JP2011188863A - アスペルギルス変異体細胞におけるポリペプチドの生産方法 - Google Patents
アスペルギルス変異体細胞におけるポリペプチドの生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011188863A JP2011188863A JP2011103808A JP2011103808A JP2011188863A JP 2011188863 A JP2011188863 A JP 2011188863A JP 2011103808 A JP2011103808 A JP 2011103808A JP 2011103808 A JP2011103808 A JP 2011103808A JP 2011188863 A JP2011188863 A JP 2011188863A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aspergillus
- toxin
- mutant
- polypeptide
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/248—Xylanases
- C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/66—Aspergillus
- C12R2001/69—Aspergillus oryzae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【解決手段】着目のポリペプチドの生産方法であって、(a) 親のアスペルギルス細胞の変異体を培養し、ここで(i) 前記変異体は前記ポリペプチドをコードする第一の核酸配列を含んでなり、そして(ii) 前記変異体は同一条件下で培養した時に少なくとも1つの着目の毒素を親のアスペルギルス細胞よりも少量生産し;そして(b) 培地から前記ポリペプチドを単離することを含んでなる方法を提供する。また、アスペルギルス細胞の変異体、並びに該変異体細胞の獲得方法も提供する。
【選択図】なし
Description
最近、非相同(異種)ポリペプチドの発現に組換え宿主細胞を利用することにより、他の方法では少量しか得られないかまたは天然源からの精製によってしか得られない商業的に価値あるポリペプチド、例えば工業的に重要な酵素や二次代謝産物、の大量生産が大幅に簡素化した。現在、ある特定のポリペプチドの生産のために選択される発現系には、真正細菌および真核宿主をはじめとする多様な選択肢がある。適当な発現系の選択は、しばしば所望の組成とコンホメーションを有するポリペプチドを生産する宿主細胞の能力に依存するだけでなく、大抵は、タンパク質の意図する最終用途によっても左右される。
上記のおよび他の態様は下記の記載においてより詳細に説明されるだろう。
定義
本願の目的上、本発明のより良い理解のために次の用語を定義する。
「ベクター」なる用語は、着目のポリペプチド(その前駆体形を含む)をコードする遺伝子またはDNA配列の挿入、増殖および発現を可能にするプラスミド、コスミド、ファージまたは他の任意媒介物を意味する。
「変異体」宿主(または株)なる用語は、野生型株の変異体と形質転換体の両方を包含する、遺伝的に変更された株を意味する。
本発明は、親細胞に比較して有意に減少したレベルの1または複数の毒素を発現させるために遺伝的に変更されている、着目のポリペプチドの発現に有用なアスペルギルス宿主細胞の変異体を提供する。宿主細胞は親細胞から誘導されるが、野生型細胞であってもよい。
本発明の宿主細胞の上記例は、現在受け入れられている生物分類学に従って命名される。
本発明に従ってその生産を減少または除去しようとする毒素は、アスペルギルス属により生産されるか、またはアスペルギルス属が所有する遺伝子によりコードされるが必ずしも発現されなくてもよい、いずれの毒素であってもよい。例えば、アフラトキシン遺伝子はA.オリゼ中に存在するが、この種からは発現されないことが知られている。しかしながら、たとえそれらが発現されなくても、アフラトキシン経路遺伝子を除去することはまだ有利である場合がある。これは下記に説明され、実施例6に例示される。
本発明は、(a) 配列番号2のアミノ酸配列を有するジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼ;(b) (a) の対立遺伝子変異体;および(c) ジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼ活性を有する(a)または(b)の断片からなる群より選ばれる、糸状菌から得られる単離されたジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼにも関する。
1または複数の毒素の発現レベルを有意に減少させるために本発明の宿主細胞は遺伝的に変更されるが、それは当業者に既知の標準技術を使って達成することができる。毒素活性の生産の原因となる遺伝子配列を不活性化するかまたは部分的にもしくは完全に除去することができる。こうして、本発明のアスペルギルス変異体宿主細胞は、減少したレベルまたは検出不可能なレベルの1または複数の毒素を発現する。
本発明の方法により、或る1または複数の標的毒素の量は有意に減少されるが、その一方で着目のポリペプチドをコードする遺伝的に変更された遺伝子の細胞内安定維持、細胞の生産能力、および着目のポリペプチドの収率の点からの変異体宿主細胞の特徴は実質的に保持される。より詳しくは、本発明の方法により、宿主細胞は1または複数の着目の毒素の生産または分泌に必要な構造領域および/または調節領域の内部で遺伝的に変更され、それにより前記毒素の生産または分泌が減少または除去される。
所望の最終生成物、すなわちアスペルギルス変異体宿主細胞により発現される着目のポリペプチドは、いずれの相同または非相同タンパク質またはペプチドであってもよい。
アフラトキシンの生合成経路はアフラトキシン産生種であるアスペルギルス・フラーブスおよびアスペルギルス・パラシチクスにおいて研究されている。どちらの種も、多数の遺伝子が同定されそして大クラスターとしてマッピングされることが示されている〔Woloshuk, C.P. & Prieto, R., FEMS Microbiology Letter (1998) 160:169-176〕。別経路遺伝子の発現調節遺伝子をコードする遺伝子であるaflR、およびO−メチルトランスフェラーゼをコードするomtAといった幾つかの遺伝子はクローニングされ、そして配列決定されている。
材料と方法
1.菌株
アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)A1560はIFO 04177と同一である(下記参照)。
アスペルギルス・オリゼ IFO 4177:Institute for Fermentation, Osaka(財団法人発酵研究所;大阪府淀川区十三本町2丁目17−25)より入手可能。WO 98/12300参照。
JaL228:中性メタロプロテアーゼ NpI遺伝子が破壊されているアスペルギルス・オリゼ株;この株の作製はWO 98/12300に記載されている。
BECh 2:このCPA陰性KA陰性アスペルギルス・オリゼ株の作製は実施例1に記載される。
BECh 3:このCPA陰性KA陰性アスペルギルス・オリゼ株の作製は実施例1に記載される。
JaL 250:このアスペルギルス・オリゼ株の作製は実施例6に記載される。
プラスミドpJaL499を含有するE.コリ株は、1999年1月13日にDSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH;Mascheroder Weg 1b, D-38124 Brauschweig)に寄託され、そして寄託番号DSM 12622を付与された。
DMAT-S:この遺伝子は、麦角アルカロイドの生合成に関与する酵素であるジメチルアリル−L−トリプトファンシンターゼをコードする。
DCAT-S:この遺伝子は、シクロピアゾン酸(CPA)生合成に関与する酵素であるジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼをコードする。
pyrG:この遺伝子は、ウリジン生合成に関与する酵素であるオロチジン−5′−リン酸デカルボキシラーゼをコードする。
pAHL:このプラスミドはWO 97/07202に記載されている。
pCaHj483:このプラスミドはWO 98/00529に記載されている。
pCaHj493:このプラスミドは実施例2に記載される。
pJaL335:このプラスミドはWO 98/12300に記載されている。
pJaL499:このプラスミドは実施例4に記載される。
緩衝液および基質として使用する薬品は少なくとも試薬用品質のものであった。
スクリーニング培地1(1リットルあたり)
マンニトール 30 g
グルコース 10 g
コハク酸 10 g
カザミノ酸 3 g
KH2PO4 1 g
MgSO4・7H2O 0.3 g
FeSO4・7H2O 0.2 g
2,6−ジクロロ−4−アニリン 2 ppm
寒天 20 g
14% NH4OHで最終pH 5.6に調整。
Cove塩溶液 50 ml
ソルビトール 218 g
デキストロース 10 g
硝酸カリウム 2.02 g
寒天 35 g
脱イオン水 1000 ml
KCl 26 g
MgSO4 26 g
KH2PO4 76 g
微量金属溶液 50 ml
CHCl3 2 ml
Na2B4O7・10H2O 40 mg
CuSO4・5H2O 400 mg
FeSO4・7H2O 800 mg
MnSO4・2H2O 800 mg
Na2MoO4・2H2O 800 mg
ZnSO4・7H2O 8000 mg
酵母エキス 18 g
グリセロール87% 24 ml
プルロニック PE6100 1 ml
水道水で 1000 mlに
マルトース 9 g
MgSO4・7H2O 0.2 g
NaCl 0.2 g
K2SO4 0.4 g
KH2PO4 2.4 g
酵母エキス 1.4 g
AMG微量金属 0.1 ml
プルロニック PE6100 0.02 ml
脱イオン水 1000 mlに
最終pH 5.0;接種前に1.0 mlの50%尿素を添加する。
マルトデキストリン MD01 45.0 g
MgSO4・7H2O 1.0 g
NaCl 1.0 g
K2SO4 2.0 g
KH2PO4 12.0 g
酵母エキス 7.0 g
AMG微量金属 0.5 ml
プルロニック PE6100 1 ml
最終pH 5.0;接種前に100 ml培地あたり1.3 mlの50%尿素を添加する。
FeSO4・7H2O 13.9 g
MnSO4・H2O 8.45 g
ZnCl2 6.8 g
CuSO4・5H2O 2.5 g
NiCl2・6H2O 2.5 g
クエン酸 ≧3.0 g
微量金属溶液 1 ml
酵母エキス 2.5 g
KH2PO4 10 g
MgSO4・7H2O 0.5 g
KCl 0.5 g
FeSO4 0.01 g
グルコース 100 g
最終pHを6.0に調整
固形プレートで使用する前に、KMZ培地を20 g/l寒天で凝固させる。
コロニー増殖制限剤として300 μl/lのTriton X-100を添加する。
ショ糖 50 g
ペプトン 20 g
KH2PO4 5 g
CaHPO4 2.5 g
MgSO4 2.5 g
最終pHを6.0に調整。
A.HPキャピラリー電気泳動によるCPAについてのアッセイ方法
Supelclean LC-18 SPEチューブ(2 mlのメタノールと2 mlのMilli-Q水でコンディショニングした、カタログNo.5-7012のSupelco社製プレパック3 mlカラム)上での固相抽出により、キャピラリー電気泳動(CE)用に試料の1mlアリコートを調製する。溶液をカラムに強制的に流すために吸引マニホールドを使用する。3 mlのMilli-Q水で洗浄した後、3 mlのメタノールを用いて試料を溶離させる。更に後処理せずに、溶出液をCE分析にかける。場合により形成した沈澱を遠心により除去する。
1.平板培養物の分析
寒天プラグはFiltenborg O., Frisvad J.C. & Svendsen J.A.: "Simple Screening Method for Mold Producing Intracellular Mycotoxins in Pure Cultures", Applied and Environmental Microbiology (1983) 45:581-585に記載された通りに分析する。
上清の10μl試料をTLCプレート(Merck Silica Gel 60)の対角の縁に適用する。メタノール:クロロホルム(容量で1:2)混合物中に50 ppm, 25 ppm, 5 ppmおよび2.5 ppmに溶解希釈したシクロピアゾン酸(Sigma C 1530)を標準として使用する。まずプレートをCAP(クロロホルム:アセトン:プロパン−2−オール=容量で85:15:20)中で15分間展開し、乾燥し、次いで上下逆反転して、もう半分をTEF(トルエン:酢酸エチル:蟻酸=容量で5:4:1)中で15分間展開する。
プレートをヒュームフード中で完全に(1時間)乾燥させた後、エールリッヒ試薬(85 mlの96%エタノール中に溶かした2 gの4−ジメチルアミノベンズアルデヒドに、37%塩酸を添加したもの)を噴霧する。
この分析の全感度は(抽出なしで)約0.5〜1ppm CPAであり;抽出を使うと感度が少なくとも10倍高まる。
メタノールと10 mMホウ酸/NaOH, 4 M KCl, pH 9.1でコンディショニングしたSupelclean LC-18 SPEチューブ(カタログNo.5-7012のSupelco社製プレパック3 mlカラム)上での固相抽出により、CE分析用に試料の1〜3mlアリコートを調製する。溶液をカラムに強制的に流すために吸引マニホールドを使用する。3 mlの10 mMホウ酸/NaOH, 4 M KCl pH 9.1と0.3 mlの10 mM ホウ酸/NaOH pH 9.1で洗浄した後、7.5 mlの10 mMホウ酸/NaOH pH 9.1を用いて試料を溶離させる。更に後処理せずに、シクロピアゾン酸について上述した手順に準じて溶出液をCE分析にかける。場合により形成した沈澱を遠心により除去する。この方法の感度の下限は約6ppmである。
試料のアリコートをCPAについて上述したのと同様にTLCプレートの対角の端に適用し、CPAと同じ溶媒系を使って展開する。乾燥したプレートに0.1 M HCl中の1%FeCl3を噴霧する。試料中のコウジ酸の存在は赤色スポットにより示され、対照として適用した純粋なコウジ酸によって生じた赤色スポットの強度と比較される。検出の下限は50 ppmである。
キャピラリー電気泳動(CE)分析への準備としての試料精製の必要性は試料の伝導度に依存する。伝導度が10 mS未満である場合、溶出緩衝液として0.1 M KClを使ったVarian SAXアニオン交換体(Varian Instrumetns, Palo Alto CA)上でのイオン交換により試料を精製する。伝導度が100 mSより大きい場合、2−ブタノールを使って試料を抽出する。その場合、酸性化/高塩処理による沈澱形成と、10 mM Tris/HCl pH 7.0中への沈澱の再溶解の後、2mlの試料を6 mlのブタノールで抽出する。
CPAについて記載したのと同様にTLCプレートに発酵液のスポットを適用しそして展開する。次いでW. Majak & R.J. Bose, "Chromatographic methods for the isolation of miserotoxin and the detection of aliphatic nitro compounds", Phytochemistry (1974) 13:1005-1010により記載された通りに、それらにジアゾ化p−ニトロアニリンを噴霧する。対照物質に対比したスポットの強度と位置が3−NPA濃度の尺度である。TLCプレート上での検出レベルは25〜50 ppmである。
A.A.オリゼ BZ 14由来のCPA陰性株の作製
アスペルギルス・オリゼ BZ14株の凍結乾燥胞子に1000 Gy〜1250 Gyの最適線量でγ線を照射し、次いでその胞子を25〜50コロニー/9 cmプレートの密度においてスクリーニング培地1上に接種した。シクロピアゾン酸を生産するコロニーは、赤色の不溶性CPA−Fe錯体を形成するためスクリーニング培地1上に赤色の裏面(コロニーの下側)を生成する。
JaL228の凍結乾燥胞子を上記と同様にγ線照射しそしてスクリーニングした。推定上のCPA欠失分離株を毒素誘発条件(34℃、250 rpmで5日間)下でMDU-1B培地上で振盪フラスコ培養し、そして上清をTLC法によりCPAについて分析した。上清はそのままでまたは抽出液として試験した。
BECh 1を含む3つの株(分離株)がCPAを生産しなかった。
BECh 1をCove N斜面上で培養した。胞子を0.01%Tween 中に3-5×106の密度に懸濁し、短波UV照射(殺菌灯からの254 nm)にかけた。1〜5%生存率を生じるUV線量で照射した胞子をその後のスクリーニングに使用した。
濃赤色の発色はコウジ酸(KA)生産を示し;発色がないのはコウジ酸生産を欠くコロニーを示す。
BECh2株とBECh3株それぞれを上述したようなUV変異誘発にかけた。照射した胞子を96ウエルマイクロタイタープレート中で0.7生存胞子/100μlナカムラ培地の密度に希釈した。湿潤チャンバー中で30℃にて5〜7日間インキュベートした。
A.オリゼ株 JAL228およびBECh 1中でのリパーセ遺伝子の発現
A.プラスミド pCaHj493の作製
リパーゼプラスミド pAHL (WO 97/07202)をBamHIとSalIで消化し、得られたリパーゼをコードする916 bp断片を単離した。
WO 98/00529に記載のpCaHj 483をBamHIとXhoIで消化し、6757 bpベクター断片を上記リパーゼ断片と連結せしめた。その連結混合物を用いてE.コリ DH5α細胞を形質転換せしめ、そして所望のプラスミドを含有する形質転換体を単離した。得られたプラスミドをpCaHj 493と命名した。
ヨーロッパ特許出願第0531372号に記載のようなアセトアミド上での選択を使って、pCaHj493によりアスペルギルス・オリゼ株 JaL228およびBECh1を形質転換せしめた。形質転換体を2回胞子再分離した。各形質転換体の2回目の再分離からの胞子を、振盪フラスコ中とマイクロタイター皿培養においてリパーゼ生産について試験した。
A.CPA陰性A.オリゼ株とCPA陽性A.オリゼ株におけるリパーゼ生産
実施例2に記載のように調製した18個のJaL228形質転換体と30個のBECh 1形質転換体を振盪フラスコ培養においてリパーゼ生産について調べた。
検出可能なCPA生産を示さない10個の株(実施例1Aで調製したもの)とCPAが検出可能である3個の株をキシラナーゼ生産について評価した。その結果を下記の表1に要約する。2列目の欄は、単純放射状免疫拡散法〔Scand, J. Immunol. Vol.17, suppl. 10, 41-56 (1983), "Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques", N.H. Axelsen編、Blackwell Scientific Publications, 1983〕によりアッセイした時の真菌キシラナーゼ単位(FXU)で測定した振盪フラスコ培養で生産されたキシラナーゼの量を示す。
2つのCPA陰性KA陰性株、BECh 2とBECh 3を実施例2に記載の通りにプラスミド pCaHj 493により形質転換せしめた。得られた形質転換体を2回胞子分離した。各形質転換体の2回目の再分離からの胞子を実施例2に記載の通りにリパーゼ生産について試験した。
A.オリゼDCAT-S遺伝子の同定およびゲノムクローニング
A.A.オリゼのジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼ(DCAT-S)遺伝子の同定
cDNAクローン(pJaL499)は配列番号1に示すDNA配列を含有する。それはクラビセプス・プルプレア(Claviceps purpurea)のジメチルアリルトリプトファンシンターゼ(DMAT-S)遺伝子に対する相同性により、CPA生合成に関連することが同定されている。A.オリゼcDNAクローンの配列決定は、それが長さ1393塩基対(配列番号1)であり、クラビセプス・プルプレア由来のDMAT-Sと42.1%同一である473アミノ酸ポリペプチド(配列番号2)をコードすることを示した。
JaL228株とBECh 1株から染色体DNAを調製した。DNAをBglII, NcoI, XhoIおよびSpeIで消化し、そしてプローブとしてDCAT-S遺伝子を含むpJaL499由来の1kb 32P標識BglII DNA断片を使ってサザンブロッティングにより分析した。サザンブロット分析は、CPA生産株JaL228が1つのDCAT-S遺伝子を有し、一方でBECh 1ではそのDCAT-S遺伝子が染色体から欠失していることを示した。
次の制限酵素:EcoRI, SalI, BbuI, XhoIおよびXbaIを使って、プローブとしてDCAT-S遺伝子を含むpJaL499由来の1kb 32P標識BglII DNA断片を使って、A.オリゼ DCAT-S遺伝子のゲノム制限地図作成を行った(図1)。これは、DCAT-S遺伝子の唯一のコピーが存在することを示す。
アスペルギルス・オリゼのジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼ(DCAT-S)の遺伝子破壊によるアスペルギルス・オリゼCPA陰性株の作製
選択マーカーとしてA.オリゼ pyrG遺伝子を使って、A.オリゼのpyrG陰性株中のDCAT-S遺伝子を一段階遺伝子置換法〔B.L. Miller他,Mol. Cell. Biol. (1985) 5:1714-1721;G. May, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, 1-25頁, J.R. Kinghorn & G. Turner編, Blakie Academic and Professional, 1992〕により破壊した。
プラスミドpJaL499をSacIIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、そして製造業者(Boehringer Mannheim)の教示に従って細菌アルカリ性ホスファターゼで処理して5′リン酸基を除去し、次いでフェノール抽出しそして沈澱させた。
A.オリゼ株 JaL228を5−フルオロオロト酸に対する耐性についてスクリーニングし、自然pyrG変異体を同定した。JaL250と命名した1つの株がpyrG陰性であると同定された。この変異体はウリジン依存性であるので、それを野生型pyrG遺伝子を用いて形質転換し、そしてウリジンの非存在下での増殖能力により形質転換体を選択することができる。
プラスミド pDCAT-S-pyrGの4.9 kb NotI-EcoRI断片をゲル精製し、Christensen他、Biotechnology (1988) 6:1419-1422により記載された通りA.オリゼ株 JaL250を形質転換せしめるのに使った。次いでウリジン非存在下でのそれの増殖能力により形質転換体を選択した。2回再分離した後、実施例1に記載の通りにCPAを生産する能力について形質転換体をスクリーニングした。
BECh1とBECh2がアフラトキシン生合成経路クラスターからの2つの遺伝子を欠くことの確証
A.オリゼ IFO 4177およびそれの多数の誘導体においてアフラトキシン生合成経路クラスター由来のaflRおよびomtAアフラトキシン遺伝子の存在を探求した。プライマー5956(5'-GGATCCAGGGCTCCCTGGAG-3')(配列番号3)と5955(5'-CCTGACCAGCCAGATCTCCT-3')(配列番号4)を使ったPCRにより、A.オリゼ IFO4177のゲノムDNAからaflR相同体を単離した。0.9 kb PCR断片を獲得し、それをInvitrogenから入手したベクター pCR2中にクローニングした。M13正(-40)プライマーと逆プライマーを使って、得られたプラスミド pToC280を配列分析することにより、クローン化断片の素性を確認した。また、プライマー 6120(5'-AGTGAGAGAACTCCCTCCTC-3')(配列番号5)と6121(5'-CCATATCTTCTCAGTCTCCA-3')(配列番号6)を使ったPCRにより、ゲノム IFO4177 DNAからomtA相同体を単離した。1.2 kb断片を得、それをInvirtogenからのベクターpCR2中にクローニングし、そして得られたプラスミド pToC276をM13正(-40)および逆プライマーを使って配列分析することにより、クローン化断片の素性を確認した。
Claims (42)
- 着目のポリペプチドの生産方法であって、
(a) 親のアスペルギルス細胞の変異体を培養し、ここで(i) 前記変異体は前記ポリペプチドをコードする第一の核酸配列を含んでなり、そして(ii) 前記変異体は同一条件下で培養した時に少なくとも1つの着目の毒素を親のアスペルギルス細胞よりも少量生産し;そして
(b) 培地から前記ポリペプチドを単離する
ことを含んでなる方法。 - 前記変異体が、1または複数の毒素の生合成または分泌の原因となる少なくとも1つの遺伝子の変更の結果として前記毒素を少量生産する、請求項1に記載の方法。
- 前記変異体が同一条件下で培養した時に前記毒素を親細胞よりも少なくとも約90%少なく生産する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記毒素がシクロピアゾン酸、コウジ酸、3−ニトロプロピオン酸、エモジン、マルフォルミン、アフラトキシン、オクラトキシンおよびセカロン酸からなる群より選ばれる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異体が同一条件下で培養した時にシクロピアゾン酸と少なくとも第二の毒素を親のアスペルギルス細胞よりも少量生産する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二の毒素がコウジ酸またはアフラトキシンである、請求項5に記載の方法。
- 前記変異体が同一条件下で培養した時に更に3−ニトロプロピオン酸を親のアスペルギルス細胞よりも少量生産する、請求項5または6に記載の方法。
- 前記アスペルギルス細胞がアスペルギルス亜群ユーロチウム、ケトサルトリア、スクレロクレイスタ、サトイア、ネオサルトリア、ヘミカーペンテレス、ペトロミセス、エメリセラおよびフェネリアからなる群より選ばれる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記着目のポリペプチドがアスペルギルス宿主細胞にとって生来である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記着目のポリペプチドが、同一条件下で培養した時に、親のアスペルギルス宿主細胞による発現に比較してアスペルギルス変異体宿主細胞により過剰発現される、請求項9に記載の方法。
- 前記着目のポリペプチドがアスペルギルス宿主細胞にとって非相同である、請求項10に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、ホルモンまたはそれの前駆体形、酵素もしくは酵素変異体またはそれの前駆体形、抗体またはそれの機能性断片、レセプターまたはそれの機能性断片、およびレポーターからなる群より選ばれる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素がアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ペクチナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼおよびキシラナーゼからなる群より選ばれる、請求項12に記載の方法。
- 着目の非相同ポリペプチドの生産に有用な毒素欠失アスペルギルス変異体宿主細胞であって、同一条件下で培養した時にアスペルギルス親細胞に比較して少なくとも1つの毒素をより少量生産させるために該細胞が遺伝的に変更されていることを特徴とする変異体細胞。
- 着目のポリペプチドをコードする第一の核酸配列と、前記毒素の生合成または分泌の原因となる少なくとも1つの遺伝子の変更を含んでなる第二の核酸配列とを含んでなる、請求項14に記載の変異体細胞。
- 前記細胞が前記第一の核酸配列の少なくとも2コピーを含んでなる、請求項14または15に記載の変異体細胞。
- 前記着目のポリペプチドが前記変異体細胞にとって生来である、請求項14〜16のいずれか一項に記載の変異体細胞。
- 前記着目のポリペプチドが前記変異体細胞にとって非相同である、請求項14〜16のいずれか一項に記載の変異体細胞。
- 前記毒素がシクロピアゾン酸、コウジ酸、3−ニトロプロピオン酸、エモジン、マルフォルミン、アフラトキシン、オクラトキシンおよびセカロン酸からなる群より選ばれる、請求項13〜18のいずれか一項に記載の変異体細胞。
- 前記毒素が、シクロピアゾン酸である第一の毒素と、コウジ酸、3−ニトロプロピオン酸およびアフラトキシンからなる群より選ばれる第二の毒素とを含んでなる、請求項13〜19のいずれか一項に記載の変異体細胞。
- 請求項13〜20のいずれか一項に記載の毒素欠失アスペルギルス変異体宿主細胞を獲得する方法であって、前記細胞は少なくとも1つの着目の毒素の生産を欠いており、(a) 親細胞を突然変異誘発にかけそして(b) 着目の毒素の生産が減少または除去されている変異体細胞についてスクリーニングすることを含んでなる方法。
- 前記突然変異誘発がランダムである、請求項21に記載の方法。
- 前記突然変異誘発が特異的であり、そして前記着目の毒素の生産または分泌に関係しており且つそれに必要であるヌクレオチド配列を変更するように行われる、請求項22に記載の方法。
- 前記毒素の生合成または分泌の原因である少なくとも1つの遺伝子の変更を含んでなる核酸配列を、アスペルギルス宿主細胞中の対応する生来の遺伝子との相同組換えを媒介する条件下で、前記遺伝子を不活性化するようにアスペルギルス宿主細胞中に導入し、それにより前記生来の遺伝子と不活性な変更遺伝子との置換を引き起こす、請求項23に記載の方法。
- 着目のポリペプチドをコードする核酸配列をアスペルギルス親宿主細胞中に導入することを更に含んでなる、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記着目のポリペプチドがアスペルギルス細胞にとって生来である、請求項25に記載の方法。
- 前記着目のポリペプチドがアスペルギルス細胞にとって非相同である、請求項25に記載の方法。
- 請求項13〜20のいずれか一項に記載の毒素欠失アスペルギルス変異体宿主細胞を獲得する方法であって、(a) 着目のポリペプチドをコードする第一の核酸配列と、少なくとも1つの毒素の生合成または分泌の原因である少なくとも1つの遺伝子の変更を含んでなる第二の核酸配列とを、アスペルギルス親宿主細胞中に導入し;そして(b) 段階(a)から前記第一および第二の核酸配列を含んでなる変異体を同定することを含んで成る方法。
- 前記第一および第二の核酸配列の導入の前または後にアスペルギルス親宿主細胞を突然変異誘発にかけることを更に含んでなる、請求項28に記載の方法。
- 前記突然変異誘発が、特異的もしくはランダム突然変異誘発、PCR作製突然変異誘発、部位特異的DNA欠失、挿入および/または置換、遺伝子破壊または置換技術、並びにアンチセンス技術からなる群より選ばれる1または複数の方法により達成される、請求項29に記載の方法。
- 配列番号1に記載のものと実質的に同じ、ジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼをコードする核酸配列。
- 糸状菌宿主株における類似遺伝子の破壊のための、請求項31に記載の核酸配列またはそれの活性断片の使用。
- 前記糸状菌宿主株がアスペルギルス、トリコデルマ、ペニシリウムおよびフザリウム種からなる群より選ばれる、請求項32に記載の使用。
- アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)株より得られる単離されたジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼであって、
(a) 実質的に配列番号2のアミノ酸配列を有するジメチルアリル−シクロアセチル−L−トリプトファンシンターゼ;
(b) (a) の対立遺伝子変異体;および
(c) ジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼ活性を有する、(a)または(b)の断片
からなる群より選ばれる、単離されたジメチルアリル−シクロアセトアセチル−L−トリプトファンシンターゼ。 - 1または複数のサイレント毒素遺伝子が除去されている、非相同ポリペプチドの発現に適当な変異体アスペルギルス細胞。
- 前記1または複数の毒素遺伝子の全部または一部の不可逆的欠失または破壊により1または複数の毒素遺伝子が除去されている、請求項35に記載の変異体。
- 前記アスペルギルス細胞がアスペルギルス亜群ユーロチウム、ケトサルトリア、スクレロクレイスタ、サトイア、ネオサルトリア、ヘミカーペンテレス、ペトロミセス、エメリセラおよびフェネリアからなる群より選ばれる、請求項35または36のいずれか一項に記載の変異体。
- 前記毒素遺伝子が、シクロピアゾン酸、コウジ酸、3−ニトロプロピオン酸、エモジン、マルフォルミン、アフラトキシン、オクラトキシンおよびセカロン酸からなる群より選ばれる1または複数の毒素をコードする、請求項35〜37のいずれか一項に記載の変異体。
- 問題の前記毒素遺伝子がアフラトキシンをコードする、請求項35〜38のいずれか一項に記載の変異体。
- 前記毒素遺伝子がA.オリゼのアフラトキシンクラスターからの遺伝子であり、特にomtA, aflR, pksA, Nor-1, fas-beta, fas-alpha, vber-1, avnA, ord-2からなる群より選ばれる、請求項35〜39のいずれか一項に記載の変異体。
- 親のアスペルギルス細胞がA.オリゼ、特にA.オリゼ A1560 (IFO 0417)である、請求項40に記載の変異体。
- 前記アフラトキシン遺伝子がomtAおよびaflRから成る群より選ばれる、請求項41に記載の変異体。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA199801726 | 1998-12-23 | ||
DKPA199801726 | 1998-12-23 | ||
DKPA199900745 | 1999-05-27 | ||
DKPA199900745 | 1999-05-27 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000591212A Division JP2002533133A (ja) | 1998-12-23 | 1999-12-22 | アスペルギルス変異体細胞におけるポリペプチドの生産方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011188863A true JP2011188863A (ja) | 2011-09-29 |
JP5453343B2 JP5453343B2 (ja) | 2014-03-26 |
Family
ID=26064565
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000591212A Withdrawn JP2002533133A (ja) | 1998-12-23 | 1999-12-22 | アスペルギルス変異体細胞におけるポリペプチドの生産方法 |
JP2011103808A Expired - Lifetime JP5453343B2 (ja) | 1998-12-23 | 2011-05-06 | アスペルギルス変異体細胞におけるポリペプチドの生産方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000591212A Withdrawn JP2002533133A (ja) | 1998-12-23 | 1999-12-22 | アスペルギルス変異体細胞におけるポリペプチドの生産方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1141371B1 (ja) |
JP (2) | JP2002533133A (ja) |
CN (1) | CN100529096C (ja) |
AT (1) | ATE414782T1 (ja) |
AU (1) | AU1774000A (ja) |
DE (1) | DE69939947D1 (ja) |
DK (1) | DK1141371T3 (ja) |
ES (1) | ES2317706T3 (ja) |
WO (1) | WO2000039322A1 (ja) |
Families Citing this family (79)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003070957A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Novozymes A/S | Plant polypeptide production |
EP1886582B1 (en) | 2002-10-11 | 2015-01-14 | Novozymes A/S | Method of preparing a heat-treated product |
WO2004090549A1 (en) * | 2003-04-11 | 2004-10-21 | Novozymes A/S | Method of screening for secreted glycosylated polypeptides |
WO2004097012A2 (en) | 2003-04-28 | 2004-11-11 | Novozymes A/S | Phospholipase and method of producing it |
EP1678296B1 (en) | 2003-10-23 | 2011-07-13 | Novozymes A/S | Protease with improved stability in detergents |
WO2006053565A2 (en) | 2004-11-19 | 2006-05-26 | Novozymes A/S | Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same |
JP5452869B2 (ja) | 2004-12-22 | 2014-03-26 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | デンプン加工法 |
EP2410048B1 (en) | 2005-01-24 | 2016-08-10 | DSM IP Assets B.V. | Method for producing a compound of interest in a filamentous fungal cell |
EP1739428A1 (en) * | 2005-07-01 | 2007-01-03 | Institut Pasteur | In vitro diagnostic method and kit for an aspergillus infection |
US7858360B2 (en) | 2005-10-17 | 2010-12-28 | Novozymes A/S | Use of fungal mutants for expression of antibodies |
ES2534282T3 (es) | 2006-06-29 | 2015-04-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Un método para lograr la expresión polipeptídica mejorada |
WO2008008950A2 (en) | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Novozymes, Inc. | Methods for producing secreted polypeptides having biological activity |
JP5410981B2 (ja) * | 2007-10-19 | 2014-02-05 | 公益財団法人野田産業科学研究所 | ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子 |
EP2358878B1 (en) | 2008-11-20 | 2014-10-15 | Novozymes Inc. | Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
CA2749353A1 (en) | 2009-01-21 | 2010-07-29 | Novozymes A/S | Polypeptides having esterase activity and nucleic acids encoding the same |
BRPI1013483B1 (pt) | 2009-03-24 | 2019-04-24 | Novozymes A/S | Construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir o polipeptídeo, para degradar um xilano acetilado e para produzir um produto de fermentação, e, composição |
AU2010241099A1 (en) | 2009-04-22 | 2011-10-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for the production of a recombinant polypeptide of interest |
EP2421965B1 (en) | 2009-04-24 | 2016-05-25 | DSM IP Assets B.V. | Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof |
EP2456872B1 (en) | 2009-07-22 | 2017-08-30 | DSM IP Assets B.V. | Improved host cell for the production of a compound of interest |
WO2011039319A1 (en) | 2009-09-30 | 2011-04-07 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
CA2780179A1 (en) | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Novozymes, Inc. | Compositions for saccharification of cellulosic material |
EP2496692B1 (en) | 2009-11-06 | 2016-03-16 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same |
WO2011057086A1 (en) | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
EA201201126A1 (ru) | 2010-02-11 | 2013-05-30 | ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. | Полипептид, обладающий активностью целлобиогидролазы, и его применение |
CA2789301A1 (en) | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Dsm Ip Assets B.V. | Host cell capable of producing enzymes useful for degradation of lignocellulosic material |
CN103068988A (zh) | 2010-06-25 | 2013-04-24 | 诺维信公司 | 具有启动子活性的多核苷酸 |
EP2585601A1 (en) | 2010-06-25 | 2013-05-01 | Novozymes A/S | Polynucleotides having promoter activity |
WO2011161206A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Novozymes A/S | Polynucleotides having leader sequence function |
CA2803986C (en) | 2010-06-29 | 2019-04-23 | Dsm Ip Assets B.V. | Polypeptide having or assisting in carbohydrate material degrading activity and uses thereof |
AU2011273689B2 (en) | 2010-06-29 | 2014-08-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Polypeptide having carbohydrate degrading activity and uses thereof |
AU2011273688B2 (en) | 2010-06-29 | 2014-10-30 | Versalis S.P.A. | Polypeptide having beta-glucosidase activity and uses thereof |
WO2012000888A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-05 | Dsm Ip Assets B.V. | Polypeptide having acetyl xylan esterase activity and uses thereof |
EA201300058A1 (ru) | 2010-06-29 | 2013-06-28 | ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. | Полипептид, обладающий бета-глюкозидазной активностью, и его применение |
BR112012033396A2 (pt) | 2010-06-29 | 2015-06-23 | Dsm Ip Assets Bv | Polipetídeo tendo atividade swollenin e seus usos. |
DK2588604T3 (en) | 2010-06-30 | 2016-09-26 | Novozymes Inc | Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding them |
CA2803222A1 (en) * | 2010-07-01 | 2012-01-05 | Dsm Ip Assets B.V. | A method for the production of a compound of interest |
EP2603594B1 (en) | 2010-08-12 | 2018-04-25 | Novozymes, Inc. | Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a bicyclic compound and uses thereof |
WO2012030811A1 (en) | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
WO2012030844A1 (en) | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
DK2638153T3 (en) | 2010-11-12 | 2017-10-16 | Novozymes Inc | POLYPEPTIDES WITH ENDOGLUCANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM |
WO2012103288A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
CN103517985B (zh) | 2011-01-26 | 2016-12-07 | 诺维信公司 | 具有纤维二糖水解酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸 |
WO2012103322A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
WO2012103350A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
EP2668268B1 (en) | 2011-01-26 | 2017-05-31 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
EP3339442B1 (en) | 2011-03-09 | 2022-05-11 | Novozymes A/S | Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide |
US9926547B2 (en) | 2011-04-28 | 2018-03-27 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
US9624518B2 (en) | 2011-04-29 | 2017-04-18 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
EP2527448A1 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-28 | Novozymes A/S | Simultaneous site-specific integrations of multiple gene-copies in filamentous fungi |
CN102321700A (zh) * | 2011-08-03 | 2012-01-18 | 无锡赛德生物工程有限公司 | 一种曲酸发酵工艺及发酵设备 |
CN103890169A (zh) | 2011-08-24 | 2014-06-25 | 诺维信股份有限公司 | 烟曲霉纤维素分解酶组合物及其用途 |
US10308921B2 (en) | 2011-10-31 | 2019-06-04 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
BR112014012165A2 (pt) | 2011-11-21 | 2020-06-23 | Novozymes, Inc. | Variante de um polipeptídeo gh61, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, método para produção de uma variante de um polipeptídeo gh61, processos para degradação ou conversão de um material celulósico, para produção de um produto de fermentação, e para fermentação de um material celulósico, composição enzimática, formulação de caldo completo, ou composição de cultura celular, composição detergente, e método de limpeza ou lavagem de uma superfície dura ou roupa. |
WO2013163590A2 (en) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | Novozymes, Inc. | Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same |
BR112015004701B1 (pt) | 2012-09-05 | 2022-06-14 | Novozymes A/S | Composição, uso de um polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira de expressão recombinante, métodos para produção de um polipeptídeo, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, e para tratamento de proteínas, composição de ração animal, aditivo de ração animal, e, ração animal |
EP2898068A2 (en) | 2012-09-19 | 2015-07-29 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
DK2903412T3 (da) | 2012-10-08 | 2019-12-16 | Novozymes As | Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem |
US20150275194A1 (en) | 2012-10-24 | 2015-10-01 | Novozymes A/S | Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same |
US9765373B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-09-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
EP2964760B1 (en) | 2013-03-08 | 2021-05-12 | Novozymes A/S | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
CA2910239A1 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Novozymes A/S | Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same |
BR112017004251A2 (pt) | 2014-09-05 | 2017-12-12 | Novozymes As | variantes de módulos de ligação a carboidrato e polinucleotídeos que os codificam |
DK3234143T3 (da) | 2014-12-19 | 2023-09-04 | Novozymes As | Sammensætninger omfattende polypeptider med xylanaseaktivitet og polypeptider med arabinofuranosidaseaktivitet |
WO2016138167A2 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | Novozymes A/S | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
CN116676293A (zh) | 2015-05-27 | 2023-09-01 | 国投生物科技投资有限公司 | 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸 |
CN108350044B (zh) | 2015-09-22 | 2022-05-24 | 诺维信公司 | 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸 |
WO2018226171A2 (en) * | 2017-06-07 | 2018-12-13 | Ptt Global Chemical Public Company Limited | Mutant strain aspergillus aculeatus for producing cellulase and xylanase and preparation method thereof |
AU2018319349B2 (en) | 2017-08-25 | 2024-02-29 | Novozymes A/S | Enzyme assisted crude palm oil extraction |
WO2019185535A1 (en) | 2018-03-26 | 2019-10-03 | Novozymes A/S | Fungal chaperone proteins |
CN108753748B (zh) * | 2018-06-08 | 2021-12-10 | 中国中医科学院中药研究所 | 大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT75R2及其编码基因与应用 |
CN108795903B (zh) * | 2018-06-08 | 2020-12-15 | 南京林业大学 | 一种高酶活淀粉酶的表达方法 |
CN108823178B (zh) * | 2018-06-08 | 2021-12-10 | 中国中医科学院中药研究所 | 大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT73BE5及其编码基因与应用 |
BR112021011384A2 (pt) | 2018-12-12 | 2022-05-17 | Novozymes As | Polipeptídeo isolado, composição de enzimas, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, método de produção de um polipeptídeo, planta, parte da planta ou célula da planta transgênica, e, processos para degradação de um material celulósico ou hemicelulósico, para produção de um produto de fermentação e de fermentação de um material celulósico ou hemicelulósico |
US20220073898A1 (en) | 2018-12-21 | 2022-03-10 | Novozymes A/S | Tandem Protein Expression |
CN110218750B (zh) * | 2019-04-24 | 2023-04-11 | 郑州轻工业学院 | 杂色曲霉菌株在发酵生产曲酸中应用 |
CN110108874B (zh) * | 2019-04-30 | 2022-09-20 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析试纸条、制备及其应用 |
CN110106152B (zh) * | 2019-04-30 | 2021-08-17 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 杂交瘤细胞株ytt-2及其产生的抗环匹阿尼酸单克隆抗体 |
EP4004211A1 (en) | 2019-07-25 | 2022-06-01 | Novozymes A/S | Filamentous fungal expression system |
CN111139189B (zh) * | 2020-01-14 | 2022-04-19 | 浙江工业大学 | 曲霉wbx-38及其在生产环匹阿尼酸中的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09500543A (ja) * | 1993-12-01 | 1997-01-21 | ノボ ノルディスク バイオテック,インコーポレイティド | アスペルギルス発現システム |
JPH09505481A (ja) * | 1993-12-01 | 1997-06-03 | ノボ ノルディスク バイオテック,インコーポレイティド | アスペルギルス・フェティダス発現系 |
WO1998011203A1 (en) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Cells having dna insertion mutations which produce altered amounts of a polypeptide |
WO1998012300A1 (en) * | 1996-09-19 | 1998-03-26 | Novo Nordisk A/S | Novel host cells and methods of producing proteins |
-
1999
- 1999-12-22 CN CNB99815766XA patent/CN100529096C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-22 ES ES99960956T patent/ES2317706T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-22 DE DE69939947T patent/DE69939947D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-22 JP JP2000591212A patent/JP2002533133A/ja not_active Withdrawn
- 1999-12-22 AT AT99960956T patent/ATE414782T1/de active
- 1999-12-22 DK DK99960956T patent/DK1141371T3/da active
- 1999-12-22 AU AU17740/00A patent/AU1774000A/en not_active Abandoned
- 1999-12-22 WO PCT/DK1999/000726 patent/WO2000039322A1/en active Application Filing
- 1999-12-22 EP EP99960956A patent/EP1141371B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-05-06 JP JP2011103808A patent/JP5453343B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09500543A (ja) * | 1993-12-01 | 1997-01-21 | ノボ ノルディスク バイオテック,インコーポレイティド | アスペルギルス発現システム |
JPH09505481A (ja) * | 1993-12-01 | 1997-06-03 | ノボ ノルディスク バイオテック,インコーポレイティド | アスペルギルス・フェティダス発現系 |
WO1998011203A1 (en) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Cells having dna insertion mutations which produce altered amounts of a polypeptide |
WO1998012300A1 (en) * | 1996-09-19 | 1998-03-26 | Novo Nordisk A/S | Novel host cells and methods of producing proteins |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE414782T1 (de) | 2008-12-15 |
DK1141371T3 (da) | 2009-02-02 |
DE69939947D1 (de) | 2009-01-02 |
CN100529096C (zh) | 2009-08-19 |
EP1141371A1 (en) | 2001-10-10 |
CN1333837A (zh) | 2002-01-30 |
JP5453343B2 (ja) | 2014-03-26 |
ES2317706T3 (es) | 2009-04-16 |
EP1141371B1 (en) | 2008-11-19 |
AU1774000A (en) | 2000-07-31 |
WO2000039322A1 (en) | 2000-07-06 |
JP2002533133A (ja) | 2002-10-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5453343B2 (ja) | アスペルギルス変異体細胞におけるポリペプチドの生産方法 | |
US5958727A (en) | Methods for modifying the production of a polypeptide | |
US6066493A (en) | Morphological mutants of filamentous fungi | |
EP1266011B1 (en) | Fungal transcriptional activator useful in methods for producing polypeptides | |
US20080213901A1 (en) | Methods for producing heterologous polypeptides in trichothecene-deficient filamentous fungal mutant cells | |
US20110236928A1 (en) | Methods for producing polypeptides in enzyme-deficient mutants of fusarium venenatum | |
JP2002539793A (ja) | 菌類細胞中で遺伝子を発現させるためのプロモーター | |
US20080274500A1 (en) | Promoter variants for expressing genes in a fungal cell | |
JP2011101651A (ja) | オキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠陥真菌宿主細胞 | |
US5989889A (en) | Nucleic acids encoding polypeptides having tripeptide aminopeptidase activity | |
JP4563585B2 (ja) | ポリペプチドの生成方法において有用な菌類転写活性化因子 | |
US7241614B2 (en) | Methods for producing polypeptides in Aspergillus mutant cells | |
WO1999060136A1 (en) | Methods for producing polypeptides in filamentous fungal mutant cells | |
JP2019501646A (ja) | Clr1活性が低減した糸状菌においてタンパク質を生産する方法 | |
WO2003070957A2 (en) | Plant polypeptide production | |
EP1144658B1 (en) | Methods for producing polypeptides in cyclohexadepsipeptide-deficient cells | |
US6903193B1 (en) | Methods for producing heterologous polypeptides in trichothecene-deficient filamentous fungal mutant cells | |
CN113056552A (zh) | 经修饰的丝状真菌宿主细胞 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130108 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130404 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130409 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130708 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130806 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131106 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131203 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140106 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5453343 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |