钠，pH6.8和50mg变性超声处理过的小牛胸腺DNA。然后在补充了100mMATP的相同溶液中在40℃下杂交18小时。然后用如下条件洗涤该滤膜(filter)三次：2×SSC，0.2％SDS，40℃，洗涤30分钟(低严紧条件)；优选在50℃下洗涤(中严紧条件)；更优选在65℃下洗涤(高严紧条件)；进一步优选在75℃下洗涤(非常高严紧条件)。关于杂交方法的更多细节可参见：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989。
在本文中，“源自”不仅仅指α-淀粉酶产自或可产自所讨论的生物的菌株，还指α-淀粉酶编码自该菌株分离的DNA序列，以及由用该DNA序列转化的宿主生物生产。最后，该术语意欲指这样的α-淀粉酶，该α-淀粉酶被合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码，而且具有与所讨论的α-淀粉酶一致的性质。该术语还意欲指亲本α-淀粉酶可以是天然产生的α-淀粉酶的变体，即，变体，其是天然产生的α-淀粉酶的一个或多个氨基酸残基修饰(***、取代、缺失)的结果。
本领域技术人员能够了解，本发明的组合物和方法所涵盖的序列还通过在严紧杂交条件下与示例性的amyTS23序列(例如图4所示SEQ ID NO：4)杂交的能力来限定。当核酸的单链形式能够与另一条核酸在适宜的温度和溶液离子强度条件下复性时，该核酸为能够与另一条核酸序列杂交。杂交和洗涤条件为本领域所公知(参见例如上述Sambrook(1989)，特别是第9和11章)。在一些实施方式中，严紧条件对应于Tm为65℃和0.1×SSC，0.1％SDS。
1.7亲本α-淀粉酶
如上所述，根据本发明，任何AmyTS23α-淀粉酶可以用作亲本(即背景)α-淀粉酶。在优选的实施方式中，亲本α-淀粉酶源自杆菌物种TS-23菌株，例如上面涉及到的之一，例如具有SEQ ID NO：1(见图1)中所示氨基酸序列的TS-23α-淀粉酶。
1.8改变的性质
下面的部分说明了存在于本发明所述变体淀粉酶中的突变体之间的关系，和可能由其产生的理想的性质方面的改变(与亲本TS-23α-淀粉酶相比)。在整个说明书中详细说明了本发明的组合物和方法所涵盖的变体，在下面几段中仅仅进行概括。
如上所述，本发明的组合物和方法一方面涉及源自或可源自杆菌物种TS-23的α-淀粉酶的α-淀粉酶，包括相对于亲本淀粉酶具有改变的性质的变体/突变体。亲本淀粉酶是上述亲本TS-23α-淀粉酶和包括TS-23α-淀粉酶的至少一部分(例如成熟多肽的氨基酸序列)的杂交或嵌合的淀粉酶。
当杆菌物种TS-23α-淀粉酶(SEQ ID NO：1)用作讨论变体淀粉酶的起点时，应理解其他与杆菌物种TS-23α-淀粉酶具有高度同源性的杆菌物种α-淀粉酶可以作为亲本淀粉酶，而不会背离本发明的组合物和方法的范围。特别是对于其他与杆菌物种TS-23α-淀粉酶仅有少许不同而且不包括本发明主题的取代、缺失或***的天然产生的杆菌物种α-淀粉酶，更是如此。
在本发明的组合物和方法的第一方面，提供了亲本杆菌物种菌株α-淀粉酶的变体，其中该变体包括下列改变中的至少两个：
(a)C末端平截；
(b)201位氨基酸的取代(即M201)，以SEQ ID NO：1对氨基酸计数；或
(c)选自由R180，S181，T182和G183组成的组中的至少两个残基的缺失。应注意，氨基酸残基的标号参考SEQ ID NO：1。在一些实施方式中，这种改变包括(a)和(b)。在其他实施方式中，改变包括(a)和(c)。在一些实施方式中，变体可进一步包括在选自由残基87、残基225、残基272和残基282组成的组中的一个或多个残基处的取代。变体淀粉酶优选具有α-淀粉酶活性。除了特别指出的改变，变体淀粉酶的其他剩下的氨基酸序列可具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少85％的氨基酸序列同一性。
在相关的方面，提供了亲本AmyTS23α-淀粉酶的变体，其中该变体具有与亲本α-淀粉酶至少85％同一性的氨基酸序列，并包含C末端的平截。该变体可具有SEQ ID NO：2的序列。该变体与亲本淀粉酶相比可具有提高的在冷水中对淀粉污渍的清洁能力。
在一些实施方式中，包含C末端平截的变体可进一步包括R180和S181位点(参见SEQ ID NO：1的氨基酸序列)残基的缺失。得到的变体可具有比亲本淀粉酶高的洗涤剂稳定性。
在一些实施方式中，包含C末端平截的变体可进一步包括位点201处残基的取代(还是参见SEQ ID NO：1的氨基酸序列)。得到的变体可具有比亲本淀粉酶高的氧化稳定性。
在一些实施方式中，任何上述变体可进一步包括在选自由残基87、残基225、残基272、和残基282组成的组中的一个或多个残基处的取代。
1.8.1稳定性
在本文所述变体的上下文中，对于得到改变的稳定性(即较高或较低)重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括列于“改变的性质”部分的任何突变，该改变的稳定性特别是提高的稳定性，在特定的高温下(即70-120℃)和/或极端pH(即低或高pH值，即分别pH4-6或pH8-11)，特别是低于60ppm的游离(即未结合的，所以在溶液中的)钙浓度。稳定性可以如下面的“方法”部分所述测定。
1.8.2Ca2+稳定性
改变的Ca2+稳定性是指酶在Ca2+减少的条件下的稳定性得到了提高，即，较高或较低的稳定性。当前描述的变体的背景下，对于得到改变的Ca2+稳定性重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括列于“改变的性质”部分的任何突变，该改变的Ca2+稳定性特别是提高的Ca2+稳定性，在特定的高pH(即pH8-10.5)下较高或较低的稳定性。
1.8.3比活性
在进一步的方面，对于得到呈现比活性改变的变体的重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括列于“改变的性质”部分的任何突变，该改变的比活性是指，特别是升高或降低的比活性，特别是10-60℃，优选20-50℃，特别是30-40℃下的比活性。比活性可以如下面的“方法”部分所述测定。
1.8.4氧化稳定性
与亲本α-淀粉酶相比，所述变体也可以具有改变的氧化稳定性，特别是更高的氧化稳定性。例如，在洗涤剂组合物中增加的氧化稳定性是有利的，而在用于淀粉液化的组合物中降低的氧化稳定性是有利的。氧化稳定性可以如下面的“方法”部分所述测定。
改变的pH谱
关于具有pH谱改变的得到的变体的重要位置和突变包括位于活性位点残基附近的氨基酸残基的突变，该改变的pH谱是指，特别是在特别高的pH(即pH8-10.5)或低pH(即pH4-6)下的改善的活性。
优选的具体突变/取代是列于上面“改变的性质”部分中对于讨论的位置的突变/取代。适宜的检测在下面的“方法”部分说明。
1.8.6洗涤性能
对于在特别高pH(即pH8.5-11)具有洗涤性能改善的得到的变体的重要位置和突变包括列于上面“改变的性质”部分中对于讨论的位置的具体突变/取代。洗涤性能可以如下面的“方法”部分所述测定。
2.制备α-淀粉酶变体的方法
因此，本发明一方面提供了产生重组形式的杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶序列，其包括其他以前确定的氨基酸取代、缺失、颠换、***及其组合，以生产杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶的变体。这些变体可具有附加的产量增加、升高的pH稳定性、升高的温度稳定性、降低对Ca2+的需求、增加的比活性、增加的餐具洗涤或洗涤性能、增加的溶解度、增加的储存稳定性或其组合。重组产生变体的方法可以用提供的序列和载体执行，或者用其他本领域已知的方式进行。
本领域已知几种向基因中引入突变的方法。在简单讨论α-淀粉酶编码DNA序列的克隆之后，将讨论在α-淀粉酶编码序列内部的特异性位点产生突变的方法。
2.1编码α-淀粉酶的DNA序列的克隆
编码亲本α-淀粉酶的DNA序列可从任何产生该α-淀粉酶的细胞或微生物中以本领域已知的各种方法分离。首先，应该用产生要研究的α-淀粉酶的生物的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA库。然后，如果已知该α-淀粉酶的氨基酸序列，可以合成同源、标记的寡核苷酸探针，用于从所讨论生物制备的基因组库中鉴定编码α-淀粉酶的克隆。或者，含有与已知α-淀粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针可用作用杂交和低严紧条件下洗涤的方法鉴定编码α-淀粉酶克隆的探针。
鉴定编码α-淀粉酶的克隆的另一种方法涉及将基因组DNA的片段***到表达载体中，例如质粒中，用得到的基因组DNA库转化α-淀粉酶阴性的细菌，将转化的细菌平板接种于含α-淀粉酶底物的琼脂上，从而鉴定表达α-淀粉酶的克隆。
或者，编码该酶的DNA序列可以用已建立的标准方法合成制备，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)描述的亚磷酰胺方法，或Matthes等人(1984)记载的方法。在亚磷酰胺方法中，例如在自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
最后，DNA序列可以是混合了基因组来源和合成来源的，混合了合成来源的和cDNA来源的，或者混合了基因组来源和cDNA来源的，并通过以标准技术连接合成的、基因组的或cDNA来源的(如适用，则为对应于整个DNA序列的各个部分的片段)片段制备。DNA序列也可利用特定的引物通过聚合酶链式反应(PCR)制备，例如美国专利4,683,202或R.K.Saiki等人(1988)中所述。
2.2定点诱变
一旦分离了编码α-淀粉酶的DNA序列，确定了所需突变的位点，可以用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有侧翼于所需突变位点的核苷酸序列；突变核苷酸在寡核苷酸合成过程中***。在一个特定方法中，在带有α-淀粉酶基因的载体中形成桥接α-淀粉酶编码序列的单链DNA缺口。然后带有所需突变的合成核苷酸退火到该单链DNA的同源部位。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)将剩余的缺口补齐，用T4连接酶连接该构建体。这种方法的具体例子描述于Morinaga等人(1984)中。美国专利4,760,025公开了通过进行表达框的微小改变而引入编码多个突变的寡核苷酸的方法。但是，用Morinaga方法可以在任何一段时间引入更大量的突变，因为可以引入具有各种长度的多个寡核苷酸。
向编码α-淀粉酶的DNA序列引入突变的另一个方法记载于Nelson和Long(1989)中。其涉及含有需引入的突变的PCR片段的三步生成法，该突变用化学合成的DNA链作为PCR反应的一个引物来引入突变。从该PCR产生的片段，带有突变的DNA片段可以用限制性内切酶裂解来分离，然后再***到表达质粒中。
提供变体的其他方法包括基因移动(gene shuffling)，例如，如WO95/22625(Affymax Technologies N.V.)或WO 96/00343(Novo Nordisk A/S)所述，或者其他相关的得到包含所讨论突变例如取代和/或缺失的杂交酶的技术。
2.3α-淀粉酶变体的表达
用上述方法或本领域已知的其他方法产生的编码α-淀粉酶变体的DNA序列，可以用来用表达载体表达变体淀粉酶(即酶)，这些表达载体通常包括编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号的调控序列和可选的阻遏基因或各种激活子基因。
带有编码α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何载体，其可以方便地进行重组DNA过程，载体的选择经常取决于其要引入的宿主细胞。所以，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立手染色体的复制，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微染色体或人工染色体。或者，该载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中，并与其整合入的染色体一起复制的载体。
在载体中，DNA序列应有效连接于适当的启动子序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码本发明组合物和方法的α-淀粉酶变体的DNA序列转录(特别是在细菌宿主中)的适宜启动子的实例有：大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、和枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。
表达载体也可包括与编码本发明组合物和方法的α-淀粉酶变体的DNA序列有效连接的适宜转录终止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地源自与启动子相同的来源。
载体还可包括允许载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。该序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
载体也可包括选择标记，例如其产物能在宿主细胞中弥补缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包括曲霉属(Aspergillus)选择标记，例如amdS、argB、niaD和sC(产生潮霉素抗性的标记)，或者可通过共转化实现选择，参见例如，WO 91/17243。
虽然细胞内表达在一些方面可能是有益的，例如当使用某些细菌作为宿主细胞时，但是一般优选细胞外表达。一般，这里提到的杆菌属α-淀粉酶包括允许表达的蛋白酶分泌到培养基中的前区(preregion)。如果需要，可由不同的前区或信号序列代替该前区，其可以通过编码各自前区的DNA序列的取代而方便地实现。
使用的分别连接编码α-淀粉酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和其它元件的操作，和用于将它们***含有复制必需信息的合适载体的操作是本技术领域众所周知的(见，例如，Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版.，Cold Spring Harbor，1989)。
有益地，将包括DNA构建体或表达载体的细胞用作重组生产α-淀粉酶变体的宿主细胞。可用编码该变体的本发明组合物和方法的DNA构建体，通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中而方便地转化细胞。通常认为这一整合是有利的，因为DNA序列更有可能稳定地保持在细胞中。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组实现DNA构建体向宿主染色体的整合。或者，可以用与不同类型的宿主细胞相关的上述表达载体转化细胞。细胞可以是高等生物的细胞，例如哺乳动物或昆虫的细胞，但是优选微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母菌)细胞。
适宜细菌的实例为：革兰氏阳性菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。细菌的转化可以用例如原生质体转化进行，或用感受态细胞以已知的方式进行。
适宜的酵母生物可以选自：酵母属物种(Saccharomyce)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyce)物种，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。丝状真菌可有利地属于曲霉属(Aspergillus)物种，例如米曲霉(Aspergillusoryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)。真菌细胞可以用包括原生质体形成和原生质体转化的方法进行转化，原生质体转化后以已知的方式进行细胞壁的再生。曲霉宿主细胞的转化的适宜方法记载于EP 238 023中。
在又一个方面中，提供了产生α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在有利于变体生产的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基中回收变体。
用于培养细胞的培养基可以是任何适于生长所讨论宿主细胞和获得α-淀粉酶变体表达的常规培养基。适宜的培养基可获自商品供应商或可根据公开的制剂(例如按美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))的目录所述)制备。
可通过公知的方法从培养基中方便地回收分泌自宿主细胞的α-淀粉酶变体，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换层析、亲和层析等的层析方法。
3.工业应用
本发明的α-淀粉酶变体具有可用于多种工业应用的有价值的性质。特别是，该酶变体可用作洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁洗涤剂组合物的成分。
具有改变的性质的一个或多个变体可以用于淀粉加工，特别是淀粉转化，尤其是淀粉的液化(参见，例如美国专利3,912,590、欧洲专利申请252730和63 909，WO 99/19467和WO 96/28567，此处所有的参考文献均通过合并入本文作为参考)。还涉及淀粉转化目的的组合物，其除了本发明组合物和方法的变体，还包括葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和其他α-淀粉酶。
另外，一种或多种变体还可以用于甜味剂和乙醇的生产中(参见例如通过合并入本文作为参考的美国专利5,231,017)，例如从淀粉或整个谷物生产燃料乙醇、饮用乙醇和工业乙醇。
本发明的变体还可以用于纺织品、织物和衣物的退浆(参见例如通过合并入本文作为参考的WO 95/21247、美国专利4,643,736和EP 119,920)；发酵醪生产或酿造；以及纸浆和纸的生产。
3.1淀粉转化
常规的淀粉转化过程，例如液化和糖化过程记载于通过合并入本文作为参考的例如美国专利3,912,590和欧洲专利公开252,730和63,909。
在一个实施方式中，降解淀粉为较低分子量的碳水化合物成分(如糖或脂肪取代物)的淀粉转化过程包括脱支化步骤。
3.2淀粉向糖的转化
在淀粉向糖的转化的情况下，解聚淀粉。这种解聚过程可由预处理步骤和两个或三个连续步骤组成，例如液化步骤、糖化步骤，和取决于目的终点产物的可选的异构化过程。
3.3天然淀粉的预处理
天然淀粉由微观颗粒组成，其在室温下不溶于水。当加热水性淀粉料浆时，颗粒溶胀并最终破裂，向溶液中释放淀粉分子。在此“糊化”过程中，粘度会急剧升高。由于在通常的工业过程中，固体水平是30-40％，因此淀粉不得不薄化或“液化”以使其能够操作。目前这种粘度的降低大部分通过酶促降解来得到。
3.4液化
在液化步骤中，长链淀粉被α-淀粉酶降解成支链和直链的较短单位(麦芽糊精)。液化过程通常在105-110℃进行5-10分钟，然后在95℃，pH值在5.5-6.2之间进行1-2小时。为了在这些条件下保证最优的酶稳定性，加入1mM钙(40ppm游离钙离子)。该处理以后，液化的淀粉会具有10-15的“葡萄糖当量”(DE)。
3.5糖化
液化步骤后，通过添加葡糖淀粉酶(例如OPTIDEX
L-400)和脱支酶(如异淀粉酶(U.S.Pat.No.4,335,208)或支链淀粉酶，将麦芽糊精转换为葡萄糖。在此步骤之前，将pH降至低于4.5的值，维持高温(高于95℃)以使液化α-淀粉酶失活，以降低称作“潘糖前体”的短链寡糖的形成，这种短链寡糖不能被分支酶正确水解。
使温度降至60℃，可以加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化步骤通常进行24-72小时。
通常，当液化步骤后变性α-淀粉酶时，大约0.2-0.5％的糖化产物是分支的三糖，Glc pα1-6Glc pα1-4Glc(潘糖)，其不能被支链淀粉酶降解。如果来自液化步骤的活性淀粉酶在糖化步骤中存在，即没有变性，这种糖的水平可高至1-2％，这是非常不想要的结果，因为这会大大降低糖化作用的产率。
3.6异构化
当所需的最终糖产品是例如高果糖糖浆时，葡萄糖糖浆可以转化为果糖。糖化过程之后，pH升高到6-8范围内，优选pH7.5，通过离子交换除去钙。葡萄糖糖浆然后用例如固定化的葡萄糖异构酶(例如GENSWEET
IGI-HF)转化为高果糖糖浆。
3.7乙醇生产
通常从全谷物生产乙醇可分为如下四个主要步骤：研磨；液化；糖化和发酵。
3.7.1研磨
碾磨谷粒打开其结构，从而允许进一步加工。可以使用的两种碾磨方法是湿磨法或干磨法。在干磨法中，碾磨整个核和在该方法的剩下部分中使用。湿磨法提供胚芽和粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并且，除少数例外外，在平行进行糖浆生产时使用这种方法。
3.7.2液化
在该液化过程中，通过水解将淀粉颗粒溶解为大部分具有高于4的DP的麦芽糊精。水解可以通过酸处理或用α-淀粉酶酶处理进行。酸水解用于有限的基质上。原料可以是研磨的整粒谷物或淀粉加工的侧流(副产物)。
酶促液化通常作为三步热料浆过程进行。料浆加热到60-95℃，优选80-85℃，加入酶。然后在95-140℃，优选105-125℃喷射蒸煮该料浆，冷却至60-95℃，加入更多的酶，得到最终水解。液化过程在pH4.5-6.5下进行，通常在5和6之间的pH下进行。研磨的和液化的谷物也称作醪液。
3.7.3糖化
为了生产可以被酵母菌代谢的低分子糖DP1-3，液化中产生的麦芽糊精必须进一步水解。通常，水解通过酶促进行，通过葡糖淀粉酶，也可使用备选的α-糖苷酶或酸性α-淀粉酶。完全糖化步骤可以持续至多72小时，但是，通常仅仅进行一般40-90分钟的预糖化，然后在发酵中完全糖化(SSF)。通常在30-65℃进行糖化，一般为60℃左右，pH4.5。
3.7.4发酵
通常将来自酵母菌属物种的酵母菌加入到醪液中，发酵24-96小时，例如通常35-60小时。温度在26-34℃之间，通常约32℃，pH为pH3-6，优选约pH4-5。
注意到，广泛应用的方法是同时糖化和发酵(SSF)的方法，其中没有糖化的保持期，意味着酵母菌和酶一起加入。当进行SSF时，通常就在发酵之前在高于50℃的温度下引入预糖化步骤。
3.8蒸馏
发酵之后，蒸馏醪液以提取乙醇。根据该方法得到的乙醇可用作例如燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用中性酒精饮料；或工业乙醇。
3.9副产物
发酵剩下的谷物通常以液体或干燥形式用作动物饲料。
如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的进一步的细节为本领域技术人员所公知。
根据本文所述的方法，糖化和发酵可以同时或分开进行。
3.10纸浆和纸生产
本发明的α-淀粉酶也可用于从淀粉强化的废纸和卡纸板生产木质纤维素材料，例如纸浆、纸和卡纸板，特别是当在7以上的pH下进行再次制浆时，淀粉酶通过该强化淀粉的降解促进了废料的崩解。α-淀粉酶特别用于从淀粉涂层的印刷纸制备造纸纸浆的方法。该方法可以如WO95/14807所述进行，包括下列步骤：
a)分解纸，生产纸浆；
b)在a)步骤之前、过程中或之后用淀粉降解酶处理；和
C)在a)和b)步骤之后从纸浆中分离墨水颗粒。
本文所述的α-淀粉酶也可用于改性淀粉，酶促改性的淀粉与碱性填料如碳酸钙、高岭土和粘土用于造纸中。用本发明组合物和方法的α-淀粉酶，有可能在填料存在下改性淀粉，从而可以得到更简单的整合方法。
3.11纺织品、织物和衣物的退浆
本发明的α-淀粉酶也可以用于纺织品、织物或衣物的退浆。在纺织品加工工业中，α-淀粉酶通常用作退浆过程中的辅剂，以促进含淀粉浆料的去除，该浆料在纺织过程中作为纱线上的保护性涂层起作用。纺织以后的浆料涂层的完全去除对于保证后续过程的最优结果非常重要，后续过程中织物被洗涤、漂白和染色。优选酶促淀粉分解，因为这不会对织物材料造成任何有害效果。为了减少加工成本和增加研磨处理量，退浆过程有时候与洗涤和漂白步骤联合进行。在这种情况下，非酶促助剂，如碱或氧化剂通常用来分解淀粉，因为经典的α-淀粉酶非常不适用于高pH值和漂白剂。淀粉浆料的非酶促分解会导致一些纤维破坏，因为使用了更加具有攻击性的化学品。所以，使用本发明的组合物和方法的α-淀粉酶变体将是理想的，因为它们在碱溶液中具有改善的性能。α-淀粉酶可以单独使用，或当退浆含纤维素的织物或纺织品时与纤维素酶联合使用。
退浆和漂白过程为本领域所公知。例如，该过程记载于WO 95/21247，U.S.Pat.No.4,643,736和EP 119,920中，其通过合并入本文作为参考。用于退浆的市售产品包括Genencor的OPTISIZE
FLEX。
本发明还涉及使用一种或多种杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体处理织物(例如纺织品退浆)的组合物和方法。本领域公知，该酶可用于任何织物处理方法中，参见例如美国专利6,077,316。例如，一方面，用包括将织物与杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体溶液接触的方法改善织物的手感和外观。一方面，在压力下用该溶液处理织物。
一方面，在纺织品纺织过程中或之后，或在退浆阶段，或一个或多个另外的织物加工步骤中使用该酶。在纺织品纺织期间，纺线暴露于相当大的机械张力。在机械织机上纺织之前，经纱通常涂上淀粉或淀粉衍生物浆料，以增加其抗张强度并防止断裂。可以施加这些酶以除去这些淀粉或淀粉衍生物浆料。在纺织品织成之后，织物可以进入退浆阶段。这之后可接着一个或多个其他织物加工步骤。退浆是从纺织品中除去浆料的行为。纺织后必须除去浆料涂层，之后再进一步加工织物，以确保均一和耐洗效果。本文还提供了包括通过杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的作用来酶促水解上述浆料的退浆方法。
该酶可以单独或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起用作为洗涤剂添加剂，在例如水性组合物中，使织物(包括含棉织物)退浆。杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体也可用于在靛蓝染色的粗斜棉布织物和衣服上产生石洗外观的组合物和方法中。为生产衣服，织物可以剪裁并缝纫成衣服或衣物，之后进行整理。特别是，为生产粗斜棉布牛仔服(denim jeans)，已研发了不同的酶促整理方法。粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促退浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于衣服，以使织物柔软，并使该棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。该酶可用于整理粗斜棉布衣服(例如“生物打磨法”(bio-stoning))、酶促退浆及为织物提供柔软度，和/或整理的方法中。淀粉酶的剂量随着方法类型而改变。较小剂量与较大剂量的同样酶相比，会需要更多的时间。然而，退浆淀粉酶存在的量没有上限，除了受溶液的物理约束控制。因此，酶的限度可以是能够溶解于溶液中的量。通常，退浆酶，例如α-淀粉酶，以织物的重量计，以约0.00001％至约2％酶蛋白、约0.0001％至约1％酶蛋白、约0.001％至约0.5％酶蛋白的量加入到处理组合物中，在另一个实施例中，以织物的重量计，可以是约0.01％至约0.2％酶蛋白的量。
3.12发酵醪的生产
此处提供的变体α-淀粉酶也可用于发酵醪生产过程中；α-淀粉酶通常在淀粉糖化过程中加入。
3.13洗涤剂组合物
本文所述的α-淀粉酶变体可以加入并由此成为洗涤剂组合物的成分。
例如，可以将此处提供的洗涤剂组合物配制成手洗或机洗的衣物洗涤剂组合物，包括适于预处理污染的织物的衣物添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制以用于手洗或机洗的餐具洗涤操作。
在一个具体的方面，提供了包括本文所述变体酶的洗涤剂添加剂。该洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物可包含一种或多种其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解的酶(例如另一种α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、CGT酶和/或纤维素酶、甘露聚糖酶(如购自Danisco U.S.A.Inc.，Genencor Division的MANNASTARTM)、果胶酶、胶质裂合酶、角质酶和/或漆酶。
通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(即最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。
蛋白酶：适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性的微生物蛋白酶或胰蛋白酶样的蛋白酶或糜蛋白酶样的蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是来源于杆菌属的枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(记载于例如WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)，和记载于WO 89/06270和WO 94/25583中的镰孢菌属蛋白酶。
有用的蛋白酶的实例还包括但不限于WO98/23732、WO99/20770、WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中记载的变体，特别是具有下列位点中一个或多个取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
示例性可商购的蛋白酶包括ALCALASE
SAVINASE
PRIMASE
DURALASE
ESPERASE
和KANNASE
(购自Novozymes A/S)、MAXATASE
MAXACAL、MAXAPEM
PROPERASEPURAFECT
PURAFECT OXPFN2
FN3
和FN4
(Genencor)。
脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质霉属(Humicola)(与嗜热丝孢菌属(Thermomyces)同义)的脂肪酶，例如来自疏毛腐质霉(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见EP258068和EP 305216)或来自特异腐质霉(H.insolens)(如WO 96/13580所述)；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131：253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。其他可以考虑在制剂中使用的脂肪酶变体示例包括例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些。
一些市售可得的脂肪酶包括LIPOLASETM和LIPOLASE ULTRATM(Novozymes，A/S)
聚酯酶：适宜的聚酯酶可以包含在该组合物中。适宜的聚酯酶包括例如WO 01/34899和WO 01/14629中记载的那些。
淀粉酶：也可包括一种或多种其它淀粉酶(除此处所述的淀粉酶变体之外)。适宜的淀粉酶(α和/或β)包括那些细菌或真菌来源的淀粉酶。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括，例如，来自芽孢杆菌的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更具体描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株。有用的α-淀粉酶的实例是在WO 94/18314、WO 96/39528、WO94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，特别是在下列位点中的一个或多个上有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
市售可得的α-淀粉酶是DURAMYLTM、LIQUEZYMETMTERMAMYLTM、NATALASETM、STAINZYMETM PLUS、STAINZYMETMULTRA、FUNGAMYLTM和BANTM(Novozymes A/S)、RAPIDASETM和PURASTARTM(购自Genencor)。
纤维素酶：可以向组合物中加入纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。适宜的纤维素酶包括但不限于来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、木霉属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如如美国专利No.4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757和WO89/09259公开的自特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。里氏木霉纤维素酶的实例公开于美国专利4,689,297、5,814,501和5,324,649，以及WO 92/06221和WO 92/06165中。示例性芽孢杆菌属纤维素酶公开于美国专利6,562,612中。
市售可得的纤维素酶包括CELLUZYME
和CAREZYME
(Novozymes A/S)，CLAZINASE
和PURADAX HA
(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶：适宜的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括描述于WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中的来自鬼伞属(Coprinus)(例如灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶及其变体。
市售可得的过氧化物酶包括GUARDZYME(Novozymes A/S)。
可通过添加含有一种或多种酶的分开的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合的添加剂而在洗涤剂组合物中包括洗涤剂酶。可以将本发明的组合物和发明中的洗涤剂添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂配成例如颗粒、液体、浆液等。优选洗涤剂添加剂制剂是：颗粒型的，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化的液体；或浆液。
可例如按照美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开来生产无粉尘颗粒，并且可任选地用本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚环氧乙烷产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单酰甘油和二酰甘油及三酰甘油。例如GB 1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。可按照如EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。
通常，洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如棒、片、粉末、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。浓缩洗涤剂凝胶含有例如约30％或更少的水。
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子型，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表面活性剂一般按以重量计0.1％-60％的水平存在。
当包括在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。
当包括在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
洗涤剂可含有0％-65％的洗涤剂增效剂或络合剂(complexing agent)，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物)和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可含有漂白***，这可包括H2O2来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰基氧基苯磺酸盐)联用。或者，漂白***可包括过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白***也可以是酶促漂白***。参见例如WO 05/056782。
可使用常规的稳定剂来稳定本发明组合物和方法中的洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如：多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳族酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)。可按照WO 92/19709和WO 92/19708所述配制所述组合物。
洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、发泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防尘污再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂、水溶增溶剂、晦暗抑制剂或香料。
目前认为在洗涤剂组合物中，尤其是杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体可以按相当于每升洗液约0.01至约100mg酶蛋白质(例如每升洗液约0.05至约5.0mg酶蛋白质，或每升洗液约0.1至约1.0mg酶蛋白质)的量加入。
本文所记载的变体酶的一种或多种可另外加入到WO 97/07202所公开的洗涤剂制剂中，WO 97/07202通过引用而合并于此。
4.组合物和用途
本文所述的一种或多种变体酶也可以用于在洗涤剂(特别是衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物)、硬表面清洁组合物中、使用α-淀粉酶的方法中，用于织物、纺织品或衣物退浆组合物中，用于生产纸浆和纸、发酵醪生产、乙醇生产和如上所述的淀粉转化过程中。
4.1衣物洗涤剂组合物和用途
根据该实施方式，通常一种或多种杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体可为衣物洗涤剂组合物的组分。如此，其可以以无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式包括在洗涤剂组合物中。干燥的制剂可以是颗粒或微颗粒的形式。可以例如，按美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地由本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均摩尔质量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单酰甘油和二酰甘油及三酰甘油。例如英国专利1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。其他酶稳定剂是本领域公知的。可按照例如欧洲申请No.238,216公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，和用于提高蛋白质的溶解性。参见，例如J.K.Kaushik等人，“Why is trehalose an exceptional protein stabilizer？An analysis of the thermal stability of proteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose，”J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)和其中引用的参考文献；以及Monica Conti等人，“Capillary isoelectric focusing：the problem of protein solubility，”J.Chromatography 757：237-245(1997)。
该组合物可包括杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。备选地，该组合物可包括多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶，以及下述其他酶。其他酶可通过属于如下属的微生物生产：曲霉属、木霉属、腐质酶属(例如特异腐质霉(H.insolens))和镰孢菌(霉)属(Fusarium)。曲霉属的示例性成员包括棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)。镰孢霉属的示例性成员包括杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundinis)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或Fusarium venenatum。
洗涤剂组合物可以是任何有用的形式，例如粉末、颗粒、糊状或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有至多约70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。还可以是仅仅包含大约30％水的浓缩凝胶形式的洗涤剂组合物。酶可以用于与酶的稳定性相容的任何洗涤剂组合物中。通常可以用已知的包囊化形式(例如通过造粒或隔离在水凝胶中)来保护酶免于遭遇有害组分。酶和尤其是α-淀粉酶不局限于洗衣和餐具洗涤应用，还可以用于表面清洁剂以及用于由淀粉或生物质生产乙醇。
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂将通常包含0％至约50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸或皂。组合物也可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。
洗涤剂组合物可另外包括一种或多种其他酶，例如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、和/或漆酶的任何组合。如上所述。
洗涤剂可任选地含有约1％至约65％的洗涤剂增效剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸酯、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是无增效剂的，即基本上不合洗涤剂增效剂。
洗涤剂可任选地包括一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可任选地含有漂白***，可包括H2O2来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂(如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS))联用。或者，漂白***可包括过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白***也可以是酶促漂白***，其中过水解酶(perhydrolase)活化过氧化物，例如WO 2005/056783中所述的那些。
可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如：多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳族酯)。可按照WO 92/19709和WO 92/19708所述配制所述组合物。
洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、发泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防尘污再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂或香料。
pH(在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。
包含杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的洗涤剂组合物可配制成的具体形式包括：
1)具有体积密度(bulk density)为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约2％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约15％至约22％的沸石(例如NaAlSiO4)；0％至约6％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。
2)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约24％至约34％的沸石(例如NaAlSiO4)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
3)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如C16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na2CO3)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约23％至约33％的沸石(如NaAlSiO4)；0％至约4％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的磷酸酯(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
4)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na2CO3)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约25％至约35％的沸石(例如NaAlSiO4)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
5)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的磷酸酯；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
6)水性结构型液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO4)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG，PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(anchoring polymer)(例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0％至5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
7)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约20％至约40％的沸石(例如NaAlSiO4)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如荧光增白剂，抑泡剂、香料)。
8)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约14％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2)；约30％至约50％的沸石(例如NaAlSiO4)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
9)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约18％至约32％的沸石(例如，NaAlSiO4)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如，荧光增白剂、香料)。
10)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约23％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的水溶增溶剂(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
11)水性液体洗涤剂组合物，包括约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如水溶增溶剂、分散剂、香料、荧光增白剂)。
12)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；0％至约5％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约15％至约28％的沸石(NaAlSiO4)；0％至约20％的过硼酸钠(例如NaBO3·4H2O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0至3％的次要成分(例如香料、荧光增白剂)。
13)如上面组合物1)-12)所述的洗涤剂组合物，其中所有或者部分的线性烷基苯磺酸盐被(C12-C18)烷基硫酸盐代替。
14)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如NaAlSiO4)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如Na2CO3)；0％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。
15)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na2CO3)；0％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至3％的次要成分(例如荧光增白剂、磷酸盐、香料)。
(16)上面1)-15)所述的洗涤剂制剂，其含有被稳定化的或囊化的过酸作为额外组分或者作为已经述及的漂白***的替代物。
17)上面1)、3)、7)、9)和12)所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。
18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的洗涤剂组合物，还含有锰催化剂。例如锰催化剂是“Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching”，Nature 369：637-639(1994)中记载的化合物中的一种。
19)配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，包括液态非离子表面活性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、增效剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂也可包括阴离子表面活性剂和/或漂白***。
可以以常规用于洗涤剂中的浓度加入杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体。目前考虑在洗涤剂组合物中，可以以每升洗液对应0.00001-1.0mg(以纯酶蛋白质计算)酶的量加入杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体。
在另一个实施方案中，可将2，6-β-D-果聚糖水解酶掺入洗涤剂组合物中并用于家居和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜的去除/清洁。
例如，可以将洗涤剂组合物配制成手洗或机洗的衣物洗涤剂组合物，包括适于预处理污染的织物的衣物添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制以用于手洗或机洗的衣物洗涤操作。
一个具体的方面，洗涤剂组合物可以进一步包括2，6-β-D-果聚糖水解酶，除杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体之外的一种或多种α-淀粉酶，和一种或多种其它清洁酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、***聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。
通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。
4.2餐具洗涤剂组合物
本发明的α-淀粉酶也可用于餐具洗涤剂组合物中，包括下列例子：
1)粉末状自动餐具洗涤组合物
非离子表面活性剂 0.4-2.5％
硅酸钠 0-20％
二硅酸钠 3-20％
三磷酸钠 20-40％
碳酸钠 0-20％
过硼酸钠 2-9％
四乙酰基乙二胺(TAED) 1-4％
硫酸钠 5-33％
酶 0.0001-0.1％
2)粉末状自动餐具洗涤组合物
非离子表面活性剂 1-2％
(例如醇乙氧基化物)
二硅酸钠 2-30％
碳酸钠 10-50％
磷酸钠 0-5％
二水合柠檬酸三钠 9-30％
醋酸次氮基三钠(NTA) 0-20％
一水合过硼酸钠 5-10％
四乙酰基乙二胺(TAED) 1-2％
聚丙烯酸酯聚合物 6-25％
(例如马来酸/丙烯酸共聚物)
酶 0.0001-0.1％
香料 0.1-0.5％
水 5-10％
3)粉末状自动餐具洗涤组合物
非离子表面活性剂 0.5-2.0％
二硅酸钠 25-40％
柠檬酸钠 30-55％
碳酸钠 0-29％
碳酸氢钠 0-20％
一水合过硼酸钠 0-15％
四乙酰基乙二胺(TAED) 0-6％
马来酸/丙烯酸共聚物 0-5％
粘土 1-3％
聚氨基酸 0-20％
聚丙烯酸钠 0-8％
酶 0.0001-0.1％
4)粉末状自动餐具洗涤组合物
非离子表面活性剂 1-2％
沸石MAP 15-42％
二硅酸钠 30-34％
柠檬酸钠 0-12％
碳酸钠 0-20％
一水合过硼酸钠 7-15％
四乙酰基乙烯 0-3％
联胺(TAED)聚合物 0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物 0-5％
有机磷酸酯 0-4％
粘土 1-2％
酶 0.0001-0.1％
硫酸钠 余量
5)粉末状自动餐具洗涤组合物
非离子表面活性剂 1-7％
二硅酸钠 18-30％
柠檬酸三钠 10-24％
碳酸钠 12-20％
单过硫酸盐 15-21％
(2KHSO5.KHSO4.K2SO4)
漂白稳定剂 0.1-2％
马来酸/丙烯酸共聚物 0-6％
二亚乙基三胺五乙酸盐 0-2.5％
五钠盐
酶 0.0001-0.1％
硫酸钠，水 余量
6)具有清洁表面活性剂***的粉末和液体餐具洗涤组合物
非离子表面活性剂 0-1.5％
十八烷基二甲胺N-氧化二水合物 0-5％
十八烷基二甲胺N-氧化二水合物和
十六烷基二甲胺N-氧化二水合物的
80∶20wt.C18/C16共混物 0-4％
十八烷基二(羟乙基)胺N-氧化无水合物
与十六烷基二(羟乙基)胺N-氧化无水合物的
70∶30wt.C18/C16共混物 0-5％
平均乙氧基化度为3的C13-C15烷基乙氧基硫酸酯 0-10％
平均乙氧基化度为3的C12-C15烷基乙氧基硫酸酯 0-5％
平均乙氧基化度为12的C13-C15乙氧基化醇 0-5％
平均乙氧基化度为9的C12-C15乙氧基化醇共混物 0-6.5％
平均乙氧基化度为30的C13-C15乙氧基化醇共混物 0-4％
二硅酸钠 0-33％
三聚磷酸钠 0-46％
柠檬酸钠 0-28％
柠檬酸 0-29％
碳酸钠 0-20％
一水合过硼酸钠 0-11.5％
四乙酰基乙二胺(TAED) 0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物 0-7.5％
硫酸钠 0-12.5％
酶 0.0001-0.1％
7)非水性液体自动餐具洗涤组合物
液体非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物) 2.0-10.0％
碱金属硅酸盐 3.0-15.0％
碱金属磷酸盐 20.0-40.0％
选自高级乙二醇、聚乙二醇、多氧化物、 25.0-45.0％
乙二醇醚的液体载体
稳定剂(例如磷酸和C16-C18链烷醇的偏酯) 0.5-7.0％
抑泡剂(例如硅酮) 0-1.5％
酶 0.0001-0.1％
8)非水性液体餐具洗涤组合物
液体非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物) 2.0-10.0％
硅酸钠 3.0-15.0％
碱金属碳酸盐 7.0-20.0％
柠檬酸钠 0.0-1.5％
稳定化***(例如细分的硅酮和低分子量
二烷基聚乙二醇醚的混合物) 0.5-7.0％
低分子量聚丙烯酸酯聚合物 5.0-15.0％
粘土凝胶增稠剂(如膨润土) 0.0-10.0％
羟丙基纤维素聚合物 0.0-0.6％
酶 0.0001-0.1％
选自高级乙二醇、聚乙二醇、多氧化物、
乙二醇醚的液体载体 余量
9)触变性液体自动餐具洗涤组合物
C12-C14脂肪酸 0-0.5％
嵌段的共聚物表面活性剂 1.5-15.0％
柠檬酸钠 0-12％
三聚磷酸钠 0-15％
碳酸钠 0-8％
三硬酯酸铝 0-0.1％
枯烯磺酸钠 0-1.7％
聚丙烯酸酯增稠剂 1.32-2.5％
聚丙烯酸钠 2.4-6.0％
硼酸 0-4.0％
甲酸钠 0-0.45％
甲酸钙 0-0.2％
正癸基联苯氧化物二磺酸钠 0-4.0％
单乙醇胺(MEA) 0-1.86％
氢氧化钠(50％) 1.9-9.3％
1，2-丙二醇 0-9.4％
酶 0.0001-0.1％
抑泡剂、染料、香料、水 余量
10)液体自动餐具洗涤组合物
醇乙氧基化物 0-20％
脂肪酸酯磺酸酯 0-30％
十二烷基硫酸钠 0-20％
烷基聚糖苷 0-21％
油酸 0-10％
二硅酸钠一水合物 18-33％
柠檬酸钠二水合物 18-33％
硬脂酸钠 0-2.5％
一水合过硼酸钠 0-13％
四乙酰基乙二胺(TAED) 0-8％
马来酸/丙烯酸共聚物 4-8％
酶 0.0001-0.1％
11)含有保护的漂白颗粒的液体自动餐具洗涤组合物
硅酸钠 5-10％
焦磷酸四钾 15-25％
三磷酸钠 0-2％
碳酸钾 4-8％
保护的漂白颗粒，例如氯 5-10％
聚合物增稠剂 0.7-1.5％
氢氧化钾 0-2％
酶 0.0001-0.1％
水 余量
11)上面1)、2)、3)、4)、6)和10)所述的自动餐具洗涤组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。
12)上述1)-6)的自动餐具洗涤组合物，进一步包含锰催化剂。该锰催化剂可以是例如“Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching，”Nature 369，1994，pp：637-639中记载的化合物中的一种。
4.3生物膜去除组合物和用途
用于除去生物膜的组合物可包括杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体作为主要酶成分，例如单组分组合物。或者，该组合物可以包括多种酶活性，例如多种淀粉酶，或者包括下列酶任意组合的酶混合物：氨肽酶、淀粉酶(β-或α-或葡糖淀粉酶)、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶，或其任意组合，用于去除生物膜。其他酶可通过属于如下属的微生物生产：曲霉属、木霉属、腐质酶属(例如特异腐质霉)和镰孢菌(霉)属。曲霉的示例性实例包括棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉。镰孢霉属的实例包括杆孢状镰孢、F.cerealis、F.crookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、F.toruloseum、拟丝孢镰孢和Fusarium venenatum。
包括杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的组合物可以按照本领域已知的方法制备，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，含杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的组合物可以是颗粒或微颗粒的形式。欲包括在组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法稳定化。
下文给出了多肽组合物用途的实例。含杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的组合物的用量及组合物使用的其他条件可以基于本领域已知的方法来确定。
还考虑杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体与2，6-β-D-果聚糖水解酶或其变体一起用在组合物中。
另一方面是瓦解和/或去除生物膜的组合物和方法。如本文所用的术语“瓦解”应理解为水解生物膜基质中的多糖(该多糖在生物膜中将个体微生物细胞连接并结合在一起)，由此所述微生物细胞能够从生物膜中释放并除去。生物膜通常存在于表面，故生物膜的瓦解可以通过用含有杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体或一种或多种其他负责降解生物膜的酶(例如但不限于2，6-β-D-果聚糖水解酶)的水性介质接触表面(例如通过浸没、覆盖或喷洒表面)而实现。组合物可用于水解例如纸浆业和纸业白水中的淀渣。
杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的存在量可以是0.0001-10,000mg/L、0.001-1000mg/L、0.01-100mg/L、或是0.1-10mg/L。其他酶及酶变体可以以相似或更低的量存在。
该方法可以适宜地在室温至约70℃的温度进行。适宜的温度范围包括约30℃至约60℃，例如约40℃至约50℃。
用于水解生物膜的适宜pH处在约3.5至约8.5的范围内。示例性pH范围包括pH约5.5至约8，例如约6.5至约7.5。用于酶有效去除生物膜的接触时间或反应时间可以变化相当大，这取决于生物膜的特性以及用酶单独或组合其他生物膜降解酶(如2，6-β-D-果聚糖水解酶)处理表面的频率。示例性的反应时间可包括约0.25至约25小时内，以及约1至约10小时，例如约2小时。
可与杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体和2，6-β-D-果聚糖水解酶组合的其他生物膜降解酶包括但不限于：纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、其他淀粉酶，包括其他α-淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶。
杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体还可以与抗微生物剂组合，例如酶的或非酶的杀生物剂。酶杀生物剂可以是例如包括氧化还原酶，例如漆酶或过氧化物酶，特别是卤代过氧化物酶，和任选的增强剂，例如丁香酸烷基酯的组合物，例如国际PCT申请WO 97/42825和DK 97/1273中所描述的那样。
可以去除和/或清除生物膜的表面可以是硬表面，其定义涉及基本上微生物不能透过的任何表面。表面的实例是由金属例如不锈钢合金、塑料/合成聚合物、橡胶、板材、玻璃、木材、纸、纺织品、混凝土、岩石、大理石、石膏及陶瓷材料制成的表面，其任选地以例如油漆、珐琅、聚合物等包覆。从而，表面可以是支持、运输、处理或接触水性溶液的***(如供水***、食品处理***、冷却***、化学处理***或药物处理***)的构件。该组合物和使用该组合物的方法用于木材加工***(如制浆和/或造纸工业)中除去生物膜。因此，酶和含有酶的组合物可用于常规的就地清洗(C-I-P)***。表面可以是***单元(如管道、罐、泵、膜、滤器、热交换器、离心机、蒸发器、混合器、喷雾塔、阀门和反应器)的一部分。表面也可以是医学科学和工业所用的器具(如污染的内窥镜、假体装置或医学内植物)或其部分。
用于生物膜去除的组合物也可以考虑用于防止当金属表面例如管道受微生物生物膜攻击时发生的所谓生物腐蚀，即通过瓦解生物膜，由此防止生物膜中的微生物细胞建立起腐蚀其所附着的金属表面的生物膜环境。
抗生物膜组合物的其他应用包含口腔护理。然而表面也可以是生物来源的，例如粘膜、皮肤、牙齿、头发、指甲等。
因此表面包含具有牙菌斑的牙齿(例如通过将酶加入到牙膏中)和污染的隐形眼镜。因此，杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体可用在组合物中和用于制备瓦解人或动物牙齿菌斑的药物的方法中。另一用途是自粘膜瓦解生物膜，例如患有囊性纤维化的患者肺中的生物膜。
因此，本发明进一步的方面涉及口腔护理组合物，包含重组的酶，例如基本不含任何活性污染物的纯化的酶。口腔护理组合物可适当包含一定量的重组酶。
用于口腔护理组合物的其他生物膜降解酶包括但不限于口腔护理组合物中的2，6-β-D-果聚糖水解酶活性。考虑的酶活性包括下组酶中的活性：葡聚糖酶；齿斑葡聚糖酶(mutanase)；氧化酶，例如葡糖氧化酶，L-氨基酸氧化酶，过氧化物酶，例如WO 95/10602中所述的鬼伞属物种(Coprinus)过氧化物酶或乳过氧化物酶，卤代过氧化物酶，特别是衍生自弯孢霉属物种(Curvularia)、特别是糙壁弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis)的卤代过氧化物酶；漆酶；蛋白酶例如木瓜蛋白酶，酸性蛋白酶(例如WO95/02044中所述的酸性蛋白酶)，内切糖苷酶，脂肪酶，淀粉酶，包括淀粉葡糖苷酶，如AMG(Novo Nordisk A/S)；抗微生物酶，以及它们的混合物。
口腔护理组合物可以具有任何适宜的物理形式(即，粉末、糊、凝胶、液体、膏、片等)。“口腔护理组合物”包括可用于维持或改善人和动物口中口腔卫生的组合物，预防龋齿、预防牙菌斑和牙垢形成、去除牙菌斑和牙垢、预防和/或治疗牙科疾病等。口腔护理组合物在本文中至少也包括用于清洁假牙、人工牙齿等的产品。口腔护理组合物的实例包括牙膏、牙霜、凝胶或牙粉、漱牙漱口水、刷牙前后的漱洗制剂、口香糖、锭剂和糖果。牙膏和牙凝胶一般包括磨擦抛光材料、发泡剂、矫味剂、保湿剂、粘合剂、增稠剂、甜味剂、增白剂/漂白剂/去渍剂、水和任选的另外的酶和酶组合。
漱口水，包括菌斑去除液体，一般包括水/醇溶液、香料、保湿剂、增甜剂、发泡剂、着色剂和任选的另外的酶或酶组合。
磨擦抛光材料也可以掺入到口腔护理组合物例如牙粉中。
从而，磨擦抛光材料可以包括氧化铝及其水合物，例如三水合α-氧化铝(αalumina trihydrate)；三硅酸镁；碳酸镁；高岭土；铝硅酸盐，例如煅烧硅酸铝和硅酸铝；碳酸钙；硅酸锆；还有粉状塑料，例如聚氯乙烯；聚酰胺；聚甲基丙烯酸甲酯；聚苯乙烯；苯酚甲醛树脂；蜜胺甲醛树脂；脲甲醛树脂；环氧树脂；粉状聚乙烯；氧化硅干凝胶；水凝胶和气凝胶等。同样适合作为磨料的有焦磷酸钙；水不溶性碱性偏磷酸盐；磷酸二钙和/或其二水合物，正磷酸二钙；磷酸三钙；羟基磷灰石颗粒等。还可以采用这些物质的混合物。
根据口腔护理组合物的不同，磨擦产品可以以重量计约0％至约70％，或约1％至约70％存在。对于牙膏，磨料含量一般处于以最终牙膏重量计10％-70％的范围内。
采用保湿剂以防止例如牙膏的水分流失。适合用于口腔护理组合物的保湿剂包括如下化合物及其混合物：甘油；多元醇；山梨糖醇；聚乙二醇(PEG)；丙二醇；1，3-丙二醇；1，4-丁二醇；氢化的部分水解多糖等。保湿剂一般以重量计0％至约80％，或约5％至约70％存在于牙膏中。
二氧化硅、淀粉、黄芪胶、黄原胶、爱尔兰苔(Irish moss)提取物、藻酸盐、果胶、纤维素衍生物如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素钠；聚丙烯酸及其盐、聚乙烯吡咯烷酮是帮助稳定牙粉产品的适合的增稠剂和粘合剂的实例。增稠剂在牙膏乳剂和凝胶中的存在量可以是以终产品重量计约0.1％至约20％，而粘合剂达到约0.01至约10％的程度。
可以使用阴离子、阳离子、非离子、兼性和/或两性离子表面活性剂作为发泡剂皂。这些可以以终产品重量计0％至约15％、约0.1至约13％或约0.25％至约10％的水平存在。
表面活性剂仅在其不对本发明的杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体施加失活效应的程度上是适宜的。表面活性剂包括脂肪醇硫酸盐，磺化单酰甘油或具10-20个碳原子的脂肪酸的盐，脂肪酸-清蛋白缩合产物，脂肪酸酰胺和牛磺酸的盐和/或脂肪酸羟乙基磺酸酯的盐。
适宜的增甜剂包括制剂用糖精。
香料例如留兰香通常以低含量存在，例如以重量计约0.01％至约5％，尤其是约0.1％至约5％。增白剂/漂白剂包括H2O2，且可以以终产品重量计低于约5％，或约0.25％至约4％的量添加。增白剂/漂白剂可以是酶，例如氧化还原酶。适宜的牙齿漂白酶的实例为例如WO 97/06775中描述的那些。
水通常以赋予例如牙膏可流动形式的量添加。
也可以包括其它水溶性抗菌剂，例如二葡萄糖酸氯己定，氨己嘧啶(hexetidine)，双胍啶(alexidine)，三氯生(Triclosan
)，季铵抗菌化合物，以及水溶性的某些金属离子源，例如锌、铜、银和锡源(例如，氯化锌、氯化铜和氯化亚锡，以及硝酸银)。
也可以加入能够用作为氟化物源、色素/着色剂、防腐剂、维生素、pH调节剂、防龋剂、脱敏剂等的化合物。
当生物膜降解酶用于清洁口腔时可提供若干益处。蛋白酶降解唾液蛋白质，这些蛋白质吸附在牙齿表面并形成薄膜(pellicle)，即所致菌斑的第一层。蛋白酶连同脂肪酶一起通过裂解构成细菌细胞壁和膜的结构组分的蛋白质和脂质而破坏细菌。
葡聚糖酶及其他糖酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶降解细菌所产生的形成细菌粘附基质的有机主链结构。蛋白酶和淀粉酶不仅防止牙菌斑形成，而且还可以通过降解结合钙的糖-蛋白质复合物防止矿化，从而阻止牙垢发展。
牙膏一般可以包括如下成分(以最终牙膏组合物的重量百分比计)：磨料至约70％；保湿剂：0％至约80％；增稠剂：约0.1％至约20％；粘合剂：约0.01％至约10％；增甜剂：约0.1％至约5％；发泡剂：0％至约15％；增白剂：0％至约5％；和酶：约0.0001％至约20％。
在一个具体实施方式中，牙膏具有在约6.0至约8.0范围内的pH，且包括：a)约10％至约70％的磨料；b)0％至约80％的保湿剂；c)0.1％至约20％的增稠剂；d)0.01％至约10％的粘合剂；e)约0.1％至约5％的增甜剂；f)0％至约15％的发泡剂；g)0％至约5％的增白剂和i)约0.0001％至约20％的酶。
i)中涉及的所述酶包括杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体，单独或组合其他生物膜降解酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶，和任选地已知用于牙膏中的上述其他类型的酶等。
漱口剂一般可以包括如下成分(以最终漱口剂组合物的重量百分比计)：0％至约20％的保湿剂；0％至约2％的表面活性剂；0％至约5％的酶；0％至约20％的乙醇；0％至约2％的其他成分(例如香料，增甜剂活性成分，如氟化物)。组合物还可以含有约0％至约70％的水。
漱口剂组合物可以用适当的缓冲剂进行缓冲，例如pH约6.0至约7.5的柠檬酸钠或磷酸钠。漱口剂可以是非稀释的形式(即，用前必须稀释)。
口腔护理组合物可以利用任何口腔护理领域已知的常规方法来生产。
4.4淀粉加工组合物和用途
另一方面，具有所公开的杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的组合物可用于淀粉液化或糖化。
一方面，涉及组合物和组合物在用淀粉制备增甜剂中的用途。将淀粉转换为果糖糖浆的传统方法通常包括三个连续的酶促步骤：液化步骤，糖化步骤以及异构化步骤。在液化步骤中，在约5.5至约6.2的pH值、约95℃至约160℃的温度，通过为期约2个小时的杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体作用，使淀粉降解为糊精。为了在这些条件下保证最优的酶稳定性，加入1mM钙(40ppm游离钙离子)。淀粉加工用于生产醇(例如谷物液化为燃料或可饮用的醇、醇的酿造)，淀粉液化可用于增甜剂生产、蔗糖加工和其他食品相关的淀粉加工目的。其他条件可用于不同的杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体。
液化步骤后，可以通过添加葡糖淀粉酶(例如AMGTM)和脱支酶(如异淀粉酶或支链淀粉酶(例如PROMOZYME
))，将糊精转换为右旋糖。在此步骤之前，将pH降至低于约4.5的值，维持高温(高于95℃)，并使液化杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的活性变性。使温度降至60℃，可以加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化步骤通常进行约24至约72小时。
糖化步骤之后，将pH升至处于约6.0至约8.0范围的值(例如pH7.5)，并通过离子交换除去钙。然后利用例如固定化的葡萄糖异构酶(如Sweetzyme
)将葡萄糖浆转化为高果糖糖浆。
可以完成该过程中至少一种酶的改良。杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体具有液化中降低的钙需求。游离的钙的加入是充分确保杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的高稳定性所需的；但是游离的钙强烈抑制葡萄糖异构酶的活性，并且需要利用昂贵的单元操作除去钙，达到游离钙的水平降至低于3-5ppm的程度。如果能够避免这样的操作，且液化步骤无需添加游离钙离子即能进行，则可以获得费用的节约。
例如，可在组合物和操作中利用钙依赖性较小的酶，其在低浓度游离钙(＜40ppm)时稳定且具有高活性。这样的杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体应当具有位于pH范围约4.5至约6.5中，或者在范围约4.5至约5.5中的最适pH。
在实验室中和工业设置中，杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体可用于水解用于各种目的的淀粉或任何含麦芽糊精(maltodextrine)的化合物。这些杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体可单独使用以提供特异性水解，或者与其他淀粉酶组合提供具有广谱活性的混合物。示例性应用包括从生物样品、食品、动物饲料、药物或工业样品中除去或部分或完全水解淀粉或任何含麦芽糊精的化合物。
本发明另一方面涉及在发酵过程中的组合物和使用该组合物的方法，其中淀粉底物在杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体存在下液化和/或糖化，以产生葡萄糖和/或麦芽糖，其适于由发酵微生物如酵母菌转化为发酵产物。这样的发酵过程包括生成用作燃料的乙醇或饮用乙醇(可饮用乙醇)的过程，生产饮料的过程、生产所需有机化合物(例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸δ-内酯或异抗坏血酸钠)、酮类、氨基酸(如谷氨酸、谷氨酸单钠)、以及难以合成制备的更复杂的化合物(例如青霉素、四环素等抗生素)、酶、维生素(例如核黄素、维生素B12、β-胡萝卜素)和激素)的过程。
待加工的淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯。或者，淀粉可以是较为粗制的含淀粉材料，其含有碾磨过的整个谷粒，包括非淀粉级分如胚残留物和纤维。碾磨原料如整个谷粒以打开其结构，从而允许进一步加工。可以使用两种碾磨方法：湿磨法和干磨法。此外，可以使用玉米渣如碾磨过的玉米渣。
干磨的谷粒除淀粉外还将包含显著量的非淀粉糖类化合物。当通过喷射蒸煮加工这样的异质原料时，杆菌物种TS-23菌株往往仅能实现淀粉的部分糊化。由于杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体对未糊化的淀粉具有高活性，该酶应用在包括液化和/或糖化喷射蒸煮的干磨淀粉的方法中具有优势。
并且，由于杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的优良水解活性，糖化步骤中对葡糖淀粉酶的需求也得到了极大降低。这使得糖化可以在非常低水平的葡糖淀粉酶活性下进行。葡糖淀粉酶或者不存在，或者如果存在的话，以不超过或甚至低于0.5AGU/gDS、或不超过或甚至低于0.4AGU/gDS、或不超过或甚至低于约0.3AGU/g DS、或者低于0.1AGU，例如不超过或甚至低于0.05AGU/g DS淀粉底物的量存在。“DS”是加入每克干固形底物的酶单位。酶蛋白以mg表示，具有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者以不超过或甚至低于约0.5mg EP/g DS，或者不超过或甚至低于约0.4mg EP/g DS，或者不超过或甚至低于约0.3mg EP/g DS，或者不超过或甚至低于约0.1mg EP/g DS(例如不超过或甚至低于约0.05mg EP/g DS或者不超过或甚至低于0.02mg EP/g DS的淀粉底物)的量存在。葡糖淀粉酶可以源自曲霉属物种、篮状菌属物种(Talaromyces sp.)、大纹饰孢属物种(Pachykytospora sp.)或栓菌属物种(Trametes sp.)的菌株，其中示例性的实例为黑曲霉(Aspergillus niger)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、瓣环栓菌(Trametes cingulata)或纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)。
该方法可包括a)将淀粉底物与杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体接触，其包含具有α-淀粉酶活性的催化模块和糖结合模块，例如第一方面中所述的多肽；b)将所述淀粉底物与所述酶在一定温度下孵育一段时间，在此条件下足以将至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至至少99.5％w/w的所述淀粉底物转化为可发酵的糖；c)发酵，以产生发酵产物；和d)可选地回收发酵产物。在该方法的步骤b)和/或c)中，具有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者以0.001-2.0AGU/g DS、0.01-1.5AGU/g DS、0.05-1.0AGU/g DS、0.01-0.5AGU/g DS的量存在。具有葡糖淀粉酶活性的酶可以或者不存在，或者以不超过或甚至低于0.5AGU/g DS、或不超过或甚至低于0.4AGU/g DS、或不超过或甚至低于0.3AGU/g DS、或者不超过甚至低于0.1AGU/g DS，例如不超过或甚至低于0.05AGU/g DS的淀粉底物的量存在。酶蛋白以mg表示，具有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者以不超过或甚至低于0.5mgEP/g DS，或者不超过或甚至低于0.4mgEP/g DS，或者不超过或甚至低于0.3mgEP/g DS，或者不超过或甚至低于0.1mgEP/g DS(例如不超过或甚至低于0.05mgEP/g DS或者不超过或甚至低于0.02mgEP/g DS的淀粉底物)的量存在。在该方法中，步骤a)、b)、c)和/或d)可以单独执行或者同时执行。
在另一方面，该方法包括：a)将淀粉底物与转化后表达杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的酵母菌细胞接触，所述变体包含具有α-淀粉酶活性的催化模块和糖结合模块；b)将所述淀粉底物与所述酵母菌在一定温度下孵育一段时间，在此条件下足以将至少90％w/w的所述淀粉底物转化为可发酵的糖；c)发酵，以产生乙醇；和d)可选地回收乙醇。在该方法中，步骤a)、b)和c)可以单独执行或者同时执行。
在又一个方面中，该方法包括水解糊化的糖浆或颗粒淀粉，特别是在低于所述颗粒淀粉的初始糊化温度的温度下水解颗粒淀粉为可溶的淀粉水解产物。除了与包含具有α-淀粉酶活性的催化模块和糖结合模块的多肽接触之外，淀粉还可以与任何一种或多种下述真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、以及一种或多种下述β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)的酶接触。在另一方面，可向杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体中添加其他淀粉水解酶或脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)。
在一实施方案中，所述方法在低于初始糊化温度的温度实施。此类方法时常在至少30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少35℃、至少36℃、至少37℃、至少38℃、至少39℃、至少40℃、至少41℃、至少42℃、至少43℃、至少44℃、至少45℃、至少46℃、至少47℃、至少48℃、至少49℃、至少50℃、至少51℃、至少52℃、至少53℃、至少54℃、至少55℃、至少56℃、至少57℃、至少58℃、至少59℃或至少60℃实施。实施所述方法的pH可以处于约3.0至约7.0、或约3.5至约6.0、或约4.0至约5.0的范围。一方面考虑包括发酵的方法，例如，在32℃左右(例如30-35℃)的温度，例如利用酵母生产乙醇。
另一方面，所述方法包括同时进行的糖化和发酵，例如，在30-35℃(例如32℃左右)的温度，例如利用酵母生产乙醇或者利用其他适宜的发酵生物生产期望的有机化合物。
在上述发酵方法中，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％，例如至少约16％乙醇。
在上述任何方面中使用的淀粉浆可以具有约20％至约55％的干固形物颗粒淀粉，约25％至约40％的干固形物颗粒淀粉，或约30％至约35％的干固形物颗粒淀粉。在与杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体接触后，该酶将颗粒淀粉中的可溶性淀粉以至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的量转化成可溶性淀粉水解物。
在另一实施方案中，在用于液化、糖化糊化的淀粉(例如但不限于通过喷射蒸煮进行的糊化)的方法中使用杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其包含具有α-淀粉酶活性的催化模块和糖结合模块的变体，例如第一方面中所述的多肽。所述方法可以包括发酵以生产发酵产物例如乙醇。通过发酵由含淀粉原料生产乙醇的此类方法包括：(i)用包含具有α-淀粉酶活性的催化模块和糖结合模块的多肽，例如第一方面的多肽液化所述含淀粉原料；(ii)糖化所得的液化醪液(mash)；和(iii)在发酵生物的存在下发酵步骤(ii)所得的物质。任选该方法还包括回收乙醇。糖化和发酵的方法可以作为同时糖化和发酵法(SSF)实施。在上述发酵期间，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、例如至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％，例如至少约16％乙醇。
在上述方面的方法中待加工的淀粉可以特别地来自块茎、根、茎、豆类、谷物或整个谷粒。更具体地，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米芯、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。还考虑的有蜡质及非蜡质类型的玉米和大麦。
上述组合物可用于液化和/或糖化糊化或颗粒的淀粉，和部分糊化的淀粉。部分糊化的淀粉是糊化一定程度的淀粉，即，其中部分淀粉被不可逆溶胀和糊化，而部分淀粉仍然以颗粒状态存在。
上述组合物可包含以0.01-10.0AFAU/g DS或0.1-5.0AFAU/g DS或0.5-3.0AFAU/AGU或0.3-2.0AFAU/g DS的量存在的酸性α-淀粉酶变体。该组合物可用于上述任何淀粉加工中。
如本文所用，名词或动词形式的术语“液化”表示将淀粉转化为链长较短且粘性较小的糊精的过程。通常，此过程包括淀粉的糊化，同时或之后添加杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体。也可以添加其他液化诱导酶。
如本文所用，术语“初次液化(primary liquefaction)”是指浆液温度升至或接近其糊化温度时的液化步骤。继温度升高之后，使浆液传送通过热交换器或喷射器达到温度约200-300℉，例如220-235℉。继应用热交换器或喷射器温度之后，使浆液在该温度保持为期3-10分钟。这种保持浆液处于200-300℉的步骤为初次液化。
如本文所用，术语“二次液化”是指继初次液化(加热至200-300℉)之后，当浆液被允许冷却至室温时的液化步骤。此冷却步骤可以是30分钟至180分钟(3小时)，例如90分钟至120分钟(2小时)。
如本文所用，术语“二次液化的分钟数”是指自二次液化开始时起到测量DE的时间止所经过的时间。
另一方面考虑在包含杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的组合物中额外应用β-淀粉酶，β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外切产麦芽糖淀粉酶，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键水解，由此释放麦芽糖。
已经从多种植物和微生物中分离到β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，15卷，112-115页，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有处于40℃至65℃范围内的最适温度，以及处于约4.5至约7.0范围内的最适pH。考虑的β-淀粉酶包括但不限于：来自大麦SPEZYME
BBA 1500、SPEZYME
DBA、OPTIMALT
ME、OPTIMALT
BBA(Genencor International Inc.)和NOVOZYMTMWBA(Novozymes A/S)的β-淀粉酶。
考虑用于组合物中的另一酶是葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。葡糖淀粉酶来自微生物或植物。示例性葡糖淀粉酶为真菌或细菌来源。示例性细菌葡糖淀粉酶有曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人，EMBO J.3(5)：1097-1102(1984))或其变体，例如WO 92/00381和WO00/04136中所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，55(4)：941-949(1991))或其变体或片段。
其他考虑的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996)，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人，Prot.Eng.8：575-582(1995))；N182(Chen等人，Biochem.J.301：275-281(1994))；二硫键，A246C(Fierobe等人，Biochemistry，35：8698-8704(1996))；和在A435和S436位引入Pro残基(Li等人ProteinEng.10：1199-1204(1997))。其他考虑的葡糖淀粉酶包括篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、Talaromyces.leycettanus(美国专利No.RE 32,153)、杜邦篮状菌(Talaromyces.duponti)、嗜热篮状菌(Talaromyces.thermophilics)(美国专利No.4,587,215)。考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶的示例包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶。还考虑商业葡糖淀粉酶，例如AMG 200L、AMG 300L、SANTM SUPER和AMGTM E(Novozymes)；OPTIDEX
300(购自Genencor International Inc.)；AMIGASE
和AMIGASE
PLUS(DSM)；G-ZYME
G900(Enzyme Bio-Systems)；G-ZYMEG990ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。
可以以0.02-2.0AGU/g DS或0.1-1.0AGU/g DS(例如0.2AGU/g DS)的量加入葡糖淀粉酶。
组合物中可包含其他酶和酶变体。除了杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体，可以使用一种或多种α-淀粉酶，或可以进一步包括本文讨论的其他酶。
可以任选加入的另一种酶是脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D-糖苷分支键，并且通过异淀粉酶不能攻击普鲁分支葡聚糖及其对α-极限糊精的有限作用而能够与支链淀粉酶区别开来。可以按本领域技术人员熟知的有效量加入脱支酶。
所述方法的产物的确切组成取决于所应用的酶组合以及所加工的颗粒淀粉的类型。例如，可溶水解产物可以是纯度为至少约85％、至少约90％、至少约95.0％、至少约95.5％、至少约96.0％、至少约96.5％、至少约97.0％、至少约97.5％、至少约98.0％、至少约98.5、至少约99.0％或至少约99.5％的麦芽糖。备选地，可溶淀粉水解产物可以是葡萄糖，或者淀粉水解物具有至少94.5％、至少95.0％、至少95.5％、至少96.0％、至少96.5％、至少97.0％、至少97.5％、至少98.0％、至少98.5、至少99.0％或至少99.5％的DX(葡萄糖占总溶解的干固形物的百分比)。该方法可包括特制糖浆产物，例如用于生产冰淇淋、蛋糕、糖果、水果罐头的包含葡萄糖、麦芽糖、DP3和DPn的混合物的特制糖浆。
两种碾磨方法是：湿磨法和干磨法。在干磨法中，碾磨和使用整个谷粒。湿磨法提供胚芽和粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，当淀粉水解产物用于糖浆生产时通常使用这种方法。干磨法和湿磨法均为淀粉加工领域公知，且同等地考虑与所公开的组合物和方法一起使用。所述方法可在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同等考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同样考虑的是在具有微过滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。
一方面，将该方法的可溶淀粉水解产物转化为基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。这种转化可利用葡萄糖异构酶，以及通过是固定在固相支持物上的固定葡萄糖异构酶实现。所考虑的异构酶包括商品SWEETZYME
IT(Novozymes A/S)；G-ZYME
IMGI和G-ZYME
G993，KETOMAX
G-ZYME
G993(Rhodia)，G-ZYME
G993液体和GENSWEET
IGI(Genencor国际公司)。
另一方面，这些方法所生产的可溶淀粉水解产物可用于出产燃料或饮用乙醇。在第三方面的方法中，发酵可以与颗粒淀粉浆的水解同时或分开/相继进行。当发酵与水解同时进行时，温度可以在30℃-35℃之间，尤其是31℃-34℃之间。该方法可以在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。同等考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。
所述方法的可溶淀粉水解产物也可以用于发酵产品的生产，其包括将所处理的淀粉发酵成发酵产品，例如柠檬酸、谷氨酸单钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸δ-内酯或异抗坏血酸钠。
杆菌物种TS-23菌株α-淀粉酶或其变体的淀粉水解活性例如可以利用马铃薯淀粉作为底物来测定。此方法基于该酶对改性马铃薯淀粉的降解，且反应后接着将淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。最初形成黑蓝色，但是在淀粉降解期间，蓝色变弱，逐渐变成红棕色，将其与有色玻璃标准进行比较。
5.方法
5.1过滤筛选实验
下面讨论的实验可用于筛选与亲本α-淀粉酶相比，在高或低pH和/或在Ca2+衰竭条件下具有改变的稳定性的AmyTS23α-淀粉酶变体。
5.2高pH滤膜筛选实验
于37℃，将杆菌属物种库平板接种在含有10微克/毫升卡那霉素的TY琼脂平板上的多层醋酸纤维素(OE 67，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)上至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。
平板接种后但是在孵育之前用针特别标记各个滤膜夹层，以便能够在滤膜上定位阳性变体，将带有结合变体的硝酸纤维素滤膜转移到含有甘氨酸-NaOH缓冲液，pH8.6-10.6的容器中并室温(可在10-60℃间变化)孵育15分钟。带有菌落的醋酸纤维素滤膜在室温下储存于TY平板上，直至使用。孵育之后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.6-10.6)的平板上检测残余的活性。带有硝酸纤维素滤膜的实验板以与上述滤膜夹层同样的方式标记，并在室温下孵育2小时。去除滤膜后，用10％复方碘溶液(Lugol solution)对实验板染色。在暗蓝色背景下，降解淀粉的变体检测为白色斑点并然后在储存板上鉴定出。在与第一次筛选同样的条件下重新筛选两次阳性变体。
5.3低钙滤膜筛选实验
于37℃，在含有相关抗生素(例如卡那霉素或氯霉素)的TY琼脂平板上的多层醋酸纤维素(OE 67，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)上平板接种杆菌属物种库至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。
平板接种后但是在孵育之前用针特别标记各个滤膜夹层，以便能够在滤膜上定位阳性变体，将带有结合变体的硝酸纤维素滤膜转移到含有碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH8.5-10，具有不同EDTA浓度(0.001mM-100mM)的容器中。将滤膜室温下孵育1小时。带有菌落的醋酸纤维素滤膜在室温下储存于TY平板上，直至使用。孵育之后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH8.5-10)的平板上检测残余的活性。带有硝酸纤维素滤膜的实验板以与上述滤膜夹层同样的方式标记，并在室温下孵育2小时。去除滤膜后，用10％复方碘溶液(Lugol solution)对实验板染色。在暗蓝色背景下，降解淀粉的变体检测为白色斑点并然后在储存板上鉴定出。在与第一次筛选同样的条件下重新筛选两次阳性变体。
5.4低pH筛选滤膜实验
于37℃在含有10微克/毫升氯霉素的TY琼脂平板上多层醋酸纤维素(OE 67，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)上平板接种杆菌属物种库，至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。
在平板接种后但是孵育之前用针特别标记各个滤膜夹层，以便将阳性变体定位在滤膜上，带有结合变体的硝酸纤维素滤膜被转移到含有柠檬酸盐缓冲液，pH4.5的容器中并80℃孵育20分钟(当在野生型背景(backbone)下筛选变体时)或85℃孵育60分钟(当筛选亲本α-淀粉酶的变体时)。带有菌落的醋酸纤维素滤膜在室温下储存于TY平板上，直至使用。孵育之后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的实验平板上检测残余的活性。带有硝酸纤维素滤膜的实验板以与上述滤膜夹层同样的方式标记，并在50℃下孵育2小时。去除滤膜后，用10％复方碘溶液对实验板染色。在暗蓝色背景下，降解淀粉的变体检测为白色斑点并然后在储存板上鉴定出。在与第一次筛选同样的条件下重新筛选两次阳性变体。
5.5二次筛选
从储存板上挑出重筛选后的阳性转化体并在二次平板筛选中检测。37℃下阳性转化体在5mL的LB+氯霉素中生长22小时。各个阳性转化体和作为对照表达相应背景的克隆的杆菌属培养物在柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)中于90℃下孵育，在0、10、20、30、40、60和80分钟时取样。在实验板上点3μL样品。用10％复方碘溶液对实验板染色。改善的变体视为与背景相比具有更高残余活性(在实验板上检测为晕斑)的变体。用核苷酸测序来确定该改善的变体。
5.6未纯化变体的稳定性实验
变体的稳定性可以用如下方法检测：表达要分析的变体的杆菌属培养物在10ml LB+氯霉素中于37℃下生长21小时。800μL培养物与200μL柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)混合。对应于样品时间点数的多个70μL等分样品在PCR管中制备，并于在PCR仪中于70℃或90℃孵育不同时间(通常是5、10、15、20、25和30分钟)。0分钟样品不在高温下孵育。通过转移20μL样品至200μL的α-淀粉酶PNP-G7底物MPR3(Boehringer Mannheim目录号1660730)中来测定样品活性，如下面“α-淀粉酶活性测定”部分所述。结果以百分比活性(相对于0分钟时间点的活性)对时间作图，或者描述为在孵育一定时间之后残余活性百分比。
5.7α-淀粉酶变体的发酵和纯化
如下所述发酵和纯化包含相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株：将从-80℃储存的储液中取出的菌株划线接种于含有10微克/毫升卡那霉素的LB琼脂板上，37℃下过夜生长。菌落转移至500mL摇瓶中的补充有10微克/毫升氯霉素的100mL PS-1培养基中。
PS-1培养基的成分
颗粒糖(Pearl sugar) 100g/l
大豆粉 40g/l
Na2HPO4，12H2O 10g/l
PluronicTM PE 6100 0.1g/l
CaCO3 5g/l
培养物在37℃下以270rpm振荡培养5天。
4500rpm离心20-25分钟，从发酵液中去除细胞和细胞碎片。过滤上清得到完全清澈的溶液。浓缩滤液并在UF-过滤器(10000截留膜)上洗涤，缓冲液换为20mM醋酸盐缓冲液，pH5.5。将UF-过滤液上样到S-琼脂糖F.F.上，用含0.2MNaCl的同样缓冲液阶段洗脱。用10mM Tris，pH9.0透析洗脱液，并将洗脱液上样到Q-琼脂糖F.F.，用从0到0.3M的NaCl的线性梯度以6个柱体积洗脱。收集含有活性(用Phadebas实验测量)的级分，将pH调至pH7.5，通过0.5％W/vol.活性炭处理5分钟来去除剩余的颜色。
5.8比活性测定
用PHADEBAS
实验(Pharmacia)测定比活性，记作“活性/毫克酶”。遵循厂商的说明书(还参见下文“α-淀粉酶活性测定”)。
5.9等电点测定
用等电聚焦法测定pI(例如Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)。
5.10增加的稳定性测定
在50ml丙烯管中加入10ml目的洗涤剂。对AmyTS23t和AmyTS23tΔRS适当稀释，以将其吸入含有该洗涤剂的各个管中后，各自以180ppm测量。带有各个突变酶的洗涤剂涡旋30秒，然后置于RotaMix(ATR RKVS Model)上10分钟。吸取100微升含有突变酶的洗涤剂，以1∶651稀释。突变体的初始活性用嵌段的P-硝基-苯基-麦芽糖庚糖(BlockedP-Nitro-Phenyl-Maltoheptaose(嵌段的PBNPG7))底物在Konelab，Model20XT上检测。然后将洗涤剂样品在设置为37℃的恒温孵育器中孵育。在第1、2、4、7和17天取出样品，检测酶活性。
5.11α-淀粉酶活性测定
5.11.1 Phadebas实验
以使用PHADEBAS
片作为底物的方法测定α-淀粉酶活性。Phadebas片(PHADEBAS
淀粉酶检测，Pharmacia Diagnostic提供)含有交联的不可溶蓝色淀粉聚合物，其已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并压片。
对于每个单独测量，在含有5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl2，用NaOH调至所需pH值)的管中悬浮一片。该检测在目的温度的水浴中进行。要检测的α-淀粉酶在X ml的50mM Britton-Robinson缓冲液中稀释。1ml该α-淀粉酶溶液加入到5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液中。该α-淀粉酶水解淀粉，得到可溶的蓝色片段。用分光光度计在620nm测量得到的蓝色溶液的吸光度是该α-淀粉酶活性的函数。
重要的是在10或15分钟(检测时间)孵育后测得的620nm吸光度处于620nm的0.2-2.0吸光度单位范围内。在这个吸光度范围内，在活性和吸光度之间有线性关系(Lambert-beer定律)。因此酶的稀释必须调节为符合该标准。在指定条件(温度、pH、反应时间、缓冲条件)设置下，1mg的给定α-淀粉酶将水解一定量的底物而且会产生蓝色。在620nm测量颜色强度。测得的吸光度与所测α-淀粉酶在给定的条件设置下的比活性(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)正好成比例。
5.11.2备选方法
α-淀粉酶活性用使用PNP-G7底物的方法测定。PNP-G7是对-硝基苯基-α-D-麦芽庚糖苷的缩写，是能够被内切淀粉酶裂解的嵌段寡糖。裂解之后，试剂盒中包含的α-葡糖苷酶消化该底物，释放游离的PNP分子，PNP分子是黄色的，因此能够在λ＝405nm(400-420nm)被可见分光光度法检测。含有PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim生产(货号1054635)。
为了制备该试剂溶液，按照生产者的建议，10ml的底物/缓冲液加入到50ml酶/缓冲液中。将20微升样品转移至96孔微滴定板，在25℃孵育来进行该检测。加入在25℃预平衡的200微升试剂溶液。混合溶液，并预孵育1分钟，在酶标仪上4分钟内每30秒在OD 405nm测量一次吸光度。
时间相关的吸光度曲线的斜率直接与给定条件设置下所实验的α-淀粉酶的活性成比例。
5.12洗涤剂组合物中酶性能的测定
5.12.1美国条件
使用Terg-o-tometer，美国检测中心，Hoboken，新泽西州——为了模拟美国洗衣条件下的洗涤检测，在20℃下用标准洗涤剂，如不含荧光增白剂的液体AATCC2003和/或粉末AATCC1993(美国纺织品化学和色彩协会)，测量目的突变酶的剂量效率曲线(DEC)。然后测定相当的α-淀粉酶的相应DEC来比较本发明突变酶的污渍去除性能。40℃下重复该过程。通常，将4个CS-28稻米淀粉污染(荷兰CFT)的样品置于Terg-o-tometer的钢容器中，其中充满了1升去离子水和1.5g的液体AATCC。当使用粉末AATCC时，用分析天平(Model PM4800，Mettler Instrument Corp.，Highstown，N.J.08520)称取1.5g该洗涤剂粉末，然后加入到Terg-o-tometer中。同时重复进行两次检测。除非另外说明，该检测进行12分钟，洗涤3分钟。洗涤之后，空气干燥该样品，用Konica Minolta生产的Chroma Meter Model CR-410测定所测试样品的反射比。用适宜的统计分析处理收集的数据。
5.12.2欧洲条件
使用Launder-O-meter，Atlas公司制造，乔治亚州亚特兰大——为了模拟欧洲洗涤条件下的洗涤测试，在40℃下用标准欧洲测试洗涤剂，IECA和含漂白剂(TAED-四乙酰基乙二胺乙酸盐)和过硼酸钠的IEC A，测量目的突变酶的剂量效率曲线(DEC)。然后测定相当的突变酶的相应DEC曲线来比较本发明的突变酶的污渍去除性能。如果需要，在更高洗涤温度下重复该过程。通常，四个EMPA 161，玉米淀粉(EMPA，瑞士)样品置于钢容器中，其中含有250ml含有6.8g/L IEC A洗涤剂或8.0g/L含有漂白剂的IEC A洗涤剂的去离子水。同时重复进行两次检测。除非另外说明，该检测进行45分钟，洗涤5分钟。洗涤之后，空气干燥该样品，用Chroma Meter Model CR-410测定所测试样品的反射比。用适宜的统计分析处理收集的数据。
5.12.3评估洗涤剂组合物的微样品方法
存在许多种α-淀粉酶清洁测定法。检测清洁的示例性描述包括如下内容。
“样品”是一块材料，例如其上施有污渍的织物。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。该样品还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬材料，例如陶瓷、金属或玻璃。对于α-淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨水、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、色素、油或这些化合物的混合物。
“小样品”是自样品上用单孔穿孔装置切下的部分，或者用定制的96孔穿孔装置(该多孔穿孔模式与标准96孔微滴定板匹配)切下的部分，或者是以其它方式自样品上取下的部分。样品可以是纺织品、纸、金属或其他适宜的材料。小样品可以在放入24孔、48孔或96孔微滴定板的孔之前或之后被污物固着。“小样品”也可以通过向小块材料施加污物而制成。例如，小样品可以是直径为5/8”或0.25”的污染的织物片。定制的穿孔机经设计可以同时将96个样品递送至96孔板的所有孔中。该装置可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而向每孔递送一个以上的样品。可以想到将多孔穿孔装置用于向任何规格的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同时递送样品。另一可想到的方法中，污染的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷，或其他适宜材料形成的、被污物底物包覆的珠，其用于测试用于纺织品以外材料的清洁组合物。然后将一个或多个污物包覆的珠放入含有适宜缓冲液和酶的96孔、48孔或24孔板的孔中或更大形式的板的孔中。这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在二级生色反应后在上清液中检测释放的污物。也可以通过质谱分析来进行释放的污染物的分析。进一步的微筛选测定可以是将样品(例如靛蓝染色的粗斜棉布织物)递送并固定到多孔板的孔中，并加入颗粒，例如沙子或者更大的颗粒，例如筛成包括6-8或9号规格的石粒，并振荡该多孔板，以使通过加入的颗粒对样品形成磨损。该测定可用于在石洗应用中的纤维素酶的评价中。酶的有效性可以通过颜色释放到反应缓冲液中(例如释放的靛蓝溶解于二甲基亚砜中，测量A600的吸光度)或磨损样品的反射比测定来判定。
当例如未处理的BMI(血液/牛奶/墨水)样品在没有漂白剂的洗涤剂中洗涤时，大比例的墨水即使没有蛋白酶的帮助也会释放。加入蛋白酶导致墨水释放的小量增加，这种增加在大背景下难以定量。本发明的一方面提供了使人可以控制污渍的固着程度的处理方案。结果是，可以产生例如当在不存在被检测的酶的情况下进行洗涤时能释放出不等量的污渍的样品。固着的样品的使用导致在洗涤试验中信噪比的显著提高。此外，通过改变固着程度，可以产生在不同清洁条件下给出最佳结果的污渍。
在多种材料类型上具有已知“强度”的污渍的样品是市售可得的(EMPA，St.Gallen，Switzerland；wfk--Testgewebe GmbH，Krefeld Germany；或Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands)和/或可以由从业者制得(Morris和Prato，Textile Research Journal 52(4)：280286(1982))。其他检测样品包括但不限于含棉织物上的血液/牛奶/墨水(BMI)污渍，含棉织物上的菠菜污渍，或含棉织物上的草渍，和含棉织物上的巧克力/牛奶/烟灰污渍。
可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包括用0.001％-1％戊二醛固着的草渍或菠菜渍、用0.001％-1％戊二醛固着的明胶和考马斯亮兰染料、或用0.001％-1％戊二醛固着的巧克力、牛奶和烟灰。
也可以在用酶和/或洗涤剂制剂孵育期间搅拌样品。洗涤性能数据取决于孔中，尤其是在96孔板中的样品的取向(水平对垂直)。这表明在孵育期间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证孵育期间充分的搅拌，但可以构建将微滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地例如在孔上方放置粘性板密封物，然后用任何类型的适合的、市售可得的夹子将两个铝板与96孔板夹紧而实现。然后可以将它放到商品化的孵育摇床中。将摇床设定为约400转/分钟可以导致非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或交叉污染。
可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来量化洗液中的氨基浓度。这可以用作从样品中去除的蛋白质量的量度(参见例如Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200(1997))。然而，如果洗涤剂或酶样品导致异乎寻常的小肽片段的形成(例如，因样品中存在肽酶所致)，那么人们将获得较大的TNBS信号，即更多“噪音”。
另一种测定对血液/牛奶/墨水或其他污渍的洗涤性能的方式基于墨水的释放。样品上蛋白质的蛋白水解导致墨水颗粒的释放，能够通过测量洗液的吸光度来定量。可以在350和800nm之间的任何波长测量吸光度。测量波长为410nm或620nm。也可以检查洗液以确定对于含有草、菠菜、明胶或考马斯亮兰的污渍的洗涤性能。对于这些污渍，示例性的波长包括对于菠菜污渍或草污渍的670nm和对于明胶污渍或考马斯亮兰污渍的620nm。例如，移出等份试样的洗液(例如，通常来自96孔微板的100-150μL)并放到小杯或微孔微板中。然后将它放到分光光度计中并在适当的波长读取吸光度。
也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜底物上的血液/乳/墨水污渍，来测定用于餐具洗涤的强化的酶和/或洗涤剂组合物。
一方面，通过在25℃将0.3％过氧化氢施用于BMI/棉样品30分钟，或通过在60℃将0.03％过氧化氢施用于BMI/棉样品30分钟来将BMI污渍固定于棉上。从上述BMI/棉样品切下大约0.25”的小样品，置于96孔微滴定板的孔中。向各孔中放入已知的洗涤剂组合物和酶如变体蛋白质的混合物。向微滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微滴定板与铝板夹在一起，并在定轨摇床上以约250转/分钟搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上清液转移到新的微滴定板的孔中并测量620nm的墨水吸光度。相似地，可以对固着于棉的菠菜污渍或草污渍进行检测，该污渍通过在25℃对菠菜/棉样品或草/棉样品施用0.01％戊二醛30分钟来固着。同样也可以对巧克力、牛奶和/或烟灰污渍检测。其他血液/牛奶/墨水检测和条件记载于美国专利7,122,334中(Genencor International，Inc.)。
5.13 LAS敏感度测定
在40℃下将变体与不同浓度的LAS(线性烷基苯磺酸酯；Nansa 1169/P)孵育10分钟。
用Phadebas
测量法或使用PNP-G7底物的其他方法测定残余活性。
在0.1M，pH7.5的磷酸盐缓冲液中稀释LAS。
使用下列浓度：500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm和10ppm或无LAS。
在总体积10ml中，在不同的LAS缓冲液中将变体稀释至0.01-5mg/l的浓度，并在温控水浴中孵育10分钟。通过转移小等分试样至冷检测缓冲液中来停止孵育。重要的是，在活性测量期间，LAS浓度低于1ppm，以免影响该活性测量。
然后用上述PHADEBAS测量法或其他方法，测定残余活性，对每样品一式两份测定。
减去空白后测定活性。
无LAS的活性为100％。
本申请组织为多个部分，以易于阅读；但是，读者应理解在一个部分中的描述可以用于其他部分中。以这种方式，用于本公开的不同部分的标题不应被理解为限制。
为了进一步说明本发明的组合物和方法及其优势，给出了下列具体实施例。应理解的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明的组合物和方法而提供，而不应理解为以任何方式对其范围的限制。
实施例
在整个说明书中，使用了下列缩写：wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；H2O(水)；dH2O或DI(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μl和μL(微升)；mL和ml(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔每升)；mM(毫摩尔每升)；μM(微摩尔每升)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；DO(溶解氧)；W/V(重量体积比)；W/W(重量比)；V/V(体积比)；Genencor(Danisco US Inc，Genencor部，加利福尼亚州帕洛阿尔托)；Ncm(牛顿厘米)和ETOH(乙醇)；eq(等价物)；N(正常的(normal))；ds或DS(干固体含量)。
实施例1
AmyTS23在枯草芽孢杆菌中的表达
为了检测AmyTS23全长的表达，如图3所示的合成DNA序列(德国雷根斯堡Geneart制备)克隆到pHPLT载体(参见例如WO2005111203和Solingen等人(2001)Extremophiles 5：333-341)中LAT(地衣芽孢杆菌淀粉酶)启动子之后，并以与编码LAT信号肽属于相同读码框的方式融合(图5)，并转化到9个蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌株(degUHy32，oppA，ΔspoII3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr，Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB)(参见例如US公开号20050202535A1)中。新霉素(10μg/ml)抗性转化物分泌AmyTS23淀粉酶，这可以通过淀粉板上碘染色后晕斑形成来判断(参见WO2005111203)。选择这些淀粉酶阳性的转化物中的一个，命名为BG6006(pHPLT-AmyTS23)。通常让该菌株的培养物在下列培养基(每升)中于37度，250rpm下生长60-72小时：10g大豆蛋白胨(Soytone)，75g葡萄糖，7.2g尿素，40mM MOPS，4mM Tricine，3mM磷酸氢二钾，21.4mMKOH，50mM NaCl，276μM硫酸钾，528μM氯化镁，50μM二水柠檬酸钠，100μM二水氯化钙，14μM七水硫酸亚铁，5.9μM二水硫酸锰，5.7μM一水硫酸锌，2.9μM二水氯化铜，4.2μM六水氯化钴，4.5μM二水钼酸钠。对于1升体积的培养基，除了大豆蛋白胨之外的所有成分在500mL中混合，过滤除菌，然后加入到已经高压灭菌的等部分的2×大豆蛋白胨中。痕量金属和柠檬酸盐可以制成100×或1000×的储存液。缓冲液，氢氧化钾，氯化钠，硫酸钾，氯化镁和痕量金属可以制备成10×储存液。混合所有成分后，将pH值调至7.3。该培养液在使用前补充以20mM的氯化钙。
培养物以两种主要形式表达淀粉酶。在10％SDS-PAGE凝胶中观察到高分子量形式在66kDa分子量标准处。55kDa处观察到小分子量形式。
用如下方法从培养基中分离高分子量成分：用10mL固定体积的β-环糊精-琼脂糖亲和基质树脂处理500mL该培养基(该亲和树脂用标准方案从β-环糊精(Sigma Aldrich Cat.No.c4767)和环氧活化的琼脂糖-6B(GEHealthcare，N.J.Cat.No.17-0480-01)合成)，温和搅拌下4℃过夜，收集树脂，用含有2mM氯化钙(CaCl2)的25mM双-Tris丙烷缓冲液(pH8.5)洗涤。用补充有50mM β-环糊精的同样的缓冲液洗涤该树脂来洗脱该高分子量酶。用SDS-PAGE分析各级分，收集含有酶的级分，并透析去除β-环糊精。以OxAm淀粉酶(Genencor)作为蛋白质标准，用凝胶光密度法估计酶蛋白浓度。
实施例2
AmyTS23t在枯草芽孢杆菌中的表达
为了检测遗传平截的AmyTS23(AmyTS23t)的表达，如实施例1所述将图4所示的合成DNA克隆到pHPLT中，并转化到9种蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌株中。新霉素抗性转化物分泌AmyTS23t淀粉酶，这可以通过淀粉板上碘染色后晕斑形成来判断。选择这些淀粉酶阳性的转化物中的一个，命名为BG6006(pME622.1)。如实施例1所述培养该菌株，以生产AmyTS23t淀粉酶。用SDS-PAGE检测培养上清，结果表明产生了预期的分子量为55kDa的产物。
向500mL培养物中加入NH4SO4至终浓度为1M，以部分纯化淀粉酶蛋白质。然后，加入10mL固定体积的苯-琼脂糖树脂，4℃下温和搅拌所得混合物过夜。收集树脂，并用含有1M NH4SO4和2mM氯化钙(CaCl2)的25mM双Tris丙烷缓冲液(pH8.5)洗涤。用不含NH4SO4的相同缓冲液洗脱酶活性。用SDS-PAGE分析各级分，收集含有酶的级分，并透析去除残余的NH4SO4。以OxAm淀粉酶(Genencor International，Inc.)作为蛋白质标准，用凝胶光密度法估计酶蛋白浓度。
实施例3
AmyTS23在清洁筛选测定中
在96孔CS28橙色染色的稻米淀粉弄脏的织物样品微应用清洁实验中分析部分纯化的实施例1所述全长AmyTS23。为进行该实验，向96孔板中装入从在室温水中预洗1小时并空气干燥的织物上切下的1/4英寸大小的织物样品。该洗涤去除了大量松散结合的污渍。可选地，这些样品在装入板中后也经过预洗涤。两种方法产生了相似的结果。向板的孔中加入选择的缓冲液，该板温度平衡至优选的温度。在本实施例中，在25mM HEPES(pH8.0)和25mM CAPS(pH10.3)缓冲液中进行该实验，在20或40℃下孵育。该温度平衡阶段之后，加入酶至所需浓度，继续孵育30分钟至1小时，同时在Eppendorf Thermomix控温盒中以750转/分钟振摇。通过酶量依赖的颜色向溶液的释放来判断酶的性能。在488nm定量分光光度计测量颜色的释放。对于该实验另外的信息，参见美国专利7,122,334。
此实验中该酶的清洁数据示于图6(20℃)和图7(40℃)中。全长的AmyTS23(AmyTS23fl)在pH8.0下表现出高效的污渍去除性能，但是在pH10.3也能表现出惊人的污渍去除效果。
该数据表明AmyTS23fl在两种pH值下都比对照(OxAm)表现出更好的性能。
该样品实验可以以几种方式修改以适应不同目的。该96孔实验非常适用于在酶与样品孵育之后通过分光光度计法测量吸光度的高通量清洁实验，而例如用有切至适合24孔板的样品的24孔板可用于洗涤较大的样品，其反射比可以本领域公知的技术测量。上清吸光度和样品反射比这两种测量表现出几乎完全的相关性。
洗涤的样品的反射比与上清吸光度的相关性非常高，其决定系数r2为0.99。该实验原则上可以规模放大至384孔板。该实验可以用任何弄脏的样品进行，并且，除了CS28样品，也可以检测CS26、CS27和CS29样品(例如分别为玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉，Testfabrics，Inc.，WestPittiston，PA)来说明如实施例3中所述的测量的有效性。该实验也可用于洗涤剂组合物，并在不同的温度和不同的pH值下进行。这些实验改编自美国专利7,122,334。
实施例4
AmyTS23t的清洁筛选测定
如实施例3所述，在96孔CS28橙色染色、稻米淀粉弄脏的织物样品微应用清洁实验中分析部分纯化的实施例2所述平截的AmyTS23(AmyTS23t)。此实验中该酶的清洁数据示于图8(20℃)和图9(40℃)中。数据表明AmyTS23t在两种pH下都表现出比对照淀粉酶(OxAm，可自Genencor商购的淀粉酶)更优的性能。图6和8的比较清楚地表明，平截的AmyTS23在20℃比AmyTS23全长分子具有更优的性能。因此该平截的分子是对于洗衣应用更优的分子。
实施例5
AmyTS23变体在枯草芽孢杆菌中的表达
在该实施例中，说明了表达AmyTS23t变体的枯草芽孢杆菌菌株的构建。含有密码子优化的AmyTS23基因的合成的DNA片段056426(Geneart GmbH生产，Josef-Engert-strasse 11，D-93053 Regensburg，Germany)用作模板DNA(图3)。包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)启动子和用于克隆的PstI和HpaI限制性酶切位点之前的LAT信号肽(preLAT)的pHPLT载体(Solingen等人，Extremophiles 5：333-341，[2001])用于AmyTS23t变体的表达。
用如下DNA引物通过PCR制备三个DNA片段：
1.具有180位密码子CGG和181位密码子AGC缺失的AmyTS23t(AmyTS23tΔRS)；
2.具有201位密码子ATG被CTG取代的AmyTS23t(AmyTS23t(M201L)；
3.具有201位密码子ATG被CTG取代，而且180位密码子CGG和181位密码子AGC缺失的AmyTS23t(AmyTS23t(M201L+ΔRS)
这些DNA引物用Sigma(Sigma-Aldrich Chemie B.V.，Postbus 27，3330AA Zwijndrecht，The Netherlands)合成和脱盐。
对下述所有PCR反应，使用终浓度0.2μM的DNA引物(正向引物和反向引物)，和0.1-10ng的DNA模板(DNA片段056426或pDNA pHPLT)。此外，所有的PCR反应在50μL体积中完成，使用Finnzymes(Finnzymes OY，Keilaranta 16A，02150 Espoo，Finland)和Phusion高保真DNA聚合酶(Cat.no.F-530L)。同时，所有的PCR反应混合物含有10μL的5×PhusionHF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL的100％DMSO，和补充至终体积50μL的高压灭菌去离子水。该PCR程序使用MJ Research PTC-200 Peltier热循环仪(MJResearch，590 Lincoln Street，Waltham，MA 02451，USA)，在如Finnzymes(厂商说明书)说明书中所述条件下进行：98℃持续30秒，30个循环(98℃持续10秒，55℃持续20秒，72℃每kb持续22秒)，72℃持续5分钟。
1.AmyTS23tΔRS的产生：
进行两个PCR反应：在合成DNA片段056426上用引物TS-delRS-FW和pHPLT-HpaI-RV；以及在合成DNA片段056426上用引物TS-delRS-RV和pHPLT-PstI-FW。为了融合产生的这两个DNA片段，将两个PCR反应中1μL未纯化的PCR混合物加入到第三个PCR反应样本中，其中加入了引物pHPLT-PstI-FW和pHPLT-HpaI-RV。
纯化扩增的线性1.5kb DNA片段(用Qiagen
Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)，并用PstI和HpaI限制性内切酶消化。随后，将AmyTS23tΔRS(此处也称为AmyTS23tΔRS)DNA片段和pHPLT pDNA(50ng/μl范围，并用PstI和HpaI酶切过)纯化(用Qiagen QiaquickPCR纯化试剂盒，货号28106)，然后在PstI和HpaI末端连接。反应条件是：
4μL纯化的、PstI和HpaI消化的AmyTS23tΔRS DNA片段；2μL纯化的、PstI和HpaI消化的pHPLT DNA片段；8μL T4DNA连接酶缓冲液(Invitrogen货号46300-018)；25μL灭菌的蒸馏水和1μL T4DNA连接酶1单位/μL(Invitrogen货号15224-017)。在20℃进行连接反应16-20小时。
然后，将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌菌株(aprE，nprE，epr，ispA，bpr)和(degUHy32，oppA，spoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，(vpr，wprA，mpr-ybfJ，nprB)中。向枯草芽孢杆菌中的转化如WO 02/14490中所述。在含有Heart infusion琼脂(Difco，货号244400)和10mg/L新霉素的琼脂平板上选择该枯草芽孢杆菌转化体。带有pHPLT-AmyTS23tΔRS载体的枯草芽孢杆菌转化体的选择性生长如实施例1所述在摇瓶中进行。产生具有淀粉水解活性的分泌的AmyTS23tΔRS淀粉酶，其水解活性可以通过在淀粉琼脂平板上加样培养上清然后碘染色来可视化。
2.AmyTS23t(M201L)的产生：
除了前两个PCR反应之外，实施与“AmyTS23tΔRS的产生”同样的实验方案：
进行两个PCR反应：在合成DNA片段056426上用引物TS-M201L-FW和pHPLT-HpaI-RV进行PCR；和在合成DNA片段056426上用引物TS-M201L-RV和pHPLT-PstI-FW进行PCR。
3.AmyTS23t(M201L)-RS缺失的产生：
除了前两个PCR反应之外，实施与“AmyTS23tΔRS的产生”同样的实验方案：
进行两个PCR反应：在合成DNA片段056426上用引物TS-delRS/M201L-FW和pHPLT-HpaI-RV进行PCR；和在合成DNA片段056426上用引物TS-delRS/M201L-RV和pHPLT-PstI-FW进行PCR。
实施例6
AmyTS23tΔRS在洗涤剂中改善的稳定性
在增加的稳定性检测中，在37℃下分别在MOPS缓冲液、灭活的汰渍(Tide)和范例洗涤剂(范例制剂A)中检测AmyTS23t和AmyTS23tΔRS的稳定性。在37℃在灭活的液体汰渍或范例制剂A液体洗涤剂中孵育酶样品，并在Megazyme检测中随时间测定剩余活性。结果示于图10。在两种洗涤剂(灭活的汰渍和范例A洗涤剂)基础之一存在下，不需任何附加添加剂只有AmyTS23tΔRS保持稳定。如图10所示，AmyTS23t在37℃增加的稳定性检测第一天之后损失了大部分的活性，两天后损失了所有活性。在同样条件下，AmyTS23tΔRS是稳定的，而且17天之后保持了大约90％的原始酶活性。
表6-1
实施例7
AmyTS23和AmyTS23突变体的氧化稳定性
对于暴露于过乙酸(PAA)的反应，不同的淀粉酶反应不同。因此，本实施例用来测定AmyTS23和AmyTS23突变淀粉酶的氧化稳定性。条件概括如下：
压力条件 Megazyme检测
30mM酶 嵌段的PNPG7
25mM硼酸盐，pH 8.65 25mM BTP/CaCl2，pH 6.9
1mM PAA，40C，5min 40℃45min kinetic
淬灭：25mM BTP，pH 8.5
通过在1mL旋转脱盐柱上缓冲液交换来在25mM硼酸盐缓冲液，pH8.64，2mM Ca+2中制备酶稀释液。5μL体积的过乙酸加入到25μL酶溶液中得到0-1mM过乙酸。样品在PCR仪(DNA Engine，BioRad)中40℃孵育5分钟。用25mM BTP，pH8.5停止反应。用购自Megazyme(Wicklow，Ireland)的标准淀粉酶检测试剂盒测定残余淀粉酶活性。
如图11所示，TS23t(M201L)在低PAA浓度下具有大于100％的稳定性，然后在高PAA浓度时下降。TS23t(M201L+ΔRS)在低PAA浓度下稳定性升高了25％，然后在高PAA浓度下降至低于100％，最后在高PAA浓度保持了氧化稳定性。TS23t、TS23tΔRS和Amy 707在PAA存在下不稳定，其稳定性在低浓度时下降至基线。
实施例8
洗涤剂中的清洁性能
用本发明第5.12.1节中所述的方法生成选定浓度AmyTS23tΔRS的剂量有效性曲线。用Tergotometer在20℃和40℃进行性能评价。在相同条件下生成Stainzyme和Stainzyme Plus的剂量有效性曲线。由数据可知(图12)，AmyTS23tΔRS在20℃下显著优于两种Stainzyme产物，在40℃中度优于两种Stainzyme产物。该数据表明了AmyTS23tΔRS作为独特的高性能冷水酶的独特益处。
实施例9
枯草芽孢杆菌中的淀粉酶生产
在该实施例中，说明了杆菌物种TS-23t及其变体在枯草芽孢杆菌中的产生。用本领域已知的方法进行转化(参见例如WO 02/14490)。简单地说，编码亲本淀粉酶的基因克隆到pHPLT表达载体中，该载体中含有LAT启动子(PLAT)，编码LAT信号肽的序列(preLAT)，然后是用于克隆的PstI和HpaI限制性内切酶位点。
LAT信号肽的编码区如下所示：
atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcttcagca(SEQ ID NO：5).
LAT信号肽的氨基酸序列如下所示：
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA(SEQ ID NO：6).
成熟AmyTS-23t淀粉酶的编码区如图4所示。
用作制备本文所述变体库的基础的成熟AmyTS-23t淀粉酶的氨基酸序列示于图2中。
用Qiagen的Qiaquik柱纯化PCR产物，然后重悬于50μL去离子水中。用HpaI(Roche)和PstI(Roche)消化50μL纯化的DNA，得到的DNA重悬于30μL去离子水中。用PstI和HpaI克隆位点将10-20ng/μL的DNA克隆到质粒pHPLT中。连接混合物直接转化到感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB)中。该枯草芽孢杆菌细胞具有感受性基因(comK)，其位于木糖诱导的启动子的下游，因此，木糖用于诱导DNA结合和摄取的感受性(参见Hahn等人，Mol.Microbiol.，21：763-775，[1996])。
质粒pHPLT-AmyS的元件包括：pUB110＝来自质粒pUB110的DNA片段(McKenzie等人，Plasmid 15：93-103，[1986])。质粒特征包括：ori-pUB110＝pUB110的复制起点；neo＝pUB110的新霉素抗性基因；Plat＝来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶的转录启动子；Pre-LAT＝来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶的信号肽；SAMY 425ss＝平截Amy TS-23基因序列的编码区(用本研究中表达的各个平截Amy TS-23变体编码区取代)；和终止子＝来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶的转录终止子。
淀粉酶表达——2mL规模。
含有AmyTS23t表达载体的枯草芽孢杆菌克隆用96孔钢复制器复制，从甘油储存液转移至96孔培养板(BD，353075)(含有150μL的LB培养基和10μg/ml新霉素)中，在湿盒中，37℃，220转/分钟生长过夜。从过夜培养物中取100μL等分试样，用于接种5mL塑料培养管中的2000μL含10μg/mL新霉素的确定成分培养基。培养基是基于MOPS缓冲液的强化的半确定成分培养基，含有尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并补充有1％大豆蛋白胨和5mM钙用于强壮细胞生长。37℃，250rpm下孵育培养管72小时。孵育之后，3000×g，10分钟离心培养液。上清液移入15mL聚丙烯圆锥管中，各个样品取80μL加入96孔板中用于蛋白质定量。
杆菌物种AmyTS23t组合电荷库(Combinatorial Charge Library)的生成。
从存在的库中选择具有感兴趣的多种物理性质的多个蛋白质变体，或通过本领域已知的定点诱变技术产生这些蛋白质变体(参见例如美国专利申请序列号10/576,331、11/581,102和11/583,334)。然后在目的检测中检验这一套定义的探测蛋白质。
AmyTS23t是杆菌属TS-23α-淀粉酶的平截形式(参见Lin等人，1998，Production and properties of a raw-starch-degrading amylase from thethermophilic and alkaliphilic Bacillus sp.TS-23，Biotechnol.Appl.Biochem.28：61-68)。在本文中示出了AmyTS23t在多种蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌株(degUHy32，oppA，spoII3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，aprE，nprE，epr，ispA，bpr，vpr，wprA，mpr-ybfJ，nprB)(还参见US公开号20050202535A1)中的表达。分离自转化的枯草芽孢杆菌细胞的AmyTS23t质粒DNA送至DNA2.0公司(Menlo Park，CA)用作CCL构建的模板。要求DNA 2.0通过引入下列7个突变至AmyTS23t来制备亲本构建体用于CCL，其因而称为AmyTS23t-7mut，这7个突变是：Q98R，M201L，S243Q，R309A，Q320R，Q359E和K444E。变体作为96孔板中的甘油储存液提供。然后要求DNA2.0公司在表9-1中所示的AmyTS23t-7mut淀粉酶中的四个位点的每一个处生成位置库。
通过识别AmyTS23t-7mut中的下列四个残基设计该AmyTS23t-7mut组合电荷库：Gln 87，Asn225，Asn272和Asn282。通过形成各个位点的三种可能(野生型、精氨酸或天冬氨酸)的所有组合，形成四位点、81成员的CCL。
表9-1.AmyTS23t-7mut CCL变体
| 变体# | Q87 | N225 | N272 | N282 | Δ电荷 |
| 亲本1 | - | - | - | - | 0 |
| 2 | Q87E | N225E | N272E | N282E | -4 |
| 3 | Q87E | N225E | N272E | N282R | -2 |
| 4 | Q87E | N225E | N272E | - | -3 |
| 5 | Q87E | N225E | N272R | N282E | -2 |
| 6 | Q87E | N225E | N272R | N282R | 0 |
| 7 | Q87E | N225E | N272R | - | -1 |
| 8 | Q87E | N225E | - | N282E | -3 |
| 9 | Q87E | N225E | - | N282R | -1 |
| 10 | Q87E | N225E | - | - | -2 |
| 11 | Q87E | N225R | N272E | N282E | -2 |
| 12 | Q87E | N225R | N272E | N282R | 0 |
| 13 | Q87E | N225R | N272E | - | -1 |
| 14 | Q87E | N225R | N272R | N282E | 0 |
| 15 | Q87E | N225R | N272R | N282R | +2 |
| 16 | Q87E | N225R | N272R | - | +1 |
| 17 | Q87E | N225R | - | N282E | -1 |
| 18 | Q87E | N225R | - | N282R | +1 |
| 19 | Q87E | N225R | - | - | 0 |
| 20 | Q87E | - | N272E | N282E | -3 |
| 21 | Q87E | - | N272E | N282R | -1 |
| 22 | Q87E | - | N272E | - | -2 |
| 23 | Q87E | - | N272R | N282E | -1 |
| 变体# | Q87 | N225 | N272 | N282 | Δ电荷 |
| 24 | Q87E | - | N272R | N282R | +1 |
| 25 | Q87E | - | N272R | - | 0 |
| 26 | Q87E | - | - | N282E | -2 |
| 27 | Q87E | - | - | N282R | 0 |
| 28 | Q87E | - | - | - | -1 |
| 29 | Q87R | N225E | N272E | N282E | -2 |
| 30 | Q87R | N225E | N272E | N282R | 0 |
| 31 | Q87R | N225E | N272E | - | -1 |
| 32 | Q87R | N225E | N272R | N282E | 0 |
| 33 | Q87R | N225E | N272R | N282R | +2 |
| 34 | Q87R | N225E | N272R | - | +1 |
| 35 | Q87R | N225E | - | N282E | -1 |
| 36 | Q87R | N225E | - | N282R | +1 |
| 37 | Q87R | N225E | - | - | 0 |
| 38 | Q87R | N225R | N272E | N282E | 0 |
| 39 | Q87R | N225R | N272E | N282R | +2 |
| 40 | Q87R | N225R | N272E | - | +1 |
| 41 | Q87R | N225R | N272R | N282E | +2 |
| 42 | Q87R | N225R | N272R | N282R | +4 |
| 43 | Q87R | N225R | N272R | - | +3 |
| 44 | Q87R | N225R | - | N282E | +1 |
| 45 | Q87R | N225R | - | N282R | +3 |
| 46 | Q87R | N225R | - | - | +2 |
| 47 | Q87R | - | N272E | N282E | -1 |
| 48 | Q87R | - | N272E | N282R | +1 |
| 49 | Q87R | - | N272E | - | 0 |
| 50 | Q87R | - | N272R | N282E | +1 |
| 51 | Q87R | - | N272R | N282R | +3 |
| 52 | Q87R | - | N272R | - | +2 |
| 53 | Q87R | - | - | N282E | 0 |
| 54 | Q87R | - | - | N282R | +2 |
| 55 | Q87R | - | - | - | +1 |
| 56 | - | N225E | N272E | N282E | -3 |
| 变体# | Q87 | N225 | N272 | N282 | Δ电荷 |
| 57 | - | N225E | N272E | N282R | -1 |
| 58 | - | N225E | N272E | - | -2 |
| 59 | - | N225E | N272R | N282E | -1 |
| 60 | - | N225E | N272R | N282R | +1 |
| 61 | - | N225E | N272R | - | 0 |
| 62 | - | N225E | - | N282E | -2 |
| 63 | - | N225E | - | N282R | 0 |
| 64 | - | N225E | - | - | -1 |
| 65 | - | N225R | N272E | N282E | -1 |
| 66 | - | N225R | N272E | N282R | +1 |
| 67 | - | N225R | N272E | - | 0 |
| 68 | - | N225R | N272R | N282E | +1 |
| 69 | - | N225R | N272R | N282R | +3 |
| 70 | - | N225R | N272R | - | +2 |
| 71 | - | N225R | - | N282E | 0 |
| 72 | - | N225R | - | N282R | +2 |
| 73 | - | N225R | - | - | +1 |
| 74 | - | - | N272E | N282E | -2 |
| 75 | - | - | N272E | N282R | 0 |
| 76 | - | - | N272E | - | -1 |
| 77 | - | - | N272R | N282E | 0 |
| 78 | - | - | N272R | N282R | +2 |
| 79 | - | - | N272R | - | +1 |
| 80 | - | - | - | N282E | -1 |
| 81 | - | - | - | N282R | +1 |
实施例10
性能参数
稻米微样片检测。
如本文其他部分所述制备测试洗涤剂。使用的仪器包括：New Brunswick Innova 4230摇床/培养箱和SpectraMAX(340型)MTP读数器。MTP购自Corning(3641型)。带有橙色色素的陈化稻米淀粉的样片(CS-28)来自检测材料中心(荷兰Vlaardingen)。先用水洗涤该织物，然后切为0.25英寸的圆形微样片。96孔微滴定板的每个孔中放入两个微样片。在20℃(北美)或40℃(西欧)平衡检测洗涤剂。向包含微样片的MTP的各个孔中加入190μL洗涤剂溶液。向该混合物中加入10μL稀释的酶溶液。用粘合箔密封MTP，将其放置于培养箱中，在所需测试温度下(通常20℃或40℃)750rpm振荡1小时。孵育后，每孔取150μL溶液，转移到新的MTP中。用SpectraMax MTP读数器在488nm对该MTP读数，以定量清洁效果。包括空白对照，以及含有微样片和洗涤剂但没有酶的对照。
洗涤剂热灭活
商品洗涤剂制剂的热灭活用来破坏任何蛋白质成分的酶活性，而保留其非酶成分的性质。因此，该方法适应于制备用于检测本发明的组合物和方法的酶变体的商购洗涤剂。对于北美(NA)和西欧(WE)的强效液体洗衣(HDL)洗涤剂，通过将预称重的液体洗涤剂(玻璃瓶中)在95℃水浴中放置2小时来进行热灭活。北美(NA)和日本(JPN)强效颗粒洗衣(HDG)洗涤剂的热灭活的孵育时间需要8小时，西欧(WE)HDG洗涤剂需要5小时。热灭活NA和WE自动餐具洗涤剂(ADW)的孵育时间是8小时。洗涤剂购自当地超市。通过在5分钟的洗涤剂溶解中检测未热处理和热处理后的洗涤剂来精确测定灭活的百分比。用1mg/mL AAPF的AAPF实验检测酶活性。
从热灭活的储存液制备洗涤剂工作液用于检测热灭活洗涤剂中的酶活性。向该洗涤剂溶液中加入适量水硬度(6gpg或12gpg)和缓冲剂，以满足所需条件(表10-1)。涡旋或颠倒试剂瓶来混合该溶液。
*简写：宝洁公司(P&G)；和Reckitt Benckiser(RB).
酶性能的计算。
用空白值(即，在酶不存在的情况在孵育微样片得到的值)校正得到的吸光度。得到的吸光度是水解活性的量度。结果示于表10-2和10-3中。用如上所述的热灭活洗涤剂估计酶性能。“胜出者”定义为具有大于1的性能指数(PI)的那些。PI是突变体残余活性与野生型残余活性的比值。
表10-2：TS23t-7mut CCL-CS-28稻米微样片胜出者，汰渍2x
| 变体# | 87 | 225 | 272 | 282 | 相对电荷 | PI |
| 11 | Q87E | N225R | N272E | N282E | -2 | 1.24 |
| 12 | Q87E | N225R | N272E | N282R | 0 | 1.20 |
| 13 | Q87E | N225R | N272E | -1 | 1.16 | |
| 14 | Q87E | N225R | N272R | N282E | 0 | 1.15 |
| 17 | Q87E | N225R | N282E | -1 | 1.34 | |
| 18 | Q87E | N225R | N282R | 1 | 1.26 | |
| 19 | Q87E | N225R | 0 | 1.34 |
| 20 | Q87E | N272E | N282E | -3 | 1.17 | |
| 21 | Q87E | N272E | N282R | -1 | 1.34 | |
| 22 | Q87E | N272E | -2 | 1.13 | ||
| 变体# | 87 | 225 | 272 | 282 | 相对电荷 | PI |
| 27 | Q87E | N282R | 0 | 1.22 | ||
| 28 | Q87E | -1 | 1.22 | |||
| 29 | Q87R | N225E | N272E | N282E | -2 | 1.44 |
| 30 | Q87R | N225E | N272E | N282R | 0 | 1.15 |
| 31 | Q87R | N225E | N272E | -1 | 1.36 | |
| 35 | Q87R | N225E | N282E | -1 | 1.15 | |
| 40 | Q87R | N225R | N272E | 1 | 1.27 | |
| 44 | Q87R | N225R | N282E | 1 | 1.38 | |
| 45 | Q87R | N225R | N282R | 3 | 1.21 | |
| 47 | Q87R | N272E | N282E | -1 | 1.65 | |
| 48 | Q87R | N272E | N282R | 1 | 1.52 | |
| 49 | Q87R | N272E | 0 | 1.28 | ||
| 50 | Q87R | N272R | N282E | 1 | 1.10 | |
| 53 | Q87R | N282E | 0 | 1.47 | ||
| 54 | Q87R | N282R | 2 | 1.25 | ||
| 55 | Q87R | 1 | 1.51 | |||
| 64 | N225E | -1 | 1.15 |
| 65 | N225R | N272E | N282E | -1 | 1.26 | |
| 66 | N225R | N272E | N282R | 1 | 1.22 | |
| 67 | N225R | N272E | 0 | 1.19 | ||
| 74 | N272E | N282E | -2 | 1.21 | ||
| 76 | N272E | -1 | 1.13 | |||
| 80 | N282E | -1 | 1.27 | |||
| 81 | N282R | 1 | 1.49 |
表10-3：TS-23t-7mut CCL CS-28稻米淀粉微样片胜出者，Persil
| 变体# | 87 | 225 | 272 | 282 | 相对电荷 | PI |
| 4 | Q87E | N225E | N272E | 0 | -3 | 1.13 |
| 6 | Q87E | N225E | N272R | N282R | 0 | 1.11 |
| 9 | Q87E | N225E | N282R | -1 | 1.20 | |
| 10 | Q87E | N225E | 0 | -2 | 1.17 | |
| 11 | Q87E | N225R | N272E | N282E | -2 | 1.41 |
| 变体# | 87 | 225 | 272 | 282 | 相对电荷 | PI |
| 13 | Q87E | N225R | N272E | 0 | -1 | 1.40 |
| 14 | Q87E | N225R | N272R | N282E | 0 | 1.28 |
| 15 | Q87E | N225R | N272R | N282R | 2 | 1.13 |
| 16 | Q87E | N225R | N272R | 0 | 1 | 1.17 |
| 17 | Q87E | N225R | N282E | -1 | 1.51 |
| 18 | Q87E | N225R | N282R | 1 | 1.47 | |
| 19 | Q87E | N225R | 0 | 0 | 1.48 | |
| 20 | Q87E | N272E | N282E | -3 | 1.46 | |
| 21 | Q87E | N272E | N282R | -1 | 1.40 | |
| 22 | Q87E | N272E | 0 | -2 | 1.42 | |
| 25 | Q87E | N272R | 0 | 0 | 1.18 | |
| 26 | Q87E | N282E | -2 | 1.54 | ||
| 27 | Q87E | N282R | 0 | 1.47 | ||
| 28 | Q87E | 0 | -1 | 1.40 | ||
| 29 | Q87R | N225E | N272E | N282E | -2 | 1.46 |
| 30 | Q87R | N225E | N272E | N282R | 0 | 1.59 |
| 31 | Q87R | N225E | N272E | 0 | -1 | 1.14 |
| 34 | Q87R | N225E | N272R | 0 | 1 | 1.29 |
| 35 | Q87R | N225E | N282E | -1 | 1.47 | |
| 36 | Q87R | N225E | N282R | 1 | 1.62 | |
| 37 | Q87R | N225E | 0 | 0 | 1.53 | |
| 38 | Q87R | N225R | N272E | N282E | 0 | 1.13 |
| 39 | Q87R | N225R | N272E | N282R | 2 | 1.13 |
| 40 | Q87R | N225R | N272E | 0 | 1 | 1.17 |
| 41 | Q87R | N225R | N272R | N282E | 2 | 1.31 |
| 44 | Q87R | N225R | N282E | 1 | 1.26 |
| 47 | Q87R | N272E | N282E | -1 | 1.45 | |
| 48 | Q87R | N272E | N282R | 1 | 1.50 | |
| 49 | Q87R | N272E | 0 | 0 | 1.17 | |
| 50 | Q87R | N272R | N282E | 1 | 1.16 | |
| 53 | Q87R | N282E | 0 | 1.21 | ||
| 54 | Q87R | N282R | 2 | 1.30 | ||
| 变体# | 87 | 225 | 272 | 282 | 相对电荷 | PI |
| 55 | Q87R | 0 | 1 | 1.33 | ||
| 56 | N225E | N272E | N282E | -3 | 1.29 | |
| 57 | N225E | N272E | N282R | -1 | 1.12 | |
| 58 | N225E | N272E | 0 | -2 | 1.41 | |
| 59 | N225E | N272R | N282E | -1 | 1.16 | |
| 61 | N225E | N272R | 0 | 0 | 1.20 | |
| 66 | N225R | N272E | N282R | 1 | 1.27 | |
| 67 | N225R | N272E | 0 | 0 | 1.34 | |
| 71 | N225R | N282E | 0 | 1.17 | ||
| 73 | N225R | 0 | 1 | 1.12 | ||
| 74 | N272E | N282E | -2 | 1.29 | ||
| 75 | N272E | N282R | 0 | 1.24 | ||
| 76 | N272E | 0 | -1 | 1.20 | ||
| 78 | N272R | N282R | 2 | 1.18 |
| 79 | N272R | 0 | 1 | 1.11 | ||
| 80 | N282E | -1 | 1.11 | |||
| 81 | N282R | 1 | 1.33 |
实施例11
组合的LAS/螯合剂稳定性
本实施例描述了在含有阴离子表面活性剂和螯合剂的反应介质中测定蛋白质电荷与稳定性的关系。将待测淀粉酶在0.1％LAS(十二烷基苯磺酸钠)和10mM EDTA存在下孵育，通过如上所述的BODIPY方法测量残余活性来测量LAS稳定性。使用BODIPY-淀粉实验来测定加压和未加压(stressed and unstressed)样品的α-淀粉酶活性。加压板的残余LAS和EDTA不影响BODIPY-淀粉实验。
使用的试剂包括：对照缓冲液(50mM HEPES，0.005％Tween-80，pH8.0)和加压缓冲液(50mM HEPES，0.1％(w/v)LAS(十二烷基苯磺酸钠盐，Sigma D-2525)，10mM EDTA，pH8.0)。将酶变体(20ppm)以1∶20稀释入含有对照缓冲液或加压缓冲液的96孔未结合平底板中，并混合。对照板在室温孵育，而加压板则立即放置到37℃，30-60分钟(取决于待测酶的稳定性)。孵育之后，以用于淀粉酶的BODIPY-淀粉实验测定酶活性。残余或剩余活性的分数等于加压样品的反应速率除以对照样品的反应速率。在对照缓冲液中亲本酶和变体都能够稳定60分钟。
表11-1列出了具有增强的LAS/EDTA稳定性的变体的数据，对于含有80个变体的库来说，这些数据是相对于野生型TS-23t-7mut的净电荷改变的函数。根据实施例2所述的方法设计和构建这个库，以涵盖相对于亲本TS-23t-7mut分子的几个净电荷。性能指数(PI)大于1说明变体在这种淀粉底物(玉蜀黍淀粉)上比S242Q亲本具有更高的比活性。
表11-1：TS23t-7mut CCL-LAS/EDTA稳定性胜出者
对于ASP和FNA，其LAS/EDTA稳定性具有电荷依赖性(参见WO/2008/153925，2008年6月6日提交，Genencor代理目录号30974WO-2)。加入负电荷增加稳定性。但是，即使比亲本多了一个或两个正电荷，在我们的方法中，也可能发现电荷突变的排列赋予了比亲本更高的稳定性或者与亲本相同的稳定性。对于更大的酶，例如图13中所示的TS23t′，该方法也有效，加入正电荷对稳定性的不利影响可以被增加稳定性的优化电荷排列所抵偿掉。
上文中提及的所有公开和专利均引入作为参考。各种不背离本发明的精神和范围的修改和改变对本领域技术人员来说是明显的。虽然已经联系具体优选实施方式说明了本发明的组合物和方法，应理解本发明的组合物和方法不应当不适当地限于这些具体实施方式。实际上，那些对于本领域技术人员来说显而易见的实施本发明的组合物和方法的上述方式的各种修改，而且应落入所附权利要求书的范围内。
Claims (23)
1.一种亲本AmyTS-23α-淀粉酶的变体，其中所述变体具有与亲本α-淀粉酶至少80％的同一性的氨基酸序列，而且包括下列特征中的至少两种：
a)C末端的平截；
b)残基201的取代；
c)残基R180和S181的缺失，
其中所述氨基酸残基位置参照SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的变体，其中所述变体具有α-淀粉酶活性。
3.如权利要求1或2所述的变体，其中所述变体具有与亲本α-淀粉酶至少90％的同一性。
4.如权利要求3所述的变体，其中所述变体具有与亲本α-淀粉酶至少95％的同一性。
5.一种亲本AmyTS-23α-淀粉酶的变体，其中所述变体具有与亲本α-淀粉酶至少85％的同一性的氨基酸序列，而且包括C末端的平截。
6.如权利要求5所述的变体，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
7.如权利要求5或6所述的变体，其中所述变体比亲本淀粉酶在冷水中具有提高了的去除淀粉污渍的清洁活性。
8.如权利要求5或6所述的变体，进一步包括R180和S181位置残基的缺失，其中所述氨基酸残基位置参照SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的变体，其中所述变体与亲本淀粉酶相比具有提高的洗涤剂稳定性。
10.如权利要求5或6所述的变体，进一步包括201位置残基的取代，其中所述氨基酸残基位置参照SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的变体，其中所述变体与亲本淀粉酶相比具有提高的氧化稳定性。
12.如权利要求10或11所述的变体，其中所述取代是M201L。
13.如前述任一项权利要求所述的变体，其中所述亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
14.如前述任一项权利要求所述的变体，进一步包括在选自由残基87、残基225、残基272和残基282组成的组中的一个或多个残基处的取代。
15.编码前述任一项权利要求所述变体的核酸。
16.包含在适宜启动子控制下的权利要求15所述核酸的表达载体。
17.包含权利要求16所述表达载体的宿主细胞。
18.一种手洗或自动洗涤餐具的组合物，该组合物包含权利要求1-14中任一项所述的变体和下列物质中的一种或多种：表面活性剂、洗涤剂增效剂、络合剂、聚合物、漂白***、稳定剂、发泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污物悬浮剂、防尘污再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶增溶剂、晦暗抑制剂和香味剂。
19.衣物洗涤剂添加剂，包含如权利要求1-14中任一项所述的变体和下列物质中的一种或多种：表面活性剂、洗涤剂增效剂、络合剂、聚合物、漂白***、稳定剂、发泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污物悬浮剂、防尘污再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶增溶剂、荧光增白剂、织物调节剂和香味剂。
20.一种从织物去除淀粉的方法，包括：在亲本AmyTS23α-淀粉酶的变体存在下孵育织物，其中所述变体具有与亲本α-淀粉酶至少80％同一性的氨基酸序列，并包含下列特征中的至少两种：
(a)C-末端的平截，
(b)残基201的取代，或
(c)残基R180和S181的缺失，
其中所述氨基酸残基位置参照SEQ ID NO：1的氨基酸序列，而且
其中上述孵育从该织物去除了淀粉。
21.一种加工淀粉的方法，所述方法包括在亲本AmyTS23α-淀粉酶的变体存在下孵育织物，其中该变体具有与该亲本α-淀粉酶至少80％同一性的氨基酸序列，并包含下列特征中的至少两种：
(a)C-末端的平截，
(b)残基201的取代，或
(c)残基R180和S181的缺失，
其中所述氨基酸残基位置参照SEQ ID NO：1的氨基酸序列，而且
其中所述孵育水解了所述淀粉。
22.一种从织物去除淀粉的方法，包括在如权利要求1-14中任一项所述的变体存在下孵育织物，其中所述孵育从该织物去除了淀粉。
23.一种加工淀粉的方法，包括在如权利要求1-14中任一项所述的变体存在下孵育织物，其中所述孵育水解了所述淀粉。
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