CN108795903B

CN108795903B - 一种高酶活淀粉酶的表达方法

Info

Publication number: CN108795903B
Application number: CN201810735301.7A
Authority: CN
Inventors: 金锋杰; 张智敏; 庄淼; 王宝腾
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2038-07-05
Also published as: CN108795903A

Abstract

本发明公开了一种高酶活淀粉酶的表达方法，先敲除米曲霉中的AO090701000363基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。本发明通过同源重组将米曲霉中的AO090701000363基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AO090701000363敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，试验结果证实：AO090701000363的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第3天，AO090701000363敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的1.5倍左右，后续两天缺陷株的活性是参照菌株的2倍之多。

Description

一种高酶活淀粉酶的表达方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种高酶活淀粉酶的表达方法。

背景技术

淀粉酶是酶制剂中用途最广、消费量最大的一种。主要用于面包生产中的面团改良(降低面团粘度、加速发酵进程、增加糖含量、缓和面包老化)；婴幼儿食品中谷类原料的预处理；啤酒制造；工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生物制剂等多种领域。米曲霉被美国FDA及世界卫生组织列为食品级安全菌株(GRAS)，是工业上淀粉酶的重要来源。通过基因敲除手段选育出更高酶产量的米曲霉，有助于米曲霉在工业上更好的应用。

淀粉是自然界最丰富的原料之一，是人类食物的重要成分，淀粉很容易从植物中获得，价格低廉。淀粉利用的关键是通过淀粉酶降解为可发酵的葡萄糖等可发酵性糖。根据作用的方式可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中。

米曲霉应用历史悠久，随着人类发展生活所需，获得高产淀粉酶的菌株，降低淀粉酶的生产成本成为淀粉酶工业化利用的必由之路，选育优良的菌株是酶制剂产业的核心问题。米曲霉相对于植物和哺乳动物具有较强的蛋白质分泌、合成能力以及快速生长，易培养等优点，与大肠杆菌和酵母相比也具有强大的翻译后修饰功能，被认为是生产淀粉酶最有应用前景的菌株之一。目前获得优良的高产量菌株，通常采用诱变和基因工程构建基因工程菌株等方法。诱变方法简单成本低，但是具有一定的随机性，因此基因工程技术手段是未来选育高产量菌株的一个有效方法，特别的米曲霉的全基因组的破译更促进了基因工程技术的应用。发展安全、通用、高效、规模化表达***，是全面提高酶制剂产业技术水平的战略必争之地，对于酶制剂产业实现变革性突破具有十分重要的意义。

米曲霉中淀粉酶转录激活因子AmyR在淀粉或麦芽糖的诱导下会激活下游淀粉酶的表达，而CreA和CreB参与调控淀粉酶转录因子AmyR的表达。米曲霉淀粉酶生产的瓶颈在于：在米曲霉培养后期存在着反抑制调控，其会抑制米曲霉淀粉酶的生产，虽然这方面有研究通过删除单creA和双creA/creB基因片段，一定程度上提高了在高浓度培养后期的淀粉酶活性，但效果不是很明显。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高酶活淀粉酶的表达方法，通过同源重组将米曲霉中的AO090701000363基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AO090701000363敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种高酶活淀粉酶的表达方法，先敲除米曲霉中的AO090701000363基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。

所述的高酶活淀粉酶的表达方法，通过同源重组将米曲霉中的AO090701000363基因用选择标记基因pyrG代替，从而实现AO090701000363敲除。

所述的高酶活淀粉酶的表达方法，具体步骤如下：

1)利用PrimeStar PCR聚合酶扩增并获得AO090701000363基因两侧片段和pyrG基因；

2)将AO090701000363基因两侧片段与pyrG基因融合；

3)将融合基因转化入E-F1菌株，利用选择性培养基进行至少两次分离纯化，然后提取基因组，进行Southern blot鉴定；

4)培养阳性菌株，获得高活性淀粉酶。

步骤1)中，AO090701000363基因两侧片段为：AO090701000363 L，基因序列如SEQID NO.1所示，AO090701000363 R，基因序列如SEQ ID NO.2所示；pyrG基因的序列如SEQ IDNO.3所示。

步骤1)中，PCR体系：25μL的primestar Mix酶；上游引物、下游引物各2μL；1μLA.oryzae RIB40基因组DNA；加入水至50μL；具体引物序列见下表：

步骤1)中，PCR条件：98.0℃ 10s；98.0℃ 10s，55.0℃ 15s，72.0℃2min20s，35次循环；72.0℃5min；16.0℃保存。

步骤2)中，利用fusion PCR进行融合，基因加入摩尔浓度比：AO090701000363 L∶pyrG∶AO090701000363 R＝1∶3∶1。

步骤2)中，PCR体系：primestar Mix 25μL；上游引物，下游引物各加2μL；按浓度比加入模板；加水定容至50μL。

步骤2)中，两步法：98.0℃ 10s；98.0℃ 10s，68.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存；

三步法：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存。

步骤3)中，转化过程如下：Solution1，使用0.45μm过滤灭菌到新的50mL灭菌tube中；将培养的米曲霉用漏斗过滤，用水冲一下把培养基冲走，用药匙挤一下把水挤下；用药匙把菌体放入1中配置的Solution0+1中，用封条裹上tube，30℃ 50rpm 3h；制冰；过滤，取液体；加Solution2 10mL，上下混合；将tube取出在4℃下离心2000rpm 8min，取沉淀；加5mLSolution2混匀4℃下离心2000rpm 8min上清液丢弃；视沉淀量加Solution2，分装各200μL×4；分别加10μL质粒，用一次性吸管混匀；放冰上30min，在此期间将CD选择培养基放微波炉溶后，倒入50mL的tub中，放45℃中保温；30min后分3次加入Solution3：250μL混匀；250μL混匀；850μL混匀；在室温中放置20min；加入5mL Solution2混匀后4℃下离心2000rpm 8min将上清液丢弃；加入500μLSolution2混匀，加入10mL CD上层培养基混匀后倒平板；在CD培养基30℃环境下3-5天避光培养。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过同源重组将米曲霉中的AO090701000363基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AO090701000363敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，试验结果证实：AO090701000363的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第3天，AO090701000363敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的1.5倍，并且在后期培养中，敲除菌株的酶活性均高于对比菌株2倍之多。

附图说明

图1是AO090701000363基因敲除原理图；

图2是基因片段的0.8％琼脂糖凝胶电泳图；

图3是融合基因的0.8％琼脂糖凝胶电泳图；

图4是southern blot验证结果图；

图5是米曲霉淀粉酶酶活性测定图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

一种高酶活淀粉酶的表达方法，流程图如图1所示，通过同源重组将米曲霉中的AO090701000363基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AO090701000363敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，图中标出的SmaI酶切位点及probe探针位置用于Southern blot验证。具体步骤如下：

1)利用PrimeStar PCR聚合酶(TaKaRa，Japan)扩增AO090701000363基因两侧片段(AO090701000363 L，基因序列如SEQ ID NO.1所示；AO090701000363 R，基因序列如SEQ IDNO.2所示)和pyrG基因(基因序列如SEQ ID NO.3所示)，主要过程如下：

PCR体系：25μL的primestar Mix酶；上游引物、下游引物各2μL(具体引物序列见表1)；1μL A.oryzae RIB40(日本(财团法人)野田产业科学研究所赠送)基因组DNA；加入水至50μL。

表1具体引物序列

PCR条件：98.0℃ 10s；98.0℃ 10s，55.0℃ 15s，72.0℃ 2min20s，35次循环；72.0℃5min；16.0℃保存。

2)电泳确定，结果如图2所示，图中三条条带：依次为AO090701000363基因ORF的左侧序列(L)、AO090701000363基因ORF的右侧序列(R)、pyrG选择标记基因，大小分别约1kb、1kb、2.2kb，说明扩增成功。

3)纯化电泳凝胶中DNA

利用kit：Takara MiniBest Agarose Gel DNA Etraction kit(TaKaRa，Japan)切胶提取DNA，主要过程如下：

准备：将干热恒温仪设定至37℃。将胶切碎加入1.5mL微量离心管中，加3倍量的Buffer GM混匀，37℃，10min(中途可拿出涡旋，以便更快溶解)；将Spin Column放到collection tube中，将上述中溶液用移液枪移到Spin Column中。12000rpm离心1min，离心结束后将下面的液体移除；加700μL Buffer WB到column中。12000rpm离心30s。离心结束后将下面的液体移除，重复该步骤；空转12000rpm离心1min；将Spin column放入新的1.5mL的tube中。加30μL水/Elution Buffer中，在室温下静置1min；12000rpm离心1min。

4)AO090701000363基因两侧片段与pyrG基因融合

利用fusion PCR进行融合，基因加入摩尔浓度比：AO090701000363L∶pyrG∶AO090701000363R＝1∶3∶1。

PCR体系：primestarMix 25μL；上游引物，下游引物各加2μL(具体引物序列见表1)；按浓度比加入模板；加水定容至50μL。

两步法：98.0℃10s；98.0℃10s，68.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存。

5)电泳确认，结果如图3所示，图中：AO090701000363基因两侧片段与pyrG基因融合片段约4.2kb，电泳图中出现4.2kb片段说明融合成功。将此片段通过使用TakaraMiniBest Agarose Gel DNA Extraction kit(TaKaRa，Japan)纯化凝胶中DNA，用于转化。

6)转化

准备：Solution0(50mM Maleate buffer pH5.5)；Solution2(1.2M Sorbitol，50mM CaCl₂，35mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.5)：Solution3(60％PEG4000，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl pH7.5)；CD上层培养基(CD培养基+1.2M Sorbitol+0.8％Agar)；CD选择培养基(0.3％NaNO₃，0.2％KCl，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.002％FeSO₄·7H₂O，2％glucose，pH 5.5)；YPD液体培养基。

前培养：YPD液体培养基培养E-F1菌株(Δku70：：ptrA，ΔAF，ΔpyrG，由日本(财团法人)野田产业科学研究所赠送)，30℃，150rpm，18-24h。

转化实验：Solution1(0.1％Yatalase，0.6M(NH₄)₂SO₄，加入10mL Solution0)，使用0.45μm过滤灭菌到新的50mL灭菌tube中；将培养的米曲霉用漏斗过滤，用水冲一下把培养基冲走(菌体白色)，用药匙挤一下把水挤下；用药匙把菌体放入1中配置的Solution0+1中，用封条裹上tube，30℃ 50rpm 3h(原生质体化)；制冰；过滤(使用一次性)，取液体；加Solution2 10mL，上下混合；将tube取出在4℃下离心2000rpm 8min(上升速率调至3’)，取沉淀；加5mL Solution2混匀4℃下离心2000rpm 8min上清液丢弃；视沉淀量加Solution2(1-5×10⁷加1mL)，分装各200μL×4；分别加10μL质粒(不超过15μL)，用一次性吸管混匀；放冰上30min，在此期间将CD选择培养基放微波炉溶后，倒入50mL的tub中，放45℃中保温；30min后分3次加入Solution3：250μL混匀；250μL混匀；850μL混匀。在室温中放置20min；加入5mL Solution2混匀后4℃下离心2000rpm 8min将上清液丢弃；加入500μLSolution2混匀，加入10mL CD上层培养基混匀后倒平板；在CD培养基30℃环境下3-5天避光培养；

7)利用选择性培养基(CD)进行至少两次分离纯化，然后提取基因组，过程如下：

准备：加Nuclei lysis solution(600μL)核酸溶出液。液氮处理，研钵研磨放入1.5mL的tube中；干式恒温器65℃处理15min，取出后冷却到手温；加3μL RNaseA 37℃ 30-60min水解RNA；加200μL protein precipitationSolution上下翻转混合20s去除蛋白质；离心12000rpm 3min将上清液移到新的1.5mL tube中；600μL PCI处理(戴手套)上下翻转混合进一步去除蛋白质等杂质(Phenol(苯酚)∶chloroform(氯仿)∶Isoamyl Alcohol(异戊醇)25∶24∶1)；离心12000rpm 3min取上清液；加600μL Isopropanol异丙醇沉淀基因；离心12000rpm 5min除去上清液取沉淀；600μL 70％乙醇清洗12000rpm 5min除去上清液取沉淀；12000rpm离心1min除去上清液，风干10min；加100μL TE溶液。

8)Southern blot

通过Southern印迹分析鉴定转化菌株，提取米曲霉菌株的基因组DNA，电泳后，将消化的基因组DNA转移到Hybond-N+膜(Amersham Biosciences，Amersham，UK)上，进行Southern杂交(Takahashi等，2004)，使用PCRDIG标记试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim，德国)构建地高辛配基(DIG)标记的探针，根据说明书(Roche Diagnostics)进行DIG***的信号杂交和检测，结果如图4所示，M为marker(λDNA/HindIII)；1为对照菌株；2、3、4均为转化株。对照株基因组DNA用BglII酶切后与探针反应的片段约为4.4kb；AO090701000363基因成功敲除的菌株基因组DNA被BglII酶切后与探针反应的片段约6.1kb。

实施例2淀粉酶活性测定

将实施例制备的2号转化株，以Control：将pyrG导入E-F1(Δku70：：ptrA，ΔAF，ΔpyrG)得到的菌株作为参照菌株，接入YPD液体培养基，45mL/瓶；分生孢子数：10⁵，30℃，150rpm条件下进行培养，3个重复。测酶活天数：2，3，4，5d。

使用淀粉酶(AMS)测试盒淀粉-碘比色法(上海纪宁)测定YPD培养基中的淀粉酶活性。

结果见图5，Control：将pyrG导入E-F1(Δku70：：ptrA，ΔAF，ΔpyrG)得到的菌株作为参照菌株；Δ363：AO090701000363敲除菌株。AO090701000363的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第3天，AO090701000363敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的1.5倍左右，后续两天缺陷株的活性是参照菌株的2倍之多。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种高酶活淀粉酶的表达方法

<130> 100

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1118

<212> DNA

<213> Aspergillus oryzae

<400> 1

gtttcgcgta taacgccttg tggtgtgata aagatcaaag agaagcacgt cttcgggtgt 60

tactatcagc ggtgcaccgt atatagtgca cccacgactg gcgttggcat cgtcagaata 120

aaaaagctga ctgcgattgc tcatcaatgg tctgctgcca cacttgatga tatctgccaa 180

ctgctaccgt ccctaggagt tgacctctag tccctgtgga gtgagtcgtc gactacctcc 240

acatagctgc ccggttacaa ccattcagct acaacaggtg ttagagctat gccattcaga 300

aggatgccaa gcatgagtga atcgtagtcg atcagtgacg caggaagtat ataagctcta 360

agagagcctt cttgttcata gctcaatgag gagaaatctc acaacgtgaa gatgcccgtg 420

tgggacgcaa cgcgacaggc tgggggttca ctgtacgatg gtcaacatct gtaccctcca 480

gtagcatcac ctcgacgaaa ggttgacttc tagacaccaa tgttcttttg cattgattcc 540

agttccccac tcaaggagca agtgaagaca agatcacggt aattgagatg cttccaaggc 600

cccactaacc cacaaccccc tcaccccgga ttccacgtga cgggatctag tgcggagaag 660

gacgattgat aactttcccc aggtttctct acttacccga gcagtcaaat taattctagc 720

catgagtaca tccggcaacc aacgggtcgc tactaaggtc gatcggaaac gtattacgga 780

ccgcaaagcc cagagaaacc accgagaacg tgtcaaagca tatatcagtc gcctcgagac 840

cactgttgag gagcttacca aagcatccca ggagggctct gaatgcagtc tactacagaa 900

gctgcaagaa aagcaactcg agatagaacg gcttaagggg gcgatacggc aagccaatac 960

agccctgcga actgcccttg acacgacctc cgcgtccata acgcgttccc ccatcgccga 1020

gatcgtgcct agagataccc cggtaacaga gaataactcg ccgtccgtag ctgagcatga 1080

aacgacacaa agactcaata accgcagaat gcagatgg 1118

<210> 2

<211> 821

<212> DNA

<213> Aspergillus oryzae

<400> 2

gatgacttga ctattcgggc catcttacac ggatgggata ctatcaagga ggagaagcca 60

ctcgaccgtg cctggaactt tctcagagct ctagaccaag gcctatttca ccgcactggc 120

cctgtggagc gcctggctat cttgcgccta atgcgatcca tgctgatggt gggtcgaaac 180

aagtaaccct ttgcatattc attgtaacat tgagtagtcg aagaacgggt ccccggggca 240

ctccactggc caggttccgt ctttcatgtt ccccacgtac gtaccagccc tcttccgtcg 300

atatgaagct gagtagtgcg taacaatagt accatgcaaa ccctcgtgac tcacgcgtgt 360

attatcgact ttttcgtgtg gtgagaatta ggaagtagga atattcttga atctcgcgta 420

ctaatcagag attaggccaa acctccgtga ccacttaatc gcctccgaaa cctcccatac 480

ttctgaagca gcagcggcgc attatgcgga agaaatccag ctgagttggc catatcagat 540

tcgagatgcc tacaggtacc acgaagaaga aggcaggttt caattttcga tcgaattcaa 600

caacgtttat tacgacttaa agtcatggca atttcgttcg aaccctgcac tcaagatgct 660

tgttgcgaat ggaccaatgt cctcactgga aggacgctta caggcctcgt caagtatact 720

gattagttct ctggatccaa atgggtttat tgagtcaggg ggagttgttg gctattgatt 780

ctatttgaat tttcccatgc atgcaatgtc ggctgtcaaa g 821

<210> 3

<211> 2260

<212> DNA

<213> Aspergillus oryzae

<400> 3

cgagaacgtg tcaaagacaa cagacgtacc ctgtgatgtt catcactaat gccggcaagc 60

ctccagttac ggatcgagag atgagggctg ccagcataca gtccgctgtt cgatttgcca 120

agaggtggaa tttatctggc cttgtctttg catctgaggc gctggtaatg tgccccaggc 180

ttgtcagata tgttcaacga tcaggattga tctgtggatc ctatggatct cagaacaata 240

taccagaaaa tgcgaaggta agtgcttcta tattgatcct tagtgctttc aaactgtgat 300

gtagaagttg ctcggtagct gattaaatat tctagaccca agccgctgct ggaattgaca 360

ttattatggc cgatagggtt gggcttattg ctatgtccct gaaaggatat caaaagcagg 420

caaaaagcca ggcataatcc ccgcgtggac ggtaccctaa ggataggccc taatcttatc 480

tacatgtgac tgcatcgatg tgtttggtca aaatgaggca tgtggctcac cccacaggcg 540

gagaaacgtg tggctagtgc atgacagtcc cctccataga ttcaatttaa tttttcgcgg 600

caattgtcgt gcagtttgta tctacatttc attccatata tcaagagtta gtagttggac 660

atcctgatta ttttgtctaa ttactgaaaa ctcgaagtac taacctacta ataagccagt 720

ttcaaccact aagtgctcat ttatacaata tttgcagaac cccgcgctac ccctccatcg 780

ccaacatgtc ttccaagtcg caattgacct acagcgcacg cgctagcaag caccccaatg 840

cgctcgtaaa gaagctcttc gaggttgccg aggccaagaa aaccaatgtc accgtttccg 900

ccgacgtgac aaccaccaaa gagctgctgg atttggctga ccgtatgcgc accggggatg 960

ccacttacat gtgatctagt aatggttaat ggtggattat ataacaggac tcggtccgta 1020

cattgccgtg atcaaaactc acatcgatat cctctccgat ttcagcgaag aaaccatcac 1080

cggtctgaag gcccttgcag agaagcacaa tttcctcatc ttcgaagatc gcaagttcat 1140

cgatatcgga aacacagtcc aaaagcagta ccatggcggc actctgcgta tctctgagtg 1200

ggcccacatc atcaactgca gtattctgcc cggtgagggt atcgtcgagg ctctggccca 1260

gactgcttcg gccgaggact tcccctacgg ctccgagagg ggccttttga tccttgcgga 1320

gatgacctcc aagggatctt tggctaccgg tcaatatact acttcttctg ttgactatgc 1380

tcggaagtat aagaagtttg tgatgggatt cgtctcgaca cgtcaccttg gcgaggttca 1440

gtctgaagtt agctcgcctt cggaggagga agattttgtc gtcttcacga caggtgtcaa 1500

cctctcctcg aagggtgaca agctgggaca gcagtaccaa actcctgagt cggctgttgg 1560

acgcggtgcc gactttatta ttgctggccg tggaatttat gctgctcctg atcccgtgga 1620

ggcggcgaag cagtaccaga aggagggatg ggatgcatac ctgaagcgtg ttggtgcgca 1680

ataagtagtg gtggatacgt actcctttta tggcagtatg tcgcaagtat gatgcgattt 1740

ataaattcag cactcgaaat gactactact atgtgtctac gacagatacc ctctccgtac 1800

gaataagaca cctgcctcga tatatggaca aattcaaaat cagggtcaag ggtcatgttt 1860

caaagtcaca acaatctcca acatagacga gaatttgtac cggagtgtct gaaggtgcag 1920

ctggagattg gtctattttc ttagagtggg gtatcactaa tgtacagtcg gtcactatcg 1980

tacaaacaat cacaattata tacaagattt cccaccaccc cctactctaa cacggcacaa 2040

ttatccatcg agtcagagcc tagccaccat ttggtgctct cgtagagacc aaagtataat 2100

cctgatccga cagcggccat aaacgtgttg atagcacacc ctcggaatag tcctctcggg 2160

ccatctgttc gtacaatctc ccgtacggta ttgatcatcc ttttcttctg aggtgcagtt 2220

atccttttct tctgaggtgc agttgatgac ttgactattc 2260

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> AO090701000363 L -F(Artificial)

<400> 4

gtttcgcgta taacgccttg tggtg 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> AO090701000363 L -R(Artificial)

<400> 5

ctttgacacg ttctcggtgg tttc 24

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> pyrG-F(Artificial)

<400> 6

cgagaacgtg tcaaagacaa cagacgtacc ctgtgatg 38

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> pyrG-R(Artificial)

<400> 7

gaatagtcaa gtcatcaact gcacctcaga agaaaaggat 40

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> AO090701000363 R -F(Artificial)

<400> 8

gatgacttga ctattcgggc catc 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> AO090701000363 R -R(Artificial)

<400> 9

ctttgacagc cgacattgca tgcatg 26

Claims

1.一种高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，先敲除米曲霉中的AO090701000363基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。

2.根据权利要求1所述的高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，通过同源重组将米曲霉中的AO090701000363基因用选择标记基因pyrG代替，从而实现AO090701000363敲除。

3.根据权利要求1或2所述的高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）利用PrimeStar PCR聚合酶扩增并获得AO090701000363基因两侧片段和pyrG基因；

2）将AO090701000363基因两侧片段与pyrG基因融合；

3）将融合基因转化入米曲霉∆ku70::ptrA，∆AF，∆pyrG，利用选择性培养基进行至少两次分离纯化，然后提取基因组，进行Southern blot鉴定；

4）培养阳性菌株，获得高活性淀粉酶。

4.根据权利要求3所述的高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，步骤1）中，AO090701000363基因两侧片段为：AO090701000363 L，基因序列如SEQ ID NO.1所示，AO090701000363 R，基因序列如SEQ ID NO.2所示；pyrG基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求3所述的高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，步骤1）中，PCR体系：25μL的primestar Mix酶；上游引物、下游引物各2μL；1μL A. oryzae RIB40基因组DNA；加入水至50μL；具体引物序列如下：

AO090701000363 L –F：5'–GTTTCGCGTATAACGCCTTGTGGTG–3'，

AO090701000363 L -R：5'–CTTTGACACGTTCTCGGTGGTTTC–3'，

pyrG-F：5'–CGAGAACGTGTCAAAGACAACAGACGTACCCTGTGATG–3'，

pyrG-R：5'–GAATAGTCAAGTCATCAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGAT–3'，

AO090701000363 R -F：5'–GATGACTTGACTATTCGGGCCATC–3'，

AO090701000363 R -R：5'–CTTTGACAGCCGACATTGCATGCATG–3'。

6.根据权利要求3所述的高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，步骤1）中，PCR条件：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃2min20s，35次循环；72.0℃5min；16.0℃保存。

7.根据权利要求3所述的高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，步骤2）中，利用fusion PCR进行融合，基因加入摩尔浓度比：AO090701000363 L：pyrG：AO090701000363 R=1:3:1。

8.根据权利要求3所述的高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，步骤2）中，PCR体系：primestar Mix 25μL；上游引物，下游引物各加2μL；按浓度比加入模板；加水定容至50μL。

9.根据权利要求3所述的高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，步骤2）中，两步法：98.0℃10s；98.0℃10s，68.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存；

10.根据权利要求3所述的高酶活淀粉酶的表达方法，其特征在于，步骤3）中，转化过程如下：溶液1，使用0.45μm过滤灭菌到新的50mL灭菌试管中；将培养的米曲霉用漏斗过滤，用水冲一下把培养基冲走，用药匙挤一下把水挤下；用药匙把菌体放入溶液1中，用封条裹上试管，30℃ 50rpm 3h；制冰；过滤，取液体；加溶液2 10mL，上下混合；将试管取出在4℃下离心2000rpm 8min，取沉淀；加5mL 溶液2 混匀 4℃下离心2000rpm 8min 上清液丢弃；视沉淀量加溶液2，分装各200μL×4；分别加10μL质粒，用一次性吸管混匀；放冰上30min，在此期间将CD选择培养基放微波炉溶后，倒入50mL的试管中，放45℃中保温；30min后分3次加入溶液3：250μL混匀；250μL混匀；850μL混匀；在室温中放置20min；加入5mL 溶液2 混匀后 4℃下离心2000rpm 8min将上清液丢弃；加入500μL 溶液2 混匀，加入10mL CD上层培养基混匀后倒平板；在CD培养基30℃环境下3-5天避光培养；其中，溶液0的组分为：50mM Maleatebuffer pH5.5；溶液1的组分为： 0.1％Yatalase，0.6M(NH₄)₂SO₄，加入10mL溶液0；溶液2的组分为：1.2M Sorbitol，50mM CaCl₂，35mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.5；溶液3的组分为：60％PEG4000，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl pH7.5。